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JP2000239299A - New protein and its production - Google Patents

New protein and its production

Info

Publication number
JP2000239299A
JP2000239299A JP11036225A JP3622599A JP2000239299A JP 2000239299 A JP2000239299 A JP 2000239299A JP 11036225 A JP11036225 A JP 11036225A JP 3622599 A JP3622599 A JP 3622599A JP 2000239299 A JP2000239299 A JP 2000239299A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
protein
adif
activity
dna
ala
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
JP11036225A
Other languages
Japanese (ja)
Inventor
Masaaki Goto
雅昭 後藤
Masaaki Tomoyasu
昌昭 友保
Kyoji Yamaguchi
京二 山口
Masahiko Kinosaki
雅彦 木野崎
Nobuyuki Shima
伸行 島
Naotaka Yasuda
尚孝 保田
Nobuaki Nakagawa
信明 中川
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Snow Brand Milk Products Co Ltd
Original Assignee
Snow Brand Milk Products Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Snow Brand Milk Products Co Ltd filed Critical Snow Brand Milk Products Co Ltd
Priority to JP11036225A priority Critical patent/JP2000239299A/en
Publication of JP2000239299A publication Critical patent/JP2000239299A/en
Pending legal-status Critical Current

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  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

PROBLEM TO BE SOLVED: To obtain a new heterodimer type protein which has the activity to inhibit the differentiation and/or maturation of fat cells, therefore is useful in medicinal compositions or the like aiming prophylactic and/or therapy of obesity, and is formed from adipogenesis inhibitory factor(ADIF) and stanniocalcin(STC). SOLUTION: This heterodimer type protein has N-terminated amino acid sequences indicated by formulas I and II and the activity to inhibit the differentiation and/or maturation of fat cells. This protein is obtained by sticking human fibroblast [preferably human fetus lung fibroblast IMR-90 (ATCC deposit-trust number CCL186)] to a piece of alumina ceramic, utilizing Dulbecco modified Eagle medium to which neonatal bovine serum is added as a culture solution, culturing stationarily in a roller bottle or the like for a period of preferably about one week to 10 days, treating the culture solution preferably with a heparin column, SP.cation-exchange column and/or the like in this order and then isolating and refining the above protein.

Description

【発明の詳細な説明】DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION

【0001】[0001]

【発明の属する技術分野】本発明は、脂肪細胞の分化及
び/又は成熟を抑制する活性を有する新規蛋白質に関す
る。本発明蛋白質は、肥満の予防及び/又は治療を目的
とした医薬組成物、あるいは免疫学的診断を確立するた
めの抗原などとして有用である。
TECHNICAL FIELD The present invention relates to a novel protein having an activity to suppress the differentiation and / or maturation of adipocytes. The protein of the present invention is useful as a pharmaceutical composition for preventing and / or treating obesity, or as an antigen for establishing an immunological diagnosis.

【0002】[0002]

【従来の技術】肥満は、糖尿病、高血圧症、心臓病など
のリスクファクターであり、先進国の国民の健康を脅か
す存在である。肥満とは、脂肪組織が普通以上に蓄積し
た身体状況のことを言う。脂肪組織は、生体内の余剰エ
ネルギーを脂肪、即ちトリグリセライドとして備蓄して
いる特殊な器官であり、脂肪細胞、その前駆細胞を含む
線維芽細胞、マクロファージ、血管周囲細胞、血液細胞
などから構成されている。脂肪細胞は、脂肪組織に存在
する細胞の1/3から2/3を占めると言われており、
その細胞内に脂肪、即ちトリグリセライドを蓄積してい
る。脂肪細胞は、間葉系の多能性幹細胞から脂肪細胞と
しての素地を獲得した脂肪芽細胞、脂肪滴は出現してい
ないが脂肪細胞の初期マーカーを有する前駆脂肪細胞、
脂肪滴を有する未成熟脂肪細胞、脂肪が多量に蓄積した
成熟脂肪細胞と分化・成熟していくとされている。軽度
の肥満成人の生体内では、個々の脂肪細胞が蓄積してい
る脂肪、即ちトリグリセライド量が増加し細胞が肥大化
している。肥満の程度が大きくなると脂肪細胞の数も増
加する。従って、脂肪細胞への分化・成熟を抑制し脂肪
細胞の数を減少させることや、成熟脂肪細胞の肥大化を
抑制することにより蓄積脂肪量の増加を抑制することに
より肥満の進行を止め、肥満を治療することが期待され
る。生体内における脂肪細胞の分化制御は、食物摂取や
運動などの環境因子などから派生する数多くの因子によ
って、正あるいは負に行われていることが明らかにされ
てきた。前駆脂肪細胞から脂肪細胞への分化を抑制する
サイトカインとして、腫瘍壊死因子−α ; (TNF-α : T
orti F.M. et al., Science, Vol.229, p867 (1985))、
トランスフォーミング増殖因子−β(transforming gro
wth factor- β ; Ignotz R.A. et al., Proc. Natl. A
cad. Sci. USA, Vol.82, p8530 (1985) )、プレアディ
ポサイトファクター−1(Pref-1, Preadipocyte facto
r-1 :Smas C.M. et al., Cell, Vol.73, p725 (1993)
)などのサイトカインが報告されている。又、近年ク
ローニングされたob遺伝子の翻訳蛋白質レプチンは、
おそらくは中枢神経を介して摂食量や脂肪組織重量を減
少させることが報告されている(Levin N. et al. Pro
c. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 93. p1726, 1996) 。
さらには、強力な摂食促進作用を有する脳内ペプチド・
ニューロペプチドYとそのレセプターも肥満を抑制する
医薬品開発の強力なツールとして注目されている(Sain
sburg A. et al. Diabetologia, Vol. 39, p353, 199
6)。これらのサイトカインは、脂肪細胞への抑制作用に
よる肥満の治療剤となることが期待され、レプチンなど
上記のサイトカインの一部については、肥満の治療剤又
は予防薬として臨床試験が進められている。また現在、
肥満の治療薬又は予防薬として、米国では既にレダック
ス(アメリカンホームプロダクツ社)が上市されてい
る。又、メリディア(クノール社)やキセニカル(ロッ
シュ社)なども、米国において肥満の治療薬又は脂肪の
吸収抑制薬として認可される見通しである。しかし、こ
れらの薬剤を用いた治療法はその効果並びに治療結果に
おいて必ずしも満足できるものではなく、これらに代わ
るより有効性が高く副作用の少ない新しい治療薬の開発
が望まれていた。
2. Description of the Related Art Obesity is a risk factor for diabetes, hypertension, heart disease and the like, and is a threat to the health of citizens in developed countries. Obesity refers to a physical condition in which adipose tissue has accumulated more than normal. Adipose tissue is a special organ that stores excess energy in the body as fat, that is, triglyceride, and is composed of fat cells, fibroblasts including their precursor cells, macrophages, perivascular cells, blood cells, and the like. I have. Fat cells are said to occupy 1/3 to 2/3 of the cells present in adipose tissue,
It accumulates fat, triglyceride, in its cells. Adipocytes are lipoblasts that have acquired the base as adipocytes from pluripotent stem cells of the mesenchymal system, preadipocytes that do not have lipid droplets but have an early marker of adipocytes,
It is said that immature adipocytes having lipid droplets and mature adipocytes in which a large amount of fat has accumulated differentiate and mature. In a living body of a mildly obese adult, the amount of fat accumulated in individual fat cells, that is, triglyceride, is increased and the cells are enlarged. As the degree of obesity increases, so does the number of fat cells. Therefore, obesity progression is stopped by suppressing differentiation / maturation into adipocytes to reduce the number of adipocytes, or by suppressing the increase in fat accumulation by suppressing the enlargement of mature adipocytes. Is expected to be treated. It has been revealed that the regulation of adipocyte differentiation in vivo is positively or negatively controlled by a number of factors derived from environmental factors such as food intake and exercise. Tumor necrosis factor-α as a cytokine that suppresses the differentiation of preadipocytes into adipocytes; (TNF-α: T
orti FM et al., Science, Vol.229, p867 (1985)),
Transforming growth factor-β (transforming gro
wth factor- β; Ignotz RA et al., Proc. Natl. A
cad. Sci. USA, Vol. 82, p8530 (1985)), preadipocyte factor-1 (Pref-1, Preadipocyte facto).
r-1: Smas CM et al., Cell, Vol. 73, p725 (1993)
) Have been reported. In addition, leptin, a translation protein of the ob gene cloned in recent years,
It has been reported that food intake and adipose tissue weight are reduced, possibly through the central nervous system (Levin N. et al. Pro
c. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 93. p1726, 1996).
Furthermore, a peptide in the brain that has a strong food intake promoting action
Neuropeptide Y and its receptor are also attracting attention as powerful tools for the development of drugs to control obesity (Sain
sburg A. et al. Diabetologia, Vol. 39, p353, 199
6). These cytokines are expected to be therapeutic agents for obesity due to their inhibitory action on adipocytes, and some of the above cytokines such as leptin are undergoing clinical trials as therapeutic agents or preventive agents for obesity. Currently,
Redax (American Home Products) has already been launched in the United States as a therapeutic or prophylactic agent for obesity. Meridia (Knoll) and Xenical (Roche) are also expected to be approved in the United States as obesity treatments or fat absorption inhibitors. However, the therapeutic methods using these drugs are not always satisfactory in their effects and therapeutic results, and there has been a demand for the development of new therapeutic agents that are more effective and have fewer side effects instead of these.

【0003】このような状況下、本発明者らは抗肥満作
用あるいは肥満の改善作用を有する新規な物質を求め鋭
意探索の結果、ヒト胎児肺線維芽細胞IMR−90(A
TCC寄託−受託番号CCL186)の培養液中に脂肪
細胞形成抑制活性、即ち脂肪細胞の分化及び/又は成熟
を抑制する活性を有する蛋白質、ADIF(Adipogenes
is Inhibitory Factor; 脂肪細胞形成抑制因子)を既に
見出した。又、付着細胞のための担体としてアルミナセ
ラミック片を用いて細胞培養を行うことにより、該蛋白
質を培地中に高濃度に蓄積せしめ、効率よく精製できる
該蛋白質の製造方法を見出した。さらに、前記培養液か
らイオン交換カラム、アフィニティーカラム、及び逆相
カラムで順次処理して吸着及び溶出を繰り返すことによ
り、該蛋白質を効率よく精製する方法を既に確立した。
さらに本発明者らは、ADIFのDNA及びアミノ酸配
列についても既に決定した。天然型ADIFは、以下の
物理化学的性質で特定される蛋白質である。 (a) 活性:脂肪細胞の分化及び/又は成熟を抑制する活性を有する (b) 分子量(SDS−PAGEによる): 約45kDa(非還元条件下) 約28kDa及び/又は約23kDa(還元条件下) (c) 親和性:ヘパリンに親和性を有する。 (d) 糖鎖を有する。 (e) N−末端アミノ酸配列(アミノ酸シークエンサーで分析した結果): Xaa Ser Gln Gln Lys Gly Arg Leu Ser Leu Gln Asn Thr Ala Glu Ile 1 5 10 15 Gln His Cys Leu Val Asn Ala Gly Asp Val Gly Cys Gly Val Phe Glu 20 25 30 Cys Phe Glu Asn Asn Xaa Xaa Glu 35 40 (但し、Xaa は未同定のアミノ酸を示す。)
[0003] Under such circumstances, the present inventors have intensively searched for a novel substance having an anti-obesity effect or an obesity ameliorating effect, and as a result, have found that human fetal lung fibroblast IMR-90 (A
ADIF (Adipogenes), a protein having an activity of inhibiting adipogenesis, that is, an activity of inhibiting adipocyte differentiation and / or maturation, in the culture medium of TCC Deposit-Accession No. CCL186)
is Inhibitory Factor). In addition, the present inventors have found a method for producing the protein which can be efficiently purified by accumulating the protein in a medium at a high concentration by culturing cells using an alumina ceramic piece as a carrier for adherent cells. In addition, a method for efficiently purifying the protein has been already established by sequentially treating the culture solution with an ion exchange column, an affinity column, and a reverse phase column and repeating adsorption and elution.
Furthermore, the present inventors have also determined the DNA and amino acid sequence of ADIF. Native ADIF is a protein specified by the following physicochemical properties. (a) activity: having activity to suppress adipocyte differentiation and / or maturation (b) molecular weight (by SDS-PAGE): about 45 kDa (under non-reducing conditions) about 28 kDa and / or about 23 kDa (under reducing conditions) (c) Affinity: has affinity for heparin. (d) It has a sugar chain. (e) N-terminal amino acid sequence (result of analysis with amino acid sequencer): Xaa Ser Gln Gln Lys Gly Arg Leu Ser Leu Gln Asn Thr Ala Glu Ile 1 5 10 15 Gln His Cys Leu Val Asn Ala Gly Asp Val Gly Cys Gly Val Phe Glu 20 25 30 Cys Phe Glu Asn Asn Xaa Xaa Glu 35 40 (However, Xaa indicates an unidentified amino acid.)

【0004】又、スタンニオカルシンと呼ばれる公知の
蛋白質が存在する。このスタンニオカルシンは、ミネラ
ル代謝を調節する蛋白質として知られている(Stannioc
alcin ;STC:Olsen H.S. et al., Proc. Natl. Aca
d. Sci. USA, vol.93, p1972(1996) )が、脂肪細胞形
成抑制活性を有することは知られていない。本発明者ら
は、このスタンニオカルシンが脂肪細胞の分化及び/又
は成熟を抑制する活性を有することを見出し、既に特許
出願している。
[0004] There is also a known protein called stanniocalcin. This stanniocalcin is known as a protein that regulates mineral metabolism (Stannioc
alcin; STC: Olsen HS et al., Proc. Natl. Aca
d. Sci. USA, vol. 93, p1972 (1996)) is not known to have adipocyte formation inhibitory activity. The present inventors have found that stanniocalcin has an activity to suppress the differentiation and / or maturation of adipocytes, and have already filed a patent application.

【0005】[0005]

【発明が解決しようとする課題】本発明者らは、さらに
脂肪細胞の分化及び/又は成熟抑制活性を有する新規な
蛋白質を求め鋭意探索の結果、上述のADIFのモノマ
ー1分子と既知蛋白質であるスタンニオカルシンのモノ
マー1分子から形成されたヘテロダイマーに、優れた脂
肪細胞形成抑制活性、即ち脂肪細胞の分化及び/又は成
熟を抑制する活性を見出すに至った。即ち本発明は、脂
肪細胞の分化及び/又は成熟を抑制する活性を有する新
規蛋白質、及びその製造方法を提供することを課題とす
る。
The present inventors have further sought to find a novel protein having an activity of inhibiting adipocyte differentiation and / or maturation. A heterodimer formed from one molecule of stanniocalcin monomer has been found to have an excellent activity of inhibiting adipocyte formation, ie, an activity of inhibiting differentiation and / or maturation of adipocytes. That is, an object of the present invention is to provide a novel protein having an activity of suppressing adipocyte differentiation and / or maturation, and a method for producing the same.

【0006】[0006]

【課題を解決するための手段】本発明は、脂肪細胞の分
化及び/又は成熟を抑制する活性を有する新規蛋白質に
関する。本発明蛋白質は、配列表配列番号2及び3に示
されるN末端アミノ酸配列を有し、脂肪細胞の分化及び
/又は成熟を抑制する活性を有するヘテロダイマー型新
規蛋白質に関する。また、配列表配列番号13及び17
に示されるアミノ酸配列をコードするDNAを発現させ
て得られる二本鎖の蛋白質から構成され、脂肪細胞の分
化及び/又は成熟を抑制する活性を有する新規蛋白質に
関する。又、本発明は、脂肪細胞形成抑制因子(ADI
F)、及びスタンニオカルシン(STC)をコードする
cDNAをクローニングし、それぞれのcDNAを発現
ベクターに挿入し発現プラスミドを作製し、得られたそ
れぞれの発現プラスミドを宿主にコ・トランスフェクシ
ョンし発現させることにより得られることを特徴とす
る、前記の蛋白質の製造方法に関する。本発明蛋白質
は、肥満の予防及び/又は治療を目的とした医薬組成
物、あるいは免疫学的診断を確立するための抗原などと
して有用である。
SUMMARY OF THE INVENTION The present invention relates to a novel protein having an activity of suppressing adipocyte differentiation and / or maturation. The protein of the present invention has an N-terminal amino acid sequence shown in SEQ ID NOs: 2 and 3 and relates to a novel heterodimeric protein having an activity of suppressing adipocyte differentiation and / or maturation. In addition, SEQ ID NOs: 13 and 17 in the Sequence Listing
The present invention relates to a novel protein composed of a double-stranded protein obtained by expressing a DNA encoding the amino acid sequence shown in (1) and having an activity of suppressing adipocyte differentiation and / or maturation. The present invention also relates to an adipocyte formation inhibitory factor (ADI)
F) and cDNAs encoding stanniocalcin (STC) are cloned, each cDNA is inserted into an expression vector to prepare an expression plasmid, and each obtained expression plasmid is co-transfected into a host for expression. And a method for producing the above-mentioned protein. The protein of the present invention is useful as a pharmaceutical composition for preventing and / or treating obesity, or as an antigen for establishing an immunological diagnosis.

【0007】[0007]

【発明の実施の形態】本発明は、本発明蛋白質は、配列
表配列番号2及び3に示されるN末端アミノ酸配列を有
し、脂肪細胞の分化及び/又は成熟を抑制する活性を有
するヘテロダイマー型新規蛋白質に関する。又、配列表
配列番号13及び17に示されるアミノ酸配列をコード
するDNAを発現させて得られる二本鎖の蛋白質から構
成され、脂肪細胞の分化及び/又は成熟を抑制する活性
を有する新規蛋白質に関する。本発明蛋白質は、肥満の
予防及び/又は治療を目的とした医薬組成物、あるいは
免疫学的診断を確立するための抗原などとして有用であ
る。本発明蛋白質は、脂肪芽細胞、前駆脂肪細胞、ある
いは未成熟脂肪細胞が、脂肪が多量に蓄積した成熟脂肪
細胞へと分化及び/又は成熟していく過程を抑制する。
BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION According to the present invention, the protein of the present invention has an N-terminal amino acid sequence shown in SEQ ID NOs: 2 and 3 and has an activity of suppressing adipocyte differentiation and / or maturation. Type novel proteins. The present invention also relates to a novel protein comprising a double-stranded protein obtained by expressing a DNA encoding the amino acid sequence shown in SEQ ID NOs: 13 and 17 in the Sequence Listing, and having an activity of inhibiting adipocyte differentiation and / or maturation. . The protein of the present invention is useful as a pharmaceutical composition for preventing and / or treating obesity, or as an antigen for establishing an immunological diagnosis. The protein of the present invention suppresses the process in which lipoblasts, preadipocytes, or immature adipocytes differentiate and / or mature into mature adipocytes in which a large amount of fat has accumulated.

【0008】本発明蛋白質は、ヒト線維芽細胞の培養液
から効率良く且つ高収率で単離精製することができる。
生産細胞として用いるヒト線維芽細胞は限定されない
が、特に好ましくはヒト胎児肺線維芽細胞IMR−90
(ATCC寄託−受託番号CCL186)が用いられ
る。ヒト線維芽細胞をアルミナセラミック片に付着さ
せ、ウシ新生児血清を添加したダルベッコ改変イーグル
培地(DMEM)を培養液として用い、T−フラスコや
ローラーボトル中で1週間から10日程度静置培養す
る。この培養液から本発明蛋白質を単離・精製する。こ
の時、用いる単離及び精製方法は、生体試料からの蛋白
質の精製に汎用される常法に従い、目的とする蛋白質の
物理的あるいは化学的性質を利用した各種の精製操作を
用いることにより実施することができる。濃縮手段とし
ては、例えば限外濾過、凍結乾燥、塩析などの常法が用
いられる。精製手段としては、例えばイオン交換クロマ
トグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ゲ
ル濾過クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、
逆相クロマトグラフィー、調製用電気泳動など、蛋白質
の精製に利用される各種の手法及びこれらを組み合わせ
て用いることができる。又、培養液からの本発明蛋白質
の精製処理を実施する際に、界面活性剤を添加しても良
い。この時、用いる界面活性剤は限定されないが、好ま
しくは0.1%CHAPS(3-[(3-cholamidopropyl)-d
imethylammonio]-1-propanesulfonate) 、0.01%ポ
リソルベート80、あるいは0.01%ポリソルベート
20を用いることができる。本発明蛋白質は、特に好ま
しくは培養液をヘパリンカラム、SP・陽イオン交換カ
ラム、Q・陰イオン交換カラム、ゲル濾過カラム、ヘパ
リンカラム、弱陽イオン交換カラム、逆相カラムの順に
処理することにより単離・精製することができる。この
ようにして得られるヘテロダイマー型本発明蛋白質は、
以下の生物学的及び物理化学的性質により特定される。 (a) 活性:脂肪細胞の分化及び/又は成熟を抑制する活
性を有する (b) 配列表配列番号2及び3に示されるN末端アミノ酸
配列を有する二本鎖の蛋白質からなる。
[0008] The protein of the present invention can be isolated and purified efficiently and in high yield from a culture of human fibroblasts.
Although human fibroblasts used as production cells are not limited, particularly preferred are human fetal lung fibroblasts IMR-90.
(ATCC Deposit-Accession No. CCL186). Human fibroblasts are allowed to adhere to alumina ceramic pieces, and static culture is performed in a T-flask or roller bottle for about one to ten days using Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) supplemented with newborn bovine serum as a culture solution. The protein of the present invention is isolated and purified from the culture. At this time, the isolation and purification method to be used is carried out by using various purification operations utilizing physical or chemical properties of the target protein according to a common method generally used for purification of a protein from a biological sample. be able to. As the concentration means, for example, a conventional method such as ultrafiltration, freeze-drying and salting out is used. Purification means include, for example, ion exchange chromatography, affinity chromatography, gel filtration chromatography, hydrophobic chromatography,
Various techniques used for protein purification, such as reverse phase chromatography and preparative electrophoresis, and combinations thereof can be used. In addition, a surfactant may be added when the protein of the present invention is purified from the culture solution. At this time, the surfactant used is not limited, but preferably 0.1% CHAPS (3-[(3-cholamidopropyl) -d
imethylammonio] -1-propanesulfonate), 0.01% polysorbate 80, or 0.01% polysorbate 20. The protein of the present invention is particularly preferably obtained by treating a culture solution in the order of a heparin column, SP / cation exchange column, Q / anion exchange column, gel filtration column, heparin column, weak cation exchange column, and reverse phase column. It can be isolated and purified. The thus obtained heterodimeric protein of the present invention is
It is identified by the following biological and physicochemical properties. (a) activity: having an activity of inhibiting adipocyte differentiation and / or maturation; (b) consisting of a double-stranded protein having an N-terminal amino acid sequence shown in SEQ ID NOs: 2 and 3 in the sequence listing.

【0009】又、本発明蛋白質を遺伝子工学的手法によ
り製造することもできる。即ち、ADIF及びスタンニ
オカルシンのアミノ酸配列情報に基づいてこれらの蛋白
質をコードするcDNA(特に配列表配列番号12及び
16)をクローニングする。次に、それぞれのcDNA
を適当な発現ベクターに挿入し発現プラスミドを作製す
る。得られたそれぞれの発現プラスミドを各種細菌又は
細胞等の宿主にコ・トランスフェクションし、常法にて
発現させることにより、遺伝子組み換え型の本発明蛋白
質を得ることができる。このようにして得られた本発明
蛋白質は、先に本発明者らが見出したADIFのモノマ
ー1分子と、既知の蛋白質であるスタンニオカルシン
(Olsen H. S. et al.; Proc. Natl. Acad. Sci. USA,
Vol.93, No.5, p1792 (1996))のモノマー1分子からな
るヘテロダイマーであり、以下の特性により特定され
る。 (a) 活性:脂肪細胞の分化及び/又は成熟を抑制する活
性を有する (b) 配列表配列番号13及び17に示されるアミノ酸配
列をコードするDNAを発現させて得られる二本鎖の蛋
白質からなる。
[0009] The protein of the present invention can also be produced by genetic engineering techniques. That is, based on the amino acid sequence information of ADIF and stanniocalcin, cDNAs encoding these proteins (in particular, SEQ ID NOs: 12 and 16 in the Sequence Listing) are cloned. Next, each cDNA
Into an appropriate expression vector to prepare an expression plasmid. Each of the obtained expression plasmids is co-transfected into a host such as various bacteria or cells and expressed by a conventional method, whereby a recombinant protein of the present invention can be obtained. The thus-obtained protein of the present invention comprises one molecule of ADIF monomer previously discovered by the present inventors and a known protein, stanniocalcin (Olsen HS et al .; Proc. Natl. Acad. Sci. . USA,
Vol.93, No.5, p1792 (1996)) and is a heterodimer consisting of one monomer molecule, and is specified by the following properties. (a) activity: having an activity to suppress the differentiation and / or maturation of adipocytes (b) from a double-stranded protein obtained by expressing a DNA encoding the amino acid sequence shown in SEQ ID NOs: 13 and 17 in the sequence listing Become.

【0010】脂肪細胞形成抑制活性は、Kodama H. et a
l.の方法(Journal of Cellular Physiology, Vol.112,
p83 (1982) )、即ち、マウス前駆脂肪細胞株を標的細
胞として用い、デキサメタゾン存在下での脂肪細胞形成
の抑制を、トリグリセライドの蓄積抑制で評価すること
により確認することができる。
[0010] The activity of inhibiting adipocyte formation is described in Kodama H. et a
l. method (Journal of Cellular Physiology, Vol. 112,
p83 (1982)), that is, suppression of adipocyte formation in the presence of dexamethasone using a mouse preadipocyte cell line as a target cell can be confirmed by evaluating accumulation inhibition of triglyceride.

【0011】本発明蛋白質は、肥満の予防及び/又は治
療を目的とした医薬組成物として、あるいは免疫学的診
断を確立するための抗原として有用である。本発明蛋白
質は、ヒト及び動物に対して安全に投与されるものであ
る。本発明蛋白質は、製剤化して経口的あるいは非経口
的に投与することができる。医薬組成物の形態として
は、注射用組成物、点滴用組成物、坐剤、経鼻剤、舌下
剤、経皮吸収剤などが挙げられる。これらの製剤は、公
知の製剤学的製法に準じ、製剤として薬理学的に許容さ
れ得る担体、賦形剤、安定剤、着色剤、界面活性剤、そ
の他添加剤などを用いることにより、目的とする製剤と
することができる。注射用組成物の場合は、本発明の脂
肪細胞形成抑制因子の薬理学的有効量及び製剤学的に許
容しうる賦形剤/賦活剤との混合物とし、その中にアミ
ノ酸、糖類、セルロース誘導体、及びその他の有機/無
機化合物などの一般的に注射用組成物に添加される賦形
剤/賦活剤を用いても良い。又、本発明蛋白質とこれら
の賦形剤/賦活剤を用い注射剤を調製する場合は、必要
に応じてpH調整剤、緩衝剤、安定化剤、可溶化剤など
を添加して常法によって各種注射剤とすることができ
る。
The protein of the present invention is useful as a pharmaceutical composition for preventing and / or treating obesity or as an antigen for establishing an immunological diagnosis. The protein of the present invention can be safely administered to humans and animals. The protein of the present invention can be formulated and administered orally or parenterally. Examples of the form of the pharmaceutical composition include an injection composition, an infusion composition, a suppository, a nasal agent, a sublingual agent, a transdermal absorbent, and the like. These preparations are prepared according to known pharmaceutical manufacturing methods, using pharmacologically acceptable carriers, excipients, stabilizers, coloring agents, surfactants, other additives, etc. as preparations. Formulation. In the case of an injectable composition, a mixture of a pharmacologically effective amount of the adipocyte formation inhibitory factor of the present invention and a pharmaceutically acceptable excipient / activator is contained therein, and amino acids, saccharides, and cellulose derivatives are contained therein. And other excipients / activators commonly added to injectable compositions, such as organic / inorganic compounds. When an injection is prepared using the protein of the present invention and these excipients / activators, a pH adjuster, a buffer, a stabilizer, a solubilizing agent, etc. are added, if necessary, according to a conventional method. Various injections can be prepared.

【0012】[0012]

【実施例】以下の実施例をもって本発明をより詳細に説
明するが、これらは単に例示するのみであり、本発明は
これらにより何ら限定されるものではない。
EXAMPLES The present invention will be described in more detail with reference to the following examples, which are merely illustrative, and do not limit the present invention in any way.

【0013】[0013]

【実施例1】ヒト線維芽細胞IMR−90培養液の調製 ヒト胎児肺線維芽細胞IMR−90(ATCC−CCL
186)は、ローラーボトル(490cm2 、110×
171mm、コーニング社)中で80gのアルミナセラ
ミック片(アルミナ99.5%、東芝セラミック社) に
付着させ培養した。培養には40本のローラーボトルを
使用し、ローラーボトル1本当たり5%ウシ新生児血清
と10mM HEPES緩衝液を添加したDMEM(ギ
ブコBRL社)500mlを用い、37℃、5%CO2
存在下で7〜10日間静置培養した。培養後培養液を回
収し、新たな培地を添加することにより各培養サイクル
当たり20リットルのIMR−90培養液を得た。得ら
れた培養液を試料1とした。
Example 1 Preparation of Human Fibroblast IMR-90 Culture Solution Human fetal lung fibroblast IMR-90 (ATCC-CCL)
186) is a roller bottle (490 cm2, 110 ×
(171 mm, Corning) and attached to 80 g of alumina ceramic pieces (alumina 99.5%, Toshiba Ceramics) and cultured. 40 roller bottles were used for the culture, and 500 ml of DMEM (Gibco BRL) supplemented with 5% neonatal bovine serum and 10 mM HEPES buffer per roller bottle was used at 37 ° C. and 5% CO 2.
The culture was allowed to stand still in the presence for 7 to 10 days. After the culture, the culture was collected and fresh medium was added to obtain a 20 L IMR-90 culture per culture cycle. The obtained culture solution was used as Sample 1.

【0014】[0014]

【実施例2】脂肪細胞形成抑制活性の測定法 本発明蛋白質の脂肪細胞形成抑制活性測定は、Kodama
H. et al.の方法(Journal of Cellular Physiology, V
ol.112, p83, 1982)に従い測定した。即ち、マウス前
駆脂肪細胞株MC3T3-G2/PA6細胞(RIKEN GENE BANK 、RC
B1127 )を標的細胞として用い、デキサメタゾン存在下
での脂肪細胞の形成をトリグリセライドの蓄積を指標と
して試験し、その抑制活性を測定することによって行っ
た。即ち、96ウェルマイクロプレートに2×10-7
デキサメタゾン及び10%牛胎児血清を含むα−MEM
(ギブコBRL社)で希釈したサンプル50μlを入
れ、マウス前駆脂肪細胞株MC3T3-G2/PA6細胞3×103
個を50μlの10%牛胎児血清を含むα−MEMに懸
濁させて播種し、5%CO2 、37℃、湿度100%に
て一週間培養した。培養7日後に培地を吸引除去し、風
乾後、脂肪細胞中に蓄積したトリグリセライドの量をト
リグリセライド測定キット(トリグリセライドG−テス
トワコー、和光純薬工業社) を用いて測定した。OD510n
m の減少を脂肪細胞形成抑制活性(ADIF活性)とし
た。
Example 2 Method for measuring adipocyte formation inhibitory activity The adipocyte formation inhibitory activity of the protein of the present invention was measured by Kodama
H. et al. Method (Journal of Cellular Physiology, V
ol. 112, p83, 1982). That is, mouse preadipocyte cell line MC3T3-G2 / PA6 cells (RIKEN GENE BANK, RC
B1127) was used as a target cell, adipocyte formation in the presence of dexamethasone was tested using triglyceride accumulation as an index, and its inhibitory activity was measured. That is, 2 × 10 −7 M was added to a 96-well microplate.
Α-MEM containing dexamethasone and 10% fetal calf serum
(Gibco BRL), 50 μl of the diluted sample was added thereto, and the mouse preadipocyte cell line MC3T3-G2 / PA6 cells 3 × 10 3
The cells were suspended and seeded in 50 μl of α-MEM containing 10% fetal bovine serum, and cultured for one week at 5% CO 2 , 37 ° C. and 100% humidity. After 7 days of culture, the medium was removed by suction, air-dried, and the amount of triglyceride accumulated in the fat cells was measured using a triglyceride measurement kit (Triglyceride G-Test Wako, Wako Pure Chemical Industries, Ltd.). OD510n
The decrease in m was defined as the adipocyte formation inhibitory activity (ADIF activity).

【0015】[0015]

【実施例3】ADIFの精製 i) ヘパリン・セファロ−スCL−6Bによる精製 約60リットルのIMR−90培養液(試料1)を、
0.22μmのフィルター(親水性ミリディスク、2,
000cm2 、ミリポア社)で濾過した後、3回に分け
て0.3M NaClを含む10mM Tris−HC
l緩衝液、pH7.5で平衡化させたヘパリン・セファ
ロースCL−6Bカラム(5×4.1cm、ゲル容量8
0ml)に負荷した。流速500ml/hrにて、10mM
Tris−HCl緩衝液、pH7.5(以下、Tri
s−HClという)で洗浄した後、2M NaClを含
む10mM Tris−HCl、pH7.5で溶出を行
い、ヘパリン・セファロースCL−6B吸着画分1.5
リットルを得て、試料2とした。
Example 3 Purification of ADIF i) Purification by Heparin Sepharose CL-6B About 60 liters of an IMR-90 culture solution (sample 1) was used.
0.22 μm filter (Hydrophilic Millidisk, 2,
000 cm 2 , Millipore) and divided into three portions of 10 mM Tris-HC containing 0.3 M NaCl.
Heparin-Sepharose CL-6B column (5 x 4.1 cm, gel volume 8) equilibrated with 1 buffer, pH 7.5
0 ml). 10 mM at a flow rate of 500 ml / hr
Tris-HCl buffer, pH 7.5 (hereinafter referred to as Tri
s-HCl), elution was performed with 10 mM Tris-HCl containing 2 M NaCl, pH 7.5, and heparin-Sepharose CL-6B adsorbed fraction 1.5
One liter was obtained and designated as Sample 2.

【0016】ii)HiLoad−SP/HPによる精製 ヘパリン・セファロース吸着画分(試料2)を10mM
Tris−HCl、pH7.5に対して透析した後、
0.1%になるようにCHAPSを加え4℃で一晩放置
したものを、6回に分けて0.1% CHAPSを含む
50mM Tris−HCl、pH7.5で平衡化した
陽イオン交換カラム(HiLoad−SP/HP、2.
6×10cm、ファルマシア社)に負荷した。0.1%
CHAPSを含む50mM Tris−HCl、pH
7.5で洗浄した後、120分間でNaCl濃度を0.
5Mにする直線勾配、流速6ml/分にて溶出を行い、1
2ml/フラクションにて分取を行った。各フラクション
30μlを用いて、実施例2記載の方法に従いADIF
活性を測定し、約0.15〜0.25M NaClで溶
出されるADIF活性画分936mlを得て、試料3とし
た。
Ii) 10 mM of the heparin-Sepharose-adsorbed fraction (sample 2) purified by HiLoad-SP / HP
After dialysis against Tris-HCl, pH 7.5,
CHAPS was added to a concentration of 0.1%, and the mixture was allowed to stand at 4 ° C. overnight. The cation exchange column (6 parts) was equilibrated with 50 mM Tris-HCl containing 0.1% CHAPS, pH 7.5, and equilibrated (6 times). 1. HiLoad-SP / HP;
(6 × 10 cm, Pharmacia). 0.1%
50 mM Tris-HCl containing CHAPS, pH
After washing with 7.5, the NaCl concentration was reduced to 0.1 for 120 minutes.
Elution was carried out with a linear gradient of 5 M and a flow rate of 6 ml / min.
Fractionation was performed at 2 ml / fraction. ADIF was performed according to the method described in Example 2 using 30 μl of each fraction.
The activity was measured, and 936 ml of an ADIF active fraction eluted with about 0.15 to 0.25 M NaCl was obtained and used as sample 3.

【0017】iii) HiLoad−Q/HPによる精製 得られた試料3を、0.1%CHAPSを含む50mM
Tris−HCl、pH7.5、1900mlで希釈
した後、6回に分けて0.1%CHAPSを含む50m
M Tris−HCl、pH7.5で平衡化した陰イオ
ン交換カラム(HiLoad−Q/HP、2.6×10
cm、ファルマシア社)に負荷した。0.1%CHAP
Sを含む50mM Tris−HCl、pH7.5で洗
浄した後、120分間でNaCl濃度を0.5Mにする
直線勾配、流速6ml/分にて溶出を行い、12ml/フラ
クションにて分取を行った。各フラクション30μlを
用いて、実施例2記載の方法に従いADIF活性を測定
し、約0.1〜0.18MNaClで溶出されるADI
F活性画分936mlを得て、試料4とした。
Iii) Purification by HiLoad-Q / HP The obtained sample 3 was treated with 50 mM containing 0.1% CHAPS.
After diluting with Tris-HCl, pH 7.5, 1900 ml, the mixture was divided into six portions and the 50 m containing 0.1% CHAPS was added.
Anion exchange column (HiLoad-Q / HP, 2.6 × 10 6) equilibrated with M Tris-HCl, pH 7.5
cm, Pharmacia). 0.1% CHAP
After washing with 50 mM Tris-HCl containing S, pH 7.5 containing S, elution was carried out at a linear gradient of NaCl concentration of 0.5 M for 120 minutes, at a flow rate of 6 ml / min, and fractionation was carried out at 12 ml / fraction. . Using 30 μl of each fraction, ADIF activity was measured according to the method described in Example 2, and ADI eluted with about 0.1 to 0.18 M NaCl.
936 ml of the F-active fraction was obtained and used as sample 4.

【0018】iv) HiLoad−SP/HPによる精製 得られた試料4を、0.1%CHAPSを含む50mM
BisTris−HCl緩衝液、pH6.0(以下、
BisTris−HClという)1900mlで希釈した
後、3回に分けて0.1%CHAPSを含む50mM
BisTris−HCl、pH6.0で平衡化した陽イ
オン交換カラム(HiLoad−SP/HP、2.6×
10cm、ファルマシア社)に負荷した。0.1%CH
APSを含む50mMBisTris−HCl、pH
6.0で洗浄した後、100分間でNaCl濃度を0.
1Mから0.6Mにする直線勾配、流速6ml/分にて溶
出を行い、12ml/フラクションにて分取を行った。各
フラクション30μlを用いて、実施例2記載の方法に
従いADIF活性を測定し、約0.3〜0.45MNa
Clで溶出されるADIF活性画分360mlを得て、試
料5とした。
Iv) Purification by HiLoad-SP / HP The obtained sample 4 was subjected to 50 mM containing 0.1% CHAPS.
BisTris-HCl buffer, pH 6.0 (hereinafter, referred to as BisTris-HCl buffer)
After dilution with 1900 ml of BisTris-HCl, 50 mM containing 0.1% CHAPS was divided into three portions.
Cation exchange column (HiLoad-SP / HP, 2.6 ×) equilibrated with BisTris-HCl, pH 6.0
10 cm, Pharmacia). 0.1% CH
50 mM BisTris-HCl containing APS, pH
After washing with 6.0, the NaCl concentration was reduced to 0.1 for 100 minutes.
Elution was performed at a linear gradient from 1M to 0.6M, at a flow rate of 6 ml / min, and fractionation was performed at 12 ml / fraction. Using 30 μl of each fraction, the ADIF activity was measured according to the method described in Example 2, and about 0.3 to 0.45 M Na
360 ml of the ADIF active fraction eluted with Cl was obtained and used as sample 5.

【0019】v) Resource Sによる精製 得られた試料5を、0.1%CHAPSを含む50mM
BisTris−HCl、pH6.0、1080 ml
で希釈した後、3回に分けて0.1%CHAPSを含む
50mM BisTris−HCl、pH6.0で平衡
化した陽イオン交換カラム(Resource S、
0.5×5cm、ファルマシア社)に負荷した。0.1
%CHAPSを含む50mM BisTris−HC
l、pH6.0で洗浄した後、40分間でNaCl濃度
を0.6Mにする直線勾配、流速1ml/分にて溶出を行
い、1ml/フラクションにて分取を行った。各フラクシ
ョン10μlを用いて、実施例2記載の方法に従いAD
IF活性を測定し、約0.2〜0.3M NaClで溶
出されるADIF活性画分30mlを得て、試料6とし
た。
V) Purification by Resource S The obtained sample 5 was subjected to 50 mM containing 0.1% CHAPS.
BisTris-HCl, pH 6.0, 1080 ml
Cation exchange column (Resource S, equilibrated with 50 mM BisTris-HCl, pH 6.0 containing 0.1% CHAPS, divided into three portions)
0.5 × 5 cm, Pharmacia). 0.1
50 mM BisTris-HC with% CHAPS
After washing with 1, pH 6.0, elution was performed at a linear gradient of NaCl concentration of 0.6 M in 40 minutes, at a flow rate of 1 ml / min, and fractionation was performed at 1 ml / fraction. Using 10 μl of each fraction, AD was prepared according to the method described in Example 2.
The IF activity was measured, and 30 ml of an ADIF active fraction eluted with about 0.2 to 0.3 M NaCl was obtained, which was designated as Sample 6.

【0020】vi) Superose 12による精製 得られた試料6を、遠心式濃縮器(セントリコン10、
アミコン社)で約600μlに濃縮した後、3回に分け
て0.1%CHAPSと0.5M NaClを含む50
mM Tris−HCl、pH7.5で平衡化したゲル
濾過カラム(Superose 12、1.0×30c
m、ファルマシア社)に負荷し、0.1%CHAPSと
0.5M NaClを含む50mM Tris−HC
l、pH7.5で流速0.5ml/分にて展開し、0.5
ml/フラクションにて分取を行った。各フラクション1
0μlを用いて、実施例2記載の方法に従いADIF活
性を測定し、溶出時間約25〜30分に溶出されたAD
IF活性画分9mlを得て、試料7とした。
Vi) Purification by Superose 12 The obtained sample 6 is centrifuged (centricon 10,
After concentrating to about 600 μl with Amicon, the solution was divided into three portions and containing 50% containing 0.1% CHAPS and 0.5 M NaCl.
Gel filtration column (Superose 12, 1.0 × 30c) equilibrated with mM Tris-HCl, pH 7.5
m, Pharmacia) and 50 mM Tris-HC containing 0.1% CHAPS and 0.5 M NaCl.
1, developing at a flow rate of 0.5 ml / min at pH 7.5,
The fraction was collected in ml / fraction. Each fraction 1
Using 0 μl, the ADIF activity was measured according to the method described in Example 2, and AD eluted at an elution time of about 25 to 30 minutes.
9 ml of an IF-active fraction was obtained and used as Sample 7.

【0021】vii) Heparin 5PWによる精製 得られた試料7を、0.1%CHAPSを含む50mM
BisTris−HCl、pH6.0、41mlで希釈
した後、0.1%CHAPSを含む50mMBisTr
is−HCl、pH6.0で平衡化したヘパリンアフィ
ニティーカラム(Heparin 5PW、0.5×5
cm、トーソー社)に負荷した。0.1%CHAPSを
含む50mM BisTris−HCl、pH6.0で
洗浄した後、120分間でNaCl濃度を0.2Mから
0.8Mにする直線勾配、流速0.5ml/分にて溶出を
行い、1ml/フラクションにて分取を行った(図1)。
各フラクション10μlを用いて、実施例2記載の方法
に従いADIF活性を測定し、約0.2〜0.3MNa
Clで溶出されるADIF活性画分16mlを得て、試料
8とした。
Vii) Purification by Heparin 5PW The obtained sample 7 was subjected to 50 mM containing 0.1% CHAPS.
After dilution with 41 ml of BisTris-HCl, pH 6.0, 50 mM BisTr containing 0.1% CHAPS was used.
Heparin affinity column (Heparin 5PW, 0.5 × 5) equilibrated with is-HCl, pH 6.0
cm, Tosoh Corporation). After washing with 50 mM BisTris-HCl containing 0.1% CHAPS, pH 6.0, elution was performed at a linear gradient of NaCl concentration from 0.2 M to 0.8 M in 120 minutes, at a flow rate of 0.5 ml / min. Fractionation was performed at 1 ml / fraction (FIG. 1).
Using 10 μl of each fraction, ADIF activity was measured according to the method described in Example 2, and about 0.2 to 0.3 M Na
16 ml of an ADIF active fraction eluted with Cl was obtained and used as sample 8.

【0022】viii) ポリキャットAによる精製 得られた試料8を、遠心式濃縮器(セントリコン10、
アミコン社)で約300μlに濃縮した後、600μl
の0.1%CHAPSを含む50mM BisTris
−HCl、pH6.0で希釈し、0.1%CHAPSを
含む50mMBisTris−HCl、pH6.0で平
衡化した弱陽イオン交換カラム(ポリキャットA、0.
46×20cm、ポリエルシー社)に負荷した。0.1
%CHAPSを含む50mM BisTris−HC
l、pH6.0で洗浄した後、50分間でNaCl濃度
を0.4Mにする直線勾配、流速1.0ml/分にて溶出
を行い、1ml/フラクションにて分取を行った(図
2)。各フラクション10μlを用いて、実施例2記載
の方法に従いADIF活性を測定し、約0.3〜0.4
MNaClで溶出されるADIFフラクションNo.3
5〜46を得た。
Viii) Purification by Polycat A The obtained sample 8 is centrifuged (Centricon 10,
After concentrating to about 300 μl with Amicon, 600 μl
50 mM BisTris containing 0.1% CHAPS
-HCl, pH 6.0, and diluted with 50 mM BisTris-HCl, pH 6.0 containing 0.1% CHAPS, weak cation exchange column (Polycat A, 0.
46 × 20 cm, Polyersie). 0.1
50 mM BisTris-HC with% CHAPS
After washing with 1, pH 6.0, elution was performed at a flow rate of 1.0 ml / min with a linear gradient of 0.4 M NaCl concentration in 50 minutes, and fractionation was performed at 1 ml / fraction (FIG. 2). . Using 10 μl of each fraction, ADIF activity was measured according to the method described in Example 2, and about 0.3 to 0.4
ADIF fraction No. eluted with MNaCl. 3
5-46 were obtained.

【0023】ix )逆相カラムによる精製 得られたポリキャットAフラクションNo.35〜46
のうち、No.43の1mlに10μlの20%TFA
(トリフルオロ酢酸)を加えた後、0.1%TFAを含
む30%アセトニトリルで平衡化した逆相カラム(C
4、2.1×250mm、バイダック社)に負荷し、5
0分間でアセトニトリルを55%にする直線勾配、流速
0.2ml/分にて溶出を行い、各蛋白質ピークを分取し
た(図3)。各ピークフラクションの内35μlを用い
て、実施例2記載の方法に従いADIF活性を測定し、
ピ−ク5に濃度依存的な活性を検出した。結果を図4に
示す。
Ix) Purification by reverse phase column Polycat A fraction No. 35-46
Among them, No. 10 ml of 20% TFA in 1 ml of 43
(Trifluoroacetic acid), and then a reversed-phase column (C) equilibrated with 30% acetonitrile containing 0.1% TFA.
4, 2.1 × 250 mm, Baydak Company)
Elution was performed at a linear gradient of acetonitrile of 55% in 0 min at a flow rate of 0.2 ml / min, and each protein peak was collected (FIG. 3). Using 35 μl of each peak fraction, ADIF activity was measured according to the method described in Example 2,
Concentration-dependent activity was detected at peak 5. FIG. 4 shows the results.

【0024】[0024]

【実施例4】ADIFの分子量測定 ADIF活性の認められたピーク5の内100μlを用
い、還元条件下と非還元条件下でSDS−ポリアクリル
アミドゲル電気泳動を行った。即ち、ピーク5フラクシ
ョン50μlづつを2本のチューブに分取し減圧濃縮し
た後、1mMEDTA、2.5% SDS、及び0.0
1%ブロモフェノールブルーを含む10mM Tris
−HCl、pH8 1.5μlで溶解し、それぞれを非
還元条件下及び還元条件下(5% 2−メルカプトエタ
ノール存在下)37℃で一晩放置後、それぞれの1μl
をSDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動に負荷し
た。電気泳動は10−15%アクリルアミドグラジエン
トゲル(ファルマシア社)を使用し、電気泳動装置Phas
t System(ファルマシア社)を用いて行った。分子量マ
ーカーとして、ホスホリラーゼb(94kDa)、ウシ
血清アルブミン(67kDa)、オボアルブミン(43
kDa)、カルボニックアンヒドラーゼ(30kD
a)、トリプシンインヒビター(20.1kDa)、α
−ラクトアルブミン(14.4kDa)を用いた。電気
泳動終了後、Phast Gel Silver Stain Kit(ファルマシ
ア社)を用いて銀染色を行った。尚、ピーク5の蛋白質
の分子量は以下のようにして算出した。即ち、各分子量
マーカーについて分離ゲルの上端からの泳動距離を測定
し、測定した泳動距離を分子量に対し片対数グラフにプ
ロットすることにより、スタンダード直線を作成した。
さらに、ピーク5の泳動距離を測定し、作成したスタン
ダード直線を用いて分子量を算出した。この結果、ピー
ク5には非還元条件下で45kDaの蛋白質バンドのみ
が、また還元条件下で約28kDaと約23kDaの蛋
白質バンドのみが検出された。
Example 4 Measurement of ADIF Molecular Weight SDS-polyacrylamide gel electrophoresis was performed under reducing and non-reducing conditions using 100 μl of the peak 5 in which ADIF activity was recognized. That is, 50 μl of each of the peak 5 fractions was separated into two tubes, concentrated under reduced pressure, and then concentrated to 1 mM EDTA, 2.5% SDS, and 0.0%.
10 mM Tris containing 1% bromophenol blue
-HCl, pH8, dissolved in 1.5 μl, and left at 37 ° C. overnight under non-reducing and reducing conditions (in the presence of 5% 2-mercaptoethanol), and then 1 μl of each
Was loaded on SDS-polyacrylamide gel electrophoresis. The electrophoresis was performed using a 10-15% acrylamide gradient gel (Pharmacia) and an electrophoresis apparatus Phas
The measurement was performed using tSystem (Pharmacia). As molecular weight markers, phosphorylase b (94 kDa), bovine serum albumin (67 kDa), ovalbumin (43
kDa), carbonic anhydrase (30 kD
a), trypsin inhibitor (20.1 kDa), α
-Lactalbumin (14.4 kDa) was used. After completion of the electrophoresis, silver staining was performed using a Phast Gel Silver Stain Kit (Pharmacia). In addition, the molecular weight of the protein of the peak 5 was calculated as follows. That is, for each molecular weight marker, the migration distance from the upper end of the separation gel was measured, and the measured migration distance was plotted against the molecular weight on a semilogarithmic graph to prepare a standard straight line.
Further, the migration distance of peak 5 was measured, and the molecular weight was calculated using the prepared standard straight line. As a result, only a protein band of 45 kDa was detected in peak 5 under non-reducing conditions, and only protein bands of about 28 kDa and about 23 kDa were detected under reducing conditions.

【0025】[0025]

【実施例5】N−末端アミノ酸配列の決定 ポリキャットAフラクションNo.37〜46につい
て、遠心式濃縮器(セントリコン10、アミコン社)で
約500μlに濃縮した後、10μlの25%TFAを
加え、0.1%TFAを含む30%アセトニトリルで平
衡化した逆相カラム(C4、2.1×250mm、バイ
ダック社)に負荷し、50分間でアセトニトリルを55
%にする直線勾配、流速0.2ml/分にて溶出を行
い、ピーク5を得た。得られたピーク5を遠心濃縮器で
減圧濃縮した後、1mM EDTA、2.5% SD
S、及び0.01%ブロモフェノールブルーを含む10
mMTris−HCl、pH8.5μlで溶解し、還元
条件下(5% 2−メルカプトエタノール存在下)37
℃で一晩放置後、4μlをSDS−ポリアクリルアミド
ゲル電気泳動に負荷した。電気泳動は10−15%アク
リルアミドグラジエントゲル(ファルマシア社)を使用
し、電気泳動装置Phast System/Phast Transfer (ファ
ルマシア社)を用いて行った。泳動後、ブロッティング
装置Phast System(ファルマシア社)を用いてPVDF
膜(ProBlot、パーキンエルマー社)に、20
V、25mAで30分間転写した。転写後、0.2%ク
ーマシーブルー/40%メタノール/10%酢酸溶液で
染色し、60%メタノール溶液で余分な色素を脱色し
た。約23kDaと約28kDaのバンドを切り出し、
プロテインシーケンサー(プロサイス、492型、パー
キンエルマー社)を用い、N末端アミノ酸配列分析を行
った。結果を配列表配列番号1に示す。
Example 5 Determination of N-Terminal Amino Acid Sequence Polycat A Fraction No. About 37-46, after concentrating to about 500 μl with a centrifugal concentrator (Centricon 10, Amicon), 10 μl of 25% TFA was added, and a reversed phase column (equilibrated with 30% acetonitrile containing 0.1% TFA) ( C4, 2.1 × 250 mm, Baydac) and acetonitrile was added to 55
The elution was performed at a linear gradient of 0.2% / min and a flow rate of 0.2 ml / min to obtain peak 5. After concentrating the obtained peak 5 under reduced pressure with a centrifugal concentrator, 1 mM EDTA, 2.5% SD was used.
10 containing S and 0.01% bromophenol blue
Dissolve in mM Tris-HCl, pH 8.5 μl, and reduce under reducing conditions (in the presence of 5% 2-mercaptoethanol).
After standing at <RTIgt; 0 C </ RTI> overnight, 4 <RTIgt; pl </ RTI> were loaded on SDS-polyacrylamide gel electrophoresis. Electrophoresis was performed using a 10-15% acrylamide gradient gel (Pharmacia) and an electrophoresis apparatus Phast System / Phast Transfer (Pharmacia). After the electrophoresis, PVDF is used using a blotting device Phast System (Pharmacia).
20 membranes (ProBlot, PerkinElmer)
V, transferred at 25 mA for 30 minutes. After transfer, the cells were stained with a 0.2% Coomassie blue / 40% methanol / 10% acetic acid solution, and excess dye was decolorized with a 60% methanol solution. Cut out about 23 kDa and about 28 kDa bands,
N-terminal amino acid sequence analysis was performed using a protein sequencer (Procise, Model 492, PerkinElmer). The results are shown in SEQ ID NO: 1 in the Sequence Listing.

【0026】[0026]

【実施例6】N−末端アミノ酸配列の決定 約80リットルのIMR−90培養液から、実施例3と
同様にしてADIF活性を有するポリキャトAフラクシ
ョン37〜46に相当する画分を得た。このポリキャッ
トAフラクション37〜46に相当する画分について、
各フラクションに10μlの20%TFAを加え、10
回に分けて、0.1%TFAを含む30%アセトニトリ
ルで平衡化した逆相カラム(C4、2.1×250m
m、バイダック社)にかけ、50分間でアセトニトリル
を55%にする直線勾配、流速0.2ml/分にて溶出
を行い、実施例4のピーク5相当画分を集めた。得られ
たピーク5相当画分を還元ピリジルエチル化した後、プ
ロテインシーケンサー(プロサイス、492型、パーキ
ンエルマー社)を用い、N末端アミノ酸配列分析を行っ
た。この結果得られた配列は2種類で、今回得られたピ
ーク5には異なる2種類の蛋白質が混在していることが
示唆された。このアミノ酸配列を表1に示す。また、N
末端アミノ酸配列分析の結果において、得られた2種の
蛋白質はほぼ等量存在するため、ヘテロダイマーを形成
している可能性が示唆された。2種類のうちの1種は、
実施例5で得られたADIFと同一であったので、残り
の配列のホモロジー検索を行ったところ、既知の蛋白質
であるスタンニオカルシンであることが明らかになっ
た。そこで、今回得られた配列から、スタンニオカルシ
ンの配列を消去することにより、実施例5で得られたA
DIFのN末端の40番目までのアミノ酸配列が明らか
になった。ADIFのN末端アミノ酸配列を配列表配列
番号2に、スタンニオカルシンのN末端アミノ酸配列を
配列表配列番号3に、それぞれ示す。
Example 6 Determination of N-Terminal Amino Acid Sequence A fraction corresponding to polycat A fractions 37 to 46 having ADIF activity was obtained from about 80 liters of IMR-90 culture solution in the same manner as in Example 3. About the fractions corresponding to the polycat A fractions 37 to 46,
10 μl of 20% TFA was added to each fraction and 10
The reverse phase column (C4, 2.1 × 250 m) equilibrated with 30% acetonitrile containing 0.1% TFA
m, Baydac Co., Ltd.), elution was performed at a linear gradient of 50% acetonitrile in 50 minutes, at a flow rate of 0.2 ml / min, and a fraction corresponding to peak 5 of Example 4 was collected. After the fraction corresponding to the obtained peak 5 was subjected to reductive pyridylethylation, N-terminal amino acid sequence analysis was performed using a protein sequencer (Procise, Model 492, Perkin Elmer). As a result, two types of sequences were obtained, and it was suggested that two different types of proteins were mixed in peak 5 obtained this time. The amino acid sequence is shown in Table 1. Also, N
The results of the terminal amino acid sequence analysis suggested that the two types of proteins obtained were present in almost equal amounts, and that they may have formed a heterodimer. One of the two is
Since it was the same as ADIF obtained in Example 5, homology search of the remaining sequence revealed that it was a known protein, stanniocalcin. Therefore, by deleting the sequence of stanniocalcin from the sequence obtained this time, the A sequence obtained in Example 5 was deleted.
The amino acid sequence up to the N-terminal 40th position of DIF was revealed. The N-terminal amino acid sequence of ADIF is shown in SEQ ID NO: 2, and the N-terminal amino acid sequence of stanniocalcin is shown in SEQ ID NO: 3, respectively.

【0027】[0027]

【表1】 [Table 1]

【0028】[0028]

【実施例7】ADIFcDNA配列の決定 i) IMR-90細胞からのポリ(A) + RNA の単離 IMR-90細胞のポリ(A) + RNA は、ファストトラックmRNA
アイソレーションキット(インヴィトロージェン社) を
用い、そのマニュアルに準じて、1X108 個のIMR-90細胞
より約10μg のポリ(A) + RNA を単離した。
EXAMPLE 7 Determination of ADIFcDNA sequence i) IMR-90 from cell poly (A) + RNA Isolation IMR-90 cells poly (A) + RNA, Fast Track mRNA
Using an isolation kit (Invitrogen), about 10 μg of poly (A) + RNA was isolated from 1 × 10 8 IMR-90 cells according to the manual.

【0029】ii) ミックスプライマーの作製 実施例6で得られたN末端のアミノ酸配列をもとに、次
の2種のミックスプライマーを合成した。即ち、N末端
から13番目(Thr) から19番目(Cys) までのアミノ酸
配列をコードしうるすべての塩基配列を持つオリゴヌク
レオチドの混合物(ミックスプライマー,TAE/F)を合成
した。又、N末端から29番目(Gly) から35番目(Gl
u) までのアミノ酸配列をコードしうるすべての塩基配
列に対する相補的オリゴヌクレオチドの混合物(ミック
スプライマー,CFE/R)を合成した。用いたミックスプラ
イマーの塩基配列を、表2及び3にそれぞれ示す。
Ii) Preparation of Mixed Primers Based on the N-terminal amino acid sequence obtained in Example 6, the following two types of mixed primers were synthesized. That is, a mixture of oligonucleotides (mix primer, TAE / F) having all base sequences capable of encoding the amino acid sequence from the 13th (Thr) to the 19th (Cys) from the N-terminal was synthesized. Also, from the 29th (Gly) to the 35th (Gl
A mixture (mix primer, CFE / R) of complementary oligonucleotides to all base sequences capable of encoding the amino acid sequences up to u) was synthesized. The base sequences of the mixed primers used are shown in Tables 2 and 3, respectively.

【0030】[0030]

【表2】 [Table 2]

【0031】[0031]

【表3】 [Table 3]

【0032】iii) ADIFcDNA断片のPCR による増幅 実施例7−i)で得たポリ(A) + RNA 、1 μg を鋳型とし
てスーパースクリプトIIcDNA合成キット(ギブコB
RL社) を用いて、同社のプロトコールに従って一本鎖
cDNAを合成し、このcDNAと実施例7−ii) で示
したプライマーを用いて、PCRを行い、ADIFcD
NA断片を取得した。以下に条件を示す。 10X Ex Taqバッファー(宝酒造社) 10 μl 2.5 mM dNTP 8 μl cDNA溶液 2.5 μl Ex Taq (宝酒造社) 1 μl 蒸留水 73.5 μl 20μM プライマーTAE/F 2.5 μl 20μM プライマーCFE/R 2.5 μl 上記の溶液を微量遠心チューブ中で混合後、以下の条件
でPCRを行った。95℃で3 分前処理後、95℃30秒、50
℃30秒、72℃ 1秒の3 段階の反応を40回繰り返したの
ち、72℃で5分保温した。反応液の一部をアガロース電
気泳動し、N末端アミノ酸配列から予想される約68bpと
みられるDNA断片が得られたことを確認した。
Iii) Amplification of ADIF cDNA fragment by PCR Using 1 μg of the poly (A) + RNA obtained in Example 7-i) as a template, Superscript II cDNA synthesis kit (Gibco B
(RL) according to the company's protocol, and using this cDNA and the primers described in Example 7-ii), PCR is performed to obtain ADIFcD
An NA fragment was obtained. The conditions are shown below. 10X Ex Taq buffer (Takara Shuzo) 10 μl 2.5 mM dNTP 8 μl cDNA solution 2.5 μl Ex Taq (Takara Shuzo) 1 μl Distilled water 73.5 μl 20 μM Primer TAE / F 2.5 μl 20 μM Primer CFE / R 2.5 μl Trace amount of the above solution After mixing in a centrifuge tube, PCR was performed under the following conditions. After pretreatment at 95 ° C for 3 minutes, 95 ° C for 30 seconds, 50
After repeating the three-stage reaction of 30 ° C. for 30 seconds and 72 ° C. for 1 second 40 times, the mixture was kept at 72 ° C. for 5 minutes. A part of the reaction solution was subjected to agarose electrophoresis, and it was confirmed that a DNA fragment estimated to be about 68 bp from the N-terminal amino acid sequence was obtained.

【0033】[0033]

【実施例8】PCR により増幅されたADIFcDNA断片のクロ
ーニング及び塩基配列決定 実施例7−iii)で得られたDNA断片を、DNAライゲ
ーションキット Ver.2(宝酒造社) を用いてpT7
Tvector (Novagen 社)に挿入し、大腸菌XL2Blu
e(ストラタジーン社)の形質転換を行った。得られた
形質転換株を増殖させ、約68bpのADIFcDNA
断片が挿入されたプラスミドを常法に従い精製した。こ
のプラスミドをpBSADIF と名付け、このプラスミドに挿
入されているADIFcDNAの塩基配列をDNAシー
クエンシングキット(パーキンエルマー社)を用いて決
定した。この塩基配列から予測される23個のアミノ酸か
らなるアミノ酸配列は、ミックスプライマーを設計する
のに用いたADIFのN末端アミノ酸配列(配列表配列
番号2)中に見出すことができた。以上の結果より、ク
ローニングした68bpのcDNAは、ADIFcDN
A断片であることが確認された。
Example 8 Cloning of ADIF cDNA fragment amplified by PCR
The DNA fragment obtained in Example 7-iii) was subjected to DNA ligation kit Ver. PT7 using 2 (Takara Shuzo)
Insert into Tvector (Novagen) and use Escherichia coli XL2Blu
e (Stratagene) was transformed. The resulting transformant is grown and about 68 bp of ADIF cDNA
The plasmid into which the fragment was inserted was purified according to a conventional method. This plasmid was named pBSADIF, and the nucleotide sequence of ADIF cDNA inserted into this plasmid was determined using a DNA sequencing kit (Perkin Elmer). The amino acid sequence consisting of 23 amino acids predicted from this nucleotide sequence could be found in the N-terminal amino acid sequence of ADIF used to design the mix primer (SEQ ID NO: 2 in the Sequence Listing). From the above results, the cloned 68 bp cDNA was obtained from ADIFcDN.
It was confirmed to be an A fragment.

【0034】[0034]

【実施例9】DNAプローブの作製 実施例8で作成された約68bpのADIFcDNA断
片が挿入されたプラスミドを鋳型にして実施例7−iii)
の条件でPCRを行なうことにより、このADIFcD
NA断片を増幅した。アガロース電気泳動により約68
bpのADIFcDNA断片を分離後、QIAEX D
NAアイソレーションキット(キアゲン社)を用いて精
製した。このDNAをメガプライムDNAラベリングキ
ット(アマシャム社) を用いて [α 32P]dCTP で標識
し、全長のADIFcDNAをスクリーニングするため
のプローブとして用いた。
Example 9 Preparation of DNA Probe Example 7-iii) Using the plasmid into which the ADIF cDNA fragment of about 68 bp prepared in Example 8 was inserted as a template.
This ADIFcD
The NA fragment was amplified. About 68 by agarose gel electrophoresis
After separation of the ADIF cDNA fragment of QIAEX D
Purification was performed using an NA isolation kit (Qiagen). This DNA was labeled with [α 32 P] dCTP using a Megaprime DNA Labeling Kit (Amersham) and used as a probe for screening for full-length ADIF cDNA.

【0035】[0035]

【実施例10】cDNAライブラリーの作成 実施例7−i)で得られたポリ(A) + RNA 、2.5 μg を鋳
型としてグレートレングスcDNA合成キット(クロン
テック社) を用いて同社のプロトコールに従い、oligo
(dT)primer を用いてcDNAの合成、EcoRI-SalI-Not-
Iアダプター付加、cDNAサイズフラクショネーショ
ンを行いエタノール沈殿の後10μl のTEバッファーに溶
解した。得られたアダプター付加cDNA、0.1 μg を
T4DNA リガーゼを用いてあらかじめEcoRI で切断した1
μg のλZAP エクスプレスベクター(ストラタジーン
社)に挿入した。このようにして得られたcDNA組み
換えファージDNA 溶液をギガパックゴールドII(ストラ
タジーン社) を用いてインヴィトロパッケージング反応
に供し、λZAP エクスプレス組み換えファージを作成し
た。
Example 10 Preparation of cDNA Library Using 2.5 g of the poly (A) + RNA obtained in Example 7-i) as a template and a Great Strength cDNA synthesis kit (Clontech) according to the company's protocol, oligo was used.
cDNA synthesis using (dT) primer, EcoRI-SalI-Not-
After addition of I adapter and cDNA size fractionation, ethanol precipitation was performed, followed by dissolution in 10 μl of TE buffer. 0.1 μg of the obtained adapter-added cDNA
Pre-cut with EcoRI using T4 DNA ligase1
μg of λZAP express vector (Stratagene) was inserted. The cDNA recombinant phage DNA solution thus obtained was subjected to an in vitro packaging reaction using Gigapack Gold II (Stratagene) to prepare a λZAP express recombinant phage.

【0036】[0036]

【実施例11】組み換えファージのスクリーニング 実施例10で得られた組み換えファージを37℃で15分間
大腸菌 XL1-Blue MRF'(ストラタジーン社) に感染させ
たのち、50℃に加温した0.7%の寒天を含むNZY培地に添
加し、NZY 寒天培地プレートに流しこんだ。37℃で一晩
培養後、プラークの生じたプレート上にハイボンドN
(アマシャム社) を約30秒密着させた。このフィルター
を常法に従いアルカリ変性の後、中和し、2XSSC 溶液に
浸したのちUVクロスリンク(ストラタジーン社) により
DNA をフィルターに固定化した。得られたフィルターを
100 μg/mlのサケ精子DNA を含むハイブリダイゼーショ
ンバッファー(アマシャム社) に浸漬し65℃で4 時間前
処理した後、熱変性した上記DNA プローブ(2X105cpm/m
l) を添加した上記バッファ−に移し替え65℃で一晩ハ
イブリダイゼーションを行った。反応後フィルターを2X
SSC で2 回、0.1XSSC, 0.1%SDS溶液で2 回それぞれ65℃
で10分間洗浄した。得られたいくつかの陽性クローン
を、さらに1 回スクリーニングを行うことにより純化し
た。それらの中から約2.0kb のインサートを持つものを
以下に用いた。純化したファージをλZAP エクスプレス
クローニングキット(ストラタジーン社) のプロトコー
ルに従い、大腸菌XL1-Blue MRF' に感染させたのち、ヘ
ルパーファージExAssist(ストラタジーン社) で多重感
染を行い、その培養上清を大腸菌XLOLR (ストラタジー
ン社)に感染させたのちカナマイシン耐性株を拾うこと
によりpBKCMV(ストラタジーン社) に上述の2.0kb のイ
ンサートが挿入されたプラスミドpBKADIF をもつ形質転
換株を得た。この形質転換株はXLOLR/pBKADIF として、
通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所に平成10
年8 月11日に受託番号FERM BP-6459として寄託してあ
る。このプラスミドをもつ形質転換株を増殖させ、常法
によりプラスミドを精製した。
Example 11 Screening of Recombinant Phage The recombinant phage obtained in Example 10 was infected with Escherichia coli XL1-Blue MRF '(Stratagene) at 37 ° C. for 15 minutes, and then heated to 50 ° C. at 0.7%. It was added to NZY medium containing agar and poured onto NZY agar plate. After overnight incubation at 37 ° C, place Hybond N on the plate with plaques.
(Amersham) for about 30 seconds. This filter is denatured with alkali according to a conventional method, neutralized, immersed in 2XSSC solution, and then subjected to UV crosslink (Stratagene).
DNA was immobilized on the filter. The obtained filter
After immersion in a hybridization buffer (Amersham) containing 100 μg / ml salmon sperm DNA and pretreatment at 65 ° C for 4 hours, the above heat-denatured DNA probe (2 × 10 5 cpm / m
l) was added to the above buffer and hybridization was carried out at 65 ° C overnight. 2X filter after reaction
Twice with SSC and twice with 0.1XSSC, 0.1% SDS solution 65 ° C each
For 10 minutes. Some of the obtained positive clones were purified by one more screening. Those having an insert of about 2.0 kb were used below. The purified phage was infected with Escherichia coli XL1-Blue MRF 'according to the protocol of the λZAP Express Cloning Kit (Stratagene), followed by multiple infections with the helper phage ExAssist (Stratagene), and the culture supernatant was used to transform the culture supernatant into Escherichia coli XLOLR. After infection with (Stratagene), a kanamycin resistant strain was picked up to obtain a transformant having the plasmid pBKADIF in which the above-mentioned 2.0 kb insert was inserted into pBKCMV (Stratagene). This transformant is designated as XLOLR / pBKADIF
Ministry of International Trade and Industry institute of biotechnology
Deposited on August 11, 2008 under accession number FERM BP-6459. A transformant having this plasmid was grown, and the plasmid was purified by a conventional method.

【0037】[0037]

【実施例12】ADIFの全アミノ酸配列をコードするcDNA
の塩基配列の決定 実施例11で得られたADIFcDNAの塩基配列をD
NAシ−クエンシングキット(パーキンエルマー社) を
用いて決定した。用いたプライマーはT3, T7プライマー
(ストラタジーン社)及びADIFcDNAの塩基配列
に基づいて設計された合成プライマーであり、その配列
を配列表配列番号4〜11に示す。決定されたADIF
をコードする遺伝子の塩基配列を配列番号12に、その
配列から推定される全アミノ酸配列を配列番号13にそ
れぞれ示す。
Example 12 cDNA encoding the entire amino acid sequence of ADIF
Determination of the base sequence of ADIF cDNA obtained in Example 11
The determination was performed using an NA sequencing kit (PerkinElmer). The primers used were T3 and T7 primers (Stratagene) and synthetic primers designed based on the nucleotide sequence of ADIF cDNA, and the sequences are shown in SEQ ID NOs: 4 to 11 in the Sequence Listing. ADIF determined
Is shown in SEQ ID NO: 12, and the entire amino acid sequence deduced from the sequence is shown in SEQ ID NO: 13.

【0038】[0038]

【実施例13】ヒトスタンニオカルシンcDNAのクロ
ーニング 実施例7−i)で得たポリ(A) + RNA 、1 μg を鋳型とし
てスーパースクリプトIIcDNA合成キット(ギブコB
RL社) を用いて、同社のプロトコールに従って一本鎖
cDNAを合成し、このcDNAと配列表配列番号14
及び15で示したプライマー(プライマーSTCF1
N、プライマーSTCR1Xh)を用いて、PCRを行
い、STCcDNA断片を取得した。以下に条件を示
す。 10X Ex Taqバッファー(宝酒造社) 10 μl 2.5 mM dNTP 8 μl cDNA溶液 1 μl Ex Taq (宝酒造社) 0.5 μl 蒸留水 74.5 μl 20μM プライマーSTCF1N 5 μl 100μM プライマーSTCR1Xh 1 μl 上記の溶液を微量遠心チューブ中で混合後、以下の条件
でPCRを行った。95℃で3 分前処理後、95℃30秒、55
℃30秒、72℃ 2分の3 段階の反応を30回繰り返したの
ち、70℃5分保温した。反応液の一部をアガロース電気
泳動し約900bp の均一なDNA断片が得られたことを確
認した。又、このDNA断片をシークエンスし、ヒトス
タンニオカルシンが得られたことが確認できた。DNA
配列を配列表配列番号16に、DNA配列から推定され
る全アミノ酸配列を配列表配列番号17に示す。
Example 13 Cloning of human stanniocalcin cDNA
Ningu Example 7-i) obtained in poly (A) + RNA, Superscript IIcDNA synthesis kit 1 [mu] g as a template (Gibco B
(RL Co., Ltd.) to synthesize a single-stranded cDNA according to the company's protocol.
And 15 (primer STCF1
N, primer STCR1Xh) was used to perform PCR to obtain an STC cDNA fragment. The conditions are shown below. 10X Ex Taq buffer (Takara Shuzo) 10 μl 2.5 mM dNTP 8 μl cDNA solution 1 μl Ex Taq (Takara Shuzo) 0.5 μl Distilled water 74.5 μl 20 μM Primer STCF1N 5 μl 100 μM Primer STCR1Xh 1 μl The above solution in a microcentrifuge tube After mixing, PCR was performed under the following conditions. After pretreatment at 95 ° C for 3 minutes, 95 ° C for 30 seconds, 55
After repeating the reaction in three steps of 30 ° C. for 30 seconds and 72 ° C. for 2 minutes 30 times, the mixture was kept at 70 ° C. for 5 minutes. A part of the reaction solution was subjected to agarose electrophoresis, and it was confirmed that a uniform DNA fragment of about 900 bp was obtained. This DNA fragment was sequenced, and it was confirmed that human stanniocalcin was obtained. DNA
The sequence is shown in SEQ ID NO: 16, and the entire amino acid sequence deduced from the DNA sequence is shown in SEQ ID NO: 17.

【0039】[0039]

【実施例14】293/EBNA細胞による組み換え型
FL-ADIF/ his-myc-STC の生産 i) FLAGタグ付きADIF発現プラスミドの構築 実施例11で得られたプラスミドpBKADIF を鋳型とし、
ADIFF2(配列表配列番号18) およびAD-FLAGXhoI (配
列表配列番号19)をプライマーとしてExTaq(宝酒造
社) を用いてPCR を行った。得られたDNA 断片を制限酵
素SmaIおよびXhoIで消化して、約500bp のDNA 断片をQI
AEXIIDNAアイソレーションキット( キアゲン社) を用い
て精製した。また、プラスミドpBKADIF を制限酵素SalI
およびSmaIで消化し、約700bp のDNA 断片をQIAEXIID
NAアイソレーションキット( キアゲン社) を用いて精製
した。この2 つのDNA 断片を、予め制限酵素XhoIで切断
し、アルカリフォスファターゼで処理しておいたプラス
ミドpCEP4 (インヴィトロージェン社)に、ライゲーシ
ョンキットver.2 (宝酒造社)を用いて挿入した。ライ
ゲーション反応の終了したDNA 溶液を用いて、大腸菌DH
5 α(ギブコBRL 社)を形質転換した。得られたアンピ
シリン耐性形質転換株より、FLAGタグ付きADIFcDNAがCM
V プロモーターによる転写方向と同方向に挿入されたプ
ラスミドを持つ株を選びだした。得られた細胞をDH5 α
/pCEP-ADIF-FL と名付けた。このプラスミド(pCEP-ADIF
-FL)中のADIFcDNA部分およびFLAGタグ部分はDNA シーク
エンスを決定して、PCR 反応時の塩基の取り込みエラー
がないことを確認した。
Example 14 Recombinant type using 293 / EBNA cells
Production of FL-ADIF / his-myc-STC i) Construction of FLAG-tagged ADIF expression plasmid Using plasmid pBKADIF obtained in Example 11 as a template,
PCR was performed using ExTaq (Takara Shuzo) with ADIFF2 (SEQ ID NO: 18) and AD-FLAGXhoI (SEQ ID NO: 19) as primers. The obtained DNA fragment was digested with restriction enzymes SmaI and XhoI, and a DNA fragment of about 500 bp was digested with QI.
Purification was performed using an AEXII DNA isolation kit (Qiagen). Plasmid pBKADIF was replaced with the restriction enzyme SalI.
Digested with SmaI and the DNA fragment of about 700 bp
Purification was performed using an NA isolation kit (Qiagen). These two DNA fragments were cut with the restriction enzyme XhoI in advance, and inserted into the plasmid pCEP4 (Invitrogen), which had been treated with alkaline phosphatase, using the ligation kit ver.2 (Takara Shuzo). Using the DNA solution after the ligation reaction,
5α (Gibco BRL) was transformed. From the obtained ampicillin-resistant transformant, FLAG-tagged ADIF cDNA was converted to CM
A strain having a plasmid inserted in the same direction as the transcription direction by the V promoter was selected. DH5α
Named / pCEP-ADIF-FL. This plasmid (pCEP-ADIF
The DNA sequence of the ADIF cDNA portion and the FLAG tag portion in -FL) was determined by DNA sequencing, and it was confirmed that there was no base incorporation error during the PCR reaction.

【0040】ii) myc/his タグ付きSTC 発現プラスミド
の構築 実施例13で得られた約0.9kb のDNA 断片をQIAEXII DN
A extraction kit (QIAGEN社) によって精製した。この
DNA 断片を制限酵素XhoIおよびNheI(宝酒造社)で切断
し、QIAEXII DNA extraction kitにより精製した(STC
XhoI-NheI 断片)。また、pCEP4 myc his を同様に制限
酵素XhoIおよびNheIで切断した。pCEP4myc his は以下
の方法により作製した。pSecTagA(Invitrogen 社)10ng
を鋳型としTaqF(配列表配列番号20)と BglIIR(配列
表配列番号21)をプライマーとしてExTaq polymerase
を用いてPCR を行った。得られた約300bp のDNA 断片を
QIAEXII DNA extraction kitにより精製し、制限酵素Nh
eIおよびBglII(宝酒造社)で切断した後再びQIAEXII DN
A extraction kitにより精製し、その精製断片をpCEP4
(Invitrogen社) のNheI,BamHI部位に挿入してpCEP4 myc
his を構築した。STC XhoI-NheI 断片をXhoIおよびNhe
Iで切断したpCEP4 myc his にligation kit ver.2(宝
酒造社)により結合させてpCEPSTC myc his を得た。こ
のプラスミドはC 末端にmyc epitope およびpolyhistid
ine tag が付加されたSTC をコードするDNA を含んでい
る。PCR 由来のDNA 部分にDNA 合成時に塩基の誤った取
り込みがない事をDNA シークエンシングにより確かめ
た。
Ii) STC expression plasmid with myc / his tag
The DNA fragment of about 0.9 kb obtained in Example 13 was ligated with QIAEXII DN
Purification was performed using an A extraction kit (QIAGEN). this
The DNA fragment was digested with restriction enzymes XhoI and NheI (Takara Shuzo) and purified with QIAEXII DNA extraction kit (STC
XhoI-NheI fragment). In addition, pCEP4 myc his was similarly digested with restriction enzymes XhoI and NheI. pCEP4myc his was prepared by the following method. pSecTagA (Invitrogen) 10ng
With TaqF (SEQ ID NO: 20) and BglIIR (SEQ ID NO: 21) as primers and ExTaq polymerase
PCR was performed using PCR. The obtained DNA fragment of about 300 bp
Purified by QIAEXII DNA extraction kit, restriction enzyme Nh
After cutting with eI and BglII (Takara Shuzo), QIAEXII DN again
Purified using A extraction kit, and the purified fragment was pCEP4
(Invitrogen) into NheI and BamHI sites and insert pCEP4 myc
built his. STC XhoI-NheI fragment
The fragment was ligated to pCEP4 myc his cut with I using ligation kit ver.2 (Takara Shuzo) to obtain pCEPSTC myc his. This plasmid has a myc epitope and polyhistid at the C-terminus.
Contains DNA encoding STC with ine tag added. We confirmed by DNA sequencing that there was no erroneous incorporation of bases during DNA synthesis in the PCR-derived DNA portion.

【0041】iii) FL-ADIF/ his-myc-STC cDNAのト
ランジエントな発現及びその活性の測定 実施例14−i)で得られたFL-ADIF 発現プラスミドpCEP
-ADIF-FLとmyc-his-STC 発現プラスミドpCEPSTC myc hi
s を用いて、以下に述べる方法で組み換え FL-ADIF/ hi
s-myc-STC を発現させ、その活性を測定した。2×10
5 個の293/EBNA細胞(インヴィトロージェン
社) を24ウェルプレートの各ウェルに10%牛胎児血
清(ギブコBRL社)を含むIMDM培地(ギブコBR
L社)を用いて植え込み、翌日、トランスフェクション
用試薬FuGENETM6 (ベ−リンガ−・マンハイム
社)添付のプロトコールに従い、あらかじめIMDM培
地を用いて希釈しておいたpCEP-ADIF-FL、pCEPSTC myc
his 及びFuGENETM6 を混合した後、この混合液を
各ウェルの細胞に加えた。用いたpCEP-ADIF-FL、pCEPST
C myc his 及びFuGENETM量はそれぞれ0.5μg
、0.5μg 及び1μlであった。72時間後、培地を
回収し、これをADIF活性測定用サンプルとした。A
DIFの活性測定は以下のようにして行った。マウス前
駆脂肪細胞株MC3T3-G2/PA6細胞を標的細胞として用い、
デキサメタゾン存在下での脂肪細胞の形成をトリグリセ
ライドの蓄積を指標として試験し、その抑制活性を測定
することによって行った。即ち、96ウェルマイクロプ
レートに10%牛胎児血清を含むα−MEM(ギブコB
RL社)で希釈したサンプル50μlを入れ、マウス前
駆脂肪細胞株MC3T3-G2/PA6細胞3×103 個を2×10
-7Mデキサメタゾン及び10%牛胎児血清を含む50μ
lのα−MEMに懸濁させて播種し、5%CO2 、37
℃、湿度100%にて一週間培養した。培養7日後に培
地を吸引除去し、風乾後、脂肪細胞中に蓄積したトリグ
リセライドをトリグリセライド測定キット(トリグリセ
ライドG−テストワコー、コード番号274-69802 、和光
純薬工業社) を用いて測定した。OD510nm の減少をAD
IF活性とした。結果を表4に示す。この結果、先にI
MR−90の培養液から得られた実施例3の精製蛋白質
と同様の活性をこの培養液が有することが確認された。
Iii) FL-ADIF / his-myc-STC cDNA
Measurement of transient expression and its activity FL-ADIF expression plasmid pCEP obtained in Example 14-i)
-ADIF-FL and myc-his-STC expression plasmid pCEPSTC myc hi
s and the recombinant FL-ADIF / hi
s-myc-STC was expressed and its activity was measured. 2 × 10
Five 293 / EBNA cells (Invitrogen) were placed in each well of a 24-well plate in IMDM medium (Gibco BR) containing 10% fetal bovine serum (Gibco BRL).
LC), and the next day, pCEP-ADIF-FL, pCEPSTC myc, which had been diluted with IMDM medium, according to the protocol attached to the transfection reagent FuGENE 6 (Behringer Mannheim).
After mixing his and FuGENE 6, this mixture was added to the cells in each well. PCEP-ADIF-FL, pCEPST used
The amounts of C myc his and FuGENE are 0.5 μg each.
, 0.5 μg and 1 μl. After 72 hours, the medium was recovered and used as a sample for measuring ADIF activity. A
The activity of DIF was measured as follows. Using mouse preadipocyte cell line MC3T3-G2 / PA6 cells as target cells,
Adipocyte formation in the presence of dexamethasone was tested by examining triglyceride accumulation as an index and measuring its inhibitory activity. That is, α-MEM (Gibco B) containing 10% fetal bovine serum in a 96-well microplate.
RL), and 3 × 10 3 mouse preadipocyte cell line MC3T3-G2 / PA6 cells were added to 2 × 10 3
50μ, including -7 M dexamethasone and 10% fetal bovine serum
l-α-MEM and seeded with 5% CO 2 , 37
The cells were cultured at 100 ° C. and 100% humidity for one week. After 7 days of culture, the medium was removed by suction, air-dried, and the triglyceride accumulated in the fat cells was measured using a triglyceride measurement kit (Triglyceride G-Test Wako, code number 274-69802, Wako Pure Chemical Industries, Ltd.). OD510nm decrease AD
IF activity. Table 4 shows the results. As a result, first,
It was confirmed that this culture had the same activity as the purified protein of Example 3 obtained from the culture of MR-90.

【0042】[0042]

【表4】 [Table 4]

【0043】[0043]

【実施例15】3T3/LI細胞を用いた脂肪細胞形成
抑制活性の測定 マウス前駆脂肪細胞株3T3-LI細胞を標的細胞として用
い、デキサメタゾンと1-メチル-3- イソブチルキサンチ
ン存在下での脂肪細胞の形成をトリグリセライドの蓄積
を指標として試験し、その抑制活性を測定することによ
って行った。即ち、96ウェルマイクロプレートに10
%牛胎児血清を含むα−MEM(ギブコBRL社)で希
釈したサンプル50μlを入れ、マウス前駆脂肪細胞株
3T3-LI細胞5×103 個を50μlの4×10-7Mデキ
サメタゾン、2×10-5M 1-メチル-3- イソブチルキ
サンチン及び10%牛胎児血清を含むα−MEMに懸濁
させて播種し、5%CO2 、37℃、湿度100%にて
一週間培養した。培養7日後に培地を吸引除去し、風乾
後、脂肪細胞中に蓄積したトリグリセライドをトリグリ
セライド測定キット(トリグリセライドG−テストワコ
ー、コード番号274-69802 、和光純薬工業社) を用いて
測定した。OD510nm の減少を脂肪細胞形成抑制ADIF
活性とした。結果を表5に示す。この結果、3T3-LI細胞
を標的細胞として用いた場合にも、脂肪細胞形成抑制活
性をこの培養液が有することが確認された。
Example 15 Adipocyte formation using 3T3 / LI cells
Measurement of inhibitory activity Using 3T3-LI mouse preadipocyte cell line as target cells, the formation of adipocytes in the presence of dexamethasone and 1-methyl-3-isobutylxanthine was tested using triglyceride accumulation as an index, and the inhibitory activity was examined. Was measured. That is, 10 is added to a 96-well microplate.
50 μl of a sample diluted with α-MEM (Gibco BRL) containing 10% fetal bovine serum was added to the mouse preadipocyte cell line.
5 × 10 3 3T3-LI cells were suspended in 50 μl of α-MEM containing 4 × 10 −7 M dexamethasone, 2 × 10 −5 M 1-methyl-3-isobutylxanthine and 10% fetal bovine serum. The cells were inoculated and cultured at 5% CO 2 , 37 ° C. and 100% humidity for one week. After 7 days of culture, the medium was removed by suction, air-dried, and the triglyceride accumulated in the fat cells was measured using a triglyceride measurement kit (Triglyceride G-Test Wako, code number 274-69802, Wako Pure Chemical Industries, Ltd.). ADIF reduces OD510nm to suppress adipocyte formation
Active. Table 5 shows the results. As a result, it was confirmed that even when 3T3-LI cells were used as target cells, the culture solution had an adipocyte formation inhibitory activity.

【0044】[0044]

【表5】 [Table 5]

【0045】[0045]

【実施例16】ADIF/STCヘテロダイマーの精製 i) FL-ADIF/myc-his-STCcDNAのトランジエントな発
実施例14−i)で得られたFL-ADIF 発現プラスミドpCEP
-ADIF-FLとmyc-his-STC 発現プラスミドpCEPSTC myc hi
s を用いて、以下に述べる方法で組み換えFL-ADIF/myc-
his-STC を発現させた。5×105 個の293/EBN
A細胞(インヴィトロージェン社) を6ウェルプレート
の各ウェルに10%牛胎児血清(ギブコBRL社)を含
むIMDM培地(ギブコBRL社)を用いて植え込み、
翌日、トランスフェクション用試薬FuGENETM6
(ベ−リンガ−・マンハイム社)添付のプロトコールに
従い、あらかじめIMDM培地を用いて希釈しておいた
pCEP-ADIF-FL、pCEPSTC myc his 及びFuGENETM6
を混合した後、この混合液を各ウェルの細胞に加えた。
用いたpCEP-ADIF-FL、pCEPSTC myc his 及びFuGEN
TM量はそれぞれ0.5μg 、0.5μg 及び3μl で
あった。24時間後、培地を無血清IMDM培地(ギブ
コBRL社)と交換し、更に72時間後培養液を回収
し、これをADIF/STCヘテロダイマー精製サンプ
ルとした。
Example 16 Purification of ADIF / STC Heterodimer i) Transient Expression of FL-ADIF / myc-his-STC cDNA
The FL-ADIF expression plasmid pCEP obtained in the present Example 14-i)
-ADIF-FL and myc-his-STC expression plasmid pCEPSTC myc hi
s and the recombinant FL-ADIF / myc-
his-STC was expressed. 5 × 10 5 293 / EBN
A cells (Invitrogen) were implanted into each well of a 6-well plate using IMDM medium (Gibco BRL) containing 10% fetal bovine serum (Gibco BRL),
The next day, the transfection reagent FuGENE 6
(Behringer Mannheim) Diluted in advance with IMDM medium according to the attached protocol
pCEP-ADIF-FL, pCEPSTC myc his and FuGENE 6
After mixing, the mixture was added to the cells in each well.
PCEP-ADIF-FL, pCEPSTC myc his and FuGEN used
The ETM amounts were 0.5 μg, 0.5 μg and 3 μl, respectively. After 24 hours, the medium was replaced with a serum-free IMDM medium (Gibco BRL), and after a further 72 hours, the culture was recovered and used as an ADIF / STC heterodimer purified sample.

【0046】ii) Anti-FLAG-M2-Affinity-Gel による精
実施例15−i)で得られた培養液40mlと0.5mlのAn
ti-FLAG-M2-Affinity-Gel (シグマ社)を50ml遠心管
に入れ、4℃で一晩攪拌することによりADIF/ST
CヘテロダイマーをAnti-FLAG-M2-Affinity-Gel に結合
させた。遠心後、上清を廃棄し、0.15M NaCl
と0.01% Tween80を含む50mM Tri
s−HCl,pH7.4,20mlで2回洗浄し、5mlの
0.1MGlycine−HCl,pH3.5で溶出さ
せ、3M TrisでpHを8に調整した。Anti-FLAG-
M2-Affinity-Gel により、FL-ADIF 及びFL-ADIF/myc-hi
s-STC ヘテロダイマーを得た。
Ii) Purification by Anti-FLAG-M2-Affinity-Gel
An in manufacturing Example 15-i) in the obtained culture solution 40ml and 0.5ml
Add ti-FLAG-M2-Affinity-Gel (Sigma) into a 50 ml centrifuge tube and stir at 4 ° C overnight to obtain ADIF / ST.
The C heterodimer was conjugated to Anti-FLAG-M2-Affinity-Gel. After centrifugation, the supernatant is discarded and 0.15 M NaCl
Tris containing 50 mM Tris and 0.01% Tween80
Washed twice with s-HCl, pH 7.4, 20 ml, eluted with 5 ml of 0.1 M Glycine-HCl, pH 3.5 and adjusted to pH 8 with 3 M Tris. Anti-FLAG-
FL-ADIF and FL-ADIF / myc-hi by M2-Affinity-Gel
An s-STC heterodimer was obtained.

【0047】iii) Ni-NTA Superflowによる精製 実施例15−ii) で得られた溶出液10mlを、0.5M
NaClを含む20mMリン酸緩衝液、pH7.8で
平衡化させたNi-NTA Superflowカラム(7.5mlゲル、
キアゲン社) にかけ、0.5M NaClと10mMイ
ミダゾールを含む20mMリン酸緩衝液、pH6.0で
洗浄後、0.5M NaClと500mMイミダゾール
を含む20mMリン酸緩衝液、pH6.0で溶出させ
た。以上の精製により、FL-ADIF/myc-his-STC ヘテロダ
イマーを得た。
Iii) Purification by Ni-NTA Superflow 10 ml of the eluate obtained in Example 15-ii) was
Ni-NTA Superflow column (7.5 ml gel, equilibrated with 20 mM phosphate buffer containing NaCl, pH 7.8)
After washing with 20 mM phosphate buffer containing 0.5 M NaCl and 10 mM imidazole, pH 6.0, the column was eluted with 20 mM phosphate buffer containing 0.5 M NaCl and 500 mM imidazole, pH 6.0. By the above purification, FL-ADIF / myc-his-STC heterodimer was obtained.

【0048】iv)FL-ADIF/myc-his-STCヘテロダイマーの
生物活性 マウス前駆脂肪細胞株MC3T3-G2/PA6細胞を標的細胞とし
て用い、デキサメタゾン存在下での脂肪細胞の形成をト
リグリセライドの蓄積を指標として試験し、その抑制活
性を測定することによって行った。即ち、96ウェルマ
イクロプレートに10%牛胎児血清を含むα−MEM
(ギブコBRL社)で希釈した、実施例15−iii)で得
られたFL-ADIF/myc-his-STC ヘテロダイマーのサンプル
50μlを入れ、マウス前駆脂肪細胞株MC3T3-G2/PA6細
胞3×103 個を2×10-7Mデキサメタゾン及び10
%牛胎児血清を含む50μlのα−MEMに懸濁させて
播種し、5%CO2 、37℃、湿度100%にて一週間
培養した。培養7日後に培地を吸引除去し、風乾後、脂
肪細胞中に蓄積したトリグリセライドをトリグリセライ
ド測定キット(トリグリセライドG−テストワコー、コ
ード番号274-69802 、和光純薬工業社) を用いて測定し
た。OD510nm の減少をADIF活性とした。結果を表6
に示す。この結果、FL-ADIF/myc-his-STC ヘテロダイマ
ーが脂肪細胞形成抑制活性を有することが確認された。
Iv) of FL-ADIF / myc-his-STC heterodimer
Using the bioactive mouse preadipocyte cell line MC3T3-G2 / PA6 cells as target cells, the formation of adipocytes in the presence of dexamethasone was tested using triglyceride accumulation as an index, and the inhibitory activity was measured. That is, α-MEM containing 10% fetal bovine serum in a 96-well microplate.
50 μl of the sample of the FL-ADIF / myc-his-STC heterodimer obtained in Example 15-iii) diluted with (Gibco BRL) was placed therein, and the mouse preadipocyte cell line MC3T3-G2 / PA6 cells 3 × 10 Three of them are 2 × 10 −7 M dexamethasone and 10
The cells were suspended in 50 μl of α-MEM containing 50% fetal bovine serum, inoculated, and cultured at 5% CO 2 , 37 ° C. and 100% humidity for one week. After 7 days of culture, the medium was removed by suction, air-dried, and the triglyceride accumulated in the fat cells was measured using a triglyceride measurement kit (Triglyceride G-Test Wako, code number 274-69802, Wako Pure Chemical Industries, Ltd.). The decrease in OD 510 nm was defined as ADIF activity. Table 6 shows the results
Shown in As a result, it was confirmed that the FL-ADIF / myc-his-STC heterodimer has adipocyte formation inhibitory activity.

【0049】[0049]

【表6】 [Table 6]

【0050】[0050]

【発明の効果】本発明により、脂肪細胞の分化及び/又
は成熟を抑制する活性を有する新規蛋白質が提供され
る。本発明蛋白質は、肥満の予防及び/又は治療を目的
とした医薬組成物、あるいは免疫学的診断を確立するた
めの抗原などとして有用である。
Industrial Applicability According to the present invention, there is provided a novel protein having an activity of suppressing adipocyte differentiation and / or maturation. The protein of the present invention is useful as a pharmaceutical composition for preventing and / or treating obesity, or as an antigen for establishing an immunological diagnosis.

【0051】[0051]

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> 雪印乳業株式会社(Snow Brand Milk Products Co., Ltd.) <120> 新規蛋白質及びその製造方法 <130> YTP98026 <160> 21 <210> 1 <211> 20 <212> PRT <213> Homo Sapiens <220> <221> (1...2) <222> UNSURE <220> <221> (19) <222> UNSURE <400> 1 Xaa Xaa Gln Gln Lys Gly Arg Leu Val Leu Gln Asn Thr Ala Glu Ile 1 5 10 15 Gln His Xaa Leu 20 <210> 2 <211> 40 <212> PRT <213> Human <400> 2 Xaa Ser Gln Gln Lys Gly Arg Leu Ser Leu Gln Asn Thr Ala Glu Ile 1 5 10 15 Gln His Cys Leu Val Asn Ala Gly Asp Val Gly Cys Gly Val Phe Glu 20 25 30 Cys Phe Glu Asn Asn Xaa Xaa Glu 35 40 <210> 3 <211> 40 <212> PRT <213> Human <400> 3 Val Ala Ala Gln Asn Ser Ala Glu Val Val Arg Cys Leu Asn Ser Ala 1 5 10 15 Leu Gln Val Gly Cys Gly Ala Phe Ala Cys Leu Glu Asn Ser Thr Cys 20 25 30 Asp Thr Asp Gly Met Tyr Asp Ile 35 40 <210> 4 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Synthesized DNA <400> 4 ATTAACCCTC ACTAAAGGG 19 <210> 5 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Synthesized DNA <400> 5 GTAATACGAC TCACTATAGG GC 22 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Synthesized DNA <400> 6 AAGAGGGGAG CACAAAGGAT 20 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Synthesized DNA <400> 7 GTCCCTGCAG AATACAGCGG 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Synthesized DNA <400> 8 CAAGGACTTG CTGCTGCACG 20 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Synthesized DNA <400> 9 TGGACGGCGT GGAGGAAAGA 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Synthesized DNA <400> 10 GCTCAAGATG GAGCACAGGC 20 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Synthesized DNA <400> 11 GTTGTGCAGA AAAGTCATGC 20 <210> 12 <211> 882 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 12 ATGACCCTGG CTTTGGTGTT GGCCACCTTT GACCCGGCGC GGGGGACCGA CGCCACCAAC 60 CCACCCGAGG GTCCCCAAGA CAGGAGCTCC CAGCAGAAAG GCCGCCTGTC CCTGCAGAAT 120 ACAGCGGAGA TCCAGCACTG TTTGGTCAAC GCTGGCGATG TGGGGTGTGG CGTGTTTGAA 180 TGTTTCGAGA ACAACTCTTG TGAGATTCGG GGCTTACATG GGATTTGCAT GACTTTTCTG 240 CACAACGCTG GAAAATTTGA TGCCCAGGGC AAGTCATTCA TCAAAGACGC CTTGAAATGT 300 AAGGCCCACG CTCTGCGGCA CAGGTTCGGC TGCATAAGCC GGAAGTGCCC GGCCATCAGG 360 GAAATGGTGT CCCAGTTGCA GCGGGAATGC TACCTCAAGC ACGACCTGTG CGCGGCTGCC 420 CAGGAGAACA CCCGGGTGAT AGTGGAGATG ATCCATTTCA AGGACTTGCT GCTGCACGAA 480 CCCTACGTGG ACCTCGTGAA CTTGCTGCTG ACCTGTGGGG AGGAGGTGAA GGAGGCCATC 540 ACCCACAGCG TGCAGGTTCA GTGTGAGCAG AACTGGGGAA GCCTGTGCTC CATCTTGAGC 600 TTCTGCACCT CGGCCATCCA GAAGCCTCCC ACGGCGCCCC CCGAGCGCCA GCCCCAGGTG 660 GACAGAACCA AGCTCTCCAG GGCCCACCAC GGGGAAGCAG GACATCACCT CCCAGAGCCC 720 AGCAGTAGGG AGACTGGCCG AGGTGCCAAG GGTGAGCGAG GTAGCAAGAG CCACCCAAAC 780 GCCCATGCCC GAGGCAGAGT CGGGGGCCTT GGGGCTCAGG GACCTTCCGG AAGCAGCGAG 840 TGGGAAGACG AACAGTCTGA GTATTCTGAT ATCCGGAGGT GA 882 <210> 13 <211> 293 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 13 Met Thr Leu Ala Leu Val Leu Ala Thr Phe Asp Pro Ala Arg Gly Thr 5 10 15 Asp Ala Thr Asn Pro Pro Glu Gly Pro Gln Asp Arg Ser Ser Gln Gln 20 25 30 Lys Gly Arg Leu Ser Leu Gln Asn Thr Ala Glu Ile Gln His Cys Leu 35 40 45 Val Asn Ala Gly Asp Val Gly Cys Gly Val Phe Glu Cys Phe Glu Asn 50 55 60 Asn Ser Cys Glu Ile Arg Gly Leu His Gly Ile Cys Met Thr Phe Leu 65 70 75 80 His Asn Ala Gly Lys Phe Asp Ala Gln Gly Lys Ser Phe Ile Lys Asp 85 90 95 Ala Leu Lys Cys Lys Ala His Ala Leu Arg His Arg Phe Gly Cys Ile 100 105 110 Ser Arg Lys Cys Pro Ala Ile Arg Glu Met Val Ser Gln Leu Gln Arg 115 120 125 Glu Cys Tyr Leu Lys His Asp Leu Cys Ala Ala Ala Gln Glu Asn Thr 130 135 140 Arg Val Ile Val Glu Met Ile His Phe Lys Asp Leu Leu Leu His Glu 145 150 155 160 Pro Tyr Val Asp Leu Val Asn Leu Leu Leu Thr Cys Gly Glu Glu Val 165 170 175 Lys Glu Ala Ile Thr His Ser Val Gln Val Gln Cys Glu Gln Asn Trp 180 185 190 Gly Ser Leu Cys Ser Ile Leu Ser Phe Cys Thr Ser Ala Ile Gln Lys 195 200 205 Pro Pro Thr Ala Pro Pro Glu Arg Gln Pro Gln Val Asp Arg Thr Lys 210 215 220 Leu Ser Arg Ala His His Gly Glu Ala Gly His His Leu Pro Glu Pro 225 230 235 240 Ser Ser Arg Glu Thr Gly Arg Gly Ala Lys Gly Glu Arg Gly Ser Lys 245 250 255 Ser His Pro Asn Ala His Ala Arg Gly Arg Val Gly Gly Leu Gly Ala 260 265 270 Gln Gly Pro Ser Gly Ser Ser Glu Trp Glu Asp Glu Gln Ser Glu Tyr 275 280 285 Ser Asp Ile Arg Arg 290 <210> 14 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Synthesized DNA <400> 14 GGGGCTAGCC AACAACTTAG CGGAAACTT 29 <210> 15 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Synthesized DNA <400> 15 CCCCTCGAGT GCACTCTCAT GGGATGTGC 29 <210> 16 <211> 741 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 16 ATGCTCCAAA ACTCAGCAGT GCTTCTGGTG CTGGTGATCA GTGCTTCTGC AACCCATGAG 60 GCGGAGCAGA ATGACTCTGT GAGCCCCAGG AAATCCCGAG TGGCGGCCCA AAACTCAGCT 120 GAAGTGGTTC GTTGCCTCAA CAGTGCTCTA CAGGTCGGCT GCGGGGCTTT TGCATGCCTG 180 GAAAACTCCA CCTGTGACAC AGATGGGATG TATGACATCT GTAAATCCTT CTTGTACAGC 240 GCTGCTAAAT TTGACACTCA GGGAAAAGCA TTCGTCAAAG AGAGCTTAAA ATGCATCGCC 300 AACGGGGTCA CCTCCAAGGT CTTCCTCGCC ATTCGGAGGT GCTCCACTTT CCAAAGGATG 360 ATTGCTGAGG TGCAGGAAGA GTGCTACAGC AAGCTGAATG TGTGCAGCAT CGCCAAGCGG 420 AACCCTGAAG CCATCACTGA GGTCGTCCAG CTGCCCAATC ACTTCTCCAA CAGATACTAT 480 AACAGACTTG TCCGAAGCCT GCTGGAATGT GATGAAGACA CAGTCAGCAC AATCAGAGAC 540 AGCCTGATGG AGAAAATTGG GCCTAACATG GCCAGCCTCT TCCACATCCT GCAGACAGAC 600 CACTGTGCCC AAACACACCC ACGAGCTGAC TTCAACAGGA GACGCACCAA TGAGCCGCAG 660 AAGCTGAAAG TCCTCCTCAG GAACCTCCGA GGTGAGGAGG ACTCTCCCTC CCACATCAAA 720 CGCACATCCC ATGAGAGTGC A 741 <210> 17 <211> 247 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 17 Met Leu Gln Asn Ser Ala Val Leu Leu Val Leu Val Ile Ser Ala Ser 5 10 15 Ala Thr His Glu Ala Glu Gln Asn Asp Ser Val Ser Pro Arg Lys Ser 20 25 30 Arg Val Ala Ala Gln Asn Ser Ala Glu Val Val Arg Cys Leu Asn Ser 35 40 45 Ala Leu Gln Val Gly Cys Gly Ala Phe Ala Cys Leu Glu Asn Ser Thr 50 55 60 Cys Asp Thr Asp Gly Met Tyr Asp Ile Cys Lys Ser Phe Leu Tyr Ser 65 70 75 80 Ala Ala Lys Phe Asp Thr Gln Gly Lys Ala Phe Val Lys Glu Ser Leu 85 90 95 Lys Cys Ile Ala Asn Gly Val Thr Ser Lys Val Phe Leu Ala Ile Arg 100 105 110 Arg Cys Ser Thr Phe Gln Arg Met Ile Ala Glu Val Gln Glu Glu Cys 115 120 125 Tyr Ser Lys Leu Asn Val Cys Ser Ile Ala Lys Arg Asn Pro Glu Ala 130 135 140 Ile Thr Glu Val Val Gln Leu Pro Asn His Phe Ser Asn Arg Tyr Tyr 145 150 155 160 Asn Arg Leu Val Arg Ser Leu Leu Glu Cys Asp Glu Asp Thr Val Ser 165 170 175 Thr Ile Arg Asp Ser Leu Met Glu Lys Ile Gly Pro Asn Met Ala Ser 180 185 190 Leu Phe His Ile Leu Gln Thr Asp His Cys Ala Gln Thr His Pro Arg 195 200 205 Ala Asp Phe Asn Arg Arg Arg Thr Asn Glu Pro Gln Lys Leu Lys Val 210 215 220 Leu Leu Arg Asn Leu Arg Gly Glu Glu Asp Ser Pro Ser His Ile Lys 225 230 235 240 Arg Thr Ser His Glu Ser Ala 245 <210> 18 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Synthesized DNA <400> 18 GTCCCTGCAG AATACAGCGG 20 <210> 19 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Synthesized DNA <400> 19 GGCTCGAGCT ACTTGTCATC GTCGTCCTTG TAATCCCTCC GGATATCAGA ATAC 54 <210> 20 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Synthesized DNA <400> 20 GCTGGCTAGC CACCATGGAG ACAGACACAC TC 32 <210> 21 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Synthesized DNA <400> 21 CCAGATCTTG ATCAGCGGGT TTAAACTCAA TGATG 35[Sequence List] SEQUENCE LISTING <110> Snow Brand Milk Products Co., Ltd. <120> New protein and its production method <130> YTP98026 <160> 21 <210> 1 <211> 20 < 212> PRT <213> Homo Sapiens <220> <221> (1 ... 2) <222> UNSURE <220> <221> (19) <222> UNSURE <400> 1 Xaa Xaa Gln Gln Lys Gly Arg Leu Val Leu Gln Asn Thr Ala Glu Ile 1 5 10 15 Gln His Xaa Leu 20 <210> 2 <211> 40 <212> PRT <213> Human <400> 2 Xaa Ser Gln Gln Lys Gly Arg Leu Ser Leu Gln Asn Thr Ala Glu Ile 1 5 10 15 Gln His Cys Leu Val Asn Ala Gly Asp Val Gly Cys Gly Val Phe Glu 20 25 30 Cys Phe Glu Asn Asn Xaa Xaa Glu 35 40 <210> 3 <211> 40 <212> PRT <213 > Human <400> 3 Val Ala Ala Gln Asn Ser Ala Glu Val Val Arg Cys Leu Asn Ser Ala 1 5 10 15 Leu Gln Val Gly Cys Gly Ala Phe Ala Cys Leu Glu Asn Ser Thr Cys 20 25 30 Asp Thr Asp Gly Met Tyr Asp Ile 35 40 <210> 4 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthesized DNA <400> 4 ATTAACCCTC ACTAAAGGG 19 <210 > 5 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthesized DNA <400> 5 GTAATACGAC TCACTATAGG GC 22 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213 > Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthesized DNA <400> 6 AAGAGGGGAG CACAAAGGAT 20 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence : Synthesized DNA <400> 7 GTCCCTGCAG AATACAGCGG 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthesized DNA <400> 8 CAAGGACTTG CTGCTGCACG 20 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthesized DNA <400> 9 TGGACGGCGT GGAGGAAAGA 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthesized DNA <400> 10 GCTCAAGATG GAGCACAGGC 20 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Syntnt hesized DNA <400> 11 GTTGTGCAGA AAAGTCATGC 20 <210> 12 <211> 882 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 12 ATGACCCTGG CTTTGGTGTT GGCCACCTTT GACCCGGCGC GGGGGACCGA CGCCACCAAC 60 CCACCCGAGG GTCCCCAAGA CAGGAGTCGA GCCATGTCAGGCGA CAGCAGTCAG GCCCGAGCAGTCGA CAGCAGTCAG 180 TGTTTCGAGA ACAACTCTTG TGAGATTCGG GGCTTACATG GGATTTGCAT GACTTTTCTG 240 CACAACGCTG GAAAATTTGA TGCCCAGGGC AAGTCATTCA TCAAAGACGC CTTGAAATGT 300 AAGGCCCACG CTCTGCGGCA CAGGTTCGGC TGCATAAGCC GGAAGTGCCC GGCCATCAGG 360 GAAATGGTGT CCCAGTTGCA GCGGGAATGC TACCTCAAGC ACGACCTGTG CGCGGCTGCC 420 CAGGAGAACA CCCGGGTGAT AGTGGAGATG ATCCATTTCA AGGACTTGCT GCTGCACGAA 480 CCCTACGTGG ACCTCGTGAA CTTGCTGCTG ACCTGTGGGG AGGAGGTGAA GGAGGCCATC 540 ACCCACAGCG TGCAGGTTCA GTGTGAGCAG AACTGGGGAA GCCTGTGCTC CATCTTGAGC 600 TTCTGCACCT CGGCCATCCA GAAGCCTCCC ACGGCGCCCC CCGAGCGCCA GCCCCAGGTG 660 GACAGAACCA AGCTCTCCAG GGCCCACCAC GGGGAAGCAG GACATCACCT CCCAGAGCCC 720 AGCAGTAGGG AGACTGGCCG AGGTGCCAAG GGTGAGCGAG GTAGCAAGAG CCA CCCAAAC 780 GCCCATGCCC GAGGCAGAGT CGGGGGCCTT GGGGCTCAGG GACCTTCCGG AAGCAGCGAG 840 TGGGAAGACG AACAGTCTGA GTATTCTGAT ATCCGGAGGT GA 882 <210> 13 <211> 293 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 13 Met Ala Threu Gly Thr 5 10 15 Asp Ala Thr Asn Pro Pro Glu Gly Pro Gln Asp Arg Ser Ser Gln Gln 20 25 30 Lys Gly Arg Leu Ser Leu Gln Asn Thr Ala Glu Ile Gln His Cys Leu 35 40 45 Val Asn Ala Gly Asp Val Gly Cys Gly Val Phe Glu Cys Phe Glu Asn 50 55 60 Asn Ser Cys Glu Ile Arg Gly Leu His Gly Ile Cys Met Thr Phe Leu 65 70 75 80 His Asn Ala Gly Lys Phe Asp Ala Gln Gly Lys Ser Phe Ile Lys Asp 85 90 95 Ala Leu Lys Cys Lys Ala His Ala Leu Arg His Arg Phe Gly Cys Ile 100 105 110 Ser Arg Lys Cys Pro Ala Ile Arg Glu Met Val Ser Gln Leu Gln Arg 115 120 125 Glu Cys Tyr Leu Lys His Asp Leu Cys Ala Ala Ala Gln Glu Asn Thr 130 135 140 Arg Val Ile Val Glu Met Ile His Phe Lys Asp Leu Leu Leu His Glu 145 150 155 160 Pro Tyr Val Asp Leu Val Asn Leu Leu Leu Thr Cys Gly Glu Glu Va l 165 170 175 Lys Glu Ala Ile Thr His Ser Val Gln Val Gln Cys Glu Gln Asn Trp 180 185 190 Gly Ser Leu Cys Ser Ile Leu Ser Phe Cys Thr Ser Ala Ile Gln Lys 195 200 205 Pro Pro Thr Ala Pro Pro Glu Arg Gln Pro Gln Val Asp Arg Thr Lys 210 215 220 Leu Ser Arg Ala His His Gly Glu Ala Gly His His Leu Pro Glu Pro 225 230 235 240 Ser Ser Arg Glu Thr Gly Arg Gly Ala Lys Gly Glu Arg Gly Ser Lys 245 250 255 Ser His Pro Asn Ala His Ala Arg Gly Arg Val Gly Gly Leu Gly Ala 260 265 270 Gln Gly Pro Ser Gly Ser Ser Glu Trp Glu Asp Glu Gln Ser Glu Tyr 275 280 285 Ser Asp Ile Arg Arg 290 <210> 14 <211 > 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthesized DNA <400> 14 GGGGCTAGCC AACAACTTAG CGGAAACTT 29 <210> 15 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence < 220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthesized DNA <400> 15 CCCCTCGAGT GCACTCTCAT GGGATGTGC 29 <210> 16 <211> 741 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 16 ATGCTCCAAA ACTCAGCAGT GCTTCTGGTG CTGGTGATCA GTG CTTCTGC AACCCATGAG 60 GCGGAGCAGA ATGACTCTGT GAGCCCCAGG AAATCCCGAG TGGCGGCCCA AAACTCAGCT 120 GAAGTGGTTC GTTGCCTCAA CAGTGCTCTA CAGGTCGGCT GCGGGGCTTT TGCATGCCTG 180 GAAAACTCCA CCTGTGACAC AGATGGGATG TATGACATCT GTAAATCCTT CTTGTACAGC 240 GCTGCTAAAT TTGACACTCA GGGAAAAGCA TTCGTCAAAG AGAGCTTAAA ATGCATCGCC 300 AACGGGGTCA CCTCCAAGGT CTTCCTCGCC ATTCGGAGGT GCTCCACTTT CCAAAGGATG 360 ATTGCTGAGG TGCAGGAAGA GTGCTACAGC AAGCTGAATG TGTGCAGCAT CGCCAAGCGG 420 AACCCTGAAG CCATCACTGA GGTCGTCCAG CTGCCCAATC ACTTCTCCAA CAGATACTAT 480 AACAGACTTG TCCGAAGCCT GCTGGAATGT GATGAAGACA CAGTCAGCAC AATCAGAGAC 540 AGCCTGATGG AGAAAATTGG GCCTAACATG GCCAGCCTCT TCCACATCCT GCAGACAGAC 600 CACTGTGCCC AAACACACCC ACGAGCTGAC TTCAACAGGA GACGCACCAA TGAGCCGCAG 660 AAGCTGAAAG TCCTCCTCAG GAACCTCCGA GGTGAGGAGG ACTCTCCCTC CCACATCAAA 720 CGCACATCCC ATGAGAGTGC A 741 <210> 17 <211> 247 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 17 Met Leu Gln Asn Ser Ala Val Leu Leu Val Leu Val Ile Ser Ala Ser 5 10 15 Ala Thr His Glu Ala Glu Gln Asn Asp Ser Val Ser Pro Arg Lys Ser 20 25 30 Arg Val Ala Ala Gln Asn Ser Ala Glu Val Val Arg Cys Leu Asn Ser 35 40 45 Ala Leu Gln Val Gly Cys Gly Ala Phe Ala Cys Leu Glu Asn Ser Thr 50 55 60 Cys Asp Thr Asp Gly Met Tyr Asp Ile Cys Lys Ser Phe Leu Tyr Ser 65 70 75 80 Ala Ala Lys Phe Asp Thr Gln Gly Lys Ala Phe Val Lys Glu Ser Leu 85 90 95 Lys Cys Ile Ala Asn Gly Val Thr Ser Lys Val Phe Leu Ala Ile Arg 100 105 110 Arg Cys Ser Thr Phe Gln Arg Met Ile Ala Glu Val Gln Glu Glu Cys 115 120 125 Tyr Ser Lys Leu Asn Val Cys Ser Ile Ala Lys Arg Asn Pro Glu Ala 130 135 140 Ile Thr Glu Val Val Gln Leu Pro Asn His Phe Ser Asn Arg Tyr Tyr 145 150 155 160 Asn Arg Leu Val Arg Ser Leu Leu Glu Cys Asp Glu Asp Thr Val Ser 165 170 175 Thr Ile Arg Asp Ser Leu Met Glu Lys Ile Gly Pro Asn Met Ala Ser 180 185 190 Leu Phe His Ile Leu Gln Thr Asp His Cys Ala Gln Thr His Pro Arg 195 200 205 Ala Asp Phe Asn Arg Arg Arg Thr Asn Glu Pro Gln Lys Leu Lys Val 210 215 220 Leu Leu Arg Asn Leu Arg Gly Glu Glu Asp Ser Pro Ser His Ile Lys 225 230 235 240 Arg Thr Ser His Glu Ser Ala 245 <210> 18 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthesized DNA <400> 18 GTCCCTGCAG AATACAGCGG 20 <210> 19 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthesized DNA <400> 19 GGCTCGAGCT ACTTGTCATC GTCGTCCTTG TAATCCCTCC GGATATCAGA ATAC 54 <210> 20 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthesized DNA <400> 20 GCTGGCTAGC CACCATGGAG ACAGACACAC TC 32 <210> 21 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthesized DNA <400> 21 CCAGATCTTG ATCAGCGGGT TTAAACTCAA TGATG 35

【図面の簡単な説明】[Brief description of the drawings]

【図1】 Superose12画分粗精製製品(試料
7)をHeparin5PWカラムにかけた時の溶出プ
ロファイルを示す。
FIG. 1 shows an elution profile of a roughly purified Superose 12 fraction product (sample 7) applied to a Heparin 5PW column.

【図2】 Heparin5PW粗精製製品 (試料5)
をポリキャットAカラムにかけた時の溶出プロファイル
を示す。
FIG. 2 Heparin5PW roughly purified product (Sample 5)
1 shows an elution profile when applied to a Polycat A column.

【図3】 ポリキャットA溶出フラクション43を逆相
カラムにかけた時の溶出プロファイルを示す。
FIG. 3 shows an elution profile when Polycat A elution fraction 43 was applied to a reversed-phase column.

【図4】 精製された本発明蛋白質の脂肪細胞形成抑制
活性を示す。
FIG. 4 shows the adipocyte formation inhibitory activity of the purified protein of the present invention.

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 FI テーマコート゛(参考) A61P 43/00 C12N 15/00 ZNAA A61K 38/00 A61K 37/02 (C12P 21/02 C12R 1:91) (72)発明者 島 伸行 栃木県河内郡南河内町緑4−17−28 (72)発明者 保田 尚孝 栃木県河内郡南河内町緑2−3293−46 (72)発明者 中川 信明 栃木県下都賀郡石橋町石橋578−15 西浦 ハイツ2−4 Fターム(参考) 4B024 AA01 BA80 CA04 CA09 CA12 DA03 DA06 DA20 EA03 EA04 GA11 GA18 GA19 HA14 4B064 AG01 AG31 BH09 CA02 CA10 CA19 CC24 CE06 CE07 CE11 CE12 CE14 DA01 DA06 4B065 AA26X AA93X AA93Y AA98X AB01 BA02 CA24 CA44 4C084 AA06 AA07 BA01 BA19 MA17 MA31 MA52 MA57 MA59 MA63 MA66 ZA702 ZB212 4H045 AA10 AA30 BA05 BA10 BA19 CA40 DA86 EA28 FA72 FA74 GA10 GA22 GA23 GA25 GA26 GA31 ──────────────────────────────────────────────────続 き Continued on the front page (51) Int.Cl. 7 Identification symbol FI Theme coat ゛ (Reference) A61P 43/00 C12N 15/00 ZNAA A61K 38/00 A61K 37/02 (C12P 21/02 C12R 1:91) (72) Inventor Nobuyuki Shima 4-17-28, Minamikawachi-cho, Kawachi-gun, Tochigi Prefecture (72) Inventor Naotaka 2-32-46, Midori-Kawachi-cho, Kawachi-gun, Tochigi Prefecture (72) Nobuaki Nakagawa Ishibashi, Shimotsuga-gun, Tochigi Prefecture 578-15 Machiishibashi 578-15 Nishiura Heights 2-4 F-term (reference) 4B024 AA01 BA80 CA04 CA09 CA12 DA03 DA06 DA20 EA03 EA04 GA11 GA18 GA19 HA14 4B064 AG01 AG31 BH09 CA02 CA10 CA19 CC24 CE06 CE07 CE11 CE12 CE14 DA01 DA06 4B065 AA26A A93 AB01 BA02 CA24 CA44 4C084 AA06 AA07 BA01 BA19 MA17 MA31 MA52 MA57 MA59 MA63 MA66 ZA702 ZB212 4H045 AA10 AA30 BA05 BA10 BA19 CA40 DA86 EA28 FA72 FA74 GA10 GA22 GA 23 GA25 GA26 GA31

Claims (4)

【特許請求の範囲】[Claims] 【請求項1】 配列表配列番号2及び3に示されるN末
端アミノ酸配列を有し、脂肪細胞の分化及び/又は成熟
を抑制する活性を有するヘテロダイマー型新規蛋白質。
1. A novel heterodimeric protein having the N-terminal amino acid sequence shown in SEQ ID NOs: 2 and 3 in the sequence listing and having an activity of suppressing adipocyte differentiation and / or maturation.
【請求項2】 配列表配列番号13及び17に示される
アミノ酸配列をコードするDNAを発現させて得られ
る、二本鎖の蛋白質から構成され、脂肪細胞の分化及び
/又は成熟を抑制する活性を有する新規蛋白質。
2. A double-stranded protein obtained by expressing a DNA encoding the amino acid sequence shown in SEQ ID NOs: 13 and 17 in the sequence listing and having an activity to suppress adipocyte differentiation and / or maturation. Novel protein having.
【請求項3】 配列表13及び17に示されるアミノ酸
配列をコードするDNAの一部が欠失、置換、挿入又は
付加されたDNAを発現させて得られる、二本鎖の蛋白
質から構成され、脂肪細胞の分化及び/又は成熟を抑制
する活性を有する新規蛋白質。
3. A double-stranded protein obtained by expressing a DNA in which a part of the DNA encoding the amino acid sequence shown in Sequence Listings 13 and 17 has been deleted, substituted, inserted or added, A novel protein having an activity of suppressing adipocyte differentiation and / or maturation.
【請求項4】 脂肪細胞形成抑制因子(Adipogenesis I
nhibitory Factor; ADIF)及びスタンニオカルシン
(Stanniocalcin;STC)をコードするcDNAをクロ
ーニングし、それぞれのcDNAを発現ベクターに挿入
し発現プラスミドを作製し、得られたそれぞれの発現プ
ラスミドを宿主にコ・トランスフェクションし発現させ
ることにより得られることを特徴とする、請求項2又は
3記載の蛋白質の製造方法。
4. Adipogenesis I (adipogenesis I)
cDNAs encoding nhibitory factor (ADIF) and stanniocalcin (STC) are cloned, each cDNA is inserted into an expression vector to prepare an expression plasmid, and each obtained expression plasmid is co-transfected into a host. 4. The method for producing a protein according to claim 2, wherein the protein is obtained by cloning and expression.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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JP2021176856A (en) * 2015-09-17 2021-11-11 アネキシン ファーマシューティカルズ アーベー Process for manufacture of annexin v

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