JP2000253898A - Quantitative determination of substance or enzyme, and quantitative determining reagent - Google Patents
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Abstract
Description
【０００１】[0001]
【発明の属する技術分野】本発明は、試料中のアンモニ
アまたはアンモニアに直接または間接的に変換される物
質または酵素の定量方法および該方法に用いるアンモニ
ア定量試薬に関する。The present invention relates to a method for quantifying ammonia or a substance or an enzyme which is directly or indirectly converted to ammonia in a sample, and a reagent for quantifying ammonia used in the method.
【０００２】[0002]
【従来の技術】臨床検査の分野においてアンモニアの定
量は各種疾病診断に重要な指標である。例えば、劇症肝
炎、肝硬変などの重症肝疾患、先天性尿素サイクル酵素
欠損症、肝内・肝外の門脈−大静脈短絡症では血中アン
モニア量が増大する。特に肝性昏睡の病体把握には、血
中アンモニア濃度が重要である。2. Description of the Related Art In the field of clinical examination, the determination of ammonia is an important index for diagnosis of various diseases. For example, blood ammonia level increases in severe liver diseases such as fulminant hepatitis and cirrhosis, congenital urea cycle enzyme deficiency, and intrahepatic / extrahepatic portal vein-cava shunt. In particular, blood ammonia concentration is important for understanding the pathology of hepatic coma.
【０００３】従来、アンモニアの定量法としてはインド
フェノール発色を用いるイオン交換法や、直接比色法な
どの化学的測定法が用いられている。しかし、イオン交
換法や直接比色法などの化学的測定法は、操作が煩雑
で、正確性、精密性に欠け、また長時間を必要とするな
どの問題点がある。一方、酵素法を用いたアンモニアの
定量法としては、例えばアンモニアにα−ケトグルタル
酸と還元型ニコチンアミノアデニンジヌクレオチド（リ
ン酸）［以下、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈと略記する］の存在下で
グルタメートデヒドロゲナーゼを作用させ、ＮＡＤ
（Ｐ）Ｈを酸化型ニコチンアミノアデニンジヌクレオチ
ド（リン酸）［以下、ＮＡＤ（Ｐ）と略記する］に変換
し反応前後の吸光度の減少を定量する方法がある。Conventionally, as a method for quantifying ammonia, a chemical measurement method such as an ion exchange method using indophenol coloring or a direct colorimetric method has been used. However, chemical measurement methods such as an ion exchange method and a direct colorimetric method have problems that the operation is complicated, lacks accuracy and precision, and requires a long time. On the other hand, as a method for quantifying ammonia using an enzymatic method, for example, glutamate is added to ammonia in the presence of α-ketoglutaric acid and reduced nicotine aminoadenine dinucleotide (phosphate) [hereinafter abbreviated as NAD (P) H]. Dehydrogenase is acted on and NAD
There is a method of converting (P) H into oxidized nicotine aminoadenine dinucleotide (phosphate) [hereinafter abbreviated as NAD (P)] and quantifying a decrease in absorbance before and after the reaction.
【０００４】グルタメートデヒドロゲナーゼを用いたア
ンモニアの測定法は、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈの吸光度の減少を
測定するため、感度が悪く多くの被検試料が必要であ
り、またアンモニアの測定域が狭いため、異常高値アン
モニア試料は直接定量できなかった。このため、感度の
良い吸光度の増加によるアンモニアの定量法が望まれて
いる。The method for measuring ammonia using glutamate dehydrogenase measures a decrease in the absorbance of NAD (P) H, and is insensitive and requires a large number of test samples. Abnormally high ammonia samples could not be directly quantified. Therefore, there is a demand for a sensitive method for quantifying ammonia by increasing the absorbance.
【０００５】[0005]
【発明が解決しようとする課題】本発明は、被検試料が
少量ですみ、定量域が広範囲な増加法でアンモニアおよ
びアンモニアに変換される物質または酵素を定量する方
法および該方法に使用する試薬を提供することである。DISCLOSURE OF THE INVENTION The present invention relates to a method for quantifying ammonia and a substance or an enzyme which is converted to ammonia by an increasing method in which the amount of a test sample is small and the quantification range is wide, and a reagent used in the method. It is to provide.
【０００６】[0006]
【課題を解決するための手段】本発明は下記（１）〜
（１９）に関する。 （１） アンモニアを含有する試料に、グルタミン酸、
アデノシン三リン酸およびイノシンの存在下に、グルタ
ミンシンセターゼ、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ
およびキサンチンオキシダーゼを作用させ、生成する過
酸化水素を定量することを特徴とする、試料中のアンモ
ニアの定量方法。The present invention provides the following (1) to
(19). (1) Glutamic acid,
A method for quantifying ammonia in a sample, comprising reacting glutamine synthetase, purine nucleoside phosphorylase and xanthine oxidase in the presence of adenosine triphosphate and inosine to quantify the generated hydrogen peroxide.
【０００７】（２） アンモニアを含有する試料に、イ
ノシン存在下、プリンヌクレオシドホスホリラーゼおよ
びキサンチンオキシダーゼを作用させ、生成する過酸化
水素を消去したのち、グルタミン酸、アデノシン三リン
酸およびイノシンの存在下、グルタミンシンセターゼ、
プリンヌクレオシドホスホリラーゼおよびキサンチンオ
キシダーゼを作用させ、生成する過酸化水素を定量する
ことを特徴とする、試料中のアンモニアの定量方法。(2) Purine nucleoside phosphorylase and xanthine oxidase are allowed to act on a sample containing ammonia in the presence of inosine to eliminate generated hydrogen peroxide, and then glutamine, adenosine triphosphate, and glutamine are added in the presence of glutamic acid, adenosine triphosphate and inosine. Synthetase,
A method for quantifying ammonia in a sample, comprising reacting purine nucleoside phosphorylase and xanthine oxidase, and quantifying the generated hydrogen peroxide.
【０００８】（３） 過酸化水素の消去を、酸素の存在
下、カタラーゼを作用させて行い、かつグルタミン酸、
アデノシン三リン酸およびイノシンの存在下、グルタミ
ンシンセターゼ、プリンヌクレオシドホスホリラーゼお
よびキサンチンオキシダーゼを作用させると同時または
その前にカタラーゼ阻害剤でカタラーゼ活性を失活させ
て行うものである（２）に記載のアンモニアの定量方
法。(3) Elimination of hydrogen peroxide is carried out by reacting catalase in the presence of oxygen, and glutamic acid,
(2) The method according to (2), wherein the reaction is carried out by inactivating catalase activity with a catalase inhibitor simultaneously with or before the action of glutamine synthetase, purine nucleoside phosphorylase and xanthine oxidase in the presence of adenosine triphosphate and inosine. A method for determining ammonia.
【０００９】（４） 過酸化水素の消去を、過酸化水素
の存在下にパーオキシダーゼを作用させると結合して色
素となる二つの化合物の片方の化合物の存在下、パーオ
キシダーゼを作用させて行い、かつグルタミン酸、アデ
ノシン三リン酸およびイノシンの存在下、グルタミンシ
ンセターゼ、プリンヌクレオシドホスホリラーゼおよび
キサンチンオキシダーゼを作用させて生成する過酸化水
素の定量を、該片方の化合物およびもう片方の化合物の
存在下、パーオキシダーゼを作用させ生成する色素を定
量して行うものである（２）に記載のアンモニアの定量
方法。(4) Elimination of hydrogen peroxide is carried out by allowing peroxidase to act in the presence of one of the two compounds which becomes a dye when combined with peroxidase in the presence of hydrogen peroxide. And, in the presence of glutamic acid, adenosine triphosphate and inosine, the amount of hydrogen peroxide produced by the action of glutamine synthetase, purine nucleoside phosphorylase and xanthine oxidase was determined in the presence of the one compound and the other compound. The method for quantifying ammonia according to (2), wherein the dye produced by the action of peroxidase is quantified.
【００１０】（５） 過酸化水素の定量を、色源体、蛍
光化合物、または発光化合物の存在下、パーオキシダー
ゼを作用させ生成する色素、蛍光、または発光強度を定
量して行うものである（１）または（３）に記載の方
法。 （６） グルタミン酸、アデノシン三リン酸、イノシ
ン、グルタミンシンセターゼ、プリンヌクレオシドホス
ホリラーゼおよびキサンチンオキシダーゼを含有するア
ンモニア定量用試薬。(5) Quantification of hydrogen peroxide is carried out by quantifying a dye, fluorescence or luminescence intensity produced by the action of peroxidase in the presence of a chromogen, a fluorescent compound or a luminescent compound ( The method according to 1) or (3). (6) A reagent for the determination of ammonia containing glutamic acid, adenosine triphosphate, inosine, glutamine synthetase, purine nucleoside phosphorylase and xanthine oxidase.
【００１１】（７） 色源体、蛍光化合物および発光化
合物から選ばれる１つの化合物およびパーオキシダーゼ
を含有する（６）に記載のアンモニア定量試薬。 （８） グルタミン酸、アデノシン三リン酸、グルタミ
ンシンセターゼから選ばれる０、１または２個の化合
物、イノシン、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ、キ
サンチンオキシダーゼおよびカタラーゼを含有する第一
試薬並びに第一試薬に含有されない、グルタミン酸、ア
デノシン三リン酸およびグルタミンシンセターゼからな
る群より選ばれる化合物およびカタラーゼ阻害剤を含有
する第二試薬からなるアンモニア定量用試薬キット。(7) The reagent for quantifying ammonia according to (6), which comprises a peroxidase and one compound selected from a chromogen, a fluorescent compound and a luminescent compound. (8) a first reagent containing 0, 1 or 2 compounds selected from glutamic acid, adenosine triphosphate, and glutamine synthetase, inosine, purine nucleoside phosphorylase, xanthine oxidase and catalase, and glutamic acid not contained in the first reagent A reagent kit for determining ammonia, comprising a compound selected from the group consisting of adenosine triphosphate and glutamine synthetase and a second reagent containing a catalase inhibitor.
【００１２】（９） 第二試薬に色源体、蛍光化合物お
よび発光化合物から選ばれる１つの化合物およびパーオ
キシダーゼを含有する（８）に記載の定量キット。 （１０） グルタミン酸、アデノシン三リン酸およびグ
ルタミンシンセターゼから選ばれる０、１または２個以
下の化合物、イノシン、プリンヌクレオシドホスホリラ
ーゼ、キサンチンオキシダーゼ、パーオキシダーゼおよ
び過酸化水素の存在下にパーオキシダーゼを作用させる
と結合して色素となる二つの化合物の片方の化合物を含
有する第一試薬並びに第一試薬に含有されない、グルタ
ミン酸、アデノシン三リン酸およびグルタミンシンセタ
ーゼからなる群より選ばれる化合物および過酸化水素の
存在下にパーオキシダーゼを作用させると結合して色素
となる二つの化合物のもう片方の化合物を含有する第二
試薬からなるアンモニア定量用試薬キット。(9) The quantification kit according to (8), wherein the second reagent contains one compound selected from a chromogen, a fluorescent compound and a luminescent compound and peroxidase. (10) Peroxidase is acted on in the presence of 0, 1, or 2 or less compounds selected from glutamic acid, adenosine triphosphate and glutamine synthetase, inosine, purine nucleoside phosphorylase, xanthine oxidase, peroxidase and hydrogen peroxide A first reagent containing one of the two compounds that becomes a dye by binding to the first reagent and not contained in the first reagent, a compound selected from the group consisting of glutamic acid, adenosine triphosphate and glutamine synthetase and hydrogen peroxide A reagent kit for the determination of ammonia comprising a second reagent containing the other of the two compounds that becomes a dye by the action of peroxidase in the presence of the compound.
【００１３】（１１） 試料中の定量すべき物質または
酵素を定量する方法であって、該物質または酵素がアン
モニア生成に関与するものであり、該試料にグルタミン
酸、アデノシン三リン酸およびイノシンの存在下、グル
タミンシンセターゼ、プリンヌクレオシドホスホリラー
ゼおよびキサンチンオキシダーゼを作用させ、生成する
過酸化水素を消去した後、物質または酵素を直接または
間接的にアンモニアに変換する試薬、グルタミン酸、ア
デノシン三リン酸およびイノシンの存在下、グルタミン
シンセターゼ、プリンヌクレオシドホスホリラーゼおよ
びキサンチンオキシダーゼを作用させ生成する過酸化水
素を定量することを特徴とする物質または酵素の定量方
法。(11) A method for quantifying a substance or an enzyme to be determined in a sample, wherein the substance or the enzyme is involved in ammonia production, and the presence of glutamic acid, adenosine triphosphate and inosine in the sample. Glutamine synthetase, purine nucleoside phosphorylase and xanthine oxidase are allowed to act to eliminate the generated hydrogen peroxide, and then a reagent that directly or indirectly converts the substance or enzyme to ammonia, glutamic acid, adenosine triphosphate and inosine. A method for quantifying a substance or an enzyme, which comprises quantifying hydrogen peroxide produced by the action of glutamine synthetase, purine nucleoside phosphorylase and xanthine oxidase in the presence of the substance or enzyme.
【００１４】（１２） 過酸化水素の消去を、酸素の存
在下、カタラーゼを作用させて行い、かつ物質または酵
素を直接または間接的にアンモニアに変換する試薬、グ
ルタミン酸、アデノシン三リン酸およびイノシンの存在
下、グルタミンシンセターゼ、プリンヌクレオシドホス
ホリラーゼおよびキサンチンオキシダーゼを作用させる
と同時またはその前にカタラーゼ阻害剤でカタラーゼ活
性を失活させて行うものである（１１）に載のアンモニ
アの定量方法。(12) Elimination of hydrogen peroxide by the action of catalase in the presence of oxygen and the conversion of a substance or enzyme directly or indirectly to ammonia, glutamic acid, adenosine triphosphate and inosine. The method for quantifying ammonia according to (11), wherein the method is performed by inactivating catalase activity with a catalase inhibitor simultaneously with or before the action of glutamine synthetase, purine nucleoside phosphorylase and xanthine oxidase in the presence of the enzyme.
【００１５】（１３） 過酸化水素の消去を、過酸化水
素の存在下にパーオキシダーゼを作用させると結合して
色素となる二つの化合物の片方の化合物の存在下、パー
オキシダーゼを作用させて行い、かつ物質または酵素を
直接または間接的にアンモニアに変換する試薬、グルタ
ミン酸、アデノシン三リン酸およびイノシンの存在下、
グルタミンシンセターゼ、プリンヌクレオシドホスホリ
ラーゼおよびキサンチンオキシダーゼを作用させ生成す
る過酸化水素の定量を、該片方の化合物およびもう片方
の化合物の存在下、パーオキシダーゼを作用させ生成す
る色素を定量して行うものである（１１）に記載のアン
モニアの定量方法。(13) Elimination of hydrogen peroxide is carried out by allowing peroxidase to act in the presence of one of the two compounds which becomes a dye when combined with peroxidase in the presence of hydrogen peroxide. And in the presence of reagents that directly or indirectly convert substances or enzymes to ammonia, glutamic acid, adenosine triphosphate and inosine,
Glutamine synthetase, purine nucleoside phosphorylase and xanthine oxidase are acted on to determine the amount of hydrogen peroxide produced by the action of peroxidase in the presence of the one compound and the other compound to quantify the produced dye. The method for quantifying ammonia according to (11).
【００１６】（１４） 過酸化水素の定量を、色源体、
蛍光化合物または発光化合物の存在下、パーオキシダー
ゼを作用させ生成する色素、蛍光または発光強度を定量
して行うものである（１１）に記載の方法。 （１５） グルタミン酸、アデノシン三リン酸、イノシ
ン、グルタミンシンセターゼ、プリンヌクレオシドホス
ホリラーゼ、キサンチンオキシダーゼおよび定量すべき
物質または酵素を直接または間接的にアンモニアに変換
する試薬を含有する物質または酵素の定量用試薬。(14) The amount of hydrogen peroxide is determined by using a chromogen,
(11) The method according to (11), wherein a dye produced by the action of peroxidase in the presence of a fluorescent compound or a luminescent compound and the intensity of fluorescence or luminescence are quantified. (15) A reagent for quantifying a substance or an enzyme containing glutamic acid, adenosine triphosphate, inosine, glutamine synthetase, purine nucleoside phosphorylase, xanthine oxidase and a reagent for directly or indirectly converting the substance or enzyme to be quantified into ammonia .
【００１７】（１６） 色源体、蛍光化合物および発光
化合物から選ばれる１つの化合物およびパーオキシダー
ゼを含有する（１５）に記載のアンモニア定量試薬 （１７） グルタミン酸、アデノシン三リン酸、グルタ
ミンシンセターゼ、イノシン、プリンヌクレオシドホス
ホリラーゼ、キサンチンオキシダーゼおよびカタラーゼ
を含有する第一試薬並びに定量すべき物質または酵素を
直接または間接的にアンモニアに変換する試薬およびカ
タラーゼ阻害剤を含有する第二試薬からなる物質または
酵素の定量用試薬キット。(16) The ammonia determination reagent according to (15), comprising one compound selected from a chromogen, a fluorescent compound and a luminescent compound and peroxidase. (17) glutamic acid, adenosine triphosphate, glutamine synthetase, A first reagent containing inosine, purine nucleoside phosphorylase, xanthine oxidase and catalase, and a substance or enzyme consisting of a reagent for directly or indirectly converting the substance or enzyme to be quantified into ammonia and a second reagent containing a catalase inhibitor Reagent kit for quantification.
【００１８】（１８） 第二試薬に、色源体、蛍光化合
物および発光化合物から選ばれる１つの化合物およびパ
ーオキシダーゼを含有する（１７）に記載の定量キッ
ト。 （１９） グルタミン酸、アデノシン三リン酸、グルタ
ミンシンセター、イノシン、プリンヌクレオシドホスホ
リラーゼ、キサンチンオキシダーゼ、パーオキシダーゼ
および過酸化水素の存在下にパーオキシダーゼを作用さ
せると結合して色素となる二つの化合物の片方の化合物
を含有する第一試薬並びに定量すべき物質または酵素を
直接または間接的にアンモニアに変換する試薬および過
酸化水素の存在下にパーオキシダーゼを作用させると結
合して色素となる化合物のもう片方の化合物を含有する
第二試薬からなる物質または酵素の定量用試薬キット。(18) The quantification kit according to (17), wherein the second reagent contains one compound selected from a chromogen, a fluorescent compound and a luminescent compound, and peroxidase. (19) One of the two compounds that form a dye by binding peroxidase in the presence of glutamic acid, adenosine triphosphate, glutamine synthetase, inosine, purine nucleoside phosphorylase, xanthine oxidase, peroxidase, and hydrogen peroxide The first reagent containing the compound of formula (1), the reagent that directly or indirectly converts the substance or enzyme to be quantified into ammonia, and the other compound that becomes a dye by binding peroxidase in the presence of hydrogen peroxide A reagent kit for quantifying a substance or an enzyme comprising the second reagent containing the compound of the above.
【００１９】[0019]
【発明の実施の形態】本発明者らは、アンモニアに、キ
サンチンオキシダーゼ、イノシン、アデノシン三リン酸
およびグルタミン酸の存在下でグルタミンシンセター
ゼ、プリンヌクレオシドホスホリラーゼを作用させるこ
とにより、１分子のアンモニアから２分子の過酸化水素
を発生させる、定量域が広範囲で、精度がよく正確でか
つ簡便なアンモニアの定量方法を見いだし本発明を完成
した。BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION The present inventors have found that by reacting ammonia with glutamine synthetase and purine nucleoside phosphorylase in the presence of xanthine oxidase, inosine, adenosine triphosphate and glutamic acid, one molecule of ammonia is converted to 2 molecules of ammonia. The present invention has been completed by finding a simple, accurate, and accurate method for quantifying ammonia, which has a wide quantification range for generating molecular hydrogen peroxide and has a high accuracy.
【００２０】本発明の反応は下記反応式（Ｉ）に従って
行われる。The reaction of the present invention is carried out according to the following reaction formula (I).
【００２１】[0021]
【化１】 Embedded image
【００２２】すなわち、試料中のアンモニアにアデノシ
ン三リン酸とグルタミン酸の存在下グルタミンシンセタ
ーゼを作用させてリン酸を生じさせ、該リン酸にイノシ
ン存在下でプリンヌクレオシドホスホリラーゼを作用さ
せてヒポキサンチンを生じさせ、該ヒポキサンチンに酸
素の存在下にキサンチンオキシダーゼを作用させて過酸
化水素を生じさせ、生成する過酸化水素を定量すること
によりアンモニアを定量するものである。That is, glutamine synthetase acts on ammonia in a sample in the presence of adenosine triphosphate and glutamic acid to generate phosphoric acid, and purine nucleoside phosphorylase acts on the phosphoric acid in the presence of inosine to produce hypoxanthine. Then, xanthine oxidase is allowed to act on the hypoxanthine in the presence of oxygen to generate hydrogen peroxide, and the generated hydrogen peroxide is quantified to determine ammonia.
【００２３】本発明の方法でアンモニアを過酸化水素に
導く反応は、例えばアンモニアを含有する試料を、グル
タミン酸、アデノシン三リン酸、イノシン、グルタミン
シンセターゼ、プリンヌクレオシドホスホリラーゼおよ
びキサンチンオキシダーゼを含有し、必要に応じて酵素
活性調節剤、酵素安定化剤、界面活性剤、防腐剤等を含
有する水性媒体中に添加して行う。反応条件は特に限定
されない。反応温度は、１０〜５０℃が好ましく、２０
〜４０がより好ましく、２５〜３７℃が特に好ましい。
反応時間は、１〜６０分間が好ましく、２〜３０分間が
より好ましく、５〜１５分間が特に好ましい。In the reaction for converting ammonia to hydrogen peroxide by the method of the present invention, for example, a sample containing ammonia containing glutamic acid, adenosine triphosphate, inosine, glutamine synthetase, purine nucleoside phosphorylase and xanthine oxidase may be used. The reaction is carried out by adding to an aqueous medium containing an enzyme activity regulator, an enzyme stabilizer, a surfactant, a preservative, etc. The reaction conditions are not particularly limited. The reaction temperature is preferably from 10 to 50 ° C,
-40 is more preferable, and 25-37 degreeC is especially preferable.
The reaction time is preferably 1 to 60 minutes, more preferably 2 to 30 minutes, and particularly preferably 5 to 15 minutes.
【００２４】生成する過酸化水素の定量方法は特に制限
されるものではなく、過酸化水素を定量する方法であれ
ばいかなる方法も使用できる。過酸化水素の定量方法と
しては、例えば過酸化水素電極により直接定量すること
ができるが、酵素反応を用いた発色法、蛍光法、発光法
等の方法で検出することが好ましい。The method for quantifying the generated hydrogen peroxide is not particularly limited, and any method can be used as long as it is a method for quantifying hydrogen peroxide. As a method for quantifying hydrogen peroxide, for example, it can be directly quantified using a hydrogen peroxide electrode, but it is preferable to detect it by a method such as a color development method, a fluorescence method, or a luminescence method using an enzyme reaction.
【００２５】発色法としては、例えば定量すべき過酸化
水素に色源体の存在下でパーオキシダーゼ等の過酸化酵
素を作用させ生成する色素を特定の波長の光を用いて測
定し、その吸光度からアンモニア濃度を求める方法であ
る。色源体としては、単独で色素となるものや、二つの
化合物が結合して色素となるもの等いずれでも使用でき
る。As a color-forming method, for example, a dye produced by reacting a hydrogen peroxide to be quantified with a peroxidase such as peroxidase in the presence of a chromogen is measured using light of a specific wavelength, and its absorbance is measured. Is a method of obtaining the ammonia concentration from the As the color source, any of those that can be used alone as a dye and those that combine two compounds to form a dye can be used.
【００２６】単独で色素となるものとしては、例えば特
開昭５６−１４５３５２号公報、特開昭５７−２９２９
７号公報、特開昭５９−１８２３６１号公報、特開昭６
０−２１８０６９号公報および特開平１−１２８７９９
号公報に記載されている化合物があげられる。Examples of the dye which can be used alone include, for example, JP-A-56-145352 and JP-A-57-2929.
No. 7, JP-A-59-182361, JP-A-59-182361
0-218069 and JP-A-1-128799
And the compounds described in Japanese Patent Application Publication No.
【００２７】具体的化合物としては、例えば１０−Ｎ−
カルボキシメチルカルバモイル−３，７−ビス（ジメチ
ルアミノ）−１０Ｈ−フェノチアジン（以下、ＣＣＡＰ
と略記する。）、１０−Ｎ−メチルカルバモイル−３，
７−ビス（ジメチルアミノ）−１０Ｈ−フェノチアジン
（以下、ＭＣＤＰと略記する。）、Ｎ−（カルボキシメ
チルアミノカルボニル）−４，４′−ビス（ジメチルア
ミノ）ジフェニルアミン ナトリウム塩（以下、ＤＡ−
６４と略記する。）、４，４′−ビス（ジメチルアミ
ノ）ジフェニルアミン、ビス［３−ビス（４−クロロフ
ェニル）メチル−４−ジメチルアミノフェニル］アミン
（以下、ＢＣＭＡと略記する。）等があげられる。本発
明で用いられる呈色試薬は、例えば特開昭５７−２９２
９７号公報に記載の方法で合成することができる。As a specific compound, for example, 10-N-
Carboxymethylcarbamoyl-3,7-bis (dimethylamino) -10H-phenothiazine (hereinafter CCAP)
Abbreviated. ), 10-N-methylcarbamoyl-3,
7-bis (dimethylamino) -10H-phenothiazine (hereinafter abbreviated as MCDP), N- (carboxymethylaminocarbonyl) -4,4′-bis (dimethylamino) diphenylamine sodium salt (hereinafter DA-
Abbreviated as 64. ), 4,4'-bis (dimethylamino) diphenylamine, bis [3-bis (4-chlorophenyl) methyl-4-dimethylaminophenyl] amine (hereinafter abbreviated as BCMA) and the like. The color reagent used in the present invention is described in, for example, JP-A-57-292.
No. 97 can be synthesized.
【００２８】二つの化合物が結合して色素となるものと
しては、例えば過酸化水素水とパーオキシダーゼとの共
存下で、結合して色素を形成する化合物があげられる。[0028] Examples of the compound that forms a dye by bonding two compounds include a compound that forms a dye by bonding in the coexistence of aqueous hydrogen peroxide and peroxidase.
【００２９】例えば、４−アミノアンチピリン（以下４
−ＡＡと略す。）や、３−メチル−２−ベンゾチアゾリ
ノンヒドラジン等のカプラ−と、アニリン化合物、例え
ばＮ−エチル−Ｎ−（３−メチルフェニル）−Ｎ′−サ
クシニルエチレンジアミン（以下ＥＭＳＥと略す。）、
Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピ
ル）−ｍ−トルイジン、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピ
ルアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−３，５
−ジメトキシアニリン、Ｎ−スルホプロピル−３，５−
ジメトキシアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル
−３，５−ジメチルアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホ
プロピル−ｍ−トルイジン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒ
ドロキシ−３−スルホプロピル）−ｍ−アニシジン、Ｎ
−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピ
ル）アニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３
−スルホプロピル）−３−メチルアニリン・ナトリウム
塩２水和物（以下ＴＯＯＳと略記する。）、Ｎ−エチル
−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，
５−ジメトキシアニリン、Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−
スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリン、Ｎ−
エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）
−３，５−ジメチルアニリン、Ｎ−スルホプロピルアニ
リン、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピルアニリンプロピ
ル−ｍ−アニジン等の組み合わせ等が例示できる。その
他、４−ＡＡとフェノールや３−ヒドロキシ−２，４，
６−トリヨウド酢酸の組合わせが例示できる。For example, 4-aminoantipyrine (hereinafter referred to as 4
Abbreviated as -AA. ) Or a coupler such as 3-methyl-2-benzothiazolinone hydrazine and an aniline compound such as N-ethyl-N- (3-methylphenyl) -N'-succinylethylenediamine (hereinafter abbreviated as EMSE),
N-ethyl-N- (2-hydroxy-3-sulfopropyl) -m-toluidine, N-ethyl-N-sulfopropylaniline, N-ethyl-N-sulfopropyl-3,5
-Dimethoxyaniline, N-sulfopropyl-3,5-
Dimethoxyaniline, N-ethyl-N-sulfopropyl-3,5-dimethylaniline, N-ethyl-N-sulfopropyl-m-toluidine, N-ethyl-N- (2-hydroxy-3-sulfopropyl) -m -Anisidine, N
-Ethyl-N- (2-hydroxy-3-sulfopropyl) aniline, N-ethyl-N- (2-hydroxy-3
-Sulfopropyl) -3-methylaniline sodium salt dihydrate (hereinafter abbreviated as TOOS), N-ethyl-N- (2-hydroxy-3-sulfopropyl) -3,
5-dimethoxyaniline, N- (2-hydroxy-3-
Sulfopropyl) -3,5-dimethoxyaniline, N-
Ethyl-N- (2-hydroxy-3-sulfopropyl)
Examples thereof include combinations of -3,5-dimethylaniline, N-sulfopropylaniline, N-ethyl-N-sulfopropylanilinepropyl-m-anidin and the like. In addition, 4-AA and phenol or 3-hydroxy-2,4,
A combination of 6-triiodoacetic acid can be exemplified.
【００３０】蛍光法としては、例えば定量すべき過酸化
水素に蛍光源の存在下、パーオキシダーゼ等の過酸化酵
素を作用させ生成する蛍光強度を測定し、その強度から
アンモニアの濃度を求める方法があげられる。蛍光源と
しては、３−（４−ヒドロキシフェニル）プロピオン酸
等があげられる。発光法としては、定量すべき過酸化水
素に発光化合物の存在下、パーオキシダーゼ等の過酸化
酵素を作用させ生成する光強度を測定し、その強度から
アンモニア濃度を求める方法があげられる。発光源とし
ては、ルミノール、イソルミノール、ルシゲニン、アク
リジニウムエステル、クマリン誘導体、ピラゾロピリド
ピリダジン誘導体等があげられる。クマリン誘導体とし
ては、ＷＯ９３−１５２１９号公報に記載の化合物が好
ましく例示される。ピラゾロピリドピリダジン誘導体と
しては、特開平９−４９８３１号公報に記載の化合物が
好ましく例示される。As the fluorescence method, for example, there is a method in which a hydrogen peroxide to be quantified is allowed to act on a peroxidase such as peroxidase in the presence of a fluorescent source to measure the intensity of the generated fluorescence, and the concentration of ammonia is determined from the intensity. can give. Examples of the fluorescent source include 3- (4-hydroxyphenyl) propionic acid. As the luminescence method, there is a method in which a peroxidase such as peroxidase is allowed to act on hydrogen peroxide to be quantified in the presence of a luminescent compound, the light intensity generated is measured, and the ammonia concentration is determined from the intensity. Examples of the light emitting source include luminol, isoluminol, lucigenin, acridinium ester, coumarin derivative, pyrazolopyridopyridazine derivative and the like. As the coumarin derivative, compounds described in WO93-15219 are preferably exemplified. Preferable examples of the pyrazolopyridopyridazine derivative include compounds described in JP-A-9-49831.
【００３１】吸光度、蛍光強度または発光強度と既知濃
度のアンモニアを試料に用い、得られる吸光度、蛍光強
度または発光強度とアンモニア濃度を示す検量線を作成
しておくことにより、試料中のアンモニア濃度を求める
ことができる。過酸化水素定量反応は、過酸化水素生成
反応と同時に行っても、また生成反応が終了した後に行
ってもよい。特に、過酸化物質等がパーオキシダーゼ等
の酵素のときは、過酸化水素生成反応と同時に行うのが
好ましい。The ammonia concentration in the sample is determined by preparing a calibration curve showing the absorbance, the fluorescence intensity or the emission intensity and the ammonia concentration using the absorbance, the fluorescence intensity or the emission intensity and the ammonia at a known concentration for the sample. You can ask. The hydrogen peroxide quantitative reaction may be carried out simultaneously with the hydrogen peroxide producing reaction, or may be carried out after the production reaction is completed. In particular, when the peroxide substance or the like is an enzyme such as peroxidase, it is preferable to carry out the reaction simultaneously with the reaction for producing hydrogen peroxide.
【００３２】本発明では、アンモニアを定量する血清検
体等の試料に含有されるリン酸、ヒポキサンチンおよび
キサンチンも過酸化水素を発生させるので、アンモニア
の定量に影響する。このため、試料中にリン酸、ヒポキ
サンチン、キサンチン等が存在すると考えられる場合に
は、あらかじめ試料中に存在するリン酸、ヒポキサンチ
ンおよびキサンチンを消去したのち試料中のアンモニア
を定量するのが好ましい。In the present invention, phosphoric acid, hypoxanthine and xanthine contained in a sample such as a serum sample for quantifying ammonia also generate hydrogen peroxide, which affects the quantification of ammonia. For this reason, when it is considered that phosphoric acid, hypoxanthine, xanthine, etc. are present in the sample, it is preferable to quantify the ammonia in the sample after previously eliminating the phosphoric acid, hypoxanthine and xanthine present in the sample. .
【００３３】該消去方法としては、特に制限はなく、カ
ラム等の物理的除去や、酵素反応を利用して、アンモニ
アからの過酸化水素反応に影響しない物質に導くことが
できる。試料中に存在するリン酸、ヒポキサンチンおよ
びキサンチンの消去法としては、例えば試料にイノシン
存在下でプリンヌクレオシドホスホリラーゼおよびキサ
ンチンオキシダーゼを作用させ過酸化水素を生成させ、
生成する過酸化水素を下記反応式（ＩＩ）で消去する方
法があげられる。The erasing method is not particularly limited, and it can be led to a substance which does not affect the hydrogen peroxide reaction from ammonia by physical removal of a column or the like or an enzymatic reaction. As a method for eliminating phosphate, hypoxanthine and xanthine present in a sample, for example, purine nucleoside phosphorylase and xanthine oxidase are allowed to act on the sample in the presence of inosine to generate hydrogen peroxide,
There is a method of eliminating generated hydrogen peroxide by the following reaction formula (II).
【００３４】[0034]
【化２】 Embedded image
【００３５】リン酸、キサンチンおよびヒポキサンチン
を過酸化水素に変換する反応は、例えば試料を、イノシ
ン、グルタミンシンセターゼ、プリンヌクレオシドホス
ホリラーゼおよびキサンチンオキシダーゼを含有し、必
要に応じて酵素活性調節剤、酵素安定化剤、界面活性
剤、防腐剤等を含有する水性媒体中に添加して行う。過
酸化水素生成反応条件は、上述のアンモニアから過酸化
水素を生成させる条件と同一である。The reaction for converting phosphoric acid, xanthine and hypoxanthine to hydrogen peroxide is, for example, a method in which a sample contains inosine, glutamine synthetase, purine nucleoside phosphorylase and xanthine oxidase. It is carried out by adding it to an aqueous medium containing a stabilizer, a surfactant, a preservative and the like. The hydrogen peroxide generation reaction conditions are the same as the above-described conditions for generating hydrogen peroxide from ammonia.
【００３６】生成した過酸化水素を消去する反応は、例
えば該試料を、過酸化水素の存在下にパーオキシダーゼ
を作用させると結合して色素となる二つの化合物の片方
の化合物、パーオキシダーゼを含有し、必要により酵素
活性調節剤、酵素安定化剤、界面活性剤、防腐剤等を含
有する水性媒体に添加して行う。過酸化水素の消去反応
条件は特に制限されない。該反応温度は、１０〜５０℃
が好ましく、２０〜４０℃がより好ましく、２５〜３７
℃が特に好ましい。該反応時間は、１〜６０分間が好ま
しく、２〜３０分間がより好ましく、５〜１５分間が特
に好ましい。The reaction for eliminating the generated hydrogen peroxide is carried out, for example, by containing peroxidase, which is one of the two compounds that become a dye by binding the sample to peroxidase in the presence of hydrogen peroxide. If necessary, it is added to an aqueous medium containing an enzyme activity regulator, an enzyme stabilizer, a surfactant, a preservative and the like. The conditions for the elimination reaction of hydrogen peroxide are not particularly limited. The reaction temperature is 10 to 50 ° C.
Is preferably 20 to 40 ° C, more preferably 25 to 37.
C is particularly preferred. The reaction time is preferably 1 to 60 minutes, more preferably 2 to 30 minutes, and particularly preferably 5 to 15 minutes.
【００３７】これにより、試料中のリン酸、ヒポキサン
チン、キサンチンを過酸化水素に導き、生じた過酸化水
素は、水に変換され消去される。過酸化水素の存在下に
パーオキシダーゼを作用させると結合して色素となる二
つの化合物の組合わせとしては、具体的には４−アミノ
アンチピリンや、３−メチル−２−ベンゾチアゾリノン
ヒドラジン等のカップラーと、アニリン誘導体またはフ
ェノール誘導体の組合わせがあげられる。またアニリン
誘導体、フェノール誘導体およびアニリン誘導体とフェ
ノール誘導体の組合わせがあげられる。フェノール誘導
体およびアニリン誘導体としては、前述の誘導体が例示
できる。Thus, the phosphoric acid, hypoxanthine, and xanthine in the sample are led to hydrogen peroxide, and the generated hydrogen peroxide is converted into water and eliminated. Specific examples of the combination of two compounds that become a dye by binding peroxidase in the presence of hydrogen peroxide to form a dye include 4-aminoantipyrine and 3-methyl-2-benzothiazolinone hydrazine. And a combination of an aniline derivative or a phenol derivative. In addition, aniline derivatives, phenol derivatives and combinations of aniline derivatives and phenol derivatives can be mentioned. Examples of the phenol derivative and the aniline derivative include the above-described derivatives.
【００３８】次いで、あらかじめ試料に存在するリン
酸、ヒポキサンチン、キサンチンを上述の反応により消
去した試料にアデノシン三リン酸、グルタミン酸および
過酸化水素を消去するのに使用したもう片方の化合物存
在下で、グルタミンシンセターゼ、プリンヌクレオシド
ホスファターゼ、キサンチンオキシダーゼおよびパーオ
キシダーゼを作用させることにより、色素が生成する。Next, a sample in which phosphoric acid, hypoxanthine, and xanthine, which were previously present in the sample, were eliminated by the above-described reaction was added in the presence of the other compound used to eliminate adenosine triphosphate, glutamic acid, and hydrogen peroxide. , Glutamine synthetase, purine nucleoside phosphatase, xanthine oxidase and peroxidase produce a dye.
【００３９】反応条件は特に限定されない。反応温度
は、１０〜５０℃が好ましく、２０〜４０℃がより好ま
しく、２５〜３７℃が特に好ましい。反応時間は、１〜
６０分間が好ましく、２〜３０分間がより好ましく、５
〜１５分間が特に好ましい。また、試料中に存在するリ
ン酸、ヒポキサンチン、キサンチンの消去法としては、
プリンヌクレオシドホスホリラーゼ、キサンチンオキシ
ダーゼ、イノシンを作用させ過酸化水素を生成させ、該
生成過酸化水素を下記反応式（ＩＩＩ）で消去する方法
があげられる。The reaction conditions are not particularly limited. The reaction temperature is preferably from 10 to 50C, more preferably from 20 to 40C, particularly preferably from 25 to 37C. The reaction time is 1 to
60 minutes is preferable, 2 to 30 minutes is more preferable, and 5 minutes
Especially preferred is １５15 minutes. Further, as a method for eliminating phosphate, hypoxanthine, and xanthine present in a sample,
There is a method in which purine nucleoside phosphorylase, xanthine oxidase, and inosine are allowed to act to generate hydrogen peroxide, and the generated hydrogen peroxide is eliminated by the following reaction formula (III).
【００４０】[0040]
【化３】 Embedded image
【００４１】リン酸、キサンチンおよびヒポキサンチン
を過酸化水素に変換する反応は、例えば前述と同様にし
て行うことができる。リン酸、ヒポキサンチン、キサン
チンから生成した過酸化水素を消去する反応は、例えば
該試料をカタラーゼを含有し、必要により酵素活性調節
剤、酵素安定化剤、界面活性剤、防腐剤を含有する水性
媒体に添加して行う。The reaction for converting phosphoric acid, xanthine and hypoxanthine to hydrogen peroxide can be carried out, for example, in the same manner as described above. Phosphoric acid, hypoxanthine, a reaction for eliminating hydrogen peroxide generated from xanthine, for example, an aqueous solution containing catalase and optionally containing an enzyme activity regulator, an enzyme stabilizer, a surfactant, and a preservative Performed by adding to the medium.
【００４２】これにより過酸化水素はカタラーゼにより
水に変換され消去される。ついでカタラーゼ阻害剤を添
加しカタラーゼ活性を完全に阻害する。カタラーゼの阻
害剤は、グルタミンシンターゼを作用させる前または同
時に反応液に添加する。カタラーゼ阻害剤としては、例
えばＮａＮ3、Ｈ2Ｓ、ＨＣＮ、ＮＨ2ＯＨ、３−アミノ
−１，２，４−トリアゾール等があげられる。Thus, the hydrogen peroxide is converted into water by catalase and eliminated. Then, a catalase inhibitor is added to completely inhibit catalase activity. The catalase inhibitor is added to the reaction solution before or simultaneously with the action of glutamine synthase. Examples of the catalase inhibitor include NaN 3 , H 2 S, HCN, NH 2 OH, 3-amino-1,2,4-triazole and the like.
【００４３】次いでアデノシン三リン酸およびグルタミ
ン酸存在下に、グルタミンシンセターゼ、プリンヌクレ
オシドホスファターゼ、キサンチンオキシダーゼを作用
させ、生成する過酸化水素を定量する。生成する過酸化
水素の定量方法は特に制限されるものではなく過酸化水
素を定量する方法であればいかなる方法で定量してもよ
い。具体的には前述の過酸化水素定量方法があげられ
る。Next, glutamine synthetase, purine nucleoside phosphatase and xanthine oxidase are allowed to act in the presence of adenosine triphosphate and glutamic acid, and the amount of hydrogen peroxide produced is quantified. The method for quantifying the generated hydrogen peroxide is not particularly limited, and any method may be used as long as it is a method for quantifying hydrogen peroxide. Specific examples include the above-mentioned method for determining hydrogen peroxide.
【００４４】さらに、本発明は上記の反応式に従ってア
ンモニアを定量できることはもちろんのこと、アンモニ
アを生成する反応系に関与する物質および酵素活性を定
量できる。このようなアンモニアを生成する反応系、あ
るいはアンモニアを生成する酵素系に関与する物質およ
び酵素活性としては、例えば下記のものがあげられる。Further, according to the present invention, not only can ammonia be quantified according to the above reaction formula, but also substances involved in the reaction system for producing ammonia and enzyme activities can be quantified. Examples of substances and enzyme activities involved in such a reaction system for producing ammonia or an enzyme system for producing ammonia include the following.
【００４５】定量すべき物質が尿素のときはウレアー
ゼ、定量すべき物質がニコチンアミドのときはニコチナ
ミダーゼ、定量すべき物質がグルタミニルペプチドのと
きはグルタミニルペプチド−グルタミナーゼ、定量すべ
き物質がグアニンのときはグアニンデアミナーゼ、定量
すべき物質がアデノシンのときはアデノシンデアミナー
ゼ、定量すべき物質がスレオニンのときはスレオニンデ
ヒドラーゼ、定量すべき物質がアスパラギン酸のときは
アスパラギン酸アンモニアリアーゼ、定量すべき物質が
メチオニンのときはメチオニンリアーゼ、定量すべき物
質がグアニンのときはグアニンデアミナーゼ、定量すべ
き物質がクレアチニンのときはクレアチニンデイミダー
ゼ等があげられる。また、定量すべき物質が、クレアチ
ンのときはクレアチナーゼおよびウレアーゼ、定量すべ
き物質がクレアチニンのときはクレアチニナーゼ、クレ
アチナーゼおよびウレアーゼがあげられる。When the substance to be quantified is urea, urease, when the substance to be quantified is nicotinamide, nicotinamide, when the substance to be quantified is glutaminyl peptide, glutaminyl peptide-glutaminase, and the substance to be quantified is guanine. When the substance to be quantified is adenosine, adenosine deaminase, when the substance to be quantified is threonine, threonine dehydrolase, when the substance to be quantified is aspartic acid, the aspartate ammonia lyase Examples include methionine lyase when methionine is used, guanine deaminase when the substance to be quantified is guanine, and creatinine deimidase when the substance to be quantified is creatinine. When the substance to be quantified is creatine, creatinase and urease are included, and when the substance to be quantified is creatinine, creatininase, creatinase and urease are exemplified.
【００４６】これらの物質または酵素を含有する試薬
を、本発明では定量すべき物質または酵素を直接または
間接的にアンモニアに変換する試薬という。アンモニア
を生成する反応系に関与する物質または酵素を定量する
に際し、試料中にあらかじめアンモニアまたは無機燐が
存在すると定量すべき物質または酵素に特異的でない定
量結果が得られるので、本発明ではあらかじめ試料中に
存在するアンモニア、無機リン酸、キサンチン、ヒポキ
サンチンは消去することが望ましい。In the present invention, the reagent containing these substances or enzymes is referred to as a reagent for directly or indirectly converting the substance or enzyme to be quantified into ammonia. When quantifying a substance or an enzyme involved in the reaction system that produces ammonia, the presence of ammonia or inorganic phosphorus in the sample in advance gives a non-specific quantification result for the substance or enzyme to be quantified. It is desirable to eliminate ammonia, inorganic phosphoric acid, xanthine, and hypoxanthine present therein.
【００４７】該消去は、定量すべき物質または酵素をア
ンモニアに変換する前に、試料にアデノシン三リン酸、
グルタミン酸、イノシン存在下に、グルタミンシンセタ
ーゼ、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ、およびキサ
ンチンオキシダーゼを作用させ、該生成する過酸化水素
を前述の方法で消去することにより行うことができる。The elimination involves adding adenosine triphosphate, adenosine triphosphate to the sample before converting the substance or enzyme to be quantified into ammonia.
Glutamine synthetase, purine nucleoside phosphorylase, and xanthine oxidase are allowed to act in the presence of glutamic acid and inosine, and the produced hydrogen peroxide is eliminated by the method described above.
【００４８】過酸化水素の消去を反応式（ＩＩ）で行う
ときは、定量すべき物質は、該消去反応終了後、測定す
べき物質をアンモニアに変換する試薬および過酸化水素
消去に使用した化合物と組となるもう片方の化合物を添
加し、生成する色素を定量することにより行うことがで
きる。反応条件は、前述と同様である。When the elimination of hydrogen peroxide is carried out by the reaction formula (II), the substance to be quantified is a reagent for converting the substance to be measured into ammonia after completion of the elimination reaction and the compound used for elimination of hydrogen peroxide. Can be carried out by adding the other compound that forms a pair with and quantifying the resulting dye. The reaction conditions are the same as described above.
【００４９】過酸化水素の消去を反応式（ＩＩＩ）で行
うときは、アンモニア、リン酸、ヒポキサンチン、キサ
ンチンを過酸化水素に導いた後、カタラーゼを添加し生
成する過酸化水素を消去する。カタラーゼにより過酸化
水素が消去された後、カタラーゼ阻害剤を添加しカタラ
ーゼ活性を阻害する。カタラーゼ阻害剤は、定量すべき
物質または酵素を直接または間接的にアンモニアに変換
させる試薬を添加する前または同時に反応液に添加す
る。When the elimination of hydrogen peroxide is carried out by the reaction formula (III), ammonia, phosphoric acid, hypoxanthine and xanthine are led to hydrogen peroxide, and then catalase is added to eliminate the produced hydrogen peroxide. After the hydrogen peroxide is eliminated by catalase, a catalase inhibitor is added to inhibit catalase activity. The catalase inhibitor is added to the reaction solution before or simultaneously with the addition of a reagent for directly or indirectly converting the substance or enzyme to be quantified into ammonia.
【００５０】本発明におけるグルタミンシンセターゼと
は酵素番号［ＥＣ６．３．１．２．］に属する酵素であ
ればよく、微生物から採取したグルタミンシンセターゼ
あるいはそれらを遺伝子工学により改変し製造した酵素
が含まれる。例えば、キッコーマン社やユニチカ社等の
市販品が入手できる。市販もしくは調製して得たグルタ
ミンシンセターゼにはアデノシントリホスファターゼが
混在するものがあるが、本発明においてはアデノシント
リホスファターゼの混在は好ましくない。アデノシント
リホスファターゼの混入としては、グルタミンシンセタ
ーゼ１０００Ｕに対して、２０Ｕ以下が好ましく、１０
Ｕ以下がより好ましく、５Ｕ以下が特に好ましい。Glutamine synthetase in the present invention is an enzyme number [EC6.3.1.2. Glutamine synthetase collected from a microorganism or an enzyme produced by modifying them by genetic engineering. For example, commercially available products such as Kikkoman and Unitika are available. Some glutamine synthetases which are commercially available or prepared are mixed with adenosine triphosphatase, but in the present invention, mixed with adenosine triphosphatase is not preferred. The mixing of adenosine triphosphatase is preferably 20 U or less with respect to 1000 U of glutamine synthetase, and
U or less is more preferable, and 5U or less is particularly preferable.
【００５１】また、アデノシントリホスファターゼが混
在していても、アデノシントリホスファターゼ阻害剤を
添加することにより上述の酵素活性となる様に調製した
酵素も使用しうる。なお、グルタミンシンセターゼ活性
の測定方法は、酵素（ＥＮＺＹＭＥＳ）、４５頁、ユニ
チカ社およびアデノシントリホスファターゼ活性の測定
方法は、生化学実験講座、１５、３４１−３６１（１９
７５）の３４３頁のＡＤＰの変化量「ピルビン酸キナー
ゼ、乳酸デヒドロゲナーゼを組合わせる方法」に記載の
方法で行う。Further, even when adenosine triphosphatase is present, an enzyme prepared to have the above-mentioned enzyme activity by adding an adenosine triphosphatase inhibitor can also be used. The method for measuring glutamine synthetase activity is described in Enzymes, page 45. The method for measuring unitica and adenosine triphosphatase activity is described in Biochemistry Laboratory, 15 , 341-361 (19).
75), the amount of ADP change on page 343, "Method for combining pyruvate kinase and lactate dehydrogenase".
【００５２】本発明に用いられるプリンヌクレオシドホ
スホリラーゼの起源は特に限定されるものではなく、例
えば、細菌、酵母、赤血球、動物組織由来の酵素などが
あげられ、細菌由来の酵素が好ましい。本発明に用いら
れるキサンチンオキシダーゼの起源は特に限定されるも
のではなく、例えば細菌、動物組織、牛乳由来の酵素が
あげられる。[0052] The origin of the purine nucleoside phosphorylase used in the present invention is not particularly limited, and examples thereof include enzymes derived from bacteria, yeast, erythrocytes, and animal tissues, and enzymes derived from bacteria are preferred. The origin of the xanthine oxidase used in the present invention is not particularly limited, and examples thereof include enzymes derived from bacteria, animal tissues, and milk.
【００５３】アンモニアを測定する際の緩衝液はｐＨ６
〜８の間で緩衝能を持つものでよく、トリス緩衝液、リ
ン酸緩衝液、クエン酸緩衝液、イミダゾール緩衝液、マ
レイン酸ナトリウム緩衝液、３−モルフォリノプロパン
スルホン酸（ＭＯＰＳ）等のグッド（ＧＯＯＤ）の緩衝
液等があげられる。アンモニアを測定する際の緩衝液の
濃度は測定に適した濃度であれば特に制限はされない
が、１０〜１０００ｍＭが好ましく、２０〜１００ｍＭ
がより好ましく、３０〜５０ｍＭが特に好ましい。The buffer used for measuring ammonia was pH 6
Any of those having a buffering capacity between -8 and 8, such as Tris buffer, phosphate buffer, citrate buffer, imidazole buffer, sodium maleate buffer, 3-morpholinopropanesulfonic acid (MOPS), etc. (GOOD) buffer and the like. The concentration of the buffer solution when measuring ammonia is not particularly limited as long as it is a concentration suitable for measurement, but is preferably 10 to 1000 mM, and more preferably 20 to 100 mM.
Is more preferable, and 30 to 50 mM is particularly preferable.
【００５４】本発明では、反応液に、必要に応じて酵素
活性阻害剤、界面活性剤、防腐剤、さらに安定化剤、酵
素賦活剤等が添加される。アデノシントリフォスファタ
ーゼの阻害剤としては、Ｐ１、Ｐ５−ビス（アデノシン
−５′）−五リン酸、β−オイデスモール、ウアバイ
ン、キニジン、エタクリン酸、２，３−ブタンジオン、
硫酸キニジン、塩酸ベンザミル、４−アセタミド−４′
−イソチオシアネトスチルベンゼン−２，２′−ジスル
フォン酸・２ナトリウム（ＳＩＴＳ）、ナトリウム・カ
リウム・アデノシントリホスファターゼ 阻害剤−１
（ＳＰＡＩ−１）、フィセチン、ミリセチン等、グリシ
ルグリシン、コハク酸、マレイン酸などの有機酸、酢酸
ナトリウム、硫酸アンモニウムなどの塩類、フッ化ナト
リウム、ＥＤＴＡなどのキレート剤、Ｎ−エチルマレイ
ミドなどのＳＨ試薬、ジシクロヘキシルカルボジイミド
等のペプチド縮合試薬、グアニジンなどの変性剤、スト
レプトマイシン、硫酸ネオマイシンなどの抗生物質、シ
チジン三リン酸などの核酸等アデノシントリホスファタ
ーゼ阻害剤があげられる。In the present invention, an enzyme activity inhibitor, a surfactant, a preservative, a stabilizer, an enzyme activator, and the like are added to the reaction solution, if necessary. Examples of adenosine triphosphatase inhibitors include P1, P5-bis (adenosine-5 ')-pentaphosphate, β-eudesmol, ouabain, quinidine, ethacrynic acid, 2,3-butanedione,
Quinidine sulfate, benzamil hydrochloride, 4-acetamide-4 '
-Isothiocyanatostilbenzene-2,2'-disulfonate disodium (SITS), sodium potassium adenosine triphosphatase inhibitor-1
(SPAI-1), fisetin, myricetin, etc., organic acids such as glycylglycine, succinic acid, and maleic acid, salts such as sodium acetate and ammonium sulfate, chelating agents such as sodium fluoride and EDTA, and SH such as N-ethylmaleimide. Reagents, peptide condensing reagents such as dicyclohexylcarbodiimide, denaturing agents such as guanidine, antibiotics such as streptomycin and neomycin sulfate, and adenosine triphosphatase inhibitors such as nucleic acids such as cytidine triphosphate.
【００５５】検体の濁りを回避する目的で、界面活性剤
が添加できる。界面活性剤としては、ノニオンＨＳ２１
０（日本油脂社）等の非イオン界面活性剤が好適に用い
られる。防腐剤としては、ＮａＮ3（カタラーゼを使用
するときは該カタラーゼ活性を阻害しない範囲で）、抗
生物質が好適に用いられる。For the purpose of avoiding turbidity of the specimen, a surfactant can be added. Nonionic HS21 is used as the surfactant.
A nonionic surfactant such as 0 (Nippon Yushi Co., Ltd.) is preferably used. As a preservative, NaN 3 (when catalase is used, as long as the catalase activity is not inhibited) and antibiotics are suitably used.
【００５６】安定化剤、酵素賦活剤としては効果を示す
物であれば特に限定されない。例えば、マグネシウムイ
オン、マンガンイオン等があげられる。ウリカーゼ活性
阻害としては、例えばオキソネート、ホスファターゼ活
性阻害としては、例えばフッ化ナトリウム等も添加でき
る。キサンチンオキシダーゼの安定化剤としては、例え
ばホウ酸類、ＥＭＳＥ、４−ＡＡ、（添加しているＭｇ
を越えない範囲で）エチレンジアミン四酢酸（以下、Ｅ
ＤＴＡと略す。）、牛血清アルブミン、グルタミン酸ナ
トリウム、Ｎ−（３，５−ジメトキシフェニル）−N′
−サクシニルエチレンジアミンナトリウム塩（ＤＯＳ
Ｅ）、界面活性剤、アルデヒド補足剤が添加できる。ア
ルデヒドを捕捉剤として例えば４−フェニルセミカルバ
ジド、リン酸イプロニアジド、カルバジン酸エチル等が
あげられる。The stabilizer and the enzyme activator are not particularly limited as long as they exhibit an effect. For example, magnesium ion, manganese ion and the like can be mentioned. As uricase activity inhibition, for example, oxonate can be added, and as phosphatase activity inhibition, for example, sodium fluoride or the like can be added. As a stabilizer for xanthine oxidase, for example, boric acids, EMSE, 4-AA, (added Mg
Ethylenediaminetetraacetic acid (hereinafter E)
Abbreviated as DTA. ), Bovine serum albumin, sodium glutamate, N- (3,5-dimethoxyphenyl) -N '
-Succinylethylenediamine sodium salt (DOS
E), a surfactant and an aldehyde supplement can be added. Examples of aldehyde scavengers include 4-phenyl semicarbazide, phosphoric acid iproniazide, and ethyl carbazate.
【００５７】ビリルビンの影響を回避する目的で、例え
ばフェロシアン化カリウムを添加することができる。ア
スコルビン酸の影響を回避する目的で、例えばアスコル
ビン酸オキシダーゼを添加することができる。グルタミ
ンシンセターゼ、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ、
キサンチンオキシダーゼ、カタラーゼ、パーオキシダー
ゼは測定に適した濃度であれば特に制限はされない。For the purpose of avoiding the effect of bilirubin, for example, potassium ferrocyanide can be added. For the purpose of avoiding the effects of ascorbic acid, for example, ascorbic acid oxidase can be added. Glutamine synthetase, purine nucleoside phosphorylase,
Xanthine oxidase, catalase, and peroxidase are not particularly limited as long as they are concentrations suitable for measurement.
【００５８】好適にはグルタミンシンセターゼは１〜１
００Ｕ／ｍＬ、特に１〜１０Ｕ／ｍＬの濃度で好適に使
用される。プリンヌクレオシドホスホリラーゼは１〜１
００Ｕ／ｍｌ、特に２〜１０Ｕ／ｍＬの濃度で好適に使
用される。キサンチンオキシダーゼは２〜１００Ｕ／ｍ
Ｌ、特に２〜１０Ｕ／ｍＬの濃度で好適に使用される。
カタラーゼは２００〜１０００Ｕ／ｍＬ、特に２５０〜
５００Ｕ／ｍＬの濃度で好適に使用される。パーオキシ
ダーゼは４〜１００Ｕ／ｍＬ、特に５〜１０Ｕ／ｍＬの
濃度で好適に使用される。Preferably, glutamine synthetase is 1 to 1
It is suitably used at a concentration of 00 U / mL, especially 1 to 10 U / mL. Purine nucleoside phosphorylase is 1-1
It is preferably used at a concentration of 00 U / ml, especially 2 to 10 U / mL. Xanthine oxidase is 2-100 U / m
L, especially at a concentration of 2 to 10 U / mL.
Catalase is 200-1000 U / mL, especially 250-
It is preferably used at a concentration of 500 U / mL. Peroxidase is suitably used at a concentration of 4 to 100 U / mL, particularly 5 to 10 U / mL.
【００５９】グルタミン酸は測定に適した濃度であれば
特に制限はされないが、好適には１〜１００ｍｍｏｌ／
Ｌ、特に２〜１０ｍｍｏｌ／Ｌの濃度で好適に使用され
る。アデノシン三リン酸は測定に適した濃度であれば特
に制限はされないが、好適には０．２〜１００ｍｍｏｌ
／Ｌ、特に０．５〜５ｍｍｏｌ／Ｌの濃度で好適に使用
される。イノシンは測定に適した濃度であれば特に制限
はされないが、３〜１００ｍｍｏｌ／Ｌが可能で、特に
４〜１０ｍｍｏｌ／Ｌの濃度で好適に使用される。Glutamic acid is not particularly limited as long as it is a concentration suitable for measurement, but preferably 1 to 100 mmol / g.
L, particularly preferably at a concentration of 2 to 10 mmol / L. Adenosine triphosphate is not particularly limited as long as it is a concentration suitable for measurement, but is preferably 0.2 to 100 mmol.
/ L, particularly 0.5 to 5 mmol / L. Inosine is not particularly limited as long as it is a concentration suitable for measurement, but 3 to 100 mmol / L can be used, and particularly, 4 to 10 mmol / L is suitably used.
【００６０】カタラーゼ阻害剤は、測定に適した濃度で
あれば特に制限はされないが、好適には１〜１０ｍｍｏ
ｌ／Ｌ、特に１．５〜３ｍｍｏｌ／Ｌの濃度で好適に使
用される。本発明のアンモニア定量試薬は、グルタミン
酸、アデノシン三リン酸、イノシン、グルタミンシンセ
ターゼ、プリンヌクレオシドホスホリラーゼおよびキサ
ンチンオキシダーゼを含有する試薬からなる。該試薬に
は、パーオキシダーゼおよび色源体、蛍光化合物および
発光化合物から選ばれる１つの化合物を含有するものが
好ましい。The catalase inhibitor is not particularly limited as long as it is a concentration suitable for measurement, but is preferably 1 to 10 mmol.
It is preferably used at a concentration of 1 / L, particularly 1.5 to 3 mmol / L. The ammonia determination reagent of the present invention comprises a reagent containing glutamic acid, adenosine triphosphate, inosine, glutamine synthetase, purine nucleoside phosphorylase, and xanthine oxidase. The reagent preferably contains a compound selected from peroxidase and a chromogen, a fluorescent compound and a luminescent compound.
【００６１】また本発明のアンモニア定量試薬キット
は、グルタミン酸、アデノシン三リン酸およびグルタミ
ンシンセターゼから選ばれる０、１または２個の化合物
およびイノシン、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ、
キサンチンオキシダーゼ、カタラーゼを含有する第一試
薬並びに第一試薬に含有されない、グルタミン酸、アデ
ノシン三リン酸およびグルタミンシンセターゼからなる
群より選ばれる化合物およびカタラーゼ阻害剤を含有す
る第二試薬からなるキットからなる。The ammonia determination reagent kit of the present invention comprises 0, 1, or 2 compounds selected from glutamic acid, adenosine triphosphate and glutamine synthetase, and inosine, purine nucleoside phosphorylase,
A kit comprising a first reagent containing xanthine oxidase and catalase and a second reagent containing a catalase inhibitor and a compound selected from the group consisting of glutamic acid, adenosine triphosphate and glutamine synthetase which are not contained in the first reagent. .
【００６２】また本発明のアンモニア定量試薬キット
は、グルタミン酸、アデノシン三リン酸およびグルタミ
ンシンセターゼから選ばれる０、１または２個以下の化
合物、イノシン、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ、
キサンチンオキシダーゼ、パーオキシダーゼおよび過酸
化水素の存在下にパーオキシダーゼを作用させると結合
して色素となる二つの化合物の片方の化合物を含有する
第一試薬並びに第一試薬に含有されない、グルタミン
酸、アデノシン三リン酸およびグルタミンシンセターゼ
からなる群より選ばれる化合物および過酸化水素の存在
下にパーオキシダーゼを作用させると結合して色素とな
る化合物のもう片方の化合物を含有する第二試薬からな
るキットからなる。The ammonia determination reagent kit of the present invention comprises 0, 1, or 2 or less compounds selected from glutamic acid, adenosine triphosphate and glutamine synthetase, inosine, purine nucleoside phosphorylase,
A first reagent containing one of the two compounds that becomes a dye by binding peroxidase in the presence of xanthine oxidase, peroxidase and hydrogen peroxide, and a glutamic acid, adenosine trioxide not contained in the first reagent. A kit consisting of a compound selected from the group consisting of phosphate and glutamine synthetase and a second reagent containing the other compound of the compound that becomes a dye by binding peroxidase in the presence of hydrogen peroxide .
【００６３】該試薬の第二試薬にパーオキシダーゼおよ
び色源体、蛍光化合物および発光化合物から選ばれる１
つの化合物を含有するのが好ましい。また本発明の物質
または酵素の定量用試薬は、グルタミン酸、アデノシン
三リン酸、イノシン、グルタミンシンセターゼ、プリン
ヌクレオシドホスホリラーゼ、キサンチンオキシダーゼ
および定量すべき物質または酵素を直接または間接的に
アンモニアに変換する試薬を含有する試薬からなる。The second reagent selected from peroxidase and a chromogen, a fluorescent compound and a luminescent compound
Preferably it contains two compounds. Further, the reagent for quantifying the substance or enzyme of the present invention is glutamic acid, adenosine triphosphate, inosine, glutamine synthetase, purine nucleoside phosphorylase, xanthine oxidase and a reagent for directly or indirectly converting the substance or enzyme to be quantified into ammonia. Consisting of a reagent containing
【００６４】該試薬には、パーオキシダーゼおよび色源
体、蛍光化合物および発光化合物から選ばれる１つの化
合物を含有するのが好ましい。また本発明の物質または
酵素の定量試薬キットは、グルタミン酸、アデノシン三
リン酸、グルタミンシンセターゼ、イノシン、プリンヌ
クレオシドホスホリラーゼ、キサンチンオキシダーゼ、
カタラーゼを含有する第一試薬並びに定量すべき物質ま
たは酵素を直接または間接的にアンモニアに変換する試
薬およびカタラーゼ阻害剤を含有する第二試薬からなる
アンモニア定量用試薬キットからなる。The reagent preferably contains one compound selected from peroxidase and a chromogen, a fluorescent compound and a luminescent compound. Further, the reagent kit for quantifying the substance or enzyme of the present invention includes glutamic acid, adenosine triphosphate, glutamine synthetase, inosine, purine nucleoside phosphorylase, xanthine oxidase,
It comprises a first reagent containing catalase, a reagent for directly or indirectly converting the substance or enzyme to be quantified into ammonia, and a reagent kit for quantifying ammonia comprising a second reagent containing a catalase inhibitor.
【００６５】該試薬の第二試薬にパーオキシダーゼおよ
び色源体、蛍光化合物および発光化合物から選ばれる１
つの化合物を含有するのが好ましい。また本発明の物質
または酵素の定量試薬キットは、グルタミン酸、アデノ
シン三リン酸、グルタミンシンセターゼ、イノシン、プ
リンヌクレオシドホスホリラーゼ、キサンチンオキシダ
ーゼ、パーオキシダーゼ、過酸化水素の存在下にパーオ
キシダーゼを作用させると結合して色素となる二つの化
合物の片方の化合物を含有する第一試薬並びに定量すべ
き物質または酵素を直接または間接的にアンモニアに変
換する試薬および過酸化水素の存在下にパーオキシダー
ゼを作用させると結合して色素となる二つの化合物のも
う片方の化合物を含有する第二試薬からなるキットから
なる。The second reagent of the reagent is selected from peroxidase and a chromogen, a fluorescent compound and a luminescent compound.
Preferably it contains two compounds. Further, the reagent kit of the present invention for quantifying a substance or enzyme binds to glutamic acid, adenosine triphosphate, glutamine synthetase, inosine, purine nucleoside phosphorylase, xanthine oxidase, peroxidase, and peroxidase in the presence of hydrogen peroxide. Reacting peroxidase in the presence of a first reagent containing one of the two compounds that becomes a dye, a reagent that directly or indirectly converts the substance or enzyme to be quantified into ammonia, and hydrogen peroxide The kit comprises a second reagent containing the other of the two compounds that combine to form a dye.
【００６６】これら、試薬および試薬キットは、凍結乾
燥品でもよいが、あらかじめ緩衝液等の水性媒体に溶解
されていてもよい。試薬の濃度は特に制限がないが、反
応液中で前述の濃度となるように調製されるのが好まし
い。以下に本発明の実施例を示すが本発明はこれに限定
されるものではない。なお、使用した試薬、酵素は下記
メーカーのものを使用した。These reagents and reagent kits may be freeze-dried products, or may be dissolved in an aqueous medium such as a buffer in advance. The concentration of the reagent is not particularly limited, but is preferably adjusted so as to have the aforementioned concentration in the reaction solution. Examples of the present invention will be described below, but the present invention is not limited to these examples. The reagents and enzymes used were from the following manufacturers.
【００６７】ＭＯＰＳ緩衝液（同仁化学社製）、ノニオ
ンＨＳ２１０（日本油脂社製）、ＴＯＯＳ（同仁化学社
製）、グルタミン酸ナトリウム（和光純薬工業社製）、
アデノシン三リン酸（関東化学社製）、イノシン（半井
化学社製）、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ（微生
物由来、東洋紡社製）、キサンチンオキシダーゼ（微生
物由来、東洋紡社製）、パーオキシダーゼ（西洋わさび
由来、東洋紡社製）、硫酸マグネシウム（関東化学社
製）、４−ＡＡ（関東化学社製）、グルタミンシンセタ
ーゼ（盛進社製）、硫酸マグネシウム（関東化学）、Ｎ
ａＮ3（同仁化学社製）、リン酸緩衝液（関東化学社
製）、α−ケトグルタル酸二ナトリウム（協和醗酵工業
社製）、ＥＤＴＡ−四ナトリウム（同仁化学社製）、Ｎ
ＡＤＰＨ（オリエンタル酵母社製）、カタラーゼ（シグ
マ社製）。MOPS buffer (manufactured by Dojindo), Nonion HS210 (manufactured by NOF Corporation), TOOS (manufactured by Dojindo), sodium glutamate (manufactured by Wako Pure Chemical Industries),
Adenosine triphosphate (Kanto Chemical Co., Ltd.), inosine (Hansui Chemical Co., Ltd.), purine nucleoside phosphorylase (microbial origin, Toyobo Co., Ltd.), xanthine oxidase (microbial origin, Toyobo Co., Ltd.), peroxidase (Western horseradish origin, Toyobo Co., Ltd.) Sulfate) (manufactured by Kanto Kagaku), 4-AA (manufactured by Kanto Kagaku), glutamine synthetase (manufactured by Seishin), magnesium sulfate (Kanto Chemical), N
aN 3 (manufactured by Dojin Kagaku), phosphate buffer (manufactured by Kanto Kagaku), disodium α-ketoglutarate (manufactured by Kyowa Hakko Kogyo), tetrasodium EDTA (manufactured by Dojindo), N
ADPH (manufactured by Oriental Yeast) and catalase (manufactured by Sigma).
【００６８】[0068]
【実施例】実施例１ 下記の通り、検体中のアンモニア定量試薬キットを調製
した。 第一試薬 ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ ７．２５） ３０ｍｍｏｌ／Ｌ ノニオンＨＳ２１０ ０．３％ ＴＯＯＳ １．４ｍｍｏｌ／Ｌ グルタミン酸ナトリウム ６ｍｍｏｌ／Ｌ アデノシン三リン酸 １ｍｍｏｌ／Ｌ イノシン ４ｍｍｏｌ／Ｌ プリンヌクレオシドホスホリラーゼ ２Ｕ／ｍＬ キサンチンオキシダーゼ ５Ｕ／ｍＬ パーオキシダーゼ ５Ｕ／ｍＬ 第二試薬 ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ ７．２５） ３０ｍｍｏｌ／Ｌ ノニオンＨＳ２１０ ０．１％ 硫酸マグネシウム １６ｍｍｏｌ／Ｌ ４−ＡＡ ２．５ｍｍｏｌ／Ｌ グルタミンシンセターゼ ２Ｕ／ｍＬ パーオキシダーゼ ３０Ｕ／ｍＬExample 1 A kit for the determination of ammonia in a sample was prepared as follows. First reagent MOPS buffer (pH 7.25) 30 mmol / L Nonionic HS210 0.3% TOOS 1.4 mmol / L Sodium glutamate 6 mmol / L Adenosine triphosphate 1 mmol / L Inosine 4 mmol / L Purine nucleoside phosphorylase 2 U / mL xanthine Oxidase 5 U / mL Peroxidase 5 U / mL Second reagent MOPS buffer (pH 7.25) 30 mmol / L Nonionic HS210 0.1% Magnesium sulfate 16 mmol / L 4-AA 2.5 mmol / L Glutamine synthetase 2 U / mL Oxidase 30U / mL
【００６９】実施例２ 下記の方法で試料中のアンモニアを定量した。 検体液 硫酸アンモニウムを蒸留水で希釈し、７、１４、２１、
２８、３５、４２、４９、５６、６３、７０μｍｏｌ／
Ｌ、及び、３５、７０、１０５、１４０、１７５、２１
０、２４５、２８０、３１５、３５０μｍｏｌ／Ｌの硫
酸アンモニウム検量線用標準液を調製した。Example 2 Ammonia in a sample was quantified by the following method. Sample liquid Dilute ammonium sulfate with distilled water, 7, 14, 21,
28, 35, 42, 49, 56, 63, 70 μmol /
L and 35, 70, 105, 140, 175, 21
Standard solutions for ammonium sulfate calibration curves of 0, 245, 280, 315, and 350 μmol / L were prepared.
【００７０】操作方法 実施例１で調製した第一試薬２．２５ｍＬに検体液０．
０５ｍＬを添加し、３７℃で５分間インキュベートした
後、実施例１で調製した第二試薬を０．７５ｍＬ添加し
５５５ｎｍの波長で３７℃５分間反応させ、反応開始５
分後の吸光度を測定した。盲検は検体液の代わりに精製
水を用い同様に操作した。検量線を図１、図２に示す。Procedure The sample solution was added to 2.25 mL of the first reagent prepared in Example 1.
After adding 05 mL and incubating at 37 ° C. for 5 minutes, 0.75 mL of the second reagent prepared in Example 1 was added and reacted at a wavelength of 555 nm at 37 ° C. for 5 minutes.
The absorbance after one minute was measured. Blind operation was performed in the same manner using purified water instead of the sample solution. The calibration curves are shown in FIGS.
【００７１】該検量線を用いて試料中のアンモニア濃度
を求めるときは、試料中のアンモニア濃度（μｍｏｌ／
Ｌ）は、得られた吸光度に対応する硫酸アンモニウム濃
度表示の二倍濃度として定量される。When the ammonia concentration in the sample is determined using the calibration curve, the ammonia concentration in the sample (μmol /
L) is quantified as a double concentration of the ammonium sulfate concentration corresponding to the obtained absorbance.
【００７２】実施例３ 下記の通り、検体中のアンモニア定量試薬キットを調製
した。 第一試薬 ＭＯＰＳ緩衝液 （ｐＨ７．２５） ３０ｍｍｏｌ／Ｌ ノニオンＨＳ２１０ ０．３％ ＴＯＯＳ １．４ｍｍｏｌ／Ｌ グルタミン酸ナトリウム ６ｍｍｏｌ／Ｌ アデノシン三リン酸 １ｍｍｏｌ／Ｌ イノシン ４ｍｍｏｌ／Ｌ プリンヌクレオシドホスホリラーゼ ２Ｕ／ｍＬ キサンチンオキシダーゼ ５Ｕ／ｍＬ カタラーゼ ３００Ｕ／ｍＬ 第二試薬 ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７．２５） ３０ｍｍｏｌ／Ｌ ノニオンＨＳ２１０ ０．１％ 硫酸マグネシウム １６ｍｍｏｌ／Ｌ ４−ＡＡ ２．５ｍｍｏｌ／Ｌ ＮａＮ3 １．５ｍｍｏｌ／Ｌ グルタミンシンセターゼ ２Ｕ／ｍＬ パーオキシダーゼ ３０Ｕ／ｍＬExample 3 A kit for the determination of ammonia in a specimen was prepared as follows. First reagent MOPS buffer (pH 7.25) 30 mmol / L Nonionic HS210 0.3% TOOS 1.4 mmol / L Sodium glutamate 6 mmol / L Adenosine triphosphate 1 mmol / L Inosine 4 mmol / L Purine nucleoside phosphorylase 2 U / mL xanthine oxidase 5 U / mL catalase 300 U / mL Second reagent MOPS buffer (pH 7.25) 30 mmol / L Nonionic HS210 0.1% magnesium sulfate 16 mmol / L 4-AA 2.5 mmol / L NaN 3 1.5 mmol / L Glutamine synthetase 2U / mL peroxidase 30U / mL
【００７３】実施例４ 下記の方法で試料中のアンモニアを定量した。 検体液 硫酸アンモニウムを蒸留水で希釈し、７、１４、２１、
２８、３５、４２、４９、５６、６３、７０μｍｏｌ／
Ｌ、及び、３５、７０、１０５、１４０、１７５、２１
０、２４５、２８０、３１５、３５０μｍｏｌ／Ｌの硫
酸アンモニウム検量線用標準液を調製した。Example 4 Ammonia in a sample was quantified by the following method. Sample liquid Dilute ammonium sulfate with distilled water, 7, 14, 21,
28, 35, 42, 49, 56, 63, 70 μmol /
L and 35, 70, 105, 140, 175, 21
Standard solutions for ammonium sulfate calibration curves of 0, 245, 280, 315, and 350 μmol / L were prepared.
【００７４】操作方法 実施例３で調製した第一試薬２．２５ｍＬに検体液０．
０５ｍＬを添加し、３７℃で５分間インキュベートした
後、実施例３で調製した第二試薬を０．７５ｍＬ添加し
５５５ｎｍの波長で３７℃５分間反応させ、反応開始５
分後の吸光度を測定した。盲検は検体液の代わりに精製
水を用い同様に操作した。検量線を図３、図４に示す。Procedure The sample solution was added to 2.25 mL of the first reagent prepared in Example 3.
After adding 05 mL and incubating at 37 ° C. for 5 minutes, 0.75 mL of the second reagent prepared in Example 3 was added, and reacted at 555 nm at 37 ° C. for 5 minutes.
The absorbance after one minute was measured. Blind operation was performed in the same manner using purified water instead of the sample solution. The calibration curves are shown in FIGS.
【００７５】該検量線を用いて試料中のアンモニア濃度
を求めるときは、試料中のアンモニア濃度（μｍｏｌ／
Ｌ）は、得られた吸光度に対応する硫酸アンモニウム濃
度表示の二倍濃度として定量される。When the ammonia concentration in the sample is determined using the calibration curve, the ammonia concentration in the sample (μmol /
L) is quantified as a double concentration of the ammonium sulfate concentration corresponding to the obtained absorbance.
【００７６】実施例５ 検体液として人血清を用い、実施例１の第一試薬と第二
試薬を用い、実施例２の操作方法と同様に操作を行い、
実施例２から得られた検量線から濃度を求めたところ、
２３．５μｍｏｌ／Ｌと値が得られた。また、別途にこ
の検体を市販キットであるデタミナーＮＨ3（協和メデ
ックス社製）で測定したところ、２２．８μｍｏｌ／Ｌ
であり良く一致した。Example 5 The same operation as in Example 2 was performed using human serum as the sample liquid and the first and second reagents of Example 1,
When the concentration was determined from the calibration curve obtained from Example 2,
A value of 23.5 μmol / L was obtained. When this sample was separately measured using a commercially available kit, Determiner NH 3 (manufactured by Kyowa Medex), 22.8 μmol / L
And agreed well.
【００７７】比較例１ 下記の硫酸アンモニウム定量試薬を調製した。本反応
は、下記反応式（ＩＶ）に従って行われる。Comparative Example 1 The following ammonium sulfate quantitative reagent was prepared. This reaction is performed according to the following reaction formula (IV).
【化４】 Embedded image
【００７８】 第一試薬 リン酸緩衝液 （ｐＨ８．２５） ０．１ｍｏｌ／Ｌ α−ケトグルタル酸二ナトリウム ５ｍｍｏｌ／Ｌ ＮＡＤＰＨ １００μｍｏｌ／Ｌ 第二試薬 リン酸緩衝液 （ｐＨ８．２５） ０．１ｍｏｌ／Ｌ グルタメートデヒドロゲナーゼ ４０Ｕ／ｍＬ ＥＤＴＡ−四ナトリウム ２５ｍｍｏｌ／Ｌ 検体液 硫酸アンモニウムを蒸留水で希釈し、７、１４、２１、
２８、３５、４２、４９、５６、６３、７０μｍｏｌ／
Ｌ、及び、３５、７０、１０５、１４０、１７５、２１
０、２４５、２８０、３１５、３５０μｍｏｌ／Ｌの硫
酸アンモニウム検量線用標準液を調製した。First reagent phosphate buffer (pH 8.25) 0.1 mol / L disodium α-ketoglutarate 5 mmol / L NADPH 100 μmol / L Second reagent phosphate buffer (pH 8.25) 0.1 mol / L Glutamate dehydrogenase 40 U / mL EDTA-tetrasodium 25 mmol / L Sample solution Dilute ammonium sulfate with distilled water, and add 7,14,21,
28, 35, 42, 49, 56, 63, 70 μmol /
L and 35, 70, 105, 140, 175, 21
Standard solutions for ammonium sulfate calibration curves of 0, 245, 280, 315, and 350 μmol / L were prepared.
【００７９】操作方法 第一試薬２．２５ｍＬに検体液０．０５ｍＬを添加し、
３７℃で５分間インキュベートした後、第二試薬を０．
７５ｍＬ添加し３４０ｎｍの波長で３７℃５分間反応さ
せ、反応開始５分後の吸光度を測定した。吸光度は３４
０ｎｍで行った。盲検は検体液の代わりに精製水を用い
同様に操作した。検量線を図５、図６に示す。Operating method 0.05 mL of the sample solution was added to 2.25 mL of the first reagent,
After incubating at 37 ° C. for 5 minutes, the second reagent was added to 0.
75 mL was added and reacted at a wavelength of 340 nm at 37 ° C. for 5 minutes, and the absorbance 5 minutes after the start of the reaction was measured. Absorbance is 34
Performed at 0 nm. Blind operation was performed in the same manner using purified water instead of the sample solution. The calibration curves are shown in FIGS.
【００８０】該検量線を用いて試料中のアンモニア濃度
を求めるときは、試料中のアンモニア濃度（μｍｏｌ／
Ｌ）は、得られた吸光度に対応する硫酸アンモニウム濃
度表示の二倍濃度として定量される。検体量が０．０５
ｍＬと少ない、すなわち検体中のアンモニア濃度が低い
試料を本方法で定量すると、低濃度側で測定値にばらつ
きが認められた。When the ammonia concentration in the sample is determined using the calibration curve, the ammonia concentration in the sample (μmol /
L) is quantified as a double concentration of the ammonium sulfate concentration corresponding to the obtained absorbance. Sample volume is 0.05
When a sample as small as mL, that is, a sample having a low ammonia concentration in the sample was quantified by this method, variation was observed in the measured value on the low concentration side.
【００８１】比較例２ 下記の方法で硫酸アンモニウムを定量した。Comparative Example 2 Ammonium sulfate was quantified by the following method.
【００８２】操作方法 比較例１で調製した第一試薬２．２５ｍＬに比較例１で
調製した検体液０．３６ｍＬを添加し、３７℃で５分間
インキュベートした後、比較例１で調製した第二試薬を
０．７５ｍＬ添加し３４０ｎｍの波長で３７℃５分間反
応させ、反応開始５分後の吸光度を測定した。盲検は検
体液の代わりに精製水を用い同様に操作した。検量線を
図７、図８に示す。Operating Procedure 0.32 mL of the sample solution prepared in Comparative Example 1 was added to 2.25 mL of the first reagent prepared in Comparative Example 1, and the mixture was incubated at 37 ° C. for 5 minutes. 0.75 mL of the reagent was added and reacted at a wavelength of 340 nm at 37 ° C. for 5 minutes, and the absorbance 5 minutes after the start of the reaction was measured. Blind operation was performed in the same manner using purified water instead of the sample solution. The calibration curves are shown in FIGS.
【００８３】該検量線を用いて試料中のアンモニア濃度
を求めるときは、試料中のアンモニア濃度（μｍｏｌ／
Ｌ）は、得られた吸光度に対応する硫酸アンモニウム濃
度表示の二倍濃度として定量される。検体量が０．３６
ｍＬと多い、すなわち検体中のアンモニア濃度が高い試
料を本方法で定量すると、高濃度側で定量性が低下し
た。When the ammonia concentration in the sample is determined using the calibration curve, the ammonia concentration in the sample (μmol /
L) is quantified as a double concentration of the ammonium sulfate concentration corresponding to the obtained absorbance. Sample volume is 0.36
When a sample as large as mL, that is, a sample having a high ammonia concentration in the sample was quantified by this method, the quantification was reduced on the high concentration side.
【００８４】[0084]
【発明の効果】本発明によれば、被検試料が少量です
み、定量域が広範囲で、比色法の増加法でアンモニアを
精度よく測定することができる方法およびそれに用いる
試薬が提供される。According to the present invention, there is provided a method which requires a small amount of a test sample, has a wide quantification range, can accurately measure ammonia by an increasing method of colorimetry, and a reagent used therefor. .
【図１】 本発明の方法で定量したときの、硫酸アンモ
ニウム濃度（０〜７０μｍｏｌ／Ｌ）と吸光度との関係
を示す検量線。FIG. 1 is a calibration curve showing the relationship between ammonium sulfate concentration (0 to 70 μmol / L) and absorbance when quantified by the method of the present invention.
【図２】 本発明の方法で定量したときの、硫酸アンモ
ニウム濃度（０〜３５０μｍｏｌ／Ｌ）と吸光度との関
係を示す検量線。FIG. 2 is a calibration curve showing the relationship between ammonium sulfate concentration (0 to 350 μmol / L) and absorbance when quantified by the method of the present invention.
【図３】 本発明の方法で定量したときの、硫酸アンモ
ニウム濃度（０〜７０μｍｏｌ／Ｌ）と吸光度との関係
を示す検量線。FIG. 3 is a calibration curve showing the relationship between ammonium sulfate concentration (0 to 70 μmol / L) and absorbance when quantified by the method of the present invention.
【図４】 本発明の方法で定量したときの、硫酸アンモ
ニウム濃度（０〜３５０μｍｏｌ／Ｌ）と吸光度との関
係を示す検量線。FIG. 4 is a calibration curve showing the relationship between ammonium sulfate concentration (0 to 350 μmol / L) and absorbance when quantified by the method of the present invention.
【図５】 従来の方法で定量したときの、硫酸アンモニ
ウム濃度（０〜７０μｍｏｌ／Ｌ）と吸光度との関係を
示す検量線。検体量は、０．０５ｍＬである。FIG. 5 is a calibration curve showing the relationship between ammonium sulfate concentration (0 to 70 μmol / L) and absorbance when quantified by a conventional method. The sample volume is 0.05 mL.
【図６】 従来の方法で定量したときの、硫酸アンモニ
ウム濃度（０〜３５０μｍｏｌ／Ｌ）と吸光度との関係
を示す検量線。検体量は、０．０５ｍＬである。FIG. 6 is a calibration curve showing the relationship between ammonium sulfate concentration (0 to 350 μmol / L) and absorbance when quantified by a conventional method. The sample volume is 0.05 mL.
【図７】 従来の方法で定量したときの、硫酸アンモニ
ウム濃度（０〜７０μｍｏｌ／Ｌ）と吸光度との関係を
示す検量線。検体量は０．３６ｍＬである。FIG. 7 is a calibration curve showing the relationship between ammonium sulfate concentration (0 to 70 μmol / L) and absorbance when quantified by a conventional method. The sample volume is 0.36 mL.
【図８】 従来の方法で定量したときの、硫酸アンモニ
ウム濃度（０〜３５０μｍｏｌ／Ｌ）と吸光度との関係
を示す検量線。検体量は、０．３６ｍＬである。FIG. 8 is a calibration curve showing the relationship between ammonium sulfate concentration (0 to 350 μmol / L) and absorbance when quantified by a conventional method. The sample volume is 0.36 mL.
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Claims (19)
ン酸、アデノシン三リン酸およびイノシンの存在下に、
グルタミンシンセターゼ、プリンヌクレオシドホスホリ
ラーゼおよびキサンチンオキシダーゼを作用させ、生成
する過酸化水素を定量することを特徴とする、試料中の
アンモニアの定量方法。1. A method comprising the steps of: adding a sample containing ammonia in the presence of glutamic acid, adenosine triphosphate and inosine;
A method for quantifying ammonia in a sample, which comprises reacting glutamine synthetase, purine nucleoside phosphorylase, and xanthine oxidase, and quantifying the generated hydrogen peroxide.
存在下、プリンヌクレオシドホスホリラーゼおよびキサ
ンチンオキシダーゼを作用させ、生成する過酸化水素を
消去したのち、グルタミン酸、アデノシン三リン酸およ
びイノシンの存在下、グルタミンシンセターゼ、プリン
ヌクレオシドホスホリラーゼおよびキサンチンオキシダ
ーゼを作用させ、生成する過酸化水素を定量することを
特徴とする、試料中のアンモニアの定量方法。2. A sample containing ammonia is reacted with purine nucleoside phosphorylase and xanthine oxidase in the presence of inosine to eliminate generated hydrogen peroxide, and then, in the presence of glutamic acid, adenosine triphosphate and inosine, glutamine synthase. A method for quantifying ammonia in a sample, characterized by quantifying the generated hydrogen peroxide by reacting a protease, purine nucleoside phosphorylase and xanthine oxidase.
タラーゼを作用させて行い、かつグルタミン酸、アデノ
シン三リン酸およびイノシンの存在下、グルタミンシン
セターゼ、プリンヌクレオシドホスホリラーゼおよびキ
サンチンオキシダーゼを作用させると同時またはその前
にカタラーゼ阻害剤でカタラーゼ活性を失活させて行う
ものである請求項２に記載のアンモニアの定量方法。3. Elimination of hydrogen peroxide by the action of catalase in the presence of oxygen and the action of glutamine synthetase, purine nucleoside phosphorylase and xanthine oxidase in the presence of glutamic acid, adenosine triphosphate and inosine. The method for quantifying ammonia according to claim 2, wherein the catalase activity is deactivated with a catalase inhibitor at the same time as or before.
下にパーオキシダーゼを作用させると結合して色素とな
る二つの化合物の片方の化合物の存在下、パーオキシダ
ーゼを作用させて行い、かつグルタミン酸、アデノシン
三リン酸およびイノシンの存在下、グルタミンシンセタ
ーゼ、プリンヌクレオシドホスホリラーゼおよびキサン
チンオキシダーゼを作用させて生成する過酸化水素の定
量を、該片方の化合物およびもう片方の化合物の存在
下、パーオキシダーゼを作用させ生成する色素を定量し
て行うものである請求項２に記載のアンモニアの定量方
法。4. Elimination of hydrogen peroxide is carried out by allowing peroxidase to act in the presence of one of the two compounds that becomes a dye when combined with peroxidase in the presence of hydrogen peroxide. In addition, in the presence of glutamic acid, adenosine triphosphate and inosine, quantification of hydrogen peroxide produced by the action of glutamine synthetase, purine nucleoside phosphorylase and xanthine oxidase was performed in the presence of the one compound and the other compound. The method for quantifying ammonia according to claim 2, wherein the method is performed by quantifying a dye produced by the action of oxidase.
物、または発光化合物の存在下、パーオキシダーゼを作
用させ生成する色素、蛍光、または発光強度を定量して
行うものである請求項１または３に記載の方法。5. The method for quantitatively determining hydrogen peroxide in the presence of a chromogen, a fluorescent compound, or a luminescent compound by quantifying a dye, fluorescence, or luminescence intensity produced by the action of peroxidase. 4. The method according to 1 or 3.
ノシン、グルタミンシンセターゼ、プリンヌクレオシド
ホスホリラーゼおよびキサンチンオキシダーゼを含有す
るアンモニア定量用試薬。6. A reagent for the determination of ammonia containing glutamic acid, adenosine triphosphate, inosine, glutamine synthetase, purine nucleoside phosphorylase and xanthine oxidase.
選ばれる１つの化合物およびパーオキシダーゼを含有す
る請求項６に記載のアンモニア定量試薬。7. The reagent for determining ammonia according to claim 6, comprising one compound selected from a chromogen, a fluorescent compound and a luminescent compound, and peroxidase.
びグルタミンシンセターゼから選ばれる０、１または２
個の化合物、イノシン、プリンヌクレオシドホスホリラ
ーゼ、キサンチンオキシダーゼおよびカタラーゼを含有
する第一試薬並びに第一試薬に含有されない、グルタミ
ン酸、アデノシン三リン酸およびグルタミンシンセター
ゼからなる群より選ばれる化合物およびカタラーゼ阻害
剤を含有する第二試薬からなるアンモニア定量用試薬キ
ット。8. 0, 1 or 2 selected from glutamic acid, adenosine triphosphate and glutamine synthetase.
Compounds, inosine, purine nucleoside phosphorylase, a first reagent containing xanthine oxidase and catalase and not contained in the first reagent, a compound and a catalase inhibitor selected from the group consisting of glutamic acid, adenosine triphosphate and glutamine synthetase. A reagent kit for quantifying ammonia comprising a second reagent to be contained.
光化合物から選ばれる１つの化合物およびパーオキシダ
ーゼを含有する請求項８に記載の定量キット。9. The quantification kit according to claim 8, wherein the second reagent contains one compound selected from a chromogen, a fluorescent compound and a luminescent compound, and peroxidase.
よびグルタミンシンセターゼから選ばれる０、１または
２個以下の化合物、イノシン、プリンヌクレオシドホス
ホリラーゼ、キサンチンオキシダーゼ、パーオキシダー
ゼおよび過酸化水素の存在下にパーオキシダーゼを作用
させると結合して色素となる二つの化合物の片方の化合
物を含有する第一試薬並びに第一試薬に含有されない、
グルタミン酸、アデノシン三リン酸およびグルタミンシ
ンセターゼからなる群より選ばれる化合物および過酸化
水素の存在下にパーオキシダーゼを作用させると結合し
て色素となる二つの化合物のもう片方の化合物を含有す
る第二試薬からなるアンモニア定量用試薬キット。10. A method for producing peroxidase in the presence of 0, 1 or 2 or less compounds selected from glutamic acid, adenosine triphosphate and glutamine synthetase, inosine, purine nucleoside phosphorylase, xanthine oxidase, peroxidase and hydrogen peroxide. A first reagent containing one of the two compounds that becomes a dye by being acted upon, and not contained in the first reagent,
A second compound containing a compound selected from the group consisting of glutamic acid, adenosine triphosphate and glutamine synthetase, and the other of the two compounds that become dyes when peroxidase is acted on in the presence of hydrogen peroxide. A reagent kit for the determination of ammonia consisting of reagents.
定量する方法であって、該物質または酵素がアンモニア
生成に関与するものであり、該試料にグルタミン酸、ア
デノシン三リン酸およびイノシンの存在下、グルタミン
シンセターゼ、プリンヌクレオシドホスホリラーゼおよ
びキサンチンオキシダーゼを作用させ、生成する過酸化
水素を消去した後、物質または酵素を直接または間接的
にアンモニアに変換する試薬、グルタミン酸、アデノシ
ン三リン酸およびイノシンの存在下、グルタミンシンセ
ターゼ、プリンヌクレオシドホスホリラーゼおよびキサ
ンチンオキシダーゼを作用させ生成する過酸化水素を定
量することを特徴とする物質または酵素の定量方法。11. A method for quantifying a substance or an enzyme to be quantified in a sample, wherein the substance or the enzyme is involved in ammonia production, and wherein the sample or glutamic acid, adenosine triphosphate and inosine are present in the sample. , Glutamine synthetase, purine nucleoside phosphorylase and xanthine oxidase to act to eliminate the hydrogen peroxide produced and then directly or indirectly convert the substance or enzyme to ammonia, glutamic acid, adenosine triphosphate and inosine A method for quantifying a substance or an enzyme, characterized by quantifying hydrogen peroxide produced by the action of glutamine synthetase, purine nucleoside phosphorylase and xanthine oxidase.
カタラーゼを作用させて行い、かつ物質または酵素を直
接または間接的にアンモニアに変換する試薬、グルタミ
ン酸、アデノシン三リン酸およびイノシンの存在下、グ
ルタミンシンセターゼ、プリンヌクレオシドホスホリラ
ーゼおよびキサンチンオキシダーゼを作用させると同時
またはその前にカタラーゼ阻害剤でカタラーゼ活性を失
活させて行うものである請求項１１に載のアンモニアの
定量方法。12. Elimination of hydrogen peroxide in the presence of oxygen
Simultaneous with the action of glutamine synthetase, purine nucleoside phosphorylase and xanthine oxidase in the presence of glutamic acid, adenosine triphosphate and inosine, a reagent that performs the reaction with catalase and converts the substance or enzyme directly or indirectly into ammonia. The method for quantifying ammonia according to claim 11, wherein the method is carried out by inactivating catalase activity with a catalase inhibitor before that.
在下にパーオキシダーゼを作用させると結合して色素と
なる二つの化合物の片方の化合物の存在下、パーオキシ
ダーゼを作用させて行い、かつ物質または酵素を直接ま
たは間接的にアンモニアに変換する試薬、グルタミン
酸、アデノシン三リン酸およびイノシンの存在下、グル
タミンシンセターゼ、プリンヌクレオシドホスホリラー
ゼおよびキサンチンオキシダーゼを作用させ生成する過
酸化水素の定量を、該片方の化合物およびもう片方の化
合物の存在下、パーオキシダーゼを作用させ生成する色
素を定量して行うものである請求項１１に記載のアンモ
ニアの定量方法。13. Elimination of hydrogen peroxide is carried out by allowing peroxidase to act in the presence of one of the two compounds that becomes a dye when combined with peroxidase in the presence of hydrogen peroxide. And in the presence of glutamic acid, adenosine triphosphate and inosine, a reagent for directly or indirectly converting a substance or an enzyme into ammonia, glutamine synthetase, purine nucleoside phosphorylase and xanthine oxidase are used to determine the amount of hydrogen peroxide produced. The method for quantifying ammonia according to claim 11, wherein the method is performed by quantifying a dye produced by the action of peroxidase in the presence of the one compound and the other compound.
合物または発光化合物の存在下、パーオキシダーゼを作
用させ生成する色素、蛍光または発光強度を定量して行
うものである請求項１１に記載の方法。14. The method according to claim 11, wherein the determination of hydrogen peroxide is carried out by quantifying a dye, a fluorescence or a luminescence intensity produced by the action of peroxidase in the presence of a chromogen, a fluorescent compound or a luminescent compound. The described method.
イノシン、グルタミンシンセターゼ、プリンヌクレオシ
ドホスホリラーゼ、キサンチンオキシダーゼおよび定量
すべき物質または酵素を直接または間接的にアンモニア
に変換する試薬を含有する物質または酵素の定量用試
薬。15. Glutamate, adenosine triphosphate,
A reagent for quantifying a substance or an enzyme comprising inosine, glutamine synthetase, purine nucleoside phosphorylase, xanthine oxidase and a reagent for directly or indirectly converting the substance or enzyme to be quantified into ammonia.
から選ばれる１つの化合物およびパーオキシダーゼを含
有する請求項１５に記載のアンモニア定量試薬16. The reagent for quantitatively determining ammonia according to claim 15, comprising one compound selected from a chromogen, a fluorescent compound and a luminescent compound, and peroxidase.
グルタミンシンセターゼ、イノシン、プリンヌクレオシ
ドホスホリラーゼ、キサンチンオキシダーゼおよびカタ
ラーゼを含有する第一試薬並びに定量すべき物質または
酵素を直接または間接的にアンモニアに変換する試薬お
よびカタラーゼ阻害剤を含有する第二試薬からなる物質
または酵素の定量用試薬キット。17. Glutamate, adenosine triphosphate,
Consists of a first reagent containing glutamine synthetase, inosine, purine nucleoside phosphorylase, xanthine oxidase and catalase, a reagent for directly or indirectly converting a substance or enzyme to be quantified into ammonia, and a second reagent containing catalase inhibitor Reagent kit for the quantification of substances or enzymes.
び発光化合物から選ばれる１つの化合物およびパーオキ
シダーゼを含有する請求項１７に記載の定量キット。18. The kit according to claim 17, wherein the second reagent contains one compound selected from a chromogen, a fluorescent compound and a luminescent compound and peroxidase.
グルタミンシンセター、イノシン、プリンヌクレオシド
ホスホリラーゼ、キサンチンオキシダーゼ、パーオキシ
ダーゼおよび過酸化水素の存在下にパーオキシダーゼを
作用させると結合して色素となる二つの化合物の片方の
化合物を含有する第一試薬並びに定量すべき物質または
酵素を直接または間接的にアンモニアに変換する試薬お
よび過酸化水素の存在下にパーオキシダーゼを作用させ
ると結合して色素となる化合物のもう片方の化合物を含
有する第二試薬からなる物質または酵素の定量用試薬キ
ット。19. Glutamate, adenosine triphosphate,
Glutamine synthetase, inosine, purine nucleoside phosphorylase, xanthine oxidase, peroxidase and a first reagent containing one of the two compounds that become a dye when combined with peroxidase in the presence of hydrogen peroxide, and quantification It consists of a reagent that directly or indirectly converts the substance or enzyme to be converted to ammonia and a second reagent containing the other compound of the compound that becomes a dye by binding peroxidase in the presence of hydrogen peroxide Reagent kit for the quantification of substances or enzymes.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP11064434A JP2000253898A (en) | 1999-03-11 | 1999-03-11 | Quantitative determination of substance or enzyme, and quantitative determining reagent |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP11064434A JP2000253898A (en) | 1999-03-11 | 1999-03-11 | Quantitative determination of substance or enzyme, and quantitative determining reagent |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
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