JP2000046825A - 血液検査用容器 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 血液を短時間で凝固させることができ、しか
も、長期間にわたり品質が安定である血液凝固促進剤を
封入した血液検査用容器を提供する。 【解決手段】 一端が開口し他端が閉塞した有底管と上
記有底管の開口を密封する栓体とからなる血液検査用容
器であって、タンパク質折り畳み因子、並びに、ペプチ
ド及び／又はペプチド様血液凝固促進剤が封入されてい
る血液検査用容器。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、血清生化学検査及
び血清免疫学検査等の臨床検査分野において用いられる
血液検査用容器に関する。

【０００２】

【従来の技術】病気の予防や診断の目的で血液検査が一
般に行われているが、血液検査の多くは血清生化学検
査、血清免疫学検査、血球検査等の血清検査である。そ
れらの検査に要する血清は、通常、血液検査用容器に採
取した血液を凝固させた後、遠心分離によって比重の異
なる血餅から、ピペットを用いて、又は、デカンテーシ
ョンにより分離し、採取している。

【０００３】血液の採取に用いられる血液検査用容器
は、従来から、ガラス製やポリスチレン、ポリメチルメ
タクレート、ポリエチレン、ポリエチレンテレフタレー
ト等の合成樹脂製のものが使用されている。しかし、被
験者から採取した血液が凝固するには比較的長時間を必
要とするものであり、血液凝固の時間が最も短いとされ
るガラス製容器でも４０〜６０分を必要とし、合成樹脂
製容器では４時間以上も要するものであった。

【０００４】従来は、採血後、検査結果が得られるまで
に２日以上を必要とするのが通常であり、被験者は結果
を知るために再来院しなければならなかった。また、特
に緊急に検査を実施する必要のある場合には、血液凝固
の時間が問題となることがあった。そこで、診察に際し
て重要な情報が得られるだけでなく、早期により有効な
治療を行えるという理由から、診察の待ち時間の３０〜
６０分程度の間に採血及び検査をして、結果を得ること
が望まれている。更に、近年、検査機器の進歩に伴っ
て、より迅速な検査が一層望まれている。

【０００５】血液凝固を短時間で行うために、血液凝固
剤の検討が従来よりなされている。血液の凝固は、血液
凝固第ＸＩＩ因子の活性化により開始し、その後多くの
反応段階を経て、最終的にフィブリノーゲンがフィブリ
ンに転化する複雑な経路を有するものである。

【０００６】特開平５―１５７７４７号公報には、血液
の凝固を促進する成分として、血液凝固反応系の最終段
階であるフィブリノーゲンがフィブリンヘ転化する反応
を促進するトロンビンや蛇毒酵素等の酵素系薬剤を用い
ることが記載されている。しかし、血液検査用容器とし
て合成樹脂製容器を用いた場合、血液凝固時間は１０分
程度に短縮されるが、運搬時、特に夏場での運搬時又は
保存している間に熱や水分等によりトロンビンの失活が
生じ、品質が不安定であるという問題があった。また、
他の血液凝固因子は、血液凝固促進効果は大であるが、
安定性が悪く、血液検査容器に収納した場合、品質が不
安定であるという問題があった。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、上記現状に
鑑み、血液を短時間で凝固させることができ、しかも、
長期間にわたり品質が安定である血液凝固促進剤を封入
した血液検査用容器を提供することを目的とする。

【０００８】

【課題を解決するための手段】本発明は、一端が開口し
他端が閉塞した有底管と上記有底管の開口を密封する栓
体とからなる血液検査用容器であって、タンパク質折り
畳み因子、並びに、ペプチド及び／又はペプチド様血液
凝固促進剤が封入されている血液検査用容器である。

【０００９】以下に本発明を詳述する。本発明の血液検
査用容器は、タンパク質折り畳み因子、並びに、ペプチ
ド及び／又はペプチド様血液凝固促進剤が封入されてい
る。本発明は、タンパク質折り畳み因子を血液凝固促進
剤とともに存在させることによって、熱等の影響によっ
て不活性化しやすい血液凝固促進剤の立体構造を維持及
び修複し、血液凝固促進剤の機能を維持させるものであ
る。

【００１０】上記タンパク質折り畳み因子としては、タ
ンパク質の立体構造を維持する作用又は構造変化をすば
やく修復する作用を有するものであれば特に限定され
ず、分子シャペロン、ペプチジルプロリル−シス−トラ
ンス−イソメラーゼ（以下、「ＰＰＩアーゼ」ともい
う）等が好適に用いられる。本発明において、更に、プ
ロテインジスルフィドイソメラーゼ（以下「ＰＤＩ」と
もいう）を併用すればより効果的である。ＰＤＩはタン
パク質の立体構造中に含まれるジスルフィド結合の形成
に関与する酵素群の総称である。

【００１１】上記分子シャペロンは、熱ショックタンパ
ク質の一種であり、細胞が温度変化等の様々な環境スト
レスにさらされた際に生産されるものである。上記分子
シャペロンは、原核生物、真核生物を問わず広く存在し
ており、特に大陽菌から生産される分子シャペロンとし
て、ＧｒｏＥが良く知られている。

【００１２】上記ＧｒｏＥは、タンパク質の種類を問わ
ず、ＡＴＰ存在下、非特異的にタンパク質の立体構造形
成に関与することが明らかにされている。例えば、上記
ＧｒｏＥの構成体であるＧｒｏＥＬは、７個のサブユニ
ットが環状に連なったドーナツ型構造が２段に重なっ
た、合計１４サブユニットからなる特徴的な構造を有し
ている。ＧｒｏＥＬはドーナツ構造の凹部に変性タンパ
ク質を捕捉し、ＡＴＰ等のヌクレオチドの消費と補助因
子であるＧｒｏＥＳの結合を伴って、効率的に正しい立
体構造のタンパク質へと折り畳むことが知られている。

【００１３】上記分子シャペロンとしては、上記以外
に、例えば、大腸菌のＤｎａｋ；酵母のＳｓａｌ−４
ｐ、Ｓｓｃｌｐ、Ｋａｒ２ｐＢｉｐ、Ｇｒｐ７８；ほ乳
類のｈｓｃ７０、ＨＳＰ５８、ＨＳＰ１０、ＨＳＰ９
０；カビ類のＨＳＰ６０；植物由来のｒｕｂｉｓｃｏ；
大腸菌のＳｅｃＢ等が挙げられる。

【００１４】上記ＰＰＩアーゼは、ポリペプチド鎖中の
構成アミノ酸であるプロリン残基のＮ末端側ペプチド結
合の回転を促進する作用を有する酵素である。このプロ
リン残基のＮ末端側ペプチド結合は、自由に回転でき
ず、自発的なシス−トランス異性化が起こりにくい。そ
の結果、構造変化が生じたタンパク質鎖の正常構造への
変換は、プロリンのシス−トランス異性化反応等が律速
となり、自発的な再生が阻害される。これに対して、上
記ＰＰＩアーゼは、上記プロリン残基のＮ末端側ペプチ
ド結合の回転を促進するため、タンパク質の高次構造の
再生を促進し、変性タンパク質を再生させることができ
る。

【００１５】上記ＰＰＩアーゼとしては、シクロフィリ
ン（Ｃｙｃｌｏｐｈｉｌｉｎ）（免疫抑制剤であるサイ
クロスポリンＡへの結合タンパク質）タイプ及びＦＫＢ
Ｐ（免疫抑制剤であるＦＫ５０６への結合タンパク質）
タイプのうち、いずれのＰＰＩアーゼも用いることがで
きる。

【００１６】上記ＰＰＩアーゼとしては特に限定され
ず、真核生物由来のものとしては例えば、ブタ由来の１
９ＫＰＰＩアーゼ、ショウジョウバエ由来のｎｉｎａＡ
産物、トマトやトウモロコシ等の高等植物由来のシクロ
フィリン（Ｃｙｃｌｏｐｈｉｌｉｎ）、アカパンカビ由
来のシクロフィリン（Ｃｙｃｌｏｐｈｉｌｉｎ）、Ｎｃ
−ＦＫＢＰ、酵母由来のシクロフィリン（Ｃｙｃｌｏｐ
ｈｉｌｉｎ）、ＣＲＧタンパク質、Ｓｃ−ＦＫＢＰ等が
挙げられる。また、例えば、シグマ社から市販されてい
るシクロフィリン（Ｃｙｃｌｏｐｈｉｌｉｎ）タイプの
ＰＰＩアーゼ（子牛肋腺由来）やＦＫＢＰタイプのＰＰ
Ｉアーゼ（ヒト由来）等が手軽に入手できる。

【００１７】上記ＰＰＩアーゼのなかで、真正細菌由来
のものとしては特に限定されず、例えば．大腸菌由来の
ＰＰＩアーゼ−α、ＰＰＩアーゼ−β等が挙げられる
（蛋白質核酸酵素 Ｖｏｌ．３６，Ｎｏ．１１（１９９
１））。

【００１８】上記分子シャペロン、ＰＰＩアーゼ等の折
り畳み因子は、真核生物、真正細菌又は古細菌由来のも
のを使用することができる。好ましくは、古細菌由来の
ものである。

【００１９】上記古細菌由来の分子シャペロンのうち、
ＨＳＰ６０に属する分子シャペロンは、大陽菌のＧｒｏ
Ｅと同様の作用を有するが、ＧｒｏＥＳに相当する補助
因子なしで同様の作用を示すことがわかっている。従っ
て、古細菌由来の分子シャペロンを大量に得ようとする
場合、補助因子の調製の手間が操作が省ける分、作業性
に優れる。

【００２０】一方、古細菌由来のＰＰＩアーゼは、随意
検討を重ねた結果、本来ＰＰＩアーゼが持つプロリン残
基のＮ末端側ペプチド結合シス−トランス異性化作用だ
けではなく、分子シャペロニン様のタンパク質凝集抑制
作用を併せ持つことがわかった。従って、古細菌由来の
ＰＰＩアーゼを用いることにより、タンパク質の折り畳
み作用を更に効果的に行うことが可能である。

【００２１】上記古細菌由来のタンパク質折り畳み因子
の種類は、大腸菌等の真正細菌と比較して少ない。その
ため、古細菌は最小限の種類の折り畳み因子でタンパク
質の折り畳みを発現することから、個々の折り畳み因子
のタンパク質に対する特異性が低く、汎用性が優れてい
ると期待される。そのタンパク質折り畳み効果は、分子
シャペロン、ＰＰＩアーゼ及びＰＤＩの各々の折り畳み
因子を組み合わせることによって更に向上することが期
待される。

【００２２】上記古細菌のうち、好熱性古細菌に属する
古細菌を用いることがより好ましい。好熱性古細菌由来
の折り畳み因子は熱安定性に優れているため、血液凝固
促進剤がより高温にさらされた場合に有利である。例え
ば、上記好熱性古細菌の中でも、メタノコッカス・サー
モリソトロフィカス（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ ｔ
ｈｅｍｏｌｉｔｈｏｔｒｏｐｈｉｃｕｓ）から得られた
分子シャペロンやＰＰＩアーゼ等のタンパク質折り畳み
因子は、熱安定性に優れており、９０℃及び１００℃と
いった高温条件下で放置しても失活しにくい。これまで
市販されている分子シャペロンやＰＰＩアーゼは、６５
℃でほとんど失活してしまうため高温条件下で用いるこ
とはできなかった。しかしながら、上記メタノコッカス
・サーモリソトロフィカス（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕ
ｓ ｔｈｅｍｏｌｉｔｈｏｔｒｏｐｈｉｃｕｓ）から得
られたものは、３７〜６５℃といった中温だけでなく、
８０〜９０℃といった高温条件下でも使用可能である。
また、メタノコッカス・ボルタエ（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏ
ｃｃｕｓ ｖｏｌｔａｅ）は、中温菌であるため、同菌
由来のタンパク質折り畳み因子は４〜４０℃の広い範囲
でＨＢｓ抗原を安定化する効果がある。更に、これらの
耐熱性タンパク質折り畳み因子の特徴は、その活性が長
期にわたって保存されるという点である。

【００２３】上記好熱性古細菌は、温泉地帯や海底の熱
水床といった高温な極限環境で生育する古細菌の総称で
あり、通常、５５℃以上の温度環境で生育する菌であ
る。

【００２４】上記好熱性古細菌としては特に限定され
ず、例えば、サーモプラズマ（Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍ
ａ）属、スルフォロバス（Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ）属、
スルフロコッカス（Ｓｕｌｆｕｒｏｃｏｃｃｕｓ）属、
デサルフォロバス（Ｄｅｓｕｌｆｏｒｏｂｕｓ）属、ア
シディアヌス（Ａｃｉｄｉａｎｕｓ）属、サーモプロテ
ウス（Ｔｈｅｒｍｏｐｒｏｔｅｕｓ）属、デスルフロコ
ッカス（Ｄｅｓｕｌｆｕｒｏｃｏｃｃｕｓ）属、サーモ
フィラム（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｌｕｍ）属、サーモディス
カス（Ｔｈｅｒｍｏｄｉｓｃｕｓ）属、ピロディクチウ
ム（Ｐｙｒｏｄｉｃｔｉｕｍ）属、スタフィロサーマス
（Ｓｔａｐｈｙｌｏｔｈｅｒｍｕｓ）属、サーモコッカ
ス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ）属、ピロコッカス（Ｐ
ｙｒｏｃｏｃｃｕｓ）属、アーカエオグロバス（Ａｒｃ
ｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ）属、ピロバクラム（Ｐｙｒｏｂ
ａｃｕｌｕｍ）属、スルフリスフェラ（Ｓｕｌｆｕｒｉ
ｓｐｈａｅｒａ）属、アエロパイラム（Ａｅｒｏｐｙｒ
ｕｍ）属、イグネオコッカス（Ｉｇｎｅｏｃｏｃｃｕ
ｓ）属、サーモスフェラ（Ｔｈｅｒｍｏｓｐｈａｅｒ
ａ）属、ハイパーサーマス（Ｈｙｐｅｒｔｈｅｒｍｕ
ｓ）属、スルフォフォーボコッカス（Ｓｕｌｆｏｐｈｏ
ｂｏｃｏｃｃｕｓ）属、カルドコッカス（Ｃａｌｄｏｃ
ｏｃｃｕｓ）属、フェログロバス（Ｆｅｒｏｇｌｏｂｕ
ｓ）属、ピクロフィラス（Ｐｉｃｒｏｐｈｉｌｕｓ）
属、メタノコッカス（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ）属
等が挙げられる。

【００２５】本発明に用いられる古細菌は、特にメタノ
コッカス（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ）属に所属する
古細菌が好ましい。上記メタノコッカス（Ｍｅｔｈａｎ
ｏｃｏｃｃｕｓ）属菌としては、メタノコッカス・サー
モリソトロフィカス（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ ｔ
ｈｅｒｍｏｌｉｔｈｏｔｒｏｐｈｉｃｕｓ；ＡＴＣＣ３
５０９７）、メタノコッカス・ボルタエ（Ｍｅｔｈａｎ
ｏｃｏｃｃｕｓ ｖｏｌｔａｅ；ＡＴＣＣ３３２７
３）、メタノコッカス・デルタエ（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏ
ｃｃｕｓ ｄｅｌｔａｅ；ＡＴＣＣ３５２９４）、メタ
ノコッカス・フリシュス（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ
ｆｒｉｓｉｕｓ；ＡＴＣＣ４３３４０）、メタノコッ
カス・マリパルディス（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ
ｍａｒｉｐａｌｕｄｉｓ；ＡＴＣＣ４３０００）、メタ
ノコッカス・バンニエリ（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ
ｖａｎｎｉｅｌｉｉ；ＡＴＣＣ３５０８９）等が挙げ
られる。なかでもメタノコッカス・サーモリソトロフィ
カス（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｌｉ
ｔｈｏｔｒｏｐｈｉｃｕｓ）又はメタノコッカス・ボル
タエ（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ ｖｏｌｔａｅ）が
より好ましい。

【００２６】本発明において、上記折り畳み因子は、真
核生物、真正細菌又は古細菌から調製したものを直接精
製して得ることができる。また、真核生物、真正細菌又
は古細菌から調製したＤＮＡから発現されたものを用い
ることができる。

【００２７】上記折り畳み因子を真核生物、真正細菌又
は古細菌から直接調製する方法としては、真核生物、真
正細菌又は古細菌を適当な培地及び培養条件下で培養
し、培養した菌体を破砕後、イオン交換クロマトグラフ
ィー、疎水クロマトグラフィー等の従来公知の精製方法
によって得る方法が挙げられる。

【００２８】本発明においては、上記真核生物、真正細
菌又は古細菌の折り畳み因子をコードするＤＮＡ塩基配
列をクローニングし、大腸菌や酵母等の生育の速い生物
に組み込んで調製することが、大量に生産できるので好
ましい。具体的な手法としては、「新生物化学実験の手
引き」（化学同人社）等に記載された遺伝子実験プロト
コール等の常法を応用することで充分である。

【００２９】上記ＤＮＡ塩基配列としては、例えば、メ
タノコッカス・サーモリソトロフィカス（Ｍｅｔｈａｎ
ｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｌｉｔｈｏｔｒｏｐｈｉ
ｃｕｓ）由来ＰＰＩアーゼについては特開平１０−９１
号公報に、同菌由来シャペロニンについては特願平９−
３５０６２３号公報に記載されている。メタノコッカス
・サーモリソトロフィカス（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕ
ｓ ｔｈｅｒｍｏｌｉｔｈｏｔｒｏｐｈｉｃｕｓ）由来
シャペロニンについては、配列表の配列番号１として、
そのアミノ酸配列については配列番号２として、それぞ
れ示す（Ｆｕｒｕｔａｎｉ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂ
ｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９９８，２７３，２８３９
９）。また、メタノコッカス・サーモリソトロフィカス
由来のＰＰＩアーゼのＤＮＡ配列を配列表の配列番号３
に、そのアミノ酸配列を配列番号４に示す。

【００３０】具体的には、上記古細菌としてメタノコッ
カス・サーモリソトロフィカス（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃ
ｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｌｉｔｈｏｔｒｏｐｈｉｃｕｓ）
を用いて、このシャペロニンを得る方法としては次の方
法が採用できる。即ち、工業技術院生命工学工業技術研
究所に寄託番号ＦＥＲＭ Ｐ―１６４３８として寄託さ
れているプラスミドｐＥＴＴＳＩは、メタノコッカス・
サーモリソトロフィカスのシャペロニンをコードする遺
伝子を含むプラスミドであるが、これを鋳型とし、適当
な制限酵素サイトを含むプライマーを用い、常法に従っ
てＰＣＲ法によって増幅させる。ＰＣＲ産物から得られ
る遺伝子の断片を、耐性マーカーを含むプラスミドに挿
入し、組み換えプラスミドで大腸菌や酵母等を形質転換
する。この形質転換体を培養し、培養菌体を破砕後、イ
オン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー
等の従来公知の精製方法によって、メタノコッカス・サ
ーモリソトロフィカスのシャペロニンを得ることができ
る。

【００３１】上記分子シャペロンの確認方法としては、
分子シャペロンはＡＴＰアーゼ活性を有するので、Ｌａ
ｎｚｅｔｔａ Ｐ．Ａ著、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ、
１００号、９５〜９７頁記載のＡＴＰアーゼ活性測定法
を用いることにより行うことができる。

【００３２】上記分子シャペロンは、サブユニット１４
〜１６個がドーナツ型２段構造を形成したオリゴマーと
して反応を起こす。即ち、オリゴマー体に変性タンパク
質が結合して折り畳み反応の結果、タンパク質が正常な
構造に戻り、その後オリゴマー体分子シャペロンから遊
離する。

【００３３】上記分子シャペロンのオリゴマー構造体を
形成、維持させたり、活性を発現させるには、通常、溶
液中に塩化マグネシウム（Ｍｇ²⁺）及び硫酸アンモニウ
ム、ＡＴＰ（アデノシン三リン酸）等のヌクレオチド、
並びに、塩化カリウムが必要である。特に、ＡＴＰは、
分子シャペロンとタンパク質が解離する際に不可欠な因
子である。また、上記硫酸アンモニウムは、オリゴマー
形成及び維持に必要な因子であり、活性の発現には塩化
カリウムが必要となる。上記塩化マグネシウム、硫酸ア
ンモニウム、ＡＴＰ及び塩化カリウムの反応液中におけ
る使用濃度としては特に限定されず、例えば、塩化マグ
ネシウム（Ｍｇ²⁺）は１〜２００ｍＭ、硫酸アンモニウ
ム及び塩化カリウムは１００〜５００ｍＭ、ＡＴＰは分
子シャペロンの濃度と同モル以上であることが好まし
く、例えば、０．５〜１０ｍＭの範囲が挙げられる。

【００３４】上記ＰＰＩアーゼ活性の確認方法として
は、α−キモトリプシン反応とのカップリングアッセイ
法により行うことができる。例えば、ＨＥＰＥＳ緩衝液
（ｐＨ７．８）中、Ｎ末端がＮ−スクシニル基及びＣ末
端がｐ−ニトロアニリドでそれぞれ修飾されたＮ−ｓｕ
ｃ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−ｐＮＡ又はＮ−
ｓｕｃ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−ｐＮＡのペ
プチド（最終濃度１７μＭ）を基質として、サンプルを
セルに注入した後、２５℃でインキュベートし、キモト
リプシン溶液を添加することにより反応を開始する。終
始攪拌下、ｐＮＡの遊離による３９０ｎｍの吸収増加を
モニターすることにより酵素活性を測定することができ
る。上記基質であるペプチドとしては、商品名「Ｎ−ｓ
ｕｃ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−ｐ−ｎｉｔｒ
ｏａｎｉｌｉｄｅ」（シグマ社製）の市販品を使用する
こともできる。

【００３５】上記タンパク質折り畳み因子は、血液凝固
促進剤とともに、血液検査用容器に封入されるものであ
る。上記血液凝固促進剤は、ペプチド及び／又はペプチ
ド様のものであり、好ましくは、血液凝固系因子、並び
に、ペブチド鎖のＡｒｇと任意のアミノ酸残基との結合
及び／又はＬｙｓと任意のアミノ酸残基との結合を加水
分解する加水分解酵素である。本明細書中において、ペ
プチド及び／又はペプチド様血液凝固促進剤とは、ペプ
チド性又はタンパク質性の血液凝固促進剤を意味するも
のであり、これに糖鎖、脂質、金属イオン等の他の成分
が結合したり、これらの他の成分と複合体等を形成した
りすることによって血液凝固促進作用を示すものをも含
むものである。

【００３６】上記血液凝固系因子としては、例えば、血
液凝固第Ｘ因子又は血液凝固第Ｘａ因子が挙げられる。
上記加水分解酵素としては、例えば、トリプシン、トロ
ンビン、蛇毒トロンビン様酵素等のセリンプロテアー
ゼ；カテプシンＢ，フィシン等のチオールプロテアー
ゼ；キニナーゼＩ等の金属プロテアーゼ等が挙げられ、
特にセリンプロテアーゼが好適に用いられる。

【００３７】上記ペプチド及び／又はペプチド様血液凝
固促進剤の量は、少なくなると血液凝固の時間が長くな
ったり血液凝固が不完全になることがあり、多くなると
検査値に悪影響を及ぼすおそれがあるので、血液１ｍＬ
当たり０．１〜１００単位（Ｉ．Ｕ．）が好ましく、
０．５〜５０単位（Ｉ．Ｕ．）がより好ましい。

【００３８】本発明において使用される血液検査用容器
は、一端が開口し他端が閉塞した有底管と上記有底管の
開口を密封する栓体とからなるものである。上記有底管
としては、ブラスチック製及びガラス製のものがあり、
その素材としては、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポ
リスチレン、ポリエチレンテレフタレート、ポリメチル
メタクリレート、ポリアクリロニトリル等の熱可塑性樹
脂；不飽和ポリエステル樹脂、エポキシ樹脂、エポキシ
−アクリレート樹脂等の熱硬化性樹脂；酢酸セルロー
ス、プロピオン酸セルロース、エチルセルロース、エチ
ルキチン等の変性天然樹脂；ソーダ石灰ガラス、リンケ
イ酸ガラス、ホウケイ酸ガラス等のケイ酸塩ガラス、石
英ガラス等のガラス；及び、これらを主成分とするもの
のいずれもが用いられる。

【００３９】上記有底管は、識別のために外面の一部が
着色されていてもよく、また採血量を計量するための目
盛りが設けられていても良い。上記有底管は、血液凝固
促進剤及びタンパク質折り畳み因子を封入する前に、予
め有底管内面にシリコンコーティングを施しておくこと
が好ましい。

【００４０】上記栓体としては、有底管の開口を密封す
るものであれば特に限定されず、例えば、ガスバリア性
が高いブチルゴム製の栓体等が挙げられる。

【００４１】本発明の血液検査用容器の製造方法として
は、例えば、以下のようにして作成することができる。
即ち、上記血液凝固促進剤を好適な緩衝液で希釈し、こ
れを血液凝固促進液とする。上記緩衝液は、血液凝固促
進剤に対して最適な緩衝液が適宜選択されるが、例え
ば、リン酸緩衝液、トリス緩衝液、グッド緩衝液、グリ
シン系緩衝液等の一般に用いられている緩衝液が好適に
用いられる。上記血液凝固促進液に上記タンパク質折り
畳み因子を添加し、所定時間インキュベートすることに
より、溶液中の血液凝固促進剤の立体構造を正常化す
る。

【００４２】上記溶液中におけるタンパク質折り畳み因
子のモル濃度は、血液凝固促進剤のモル濃度の０．０５
〜５００倍が好ましい。０．０５倍未満であると、期待
される効果が得られず、５００倍を超えると、検査時の
特異的な反応を阻止する場合がある。より好ましくは、
血液凝固促進剤のモル濃度の０．２〜１００倍である。

【００４３】上記タンパク質折り畳み因子を含む血液凝
固促進液を、有底管内面にスプレー等により吹き付け、
凍結乾燥及び滅圧乾燥等により乾燥させるか、又は、タ
ンパク質折り畳み因子を含む血液凝固促進液を有底管に
注入し、その後に、有底管開口部を密封することによ
り、本発明の血液検査用容器とすることができる。上記
血液検査用容器内には血清分離剤を充填しておくこと
が、検査時の作業性を向上することができるので、好ま
しい。

【００４４】本発明の血液検査用容器は、タンパク質折
り畳み因子が有するタンパク質の立体構造を維持及び修
復する機能を利用するものであり、熱等の影響によって
不活性化しやすい血液凝固促進剤の立体構造を維持及び
修複し、血液凝固促進剤の機能を維持する。その結果、
血液を短時間で凝固させることができ、しかも長期間に
わたり品質が安定である血液検査用容器を作成すること
が可能となる。

【００４５】

【発明の実施の形態】以下に実施例を掲げて本発明を更
に詳しく説明するが、本発明はこれら実施例のみに限定
されるものではない。参考例１に好熱性古細菌由来分子
シャペロン（シャペロニン）の調製方法の一例を記載し
たが、これに限定されるものではない。他の折り畳み因
子も公知の方法にて調製することができる。

【００４６】参考例１ 好熱性古細菌由来分子シャペロ
ン（シャペロニン）の調製 （１）発現プラスミドの構築及び大陽菌へのトランスフ
ォーメーション メタノコッカス・サーモリソトロフィカス（Ｍｅｔｈａ
ｎｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｌｉｔｈｏｔｒｏｐｈ
ｉｃｕｓ）のシャペロニンをコードする遺伝子の断片
を、工業技術院生命工学工業技術研究所にＦＥＲＭ Ｐ
−１６４３８として寄託されているプラスミドｐＥＴＴ
ＳＩを鋳型とし、配列表の配列番号５のフォワードプラ
イマー及び配列表の配列番号６のリバースプライマーを
用いるＰＣＲ法によって増幅させた。

【００４７】上記プライマーを用いるＰＣＲ法によって
増幅、回収された断片を、ＢａｍＨＩ、ＮｃｏＩで消化
後、同様の制限酵素処理が施された発現ベクターｐＥＴ
−１１ｄ（ストラティジェン社製）にライゲーションし
た。その後、これをＢＬ２１（ＤＥ３）株（ストラティ
ジェン社製）にトランスフォーメーションし、アンピシ
リン１００μｇ／ｍＬを含むＬＢ培地プレート（トリプ
トン１０ｇ、酵母エキス５ｇ、ＮａＣｌ１０ｇ／１Ｌ
（ｐＨ７．０）にて培養後、コロニーをピックアップ
し、グリセロールストックとした。

【００４８】（２）組み換え大腸菌からのシャペロニン
調製 アンピシリン１００μｇ／ｍＬを含むＬＢ培地（トリプ
トン１０ｇ、酵母エキス５ｇ、ＮａＣｌ１０ｇ／１Ｌ
（ｐＨ７．０））２００ｍＬに、上記発現プラスミドを
保持するＢＬ２１（ＤＥ３）株（組み換え大陽菌）一白
耳を接種し、３７℃で１６時間予備培養した。この培養
液を上記ＬＢ培地６リットルに植菌し、ジャーファメン
ターにより本培養を行った。本培養開始３時間後に、Ｉ
ＰＴＧ（和光純薬工業社製）を１ｍＭ濃度となるように
添加し、更に、培養を４時間継続した。培養終了後、遠
心分離にて菌を回収し、−３０℃にて凍結保存した。

【００４９】次に、回収した組み換え大陽菌を、５０ｍ
ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５／５ｍＭ Ｍｇ
Ｃｌ₂ 含有）に懸濁させ、超音波処理にて菌体破砕し
た。遠心分離にて上清を採取し、９０分問、６５℃の水
浴中にて加熱処理を行い、夾雑タンパク質を変性凝集さ
せ、遠心分離にて除去した。得られた上清に硫酸アンモ
ニウムを１．３Ｍ濃度になるように添加し、硫安塩析を
行った後、上清をＴＳＫｇｅｌ Ｅｔｈｅｒ−５ＰＷ
（東ソー社製）による疎水クロマトグラフィーにより精
製した。シャペロニンに相当するサイズのタンパク質が
存在するフラクションを回収し、２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ
（ｐＨ６．８）−ＫＯＨ、５％グリセロール緩衝液で透
析した。透析内液をＴＳＫｇｅｌ ＳｕｐｅｒＱ−５Ｐ
Ｗカラム（東ソー社製）による陰イオン交換クロマトグ
ラフィーにより精製した。シャペロニンに相当するサイ
ズのタンパク質が存在するフラクションを回収した後、
これを限外濃過によって濃縮し、濃縮液をＴＳＫｇｅｌ
Ｇ３０００ＳＷＸＬカラム（東ソー社製）によるゲル
濾過（流速：０．５ｍｌ／ｍｉｎ、展開液：２５ｍＭ
ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ６．８）、２５ｍＭ ＭｇＣ
ｌ₂ 、５％Ｇｌｙｃｅｒｏｌ）により精製し、メタノコ
ッカス・サーモリソトロフィカス由来のシャペロニンを
含むフラクションを得た。

【００５０】なお、シャペロニンの分子量は、ＳＤＳ−
ＰＡＧＥにおいて約６０ＫＤａであり、この分子量を有
する画分をトレースすることにより確認した。また、シ
ャペロニンはＡＴＰアーゼ活性を有するので、Ｌｉｌ
ｌ，Ｒ．，Ｄｏｗｈａｎ，Ｗ．＆Ｗｉｃｋｎｅｒ，Ｗ．
著、Ｃｅｌｌ、６０号２７１〜２８０頁記載のＡＴＰア
ーゼ活性測定法を用いることによりその活性を評価し
た。

【００５１】本フラクションに塩化マグネシウム、ＡＴ
Ｐ及び硫酸アンモニウムをそれぞれ５０ｍＭ、０．２５
ｍＭ及び３００ｍＭとなるように添加し、３０℃にて５
時間インキュベートした。この溶液を再度ゲル濾過に供
し、シャペロニンの１６量体フラクションを得た。この
画分を以下の実施例及び比較例に使用した。

【００５２】実施例１ 参考例１にて調製したシャペロニン１６量体２００ｍｇ
とトロンビン（持田製薬社製）１５ｍｇ（１６００Ｕ）
を５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ緩衝液／（５０ｍＭ
ＭｇＣｌ₂ 及び０．２５ｍＭ ＡＴＰ含有ｐＨ７．４）
に溶解し、全量１０ｇとした。内面をシリコンコーティ
ングした管状容器にこの水溶液１０ｍｇをスプレー後、
風乾させ、血液検査用容器を作成した。

【００５３】作成直後、２５℃にて７日保存後、１４日
保存後、及び、３０日保存後の血液検査用容器につい
て、それぞれ下記に方法に従って血液凝固時間を測定し
た。また、温度負荷試験として、作成した血液検査用容
器を、それぞれ、２５℃にて１０分、４０℃にて１０
分、６０℃にて１０分、及び、６０℃にて３０分加温し
て同様に血液凝固時間を測定した。結果を表１に示す。

【００５４】血液凝固時間測定方法 健常人の血液８ｍＬを上記血液検査用容器に採取し、採
取終了時点から血液が凝固するのに要した時間を測定し
た。血液凝固の判定は、血液検査用容器を傾けても血液
の上面が動かず、更に逆さに保っても血液が流れ出ない
時点とした。次いで、凝固した血液を２５℃、１３００
Ｇ（２５００ｒｐｍ）で５分間遠心分離し、分離された
血清中のフィブリンの有無を目視観察した。

【００５５】実施例２ 実施例１で用いたメタノコッカス・サーモリソトロフィ
カス（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｌｉ
ｔｈｏｔｒｏｐｈｉｃｕｓ）由来のシャペロニンの代わ
りに、メタノコッカス・ボルタエ（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏ
ｃｃｕｓ ｖｏｌｔａｅ）由来のシャペロニンを用いた
こと以外は、実施例１に従って検討を実施した。結果を
表１に示した。

【００５６】実施例３ 実施例１で用いたメタノコッカス・サーモリソトロフィ
カス（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｌｉ
ｔｈｏｔｒｏｐｈｉｃｕｓ）由来のシャペロニンの代わ
りに、特願平９−２３５９９９号公報記載の調製法に従
って得た同菌由来のＰＰＩアーゼ５ｍｇを用い、５０ｍ
Ｍ ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ緩衝液中に５０ｍＭ ＭｇＣｌ
₂ 及び０．２５ｍＭ ＡＴＰを含有しなかったこと以外
は実施例１と同様に検討を実施した。結果を表１に示し
た。

【００５７】実施例４ 実施例１で用いたトロンビンの代わりに、ヒト由来の血
液凝固第Ｘａ因子（ＳＥＲＢＩＯ社製）を１ｍｇ（８０
０Ｕ）用いたこと以外は実施例１と同様に検討を実施し
た。結果を表１に示した。

【００５８】比較例１ トロンビン（持田製薬社製）１５ｍｇを５０ｍＭ ＨＥ
ＰＥＳ−ＫＯＨ緩衝液に溶解し、全量１０ｇとした。内
面をシリコンコーティングした管状容器にこの水溶液を
１０ｍｇをスプレー後、風乾させ、血液検査用容器を作
成し、実施例１と同様に検討を実施した。結果を表１に
示した。

【００５９】比較例２ 比較例１で用いたトロンビンの代わりに、ヒト由来の血
液凝固第Ｘａ因子（ＳＥＲＢＩＯ社製）を１ｍｇ（８０
０Ｕ）用いたこと以外は比較例１と同様に検討を実施し
た。結果を表１に示した。

【００６０】

【表１】

【００６１】

【発明の効果】本発明は、上述の通りであるので、ペプ
チド及び／又はペプチド様血液凝固促進剤とタンパク質
折り畳み因子を併用することにより、血液を短時間で凝
固させることができ、しかも長期間にわたり品質が安定
である血液凝固促進剤を封入した血液検査用容器を提供
することができる。

【００６２】

【配列表】 <110> 積水化学工業株式会社 SEKISUI CHEMICAL CO., LTD. 株式会社海洋バイオテクノロジー研究所 Marine Biotechnology Institute Co., Ltd. <120> 血液検査用容器 <130> 99P01525 <150> JP P1998-144507 <151> 1998-05-26 <160> 6 <210> 1 <211> 1680 <212> DNA <213> Methanococcus thermolithotrophicus DSM 2095 strain <220> <221> CDS <222> 32..1663 <400> 1 tctaatacac ttataaaaaa ggggtgaaat c atg gca gct aac cag cca gta 52 Met Ala Ala Asn Gln Pro Val 1 5 gta gta tta cct gaa aac gta aaa aga ttt atg gga aga gat gct caa 100 Val Val Leu Pro Glu Asn Val Lys Arg Phe Met Gly Arg Asp Ala Gln 10 15 20 aga atg aac atc tta gca gga aga att atc ggt gag aca gta aga tcc 148 Arg Met Asn Ile Leu Ala Gly Arg Ile Ile Gly Glu Thr Val Arg Ser 25 30 35 aca tta ggt cca aag gga atg gac aaa atg tta gta gat gat tta ggt 196 Thr Leu Gly Pro Lys Gly Met Asp Lys Met Leu Val Asp Asp Leu Gly 40 45 50 55 gac att gtt gtt aca aat gac ggt gtt aca atc tta aaa gaa atg agt 244 Asp Ile Val Val Thr Asn Asp Gly Val Thr Ile Leu Lys Glu Met Ser 60 65 70 gta gaa cac cca gca gct aaa atg tta att gaa gtt gca aaa aca caa 292 Val Glu His Pro Ala Ala Lys Met Leu Ile Glu Val Ala Lys Thr Gln 75 80 85 gaa aaa gaa gtt gga gac ggt aca aca aca gct gtt gtt atc gct ggt 340 Glu Lys Glu Val Gly Asp Gly Thr Thr Thr Ala Val Val Ile Ala Gly 90 95 100 gaa tta tta aga aaa gct gag gaa ttg tta gac caa aac gta cac cca 388 Glu Leu Leu Arg Lys Ala Glu Glu Leu Leu Asp Gln Lys Val His Pro 105 110 115 aca att gtt att aaa ggt tac cag tta gca gtt caa aaa gca caa gaa 436 Thr Ile Val Ile Lys Gly Thr Gln Leu Ala Val Gln Lys Ala Gln Glu 120 125 130 135 gta tta aaa gaa ata gca atg gat gta aaa gca gac gat aaa gaa ata 484 Val Leu Lys Glu Ile Ala Met Asp Val Lys Ala Asp Asp Lys Glu Ile 140 145 150 tta cac aaa ata gca atg acc tca att act gga aaa ggt gca gaa aaa 532 Leu His Lys Ile Ala Met Thr Ser Ile Thr Gly Lys Gly Ala Glu Lys 155 160 165 gct aaa gaa aaa ttg gga gaa atg atc gtt gaa gct gtt act gca gtt 580 Ala Lys Glu Lys Leu Gly Glu Met Ile Val Glu Ala Val Thr Ala Val 170 175 180 gta gac gaa agt gga aaa gtt gac aaa gat tta ata aaa atc gag aag 628 Val Asp Glu Ser Gly Lys Val Asp Lys Asp Leu Ile Lys Ile Glu Lys 185 190 195 aaa gaa gga gct tca gtt gac gaa acc gaa tta atc aat ggt gta tta 676 Lys Glu Gly Ala Ser Val Asp Glu Thr Glu Leu Ile Asn Gly Val Leu 200 205 210 215 ata gac aaa gaa aga gta agc cca caa atg cct aag aag ata gaa aac 724 Ile Asp Lys Glu Arg Val Ser Pro Gln Met Pro Lys Lys Ile Glu Asn 220 225 230 gca aag atc gca tta ttg aac tgc cca atc gaa gtt aaa gaa aca gaa 772 Ala Lys Ile Ala Leu Leu Asn Cys Pro Ile Glu Val Lys Glu tha Glu 235 240 245 aca gat gca gaa att aga atc aca gat cct aca aaa tta atg gaa ttc 820 Thr Asp Ala Glu Ile Arg Ile Thr Asp Pro Thr Lys Leu Met Glu Phe 250 255 260 att gaa caa gaa gaa aaa atg tta aaa gat atg gta gat acc ata aaa 868 Ile Glu Gln Glu Glu Lys Met Leu Lys Asp Met Val Asp Thr Ile Lys 265 270 275 gct tca gga gca aac gtt tta ttc tgc caa aaa ggt atc gat gac tta 916 Ala Gln His Tyr Asn Val Leu Phe Cys Gln Lys Gly Ile Asp Asp Leu 280 285 290 295 gca caa cac tac tta gca aaa gaa gga atc ctt gca gta aga aga gtc 964 Ala Gln His Tyr Leu Ala Lys Glu Glu Ile Leu Ala Val Arg Arg Val 300 305 310 aaa aaa tca gac atg gaa aaa tta tca aaa gct act gga gct aac gta 1012 Lys Lys Ser Asp Met Glu Lys Leu Ser Lys Ala Thr Gly Ala Asn Val 315 320 325 gta aca aac atc aaa gac tta aaa gct gaa gat tta ggg gaa gca gga 1060 Val Thr Asn Ile Lys Asp Leu Lys Ala Glu Asp Leu Gly Glu Ala Gly 330 335 340 att gta gaa gaa aga aaa att gct gga gac gca atg atc ttc gtt gaa 1108 Ile Val Glu Glu Arg Lys Ile Ala Gly Asp Ala Met Ile Phe Val Glu 345 350 355 gaa tgc aaa cat cca aaa gca gta aca atg tta ata aga ggt aca aca 1156 Glu Cys Lys His Pro Lys Ala Val Thr Met Leu Ile Arg Gly Thr Thr 360 365 370 375 gaa cac gta att gaa gaa gta gca aga gct gta gat gat gct att gga 1204 Glu His Val Ile Glu Glu Val Ala Arg Ala Val Asp Asp Ala Ile Gly 380 385 390 gtt gta gca tgt acc atc gaa gac ggt aag atc gtt gca ggt ggt gga 1252 Val Val Ala Cys Thr Ile Glu Asp Gly Lys Ile Val Ala Gly Gly Gly 395 400 405 gct gca gag ata gaa tta gca atg aaa tta aga gac tac gct gaa gga 1300 Ala Ala Glu Ile Glu Leu Ala Met Lys Leu Arg Asp Tyr Ala Glu Gly 410 415 420 gta agt gga aga gaa caa ttg gca gtt aga gca ttt gca gat gct tta 1348 Val Ser Gly Arg Glu Gln Leu Ala Val Arg Ala Phe Ala Asp Ala Leu 425 430 435 gaa gta gtt cca aga aca tta gca gaa aac gca ggt tta gat gca att 1396 Glu Val Val Pro Arg Thr Leu Ala Glu Asn Ala Gly Leu Asp Ala Ile 440 445 450 455 gaa atg ctc gtt aaa tta aga gct aaa cat gca gaa gga aat aac gca 1444 Glu Met Leu Val Lys Leu Arg Ala Lys His Ala Glu Gly Asn Asn Ala 460 465 470 tac tat ggg tta aac gtc ttc aca ggc gat gtt gaa aac atg act gaa 1492 Tyr Tyr Gly Leu Asn Val Phe Thr Gly Asp Val Glu Asn Met Thr Glu 475 480 485 aac gga gta gtt gaa cca tta aga gtt aaa act caa gct ata caa tca 1540 Asn Gly Val Val Glu Pro Leu Arg Val Lys Thr Gln Ala Ile Gln Ser 490 495 500 gct aca gaa gct aca gaa atg tta tta aga ata gac gat gta atc gct 1588 Ala Thr Glu Ala Thr Glu Met Leu Leu Arg Ile Asp Asp Val Ile Ala 505 510 515 gca gaa aaa tta agc ggc gga tct ggc gga gac atg gga gac atg ggc 1636 Ala Glu Lys Leu Ser Gly Gly Ser Gly Gly Asp Met Gly Asp Met Gly 520 525 530 535 gga atg gga ggt atg ggc gga atg atg taattccccc tacgtcc 1680 Gly Met Gly Gly Met Gly Gly Met Met 540 <210> 2 <211> 544 <212> PRT <213> Methanococcus thermolithotrophicus DSM 2095 strain <400> 2 Met Ala Ala Asn Gln Pro Val Val Val Leu Pro Glu Asn Val Lys Arg 1 5 10 15 Phe Met Gly Arg Asp Ala Gln Arg Met Asn Ile Leu Ala Gly Arg Ile 20 25 30 Ile Gly Glu Thr Val Arg Ser Thr Leu Gly Pro Lys Gly Met Asp Lys 35 40 45 Met Leu Val Asp Asp Leu Gly Asp Ile Val Val Thr Asn Asp Gly Val 50 55 60 Thr Ile Leu Lys Glu Met Ser Val Glu His Pro Ala Ala Lys Met Leu 65 70 75 80 Ile Glu Val Ala Lys Thr Gln Glu Lys Glu Val Gly Asp Gly Thr Thr 85 90 95 Thr Ala Val Val Ile Ala Gly Glu Leu Leu Arg Lys Ala Glu Glu Leu 100 105 110 Leu Asp Gln Lys Val His Pro Thr Ile Val Ile Lys Gly Thr Gln Leu 115 120 125 Ala Val Gln Lys Ala Gln Glu Val Leu Lys Glu Ile Ala Met Asp Val 130 135 140 Lys Ala Asp Asp Lys Glu Ile Leu His Lys Ile Ala Met Thr Ser Ile 145 150 155 160 Thr Gly Lys Gly Ala Glu Lys Ala Lys Glu Lys Leu Gly Glu Met Ile 165 170 175 Val Glu Ala Val Thr Ala Val Val Asp Glu Ser Gly Lys Val Asp Lys 180 185 190 Asp Leu Ile Lys Ile Glu Lys Lys Glu Gly Ala Ser Val Asp Glu Thr 195 200 205 Glu Leu Ile Asn Gly Val Leu Ile Asp Lys Glu Arg Val Ser Pro Gln 210 215 220 Met Pro Lys Lys Ile Glu Asn Ala Lys Ile Ala Leu Leu Asn Cys Pro 225 230 235 240 Ile Glu Val Lys Glu tha Glu Thr Asp Ala Glu Ile Arg Ile Thr Asp 245 250 255 Pro Thr Lys Leu Met Glu Phe Ile Glu Gln Glu Glu Lys Met Leu Lys 260 265 270 Asp Met Val Asp Thr Ile Lys Ala Gln His Tyr Asn Val Leu Phe Cys 275 280 285 Gln Lys Gly Ile Asp Asp Leu Ala Gln His Tyr Leu Ala Lys Glu Glu 290 295 300 Ile Leu Ala Val Arg Arg Val Lys Lys Ser Asp Met Glu Lys Leu Ser 305 310 315 320 Lys Ala Thr Gly Ala Asn Val Val Thr Asn Ile Lys Asp Leu Lys Ala 325 330 335 Glu Asp Leu Gly Glu Ala Gly Ile Val Glu Glu Arg Lys Ile Ala Gly 340 345 350 Asp Ala Met Ile Phe Val Glu Glu Cys Lys His Pro Lys Ala Val Thr 355 360 365 Met Leu Ile Arg Gly Thr Thr Glu His Val Ile Glu Glu Val Ala Arg 370 375 380 Ala Val Asp Asp Ala Ile Gly Val Val Ala Cys Thr Ile Glu Asp Gly 385 390 395 400 Lys Ile Val Ala Gly Gly Gly Ala Ala Glu Ile Glu Leu Ala Met Lys 405 410 415 Leu Arg Asp Tyr Ala Glu Gly Val Ser Gly Arg Glu Gln Leu Ala Val 420 425 430 Arg Ala Phe Ala Asp Ala Leu Glu Val Val Pro Arg Thr Leu Ala Glu 435 440 445 Asn Ala Gly Leu Asp Ala Ile Glu Met Leu Val Lys Leu Arg Ala Lys 450 455 460 His Ala Glu Gly Asn Asn Ala Tyr Tyr Gly Leu Asn Val Phe Thr Gly 465 470 475 480 Asp Val Glu Asn Met Thr Glu Asn Gly Val Val Glu Pro Leu Arg Val 485 490 495 Lys Thr Gln Ala Ile Gln Ser Ala Thr Glu Ala Thr Glu Met Leu Leu 500 505 510 Arg Ile Asp Asp Val Ile Ala Ala Glu Lys Leu Ser Gly Gly Ser Gly 515 520 525 Gly Asp Met Gly Asp Met Gly Gly Met Gly Gly Met Gly Gly Met Met 530 535 540 <210> 3 <211> 608 <212> DNA <213> Methanococcus thermolithotrophicus <220> <221> CDS <222> 82..543 <400> 3 tgtaataaat ccattaatcg tggtagcaat aataaaatat atataccaat acagtttgag 60 ttatgatatc gacataagca t gtg att ttt ttg gta gat aaa gga gtt aaa 111 Val Ile Phe Leu Val Asp Lys Gly Val Lys 1 5 10 ata aaa gta gac tac ata ggt aaa ctt gaa agt gga gat gtc ttt gac 159 Ile Lys Val Asp Tyr Ile Gly Lys Leu Glu Ser Gly Asp Val Phe Asp 15 20 25 act tcc ata gaa gag gta gca aaa gaa gct gga ata tac gcg cct gat 207 Thr Ser Ile Glu Glu Val Ala Lys Glu Ala Gly Ile Tyr Ala Pro Asp 30 35 40 aga gaa tat gaa cct cta gag ttc gtt gta gga gaa ggt cag ttg att 255 Arg Glu Tyr Glu Pro Leu Glu Phe Val Val Gly Glu Gly Gln Leu Ile 45 50 55 caa ggt ttt gaa gaa gct gtt tta gac atg gaa gtc ggg gac gaa aaa 303 Gln Gly Phe Glu Glu Ala Val Leu Asp Met Glu Val Gly Asp Glu Lys 60 65 70 acc gta aaa atc cct gca gag aaa gca tac ggt aac aga aat gaa atg 351 Thr Val Lys Ile Pro Ala Glu Lys Ala Tyr Gly Asn Arg Asn Glu Met 75 80 85 90 tta ata cag aaa ata cca aga gat gct ttt aaa gaa gct gat ttt gaa 399 Leu Ile Gln Lys Ile Pro Arg Asp Ala Phe Lys Glu Ala Asp Phe Glu 95 100 105 cct gaa gaa gga atg gta atc ctt gca gaa gga att cct gct aca ata 447 Pro Glu Glu GIy Met Val Ile Leu Ala Glu Gry Ile Pro Ala Thr Ile 110 115 120 acc gaa gtt aca gat aat gag gta act tta gac ttt aac cat gaa ctt 495 Thr Glu Val Thr Asp Asn Glu Val Thr Leu Asp Phe Asn His Glu Leu 125 130 135 gca gga aaa gat tta gta ttt aca att aaa att att gaa gtt gtc gaa 543 Ala Gly Lys Asp Leu Val Phe Thr Ile Lys Ile Ile Glu Val Val Glu 140 145 150 taattatcat tataacattc cgccgagatt aaataaaatc acttgtgatt ttatatcttt 603 acccg 608 <210> 4 <211> 154 <212> PRT <213> Methanococcus thermolithotrophicus <400> 4 Val Ile Phe Leu Val Asp Lys Gly Val Lys Ile Lys Val Asp Tyr Ile 1 5 10 15 Gly Lys Leu Glu Ser Gly Asp Val Phe Asp Thr Ser Ile Glu Glu Val 20 25 30 Ala Lys Glu Ala Gly Ile Tyr Ala Pro Asp Arg Glu Tyr Glu Pro Leu 35 40 45 Glu Phe Val Val Gly Glu Gly Gln Leu Ile Gln Gly Phe Glu Glu Ala 50 55 60 Val Leu Asp Met Glu Val Gly Asp Glu Lys Thr Val Lys Ile Pro Ala 65 70 75 80 Glu Lys Ala Tyr Gly Asn Arg Asn Glu Met Leu Ile Gln Lys Ile Pro 85 90 95 Arg Asp Ala Phe Lys Glu Ala Asp Phe Glu Pro Glu Glu GIy Met Val 100 105 110 Ile Leu Ala Glu Gry Ile Pro Ala Thr Ile Thr Glu Val Thr Asp Asn 115 120 125 Glu Val Thr Leu Asp Phe Asn His Glu Leu Ala Gly Lys Asp Leu Val 130 135 140 Phe Thr Ile Lys Ile Ile Glu Val Val Glu 145 150 <210> 5 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 配列表フリーテキスト フォワードプライマー <400> 5 ggccatggca gctaaccagc ca 22 <210> 6 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 配列表フリーテキスト リバースプライマー <400> 6 ccggatcctt acatcattcc gcccatac 28

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 土居 淳 大阪府三島郡島本町百山２−１ 積水化学 工業株式会社内 (72)発明者 古谷 昌弘 大阪府三島郡島本町百山２−１ 積水化学 工業株式会社内 (72)発明者 川辺 俊樹 大阪府三島郡島本町百山２−１ 積水化学 工業株式会社内 (72)発明者 山本 達夫 大阪府三島郡島本町百山２−１ 積水化学 工業株式会社内 (72)発明者 五十川 浩信 大阪府三島郡島本町百山２−１ 積水化学 工業株式会社内

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 一端が開口し他端が閉塞した有底管と前
   記有底管の開口を密封する栓体とからなる血液検査用容
   器であって、タンパク質折り畳み因子、並びに、ペプチ
   ド及び／又はペプチド様血液凝固促進剤が封入されてい
   ることを特徴とする血液検査用容器。
2. 【請求項２】 ペプチド及び／又はペプチド様血液凝固
   促進剤は、血液凝固第Ｘ因子又は血液凝固第Ｘａ因子で
   ある請求項１記載の血液検査用容器。
3. 【請求項３】 ペプチド及び／又はペプチド様血液凝固
   促進剤は、ペブチド鎖のＡｒｇと任意のアミノ酸残基と
   の結合及び／又はＬｙｓと任意のアミノ酸残基との結合
   を加水分解する加水分解酵素である請求項１記載の血液
   検査用容器。
4. 【請求項４】 タンパク質折り畳み因子は、分子シャペ
   ロン及び／又はペプチジルプロリル−シス−トランス−
   イソメラーゼである請求項１、２又は３記載の血液検査
   用容器。