JP2000325099A - 新規な核酸ハイブリダイゼーション用緩衝溶液 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】ハンドリングが良好で、非ＲＩ系でのＳ／Ｎ比
の高い迅速検出の可能な核酸ハイブリダイゼーション溶
液を提供する。 【解決手段】２％(重量／容量)以上の濃度で陰イオン性
界面活性剤およびポリエチレングリコールを含有し、か
つｐＨが７．２より高いことを特徴とする核酸ハイブリ
ダイゼーション用緩衝溶液。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、核酸ハイブリダイ
ゼーション用の試薬組成および方法に関する。さらに詳
しくは、ハイブリダイゼーション速度を上昇させ、かつ
非ＲＩ検出系でのバックグラウンドの上昇を抑制するこ
との可能な、ハイブリダイゼーション用の試薬組成およ
び該組成物を含有するキットおよび方法に関する。本発
明は、ナイロン膜上の核酸の検出およびＤＮＡチップや
Microarrayなどのハイブリダイゼーション用途にも応用
が可能である。

【０００２】

【従来の技術】核酸ハイブリダイゼーション技術は核酸
を検出する上で、生化学、分子生物学分野での研究及び
臨床分野における診断に欠くことのできない重要な技術
の一つである。特に電気泳動技術とハイブリダイゼーシ
ョン技術を組み合わせたSouthern blotおよびNorthern
blotによる解析は、様々な重要な情報を得ることが可能
であることから広く使われている。これらの技術はプロ
ーブと呼ばれる標識核酸と一本鎖鋳型核酸の相補性を利
用した核酸の検出方法であるが、実際使用する上で、特
異性及びハイブリダイゼーションの速度が重要なファク
ターとなる。また、近年、従来から用いられてきたラジ
オアイソトープ（以下、ＲＩと示す）ラベルしたプロー
ブに代わり、ジゴキシゲニン、ビオチンなどを用いた非
ＲＩ系で検出する例が多くなり、非ＲＩ系特有のバック
グラウンドを除去することが重要な課題の一つとなって
いる。

【０００３】ハイブリダイゼーション用緩衝液としては
Molecular cloning second edition(1989) 9.50に記載
されるような、５〜６×ＳＳＰＥ（２０×組成：３Ｍ
ＮａＣｌ,１７３ｍＭＮａＨ₂ＰＯ₄, ２５ｍＭＥＤＴＡ;
ｐＨ７．４)もしくは５〜６×ＳＳＣ(２０×組成：３Ｍ
ＮａＣｌ,０．３Ｍクエン酸ナトリウム:ｐＨ７．０)を
ベースとした溶液に２〜１０×Denhardt's（１０×組
成：２％ Ficol、 ２％ Bovin serum albumin、 ２％ Po
lyvinil piroridon)およびドデシル（ラウリル）硫酸ナ
トリウム（以下、ＳＤＳと示す）を０．１〜０．５％と
なるように添加したものが主流である。この緩衝液に
は、必要に応じて変性サケ精子ＤＮＡやホルムアミドが
添加される。また、これらの溶液にポリエチレングリコ
ール（以下、ＰＥＧと示す）もしくはデキストラン硫酸
を１０％になるように添加することで、ハイブリダイゼ
ーションの速度を上昇させることが可能であることが明
記されている。この緩衝液の特徴は、ＳＤＳの濃度が１
％以下と比較的低く、ブロッキング作用の高いDenhard
t's溶液を使用することが特徴である。しかし、この緩
衝液を用いてジゴキシゲンンなどで標識したプローブを
用いてハイブリダイゼーション解析を実施した場合、バ
ックグラウンドが明らかに上昇する。

【０００４】一方、７〜２０％ＳＤＳ、リン酸緩衝液(ｐ
Ｈ７．２)をベースとした非ＲＩ用ハイブリダイゼーシ
ョン用緩衝液も報告され、現在ジゴキシゲンなどの非Ｒ
Ｉ系でのハイブリダイゼーション用緩衝液として主流と
なっている。この緩衝液はＳＤＳを高濃度で添加するこ
とにより、膜へのプローブの非特異的な吸着を抑えるこ
とが可能であり、変性サケ精子ＤＮＡを加えることなく
使用できるため便利である（Analytical Biochemistry
210,235-244(1993)）。しかし、この緩衝液は保存中に
室温が低下した場合、ＳＤＳが大量に析出する傾向にあ
り、ハンドリング面で問題となる。２％以上の濃度でＳ
ＤＳを添加する組成は、非ＲＩ系において、様々な組成
が報告されている。いずれもｐＨ７．０〜７．２、ＳＤ
Ｓ濃度が７〜２０％というのが特徴である（脱アイソト
ープ実験プロトコール、秀潤社）。また、この組成に
おいてハイブリダイゼーションを促進する組成について
は報告されていおらず、一晩ハイブリダイゼーションす
るプロトコールとなっているのが現状である。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】このような理由から、
ハイブリダイゼーション速度を上昇させかつ非ＲＩ検出
系でのバックグラウンドの上昇が抑制でき、更に室温で
結晶の析出しにくい液組成の開発が求められていた。す
なわち本発明の目的は、ハンドリングが良好で、非ＲＩ
系でのＳ／Ｎ比の高い迅速検出の可能なハイブリダイゼ
ーション液組成を提供することである。

【０００６】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記事情
に鑑み、種々検討を重ねた結果、２％以上のＳＤＳおよ
びＰＥＧを含有するｐＨ７．２より高い緩衝液を用いる
ことによりハイブリダイゼーションを促進させつつ、非
ＲＩ系でのバックグラウンドの上昇を抑えることが可能
であることを見出し、また、２％以上のＳＤＳとＰＥＧ
を共存させることにより低温下でのＳＤＳ結晶の析出を
緩和することが可能であることを見出し、本発明を完成
させるに至った。

【０００７】すなわち、本発明は、以下のような構成か
らなる。 （１）２％(重量／容量)以上の濃度で）陰イオン性界面
活性剤およびポリエチレングリコールを含有し、かつｐ
Ｈが７．２より高いことを特徴とする核酸ハイブリダイ
ゼーション用緩衝溶液。 （２）陰イオン性界面活性剤がラウリル硫酸ナトリウム
もしくはＮ−ラウロイルサルコシンナトリウムのいずれ
かである（１）の核酸ハイブリダイゼーション用緩衝溶
液。 （３）ベタイン及び／又は核酸成分を含有する（１）ま
たは（２）の核酸ハイブリダイゼーション用緩衝溶液。 （４）キレート剤を含有する（１）〜（３）のいずれか
の核酸ハイブリダイゼーション用緩衝溶液。 （５）タンパク質成分を含有する（１）〜（４）のいず
れかの核酸ハイブリダイゼーション緩衝液。 （６）２％(重量／容量)以上の濃度で陰イオン性界面活
性剤およびポリエチレングリコールを含有し、かつｐＨ
が７．２より高い緩衝溶液であって、ベタイン及び／又
は核酸成分を含有する緩衝溶液を含有することを特徴と
する核酸ハイブリダイゼーション用キット。 （７）２％(重量／容量)以上の濃度で陰イオン性界面活
性剤およびポリエチレングリコールを含有し、かつｐＨ
が７．２より高い緩衝溶液を用いて核酸をハイブリダイ
ズせしめることを特徴とする核酸ハイブリダイゼーショ
ン方法。

【０００８】

【発明の実施の形態】本発明において用いるＰＥＧは＃
２００００〜４０００が好ましく用いられ、特に＃２０
０００〜６０００がハイブリダイゼーション効果が高く
好適に用いられる。また、ＰＥＧ＃２００００は分子量
１５０００〜２００００、＃６０００は分子量７３００
〜９０００、＃４０００は分子量２７００〜３５００の
分画である。従来よりハイブリダイゼーションを高める
効果の確認されているデキストラン硫酸は溶解が難しく
好ましくない。

【０００９】本発明において用いられる陰イオン性界面
活性剤としては、例えば、ラウリル硫酸ナトリウム（Ｓ
ＤＳ）、Ｎ−ラウロイルサルコシンナトリウム等が挙げ
られ、なかでも、ＳＤＳが好ましく用いられる。その濃
度としては５％以上が好ましい。ＳＤＳはバックグラウ
ンドを抑える効果が高く、無添加ではバックグラウンド
の上昇が著しい。また、１０％以上の添加は、室温保存
下における結晶析出の原因となるため、１０％以下の濃
度で用いることが好ましい。

【００１０】また、本発明において用いる緩衝液として
は特に限定されるものではないが、リン酸ナトリウム緩
衝液が特に好ましい。該緩衝液はｐＨが７．２より高い
ことが重要である。７．２以下では、バックグラウンド
を生じ易いジゴキシゲニンラベルしたプローブを用いた
場合、明らかにバックグラウンドの上昇が認められる。
また、ｐＨ７．６以上においては、シグナルの低下が認
められるため、リン酸緩衝液はｐＨ７．４前後で使用す
ることが重要である。また、従来より使用されてきた、
ＳＳＣやＳＳＰＥなどの緩衝液は、５〜６×濃度で使用
した場合、保存時のＳＤＳの析出が著しいために避ける
べきである。

【００１１】また、ナトリウムイオン濃度がハイブリダ
イゼーション時には重要となるが、本発明においては
０．２５〜１Ｍが好ましく用いられる。一方、ナトリウ
ムイオン濃度を高めるとＳＤＳの析出が顕著となるため
注意が必要である。

【００１２】また、本発明においては、更に、ベタイン
や変性させた核酸成分を添加することにより非特異的ハ
イブリダイゼーションを抑制せしめることが可能であ
る。ベタインとしてはトリメチルグリシンが好適に用い
られ、その濃度は０．５〜１Ｍが好ましい。ベタインと
は正電荷と負電荷を同一分子内の分離した隣り合わない
位置に有しており、しかも正電荷を有する原子にはプロ
トンとして解離しうる水素原子が結合しておらず、分子
全体としては電荷を持たない分子の総称である。ベタイ
ンは核酸の塩基の水素結合に関与し、ハイブリダイゼー
ションにおいてＧＣ含量の影響を受け難くなることが報
告されている（Biochemistry 32, 137-144(1993)）。

【００１３】核酸成分としては変性サケ精子ＤＮＡが好
適に用いられる。濃度は１０〜１００μｇ／ｍｌが好ま
しい。通常サケ精子ＤＮＡは、使用直前にボイリングし
た後、ハイブリダイゼーション緩衝液に添加されること
が多い。核酸成分については、バックグラウンドを抑え
る効果が以前より分かっており、現在使用されているハ
イブリダイゼーション緩衝溶液においても使用される例
が多く見受けられる。

【００１４】また、本発明の核酸ハイブリダイゼーショ
ン用緩衝溶液にＥＤＴＡなどのキレート作用を有する試
薬（キレート剤）を添加することも可能である。キレー
ト剤としてはＥＤＴＡが好適に用いられ、１〜１０ｍＭ
の範囲で添加されることが好ましい。該キレート剤は二
価のイオンの混入によるハイブリダイゼーションへの影
響を回避することに役立ち、また、デオキシリボヌクレ
アーゼの混入などによる影響を回避する役割も担ってい
る。更に、本発明のハイブリダイゼーション用緩衝溶液
にタンパク質成分を添加することもバックグラウンドを
抑える方策として有効である。タンパク質成分として
は、カゼインや牛血清アルブミンが有効であり、０．１
〜１％濃度が好適に用いられる。

【００１５】本発明の核酸ハイブリダイゼーション用緩
衝溶液は、通常のNorthern blotおよびSouthern blotに
よる解析以外にも、ドットハイブリダイゼーション、ス
ロットハイブリダイゼーション、マイクロプレート用い
たＤＮＡ−ＥＬＩＳＡ法およびin situ hybridization
法などにも適用が可能である。また、MicroarrayやＤＮ
Ａチップに関してもその応用は可能である。

【００１６】また、本発明の核酸ハイブリダイゼーショ
ン方法において用いることのできるプローブとしては、
ランダムプライミング法、ニックトランスレーション
法、ＰＣＲ法などによってラベルされた二本鎖ＤＮＡプ
ローブ、インビトロトランスクリプション法で作製され
たＲＮＡプローブおよび５'又は３'末端を標識したオリ
ゴヌクレオチドプローブなどを挙げることができる。ま
た、固相にプローブを固定して、標識された標的核酸を
ハイブリダイズさせるリバースハイブリダイゼーション
法やサイドイッチハイブリダイゼーション法において
も、その効果が容易に予測可能である。また、上記プロ
ーブは、³²Ｐ、³³Ｐなどのラジオアイソトープやビオチ
ン、ジゴキシゲニン、コレステロールなどの非ＲＩ化合
物、アルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼなどの
酵素およびＦＩＴＣなどの蛍光物質などで標識されたも
のが挙げられる。

【００１７】本発明の核酸ハイブリダイゼーション用緩
衝溶液における好ましい一態様としては、５００ｍＭリ
ン酸ナトリウム緩衝液(ｐＨ７．４；モル濃度はＮａ換
算)、７．５％ＳＤＳ、５％ＰＥＧ＃６０００、1 ｍＭ
ＥＤＴＡ、０．５％カゼインが挙げられる。

【００１８】更に、本発明は、上述したようなの組成の
緩衝液を用いて核酸ハイブリダイゼーションを行う方法
および核酸ハイブリダイゼーション用キットにも関す
る。本発明により、簡単、迅速でバックグラウンドの低
いハイブリダイゼーションの解析が可能となる。なお、
本発明は非ＲＩ検出系において有用であることはいうま
でもないが、ＲＩ検出系においても同様に優れた効果を
奏するものである。

【００１９】

【実施例】以下、本発明の実施例を例示することによっ
て、本発明の効果をより一層明確なものとする。なお、
実施例により、本発明は特に限定されるものではない。

【００２０】実施例１ Northern blot解析におけるＰ
ＥＧ添加によるハイブリダイゼーションの促進効果の検
討 （１）酵母サッカロミセス・セレビジエ(Saccharomyces
cerevisiae)ＲＮＡの電気泳動およびナイロン膜への転
写 (i)以下の組成でＲＮＡの調製を行う。試薬は全てナカ
ライテスク社製のものを使用し、ナイロン膜はアマシャ
ムファルマシア社製のHybond-N⁺を使用した。ＲＮＡ量
は２種類で行った。 10μg／2.25μl（2.5μg／2.25μl）yeast total RNA
２．２５μｌ ホルムアルデヒド １．７５μｌ ホルムアミド ５μｌ １０×ＭＯＰＳ 1μｌ (ii)６５℃、１５分間インキュベーション後、２μlの
電気泳動用色素を添加する。 (iii)６．７％ホルムアミド変性１％アガロースゲル（1
×ＭＯＰＳ）に上記組成物１０μｇおよび２．５μｇを
アプライし、５０ＶにてＢＰＢ色素がゲルの４／５まで
到達するまで泳動する。 (iv)１０μｇ／ｌＥｔＢｒ、０．０５ＮＮａＯＨ溶液に
ゲルを２０分間浸漬する。 (v)０．２Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ４．０)にゲルを浸漬し、
２０分間振とうする。 (vi)(v)を繰り返す。 (vii)ＵＶ照射を行って、泳動像を確認する。 (viii)ブロッターを２０×ＳＳＣ(３ＭＮａＣｌ,０．３
Ｍクエン酸ナトリウム:ｐＨ７．０)で満たし、濾紙、ゲ
ル、ナイロン膜、濾紙２枚、ペーパータオル(５ｃｍ）
の順番で載せる。 (ix)一晩ブロッティングを行う。 (x)膜をはがし、２×ＳＳＣにて１分間洗浄し、濾紙上
で乾燥する。 (xi)３０分間、８０℃にてベーキングする。

【００２１】（２）yeast actinプローブの調製 プローブは逆転写（ＲＴ）−ＰＣＲ法を用いて増幅した
yeast actin遺伝子断片(１ｋｂ)を精製した後、ベーリ
ンガーマンハイム社DIG DNA Labeling kit(CatNo. 1175
003)を用いてラベリングを行った。ＲＴ−ＰＣＲは東
洋紡社製RT-PCRhigh-Plus-(Code No. PCR-301)を用て行
った。またプライマーとしては、F:AACAATGGATTCTGAGGT
TGC R:CACCAATCCAGACGGAGTACを使用した。ＰＣＲ増幅産
物の精製には、東洋紡績製MagExtractor-PCR&Gel Clean
up-(Code No. NPK-601)を用いた。ＰＣＲ、精製および
ラベリングはキットの取扱説明書に従って行なった。プ
ローブはスポットテストを行ない最終濃度２ｎｇ／μｌ
に調製した。

【００２２】（３）ハイブリダイゼーション緩衝溶液の
調製 以下の組成のハイブリダイゼーション溶液を調製した。
試薬は全てナカライテスク社製のものを用いた。 ５００ｍＭＮａ−Ｐｉ緩衝液(ｐＨ７．４；モル濃度
はＮａで計算）、１ｍＭＥＤＴＡ、 １０％ＳＤＳ ５００ｍＭＮａ−Ｐｉ緩衝液(ｐＨ７．４；モル濃度
はＮａで計算）、１ｍＭＥＤＴＡ、 １０％ＳＤＳ、 ５％
ＰＥＧ２００００ （４）ハイブリダイゼーション、検出 (i)転写済みナイロン膜をハイブリダイゼーションバッ
クに入れ、ハイブリダイゼーション溶液を１ｍｌ添加
し、膜になじませる。 (ii)６８℃、１５分間放置する。 (iii)プローブ溶液を２ｎｇ／１０μｌとなるように滅
菌水で希釈し、５分間ボイルする。 (iv)新たに用意したハイブリダイゼーション溶液（６８
℃）にの溶液を添加する。 (v)(ii)の溶液を捨て、の溶液を添加する。 (vi)６８℃にて２時間もしくは１６時間（終夜）ハイブ
リダイゼーションを実施する。 (vii)ナイロン膜を取り出し、２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤ
Ｓにて、室温で５分間洗浄する。 (viii)(vii)を繰り返す。 (ix)６８℃にて暖めておいた０．１×ＳＳＣ、０．１％
ＳＤＳにて、６８℃で１５分間洗浄する。 (x)(ix)を繰り返す。 (xi)１００ｍＭ Tris-ＨＣｌ(ｐＨ７．５)、１５０ｍＭ
ＮａＣｌにて膜をリンスする。 (xii)１００ｍＭ Tris-ＨＣｌ(ｐＨ７．５)、１５０ｍＭ
ＮａＣｌ、５％ Blocking reagent(ベーリンガーマンハ
イム製)に膜を３７℃、３０分間浸漬する。 (xiii)アルカリホスファターゼ結合抗ジゴキシゲニン抗
体（ベーリンガーマンハイム製）を１００ｍＭ Tris-Ｈ
Ｃｌ(ｐＨ７．５)、１５０ｍＭＮａＣｌ、５％ Blocking
reagentにて１００００倍希釈した溶液に、膜を３７
℃、３０分間浸漬する。 (xiv)１００ｍＭ Tris-ＨＣｌ(ｐＨ７．５)、１５０ｍＭ
ＮａＣｌ、０．３％ Tween20にて１５分間洗浄する。 (xv)(xiv)を繰り返す。 (xvi)１００ｍＭ diethanolamine、 ２ｍＭＭｇＣｌ₂,
０．０２％ ＮａＮ₃にて５分間洗浄する。 (xvii) Lumiphos530（Lumigen社製）に５分間浸漬す
る。 (xviii)膜をラップにはさみ、暗室にてＸ線フィルムを
重ね、２時間感光する。 (xix)Ｘ線フィルムを現像する。

【００２３】（５）結果 結果を図１に示す。これは高濃度でＳＤＳを含有する核
酸ハイブリダイゼーション緩衝液組成へのＰＥＧの添加
による、ハイブリダイゼーションの促進効果の検討を行
ったものである。この結果、高濃度でＳＤＳを含有する
ハイブリダイゼーション緩衝液組成へＰＥＧを５％添加
することにより、ハイブリダイゼーションの時間短縮お
よびシグナル強度の増強が確認できた。また、ＰＥＧを
添加したものは室温が低下した場合もＳＤＳの析出は見
られなかった。

【００２４】実施例２ Northern blot解析における従
来のDenhardt's系ハイブリダイゼーション緩衝溶液との
比較 （１）サッカロミセス・セレビジエＲＮＡの電気泳動お
よびナイロン膜への転写実施例１（１）と同様に実施し
た。

【００２５】（２）yeast actinプローブの調製 実施例１（２）と同様に実施した。

【００２６】（３）ハイブリダイゼーション緩衝溶液の
調製 以下の組成のハイブリダイゼーション溶液を調製した。
試薬は全てナカライテスク社製のものを用いた。 ６×ＳＳＣ(ｐＨ７．０)、２×Denhardt's、０．１％Ｓ
ＤＳ（従来の組成） ６×ＳＳＣ(ｐＨ７．０)、２×Denhardt's、０．１％Ｓ
ＤＳ、１０％、ＰＥＧ＃２００００ ５００ｍＭＮａ−Ｐｉ緩衝液(ｐＨ７．４；モル濃度
はＮａで計算）、１ｍＭＥＤＴＡ、 １０％ＳＤＳ ５００ｍＭＮａ−Ｐｉ緩衝液(ｐＨ７．４；モル濃度
はＮａで計算）、１ｍＭＥＤＴＡ、 １０％ＳＤＳ、 ５％
ＰＥＧ＃２００００

【００２７】（４）ハイブリダイゼーション、検出 実施例１（４）と同様に実施した。

【００２８】（５）結果 結果を図２に示した。従来の組成のものについても、Ｐ
ＥＧを添加したものについては促進効果が確認できた
が、バックグラウンドが非常に高い傾向にあった。本発
明の組成においては、従来法と比較してＰＥＧを添加す
ることによるバックグラウンドの上昇は確認されず、ハ
イブリダイゼーションの促進効果のみ確認することがで
きた。

【００２９】実施例３ Northern blot解析における様
々なｐＨでのハイブリダイゼーションにおけるバックグ
ラウンドの比較 （１）ＨｅＬａ細胞ＲＮＡの電気泳動およびナイロン膜
への転写 以下の組成でＲＮＡの調製を行う。 １０μg／2.25μl（2.5μg／2.25μl）HeLa total RNA
２．２５μl ホルムアルデヒド １．７５μｌ ホルムアミド ５μl １０×ＭＯＰＳ 1μl 以下の操作は、実施例１（１）と同様に実施した。 １μlの電気泳動用色素を添加する。

【００３０】（２） Human tansferrin receptorプロー
ブの調製 プローブは逆転写（ＲＴ）−ＰＣＲ法を用いて増幅した
human transferrin receptor遺伝子断片(４．５ｋｂ)を
精製した後、ベーリンガーマンハイム社DIG DNA Labeli
ng kit(Cat No. 1175 003)を用いてラベリングを行っ
た。ＲＴ−ＰＣＲは東洋紡績製ReverTra dash(Code No.
PCR-401)を用いて行った。また、プライマーとして
は、F:CAGTTCAGAATGATGGATCAAG R:TACTCCTTAACGAGAAGAC
ATCTCAAGACを用いた。ＰＣＲ増幅産物の精製には東洋紡
製MagExtractor-PCR&Gel Clean up-を用いた。ＰＣＲ、
精製およびラベリングはキットの取扱説明書に従って行
なった。プローブは最終濃度２ｎｇ／μｌに調製した。

【００３１】（３）ハイブリダイゼーション緩衝溶液の
調製 以下の組成のハイブリダイゼーション溶液を調製した。
試薬はすべてナカライテスク社製のものを用いた。 ５００ｍＭＮａ−Ｐｉ緩衝液(ｐＨ７．２；モル濃度
はＮａで計算）、１ｍＭＥＤＴＡ、 ６％ＳＤＳ、 ５％
ＰＥＧ＃６０００ ５００ｍＭＮａ−Ｐｉ緩衝液(ｐＨ７．３；モル濃度
はＮａで計算）、１ｍＭＥＤＴＡ、 ６％ＳＤＳ、 ５％
ＰＥＧ＃６０００ ５００ｍＭＮａ−Ｐｉ緩衝液(ｐＨ７．４；モル濃度
はＮａで計算）、１ｍＭＥＤＴＡ、 ６％ＳＤＳ、 ５％
ＰＥＧ＃６０００

【００３２】（４）ハイブリダイゼーション、検出 実施例１（４）と同様に実施した。

【００３３】（５）結果 結果を図３に示した。ここで用いたTransferrin recept
or cDNA(４．５ｋｂ)プローブは、特にバックグランド
を生じ易い性質を有するプローブである。ｐＨ７．２の
ハイブリダイゼーション緩衝液を用いた場合は、シグナ
ルは検出可能であったが、膜全体が黒くバックグラウン
ドの上昇が認められた。一方、ｐＨ７．３および７．４
のハイブリダイゼーション緩衝液を用いた場合は、バッ
クグラウンドの出現が大きく改善されていることが分か
る。

【００３４】実施例４ ベタインの特異性に及ぼす影響 （１）培養細胞ゲノムＤＮＡの制限酵素消化気泳動およ
びナイロン膜への転写 (i)以下のようにゲノムＤＮＡの制限酵素消化を行う。
制限酵素は東洋紡績製を用いた。 滅菌蒸留水 ７μl ＨｅＬａ細胞（ＨＬ６０細胞）ゲノムＤＮＡ（１μｇ/
μl) １μl １０×制限酵素バッファー（Ｍ） １μl Hae III(１０U/μl) １μl (ii)泳動用色素を１μl添加する。 (iii)１％アガロースゲルにＨｅＬａ、ＨＬ６０ゲノムＤ
ＮＡそれぞれアプライする。 (iv)１×ＴＡＥ中で１５Ｖ、１６時間電気泳動を行な
う。 (v)１０μｇ／ｌＥｔＢｒ中でゲルを１５分間染色す
る。 (vi)０．２５ＮＨＣｌ溶液中で２０分間ゲルを振とうす
る。 (vii)１．５ＭＮａＣｌ,０．５ＭＮａＯＨ溶液にゲルを
移し、１５分間振とうする。 (viii)１．５ＭＮａＣｌ,０．５ＭＮａＯＨ溶液にゲル
を移し、１５分間振とうする。 (ix)２×ＳＳＣ溶液に浸漬する。 (x)ブロッターを２０×ＳＳＣ(３ＭＮａＣｌ,０．３Ｍ
クエン酸ナトリウム:ｐＨ７．０)で満たし、濾紙、ゲ
ル、ナイロン膜、濾紙２枚、ペーパータオル(５ｃｍ）
の順番で載せる。 (xi)一晩ブロッティングを行う。 (xii)膜をはがし、２×ＳＳＣにて１分間洗浄し、濾紙
上で乾燥する。 (xiii)３０分間、８０℃にてベーキングする。

【００３５】（２）ＣＭＭ−１０１プローブの調製 ＣＭＭ−１０１プローブはPromega社より購入した。プ
ローブの標識は、実施例１（２）と同様に実施した。

【００３６】（３）ハイブリダイゼーション緩衝溶液の
調製 以下の組成のハイブリダイゼーション溶液を調製した。
試薬は全てナカライテスク社製のものを用いた。 ５００ｍＭＮａ−Ｐｉ緩衝液(ｐＨ７．４；モル濃度
はＮａで計算）、１ｍＭＥＤＴＡ、 ７％ＳＤＳ、５％Ｐ
ＥＧ#６０００ ５００ｍＭＮａ−Ｐｉ緩衝液(ｐＨ７．４；モル濃度
はＮａで計算）、１ｍＭＥＤＴＡ、 ７％ＳＤＳ、５％Ｐ
ＥＧ#６０００、１Ｍトリメチルグリシン

【００３７】（４）ハイブリダイゼーション、検出 プローブ濃度は４ｎｇ／ｍｌにて用いた。実施例１
（４）と同様に実施した。

【００３８】（５）結果 ＣＭＭ−１０１プローブはヒトＶＮＴＲプローブの一種
であり、繰り返し配列の繰り返し回数の違いを用いて近
年、個体識別などに使用されることが多い。この繰り返
し数は染色体レベルで多形性を示すため、多くの場合解
析時に２本のバンドが出現する。また、本プローブは若
干の繰り返し配列を有しているために目的外の遺伝子に
ハイブリダイズする傾向が強く、ハイブリダイゼーショ
ンの特異性を見るには最適であった。ハイブリダイゼー
ションの結果を図５に示す。ベタイン無添加のハイブリ
ダイゼーション用緩衝液を用いた場合は、ＨＬ６０の解
析において、目的以外のバンドが多数確認できるのに対
し、ベタインを添加した系については目的のバンド以外
のバンドはほとんど検出されていないのが分かる。ま
た、ベタイン無添加の系に関しては、高分子域のバンド
の方が低分子域のものに比べてかなり濃いのに対し、ベ
タインを添加した系ではそれが緩和されている。これ
は、ベタインを添加したことにより、より特異的にハイ
ブリダイゼーションが進行したことを示している。

【００３９】

【発明の効果】上述したように、本発明により、特に非
ＲＩ系において核酸ハイブリダイゼーション解析を行う
場合において、迅速、高感度な解析が可能となった。ま
た、従来の高濃度でＳＤＳを含有する組成のハイブリダ
イゼーション緩衝溶液に比べ、室温保存時のＳＤＳの析
出も低減され、ハンドリング面でも大きく改善がなされ
た。この方法を用いることにより、従来法に比べ、簡便
かつ確実な結果が得られる。

【図面の簡単な説明】

【図１】Northern blot解析における、ＰＥＧ添加によ
るハイブリダイゼーションの促進を示す図である。

【図２】Northern blot解析における、従来のDenhardt'
s系ハイブリダイゼーション緩衝溶液との比較を示す図
である

【図３】Northern blot解析における、様々なｐＨでの
核酸ハイブリダイゼーションにおけるバックグラウンド
の比較を示す図である。

【図４】ベタインのSouthern blot解析に及ぼす影響を
示す図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き Ｆターム(参考） 4B024 AA11 CA01 CA09 CA11 DA02 DA03 DA12 HA14 4B063 QA01 QA19 QQ42 QR32 QR41 QR48 QR49 QR51 QR54 QR56 QR76 QR77 QS22 QS34 QX01

Claims (7)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ２％(重量／容量)以上の濃度で陰イオン
   性界面活性剤およびポリエチレングリコールを含有し、
   かつｐＨが７．２より高いことを特徴とする核酸ハイブ
   リダイゼーション用緩衝溶液。
2. 【請求項２】 陰イオン性界面活性剤がラウリル硫酸ナ
   トリウムもしくはＮ−ラウロイルサルコシンナトリウム
   のいずれかである請求項１記載の核酸ハイブリダイゼー
   ション用緩衝溶液。
3. 【請求項３】 ベタイン及び／又は核酸成分を含有する
   請求項１または２に記載の核酸ハイブリダイゼーション
   用緩衝溶液。
4. 【請求項４】 キレート剤を含有する請求項１〜３のい
   ずれかに記載の核酸ハイブリダイゼーション用緩衝溶
   液。
5. 【請求項５】 タンパク質成分を含有する請求項１〜４
   のいずれかに記載の核酸ハイブリダイゼーション緩衝
   液。
6. 【請求項６】 ２％(重量／容量)以上の濃度で陰イオン
   性界面活性剤およびポリエチレングリコールを含有し、
   かつｐＨが７．２より高い緩衝溶液であって、ベタイン
   及び／又は核酸成分を含有する緩衝溶液を含有すること
   を特徴とする核酸ハイブリダイゼーション用キット。
7. 【請求項７】 ２％(重量／容量)以上の濃度で陰イオン
   性界面活性剤およびポリエチレングリコールを含有し、
   かつｐＨが７．２より高い緩衝溶液を用いて核酸をハイ
   ブリダイズせしめることを特徴とする核酸ハイブリダイ
   ゼーション方法。