JP2000336038A

JP2000336038A - Liver protecting agent

Info

Publication number: JP2000336038A
Application number: JP11345231A
Authority: JP
Inventors: Masaki Kamakura; 昌樹鎌倉; Toshiyuki Fukuda; 寿之福田; Makoto Mitani; 信三谷; Hirotaka Miyazaki; 博隆宮崎
Original assignee: Pola Chemical Industries Inc
Current assignee: Pola Orbis Holdings Inc
Priority date: 1999-03-19
Filing date: 1999-12-03
Publication date: 2000-12-05

Abstract

PROBLEM TO BE SOLVED: To obtain a liver protecting agent for treatment or prophylaxis of liver function failure or protection of liver for transplantation. SOLUTION: This liver protecting agent comprises a protein in royal jelly specified by the following properties as an active ingredient. (a) A single band is formed in unmodified polyacrylamide gel electrophoresis of protein in royal jelly. (b) A molecular weight measured by SDS-polyacrylamide gel under reducing conditions is about 51 kDa.

Description

DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION

【０００１】[0001]

【発明の属する技術分野】本発明は、肝臓保護剤に関
し、詳しくは、肝臓疾患の治療もしくは予防のため、又
は移植用肝臓を保存するための肝臓保護剤に関する。[0001] The present invention relates to a hepatoprotective agent, and more particularly to a hepatoprotective agent for treating or preventing a liver disease or for preserving a liver for transplantation.

【０００２】[0002]

【従来の技術】現代はストレスの時代であり現代社会に
暮らすものは、大なり小なりストレスと共に生活してい
る。その為に人々の体調のバランスが崩れたり又、高齢
化社会にともない、循環器疾患、消化器疾患や肝臓疾患
などの重大な病気にかかる人たちが少なくない。そし
て、それらの患者が、年々増加傾向にあるので問題とな
っている。そこまで至らない人たちは、栄養のバランス
を考え個人個人が食事療法をしたり手軽に購入できるビ
タミン剤や健康食品などを常用して対処している。2. Description of the Related Art The present age is a time of stress, and those living in modern society live with stress more or less. As a result, there are not a few people who are out of balance or have serious illnesses such as cardiovascular disease, gastrointestinal disease and liver disease due to the aging society. And it is a problem because those patients are increasing year by year. For those who do not reach that level, they are trying to balance their nutrition by using vitamins and health foods that individuals can eat or buy easily.

【０００３】一方、肝臓は沈黙の臓器として知られてお
り、軽い肝疾患にかかったぐらいでは、自覚症状が現れ
ず、知らない内に脂肪肝、肝繊維症や肝硬変になり、正
常な肝臓に回復するのが困難であったり、回復するまで
時間がかかる重い疾患にかかってしまうことが度々あ
る。しかしながら、肝臓疾患を直接治す薬というものは
現在に於いては殆ど知られていない。むしろ、肝臓疾患
の程度を軽減させるために、患者の安静が第一に優先さ
れているのが現状である。[0003] On the other hand, the liver is known as a silenced organ, and when a person suffers from a mild liver disease, no subjective symptoms appear. It is often difficult to recover or often suffers from a serious disease that takes time to recover. However, drugs that directly cure liver disease are not known at present. Rather, in order to reduce the degree of liver disease, the patient's rest is given priority first.

【０００４】肝臓に対して保護剤的に働くものとして、
アミノ酸製剤（アスパラ：田辺製薬）、ビタミンＢ１５
（リバオール：三共製薬）、肝臓加水分解物（プロへパ
ールＳ：科研製薬）、グルクロン酸ナトリウム（グロン
サン：中外製薬）、チオプロニン（チオラ：参天製薬）
等が知られているが満足のいくものではなかった。従っ
て、肝臓保護剤として有用な物質が望まれていた。更
に、臓器移植などにおいては、臓器を提供者から移植さ
れる患者に移送するまでの間、該臓器のダメージを軽減
することが肝要であるが、この様な際の保護剤も今のと
ころまだ知られておらず、その開発が望まれていた。[0004] As a protective agent for the liver,
Amino acid preparation (aspara: Tanabe Seiyaku), vitamin B15
(Rivaol: Sankyo Pharmaceutical Co., Ltd.), liver hydrolyzate (Prohepal S: Kaken Pharmaceutical Co., Ltd.), sodium glucuronate (Glonsan: Chugai Pharmaceutical Co., Ltd.), thiopronin (thiola: Santen Pharmaceutical Co., Ltd.)
Etc. are known but not satisfactory. Therefore, a substance useful as a liver protective agent has been desired. Furthermore, in organ transplantation and the like, it is important to reduce the damage to the organ until the organ is transferred from the donor to the patient to be transplanted. It was not known and its development was desired.

【０００５】上記した、健康食品の成分として使用され
ている原料には、漢方生薬剤、ビタミン剤、カルシウム
剤、ローヤルゼリー剤などが用いられる。ローヤルゼリ
ーの様に、その有効性が如実に認められ、それ自身が複
数の成分からなるものもある。なかでも、ローヤルゼ
リー中の５５ｋＤａ（キロダルトン）及び３５０ｋＤａ
の糖タンパク質は、初代培養肝細胞の細胞数の維持に対
して有効であることが知られている。特に５５ｋＤａの
糖タンパク質は、培養２０日後に於いても最大増殖時の
９０％の細胞数を維持することが確認されている。[0005] The raw materials used as components of the above-mentioned health foods include Chinese herbal medicines, vitamins, calcium, royal jelly and the like. Like royal jelly, its effectiveness is clearly recognized, and some itself is composed of multiple components. Among them, 55 kDa (kilodalton) and 350 kDa in royal jelly
Is known to be effective for maintaining the cell number of primary cultured hepatocytes. Particularly, it has been confirmed that the 55 kDa glycoprotein maintains 90% of the cell number at the time of maximum proliferation even after 20 days of culture.

【０００６】しかしながら、ローヤルゼリー中の、ＳＤ
Ｓポリアクリルアミドゲル電気泳動により分子量５７ｋ
Ｄａと決定されたタンパク質が、肝臓を保護する作用を
有することは知られていなかった。[0006] However, in the royal jelly, SD
Molecular weight 57k by S polyacrylamide gel electrophoresis
It was not known that a protein determined as Da had a liver-protecting action.

【０００７】[0007]

【発明が解決しようとする課題】本発明は、上記のよう
な状況をふまえて為されたものであり、肝機能障害等の
治療もしくは予防の為の、又は移植用の肝臓を保存する
ための肝臓保護剤を提供することを課題とする。SUMMARY OF THE INVENTION The present invention has been made in view of the above circumstances, and is intended for treating or preventing hepatic dysfunction or the like, or for preserving a liver for transplantation. It is an object to provide a liver protecting agent.

【０００８】[0008]

【課題を解決するための手段】この様な状況に鑑みて、
本発明者らは鋭意研究努力を重ねた結果、ローヤルゼリ
ー中の分子量５７ｋＤａのタンパク質が肝細胞に対する
保護作用を有することを見い出し、発明を完成させるに
至った。すなわち本発明は、以下のとおりである。In view of such a situation,
As a result of intensive research efforts, the present inventors have found that a protein having a molecular weight of 57 kDa in royal jelly has a protective effect on hepatocytes, and have completed the invention. That is, the present invention is as follows.

【０００９】（１）下記の性質で特定されるローヤルゼ
リーを有効成分として含有する肝臓保護剤。（ａ）ローヤルゼリー中のタンパク質の非変性ポリアク
リルアミドゲル電気泳動において単一のバンドを形成す
る。（ｂ）還元条件下でのＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル
電気泳動により測定される分子量：約５７ｋＤａ。(1) A hepatoprotective agent containing royal jelly specified by the following properties as an active ingredient. (A) Form a single band in native polyacrylamide gel electrophoresis of proteins in royal jelly. (B) Molecular weight measured by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis under reducing conditions: about 57 kDa.

【００１０】（２）前記タンパク質が、トーソー株式会
社製ＴＳＫゲルＧ３０００ＳＷ（７．５×３０ｃｍ）を
カラムとして用いて、０．３Ｍ塩化ナトリウム、０．０
５％アジ化ナトリウム含有０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ
７．０）を展開液とし、流速を０．３ｍｌ／ｍｉｎ、カ
ラム温度を３５℃に設定し、２８０ｎｍの吸光度で検出
する、高速液体クロマトグラフィーにおいて、保持時間
２５分〜３０分にピークを有するタンパク質である、
（１）に記載の肝臓保護剤。(2) The protein was prepared by using a TSK gel G3000SW (7.5 × 30 cm) manufactured by Tosoh Corporation as a column, using 0.3M sodium chloride, 0.0M
0.1 M phosphate buffer containing 5% sodium azide (pH
7.0) is used as a developing solution, the flow rate is set to 0.3 ml / min, the column temperature is set to 35 ° C., and detection is performed at an absorbance of 280 nm. High-performance liquid chromatography has a peak at a retention time of 25 to 30 minutes. Is a protein,
The hepatoprotective agent according to (1).

【００１１】（３）前記タンパク質が、配列番号１のア
ミノ酸番号１〜８のアミノ酸配列を含むことを特徴とす
る（１）又は（２）に記載の肝臓保護剤。（４）前記（１）〜（３）の肝臓保護剤を含む肝臓疾患
の治療又は予防のための医薬。（５）前記（１）のいずれかの肝臓保護剤を含む食品。（６）移植用肝臓の保存に用いられる（１）〜（３）の
いずれかの肝臓保護剤。尚、本発明でいう肝臓保護とは、肝臓疾患を改善し、も
しくは予防すること、又は、生体から摘出した肝臓を保
存する際に肝臓細胞の劣化を保護することを含む。(3) The hepatoprotective agent according to (1) or (2), wherein the protein comprises the amino acid sequence of amino acids 1 to 8 of SEQ ID NO: 1. (4) A medicament for treating or preventing liver disease, comprising the hepatoprotective agent according to (1) to (3). (5) A food containing the hepatoprotective agent according to any of (1). (6) The hepatoprotective agent according to any one of (1) to (3), which is used for preserving a liver for transplantation. It should be noted that the term “protecting the liver” as used in the present invention includes improving or preventing liver disease, or protecting liver cells from deteriorating during preservation of a liver extracted from a living body.

【００１２】[0012]

【発明の実施の形態】＜１＞本発明の肝臓保護剤の有効
成分であるタンパク質本発明の肝臓保護剤は、下記の性質で特定されるローヤ
ルゼリー中のタンパク質を有効成分として含有する。（ａ）ローヤルゼリー中のタンパク質の非変性ポリアク
リルアミドゲル電気泳動において単一のバンドを形成す
る。（ｂ）還元条件下でのＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル
電気泳動により測定される分子量：約５７ｋＤａ。BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION <1> Protein as an active ingredient of the hepatoprotective agent of the present invention The hepatoprotective agent of the present invention contains, as an active ingredient, a protein in royal jelly specified by the following properties. (A) Form a single band in native polyacrylamide gel electrophoresis of proteins in royal jelly. (B) Molecular weight measured by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis under reducing conditions: about 57 kDa.

【００１３】上記「性質で特定される」タンパク質と
は、ローヤルゼリーを原料として得られる上記性質を有
するタンパク質のみならず、及び、同タンパク質と実質
的に同一のタンパク質、例えば組換えＤＮＡ技術によっ
て得られるタンパク質であってもよいことを意味する。The above-mentioned "specified by properties" includes not only proteins having the above properties obtained from royal jelly as a raw material, but also proteins substantially identical to the same protein, for example, obtained by recombinant DNA technology. It means that it may be a protein.

【００１４】本発明に用いるタンパク質を特定するに際
し、電気泳動の方法としては、特に制限されないが、例
えば、水溶性ローヤルゼリータンパク質（３％ローヤル
ゼリー水溶液（Ｗ／Ｖ））をポリアクリルアミドゲル
（１０％均一）にて、電流２０ｍＡで電気泳動し、クマ
シーブリリアントブルーにより染色して、タンパク質を
特定する方法がある。In specifying the protein used in the present invention, the method of electrophoresis is not particularly limited. For example, a water-soluble royal jelly protein (3% royal jelly aqueous solution (W / V)) is subjected to polyacrylamide gel (10% homogenization). ), There is a method of performing electrophoresis at a current of 20 mA and staining with Coomassie brilliant blue to identify the protein.

【００１５】上記の条件でローヤルゼリー中のタンパク
質の非変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行うと、
前記肝臓保護作用を有するタンパク質は、単一のバンド
を形成する。分子量マーカーとしてLMW Kit E（ファル
マシアバイオテク社）を用いた場合、本発明のタンパク
質の分子量は約５１ｋＤａである。When the protein in the royal jelly is subjected to non-denaturing polyacrylamide gel electrophoresis under the above conditions,
The hepatoprotective protein forms a single band. When LMW Kit E (Pharmacia Biotech) is used as a molecular weight marker, the protein of the present invention has a molecular weight of about 51 kDa.

【００１６】また、還元条件下でのＳＤＳ−ポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動は、Laemmliらの方法（Laemmli,
U. K. et al., J. Biol. Chem. 252, 1102-1106 (197
7)）で行うことができる。分子量マーカーとしてLMW Ki
t E（ファルマシアバイオテク社）を用いた場合、本発
明のタンパク質の分子量は約５７ｋＤａである。SDS-polyacrylamide gel electrophoresis under reducing conditions was carried out by the method of Laemmli et al. (Laemmli,
UK et al., J. Biol. Chem. 252, 1102-1106 (197
7)) can be done. LMW Ki as molecular weight marker
When t E (Pharmacia Biotech) is used, the molecular weight of the protein of the present invention is about 57 kDa.

【００１７】また、本発明におけるタンパク質の別の特
定方法としては、ゲル濾過クロマトグラフィー等の各種
クロマトグラフィーによっても、識別・定量することに
より特定する方法が挙げられる。クロマトグラフィーと
しては、ゲル濾過クロマトグラフィー、イオン交換クロ
マトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等
が挙げられる。また、クロマトグラフィーは、オープン
カラムを用いることもできるが、高速液体クロマトグラ
フィーが好ましい。Further, as another method for specifying the protein in the present invention, there is a method for specifying the protein by discrimination and quantification by various chromatography such as gel filtration chromatography. Examples of the chromatography include gel filtration chromatography, ion exchange chromatography, affinity chromatography and the like. In addition, open chromatography can be used for chromatography, but high performance liquid chromatography is preferable.

【００１８】例えば、ゲル濾過分析は、通常に知られて
いる方法に従って行えば良く、好ましい例としては、例
えば、トーソー株式会社製ＴＳＫゲルＧ３０００ＳＷ
（７．５×３０ｃｍ）をカラムとして用いて、０．３Ｍ
塩化ナトリウム、０．０５％アジ化ナトリウム含有０．
１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）を展開液とし、流速を
０．３ｍｌ／ｍｉｎ、カラム温度を３５℃に設定し、２
８０ｎｍの吸光度で検出する、高速液体クロマトグラフ
ィーが挙げられる。この分析条件下で、上記タンパク質
は、保持時間約２５分〜３０分にピークとして現れるこ
とより、特定される。For example, the gel filtration analysis may be performed according to a generally known method, and a preferable example is, for example, TSK gel G3000SW manufactured by Tosoh Corporation.
(7.5 × 30 cm) as a column, 0.3M
Sodium chloride, containing 0.05% sodium azide.
A 1 M phosphate buffer (pH 7.0) was used as a developing solution, the flow rate was set to 0.3 ml / min, and the column temperature was set to 35 ° C.
High-performance liquid chromatography, which detects light at an absorbance of 80 nm. Under these analytical conditions, the protein is identified by appearing as a peak at a retention time of about 25-30 minutes.

【００１９】さらに、本発明におけるタンパク質の別の
特定方法としては、該タンパク質のＮ末端配列分析によ
り決定されたアミノ酸配列（配列番号１）の、全部の配
列あるいは部分配列をＮ末端側に有していることを確認
することで特定する方法が挙げられ、なかでも配列番号
１のアミノ酸番号１〜８のアミノ酸配列をＮ末端側に有
していることを確認することで特定する方法が好まし
い。Further, as another method for specifying a protein in the present invention, the entire sequence or a partial sequence of the amino acid sequence (SEQ ID NO: 1) determined by analyzing the N-terminal sequence of the protein may be contained on the N-terminal side. The method is preferably performed by confirming that the amino acid sequence of amino acids 1 to 8 of SEQ ID NO: 1 is present on the N-terminal side.

【００２０】上述したこれら特定方法の内の、一つの方
法単独で行うことによっても特定する事ができるが、こ
れらを組み合わせることにより、さらに明確に特定する
ことができる。以下、上記のようにして特定されるロー
ヤルゼリー中のタンパク質を、「５７ｋＤａタンパク
質」ということがある。Although the identification can be performed by performing one of the above-described identification methods alone, the identification can be more clearly performed by combining these methods. Hereinafter, the protein in the royal jelly specified as described above may be referred to as a “57 kDa protein”.

【００２１】＜２＞５７ｋＤａタンパク質の調製方法本発明のローヤルゼリー中の肝臓保護作用を有するタン
パク質の調製方法としては、該タンパク質を調製できれ
ば特に限定されるものではなく、現在および今後におい
て利用が可能な分離・精製方法から適切なものを組み合
わせた方法を用いることができる。具体的には、ゲル濾
過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィ
ー、アフィニティークロマトグラフィー等の各種クロマ
トグラフィーを使用する方法が挙げられる。<2> Method for Preparing 57 kDa Protein The method for preparing a protein having hepatoprotective activity in royal jelly of the present invention is not particularly limited as long as the protein can be prepared, and it can be used now and in the future. A method combining appropriate separation and purification methods can be used. Specifically, a method using various types of chromatography such as gel filtration chromatography, ion exchange chromatography, affinity chromatography and the like can be mentioned.

【００２２】より具体的には、以下に述べる方法が挙げ
られる。凍結乾燥したローヤルゼリーを０．７重量％で
１０ｍＭのトリス塩酸緩衝液ｐＨ７に溶解し、ＵＦ１０
万（Ｍｉｎｉｐｌａｔｅ１００）で６倍濃縮、７回脱塩
を行い、その濾液をさらにＵＦ３万（Ｍｉｎｉｐｌａｔ
ｅ３０）で８倍濃縮、１回脱塩を行い、分子量１０万〜
３万の画分を得る。More specifically, the following method can be mentioned. Lyophilized royal jelly was dissolved at 0.7% by weight in 10 mM Tris-HCl buffer pH 7, and UF10
6-fold concentration and desalting 7 times with 10,000 (Miniplate 100), and the filtrate was further subjected to UF 30,000 (Miniplate 100).
e30) 8-fold concentration, desalting once, molecular weight 100,000 ~
Obtain 30,000 fractions.

【００２３】次に、この画分をゲル濾過クロマトグラフ
ィーにより分画する。ファルマシア株式会社製ＨｉＬｏ
ａｄ１６／６０Ｓｕｐｅｒｄｅｘ６００（1.6cm×60c
m）をカラムとして用いて、０．１５Ｍ塩化ナトリウム
含有５０ｍＭリン酸カリウムバッッファーｐＨ７．０を
展開液とし、流速を１．０ｍｌ／ｍｉｎ、カラム温度を
３５℃に設定し、２８０ｎｍの吸光度で検出することに
よって、上記サンプルを分画する。分画は、１フラクシ
ョン２ｍｌとして行う。その結果、フラクションＮｏ．
３５〜４３に分子量５７ｋＤａのタンパク質を得ること
が出来る。Next, this fraction is fractionated by gel filtration chromatography. Pharmacia HiLo
ad16 / 60 Superdex600 (1.6cm × 60c
m) as a column, using a developing solution of 50 mM potassium phosphate buffer containing 0.15 M sodium chloride, pH 7.0, a flow rate of 1.0 ml / min, a column temperature of 35 ° C., and an absorbance of 280 nm. Upon detection, the sample is fractionated. Fractionation is performed as 2 ml per fraction. As a result, the fraction No.
A protein having a molecular weight of 57 kDa can be obtained at 35 to 43.

【００２４】上述した方法により得られたタンパク質の
分子量を、電気泳動により確認した。分子量マーカーと
してゲル濾過用LMW Kit及びHMW Kit（ファルマシアバイ
オテク社）を用いた上記と同様のゲル濾過分析により、
上記タンパク質の分子量は、約５７ｋＤａと推定され
た。さらにこのタンパク質は、（１）と同様の還元条件
下でのＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳分析にお
いて、分子量約５７ｋＤａを示した。The molecular weight of the protein obtained by the above method was confirmed by electrophoresis. The same gel filtration analysis as above using LMW Kit for gel filtration and HMW Kit (Pharmacia Biotech) as molecular weight markers,
The molecular weight of the protein was estimated to be about 57 kDa. Further, this protein showed a molecular weight of about 57 kDa in SDS-polyacrylamide gel electrophoresis analysis under the same reducing conditions as in (1).

【００２５】また、５７ｋＤａタンパク質をＮ−グリコ
シダーゼＦで消化した後の分子量は、４８ｋＤａであ
り、糖タンパク質であることがわかっている。さらに、
上述した分子量１０万〜３万の画分を得るまでの工程
（工程Ａ）と、得られた画分をゲル濾過クロマトグラフ
ィーにより分画して５７ｋＤａタンパク質を得る工程
（工程Ｂ）との間に、以下に述べる工程を設けることが
好ましい。The molecular weight of the 57 kDa protein after digestion with N-glycosidase F is 48 kDa, which is known to be a glycoprotein. further,
Between the above-described step of obtaining a fraction having a molecular weight of 100,000 to 30,000 (step A) and the step of fractionating the obtained fraction by gel filtration chromatography to obtain a 57 kDa protein (step B) Preferably, the following steps are provided.

【００２６】この工程とは、工程Ａで得られる分子量１
０万〜３万のサンプルは、陰イオン交換クロマトグラフ
ィー等によって分画する工程であり、これによりタンパ
ク質を分離できる。陰イオン交換クロマトグラフィーと
しては通常に知られている方法に従って行えばよく、こ
のような好ましい例として、例えばトーソー株式会社製
DEAE-Toyoperal 650M (2.2×20cm)をカラムとして用い
て、２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（pH7.0）
を展開液Ａ、２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌバッファー
（pH7.0）、１ＭＮａＣｌを展開液Ｂとしてグラジエ
ントにより、流速５ｍｌ／分で溶出し、２８０ｎｍの吸
光度で検出し、２．５ｍｌ／チューブで分画したフラク
ションＮｏ．１１９〜１２７に分子量５７ｋＤａのタン
パク質を含む画分を検出することができる。この画分を
続いて工程Ｂに用いることによりさらに精製された分子
量５７ｋＤａタンパク質を得る事ができる。This step refers to the molecular weight of 1 obtained in step A.
This is a step in which the sample of 10,000 to 30,000 is fractionated by anion exchange chromatography or the like, whereby proteins can be separated. The anion exchange chromatography may be performed according to a generally known method. As such a preferable example, for example, manufactured by Tosoh Corporation
Using DEAE-Toyoperal 650M (2.2 × 20 cm) as a column, 20 mM Tris-HCl buffer (pH 7.0)
Was eluted at a flow rate of 5 ml / min with a developing solution A, 20 mM Tris-HCl buffer (pH 7.0), and 1 M NaCl as a developing solution B at a flow rate of 5 ml / min, detected by absorbance at 280 nm, and fractionated at 2.5 ml / tube. Fraction No. A fraction containing a protein having a molecular weight of 57 kDa from 119 to 127 can be detected. By subsequently using this fraction in step B, a further purified molecular weight protein of 57 kDa can be obtained.

【００２７】尚、上述した調製方法により精製したタン
パク質について、Ｎ末端アミノ酸配列を決定したとこ
ろ、ローヤルゼリー中の報告されているタンパク質ＭＲ
ＪＰ１（Schmitzova, J., et al., Cell. Mol. Life Sc
i. 54 (9), 1020-1030 (1998)）及びアピシン（apisi
n）（Kimura, Y. et al., Biosci, Biotech. Biochem,
60(12), 2099-2102 (1996)）のアミノ酸配列と高い相同
性を有していた。特に、５７ｋＤａタンパク質のＮ末端
の８アミノ酸残基は、ＭＲＪＰ１中のアミノ酸配列（Ｎ
末端から２０〜２７番目のアミノ酸残基）と完全に一致
している。報告されているＭＲＪＰ１をコードするＤＮ
Ａの塩基配列及び該配列がコードするアミノ酸配列を、
配列番号２及び３に示す。When the N-terminal amino acid sequence of the protein purified by the above-mentioned preparation method was determined, the protein MR reported in royal jelly was reported.
JP1 (Schmitzova, J., et al., Cell. Mol. Life Sc
i. 54 (9), 1020-1030 (1998)) and apicin (apisi).
n) (Kimura, Y. et al., Biosci, Biotech. Biochem,
60 (12), 2099-2102 (1996)). In particular, the N-terminal 8 amino acid residues of the 57 kDa protein correspond to the amino acid sequence (N
(The 20th to 27th amino acid residues from the terminal). The DN coding for the reported MRJP1
A base sequence of A and the amino acid sequence encoded by the sequence,
Shown in SEQ ID NOs: 2 and 3.

【００２８】ＭＲＪＰ１は、４３２アミノ酸からなり、
蜜蜂の下咽頭腺から分泌された後、Ｎ末端にあるシグナ
ルペプチドが切断され、ローヤルゼリー中に存在する。
成熟タンパク質は４１６アミノ酸からなり、その推定分
子量は、４６．８ｋＤａである。しかし、ローヤルゼリ
ー中の電気泳動で５５ｋＤａを示すタンパク質のＮ末端
アミノ酸配列が、ＭＲＪＰ１のＮ末端から２０番目のア
ミノ酸残基以降の配列と一致したことから、ＭＲＪＰ１
の成熟タンパク質の分子量は５５ｋＤａであると推定さ
れている（前記Schmitzova, J., et al.）。そして、Ｍ
ＲＪＰ１中には３つの糖鎖付加部位が存在すると記載さ
れていることから、上記の分子量の差異は糖鎖付加によ
るものと考えられる。MRJP1 consists of 432 amino acids,
After being secreted from the hypopharyngeal gland of bees, the signal peptide at the N-terminus is cleaved and present in royal jelly.
The mature protein consists of 416 amino acids and has an estimated molecular weight of 46.8 kDa. However, since the N-terminal amino acid sequence of the protein showing 55 kDa by electrophoresis in royal jelly coincided with the sequence after the 20th amino acid residue from the N-terminus of MRJP1,
Is estimated to have a molecular weight of 55 kDa (Schmitzova, J., et al., Supra). And M
Since it is described that three glycosylation sites are present in RJP1, it is considered that the above difference in molecular weight is due to glycosylation.

【００２９】上記のように、５７ｋＤａタンパク質とＭ
ＲＪＰ１成熟タンパク質のＮ末端のアミノ酸配列は一致
し、さらに、ローヤルゼリー中のタンパク質を非変性条
件でポリアクリルアミドゲル電気泳動を行った場合に
も、５７ｋＤａタンパク質に相当するバンドは単一であ
ることが確認されている。尚、配列番号１のアミノ酸配
列と配列番号３のアミノ酸番号２０以降のアミノ酸配列
とで、一部異なるが、一般的に塩基配列決定に比べてア
ミノ酸配列決定は不正確である場合があることから、こ
れらの相違は読み誤りである可能性がある。As described above, the 57 kDa protein and M
The amino acid sequence at the N-terminus of the mature RJP1 protein was identical, and it was confirmed that the protein in the royal jelly was subjected to polyacrylamide gel electrophoresis under non-denaturing conditions, and that the band corresponding to the 57 kDa protein was single. Have been. Although the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 is partially different from the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 after amino acid number 20, the amino acid sequence determination is generally inaccurate compared to the base sequence determination. , These differences can be misread.

【００３０】また、アピシンは、ローヤルゼリー中に存
在するタンパク質であり、ゲル濾過分子量は３５０ｋＤ
ａ、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動による分
子量は５８ｋＤａである（米倉ら、ローヤルゼリーのタ
ンパク質の特徴と機能ミツバチ科学、第１９巻第１
号、第１５−２２頁、１９９８年）。また、Ｎ末端アミ
ノ酸配列分析の結果、２種類の配列がみられたことか
ら、２種の５８ｋＤａのサブユニットが３分子づつ会合
したヘテロオリゴマータンパク質である。このように、
サブユニットの分子量は５７ｋＤａタンパク質に近く、
Ｎ末端アミノ酸配列も一致していることが確認されてい
る。Apisin is a protein present in royal jelly and has a gel filtration molecular weight of 350 kD.
a, The molecular weight by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis is 58 kDa (Yonekura et al., Characteristics and functions of royal jelly protein Honeybee science, Vol. 19, No. 1,
No. 15-22, 1998). Also, as a result of N-terminal amino acid sequence analysis, two types of sequences were found, indicating that the protein is a heterooligomeric protein in which two 58 kDa subunits are associated with each other by three molecules. in this way,
The molecular weight of the subunit is close to the 57 kDa protein,
It has been confirmed that the N-terminal amino acid sequences are also identical.

【００３１】これらのことより、ＭＲＪＰ１およびアピ
シンは、５７ｋＤａタンパク質と同一、または類似であ
ることが示唆される。したがって、ＭＲＪＰ１およびア
ピシンは、５７ｋＤａタンパク質と同一でなかったとし
ても、本発明の肝臓保護剤の有効成分として用いること
ができる可能性が高い。ＭＲＪＰ１は、例えば、配列番
号１に示す塩基配列を有するＤＮＡを用いて、組換えＤ
ＮＡ技術を利用することによって製造することができ
る。These facts suggest that MRJP1 and apicin are the same as or similar to the 57 kDa protein. Therefore, it is highly possible that MRJP1 and apicin can be used as active ingredients of the hepatoprotective agent of the present invention even if they are not the same as the 57 kDa protein. MRJP1 can be prepared, for example, using a DNA having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 by recombinant D
It can be manufactured by utilizing NA technology.

【００３２】＜３＞本発明の肝臓保護剤本発明の肝臓保護剤は、前記５７ｋＤａタンパク質を含
有することを特徴とする。また、この分子量５７ｋＤａ
タンパク質を有効成分として含有させることができれ
ば、ローヤルゼリー自体、または５７ｋＤａタンパク質
の部分精製物でもよい。尚、５７ｋＤａタンパク質は保
存中に劣化しやすいので、ローヤルゼリー自体を用いる
場合は、同タンパク質が含有量が高いこと、例えば全タ
ンパク質中５重量％以上、好ましくは９重量％以上であ
ることが好ましい。５７ｋＤａタンパク質含有されてい
ること、又はその含有量は、前記の５７ｋＤａタンパク
質を特定する方法と同様にして評価することができる。<3> Liver protectant of the present invention The liver protectant of the present invention is characterized by containing the above 57 kDa protein. In addition, this molecular weight is 57 kDa.
As long as a protein can be contained as an active ingredient, royal jelly itself or a partially purified product of a 57 kDa protein may be used. Since the 57 kDa protein is apt to deteriorate during storage, when royal jelly itself is used, the content of the protein is preferably high, for example, 5% by weight or more, preferably 9% by weight or more of the total protein. The content of the 57 kDa protein or the content thereof can be evaluated in the same manner as in the method for identifying the 57 kDa protein.

【００３３】上記５７ｋＤａタンパク質を有効成分とし
て含有する本発明の肝臓保護剤は、肝臓疾患の治療に有
効であり、これを人に投与することにより、四塩化炭素
等による急性肝障害、アルコール摂取による肝障害、ウ
ィルス感染による慢性肝障害等の肝疾患に対する改善効
果が得られる。本発明の肝疾患治療薬の適応症として
は、急性肝炎、慢性肝炎、アルコール性肝炎、ウィルス
性肝炎、アルコール性脂肪肝、アルコール性肝硬変等が
挙げられる。The hepatoprotective agent of the present invention containing the above 57 kDa protein as an active ingredient is effective for the treatment of liver diseases. By administering it to humans, acute liver injury due to carbon tetrachloride and the like, An effect of improving liver diseases such as liver damage and chronic liver damage due to viral infection can be obtained. Indications for the therapeutic agent for liver disease of the present invention include acute hepatitis, chronic hepatitis, alcoholic hepatitis, viral hepatitis, alcoholic fatty liver, alcoholic cirrhosis, and the like.

【００３４】また、本発明の肝臓保護剤は、上記のよう
な肝臓疾患の予防にも有効である。さらに、本発明の肝
臓保護剤は、生体肝移植等に用いられる移植用の肝臓
を、移送等等に保存するための保護剤としても、用いる
ことができる。本発明の肝臓保護剤によって、保存時に
肝臓細胞の劣化を保護することができる。The hepatoprotective agent of the present invention is also effective for preventing the above-mentioned liver diseases. Furthermore, the liver protecting agent of the present invention can also be used as a protecting agent for preserving a liver for transplantation used for living donor liver transplantation or the like during transportation or the like. The hepatoprotective agent of the present invention can protect liver cells from deterioration during storage.

【００３５】前記５７ｋＤａタンパク質は、そのまま、
あるいは慣用の製剤担体と共に動物及び人に投与するこ
とが出来る。１日の好ましい有効投与量は、分子量５７
ｋＤａのタンパク質量として、０．０１〜１００ｍｇ／
ｋｇ体重／日、更に好ましい投与量は０．５〜５０ｍｇ
／ｋｇ体重／日である。投与形態としては、特に限定は
なく、必要に応じて適宜選択して使用され、錠剤、カプ
セル剤、顆粒剤、細粒剤、散剤等の経口剤、注射剤、座
剤等の非経口剤が挙げられる。以上の製剤は、常法によ
って製造される。通常知られた任意成分を本発明の分子
量５７ｋＤａのタンパク質の生理活性が損なわれない程
度に配合することが出来る。かかる任意成分として、白
糖、乳糖等の賦形剤、デンプン、ゼラチン等の結合剤、
カルボキシメチルセルロースナトリウム、カルボキシメ
チルセルロースカルシウム等の崩壊剤、大豆レシチン、
ショ糖脂肪酸エステル等の界面活性剤、タルク、ロウ類
等の滑沢剤、軽質無水ケイ酸、乾燥水酸化アルミニウム
ゲル等の流動促進剤、生理食塩水、ブドウ糖水溶液等の
希釈剤、矯味矯臭剤、着色剤、殺菌剤、防腐剤、香料等
が挙げられる。又、移植用肝臓の保存のための保護組成
物としては、生食やリンゲル液などの生体適合性溶媒と
本発明の肝臓保護剤とを含有する組成物が例示できる。The 57 kDa protein is
Alternatively, they can be administered to animals and humans together with conventional pharmaceutical carriers. A preferred effective daily dose is a molecular weight of 57
As a protein amount of kDa, 0.01 to 100 mg /
kg body weight / day, more preferred dosage is 0.5-50 mg
/ Kg body weight / day. The administration form is not particularly limited, and may be appropriately selected and used as needed. Tablets, capsules, granules, fine granules, oral preparations such as powders, injections, and parenteral preparations such as suppositories may be used. No. The above preparations are manufactured by a conventional method. Commonly known optional components can be added to such an extent that the physiological activity of the protein of the present invention having a molecular weight of 57 kDa is not impaired. Such optional components include excipients such as sucrose and lactose, binders such as starch and gelatin,
Disintegrators such as sodium carboxymethylcellulose and carboxymethylcellulose calcium, soy lecithin,
Surfactants such as sucrose fatty acid esters, lubricating agents such as talc, waxes, etc., glidants such as light anhydrous silicic acid and dried aluminum hydroxide gel, diluents such as physiological saline and aqueous glucose solutions, and flavoring agents , Coloring agents, bactericides, preservatives, fragrances and the like. Examples of the protective composition for preserving a liver for transplantation include a composition containing a biocompatible solvent such as saline or Ringer's solution and the hepatoprotective agent of the present invention.

【００３６】本発明の肝臓保護剤を医薬として使用する
場合、５７ｋＤａタンパクの配合量は特に制限されない
が、例えば、医薬全量に対して１〜３０重量％が好まし
い。また、本発明の肝臓保護剤は、食品に配合すること
によって、肝臓保護作用を有する機能性食品としても用
いることができる。食品の成分としては、肝臓保護作用
を害さない限り特に制限されない。食品への配合量は、
食品の味を損なわずに、且つ十分な肝臓保護作用が期待
できる量であれば特に制限されないが、例えば、１〜３
０重量％が好ましい。When the hepatoprotective agent of the present invention is used as a medicine, the amount of the 57 kDa protein is not particularly limited, but is preferably, for example, 1 to 30% by weight based on the total amount of the medicine. In addition, the hepatoprotective agent of the present invention can be used as a functional food having a hepatoprotective effect by being incorporated into food. The ingredients of the food are not particularly limited as long as they do not impair the liver protection effect. The amount of food
The amount is not particularly limited as long as it is an amount that does not impair the taste of the food and that a sufficient hepatoprotective effect can be expected.
0% by weight is preferred.

【００３７】[0037]

【実施例】以下に、実施例を挙げて本発明について更に
具体的に説明を加えるが、本発明がかかる実施例にのみ
限定を受けないことは、言うまでもない。EXAMPLES Hereinafter, the present invention will be described more specifically with reference to examples. However, it is needless to say that the present invention is not limited to only these examples.

【００３８】＜実施例１＞分子量５７ｋＤａのタンパク質のラット初代培養肝細胞
に対する効果（１）分子量５７ｋＤａタンパク質の調製凍結乾燥したローヤルゼリーを０．７重量％で１０ｍＭ
のトリス塩酸緩衝液ｐＨ７に溶解し、ＵＦ１０万（Ｍｉ
ｎｉｐｌａｔｅ１００）で６倍濃縮、７回脱塩を行い、
その濾液をさらにＵＦ３万（Ｍｉｎｉｐｌａｔｅ３０）
で８倍濃縮、１回脱塩を行い、分子量１０万〜３万の画
分を得た。上記の分子量１０万〜３万のサンプルを、ゲ
ル濾過クロマトグラフィーとして、ファルマシア株式会
社製ＨｉＬｏａｄ１６／６０Ｓｕｐｅｒｄｅｘ６００
（1.6cm×60cm）をカラムとして用いて、０．１５Ｍ塩
化ナトリウム含有５０ｍＭリン酸カリウムバッッファー
ｐＨ７．０を展開液とし、流速を１．０ｍｌ／ｍｉｎ、
カラム温度を３５℃に設定し、２８０ｎｍの吸光度で検
出することによって、上記サンプルを分画した。分画
は、１フラクション２ｍｌとして行った。その結果、フ
ラクションＮｏ．３５〜４３に分子量５７ｋＤａタンパ
ク質を得た。<Example 1> Effect of 57 kDa protein on rat primary cultured hepatocytes (1) Preparation of 57 kDa protein Lyophilized royal jelly was prepared at 10 mM at 0.7% by weight.
Dissolved in Tris-HCl buffer (pH 7) and UF 100,000 (Mi
6 times concentration and desalting 7 times with Niplate 100)
The filtrate is further UF 30,000 (Miniplate 30)
, And desalting was performed once to obtain a fraction having a molecular weight of 100,000 to 30,000. The above sample having a molecular weight of 100,000 to 30,000 was subjected to gel filtration chromatography as HiLoad 16/60 Superdex 600 manufactured by Pharmacia.
(1.6 cm × 60 cm) as a column, a developing solution was a 50 mM potassium phosphate buffer containing 0.15 M sodium chloride, pH 7.0, and the flow rate was 1.0 ml / min.
The sample was fractionated by setting the column temperature to 35 ° C. and detecting by absorbance at 280 nm. Fractionation was performed as 2 ml per fraction. As a result, the fraction No. A 35-43 kDa protein was obtained at 35-43.

【００３９】（２）ラット肝臓細胞に対する５７ｋＤａ
タンパク質の作用ウィスター系ラット７週齢（体重：約１５０ｇ）の肝臓
をハンクスバッファーにて潅流後、コラゲナーゼ溶液で
潅流し肝細胞を得た。これを下記に示す培地Ｉ（表１）
で２回洗浄し、更に、下記に示す培地II（表２）で溶解
しトリパンブルー染色し細胞数を測定した。後に、３７
℃、３時間、ＣＯ₂インキュベーターで培養し、培地交
換を下記に示す培地III＋サンプル（表３、４）で行
い、３７℃、５日間、ＣＯ₂インキュベーターでさらに
培養した。尚、培地交換及び細胞数測定は毎日行った。
表５に示したように、本発明の分子量５７ｋＤａのタン
パク質は、初代培養肝細胞の維持に優れることがわか
る。このことは、即ち、本発明の肝臓保護剤無しでは維
持できない肝細胞が、本発明の肝臓保護剤を含有するこ
とにより、維持しうることを意味している。即ち、本発
明の肝臓保護剤が、肝細胞を保護する作用に優れること
を意味する。(2) 57 kDa against rat liver cells
Action of protein Liver of a 7-week-old Wistar rat (body weight: about 150 g) was perfused with Hanks buffer and then perfused with a collagenase solution to obtain hepatocytes. This is shown in Medium I below (Table 1).
, And dissolved in a medium II (Table 2) shown below, stained with trypan blue, and the number of cells was measured. Later, 37
The mixture was cultured in a CO ₂ incubator at 3 ° C. for 3 hours, the medium was replaced with a medium III + sample (Tables 3 and 4) shown below, and further cultured in a CO ₂ incubator at 37 ° C. for 5 days. In addition, medium exchange and cell number measurement were performed every day.
As shown in Table 5, it can be seen that the protein of the present invention having a molecular weight of 57 kDa is excellent in maintaining primary cultured hepatocytes. This means that hepatocytes that cannot be maintained without the hepatoprotective agent of the present invention can be maintained by containing the hepatoprotective agent of the present invention. That is, it means that the hepatoprotective agent of the present invention is excellent in the action of protecting hepatocytes.

【００４０】[0040]

【表１】 [Table 1]

【００４１】[0041]

【表２】 [Table 2]

【００４２】[0042]

【表３】 [Table 3]

【００４３】[0043]

【表４】 [Table 4]

【００４４】[0044]

【表５】 [Table 5]

【００４５】＜実施例２＞肝炎各病型に対応する病態モ
デルとして、四塩化炭素による中毒性肝障害モデルを用
いて肝疾患治療に有効な物質の評価を行った。<Example 2> As a pathological model corresponding to each type of hepatitis, a toxic liver injury model caused by carbon tetrachloride was used to evaluate substances effective for treating liver diseases.

【００４６】予備飼育後のラットに５０％四塩化炭素／
オリーブ油を４ｍｌ／ｋｇ経口投与し、２０時間絶食さ
せた。その後、表６に記載の被検物質を５０ｍｇ／ｋｇ
経口投与した。投与の方法は、被検物質２００ｍｇを、
１重量％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００の生理食塩水１０ｍｌ
に乳化させ、ゾンデで投与した。各群のラットは４匹と
した。水と餌は四塩化炭素投与までの間自由に摂取さ
せ、四塩化炭素投与後は絶食させ、水のみをそのまま与
えた。被検物質投与から２４時間後に採血し、血液は室
温下で３０分放置した後、毎分３０００回転で１０分間
遠心分離して血清を得た。The rats after preliminary breeding were given 50% carbon tetrachloride /
Olive oil was orally administered at 4 ml / kg and fasted for 20 hours. Thereafter, the test substances described in Table 6 were added at 50 mg / kg.
Oral administration. The method of administration is as follows:
10 ml of 1% by weight Triton-X100 physiological saline
And emulsified with a sonde. There were four rats in each group. Water and food were allowed to be taken freely until administration of carbon tetrachloride, and after administration of carbon tetrachloride, fasted, and only water was given. Blood was collected 24 hours after the administration of the test substance, and the blood was allowed to stand at room temperature for 30 minutes, and then centrifuged at 3000 rpm for 10 minutes to obtain serum.

【００４７】この血清について、全ピルビン（Ｔ−Ｂｉ
ｌ）（Ｊｅｎｄｒａｓｓｉｋｉ法）、全コレステロール
（Ｔ−Ｃｈｏ）（コレステロールオキシダーゼ法）、ト
リグリセリド（ＴＧ）（ＧＰＯ−ｐ−クロロフェノール
法）、トランスアミナーゼ（ＧＯＴ，ＧＰＴ）（ＰＯＰ
−ＴＯＯＳ法）、アルカリホスファターゼ（Ａｌｐａｓ
ｅ）（フェニルリン酸基質法）を和光純薬（株）製キッ
トを用いて定量した。For this serum, total pyrvin (T-Bi
l) (Jendrassiki method), total cholesterol (T-Cho) (cholesterol oxidase method), triglyceride (TG) (GPO-p-chlorophenol method), transaminase (GOT, GPT) (POP
-TOOS method), alkaline phosphatase (Alpas)
e) (Phenyl phosphate substrate method) was quantified using a kit manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.

【００４８】各被検物質投与群のＴ−Ｂｉｌ，Ｔ−Ｃｈ
ｏ，ＴＧ，ＧＯＴ，ＧＰＴ及びＡｌｐａｓｅの値に対す
る影響を平均値として表６に示す。尚、表６の標準は四
塩化炭素を投与しない群、コントロールは四塩化炭素を
投与し被検物質を投与しない群を示す。尚、本実施例で
用いた５７ｋＤａタンパク質は、実施例１における調製
方法と同様の方法によって得た。T-Bil, T-Ch of each test substance administration group
Table 6 shows the effects on the values of o, TG, GOT, GPT, and Alpase as average values. In addition, the standard of Table 6 shows the group to which carbon tetrachloride is not administered, and the control shows the group to which carbon tetrachloride is administered and the test substance is not administered. The 57 kDa protein used in this example was obtained by the same method as the preparation method in Example 1.

【００４９】[0049]

【表６】 [Table 6]

【００５０】表６の結果からわかるように、全ピルビ
ン、全コレステロール、トリグリセリド、トランスアミ
ナーゼ（ＧＯＴ，ＧＰＴ）の各値がコントロールに対し
て有意に低下し、本発明の分子量５７ｋＤａタンパク質
を投与することにより肝機能障害改善作用が認められ
た。As can be seen from the results in Table 6, the values of total pyrvin, total cholesterol, triglyceride, and transaminase (GOT, GPT) were significantly lower than those of the control, and the administration of the 57 kDa protein of the present invention showed that An effect of improving liver dysfunction was observed.

【００５１】＜実施例３〜５＞以下に示す処方に従っ
て、健康食品を作成した。即ち、処方成分を１０重量部
の水と共に転動相造粒し、打錠して錠剤状の健康食品を
得た。これらのものは何れも優れた疲労回復効果を有し
ていた。尚、表中の数値の単位は重量部を表す。さら
に、本実施例で用いた５７ｋＤａタンパク質は、実施例
１における調製方法と同様の方法によって得た。<Examples 3 to 5> Health foods were prepared according to the following prescription. That is, the prescription component was subjected to tumbling phase granulation together with 10 parts by weight of water, and tableted to obtain a tablet-shaped health food. All of these had an excellent fatigue recovery effect. The units of the numerical values in the table represent parts by weight. Further, the 57 kDa protein used in this example was obtained by the same method as the preparation method in Example 1.

【００５２】[0052]

【表７】 [Table 7]

【００５３】＜実施例６〜８＞以下に示す処方に従っ
て、健康食品を作成した。即ち、処方成分を撹拌可溶化
しドリンク製剤の健康食品を得た。これらのものは何れ
も優れた疲労回復効果を有していた。尚、表中の数値の
単位は重量部を表す。さらに、本実施例で用いた５７ｋ
Ｄａタンパク質は、実施例１における調製方法と同様の
方法によって得た。<Examples 6 to 8> Health foods were prepared according to the following prescription. That is, the ingredients were stirred and solubilized to obtain a health food of a drink preparation. All of these had an excellent fatigue recovery effect. The units of the numerical values in the table represent parts by weight. Furthermore, the 57k used in this example
Da protein was obtained by the same method as the preparation method in Example 1.

【００５４】[0054]

【表８】 [Table 8]

【００５５】＜実施例９〜１１＞以下の処方に従って、
室温で撹拌溶解することにより注射製剤の医薬品を作成
した。尚、表中の数値の単位は重量部を表す。さらに、
本実施例で用いた５７ｋＤａタンパク質は、実施例１に
おける調製方法と同様の方法によって得た。四塩化炭素
による中毒性肝臓障害モデルに於いてトランスアミナー
ゼであるＧＯＴ，ＧＰＴの値を下げる効果があった。<Examples 9 to 11> According to the following formulation,
An injectable drug product was prepared by stirring and dissolving at room temperature. The units of the numerical values in the table represent parts by weight. further,
The 57 kDa protein used in this example was obtained by the same method as the preparation method in Example 1. In a toxic liver injury model caused by carbon tetrachloride, the transaminase GOT and GPT levels were reduced.

【００５６】[0056]

【表９】 [Table 9]

【００５７】＜実施例１２＞下記に示す処方に従って、
生体肝移植用の肝臓保護液を作成した。即ち、処方成分
を室温で撹拌・可溶化し、フィルター滅菌をして、肝臓
保護液を得た。尚、本実施例で用いた５７ｋＤａタンパ
ク質は、実施例１における調製方法と同様の方法によっ
て得た。ウシガエルより摘出した肝臓をこの保存液で１
時間保存し、凍結切片をつくり、顕微鏡観察したとこ
ろ、リンゲルに比べて、その細胞死は１２％少なかっ
た。これより、本発明の肝臓保護液が優れた肝臓保護作
用を有することがわかる。<Example 12> According to the following formulation,
A liver protection solution for living donor liver transplantation was prepared. That is, the ingredients were stirred and solubilized at room temperature, and sterilized with a filter to obtain a liver protection solution. The 57 kDa protein used in this example was obtained by the same method as the preparation method in Example 1. The liver removed from the bullfrog was used for 1
When stored for a time, cryosections were made and observed under a microscope, the cell death was 12% less than Ringer's. This indicates that the liver protection solution of the present invention has an excellent liver protection effect.

【００５８】[0058]

【表１０】 [Table 10]

【００５９】＜実施例１３＞肝細胞の増殖促進作用ローヤルゼリー中の５７ｋＤａタンパク質の肝細胞の増
殖促進作用を培養下に於けるアルブミンの放出量を指標
にして測定した。Example 13 Hepatocyte Growth-Promoting Action The hepatocyte growth-promoting action of the 57 kDa protein in royal jelly was measured using the amount of albumin released in culture as an index.

【００６０】実施例１の手技に従って、ラット肝細胞を
５７ｋＤａタンパク質の存在下（０．５ｍｇ／ｍｌ）及
び非存在下培養し、培養上清について、サンドイッチ抗
体法により、肝細胞より放出されたアルブミン量を測定
した。即ち、９６穴ウェルを抗ラットアルブミンＩｇＧ
抗体でコーティングし、定時間毎に採取した培養上清を
５０μｌ加え、２時間抗体と反応させた後、Ｔ−ＰＢＳ
２００μｌで３回洗浄した後、５０μｌの西洋ワサビペ
ルオキシダーゼ標識抗ラビットアルブミンＩｇＧ抗体を
ＰＢＳで１０００倍希釈し、加え、３７℃で２時間反応
させた。ＰＢＳ２００μｌで５回洗浄し、７５μｌの基
質溶液を添加し、室温で色が変わるまでインキュベーシ
ョンし、２５μｌの１０％希硫酸を加え、反応を止め
た。プレートリコーダーで４９２ｎｍの吸光度を測定し
た。尚、本実施例で用いた５７ｋＤａタンパク質は、実
施例１における調製方法と同様の方法によって得た。According to the procedure of Example 1, rat hepatocytes were cultured in the presence (0.5 mg / ml) or absence of 57 kDa protein, and the culture supernatant was subjected to the sandwich antibody method to release albumin from hepatocytes. The amount was measured. That is, a 96-well was prepared using anti-rat albumin IgG.
After coating with an antibody and adding 50 μl of a culture supernatant collected at regular time intervals, and reacting with the antibody for 2 hours, T-PBS
After washing three times with 200 μl, 50 μl of horseradish peroxidase-labeled anti-rabbit albumin IgG antibody was diluted 1000-fold with PBS, added, and reacted at 37 ° C. for 2 hours. After washing 5 times with 200 μl of PBS, 75 μl of the substrate solution was added, incubated at room temperature until the color changed, and the reaction was stopped by adding 25 μl of 10% diluted sulfuric acid. The absorbance at 492 nm was measured with a plate recorder. The 57 kDa protein used in this example was obtained by the same method as the preparation method in Example 1.

【００６１】結果を吸光度として表１１に示す。これよ
り、５７ｋＤａタンパク質により、肝細胞からのアルブ
ミンの放出量が増加していることがわかる。即ち、本発
明の肝臓保護剤である、５７ｋＤａタンパク質の存在に
より、肝細胞が保護され、その増殖が促進されているこ
とがわかる。The results are shown in Table 11 as absorbance. This shows that the amount of albumin released from hepatocytes is increased by the 57 kDa protein. That is, it can be seen that the presence of the 57 kDa protein, which is the hepatoprotective agent of the present invention, protects hepatocytes and promotes their proliferation.

【００６２】[0062]

【表１１】 [Table 11]

【００６３】[0063]

【発明の効果】本発明によれば、肝機能障害等の改善も
しくは予防、又は移植用肝臓の移送等等の保護に好適な
肝臓保護剤を提供することが出来る。According to the present invention, it is possible to provide a liver protecting agent suitable for improving or preventing liver dysfunction and the like, or protecting the liver for transplantation and the like.

【００６４】[0064]

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> ポーラ化成工業株式会社 <120> 肝臓保護剤 <130> P-6856 <140> <141> 1999-12-3 <150> JP 11-074755 <151> 1999-3-19 <160> 3 <170> PatentIn Ver. 2.0[Sequence List] SEQUENCE LISTING <110> POLA KASEI KOGYO CO., LTD. <120> Liver protectant <130> P-6856 <140> <141> 1999-12-3 <150> JP 11-074755 <151> 1999-3 -19 <160> 3 <170> PatentIn Ver. 2.0

【００６５】 <210> １ <211> 25 <212> PRT <213> Apis mellifera <220> <221> UNSURE <222> (24) <223> Xaa=unkwnon <400> 1 Asn Ile Leu Arg Gly Glu Ser Leu Leu Lys Lys Leu Pro Ile Leu His 1 5 10 15 Glu Met Lys Phe Phe Asp Tyr Xaa Asp 20 25<210> 1 <211> 25 <212> PRT <213> Apis mellifera <220> <221> UNSURE <222> (24) <223> Xaa = unkwnon <400> 1 Asn Ile Leu Arg Gly Glu Ser Leu Leu Lys Lys Leu Pro Ile Leu His 1 5 10 15 Glu Met Lys Phe Phe Asp Tyr Xaa Asp 20 25

【００６６】 <210> 2 <211> 1430 <212> DNA <213> Apis mellifera <220> <221> CDS <222> (46)..(1341) <220> <221> sig_peptide <222> (46)..(102) <220> <221> mat_peptide <222> (103)..(1341) <220> <221> UNSURE <222> (1134) <223> n=a or g or c or t <400> 2 ttcacgtaca atattccatt gcttcgttac tcgcagctta gaaaa atg aca aga ttg 57 Met Thr Arg Leu ttt atg ctg gta tgc ctt ggc ata gtt tgt caa ggt acg aca ggc aac 105 Phe Met Leu Val Cys Leu Gly Ile Val Cys Gln Gly Thr Thr Gly Asn -15 -10 -5 -1 1 att ctt cga gga gag tct tta aac aaa tca tta ccc atc ctt cac gaa 153 Ile Leu Arg Gly Glu Ser Leu Asn Lys Ser Leu Pro Ile Leu His Glu 5 10 15 tgg aaa ttc ttt gat tat gat ttc ggt agc gat gaa aga aga caa gat 201 Trp Lys Phe Phe Asp Tyr Asp Phe Gly Ser Asp Glu Arg Arg Gln Asp 20 25 30 gca att cta tct ggc gaa tac gac tac aag aat aat tat cca tcc gac 249 Ala Ile Leu Ser Gly Glu Tyr Asp Tyr Lys Asn Asn Tyr Pro Ser Asp 35 40 45 att gac caa tgg cat gat aag att ttt gtc acc atg ctg aga tac aat 297 Ile Asp Gln Trp His Asp Lys Ile Phe Val Thr Met Leu Arg Tyr Asn 50 55 60 65 ggc gta cct tcc tct ttg aac gtg ata tct aaa aag gtc ggt gat ggt 345 Gly Val Pro Ser Ser Leu Asn Val Ile Ser Lys Lys Val Gly Asp Gly 70 75 80 ggt cct ctt cta caa cct tat ccc gat tgg tcg ttt gct aaa tat gac 393 Gly Pro Leu Leu Gln Pro Tyr Pro Asp Trp Ser Phe Ala Lys Tyr Asp 85 90 95 gat tgc tct gga atc gtg agc gcc tca aaa ctt gcg atc gac aaa tgc 441 Asp Cys Ser Gly Ile Val Ser Ala Ser Lys Leu Ala Ile Asp Lys Cys 100 105 110 gac aga ttg tgg gtt ctg gac tca ggt ctt gtc aat aat act caa ccc 489 Asp Arg Leu Trp Val Leu Asp Ser Gly Leu Val Asn Asn Thr Gln Pro 115 120 125 atg tgt tct cca aaa ctg ctc acc ttt gat ctg act acc tcg caa ttg 537 Met Cys Ser Pro Lys Leu Leu Thr Phe Asp Leu Thr Thr Ser Gln Leu 130 135 140 145 ctc aag caa gtt gaa ata cca cat gat gtt gcc gta aat gcc act aca 585 Leu Lys Gln Val Glu Ile Pro His Asp Val Ala Val Asn Ala Thr Thr 150 155 160 gga aag gga aga tta tca tct cta gct gtt caa tct tta gat tgc aat 633 Gly Lys Gly Arg Leu Ser Ser Leu Ala Val Gln Ser Leu Asp Cys Asn 165 170 175 aca aat agc gat act atg gtg tac ata gca gac gag aaa ggt gaa ggt 681 Thr Asn Ser Asp Thr Met Val Tyr Ile Ala Asp Glu Lys Gly Glu Gly 180 185 190 tta atc gtg tat cat aat tct gat gat tcc ttc cat cga ttg act tcc 729 Leu Ile Val Tyr His Asn Ser Asp Asp Ser Phe His Arg Leu Thr Ser 195 200 205 aac act ttc gat tac gat cct aaa ttt acc aaa atg acg atc gat gga 777 Asn Thr Phe Asp Tyr Asp Pro Lys Phe Thr Lys Met Thr Ile Asp Gly 210 215 220 225 gaa agt tac aca gcc caa gat gga att tct gga atg gct ctt agt ccc 825 Glu Ser Tyr Thr Ala Gln Asp Gly Ile Ser Gly Met Ala Leu Ser Pro 230 235 240 atg act aac aat ctc tat tac agt cct gta gct tcc acc agt ttg tat 873 Met Thr Asn Asn Leu Tyr Tyr Ser Pro Val Ala Ser Thr Ser Leu Tyr 245 250 255 tat gtt aac acg gaa caa ttc aga aca tcc gat tat caa cag aat gac 921 Tyr Val Asn Thr Glu Gln Phe Arg Thr Ser Asp Tyr Gln Gln Asn Asp 260 265 270 ata cat tac gaa gga gtc caa aat att ttg gat acc caa tcg tcc gct 969 Ile His Tyr Glu Gly Val Gln Asn Ile Leu Asp Thr Gln Ser Ser Ala 275 280 285 aaa gta gta tca aag agt ggc gtt ctc ttc ttc gga ttg gtg ggc gat 1017 Lys Val Val Ser Lys Ser Gly Val Leu Phe Phe Gly Leu Val Gly Asp 290 295 300 305 tca gct ctt ggc tgc tgg aac gaa cat cga aca ctt gaa aga cac aat 1065 Ser Ala Leu Gly Cys Trp Asn Glu His Arg Thr Leu Glu Arg His Asn 310 315 320 atc cgt acc gtc gct caa agt gat gag act ctt caa atg atc gct agc 1113 Ile Arg Thr Val Ala Gln Ser Asp Glu Thr Leu Gln Met Ile Ala Ser 325 330 335 atg aag att aag gaa gct ctn cca cac gtg cct ata ttc gat agg tat 1161 Met Lys Ile Lys Glu Ala Xaa Pro His Val Pro Ile Phe Asp Arg Tyr 340 345 350 ata aac cgt gaa tac ata ttg gtt tta agt aac aaa atg caa aaa atg 1209 Ile Asn Arg Glu Tyr Ile Leu Val Leu Ser Asn Lys Met Gln Lys Met 355 360 365 gtg aat aat gac ttc aac ttc gac gat gtt aac ttc aga att atg aac 1257 Val Asn Asn Asp Phe Asn Phe Asp Asp Val Asn Phe Arg Ile Met Asn 370 375 380 385 gcg aat gta aac gaa ttg ata ttg aac act cgt tgc gaa aat ccc gat 1305 Ala Asn Val Asn Glu Leu Ile Leu Asn Thr Arg Cys Glu Asn Pro Asp 390 395 400 aat gat cga aca cct ttc aaa att tca atc cat ttg taaaatctga 1351 Asn Asp Arg Thr Pro Phe Lys Ile Ser Ile His Leu 405 410 gttttttgtt atatattaaa tatttctcga aatttctttc cattatgaat gtataaaata 1411 aatattgttt tcgcataat 1430<210> 2 <211> 1430 <212> DNA <213> Apis mellifera <220> <221> CDS <222> (46) .. (1341) <220> <221> sig_peptide <222> (46 ) .. (102) <220> <221> mat_peptide <222> (103) .. (1341) <220> <221> UNSURE <222> (1134) <223> n = a or g or c or t < 400> 2 ttcacgtaca atattccatt gcttcgttac tcgcagctta gaaaa atg aca aga ttg 57 Met Thr Arg Leu ttt atg ctg gta tgc ctt ggc ata gtt tgt caa ggt acg aca ggc aac 105 Phe Met Leu Val Cys Leu Gly Gly Gly -15 -10 -5 -1 -1 1 att ctt cga gga gag tct tta aac aaa tca tta ccc atc ctt cac gaa 153 Ile Leu Arg Gly Glu Ser Leu Asn Lys Ser Leu Pro Ile Leu His Glu 5 10 15 tgg aaa ttc ttt gat tat gat ttc ggt agc gat gaa aga aga caa gat 201 Trp Lys Phe Phe Asp Tyr Asp Phe Gly Ser Asp Glu Arg Arg Gln Asp 20 25 30 gca att cta tct ggc gaa tac gac tac aag aat aat tat cca tcc gac 249 A Leu Ser Gly Glu Tyr Asp Tyr Lys Asn Asn Tyr Pro Ser Asp 35 40 45 att gac caa tgg cat gat aag att ttt gtc acc atg ctg aga tac aat 297 Ile Asp Gln Trp His As p Lys Ile Phe Val Thr Met Leu Arg Tyr Asn 50 55 60 65 ggc gta cct tcc tct ttg aac gtg ata tct aaa aag gtc ggt gat ggt 345 Gly Val Pro Ser Ser Leu Asn Val Ile Ser Lys Lys Val Gly Asp Gly 70 75 80 ggt cct ctt cta caa cct tat ccc gat tgg tcg ttt gct aaa tat gac 393 Gly Pro Leu Leu Gln Pro Tyr Pro Asp Trp Ser Phe Ala Lys Tyr Asp 85 90 95 gat tgc tct gga atc gtg agc gcc tca aaa ctt gc atc gac aaa tgc 441 Asp Cys Ser Gly Ile Val Ser Ala Ser Lys Leu Ala Ile Asp Lys Cys 100 105 110 gac aga ttg tgg gtt ctg gac tca ggt ctt gtc aat aat act caa ccc 489 Asp Arg Leu Trp Val Leu Asp Ser Gly Leu Val Asn Asn Thr Gln Pro 115 120 125 atg tgt tct cca aaa ctg ctc acc ttt gat ctg act acc tcg caa ttg 537 Met Cys Ser Pro Lys Leu Leu Thr Phe Asp Leu Thr Thr Ser Gln Leu 130 135 140 145 ctc aag caa gtt gaa ata cca cat gat gtt gcc gta aat gcc act aca 585 Leu Lys Gln Val Glu Ile Pro His Asp Val Ala Val Asn Ala Thr Thr 150 155 160 gga aag gga aga tta tca tct cta gct gtt caa tct tta gat tgc aat 633 Gly Lys Gly Arg Leu Ser Ser Leu Ala Val Gln Ser Leu Asp Cys Asn 165 170 175 aca aat agc gat act atg gtg tac ata gca gac gag aaa ggt gaa ggt 681 Thr Asn Ser Asp Thr Met Val Tyr Ile Ala Asp Glu Lys Gly Glu Gly 180 185 190 tta atc gtg tat cat aat tct gat gat tcc ttc cat cga ttg act tcc 729 Leu Ile Val Tyr His Asn Ser Asp Asp Ser Phe His Arg Leu Thr Ser 195 200 205 aac act ttc gat tac gat cct aaa ttt acc aaa atg acg atc gat gga 777 Asn Thr Phe Asp Tyr Asp Pro Lys Phe Thr Lys Met Thr Ile Asp Gly 210 215 220 225 gaa agt tac aca gcc caa gat gga att tct gga atg gct ctt agt ccc 825 Glu Ser Tyr Thr Ala Gln Asp Gly Ile Ser Gly Met Ala Leu Ser Pro 230 235 240 atg act aac aat ctc tat tac agt cct gta gct tcc acc agt ttg tat 873 Met Thr Asn Asn Leu Tyr Tyr Ser Pro Val Ala Ser Thr Ser Leu Tyr 245 250 255 tat gtt aac acg gaa caa ttc aga aca tcc gat tat caa cag aat gac 921 Tyr Val Asn Thr Glu Gln Phe Arg Thr Ser Asp Tyr Gln Gln Asn Asp 260 265 270 ata cat tac gaa gga gtc caa aat att ttg gat acc caa tcg tcc gct 969His Tyr Glu Gly Val Gln Asn Ile Leu Asp Thr Gln Ser Ser Ala 275 280 285 aaa gta gta tca aag agt ggc gtt ctc ttc ttc gga ttg gtg ggc gat 1017 Lys Val Val Ser Lys Ser Gly Val Leu Phe Phe Gly Leu Val Gly Asp 290 295 300 305 tca gct ctt ggc tgc tgg aac gaa cat cga aca ctt gaa aga cac aat 1065 Ser Ala Leu Gly Cys Trp Asn Glu His Arg Thr Leu Glu Arg His Asn 310 315 320 atc cgt acc gtc gct caa agt gat gag act ctt caa atg atc gct agc 1113 Ile Arg Thr Val Ala Gln Ser Asp Glu Thr Leu Gln Met Ile Ala Ser 325 330 335 atg aag att aag gaa gct ctn cca cac gtg cct ata ttc gat agg tat 1161 Met Lys Ile Lys Glu Ala Xaa Pro His Val Pro Ile Phe Asp Arg Tyr 340 345 350 ata aac cgt gaa tac ata ttg gtt tta agt aac aaa atg caa aaa atg 1209 Ile Asn Arg Glu Tyr Ile Leu Val Leu Ser Asn Lys Met Gln Lys Met 355 360 365 gtg aat aat gac ttc aac ttc gac gat gtt aac ttc aga att atg aac 1257 Val Asn Asn Asp Phe Asn Phe Asp Asp Val Asn Phe Arg Ile Met Asn 370 375 380 385 gcg aat gta aac gaa ttg ata ttg aac act cgt a aat ccc gat 1305 Ala Asn Val Asn Glu Leu Ile Leu Asn Thr Arg Cys Glu Asn Pro Asp 390 395 400 aat gat cga aca cct ttc aaa att tca atc cat ttg taaaatctga 1351 Asn Asp Arg Thr Pro Phe Lys Ile Ser Ile His Leu 405 410 gttttttgtt atatattaaa tatttctcga aatttctttc cattatgaat gtataaaata 1411 aatattgttt tcgcataat 1430

【００６７】 <210> 3 <211> 432 <212> PRT <213> Apis mellifera <220> <221> UNSURE <222> (344) <223> Xaa=unkwnon <400> 3 Met Thr Arg Leu Phe Met Leu Val Cys Leu Gly Ile Val Cys Gln Gly -15 -10 -5 Thr Thr Gly Asn Ile Leu Arg Gly Glu Ser Leu Asn Lys Ser Leu Pro -1 1 5 10 Ile Leu His Glu Trp Lys Phe Phe Asp Tyr Asp Phe Gly Ser Asp Glu 15 20 25 Arg Arg Gln Asp Ala Ile Leu Ser Gly Glu Tyr Asp Tyr Lys Asn Asn 30 35 40 45 Tyr Pro Ser Asp Ile Asp Gln Trp His Asp Lys Ile Phe Val Thr Met 50 55 60 Leu Arg Tyr Asn Gly Val Pro Ser Ser Leu Asn Val Ile Ser Lys Lys 65 70 75 Val Gly Asp Gly Gly Pro Leu Leu Gln Pro Tyr Pro Asp Trp Ser Phe 80 85 90 Ala Lys Tyr Asp Asp Cys Ser Gly Ile Val Ser Ala Ser Lys Leu Ala 95 100 105 Ile Asp Lys Cys Asp Arg Leu Trp Val Leu Asp Ser Gly Leu Val Asn 110 115 120 125 Asn Thr Gln Pro Met Cys Ser Pro Lys Leu Leu Thr Phe Asp Leu Thr 130 135 140 Thr Ser Gln Leu Leu Lys Gln Val Glu Ile Pro His Asp Val Ala Val 145 150 155 Asn Ala Thr Thr Gly Lys Gly Arg Leu Ser Ser Leu Ala Val Gln Ser 160 165 170 Leu Asp Cys Asn Thr Asn Ser Asp Thr Met Val Tyr Ile Ala Asp Glu 175 180 185 Lys Gly Glu Gly Leu Ile Val Tyr His Asn Ser Asp Asp Ser Phe His 190 195 200 205 Arg Leu Thr Ser Asn Thr Phe Asp Tyr Asp Pro Lys Phe Thr Lys Met 210 215 220 Thr Ile Asp Gly Glu Ser Tyr Thr Ala Gln Asp Gly Ile Ser Gly Met 225 230 235 Ala Leu Ser Pro Met Thr Asn Asn Leu Tyr Tyr Ser Pro Val Ala Ser 240 245 250 Thr Ser Leu Tyr Tyr Val Asn Thr Glu Gln Phe Arg Thr Ser Asp Tyr 255 260 265 Gln Gln Asn Asp Ile His Tyr Glu Gly Val Gln Asn Ile Leu Asp Thr 270 275 280 285 Gln Ser Ser Ala Lys Val Val Ser Lys Ser Gly Val Leu Phe Phe Gly 290 295 300 Leu Val Gly Asp Ser Ala Leu Gly Cys Trp Asn Glu His Arg Thr Leu 305 310 315 Glu Arg His Asn Ile Arg Thr Val Ala Gln Ser Asp Glu Thr Leu Gln 320 325 330 Met Ile Ala Ser Met Lys Ile Lys Glu Ala Xaa Pro His Val Pro Ile 335 340 345 Phe Asp Arg Tyr Ile Asn Arg Glu Tyr Ile Leu Val Leu Ser Asn Lys 350 355 360 365 Met Gln Lys Met Val Asn Asn Asp Phe Asn Phe Asp Asp Val Asn Phe 370 375 380 Arg Ile Met Asn Ala Asn Val Asn Glu Leu Ile Leu Asn Thr Arg Cys 385 390 395 Glu Asn Pro Asp Asn Asp Arg Thr Pro Phe Lys Ile Ser Ile His Leu 400 405 410<210> 3 <211> 432 <212> PRT <213> Apis mellifera <220> <221> UNSURE <222> (344) <223> Xaa = unkwnon <400> 3 Met Thr Arg Leu Phe Met Leu Val Cys Leu Gly Ile Val Cys Gln Gly -15 -10 -5 Thr Thr Gly Asn Ile Leu Arg Gly Glu Ser Leu Asn Lys Ser Leu Pro -1 1 5 10 Ile Leu His Glu Trp Lys Phe Phe Asp Tyr Asp Phe Gly Ser Asp Glu 15 20 25 Arg Arg Gln Asp Ala Ile Leu Ser Gly Glu Tyr Asp Tyr Lys Asn Asn 30 35 40 45 Tyr Pro Ser Asp Ile Asp Gln Trp His Asp Lys Ile Phe Val Thr Met 50 55 60 Leu Arg Tyr Asn Gly Val Pro Ser Ser Leu Asn Val Ile Ser Lys Lys 65 70 75 Val Gly Asp Gly Gly Pro Leu Leu Gln Pro Tyr Pro Asp Trp Ser Phe 80 85 90 Ala Lys Tyr Asp Asp Cys Ser Gly Ile Val Ser Ala Ser Lys Leu Ala 95 100 105 Ile Asp Lys Cys Asp Arg Leu Trp Val Leu Asp Ser Gly Leu Val Asn 110 115 120 125 Asn Thr Gln Pro Met Cys Ser Pro Lys Leu Leu Thr Phe Asp Leu Thr 130 135 140 Thr Ser Gln Leu Leu Lys Gln Val Glu Ile Pro His Asp Val Ala Val 145 150 155 Asn Ala Thr Thr Gly Lys Gly Arg Leu Ser Ser Leu Ala Val Gln Ser 160 165 170 Leu Asp Cys Asn Thr Asn Ser Asp Thr Met Val Tyr Ile Ala Asp Glu 175 180 185 Lys Gly Glu Gly Leu Ile Val Tyr His Asn Ser Asp Asp Ser Phe His 190 195 200 205 Arg Leu Thr Ser Asn Thr Phe Asp Tyr Asp Pro Lys Phe Thr Lys Met 210 215 220 Thr Ile Asp Gly Glu Ser Tyr Thr Ala Gln Asp Gly Ile Ser Gly Met 225 230 235 Ala Leu Ser Pro Met Thr Asn Asn Leu Tyr Tyr Ser Pro Val Ala Ser 240 245 250 Thr Ser Leu Tyr Tyr Val Asn Thr Glu Gln Phe Arg Thr Ser Asp Tyr 255 260 265 Gln Gln Asn Asp Ile His Tyr Glu Gly Val Gln Asn Ile Leu Asp Thr 270 275 280 285 285 Gln Ser Ser Ala Lys Val Val Ser Lys Ser Gly Val Leu Phe Phe Gly 290 295 300 Leu Val Gly Asp Ser Ala Leu Gly Cys Trp Asn Glu His Arg Thr Leu 305 310 315 Glu Arg His Asn Ile Arg Thr Val Ala Gln Ser Asp Glu Thr Leu Gln 320 325 330 Met Ile Ala Ser Met Lys Ile Lys Glu Ala Xaa Pro His Val Pro Ile 335 340 345 Phe Asp Arg Tyr Ile Asn Arg Glu Tyr Ile Leu Val Leu Ser Asn Lys 350 355 360 365 Met Gln Lys Met Val Asn Asn Asp Phe Asn Phe Asp Asp Val Asn Phe 370 375 380 Arg Ile Met Asn Ala Asn Val Asn Glu Leu Ile Leu Asn Thr Arg Cys 385 390 395 Glu Asn Pro Asp Asn Asp Arg Thr Pro Phe Lys Ile Ser Ile His Leu 400 405 410

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ａ２３Ｌ 2/38 Ａ６１Ｋ 35/64 Ａ６１Ｋ 35/64 Ａ２３Ｌ 2/00 Ｆ (72)発明者三谷信神奈川県横浜市戸塚区柏尾町560 ポーラ化成工業株式会社戸塚研究所内 (72)発明者宮崎博隆神奈川県横浜市戸塚区柏尾町560 ポーラ化成工業株式会社戸塚研究所内Ｆターム(参考） 4B017 LC03 LE10 LK15 LK20 LL09 LP01 4B018 LB08 LB10 LE01 MD20 MD77 ME14 MF01 MF08 4C084 AA02 BA02 BA05 CA49 MA17 MA52 MA66 ZA752 4C087 AA01 AA02 BB22 CA44 MA52 ZA75 4H011 BB19 CA01 CB05 CD02 DH11──────────────────────────────────────────────────の Continued on the front page (51) Int.Cl. ⁷ Identification symbol FI Theme coat ゛ (Reference) A23L 2/38 A61K 35/64 A61K 35/64 A23L 2/00 F (72) Inventor Shin Mitani Yokohama, Kanagawa 560 Pola, Kashio-cho, Totsuka-ku, Ichizuka, Japan Totsuka Research Laboratories, Inc. (72) Inventor Hirotaka Miyazaki 560, Kashio-cho, Totsuka-ku, Yokohama-shi, Kanagawa Prefecture F-term in Totsuka Research Laboratories, Toka Laboratories FB (reference) 4B018 LB08 LB10 LE01 MD20 MD77 ME14 MF01 MF08 4C084 AA02 BA02 BA05 CA49 MA17 MA52 MA66 ZA752 4C087 AA01 AA02 BB22 CA44 MA52 ZA75 4H011 BB19 CA01 CB05 CD02 DH11

Claims

[Claims]

1. A hepatoprotective agent comprising, as an active ingredient, a protein in royal jelly specified by the following properties. (A) Form a single band in native polyacrylamide gel electrophoresis of proteins in royal jelly. (B) Molecular weight measured by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis under reducing conditions: about 57 kDa.

2. The protein was prepared by using a TSK gel G3000SW (7.5 × 30 cm) manufactured by Tosoh Corporation as a column, and 0.3M sodium chloride, 0.05%
0.1 M phosphate buffer containing sodium azide (pH 7.
0) was used as a developing solution, the flow rate was set to 0.3 ml / min, the column temperature was set to 35 ° C., and the retention time was 2 in high-performance liquid chromatography in which detection was performed at an absorbance of 280 nm.
The hepatoprotective agent according to claim 1, which is a protein having a peak at 5 minutes to 30 minutes.

3. The hepatoprotective agent according to claim 1, wherein the protein comprises the amino acid sequence of amino acids 1 to 8 of SEQ ID NO: 1.

4. A medicament for treating or preventing a liver disease, comprising the hepatoprotective agent according to any one of claims 1 to 3.

5. A food containing the hepatoprotective agent according to claim 1.

6. The method according to claim 1, which is used for preserving a liver for transplantation.
The hepatoprotective agent according to any one of claims 3 to 3.