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JP2000201688A - エストロジェンレセプタ―遺伝子およびその利用 - Google Patents

エストロジェンレセプタ―遺伝子およびその利用

Info

Publication number
JP2000201688A
JP2000201688A JP11098787A JP9878799A JP2000201688A JP 2000201688 A JP2000201688 A JP 2000201688A JP 11098787 A JP11098787 A JP 11098787A JP 9878799 A JP9878799 A JP 9878799A JP 2000201688 A JP2000201688 A JP 2000201688A
Authority
JP
Japan
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leu
ser
gly
arg
pro
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
JP11098787A
Other languages
English (en)
Inventor
Hirobumi Oshita
博文 大下
Meikyoku Jo
明旭 徐
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Sumitomo Chemical Co Ltd
Original Assignee
Sumitomo Chemical Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Sumitomo Chemical Co Ltd filed Critical Sumitomo Chemical Co Ltd
Priority to JP11098787A priority Critical patent/JP2000201688A/ja
Publication of JP2000201688A publication Critical patent/JP2000201688A/ja
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  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

(57)【要約】 【課題】化学物質のエストロジェン様作用を測定するた
めの方法として、化学物質のエストロジェンレセプター
活性化能を評価するための試験系を提供可能とするこ
と。 【解決手段】配列番号1で示されるアミノ酸配列を有す
る蛋白質をコードするエストロジェンレセプター遺伝子
等。

Description

【発明の詳細な説明】
【0001】
【発明の属する技術分野】本発明は、エストロジェンレ
セプター遺伝子およびその利用に関する。
【0002】
【従来の技術および発明が解決しようとする課題】近
年、環境中の幾つかの化学物質がエストロジェン様作用
を示すことが報告されている。かかる化学物質の作用は
ヒトのホルモンバランスを崩し、疾患の原因となること
が危惧されることから、化学物質の安全性評価の一環と
して化学物質のエストロジェン様作用を測定する試みが
なされている。エストロジェンの作用機序として、エス
トロジェンがエストロジェンの標的細胞に存在するエス
トロジェンレセプターに結合すると、該レセプターは活
性化され、染色体上のエストロジェン応答配列に結合し
て該配列の下流に在する遺伝子の発現を促進する。そこ
で、化学物質のエストロジェン様作用を測定するための
方法として、化学物質のエストロジェンレセプター活性
化能を評価するための試験系の開発が切望されている。
【0003】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、かかる状
況の下、鋭意検討した結果、水生動物のモデル動物であ
るメダカのエストロジェンレセプターをコードする遺伝
子を見出し、本発明に至った。即ち、本発明は、配列番
号1で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質をコードす
るエストロジェンレセプター遺伝子(以下、本発明遺伝
子と記す。)、配列番号3で示されるアミノ酸配列から
なる蛋白質をコードする該遺伝子、配列番号2で示され
る塩基配列を有する該遺伝子、配列番号4で示される塩
基配列からなる該遺伝子、該遺伝子を含有するベクター
(以下、本発明ベクターと記す。)、該遺伝子が宿主細
胞に導入されてなる形質転換体(以下、本発明形質転換
体と記す。)、該形質転換体を培養してエストロジェン
レセプターを産生させ、これを回収することを特徴とす
るエストロジェンレセプターの製造方法、配列番号1で
示されるアミノ酸配列を有するエストロジェンレセプタ
ー、化学物質のエストロジェンレセプター活性化能を評
価するためのレポーターアッセイにおいて、エストロジ
ェン応答配列を含む転写制御領域の下流に連結されたレ
ポーター遺伝子と本発明遺伝子とがエストロジェンレセ
プター非内在性宿主細胞に導入されてなる形質転換体
に、化学物質を作用させることを特徴とする化学物質の
エストロジェンレセプター活性化能の評価方法、を提供
するものである。
【0004】
【発明の実施の形態】以下、本発明について詳細に説明
する。本発明遺伝子は、例えば、ヒメダカ等のメダカか
ら、J.Sambrook,E.F.Frisch,T.Maniatis著;モレキュラ
ー クローニング第2版(Molecular Cloning 2nd editi
on)、コールドスプリング ハーバー ラボラトリー(Co
ld Spring Harbor Laboratory)発行、1989年等に
記載の遺伝子工学的方法に準じて取得することができ
る。具体的には、まず、ヒメダカ等のメダカからRNA
を調製する。例えば、ヒメダカの内臓を塩酸グアニジン
やグアニジンチオシアネート等の強力な蛋白質変性剤を
含む溶液中で粉砕し、さらに該粉砕物にフェノール、ク
ロロホルム等を加えることにより蛋白質を変性させる。
変性蛋白質を遠心分離等により除去した後、回収された
可溶性画分から、塩酸グアニジン/フェノール法、SD
S−フェノール法、グアニジンチオシアネート/CsC
l法等の方法により全RNAを抽出する。なお、これら
の方法に基づいた市販のRNA調製用キットとしては、
例えばISOGEN(ニッポンジーン製)がある。得られた全
RNAを鋳型として使用し、該RNAにオリゴdTプラ
イマーをアニールさせた後に逆転写酵素を作用させるこ
とにより一本鎖cDNAを合成し、次いで、該一本鎖c
DNAに大腸菌RNaseHおよび大腸菌のDNAポリ
メラーゼIを作用させて二本鎖のcDNAを合成する。
更に該cDNAの両末端をT4DNAポリメラーゼによ
り平滑化する。得られたcDNAはフェノール−クロロ
ホルム抽出、エタノール沈殿等の通常の方法により精製
し、回収する。なお、これらの方法に基づいた市販のc
DNA合成用キットとしては、例えばcDNA合成シス
テムプラス(アマシャム社製)がある。このようにして
得られたcDNAを例えば、プラスミドpUC118やファー
ジλgt11などのベクターにリガーゼを用いて挿入するこ
とによりcDNAライブラリーを作製する。次に、この
ようなcDNAライブラリーから、例えば、配列番号2
で示される塩基配列の部分塩基配列を有するDNA断片
をプローブとして用いるハイブリダイゼーション法や、
配列番号2で示される塩基配列の部分塩基配列を有する
オリゴヌクレオチドをプライマーとして用いるPCR法
により、本発明遺伝子を取得することができる。また、
上記のようにして調製された全RNAを鋳型に使用して
逆転写反応を行なった後、得られたDNAを鋳型にして
PCRを行なうことにより(RT−PCR法)本発明遺
伝子を取得することもできる。上記のPCR法またはR
T−PCR法においてPCRにより本発明遺伝子を増幅
する際に用いるプライマーとしては、例えば、20bpから
40bp程度の長さでかつGまたはC塩基の割合が40%から70%
程度の塩基配列を、配列番号2で示される塩基配列の
5’末端領域および3’末端領域からそれぞれ選択し、
該塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを合成するとよ
い。具体的には、例えば、フォワードプライマーの塩基
配列としては5'-ATG TAC CCT GAA GAG AGC CGG G-3'や
5'-AAG CTTCAT GAG TAA GAG ACA GAG C-3'があげられ、
リバースプライマーの塩基配列としては5'-TCA GTC TTG
AAG GGC CGG GGA G-3'があげられる。このようにしてP
CRで増幅された本発明遺伝子は、例えば、J.Sambrook,
E.F.Frisch,T.Maniatis著;モレキュラー クローニング
第2版(Molecular Cloning 2nd edition)、コールド
スプリング ハーバー ラボラトリー(Cold Spring Harb
or Laboratory)発行、1989年等に記載の遺伝子工
学的方法に準じてベクターにクローニングすることがで
きる。具体的には例えば、TAクローニングキット(Invi
trogen社)やpBluescriptII(Stratagene社)などの市
販のプラスミドベクターを用いてクローニングすること
ができる。尚、本発明遺伝子は、配列番号2や配列番号
4で示される塩基配列に基づいて、例えばホスファイト
・トリエステル法(Hunkapiller,M.et al., Nature, 31
0,105, 1984)等の通常の方法に準じて、核酸の化学合
成を行うことにより調製することもできる。得られた本
発明遺伝子の塩基配列は、Maxam Gilbert法 (例えば、M
axam,A.M &W.Gilbert, Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 74, 5
60, 1977 等に記載される)やSanger法(例えばSanger,
F. & A.R.Coulson, J.Mol.Biol., 94, 441, 1975、Sang
er,F, & Nicklen and A.R.Coulson., Proc.Natl.Acad.S
ci.USA, 74, 5463, 1977等に記載される)に準じて解析
することにより確認することができる。
【0005】このようにして取得される本発明遺伝子
を、例えば、宿主細胞内で複製可能なDNAであって、宿
主細胞からの単離、精製が可能であり、検出可能なマー
カー遺伝子をもつベクターに、通常の遺伝子工学的手法
を用いて組込むことにより本発明ベクターを構築するこ
とができる。本発明ベクターの構築に用いることができ
るベクターとしては、具体的には、微生物である大腸菌
を宿主細胞とする場合、例えば、プラスミドpUC119(宝
酒造(株)製)や、ファージミドpBluescriptII(スト
ラタジーン社製)等をあげることができ、酵母を宿主細
胞とする場合は、プラスミドpACT2(Clontech社製)な
どをあげることができる。また、哺乳類動物細胞を宿主
細胞とする場合は、pRC/RSV、pRC/CMV(Invitrogen社
製)等のプラスミド、ウシパピローマウイルスプラスミ
ドpBPV(ファルマシア社製)、EBウイルスプラスミドpC
EP4(Invitrogen社製)等のウイルス由来の自律複製起
点を含むベクター、ワクシニアウイルス等のウイルスな
どをあげることができ、昆虫類動物細胞(以下、昆虫細
胞と記す。)を宿主細胞とする場合は、バキュロウイル
ス等の昆虫ウイルスをあげることができる。バキュロウ
イルスやワクシニアウイルス等のウイルスに本発明遺伝
子を組込むには、使用しようとするウイルスのゲノムと
相同な塩基配列を含有するトランスファーベクターを用
いる。このようなトランスファーベクターの具体的例と
しては、Pharmingen社から市販されているpVL1392,pVL1
393(Smith,G.E.,Summers M.D.et al.:Mol.Cell.Biol.,
3:2156-2165,1983)、pSFB5(Funahashi,S.et al.,J.Vir
ol.,65:5584-5588,1991)などのプラスミドをあげること
ができる。本発明遺伝子を前記のようなトランスファー
ベクターに挿入し、該トランスファーベクターとウイル
スゲノムとを同時に宿主細胞に導入すると、トランスフ
ァーベクターとウイルスゲノムとの間で相同組換えが起
こり、本発明遺伝子がゲノム上に組み込まれたウイルス
を得ることができる。ウイルスゲノムとしては、Baculo
virus、Adenovirus、Vacciniavirusなどのゲノムを用い
ることができる。本発明遺伝子の上流に、宿主細胞で機
能可能なプロモーターを機能可能な形で結合させ、これ
を上述のようなベクターに組み込むことにより、本発明
遺伝子を宿主細胞で発現させることの可能な本発明ベク
ター(以下、本発明発現ベクターと記す。)を構築する
ことができる。ここで、「機能可能な形で結合させる」
とは、本発明遺伝子が導入される宿主細胞においてプロ
モーターの制御下に発現するように、該プロモーターと
本発明遺伝子とを結合させることを意味する。使用する
プロモーターは、形質転換する宿主細胞内でプロモータ
ー活性を示すものであれば特に制限はなく、例えば、宿
主細胞が動物細胞や分裂酵母である場合は、例えば、ラ
ウス肉腫ウイルス(RSV)プロモーター、サイトメガロ
ウイルス(CMV)プロモーター、シミアンウイルス(SV4
0)の初期もしくは後期プロモーター、マウス乳頭腫ウ
イルス(MMTV)プロモーター、単純ヘルペスウイルス
(HSV)のチミジンキナーゼ(tk)遺伝子プロモーター
等をあげることができる。宿主細胞が出芽酵母である場
合はADH1プロモーターなどをあげることができる。ま
た、宿主細胞において機能するプロモーターをあらかじ
め保有するベクターを使用する場合は、ベクター保有の
プロモーターと本発明遺伝子とが機能可能な形で結合す
るように、該プロモーターの下流に本発明遺伝子を挿入
すればよい。例えば、前述のプラスミドpRC/RSV,pRC/CM
V等は、動物細胞で機能可能なプロモーターの下流にク
ローニング部位が設けられており、該クローニング部位
に本発明遺伝子を挿入し動物細胞へ導入すれば、本発明
遺伝子が発現する。これらのプラスミドにはあらかじめ
SV40の自律複製起点(ori)が組み込まれているため、o
ri(-)のSV40ゲノムで形質転換された培養細胞、例えばC
OS細胞等に該プラスミドを導入すると、細胞内でプラス
ミドのコピー数が非常に増大し、結果として該プラスミ
ドに組み込まれた本発明遺伝子を大量発現させることも
できる。また、前述の酵母用プラスミドpACT2はADH1プ
ロモーターを有しており、該プラスミドまたはその誘導
体のADH1プロモーターの下流に本発明遺伝子を挿入すれ
ば、本発明遺伝子を例えばCG1945(Clontech社製)等の
出芽酵母内で大量発現させることが可能な本発明ベクタ
ーが構築できる。
【0006】上述のようにして構築された本発明ベクタ
ーを宿主細胞に導入することにより、本発明形質転換体
を取得することができる。本発明ベクターを宿主細胞へ
導入する方法は、形質転換される宿主細胞に応じて通常
用いられる方法でよい。例えば、大腸菌を宿主細胞とす
る場合は、「モレキュラー・クローニング」(J.Sambrook
ら、コールド・スプリング・ハーバー、1989年)等
に記載される塩化カルシウム法やエレクトロポレーショ
ン法等を用いることができ、酵母菌を宿主細胞とする場
合は、例えばリチウム法に基づくYeast transformation
kit(Clontech社製)などを用いてベクターを導入するこ
とができる。また、哺乳類動物細胞や昆虫細胞等の動物
細胞を宿主細胞とする場合は、例えば、リン酸カルシウ
ム法、DEAEデキストラン法、エレクトロポレーション
法、またはリポフェクション法等により該宿主細胞に本
発明ベクターを導入することができる。尚、ウイルスを
ベクターに用いる場合は、上述のような一般的な遺伝子
導入法によりウイルスゲノムを宿主細胞に導入できるほ
か、ウイルスゲノムを含有するウイルス粒子を宿主細胞
へ感染させることによってもウイルスゲノムを宿主細胞
に導入することができる。
【0007】本発明形質転換体の選抜は、導入された本
発明ベクターが有する検出マーカー遺伝子の性質に応じ
た方法を用いればよい。例えば、検出マーカー遺伝子
が、細胞致死活性を示す薬剤に対する耐性遺伝子である
場合には、該薬剤を添加した培地を用いて、本発明ベク
ターを導入した細胞を培養すればよい。このようにして
用いることのできる薬剤耐性遺伝子と選抜薬剤との組み
合わせとしては、例えば、ネオマイシン耐性遺伝子とネ
オマイシンとの組合せ、ハイグロマイシン耐性遺伝子と
ハイグロマイシンとの組み合せ、ブラストサイジンS耐
性遺伝子とブラストサイジンSとの組合せ等をあげるこ
とができる。また、検出マーカー遺伝子が、宿主細胞の
栄養要求性を相補する遺伝子である場合には、該栄養素
を含まない最少培地を用いて、本発明ベクターを導入し
た細胞を培養すればよい。さらに、本発明発現ベクター
を導入した場合は、エストロジェン結合活性に基づく検
出方法を用いることもできる。本発明遺伝子が宿主細胞
の染色体に導入されてなる本発明形質転換体を取得する
には、例えば、本発明ベクターを制限酵素等で消化する
ことにより直鎖上にした後、これを前述の方法で宿主細
胞へ導入して該細胞を通常数週間培養し、導入された本
発明ベクターにコードされる検出マーカーを指標にして
目的とする形質転換体を選抜すればよい。例えば、上記
のような選択薬剤に対する耐性遺伝子を検出マーカー遺
伝子として持つ本発明ベクターを前述の方法で宿主細胞
に導入し、選択薬剤を添加した培地で数週間以上該細胞
を継代培養して、コロニー状に生き残った選択薬剤耐性
クローンをピペットで吸い上げ純化することにより、本
発明遺伝子が宿主細胞の染色体に導入されてなる本発明
形質転換体を取得することができる。該形質転換体は、
凍結保存が可能であり必要に応じて起眠して使用するこ
とできるので、一過性の遺伝子導入株と比較して、形質
転換体作製の手間を省くことができ、形質転換体の性能
を一定に保つこともできる。
【0008】上述のようにして得られた本発明形質転換
体を培養することにより本発明のエストロジェンレセプ
ターを産生させることができる。例えば、本発明形質転
換体が微生物である場合、該形質転換体は、一般微生物
における通常の培養に使用される炭素源や窒素源、有機
ないし無機塩等を適宜含む各種の培地を用いて培養すれ
ばよい。培養は、一般微生物における通常の方法に準じ
て行い、固体培養、液体培養(試験管振とう式培養、往
復式振とう培養、ジャーファーメンター(Jar Fermente
r)培養、タンク培養等)等が可能である。培養温度
は、微生物が生育する範囲で適宜変更でき、例えば、約
15℃〜約40℃の培養温度、約6〜約8の培地pHで培
養するとよい。培養時間は、種々の培養条件によって異
なるが、通常約1〜約5日間である。また、上記形質転
換体が動物細胞である場合、一般の培養細胞における通
常の培養に使用される培地を用いて培養すればよい。選
択薬剤を利用して当該形質転換体を選抜した場合は、対
応する選択薬剤を共存させて培養するのが望ましい。哺
乳類動物細胞の場合、例えば10v/v%となるようFBSを添
加したDMEM培地等の培地を用いて、37℃、5v/v%CO2
存在下等にて、培地を数日ごとに交換しながら培養す
る。細胞がコンフルエントになるまで増殖したら、0.
25w/v%程度のトリプシンPBS溶液を用いて個々の細胞
に分散させ、数倍に希釈して新しい培養容器に播種し培
養を続ける。目的とする量まで細胞が増殖したら細胞を
集める。昆虫細胞の場合も同様に、10v/v%FBSおよび2w/
v%Yeastlateを含むGrace's medium等の昆虫細胞用培地
を用いて25℃から35℃で継代培養する。ただし、Sf
21細胞などの培養容器からはがれやすい細胞の場合は、
トリプシン液ではなくピペッテイングにより細胞を分散
させ継代を行なう。また、Baculovirus等のウイルスベ
クターを含む形質転換体の場合は、細胞質効果により細
胞が死滅する前、例えば培養開始から72時間目までに
培養を終了することが好ましい。本発明形質転換体によ
り産生されたエストロジェンレセプターの回収は、適
宜、通常の単離、精製の方法を組み合わせて行えば良
く、例えば、培養終了後、形質転換体の細胞を遠心分離
等で集め、該細胞を通常のバッファー、例えば、20mMHE
PES pH7,1mM EDTA,1mM DTT,0.5mM PMSFからなるバッフ
ァー等に懸濁した後、ポリトロン、超音波、ダウンスホ
モジナイザー等を用いて細胞を破砕し、破砕液を数万x
gで数十分から1時間程度超遠心分離し、上清画分を回
収することにより、エストロジェンレセプターを含む画
分を得ることができる。さらに、前記上清画分をイオン
交換,疎水,ゲルろ過、アフィニティ等の各種クロマト
グラフィーに供することにより、より精製されたエスト
ロジェンレセプターを回収することもできる。この際、
後述のエストロジェンレセプターが結合する塩基配列を
含む15bpから200bp程度の長さのオリゴヌクレ
オチドをプローブとしたDNA結合アッセイなどにより、
目的とするエストロジェンレセプターを含む画分を見分
けることができる。このようにして製造された本発明の
エストロジェンレセプターは、例えば、エストロジェン
レセプターに対する化学物質の親和性を測定するための
ラジオレセプターアッセイ等に用いることができる。
【0009】上述のようにして構築された本発明発現ベ
クターは、例えば、化学物質のエストロジェンレセプタ
ー活性化能を評価するためのレポーターアッセイに利用
することができる。具体的には、エストロジェン応答配
列を有しエストロジェンレセプターにより転写が制御さ
れる遺伝子、例えばビテロジェニン遺伝子の転写制御領
域の下流にレポーター遺伝子を結合させたキメラ遺伝
子、または、エストロジェン応答配列の下流に転写開始
に必要な塩基配列とレポーター遺伝子とを結合させたキ
メラ遺伝子(以下、本キメラ遺伝子と記す。)を、細胞
内でのエストロジェンレセプターの転写調節能をモニタ
ーするためのレポーター遺伝子として用いる。エストロ
ジェン応答配列(estrogen response element)とは、
エストロジェンにより転写が制御される遺伝子のプロモ
ーターの上流に存在し、エストロジェンレセプターによ
って認識される塩基配列を意味する。エストロジェンの
結合したエストロジェンレセプターは活性化されてエス
トロジェン応答配列に結合することにより、該配列の下
流にある遺伝子の転写を促進する。エストロジェン応答
配列のコンセンサス配列としては、塩基配列 AGGTCAXXX
TGACCT(Xは、A、G、C、またはTを意味する。)が一般
に知られている。レポーター遺伝子としては、ルシフェ
ラーゼ遺伝子、分泌型アルカリフォスファターゼ遺伝
子、βガラクトシダーゼ遺伝子、クロラムフェニコール
アセチルトランスフェラーゼ遺伝子、成長ホルモン遺伝
子などが利用できる。上述のように作製した本発明発現
ベクターと、本キメラ遺伝子を組み込んだベクターと
を、内在性のエストロジェンレセプターを産生していな
い宿主細胞、例えばHeLa細胞やNIH3T3細胞などに導入し
形質転換体を取得する。この形質転換体をそのまま1日
から数日間培養する間に、例えばエストロジェン様作用
をもつ化学物質を培地中に加えて前記形質転換体に作用
させる。該形質転換体が産生するエストロジェンレセプ
ターが化学物質の結合により活性化された場合は、レポ
ーター遺伝子のmRNAへの転写が促進され、ルシフェラー
ゼ酵素蛋白質が形質転換体の細胞内に蓄積する。この状
態の形質転換体を破砕して細胞粗抽出物を調製し、レポ
ーターの酵素活性等を指標にして細胞当たりのレポータ
ー蛋白質の量を求める。例えば、レポーター遺伝子とし
てルシフェラーゼ遺伝子を用いた場合、前記細胞粗抽出
物にルシフェラーゼの基質であるルシフェリンを加える
と発光し、発光量はルシフェラーゼ量に比例する。従っ
て、この発光量をルミノメーター等の測定装置で測定す
ることにより、ルシフェラーゼ遺伝子の発現量がわか
り、よって、その際に添加されていた化学物質のエスト
ロジェンレセプター活性化能を評価することができる。
また、本発明発現ベクターと、本キメラ遺伝子が組み込
まれたベクターとを同時に宿主細胞に導入して、本発明
遺伝子および本キメラ遺伝子が宿主細胞の染色体に導入
されてなる形質転換体を取得し、上記レポーターアッセ
イに用いてもよい。該形質転換体は凍結保存が可能であ
り必要に応じて起眠して使用することできるので、これ
を一旦取得すると、アッセイの度ごとにこれらの遺伝子
を宿主細胞に導入して新たな形質転換体を取得する必要
が無く、また、形質転換体の性能を一定に保つこともで
きることから、例えばハイスループットスクリーニング
等の自動化された大規模スクリーニングを実施する際に
有用である。
【0010】
【実施例】以下、実施例により本発明を更に詳細に説明
するが、本発明はこれら実施例によって限定されるもの
ではない。
【0011】実施例1(本発明遺伝子の取得) 餌(コイ稚魚用)にβーエストラジオール(和光純薬工
業株式会社製)10mg/lを10mg/g餌となるように添加し、
これにアセトンを加えてよく混和した後、ヘアードライ
ヤーの下でアセトンを除去した。こうして得た処理餌
を、約3ヶ月のヒメダカ雌10個体に3回/日の頻度で1
日間飽食量与えた。βーエストラジオール投与24時間後
に、これらのヒメダカから内臓を摘出し、直ちに組織1
gあたり10mlのトリゾール試薬を加えてホモジナイズし
た後、クロロホルムを加えて遠心分離した。水相を採取
してイソプロパノールを加えRNAを沈澱させた。約0.3g
約500μgのRNAが得られた。このようにして調製したRNA
1μgを鋳型とし、ランダム9merプライマーを用い、予め
30℃で10分間逆転写反応を行い、引き続き42℃で50分間
逆転写反応を行った。続いて下記のプライマー(XU1とX
U14)を用い PCR(30サイクル、94℃ 30sec-1mim、50-6
0℃ 1-1.5min、72℃ 1-3min)を行った。 XU1 : 5'-ATG TAC CCT GAA GAG AGC CGG G-3' (22mer, GC/AT = 13/9) XU14: 5'-TCA GTC TTG AAG GGC CGG GGA G-3' (22mer, GC/AT = 14/8) 次いで、前記RT-PCRで得られたDNA断片をpCR2.1(TA cl
oningベクター)にサブクローニングして大腸菌DH5-α
に導入し、プラスミドを調製した(pCR-ER)。pCR2.1の塩
基配列に基づくプライマーおよび上記のプライマー (XU
1, XU14)を用い、 ABI sequence systemで、前記のpCR-
ERにクローニングされたDNA断片の塩基配列を決定し
た。その結果、配列番号2で示される塩基配列が明らか
となった。また、上記のようにして調製したRNA1μgを
鋳型とし、ランダム9merプライマーを用い、予め30℃で
10分間逆転写反応を行い、引き続き42℃で50分間逆転写
反応を行った。続いて下記のプライマー(XU36とXU14)
を用い PCR(30サイクル、94℃ 30sec-1mim、50-60℃ 1
-1.5min、72℃ 1-3min)を行った。 XU36: 5'-AAG CTT CAT GAG TAA GAG ACA GAG C-3'(25mer GC/AT = 11/14) XU14: 5'-TCA GTC TTG AAG GGC CGG GGA G-3' (22mer, GC/AT = 14/8) 次いで、前記RT-PCRで得られたDNA断片をpCR2.1(TA cl
oningベクター)にサブクローニングして大腸菌DH5-α
に導入し、プラスミドを調製した(pCR-ER2)。pCR2.1の
塩基配列に基づくプライマーおよび上記のプライマー
(XU36, XU14)を用い、 ABI sequence systemで、前記の
pCR-ER2にクローニングされたDNA断片の塩基配列を決定
した。その結果、配列番号4で示される塩基配列が明ら
かとなった。
【0012】実施例2(本発明遺伝子発現用ベクターの
構築) 実施例1で得られたプラスミドpCR-ERからエストロジェ
ンレセプター遺伝子をXba I とHind IIIで切り出し、同
じ制限酵素で消化した発現ベクターpRc/RSVに組みこ
み、エストロジェンレセプターを発現させるための発現
ベクターRSV-ERを構築した。具体的な過程を図1に、発
現ベクターRSV-ERの構造の詳細を図2示す。また、同様
にして、実施例1で得られたプラスミドpCR-ER2からエ
ストロジェンレセプター遺伝子をXba I とHind IIIで切
り出し、同じ制限酵素で消化した発現ベクターpRc/RSV
に組みこみ、エストロジェンレセプターを発現させるた
めの発現ベクターRSV-ER2を構築した。
【0013】実施例3(エストロジェンレセプターに応
答するレポーター遺伝子を有するベクターの構築) 既知のセノプスのA2ビテロジェニン遺伝子(GenBank Ac
cession No. X00205)の5’末端領域のエストロジェン
応答配列(以下、EREと記す。)のコンセンサス配列を
もとに、下記のオリゴヌクレオチド1およびオリゴヌク
レオチド2を合成した。 オリゴヌクレオチド1: 5'ーCCA AAG TCA GGT CAC AGT GAC CTG ATC AAA GGA ACー3' オリゴヌクレオチド2: 5'ーCTT TGA TCA GGT CAC TGT GAC CTG ACT TTG GGT TCー3 両オリゴヌクレオチドの末端をカイネーションによりリ
ン酸化した。カイネーション反応液は、10 nmolのオリ
ゴヌクレオチド1または10 nmolのオリゴヌクレオチ
ド、2、5μlの10 Xカイネーション バッファー、1μl
の10 mMのATP、 2.5μlのポリヌクレオチドキナーゼ
(宝酒造社製)を1.5 ml容チューブに採り、滅菌蒸留水
を加え全量を50μlとして調製した。カイネーション反
応は37℃で1時間行った。反応終了後、リン酸化したオ
リゴヌクレオチド1とオリゴヌクレオチド2をアニーリ
ングさせ、2本鎖のEREを得た。アニーリング反応液
は、リン酸化させたオリゴヌクレオチド1およびオリゴ
ヌクレオチド2のそれぞれ20μlずつを、1.5 ml容チュ
ーブに加え、95℃で5分間保温し、60℃、次いで37℃に
てそれぞれ1時間保温した後、室温で約1時間放置し
た。反応終了後、10μlのアニーリング反応液に10μlの
DNAリガーゼ(ライゲーションキット、宝酒造社製)を
加え、2本鎖のERE断片を連結した。反応液をアガロー
スゲル電気泳動に供してDNA断片の長さを分析し、ER
E断片が4個連結されたと判断されるDNA断片(以下、
4 X ERE断片と記す。)およびERE断片が5個連結された
と判断されるDNA断片(以下、5 X ERE断片と記
す。)をそれぞれ回収した。これらのDNA断片をブラ
ンティングキット(宝酒造社製)を用い、末端を平滑化
した。一方、pBluescript(SK-)を制限酵素EcoR I(宝酒
造社製)で切断し、5’末端をアルカリフォスフェターゼ
(宝酒造社製)で脱リン酸化した。前記のDNA断片(4 X
ERE断片または5 X ERE断片)とpBluescript(SK-)とを
それぞれDNAライゲーションキットを用いて結合した。
得られた反応液で大腸菌DH5αのコンピテントセル
(東洋紡社製)を形質転換してアンピシリン耐性となっ
た株を選抜し、該アンピシリン耐性株からプラスミドDN
Aを調製し、塩基配列を ABI PRISMTM377 DNA Sequence
System(パーキンエルマージャパン社製)で確認した。次
に、 HSV tKプロモーター配列を持つベクターpTKβ(ク
ロンテック)を制限酵素Sal IおよびXho I(それぞれ宝
酒造社とニッポンジーン社製)で切断した後アガロース
ゲル電気泳動で分析し、約1 kbpのtKプロモーター断片
を得た。該断片をブランティングキットを用い、末端を
平滑化した。一方、ルシフェラーゼ遺伝子を持つレポー
タープラスミド pGL-3(ピッカジーン)を制限酵素Sma
I(宝酒造社製)で切断し、5’末端をアルカリフォスフ
ェターゼ(宝酒造社製)で脱リン酸化した。2つのDNA
断片をDNAライゲーションキットを用いて結合した。得
られた反応液で大腸菌DH5αのコンピテントセル(東
洋紡)を形質転換してアンピシリン耐性となった株を選
抜し、該アンピシリン耐性株からプラスミドDNAを調製
し、 tKプロモーター挿入したレポータープラスミド(tK
-pGL-3)を取得した。次に、上記の4 X ERE断片が挿入さ
れたpBluescriptを制限酵素KpnIおよびXbaI(それぞれ
宝酒造社とニッポンジーン社製)で切断し、アガロース
ゲル電気泳動で4 X ERE断片を回収した。一方、tK-pGL-
3をKpn IおよびNhe I(いずれも宝酒造社製)で消化
し、5’末端をアルカリフォスフェターゼ(宝酒造社
製)で脱リン酸化した。このようにして調製された4 X
ERE断片とtK-pGL-3とをDNAライゲーションキットを用い
て結合した。得られた反応液で大腸菌DH5α株のコン
ピテントセル(東洋紡)を形質転換してアンピシリン耐
性となった株を選抜し、該アンピシリン耐性株からプラ
スミドDNAを調製し、4 X ERE 断片およびtKプロモータ
ー断片を保有するレポータープラスミド(ERE-tK-pGL)を
取得した。該プラスミドの構築の過程を図3に、該プラ
スミドの構造を図4に示す。また、同様にして、上記の
5 X ERE断片が挿入されたpBluescriptから5 X ERE 断
片を回収し、該断片と、Kpn IおよびNhe Iで消化された
tK-pGL-3とを結合させ、5 X ERE 断片およびtKプロモ
ーター断片を保有するレポータープラスミド(ERE5-tK-p
GL)を取得した。
【0014】実施例4(プラスミドDNAの大量調製) 実施例2で得られた発現ベクターRSV-ER、レポータープ
ラスミドERE-tK-pGLおよびERE5-tK-pGL、ならびにコン
トロールレポータープラスミドであるpRL-tK(ピッカジ
ーン)のDNAを以下の方法より大量に調製した。上記プラ
スミドを含む大腸菌をアンプシリン(終濃度50μg/ml)を
含有LB培地3mlに植菌し、37℃で一晩振動培養した。そ
の培養液をアンピシリン (50μg/ml)を含むLB培地200ml
に植菌し、一晩振動培養した。一晩培養後の菌体を5,00
0 rpm, 10 分間, 4℃で遠心分離し( CR21、日立工
機)、得られた沈澱を0.1 M のSTEバッファー60 mlに懸
濁し、同条件で再度遠心分離した。沈澱を3 ml のsolut
ion 1に懸濁し、1 ml のリゾチーム(20 mg/ml)を加え、
室温で5分間放置した。引き続き10 mlの Solution 2を
加え、氷上に10分間放置した後、7.5 ml のsolution 3
を加え、氷上に15分間放置した。12,000 rpm, 20分, 4
℃で遠心分離し、上清を50 mlチューブに移し、0.6容量
のイソプロピルアルコールを加え、室温で15分間放置し
た。3,000 rpm, 10分間,室温で遠心分離し( CR5DL、日
立工機)、70% エタノールで洗淨し、乾燥させた。沈澱
を4.2 mlの TE バッファーに溶かし、5 mg/ml Rnase溶
液(ニッポンジーン)を28μl加え、50℃, 30分間インキ
ュベートした。2 mg/mlエチジウムブロマイド溶液400μ
lとCsCl(関東化学)4.6 g を加えた後、日立工機シール
チューブに移し、55,000 rpm, 20℃, 16時間遠心分離(S
CP85H2,日立工機)した。スーパーコイルドプラスミドDN
Aのバンドを注射筒で抜き取り、55,000 rpm, 20℃, 16
時間再度遠心分離した。再びスーパーコイルプラスミド
DNAのバンドを注射筒で抜き取り、水飽和イソアミルア
ルコールでエチジウムブロマイドを完全に除き、一晩5
mM STEバッファーに透析した後、試料として用いた。
【0015】実施例5(細胞の培養) 不活化済み牛胎仔血清(GIBCO-BRL、米国)を活性炭―
デキストランで処理し、細胞培養の培地作製に用いた。
処理過程でおける各ステップは以下の通りであった。25
Mスクロース(和光純薬)、1.5mM MgCl2(和光純薬)、
10mM HEPES(pH7.4)(同仁化学、熊本)1L中にノーリッ
トEXW(ナカライテスク)2.5gとデキストランT-70(フ
ァルマシアバイオテク、スウェーデン)0.25gを懸濁
し、4℃で終夜攪拌した。本懸濁液を12,000rpmで10分遠
心( CR21、日立工機)して活性炭を沈殿させた。これ
を不活化済み牛胎仔血清(GIBCO-BRL、米国)1Lに懸濁
し、4℃で終夜攪拌した。その後、12,000rpmで10分遠心
( CR21、日立工機)して活性炭を沈殿させ、取り除い
た。以上の操作を2回繰り返した後、ザルトラブV500
(0.20μm、ザルトリウス、独国)を用いてフィルター
ろ過したろ液を活性炭―デキストラン処理済みの牛胎仔
血清とした。ヒト子宮癌細胞株HeLa(大日本製薬製)
を、10% 活性炭―デキストラン処理済みの牛胎仔血清、
0.03% L−グルタミン(日水製薬)および0.15% 炭酸水
素ナトリウムを添加したイーグルMEM(日水製薬)培地
を用いて10 cmの組織培養用ディッシュ(ファルコン)
に培養した。細胞の継代・播種は培地を除去後、適量の
PBS(-)(日水製薬)で接着した細胞を洗浄し、 PBS(-)8
0mlに5%トリプシン(DIFCO,米国) 10ml、0.2% EDTA・3
Na(同仁化学) 10mlを添加した液を用いて細胞を剥離し
た。細胞の培養はすべて5% CO2および飽和湿度下、37℃
でCO2インキュベータ(アステック)内で培養した。
【0016】実施例6(レポーターアッセイ) 以下の操作を各条件ごとに4連で実験を行った。実施例
5で培養した細胞の培地を除去し、PBS(-)で1回洗浄し
た。5%トリプシン(DIFCO,米国)5 mlを加え、細胞を剥
離した。細胞の計数した後24ウェルマルチウェルプレー
ト(ファルコン)に播種した。細胞を1ウェルあたり4
0,000個のHeLa細胞を播種した。1ウェルあたり0.5mlの
10% 活性炭―デキストラン処理済みの牛胎仔血清含有培
地を添加し翌日まで培養した。トランスフェクションは
1ウェルあたり0.25〜1.0μgのレセプター発現ベクター
RSV-ER、0.1〜0.5μgのレポータープラスミドERE-tK-pG
LまたはERE5-tK-pGL、および、0.05〜0.1μgのコントロ
ールレポータープラスミドpRL-tKを、0.35μl/ウェルの
リポフェクチン(GIBCO-BRL)またはリポフェクタミン(GI
BCO-BRL)を用いて、無血清培地中にて細胞に導入した。
1ウェルあたりの培地量は200μlとした。導入方法は添
付説明書に従った。各細胞をトランスフェクション培地
中で5時間培養後に 10% 活性炭―デキストラン処理済
みの牛胎仔血清含有培地に交換し、翌日まで培養を続け
た。次いで、βーエストラジオール(和光純薬社製)を
DMSO(関東化学)に溶解しイーグルMEM培地に溶かし
て、上述の細胞に添加した。βーエストラジオール終濃
度は10 pMから100 nMの範囲とした。βーエストラジオ
ール添加後の1ウェルあたりの培地量は1 mlとした。β
ーエストラジオールを添加してから約28時間培養後、培
地を除去し、βーエストラジオールに曝露した細胞をPB
S(-)で2回洗浄した。ピッカジーンデュアルキット(東
洋インキ)中の細胞溶解剤を超純水で5倍希釈したもの
を1ウェルあたり50μl添加し、室温で30分間放置して
細胞を溶解した。方法はキットの添付説明書に従った。
細胞溶解液10μlを白色96ウェルマルチウェルプレ
ート(燐光測定用、ベルトールド、ドイツ)に移し、キ
ット中の発光基質2種(ルシフェリン、セランテラジ
ン)を順次添加し、それぞれの発光量をルミノメーター
(ベルトールド、LB96P)で測定した。はじめに添加す
る発光基質はレポータープラスミドERE-tK-pGL由来のホ
タルルシフェラーゼによる発光を測定するために用い、
後で添加する発光基質はコントロールレポータープラス
ミドpRL-tK由来のシーパンジールシフェラーゼによる発
光を測定するために用いた。前者の発光量は化学物質が
遺伝子の転写活性にあたえる影響を反映している。ま
た、後者の発光量は内部標準として個々の実験データを
補正するために用いる。
【0017】実施例7(トランスフェクション条件の検
討) 実施例6記載のレポーターアッセイにおいて、トランス
フェクションの際の各ウェルへのプラスミドの添加量
と、リポフェクチンまたはリポフェクタミンの添加量に
ついて検討した。まず、各ウェルに、プラスミド(tK-p
GL-3)を0.2μgから1.2μg、リポフェクチンまたはリポ
フェクタミンを0.2μlから0.8μlの範囲で添加してトラ
ンスフェクションを行い、得られた細胞を培養して、実
施例6記載の方法に準じてルシフェラーゼ活性を測定し
た。結果を図5に示した。リポフェクチンを用いた場合
には、リポフェクチン0.4μlとプラスミド0.4μgを加え
たときに、リポフェクタミンを用いた場合は、リポフェ
クタミンを0.6μlとプラスミド0.4μg加えたときに、そ
れぞれ最も高いルシフェラーゼ活性が認められた。次
に、リポフェクチンまたはリポフェクタミン添加量につ
いて更に詳細に検討した。すなわち、各ウェルに加える
プラスミド量(0.4μg)を固定し、リポフェクチンはウ
ェル当り0.3〜0.55μlの範囲で、とリポフェクタミンは
ウェル当り0.4〜0.9μlの範囲で添加し、ルシフェラー
ゼ活性を測定した。その結果を図6に示した。リポフェ
クチンを0.35μl加えた場合、または、リポフェクタミ
ンを0.6μl加えた場合にそれぞれ最も高いルシフェラー
ゼ活性を認めた。この結果を基に、リポフェクチンとリ
ポフェクタミンの添加量をそれぞれ0.35μlと0.6μl に
固定して、再度プラスミドの添加量を詳細に検討した。
その結果を図7に示した。プラスミドを0.4〜0.6μg を
加えた場合に最も高いルシフェラーゼ活性が認められ
た。以上の結果を基に、レポーターアッセイにおける各
ウェルに添加する最適なプラスミドの量を0.4μg 〜 0.
6μg、リポフェクチンの量を 0.35μl、リポフェクタミ
ンの量を0.6μlと決定した。
【0018】実施例8 (β―エストラジオールによる
反応性の確認) 実施例6記載の方法および実施例7で得られた最適条件
下に、HeLa細胞におけるβ−エストラジオール(E2
のエストロジェンレセプター活性化能を測定した。ウェ
ル内のβ―エストラジオールの終濃度が10pM から50μM
となる条件でルシフェラーゼ活性を測定した。結果を図
8と9に示した。100pM以上でルシフェラーゼ活性の上
昇を認め、1nMでの活性は最大に達した。β-エストラジ
オール50μMでは活性の低下が認められたがこれは細胞
毒性によるものであると思われた。
【0019】実施例9(化学物質のエストロシ゛ェン様作用の測
定) 実施例6の方法および実施例7の結果で得られた最適条
件下に、HeLa細胞におけるビスフェノールA、p−ノニ
ルフェノール、酢酸トリブチルすず、またはフタル酸ジ
ー2ーエチルヘキシルのエストロジェンレセプター活性
化能を測定した。アッセイにおける各被験化学物質の終
濃度は10 pMから50μMの範囲として実験を行った。各被
験化学物質の溶解性を光学顕微鏡下、沈殿物あるいは浮
遊物がないことを目視で確認した。また、被験化合物に
替えてβ―エストラジオールを終濃度500pMとなるよう
に添加した群を設定し、陽性対照とした。ビスフェノー
ルAまたはノニルフェノールでは100nMで活性が上昇し
始め、10μMでは活性化倍率は溶媒コントロール( DMSO
のみ添加)の約5倍に上昇した(図10、11)。酢酸
トリブチルすずまたはフタル酸ジー2ーエチルヘキシル
では活性の上昇は認められなかった(図12、13)。
さらに上記4種について50μMでの実験も行った。その
結果を図14に示した。ビスフェノールAで更なる活性
の上昇を認めた。ノニルフェノールにおいては細胞に対
する毒性に起因すると思われる活性の低下が認められ
た。
【0020】参考例1(他の細胞用いたアッセイ) 他の種類の培養細胞を選び、実施例5〜9と同様の実験
を行う。
【0021】
【発明の効果】メダカエストロジェンレセプターをコー
ドする遺伝子、および、化学物質の該レセプター活性化
能を評価するための試験系等が提供可能となる。
【0022】
【配列表】 <110> Sumitomo Chemical Company Limited <120> Estrogen receptor genes <130> P150237 <150> JP 10/319465 <151> 1998-11-10 <160> 4 <210> 1 <211> 575 <212> PRT <213> Oryzias lapites <400> 1 Met Tyr Pro Glu Glu Ser Arg Gly Ser Gly Gly Val Ala Ala Val Asp 1 5 10 15 Leu Leu Glu Gly Thr Tyr Asp Tyr Ala Ala Pro Asn Pro Ala Thr Thr 20 25 30 Pro Leu Tyr Ser Gln Ser Ser Thr Gly Tyr Tyr Ser Ala Pro Leu Glu 35 40 45 Thr Asn Gly Pro Pro Ser Glu Gly Ser Leu Gln Ser Leu Gly Ser Gly 50 55 60 Pro Thr Ser Pro Leu Val Phe Val Pro Ser Ser Pro Arg Leu Ser Pro 65 70 75 80 Phe Met His Pro Pro Ser His His Tyr Leu Glu Thr Thr Ser Thr Pro 85 90 95 Val Tyr Arg Ser Ser His Gln Gly Ala Ser Arg Glu Asp Gln Cys Gly 100 105 110 Ser Arg Glu Asp Thr Cys Ser Leu Gly Glu Leu Gly Ala Gly Ala Gly 115 120 125 Ala Gly Gly Phe Glu Met Ala Lys Asp Thr Arg Phe Cys Ala Val Cys 130 135 140 Ser Asp Tyr Ala Ser Gly Tyr His Tyr Gly Val Trp Ser Cys Glu Gly 145 150 155 160 Cys Lys Ala Phe Phe Lys Arg Ser Ile Gln Gly His Asn Asp Tyr Met 165 170 175 Cys Pro Ala Thr Asn Gln Cys Thr Ile Asp Arg Asn Arg Arg Lys Gly 180 185 190 Cys Gln Ala Cys Arg Leu Arg Lys Cys Tyr Glu Val Gly Met Met Lys 195 200 205 Gly Gly Val Arg Lys Asp Arg Ile Arg Ile Leu Arg Arg Asp Lys Arg 210 215 220 Arg Thr Gly Val Gly Asp Gly Asp Lys Val Val Lys Gly Gln Glu His 225 230 235 240 Lys Thr Val His Tyr Asp Gly Arg Lys Arg Ser Ser Thr Gly Gly Gly 245 250 255 Gly Gly Gly Gly Gly Gly Arg Leu Ser Val Thr Ser Ile Pro Pro Glu 260 265 270 Gln Val Leu Leu Leu Leu Gln Gly Ala Glu Pro Pro Ile Leu Cys Ser 275 280 285 Arg Gln Lys Leu Ser Arg Pro Tyr Thr Glu Val Thr Met Met Thr Leu 290 295 300 Leu Thr Ser Met Ala Asp Lys Glu Leu Val His Met Ile Ala Trp Ala 305 310 315 320 Lys Lys Leu Pro Gly Phe Leu Gln Leu Ser Leu His Asp Gln Val Leu 325 330 335 Leu Leu Glu Ser Ser Trp Leu Glu Val Leu Met Ile Gly Leu Ile Trp 340 345 350 Arg Ser Ile His Cys Pro Gly Lys Leu Ile Phe Ala Gln Asp Leu Ile 355 360 365 Leu Asp Arg Asn Glu Gly Asp Cys Val Glu Gly Met Thr Glu Ile Phe 370 375 380 Asp Met Leu Leu Ala Thr Ala Ser Arg Phe Arg Val Leu Lys Leu Lys 385 390 395 400 Pro Glu Glu Phe Val Cys Leu Lys Ala Ile Ile Leu Leu Asn Ser Gly 405 410 415 Ala Phe Ser Phe Cys Thr Gly Thr Met Glu Pro Leu His Asn Ser Ala 420 425 430 Ala Val Gln Ser Met Leu Asp Thr Ile Thr Asp Ala Leu Ile His Tyr 435 440 445 Ile Ser Gln Ser Gly Tyr Leu Ala Gln Glu Gln Ala Arg Arg Gln Ala 450 455 460 Gln Pro Leu Leu Leu Leu Ser His Ile Arg His Met Ser Asn Lys Gly 465 470 475 480 Met Glu His Leu Tyr Ser Met Lys Cys Lys Asn Lys Val Pro Leu Tyr 485 490 495 Asp Leu Leu Leu Glu Met Leu Asp Ala His Arg Leu His His Pro Val 500 505 510 Arg Ala Pro Gln Ser Leu Ser Gln Val Asp Arg Asp Pro Pro Ser Thr 515 520 525 Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ile Ala Pro Gly Ser Ile Ser Ala Ser Arg 530 535 540 Gly Arg Ile Glu Ser Pro Ser Arg Gly Pro Phe Ala Pro Ser Val Leu 545 550 555 560 Gln Tyr Gly Gly Ser Arg Pro Asp Cys Thr Pro Ala Leu Gln Asp 565 570 575 <210> 2 <211> 1728 <212> DNA <213> Oryzias lapites <220> <221> CDS <222> (1)...(1728) <400> 2 atg tac cct gaa gag agc cgg ggt tct gga ggg gtg gct gct gtg gac 48 Met Tyr Pro Glu Glu Ser Arg Gly Ser Gly Gly Val Ala Ala Val Asp 1 5 10 15 ctt ttg gaa ggg acg tac gac tat gcc gcc ccc aac cct gcc acg act 96 Leu Leu Glu Gly Thr Tyr Asp Tyr Ala Ala Pro Asn Pro Ala Thr Thr 20 25 30 ccc ctt tac agc cag tcc agc acc ggc tac tac tct gct ccc ctg gaa 144 Pro Leu Tyr Ser Gln Ser Ser Thr Gly Tyr Tyr Ser Ala Pro Leu Glu 35 40 45 aca aac gga ccc ccc tca gaa ggc agt ctg cag tcc ctg ggc agt ggg 192 Thr Asn Gly Pro Pro Ser Glu Gly Ser Leu Gln Ser Leu Gly Ser Gly 50 55 60 ccg acg agc cct ctg gtg ttt gtg ccc tcc agc ccc aga ctc agt ccc 240 Pro Thr Ser Pro Leu Val Phe Val Pro Ser Ser Pro Arg Leu Ser Pro 65 70 75 80 ttt atg cat cca ccc agc cac cac tat ctg gaa acc act tcc acg ccc 288 Phe Met His Pro Pro Ser His His Tyr Leu Glu Thr Thr Ser Thr Pro 85 90 95 gtt tac aga tcc agc cac cag gga gcc tcc agg gag gac cag tgc ggc 336 Val Tyr Arg Ser Ser His Gln Gly Ala Ser Arg Glu Asp Gln Cys Gly 100 105 110 tcc cgg gag gac acg tgc agc ctg ggg gag tta ggc gcc gga gcc ggg 384 Ser Arg Glu Asp Thr Cys Ser Leu Gly Glu Leu Gly Ala Gly Ala Gly 115 120 125 gct ggg ggg ttt gag atg gcc aaa gac acg cgt ttc tgc gcc gtg tgc 432 Ala Gly Gly Phe Glu Met Ala Lys Asp Thr Arg Phe Cys Ala Val Cys 130 135 140 agc gac tac gcc tct ggg tac cac tat ggg gtg tgg tct tgt gag ggc 480 Ser Asp Tyr Ala Ser Gly Tyr His Tyr Gly Val Trp Ser Cys Glu Gly 145 150 155 160 tgc aag gcc ttc ttc aag agg agc atc cag ggt cac aat gac tat atg 528 Cys Lys Ala Phe Phe Lys Arg Ser Ile Gln Gly His Asn Asp Tyr Met 165 170 175 tgc cca gcg acc aat cag tgc act att gac aga aat cga agg aag ggc 576 Cys Pro Ala Thr Asn Gln Cys Thr Ile Asp Arg Asn Arg Arg Lys Gly 180 185 190 tgt cag gct tgt cgt ctt agg aag tgt tac gaa gtg gga atg atg aaa 624 Cys Gln Ala Cys Arg Leu Arg Lys Cys Tyr Glu Val Gly Met Met Lys 195 200 205 ggc ggt gtg cgc aag gac cgc att cgc att tta cgg cgt gac aaa cgg 672 Gly Gly Val Arg Lys Asp Arg Ile Arg Ile Leu Arg Arg Asp Lys Arg 210 215 220 cgg aca ggc gtt ggt gat gga gac aag gtt gta aag ggt cag gag cat 720 Arg Thr Gly Val Gly Asp Gly Asp Lys Val Val Lys Gly Gln Glu His 225 230 235 240 aaa acg gtg cat tat gat gga agg aaa cgc agc agc aca gga gga gga 768 Lys Thr Val His Tyr Asp Gly Arg Lys Arg Ser Ser Thr Gly Gly Gly 245 250 255 gga gga gga gga gga gga aga ctg tct gtg acc agc ata cct cct gag 816 Gly Gly Gly Gly Gly Gly Arg Leu Ser Val Thr Ser Ile Pro Pro Glu 260 265 270 cag gtg ctg ctc ctc ctt cag ggc gcc gag ccc ccg ata ctc tgc tcg 864 Gln Val Leu Leu Leu Leu Gln Gly Ala Glu Pro Pro Ile Leu Cys Ser 275 280 285 cgt cag aag ttg agc cga ccg tac acc gag gtc acc atg atg acc ctg 912 Arg Gln Lys Leu Ser Arg Pro Tyr Thr Glu Val Thr Met Met Thr Leu 290 295 300 ctc acc agc atg gca gac aag gag ctg gtc cac atg atc gcc tgg gcc 960 Leu Thr Ser Met Ala Asp Lys Glu Leu Val His Met Ile Ala Trp Ala 305 310 315 320 aag aag ctc cca ggt ttt ctg cag ctg tcc ctg cac gat cag gtg ctg 1008 Lys Lys Leu Pro Gly Phe Leu Gln Leu Ser Leu His Asp Gln Val Leu 325 330 335 ctg ctg gag agc tcg tgg ctg gag gtg ctc atg atc ggc ctc att tgg 1056 Leu Leu Glu Ser Ser Trp Leu Glu Val Leu Met Ile Gly Leu Ile Trp 340 345 350 agg tcc atc cac tgt ccc ggg aag ctc atc ttt gca caa gac ctc atc 1104 Arg Ser Ile His Cys Pro Gly Lys Leu Ile Phe Ala Gln Asp Leu Ile 355 360 365 ctg gac agg aat gag gga gac tgc gtg gaa ggc atg acg gag atc ttc 1152 Leu Asp Arg Asn Glu Gly Asp Cys Val Glu Gly Met Thr Glu Ile Phe 370 375 380 gac atg ctg ctg gcc act gct tcc cgc ttc cgt gtg ctc aaa ctc aaa 1200 Asp Met Leu Leu Ala Thr Ala Ser Arg Phe Arg Val Leu Lys Leu Lys 385 390 395 400 cct gag gaa ttc gtc tgc ctc aaa gct att att tta ctc aac tcc ggt 1248 Pro Glu Glu Phe Val Cys Leu Lys Ala Ile Ile Leu Leu Asn Ser Gly 405 410 415 gct ttt tct ttc tgc acc ggc acc atg gag cca ctt cac aac agc gcg 1296 Ala Phe Ser Phe Cys Thr Gly Thr Met Glu Pro Leu His Asn Ser Ala 420 425 430 gcg gtt cag agc atg ctg gac acc atc aca gac gca ctc att cat tac 1344 Ala Val Gln Ser Met Leu Asp Thr Ile Thr Asp Ala Leu Ile His Tyr 435 440 445 atc agt cag tcg ggt tac ttg gcc cag gag cag gcg aga cgg cag gcc 1392 Ile Ser Gln Ser Gly Tyr Leu Ala Gln Glu Gln Ala Arg Arg Gln Ala 450 455 460 cag ccg ctc ctg ctg ctc tcc cac atc agg cac atg agc aac aaa ggc 1440 Gln Pro Leu Leu Leu Leu Ser His Ile Arg His Met Ser Asn Lys Gly 465 470 475 480 atg gag cac ctc tac agc atg aag tgc aag aac aaa gtc cct ctt tat 1488 Met Glu His Leu Tyr Ser Met Lys Cys Lys Asn Lys Val Pro Leu Tyr 485 490 495 gac ctc cta ctg gag atg ctc gat gcc cac cgc ctg cac cac ccc gtc 1536 Asp Leu Leu Leu Glu Met Leu Asp Ala His Arg Leu His His Pro Val 500 505 510 aga gcc ccc cag tcc ttg tcc caa gtc gac aga gac cct ccc tcc acc 1584 Arg Ala Pro Gln Ser Leu Ser Gln Val Asp Arg Asp Pro Pro Ser Thr 515 520 525 agc agc ggc ggg ggt gga atc gct ccc ggt tct ata tca gca tct cga 1632 Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ile Ala Pro Gly Ser Ile Ser Ala Ser Arg 530 535 540 ggc aga atc gag agt ccg agc aga ggc ccc ttt gct ccc agt gtc ctt 1680 Gly Arg Ile Glu Ser Pro Ser Arg Gly Pro Phe Ala Pro Ser Val Leu 545 550 555 560 cag tat gga ggg tcg cgt cct gac tgc acc ccg gcc ctt caa gac tga 1728 Gln Tyr Gly Gly Ser Arg Pro Asp Cys Thr Pro Ala Leu Gln Asp 565 570 575 <210> 3 <211> 620 <212> PRT <213> Oryzias lapites <400> 1 Met Ser Lys Arg Gln Ser Ser Val Gln Ile Arg Gln Leu Phe Gly Pro 1 5 10 15 Ala Leu Arg Ser Arg Ile Ser Pro Ala Ser Ser Glu Leu Glu Thr Leu 20 25 30 Ser Pro Pro Arg Leu Ser Pro Arg Asp Pro Leu Gly Asp Met Tyr Pro 35 40 45 Glu Glu Ser Arg Gly Ser Gly Gly Val Ala Ala Val Asp Leu Leu Glu 50 55 60 Gly Thr Tyr Asp Tyr Ala Ala Pro Asn Pro Ala Thr Thr Pro Leu Tyr 65 70 75 80 Ser Gln Ser Ser Thr Gly Tyr Tyr Ser Ala Pro Leu Glu Thr Asn Gly 85 90 95 Pro Pro Ser Glu Gly Ser Leu Gln Ser Leu Gly Ser Gly Pro Thr Ser 100 105 110 Pro Leu Val Phe Val Pro Ser Ser Pro Arg Leu Ser Pro Phe Met His 115 120 125 Pro Pro Ser His His Tyr Leu Glu Thr Thr Ser Thr Pro Val Tyr Arg 130 135 140 Ser Ser His Gln Gly Ala Ser Arg Glu Asp Gln Cys Gly Ser Arg Glu 145 150 155 160 Asp Thr Cys Ser Leu Gly Glu Leu Gly Ala Gly Ala Gly Ala Gly Gly 165 170 175 Phe Glu Met Ala Lys Asp Thr Arg Phe Cys Ala Val Cys Ser Asp Tyr 180 185 190 Ala Ser Gly Tyr His Tyr Gly Val Trp Ser Cys Glu Gly Cys Lys Ala 195 200 205 Phe Phe Lys Arg Ser Ile Gln Gly His Asn Asp Tyr Met Cys Pro Ala 210 215 220 Thr Asn Gln Cys Thr Ile Asp Arg Asn Arg Arg Lys Gly Cys Gln Ala 225 230 235 240 Cys Arg Leu Arg Lys Cys Tyr Glu Val Gly Met Met Lys Gly Gly Val 245 250 255 Arg Lys Asp Arg Ile Arg Ile Leu Arg Arg Asp Lys Arg Arg Thr Gly 260 265 270 Val Gly Asp Gly Asp Lys Val Val Lys Gly Gln Glu His Lys Thr Val 275 280 285 His Tyr Asp Gly Arg Lys Arg Ser Ser Thr Gly Gly Gly Gly Gly Gly 290 295 300 Gly Gly Gly Arg Leu Ser Val Thr Ser Ile Pro Pro Glu Gln Val Leu 305 310 315 320 Leu Leu Leu Gln Gly Ala Glu Pro Pro Ile Leu Cys Ser Arg Gln Lys 325 330 335 Leu Ser Arg Pro Tyr Thr Glu Val Thr Met Met Thr Leu Leu Thr Ser 340 345 350 Met Ala Asp Lys Glu Leu Val His Met Ile Ala Trp Ala Lys Lys Leu 355 360 365 Pro Gly Phe Leu Gln Leu Ser Leu His Asp Gln Val Leu Leu Leu Glu 370 375 380 Ser Ser Trp Leu Glu Val Leu Met Ile Gly Leu Ile Trp Arg Ser Ile 385 390 395 400 His Cys Pro Gly Lys Leu Ile Phe Ala Gln Asp Leu Ile Leu Asp Arg 405 410 415 Asn Glu Gly Asp Cys Val Glu Gly Met Thr Glu Ile Phe Asp Met Leu 420 425 430 Leu Ala Thr Ala Ser Arg Phe Arg Val Leu Lys Leu Lys Pro Glu Glu 435 440 445 Phe Val Cys Leu Lys Ala Ile Ile Leu Leu Asn Ser Gly Ala Phe Ser 450 455 460 Phe Cys Thr Gly Thr Met Glu Pro Leu His Asn Ser Ala Ala Val Gln 465 470 475 480 Ser Met Leu Asp Thr Ile Thr Asp Ala Leu Ile His Tyr Ile Ser Gln 485 490 495 Ser Gly Tyr Leu Ala Gln Glu Gln Ala Arg Arg Gln Ala Gln Pro Leu 500 505 510 Leu Leu Leu Ser His Ile Arg His Met Ser Asn Lys Gly Met Glu His 515 520 525 Leu Tyr Ser Met Lys Cys Lys Asn Lys Val Pro Leu Tyr Asp Leu Leu 530 535 540 Leu Glu Met Leu Asp Ala His Arg Leu His His Pro Val Arg Ala Pro 545 550 555 560 Gln Ser Leu Ser Gln Val Asp Arg Asp Pro Pro Ser Thr Ser Ser Gly 565 570 575 Gly Gly Gly Ile Ala Pro Gly Ser Ile Ser Ala Ser Arg Gly Arg Ile 580 585 590 Glu Ser Pro Ser Arg Gly Pro Phe Ala Pro Ser Val Leu Gln Tyr Gly 595 600 605 Gly Ser Arg Pro Asp Cys Thr Pro Ala Leu Gln Asp 610 615 <210> 2 <211> 1863 <212> DNA <213> Oryzias lapites <220> <221> CDS <222> (1)...(1863) <400> 2 atg agt aag aga cag agc tcg gtg cag atc agg cag ctg ttc gga cca 48 Met Ser Lys Arg Gln Ser Ser Val Gln Ile Arg Gln Leu Phe Gly Pro 1 5 10 15 gca ctc aga tcc agg atc agc cca gcc tcc tca gag ctg gag acc ctc 96 Ala Leu Arg Ser Arg Ile Ser Pro Ala Ser Ser Glu Leu Glu Thr Leu 20 25 30 tcc cca cct cgc ctc tcg ccc cgt gac ccc ctc ggt gac atg tac cct 144 Ser Pro Pro Arg Leu Ser Pro Arg Asp Pro Leu Gly Asp Met Tyr Pro 35 40 45 gaa gag agc cgg ggt tct gga ggg gtg gct gct gtg gac ctt ttg gaa 192 Glu Glu Ser Arg Gly Ser Gly Gly Val Ala Ala Val Asp Leu Leu Glu 50 55 60 ggg acg tac gac tat gcc gcc ccc aac cct gcc acg act ccc ctt tac 240 Gly Thr Tyr Asp Tyr Ala Ala Pro Asn Pro Ala Thr Thr Pro Leu Tyr 65 70 75 80 agc cag tcc agc acc ggc tac tac tct gct ccc ctg gaa aca aac gga 288 Ser Gln Ser Ser Thr Gly Tyr Tyr Ser Ala Pro Leu Glu Thr Asn Gly 85 90 95 ccc ccc tca gaa ggc agt ctg cag tcc ctg ggc agt ggg ccg acg agc 336 Pro Pro Ser Glu Gly Ser Leu Gln Ser Leu Gly Ser Gly Pro Thr Ser 100 105 110 cct ctg gtg ttt gtg ccc tcc agc ccc aga ctc agt ccc ttt atg cat 384 Pro Leu Val Phe Val Pro Ser Ser Pro Arg Leu Ser Pro Phe Met His 115 120 125 cca ccc agc cac cac tat ctg gaa acc act tcc acg ccc gtt tac aga 432 Pro Pro Ser His His Tyr Leu Glu Thr Thr Ser Thr Pro Val Tyr Arg 130 135 140 tcc agc cac cag gga gcc tcc agg gag gac cag tgc ggc tcc cgg gag 480 Ser Ser His Gln Gly Ala Ser Arg Glu Asp Gln Cys Gly Ser Arg Glu 145 150 155 160 gac acg tgc agc ctg ggg gag tta ggc gcc gga gcc ggg gct ggg ggg 528 Asp Thr Cys Ser Leu Gly Glu Leu Gly Ala Gly Ala Gly Ala Gly Gly 165 170 175 ttt gag atg gcc aaa gac acg cgt ttc tgc gcc gtg tgc agc gac tac 576 Phe Glu Met Ala Lys Asp Thr Arg Phe Cys Ala Val Cys Ser Asp Tyr 180 185 190 gcc tct ggg tac cac tat ggg gtg tgg tct tgt gag ggc tgc aag gcc 624 Ala Ser Gly Tyr His Tyr Gly Val Trp Ser Cys Glu Gly Cys Lys Ala 195 200 205 ttc ttc aag agg agc atc cag ggt cac aat gac tat atg tgc cca gcg 672 Phe Phe Lys Arg Ser Ile Gln Gly His Asn Asp Tyr Met Cys Pro Ala 210 215 220 acc aat cag tgc act att gac aga aat cga agg aag ggc tgt cag gct 720 Thr Asn Gln Cys Thr Ile Asp Arg Asn Arg Arg Lys Gly Cys Gln Ala 225 230 235 240 tgt cgt ctt agg aag tgt tac gaa gtg gga atg atg aaa ggc ggt gtg 768 Cys Arg Leu Arg Lys Cys Tyr Glu Val Gly Met Met Lys Gly Gly Val 245 250 255 cgc aag gac cgc att cgc att tta cgg cgt gac aaa cgg cgg aca ggc 816 Arg Lys Asp Arg Ile Arg Ile Leu Arg Arg Asp Lys Arg Arg Thr Gly 260 265 270 gtt ggt gat gga gac aag gtt gta aag ggt cag gag cat aaa acg gtg 864 Val Gly Asp Gly Asp Lys Val Val Lys Gly Gln Glu His Lys Thr Val 275 280 285 cat tat gat gga agg aaa cgc agc agc aca gga gga gga gga gga gga 912 His Tyr Asp Gly Arg Lys Arg Ser Ser Thr Gly Gly Gly Gly Gly Gly 290 295 300 gga gga gga aga ctg tct gtg acc agc ata cct cct gag cag gtg ctg 960 Gly Gly Gly Arg Leu Ser Val Thr Ser Ile Pro Pro Glu Gln Val Leu 305 310 315 320 ctc ctc ctt cag ggc gcc gag ccc ccg ata ctc tgc tcg cgt cag aag 1008 Leu Leu Leu Gln Gly Ala Glu Pro Pro Ile Leu Cys Ser Arg Gln Lys 325 330 335 ttg agc cga ccg tac acc gag gtc acc atg atg acc ctg ctc acc agc 1056 Leu Ser Arg Pro Tyr Thr Glu Val Thr Met Met Thr Leu Leu Thr Ser 340 345 350 atg gca gac aag gag ctg gtc cac atg atc gcc tgg gcc aag aag ctc 1104 Met Ala Asp Lys Glu Leu Val His Met Ile Ala Trp Ala Lys Lys Leu 355 360 365 cca ggt ttt ctg cag ctg tcc ctg cac gat cag gtg ctg ctg ctg gag 1152 Pro Gly Phe Leu Gln Leu Ser Leu His Asp Gln Val Leu Leu Leu Glu 370 375 380 agc tcg tgg ctg gag gtg ctc atg atc ggc ctc att tgg agg tcc atc 1200 Ser Ser Trp Leu Glu Val Leu Met Ile Gly Leu Ile Trp Arg Ser Ile 385 390 395 400 cac tgt ccc ggg aag ctc atc ttt gca caa gac ctc atc ctg gac agg 1248 His Cys Pro Gly Lys Leu Ile Phe Ala Gln Asp Leu Ile Leu Asp Arg 405 410 415 aat gag gga gac tgc gtg gaa ggc atg acg gag atc ttc gac atg ctg 1296 Asn Glu Gly Asp Cys Val Glu Gly Met Thr Glu Ile Phe Asp Met Leu 420 425 430 ctg gcc act gct tcc cgc ttc cgt gtg ctc aaa ctc aaa cct gag gaa 1344 Leu Ala Thr Ala Ser Arg Phe Arg Val Leu Lys Leu Lys Pro Glu Glu 435 440 445 ttc gtc tgc ctc aaa gct att att tta ctc aac tcc ggt gct ttt tct 1392 Phe Val Cys Leu Lys Ala Ile Ile Leu Leu Asn Ser Gly Ala Phe Ser 450 455 460 ttc tgc acc ggc acc atg gag cca ctt cac aac agc gcg gcg gtt cag 1440 Phe Cys Thr Gly Thr Met Glu Pro Leu His Asn Ser Ala Ala Val Gln 465 470 475 480 agc atg ctg gac acc atc aca gac gca ctc att cat tac atc agt cag 1488 Ser Met Leu Asp Thr Ile Thr Asp Ala Leu Ile His Tyr Ile Ser Gln 485 490 495 tcg ggt tac ttg gcc cag gag cag gcg aga cgg cag gcc cag ccg ctc 1536 Ser Gly Tyr Leu Ala Gln Glu Gln Ala Arg Arg Gln Ala Gln Pro Leu 500 505 510 ctg ctg ctc tcc cac atc agg cac atg agc aac aaa ggc atg gag cac 1584 Leu Leu Leu Ser His Ile Arg His Met Ser Asn Lys Gly Met Glu His 515 520 525 ctc tac agc atg aag tgc aag aac aaa gtc cct ctt tat gac ctc cta 1632 Leu Tyr Ser Met Lys Cys Lys Asn Lys Val Pro Leu Tyr Asp Leu Leu 530 535 540 ctg gag atg ctc gat gcc cac cgc ctg cac cac ccc gtc aga gcc ccc 1680 Leu Glu Met Leu Asp Ala His Arg Leu His His Pro Val Arg Ala Pro 545 550 555 560 cag tcc ttg tcc caa gtc gac aga gac cct ccc tcc acc agc agc ggc 1728 Gln Ser Leu Ser Gln Val Asp Arg Asp Pro Pro Ser Thr Ser Ser Gly 565 570 575 ggg ggt gga atc gct ccc ggt tct ata tca gca tct cga ggc aga atc 1776 Gly Gly Gly Ile Ala Pro Gly Ser Ile Ser Ala Ser Arg Gly Arg Ile 580 585 590 gag agt ccg agc aga ggc ccc ttt gct ccc agt gtc ctt cag tat gga 1824 Glu Ser Pro Ser Arg Gly Pro Phe Ala Pro Ser Val Leu Gln Tyr Gly 595 600 605 ggg tcg cgt cct gac tgc acc ccg gcc ctt caa gac tga 1863 Gly Ser Arg Pro Asp Cys Thr Pro Ala Leu Gln Asp 610 615 620
【図面の簡単な説明】
【図1】本発明のエストロジェンレセプター遺伝子を発
現させるための発現ベクターの構築過程を示す図であ
る。
【図2】本発明のエストロジェンレセプター遺伝子を発
現させるための発現ベクターRSV-ERの構造を示す図であ
る。pRC/RSVは構築に用いたベクターである。ERは本発
明のエストロジェン遺伝子を、RSV LTRはRSVプロモータ
ーを、pSV40はSV40プロモーターを、Neomycinはネオマ
イシン耐性遺伝子をそれぞれ示す。
【図3】エストロジェン応答配列とレポーター遺伝子と
を含むレポータープラスミドERE-tK-pGL(図中ではERE-
pGLと表示)の構築過程を示す図である。
【図4】エストロジェン応答配列とレポーター遺伝子と
を含むレポータープラスミドERE-tK-pGLの構造を示す図
である。4XEREはエストロジェン応答配列が4個連結され
た配列を意味し、tK promoterはtKプロモーターを、Amp
rアンピシリン耐性遺伝子を示す。
【図5】レポーターアッセイ用の細胞を調製するための
トランスフェクションの条件を検討した結果を示す図で
ある。上段の図は、トランスフェクション試薬にリポフ
ェクチンを使用した場合、下段の図はリポフェクトアミ
ンを使用した場合の結果を示す。
【図6】レポーターアッセイ用の細胞を調製するための
トランスフェクションにおいて、添加するトランスフェ
クション試薬の量を検討した結果を示す図である。上段
の図は、リポフェクチンを使用した場合、下段の図はリ
ポフェクトアミンを使用した場合の結果を示す。
【図7】レポーターアッセイ用の細胞を調製するための
トランスフェクションにおいて、添加するプラスミドの
量を検討した結果を示す図である。上段の図は、リポフ
ェクチンを使用した場合、下段の図はリポフェクトアミ
ンを使用した場合の結果を示す。
【図8】レポーターアッセイにおけるβ−エストラジオ
ールのエストロジェンレセプター活性化能を測定した結
果を示す図である。1ウェルあたり0.25μgのレセプタ
ー発現ベクターRSV-ER、0.15μgのレポータープラスミ
ドERE5-tK-pGL、および、0.1μgのコントロールレポー
タープラスミドpRL-tKを導入した細胞を試験に用いた。
上段の図は、トランスフェクション試薬にリポフェクチ
ンを使用した場合、下段の図はリポフェクトアミンを使
用した場合の結果を示す。
【図9】レポーターアッセイにおけるβ−エストラジオ
ールのエストロジェンレセプター活性化能を測定した結
果を示す図である。1ウェルあたり0.25μgのレセプタ
ー発現ベクターRSV-ER、0.15μgのレポータープラスミ
ドERE5-tK-pGL、および、0.1μgのコントロールレポー
タープラスミドpRL-tKをリポフェクタミンを用いて導入
した細胞を試験に用いた。
【図10】レポーターアッセイにおけるビスフェノール
Aのエストロジェンレセプター活性化能を測定した結果
を示す図である。1ウェルあたり0.25μgのレセプター
発現ベクターRSV-ER、0.15μgのレポータープラスミドE
RE5-tK-pGL、および、0.1μgのコントロールレポーター
プラスミドpRL-tKをリポフェクタミンを用いて導入した
細胞を試験に用いた。E2は、終濃度500pMのβ−エス
トラジオールが添加された系を示す。
【図11】レポーターアッセイにおけるp−ノニルフェ
ノールのエストロジェンレセプター活性化能を測定した
結果を示す図である。1ウェルあたり0.25μgのレセプ
ター発現ベクターRSV-ER、0.15μgのレポータープラス
ミドERE5-tK-pGL、および、0.1μgのコントロールレポ
ータープラスミドpRL-tKをリポフェクタミンを用いて導
入した細胞を試験に用いた。E2は、終濃度500pMのβ
−エストラジオールが添加された系を示す。
【図12】レポーターアッセイにおける酢酸トリブチル
すずのエストロジェンレセプター活性化能を測定した結
果を示す図である。1ウェルあたり0.25μgのレセプタ
ー発現ベクターRSV-ER、0.15μgのレポータープラスミ
ドERE5-tK-pGL、および、0.1μgのコントロールレポー
タープラスミドpRL-tKをリポフェクタミンを用いて導入
した細胞を試験に用いた。E2は、終濃度500pMのβ−
エストラジオールが添加された系を示す。
【図13】レポーターアッセイにおけるフタル酸ジー2
ーエチルヘキシルのエストロジェンレセプター活性化能
を測定した結果を示す図である。1ウェルあたり0.25μ
gのレセプター発現ベクターRSV-ER、0.15μgのレポータ
ープラスミドERE5-tK-pGL、および、0.1μgのコントロ
ールレポータープラスミドpRL-tKをリポフェクタミンを
用いて導入した細胞を試験に用いた。E2は、終濃度50
0pMのβ−エストラジオールが添加された系を示す。
【図14】レポーターアッセイにおける各種化合物のエ
ストロジェンレセプター活性化能を測定した結果を示す
図である。1ウェルあたり0.25μgのレセプター発現ベ
クターRSV-ER、0.15μgのレポータープラスミドERE5-tK
-pGL、および、0.1μgのコントロールレポータープラス
ミドpRL-tKをリポフェクタミンを用いて導入した細胞を
試験に用いた。E2は終濃度500pMのβ−エストラジオ
ールが添加された系を、Tisは終濃度50μMの酢酸トリブ
チルすずが添加された系を、BisAは終濃度50μMのビス
フェノールAが添加された系を、Di-2は終濃度50μMの
フタル酸ジー2ーエチルヘキシルが添加された系を、No
nylは終濃度50μMのノニルフェノールが添加された系を
示す。顕微鏡観察により判定された死亡細胞率は、酢酸
トリブチルすずが添加された系において90%以上、ビ
スフェノールAが添加された系において0%、フタル酸
ジー2ーエチルヘキシルが添加された系において90%
以上、ノニルフェノールが添加された系において40%
前後であった。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 FI テーマコート゛(参考) //(C12N 15/09 ZNA C12R 1:91) (C12P 21/02 C12R 1:91) Fターム(参考) 4B024 AA11 AA17 AA20 BA63 DA02 EA04 FA02 FA10 GA13 HA03 HA11 4B063 QA01 QQ22 QQ61 QQ75 QQ91 QQ94 QR33 QR60 QR77 QR80 QS36 QX02 4B064 AG20 CA10 CA19 CC24 DA13 DA16 4B065 AA90Y AA93X AB01 AC14 BA05 CA46 4H045 AA10 AA20 AA30 BA10 CA52 DA50 EA50 FA72 FA74 HA06

Claims (12)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項1】配列番号1で示されるアミノ酸配列を有す
    る蛋白質をコードするエストロジェンレセプター遺伝
    子。
  2. 【請求項2】配列番号3で示されるアミノ酸配列からな
    る蛋白質をコードするエストロジェンレセプター遺伝
    子。
  3. 【請求項3】配列番号2で示される塩基配列を有するエ
    ストロジェンレセプター遺伝子。
  4. 【請求項4】配列番号4で示される塩基配列からなるエ
    ストロジェンレセプター遺伝子。
  5. 【請求項5】請求項1〜4記載のエストロジェンレセプ
    ター遺伝子を含有するベクター。
  6. 【請求項6】エストロジェンレセプター遺伝子に宿主細
    胞で機能可能なプロモーターが機能可能な形で結合され
    てなる請求項5記載のベクター。
  7. 【請求項7】請求項1〜4記載のエストロジェンレセプ
    ター遺伝子が宿主細胞に導入されてなる形質転換体。
  8. 【請求項8】請求項5または6記載のベクターが宿主細
    胞に導入されてなる形質転換体。
  9. 【請求項9】宿主細胞が動物細胞である請求項7または
    8記載の形質転換体。
  10. 【請求項10】請求項7〜9記載の形質転換体を培養し
    てエストロジェンレセプターを産生させ、これを回収す
    ることを特徴とするエストロジェンレセプターの製造方
    法。
  11. 【請求項11】配列番号1で示されるアミノ酸配列を有
    するエストロジェンレセプター。
  12. 【請求項12】化学物質のエストロジェンレセプター活
    性化能を評価するためのレポーターアッセイにおいて、
    エストロジェン応答配列を含む転写制御領域の下流に連
    結されたレポーター遺伝子と請求項1〜4記載のエスト
    ロジェンレセプター遺伝子とがエストロジェンレセプタ
    ー非内在性宿主細胞に導入されてなる形質転換体に、化
    学物質を作用させることを特徴とする化学物質のエスト
    ロジェンレセプター活性化能の評価方法。
JP11098787A 1998-11-10 1999-04-06 エストロジェンレセプタ―遺伝子およびその利用 Pending JP2000201688A (ja)

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