ITUD20130002A1 - Sequenza artificiale di dna avente funzione di leader in 5' (5'-utr) ottimizzata per la sovraespressione di proteine ricombinanti in pianta e metodo per la produzione di proteine ricombinanti in pianta - Google Patents

Description

“SEQUENZA ARTIFICIALE DI DNA AVENTE FUNZIONE DI LEADER IN 5' (5'-UTR) OTTIMIZZATA PER LA SOVRAESPRESSIONE DI PROTEINE RICOMBINANTI IN PIANTA E METODO PER LA PRODUZIONE DI PROTEINE RICOMBINANTI IN PIANTAâ€

CAMPO DI APPLICAZIONE

Il presente trovato si riferisce ad una sequenza artificiale di DNA avente funzione di leader in 5' (5'-UTR) ottimizzata per la sovraespressione di proteine ricombinanti in pianta e ad un metodo per la produzione di proteine ricombinanti in pianta.

STATO DELLA TECNICA

Numerosi sono gli approcci che possono essere adottati al fine di migliorare l’espressione di geni eterologhi in pianta. Di fatto, tutti gli elementi che compongono un gene esercitano, o possono esercitare, una funzione di controllo dell’espressione genica, modulando il processo di trascrizione e/o di traduzione. Non fanno eccezione le sequenze non tradotte presenti alle estremità 5’ e 3’ dell’mRNA (denominate 5'-UTR e 3’-UTR, laddove UTR sta per “untraslated region†), le quali anzi devono essere considerate bersagli preferenziali di opportune modifiche in quanto determinano in larga misura l’efficienza traduzionale e lo stesso turn-over dell’mRNA. In effetti, numerose evidenze dimostrano che:

- la struttura m7Gppp (5’-cap) presente al terminale 5’ dell’mRNA à ̈ essenziale per il reclutamento del complesso eIF4F in grado di legare la subunità ribosomiale 40S (Gao et al., 2001; Frenks e Likke- Andersen, 2008);

- attraverso il componente eIF4G, il complesso eIF4F interagisce con la coda poli(A) presente al terminale 3’ dell’mRNA consentendo a quest’ultimo di assumere una struttura circolare (Frenks e Likke- Andrsen, 2008);

- coda poli(A) e complesso eIF4F riducono l’idrolisi enzimatica della struttura 5’-cap e dunque prevengono la rapida degradazione dell’mRNA da parte di esonucleasi citoplasmatiche attive sui terminali 5’ monofosfato (Frenks e Likke- Andrsen, 2008); - la sequenza 5’-UTR può contenere elementi in grado di influenzare la formazione della struttura 5’-cap, il legame di quest’ultima con il fattore eIF4E, il reclutamento della subunità ribosomiale 40S, la costituzione di polisomi, il tasso di dissociazione spontanea del complesso 43 S, il riconoscimento del codone autentico di inizio traduzione AUG;

- la sequenza 5’-UTR può inoltre contenere sequenze che rappresentano siti di legame al DNA per specifici fattori di trascrizione e dunque può modificare l’attività trascrizionale dei promotori a monte.

Appare dunque evidente la necessità di considerare in particolare la sequenza 5’-UTR, anche denominata regione leader, nei piani di ingegnerizzazione delle piante e ciò al fine di aumentare il livello di espressione di proteine ricombinanti.

Tuttavia, a causa di vari motivi, il design di sequenze leader a elevata efficienza non à ̈ affatto semplice, anche a un esperto del settore. In primo luogo, va considerata la grande variabilità di sequenza osservabile tra regioni leader di geni diversi appartenenti allo stesso genoma o a genomi correlati. Tale variabilità rende molto difficoltosa l’individuazione di potenziali tratti in grado di conferire un aspetto migliorativo al leader e praticamente impossibile la previsione delle eventuali interazioni con altri elementi o sequenze componenti la regione 5’-UTR. In secondo luogo, la lunghezza complessiva della regione leader deve essere contenuta possibilmente entro 100-120 bp, preferibilmente entro 80 bp, al fine di non incrementare la frequenza di dissociazione spontanea del complesso 43 S dalla regione medesima. Ciò impone una scelta stringente delle componenti effettivamente utilizzate nella costruzione del tratto leader, a discapito di altre. In terzo luogo, la regione leader non dovrebbe contenere sequenze palindrome o una composizione nucleotidica ricca in G/C ad evitare la formazione di strutture secondarie nel trascritto non risolvibili attraverso l’intervento di eIF4A. Infine, una porzione minoritaria ma comunque significativa della sequenza (10% ca.) non può variare liberamente ma contenere elementi funzionali essenziali, quali specificatamente il sito iniziatore Inr e il motivo di Kozak od equivalente motivo simil-Kozak.

Nella domanda WO 2008/080954 à ̈ stata descritta la combinazione di elementi ripetuti CAA con elementi ripetuti CT internamente a sequenze 5’-UTR utilizzabili per incrementare l’espressione di proteine ricombinanti in pianta. Ulteriormente, viene descritta anche la compresenza di poli(CAA) e poli(CT) con il sito di inizio trascrizione (Inr) del promotore 35S di CaMV, ovvero del virus del mosaico del cavolfiore (Guilley et al. 1982) e/o con l’ottamero ACAATTAC proveniente dal leader Ω di TMV (Gallie e Walbot 1992). In effetti, in WO 2008/080954 à ̈ descritta una sequenza leader denominata LLTCK contenente ad esempio tutti i sopracitati elementi:

1. Sito Inr del gene 35S CaMV per un efficiente capping dell’mRNA;

2. Regione poli(CAA) simile al “translational enhancer†presente nel leader Ω di TMV (Gallie e Walbot 1992);

3. Sequenza ricca in elementi CT, in analogia a molti leader vegetali (Bolle et al.

1996);

4. Ottamero del leader Ω di TMV.

L’effetto del leader LLTCK in WO 2008/080954 à ̈ stato valutato in tabacco, utilizzando come elemento di confronto il leader del gene 35S di CaMV presente in un ampio numero di vettori commerciali e valutando i livelli di espressione del gene reporter uidA (codificante per l’enzima β-glucuronidasi, GUS) posto sotto il controllo del promotore costitutivo 35S di CaMV. Il leader LLTCK ha determinato un aumento della concentrazione di enzima GUS pari a 8-12 volte rispetto alla controparte.

Vi à ̈ tuttavia una necessità di aumentare ulteriormente l’efficienza del tratto 5’-UTR per l’espressione di transgeni, e quindi di proteine ricombinanti, in pianta.

Per ovviare agli inconvenienti della tecnica nota e per ottenere questo ed ulteriori scopi e vantaggi, la Richiedente ha studiato, sperimentato e realizzato il presente trovato.

Salvo che siano definiti altrimenti, tutti i termini tecnici e scientifici utilizzati qui e di seguito hanno lo stesso significato comunemente inteso da una persona di ordinaria esperienza nel campo della tecnica cui appartiene il presente trovato. Anche se metodi e materiali simili o equivalenti a quelli qui descritti possono essere utilizzati nella pratica o nelle prove di verifica del presente trovato, di seguito sono descritti, a titolo di esempio, i metodi e i materiali. In caso di conflitto prevale la presente domanda, incluse le definizioni. I materiali, metodi ed esempi hanno carattere puramente illustrativo e non devono essere intesi in modo limitativo.

ESPOSIZIONE DEL TROVATO

Il presente trovato à ̈ espresso e caratterizzato nelle rivendicazioni indipendenti, mentre le rivendicazioni dipendenti espongono altre caratteristiche del presente trovato o varianti dell’idea di soluzione principale.

In accordo con il suddetto scopo, la presente descrizione riguarda il settore delle biotecnologie vegetali e tratta in particolare dell’innalzamento del livello produttivo di proteine ricombinanti in piante geneticamente modificate mediante impiego di leader artificiali opportunamente costruiti secondo la presente descrizione, ottenuti per sintesi artificiale e frutto di ingegno, in quanto non preesistenti in natura.

Forme di realizzazione qui descritte si riferiscono a DNA artificiale di una regione leader 5’-UTR per l’espressione di transgeni in pianta. Il DNA artificiale in accordo con aspetti della presente descrizione à ̈ efficace nell’aumentare l’espressione di transgeni in pianta e comprende, lungo la direzione 5’→3’, un sito iniziatore Inr ed una sequenza consenso Kozak o simil-Kozak rispettivamente ai terminali 5’ e 3’ corrispondenti. Il DNA artificiale in accordo con aspetti della presente descrizione comprende inoltre, tra il sito iniziatore Inr e la sequenza consenso Kozak o simil-Kozak, una pluralità di regioni poli(CAA) o (CAA)n, formate ciascuna da un oligonucleotide che consiste di due o più copie di un elemento CAA contigue l’una all’altra, ed una pluralità di regioni poli(CT) o (CT)min numero uguale alle regioni poli(CAA) e formate ciascuna da un oligonucleotide che consiste di due o più copie di un elemento CT contigue l’una all’altra, in cui almeno una, opzionalmente ciascuna, regione poli(CAA) à ̈, lungo la direzione 5’→3’, a monte, cioà ̈ in posizione 5’, di una regione poli(CT) ed almeno una regione poli(CAA) à ̈, lungo la direzione 5’→3’, contigua con una regione poli(CT).

In forme di realizzazione, il DNA artificiale prevede la presenza di sequenze non associabili a motivi ricchi in AT, cioà ̈ l’assenza di motivi ricchi in AT ovvero di tratti, o sequenze, composte da più di 3, opzionalmente più di 4, nucleotidi adenina e/o timina, in qualsiasi combinazione tra loro.

In forme di realizzazione il DNA artificiale prevede la presenza di sequenze non associabili a elementi trinucleotidici ATT, cioà ̈ l’assenza di elementi trinucleotidici ATT.

In forme di realizzazione il DNA artificiale prevede la presenza di sequenze non associabili a elementi trinucleotidici CTG, cioà ̈ l’assenza di elementi trinucleotidici CTG.

In forme di realizzazione, il DNA artificiale prevede l’assenza di tratti omopolimerici, ovvero di sequenze composte da più di 3, opzionalmente più di 4, nucleotidi uguali.

In forme di realizzazione, il valore di n può essere scelto uguale per le regioni poli(CAA) oppure può essere scelto in modo autonomo per le varie regioni poli(CAA), cioà ̈ può essere selezionato un valore di n differente per almeno una delle regioni poli(CAA) rispetto ad una o più altre regioni poli(CAA).

In forme di realizzazione, n à ̈ un numero intero maggiore od uguale a 2, opzionalmente compreso tra 3 e 9, opzionalmente tra 4 e 8, opzionalmente tra 5 e 7. In forme di realizzazione, per almeno una regione poli(CAA), n à ̈ uguale a 7, ad esempio per almeno due regioni poli(CAA) n à ̈ uguale a 7.

In forme di realizzazione, il valore di m può essere scelto uguale per le regioni poli(CT) oppure può essere scelto in modo autonomo per le varie regioni poli(CT), cioà ̈ può essere selezionato un valore di m differente per almeno una delle regioni poli(CT) rispetto al valore di m di una o più altre regioni poli(CT).

In forme di realizzazione, m può essere un numero intero maggiore od uguale a 2, opzionalmente compreso tra 3 e 5. Secondo alcuni aspetti, per almeno una regione poli(CT), m à ̈ uguale a 5. Secondo ulteriori aspetti, per almeno una regione poli(CT), m à ̈ uguale a 3. In possibili implementazioni, per una regione poli(CT), m à ̈ uguale a 5 e per un’ulteriore regione poli(CT), m à ̈ uguale a 3.

In forme di realizzazione, il DNA artificiale contiene due regioni poli(CAA) e due regioni poli(CT), di cui una regione poli(CAA) può essere contigua ad una regione poli(CT) ed eventualmente un’ulteriore regione poli(CAA) può non essere contigua con un’ulteriore regione poli(CT).

In forme di realizzazione, una prima regione poli(CAA) à ̈ a monte, cioà ̈ in posizione 5’, di una prima regione poli(CT) ed una seconda regione poli(CAA) à ̈ a valle di detta prima regione poli(CT) ed a monte, cioà ̈ in posizione 5’, di una seconda regione poli(CT).

In forme di realizzazione, la prima regione poli(CAA) Ã ̈ contigua con la prima regione poli(CT).

In altre forme di realizzazione, la prima regione poli(CAA) non à ̈ contigua con la prima regione poli(CT).

In forme di realizzazione, la seconda regione poli(CAA) Ã ̈ contigua con la prima regione poli(CT).

In altre forme di realizzazione, la seconda regione poli(CAA) non à ̈ contigua con la prima regione poli(CT).

In forme di realizzazione, la seconda regione poli(CAA) Ã ̈ contigua con la seconda regione poli(CT).

In altre forme di realizzazione, la seconda regione poli(CAA) non à ̈ contigua con la seconda regione poli(CT).

In forme di realizzazione, per la prima regione poli(CAA) il valore di n à ̈ uguale a 7, ovvero comprende 7 copie della tripletta CAA.

In forme di realizzazione, per la seconda regione poli(CAA) il valore di n à ̈ uguale a 7, ovvero comprende 7 copie della tripletta CAA.

In forme di realizzazione, per la prima regione poli(CT) di m à ̈ uguale a 5, ovvero comprende 5 copie del dinucleotide CT.

In forme di realizzazione, per la seconda regione poli(CT) il valore di m à ̈ uguale a 3, ovvero comprende 3 copie del dinucleotideCT.

In forme di realizzazione, tra la seconda regione poli(CAA) e la seconda regione poli(CT) Ã ̈ presente una sequenza AG. In forme di realizzazione, tra la seconda regione poli(CAA) e la seconda regione poli(CT) Ã ̈ presente esclusivamente la sequenza AG.

In forme di realizzazione, il sito iniziatore Inr à ̈ il sito di inizio trascrizione 5’-ACACG-3’ di CaMV 35S oppure à ̈ un sito iniziatore Inr con sequenza consenso 5’-YYANWYY-3’, in cui:

Y=C, T;

N=A, C, G, T;

W=A, T.

In possibili esempi realizzativi, il sito iniziatore Inr à ̈ 5’-TCACATC-3’.

In forme di realizzazione, tra il sito iniziatore Inr e la prima regione poli(CAA) lungo la direzione 5’→3’ à ̈ presente una sequenza AAGTTTC. In forme di realizzazione, tra il sito iniziatore Inr e la prima regione poli(CAA) lungo la direzione 5’→3’ à ̈ presente esclusivamente la sequenza AAGTTTC.

In forme di realizzazione, il DNA artificiale ha lunghezza compresa tra 40 e 150 bp.

In forme di realizzazione il DNA artificiale ha un contenuto in GC inferiore al 50%.

In forme di realizzazione, il DNA artificiale comprende la sequenza mostrata in SEQ ID NO: 1 oppure la sequenza mostrata in SEQ ID NO: 2, entrambe incluse nella “sequence listing†allegata.

Forme di realizzazione qui descritte sono relative ad un vettore di espressione comprendente DNA artificiale di una regione leader 5’-UTR efficace nell’aumentare l’espressione di proteine ricombinanti in pianta, in particolare ad esempio di proteine umane, in accordo con forme di realizzazione come qui descritte.

In forme di realizzazione, il vettore di espressione comprende:

i) un promotore endosperma-specifico di origine naturale o artificiale a monte, cioà ̈ in posizione 5’, di una sequenza nucleotidica di origine naturale o artificiale codificante la forma matura di una proteina;

ii) il DNA artificiale della regione leader 5’-UTR efficace nell’aumentare l’espressione di proteine ricombinanti in pianta come qui descritto;

iii) una sequenza nucleotidica di origine naturale o artificiale codificante un peptide segnale per l’invio della proteina ricombinante all’interno del lume del reticolo endoplasmico delle cellule componenti il tessuto dell’endosperma e per il suo accumulo tissutale;

iv) la sequenza nucleotidica di origine naturale o artificiale codificante la forma matura della proteina;

v) una regione 3’ UTR di origine naturale o artificiale.

In forme di realizzazione, il promotore i) Ã ̈ il promotore del gene per la glutelina 4 di riso (GluB4).

In forme di realizzazione, la sequenza nucleotidica dell’elemento iii) à ̈ la sequenza PSGluB4 codificante il peptide segnale utilizzato in riso per veicolare il precursore della glutelina 4 all’interno del reticolo endoplasmico.

In forme di realizzazione, la sequenza nucleotidica dell’elemento iv) à ̈ la sequenza GCasi codificante la forma umana matura dell’enzima beta-glucosidasi acida.

In forme di realizzazione, la regione 3’ UTR dell’elemento v) à ̈ il terminatore NOS o il terminatore del gene GluB4.

Forme di realizzazione qui descritte sono relative ad un ceppo batterico portante un plasmide contenente una sequenza di DNA artificiale come qui descritta, in particolare ad esempio scelto da un gruppo comprendente le specie Escherichia coli, Agrobacterium tumefaciens e Agrobacterium rhizogenes.

Forme di realizzazione qui descritte sono relative ad un ceppo di virus ingegnerizzato contenente una sequenza di DNA artificiale in accordo con forme di realizzazione come qui descritte, indipendentemente dal tipo di organismo ospite. Forme di realizzazione qui descritte sono relative a cellule vegetali trasformate con vettori di espressione contenenti la sequenza di DNA artificiale come qui descritta sotto il controllo di un promotore scelto da un gruppo comprendente un promotore costitutivo, un promotore tessuto-specifico e in particolare ad esempio seme-specifico, un promotore inducibile, un promotore con attività trascrizionale fase-dipendente, un promotore attivo in cloroplasto ed un promotore attivo in mitocondrio.

Forme di realizzazione qui descritte sono relative a piante caratterizzate dall’espressione transitoria di una qualsivoglia proteina il cui RNA messaggero contenga la sequenza di DNA artificiale come qui descritta, intendendo con espressione transitoria la produzione di detta proteina a mezzo di vettori virali, agroinfiltrazione, bombardamento con microparticelle, elettroporazione.

Forme di realizzazione qui descritte sono relative a piante dicotiledoni stabilmente trasformate con vettori di espressione contenenti la sequenza di DNA artificiale in accordo con forme di realizzazione come qui descritte.

In forme di realizzazione, le piante dicotiledoni comprendono una o più specie appartenenti alle famiglie delle Solanaceae, Papilonaceae e/o Cruciferae.

Forme di realizzazione qui descritte sono relative alla progenie delle piante dicotiledoni di cui sopra.

Forme di realizzazione qui descritte sono relative a piante monocotiledoni trasformate con vettori di espressione contenenti la sequenza di DNA artificiale in accordo con forme di realizzazione come qui descritte.

In forme di realizzazione, le piante monocotiledoni comprendono una o più specie appartenenti alla famiglia delle Graminaceae ( Poaceae ) quali ad esempio riso coltivato ( Oryza sativa L.), mais ( Zea mays L.), orzo ( Hordeum vulgare L.) e/o frumento ( Triticum spp.).

Forme di realizzazione qui descritte sono relative alla progenie delle piante monocotiledoni di cui sopra.

Forme di realizzazione sono relative alla sequenza di DNA artificiale in accordo con forme di realizzazione come qui descritte per un uso scelto da un gruppo comprendente:

- uso per la produzione biotecnologica di molecole;

- uso per la sintesi di proteine ricombinanti, in particolaread esempio finalizzata all’induzione di resistenza a patogeni virali, batterici o fungini, o finalizzata all’induzione di resistenza a diserbanti od ottenimento di una alterata composizione in acidi grassi nella materia prima e nei prodotti da essa derivati od ottenimento di un alterato valore nutrizionale della materia prima e dei prodotti da essa derivati o produzione di combustibili, gomme e/o bioplastiche;

- uso per la sintesi di enzimi industriali e proteine commerciali;

- uso per la sintesi di proteine farmaceutiche;

- uso per la sintesi di vaccini scelti da un gruppo comprendente: vaccini a somministrazione orale, destinati all’uomo o agli animali, vaccini iniettabili, destinati all’uomo o agli animali, vaccini iniettabili paziente-specifici, preferibilmente idiotipospecifici, da utilizzare nel trattamento di tumori del sistema linfatico;

- uso per la sintesi di proteine coinvolte nella produzione di metaboliti secondari; - uso per la sintesi di proteine utilizzabili in via diretta o indiretta come fattori di individuazione e/o selezione di cellule trasformate.

Forme di realizzazione qui descritte sono relative ad un seme di pianta trasformata per l’espressione di una proteina umana, in particolare ad esempio un enzima lisosomiale umano, contenente un vettore di espressione in accordo con forme di realizzazione come qui descritte.

Forme di realizzazione qui descritte sono relative ad un seme come sopra, per l’uso nel trattamento terapeutico, in particolare ad esempio per l’uso nel trattamento enzimatico di sostituzione, ancor più in particolare ad esempio nelle seguenti malattie: malattia di Gaucher, glicogenosi tipo II o malattia di Pompe, malattia di Fabry, malattia di Niemann-Pick B, Mucopolisaccaridosi I, II, IV.

Fonne di realizzazione sono relative ad un metodo per la produzione di proteine ricombinanti in pianta, comprendente la trasformazione delle piante utilizzando un vettore di espressione come qui descritto.

In forme di realizzazione, la trasformazione delle piante à ̈ efficace nel realizzare il confinamento della proteina in un endosperma non assorbito dall’ embrione e permettere che la presenza di elevati quantitativi della proteina nell’endosperma del seme non determini effetti negativi sulla germinabilità e sull’energia germinativa del seme.

In forme di realizzazione, il metodo prevede l’accumulo della proteina all’interno dell’endosperma del seme delle piante, in particolare ad esempio la proteina viene accumulata nell’endosperma all’ interno dei vacuoli di riserva proteica (Protein Storage Vacuoles, PSV) o nei corpi proteici (Protein Bodies, PB).

In forme di realizzazione, il vettore d’espressione viene introdotto in ceppi batterici, i quali sono utilizzati, direttamente od indirettamente, per la trasformazione delle piante, in cui il ceppo batterico può essere scelto in un gruppo comprendente le specie Escherichia coli, Agrobacterium tumefaciens e Agrobacterium rhizogenes. In forme di realizzazione, le piante trasformate sono cereali.

In forme di realizzazione, il ceppo batterico viene utilizzato per la trasformazione di calli embriogenici di riso ( Oryza sativa ssp .japonica).

In forme di realizzazione, la proteina ricombinante à ̈ un enzima lisosomiale, in particolare ad esempio la beta-glucosidasi acida umana, oppure ad esempio l’alfaglucosidasi acida umana.

In forme di realizzazione, il metodo comprende la lavorazione industriale del seme delle piante.

In forme di realizzazione, la lavorazione industriale del seme delle piante prevede di sottoporre i semi maturi raccolti da piante di cereali trasformate ad operazioni di sbramatura e sbiancatura per l' allontanamento della componente fibrosa, del germe, e dello strato aleuronico contenente proteine contaminanti.

In forme di realizzazione, il metodo comprende la purificazione della proteina ottenuta.

In forme di realizzazione, la purificazione prevede nell’ordine l’esecuzione di una cromatografia a interazioni idrofobiche, una cromatografia a scambio ionico e una gelfiltrazione.

In forme di realizzazione, la purificazione prevede l’applicazione di resine cromatografiche affini per composizione chimica e/o struttura e/o funzione, di parziale modificazione dei parametri di eluizione, di duplicazione di un passaggio per ricarico dell’ eluato in colonna.

ILLUSTRAZIONE DEI DISEGNI

Queste ed altre caratteristiche del presente trovato appariranno chiare dalla seguente descrizione di forme di realizzazione, fornite a titolo esemplificativo, non limitativo, con riferimento agli annessi disegni in cui:

- la Fig. 1 rappresenta la distribuzione dei valori ottenuti mediante saggio 4-MUG in piante di tabacco trasformate con pSTART e pSTART-STE;

- la Fig. 2 rappresenta la distribuzione del contenuto in proteina GCasi, valutato mediante saggio DAS-ELISA ed espresso in Î1⁄4g GCasi per grammo di farina di riso, in piante portanti il leader LLTCK e il leader STE;

- la Fig. 3 A rappresenta lo schema del vettore di espressione in tabacco pSTART-STE, dove:

RBR: righi border repeat

LBR: left border repeat

35S CaMV: promotore 35S del virus del mosaico del cavolfiore

GUS: proteina reporter

NOS ter: terminatore della Nopalina sintasi di Agrobacterium tumefaciens

- la Fig. 3B rappresenta il tratto sintetizzato artificialmente contenente una parte del promotore 35 S di CaMV (dal sito Sca I) e il leader STE;

- la Fig. 4A rappresenta lo schema dei vettori di espressione in riso pCAMBIA1300/PMI/GluB4-LLTCK/STE::GCasi::GluB4 ter; dove:

RBR: right border repeat

LBR: left border repeat

GluB4-LLTCK: promotore della glutelina 4 di riso con leader LLTCK

GluB4-STE: promotore della gluteiina 4 di riso con leader STE

GCasi: gene codificante per l’enzima beta-glucosidasi (hGCasi)

GluB4 ter: terminatore della gluteiina 4 di riso

35S prò: promotore 35 S di CaMV

PMI: gene codificante la fosfomannosio-isomerasi (marker di selezione delle piante trasformate)

35S ter: terminatore 35S di CaMV

- le Figg. 4B e 4C rappresentano rispettivamente il tratto sintetizzato artificialmente contenente la parte finale del promotore GluB4 (dal sito Bfr I) ed i leader LLTCK e STE.

DESCRIZIONE DI FORME DI REALIZZAZIONE

Nel tentativo di aumentare ulteriormente l’efficienza del tratto 5’-UTR per l’espressione di transgeni in pianta rispetto a quanto noto nella tecnica, à ̈ stata ideata una sequenza di DNA artificiale, denominata di seguito STE, sequenza STE o leader STE, contenente elementi trinucleotidi CAA ripetuti ed elementi dinucleotidici CT ripetuti, come insegnato da WO 2008/080954, la quale sequenza STE risulta ottimizzata per la sovraespressione di proteine ricombinanti in pianta.

E’ da notare che una tale sequenza STE ha determinato un aumento di espressione genica in due specie vegetali non affini e in associazione con promotori, terminatori e sequenze codificanti diversi.

Forme di realizzazione qui descritte prevedono DNA artificiale di una regione leader 5’-UTR efficace nell’aumentare l’espressione di proteine ricombinanti in pianta, comprendente lungo la direzione 5’→3’, una pluralità di regioni poli(CAA) o (CAA)„ ed una pluralità di regioni poli(CT) o (CT)min numero uguale alle regioni poli(CAA).

In forme di realizzazione, ciascuna regione poli(CAA) à ̈ formata da un oligonucleotide che consiste di due o più copie di un elemento CAA contigue l’una all’altra.

In forme di realizzazione, ciascuna regione poli(CT) à ̈ formata da un oligonucleotide che consiste di due o più copie di un elemento CT contigue l’una all’altra.

In forme di realizzazione, almeno una, opzionalmente ciascuna, regione poli(CAA) à ̈, lungo la direzione 5’— >3’, a monte, cioà ̈ in posizione 5’, di una regione poli(CT). In forme di realizzazione, almeno una regione poli(CAA) à ̈, lungo la direzione 5’→3’, contigua con una regione poli(CT).

In forme di realizzazione, n à ̈ un numero intero, che può essere selezionato uguale o differente tra le regioni poli(CAA), maggiore od uguale a 2, opzionalmente compreso tra 3 e 9, opzionalmente tra 4 e 8, opzionalmente tra 5 e 7. Ad esempio, il valore n può essere uguale per le regioni poli(CAA) ed essere, ad esempio, pari a 7. In forme di realizzazione, m à ̈ un numero intero, che può essere selezionato uguale o differente tra le regioni poli(CT), maggiore od uguale a 2, opzionalmente compreso tra 3 e 5. Ad esempio, il valore m può essere differente per le regioni poli(CT) ed essere, ad esempio, pari a 3 o 5.

Sebbene in generale i valori di n ed m possano essere selezionati differenti tra loro, possono essere previste anche alcune forme di realizzazione in cui i valori di n ed m sono selezionati uguali tra loro.

In possibili implementazioni, possono essere previste due regioni poli(CAA) e due regioni poli(CT). Lungo la direzione 5’→3’ può essere prevista una prima regione poli(CAA), una successiva prima regione poli(CT), contigua alla precedente prima regione poli(CAA), una successiva seconda regione poli(CAA), contigua alla precedente prima regione poli(CT) ed una successiva seconda regione poli(CT), non contigua seconda regione poli(CAA).

In forme di realizzazione, la sequenza STE può essere caratterizzata da aspetti migliorativi rispetto a WO 2008/080954 e riferibili ad uno o più dei seguenti aspetti, tesi a rendere la sequenza STE maggiormente affine, cioà ̈ compatibile, con un sistema di espressione eucariotico:

1. Assenza di motivi ricchi in AT ovvero di sequenze composte da più di 3, opzionalmente più di 4, nucleotidi adenina e/o timina, in qualsiasi combinazione tra loro;

2. Assenza di elementi trinucleotidici ATT;

3. Assenza di elementi trinucleotidici CTG;

4. Assenza di tratti omopolimerici ovvero di sequenze composte da più di 3, opzionalmente più di 4, nucleotidi uguali.

In altre parole, il DNA artificiale in accordo con la presente descrizione non contiene alcuno dei seguenti componenti: motivi ricchi in AT, elementi trinucleotidici ATT, elementi trinucleotidici CTG e tratti omopolimerici, ovvero di sequenze composte da più di 3, opzionalmente più di 4, nucleotidi uguali.

In forme di realizzazione, una sequenza di DNA artificiale qui descritta può contenere un sito Inr. Il sito Inr può avere sequenza 5’-YYANWYY-3’, con le limitazioni di cui ai precedenti punti 1. (assenza di motivi ricchi in AT) e 2. (assenza di elementi trinucleotidici ATT), laddove Y=C, T; N=A, C, G, T; W=A, T; in alternativa, il sito Inr potrà avere sequenza 5’-ACACG-3’ (sito di inizio trascrizione 35S di CaMV).

In forme di realizzazione, all’estremità 3’, la regione leader può contenere anche un contesto nucleotidico favorevole al riconoscimento del codone ATG autentico di inizio traduzione (motivo, o sequenza consenso, di Kozak o simil-Kozak). Un motivo, o sequenza consenso, di Kozak o simil-Kozak richiede la presenza di un elemento R che à ̈ una purina (adenina “A†o guanina “G†) in posizione 3 a monte del codone start di inizio trascrizione, per identificare il contesto appropriato per il riconoscimento del codone autentico di inizio trascrizione. Per posizione 3 a monte del codone start (o posizione -3) si intende una posizione 3 nucleotidi a monte dell’elemento “A†del codone ATG a cui à ̈ invece convenzionalmente assegnata posizione 1 . La sequenza Kozak o simil-Kozak può essere successiva e contigua ad esempio alla seconda regione poli(CT) di cui sopra discusso.

Inoltre, in forme di realizzazione la sequenza leader STE qui descritta può avere una lunghezza compresa tra 40 e 150 bp e può avere opzionalmente un contenuto in GC inferiore al 50%.

Un esempio di realizzazione di una sequenza leader, denominata SEQ ID No: 1, secondo forme di realizzazione à ̈:

(1) 5 ’ - AC ACG AAGTTTCC AAC A AC AAC A AC AAC A AC A ACTCTCTCTCTC AAC AACAACA ACAACAACAAAGCTCTCTAGA-3 ’

Un ulteriore esempio di realizzazione di una sequenza leader, denominata SEQ ID No: 2, secondo forme di realizzazione à ̈:

(2) 5’ -TC AC ATC AAGTTTCC A AC A AC A AC A AC A AC AAC AACTCTCTCTCTC A ACAACAACAACAACAACAAAGCTCTCTAGA-3’

In forme di realizzazione, la sequenza leader qui descritta, come ad esempio la SEQ ID No: 1 e la SEQ ID No: 2, può presentare in 5’ un sito iniziatore Inr, quale il sito di inizio trascrizione 35S di CaMV (SEQ ID No: 1, variante 1) oppure un sito Inr con sequenza consenso tipica dei geni eucarioti, 5’-YYA<+1>NWYY-3’, dove A<+1>rappresenta il primo nucleotide trascritto, Y=C, T; N=A, C, G, T; W=A, T (TCACATC in SEQ ID No: 2, variante 2). A valle del sito iniziatore, seguono blocchi estesi e alternati di poli(CAA) e poli(CT), ripetuti ad detto, inoltre, per favorire il riconoscimento del codone start ATG, al terminale 3’ può essere presente una sequenza Kozak o simil-Kozak (ad esempio in entrambe le varianti può essere inclusa in TCTAGA, corrispondente al sito di restrizione per Xba I).

Rispetto alla tipologia di leader descritta in WO 2008/080954, la sequenza di DNA artificiale qui descritta può prevedere, quindi, nuove specifiche per la realizzazipne di 5’-UTR artificiali. Tali specifiche, non previste in WO 2008/080954, si possono tradurre in precise modificazioni compositive e strutturali della regione leader e in nuove applicazioni preferenziali.

L’entità delle variazioni può essere desunta a titolo esemplificativo confrontando la sequenza LLTCK descritta in WO 2008/080954 con le varianti esemplificative di leader STE soprariportate. In quest’ultime non compaiono sequenze definibili come elementi ricchi in AT (“AU-rich elements†, AREs), né triplette ATT, presenti invece in LLTCK a valle del sito Inr, internamente e ai lati dell’ottamero del leader Ω di TMV.

Per dimostrare la maggiore efficienza del nuovo leader STE, à ̈ stato operato un confronto tra quest’ultimo e LLTCK descritto in WO 2008/080954, analizzando i livelli di espressione di due geni reporter in specie vegetali non affini, quali tabacco ( Nicotiana tabacum L.) e riso ( Oryza sativa L.).

In tabacco, il gene considerato à ̈ stato uidA (GUS) e i costrutti utilizzati per la trasformazione genetica, ovvero 35S-LLTCK::uidA::NOS ter (pSTART) e 35S-STE::uidA ::NOS ter (pSTART-STE), sono stati ottenuti mediante sostituzione della sequenza leader presente in pBI121 (Clontech) con LLTCK e STE, rispettivamente (Esempio 1). Più precisamente, oggetto della sostituzione e manipolazione à ̈ stata la sequenza di pBI121 compresa tra la regione Inr 35S di CaMV (ACACG), mantenuta comune a entrambi i costrutti, e il sito di restrizione Xba I (TCTAGA). I livelli di espressione del gene reporter sono stati valutati mediante saggio fluorimetrico 4-MUG (Jefferson et al. 1987), caratterizzato da notevole sensibilità, precisione, velocità e facilità di esecuzione. In particolare, per valutare quantitativamente l’espressione del gene GUS nelle piante trasformate, sono stati condotti saggi fluorimetrici su estratti proteici crudi derivati dalla spremitura di tre foglie giovani completamente distese. I valori di attività specifica per la β-glucuronidasi (GUS), espressi in milli-moli di 4-MU prodotto per mg di proteina, sono stati normalizzati in relazione alla concentrazione proteica totale calcolata mediante saggio Bradford. In Fig. 1 vengono presentati i dati ottenuti sulle piante trasformate con i due costrutti (media dei valori registrati per i tre estratti fogliari) ordinati in senso decrescente.

Sui dati riportati in Fig. 1 à ̈ stata condotta un’analisi statistica, nella fattispecie un’analisi della varianza (ANOVA) a un criterio di classificazione, i cui risultati sono riportati nella seguente Tab. 1.

Tab. 1: ANOVA effettuata sui dati medi ottenuti in piante trasformate con i costrutti 35S-LLTCK::uidA::NOS ter e 35S-STE::uidA::NOS ter.

_ RIEPILOGO _

_ Gruppi _ Conteggio Somma Media Varianza

pSTART 20 3,985 0,199 0,151

STE 23 12,973 0,564 0,514

ANALISI VARIANZA

Origine della variazione SQ_ gdl _ MQ_ F Valore di significatività Tra gruppi 1,424 1 1,424 4,119* P < 0,05 Entro gruppi 14,169 41 0,346 ;;Totale_ 15,593 42 ;;L’analisi ha mostrato 1’esistenza di differenze statisticamente significative (P < 0.05) tra le due popolazioni analizzate (pSTART e pSTART-STE). Dall’esame congiunto di Tab. 1 e Fig. 1 à ̈ possibile affermare che il leader STE determina incrementi non marginali dei livelli di espressione di uidA. In particolare, se si considerano i valori medi ottenuti nelle due popolazioni di piante trasformate, il leader STE conduce a un aumento dei livelli di espressione del gene reporter GUS di circa 2.8 volte rispetto a LLTCK. ;A conferma di quanto osservato in tabacco (specie modello per la classe delle dicotiledoni), sono stati svolti esperimenti anche in riso, cereale largamente utilizzato in ambito biotecnologico. Similmente a quanto effettuato nella prima specie, il confronto à ̈ stato attuato con due costrutti di espressione, a completa parità di altri elementi. In particolare, sono stati confrontati i seguenti vettori: ;pC AMBI A 1300/PMI/GluB4-LLTCK: : GCasi : : GluB4ter; ;pC AMBI A 1300/PMI/GluB4- STE: : GCasi : :GluB4ter. ;Si sottolinea tuttavia che in riso l’effetto di una diversa tipologia di leader à ̈ stato saggiato in un contesto di espressione seme-specifica, impiegando elementi di controllo differenti. Più precisamente, sono stati utilizzati il promotore della glutelina 4 di riso (GluB4) e il corrispondente terminatore (GluB4ter). Come gene reporter, à ̈ stato scelto hGCasi ovvero la sequenza codificante l’enzima umano beta-glucosidasi; la rilevazione della proteina ricombinante può essere effettuata con notevole sensibilità e precisione attraverso un saggio immunologico (DAS-ELISA). Per quanto riguarda la sequenza leader, in entrambi i vettori à ̈ stato utilizzato il sito Inr di GluB4 in quanto ricadente nella sequenza consenso eucariotica YYANWYY. Inoltre, il sito di inizio trascrizione del promotore 35S di CaMV appariva meno adatto in quanto tale virus attacca esclusivamente piante dicotiledoni. ;Ciascun vettore à ̈ stato inserito in Agrobacterium tumefaciens tramite elettroporazione per la trasformazione di Oryza sativa, var. CR W3 (Hiei et al. 1994). Sono state ottenute due popolazioni di piante transgeniche, ciascuna da 50 individui. I semi maturi di ciascuna pianta sono stati raccolti e sottoposti a estrazione di proteine totali. L’estratto proteico ottenuto à ̈ stato analizzato in DAS-ELISA per la valutazione del contenuto in GCasi. La Fig. 2 riporta la distribuzione dei dati ottenuti. L’analisi della varianza ha consentito di stabilire che le differenze di espressione del gene reporter riscontrate tra le due popolazioni di riso considerate sono statisticamente significative (Tab. 2). ;;Tab. 2: ANOVA effettuata sui dati ottenuti in piante trasformate con i costrutti pCAMBIA1300/PMI/GluB4-LLTCK::GCasi::GluB4ter e pCAMBIA1300/PMI/GluB4 -STE::GCasi::GluB4ter. ;;RIEPILOGO ;Gruppi Conteggio Somma Media Varianza ;LeaderSTE 50 5052,015 101,040 1714,609 ;Leade rLLTCK 50 1468,772 29,375 643,617 ;;ANALISI VARIANZA ;Origine della variazione_ SO_ gdl_ MQ_ F _ Valore di signiflcatività Tra gruppi 128396,3296 1 128396,330 108,892* P<0,05

Entra gruppi 115553,0807 98 1179,113

Total_ 243949,4102_ 99

Dalla Tabella 2 e dal grafico di Fig. 2 riportato in precedenza risulta che il leader STE porta a livelli di espressione sicuramente maggiori rispetto al leader LLTCK. In particolare, il leader STE determina un aumento dei livelli di espressione del gene reporter GCasi di circa 3.5 volte rispetto a LLTCK.

ESEMPI

Esempio 1 Realizzazione del vettore di espressione in tabacco pSTART-STE Punto di partenza per la realizzazione del vettore pSTART-STE à ̈ stato il vettore di espressione pSTART, ottenuto in un precedente lavoro (De Amicis et al. 2007). Quest’ultimo vettore, ricavato a sua volta da una del vettore originario pBI121 (Clontech), presenta una cassetta di espressione costituita dal promotore 35S di CaMV con leader LLTCK, dal gene codificante la proteina reporter GUS e dal terminatore NOS ter. Per ottenere pSTART-STE (Fig. 3A) si à ̈ proceduto alla sostituzione in pSTART del leader LLTCK con leader STE. A tal fine à ̈ stata sintetizzata artificialmente la sequenza corrispondente a una parte del promotore 35S (dal sito Sca I) a cui à ̈ stata aggiunta la sequenza del leader STE, nella fattispecie nella forma esemplificativa SEQ ID No: 1. Il tratto sintetizzato (702 bp, Fig. 3B) à ̈ stato sostituito in pSTART mediante digestione con gli enzimi di restrizione Sca I e Xba I, recupero del vettore e saldatura con DNA ligasi della nuova sequenza sintetizzata. Esempio 2: Realizzazione dei vettori di espressione con promotore GluB4 e leader LLTCK e STE

Le sequenze leader LLTCK e STE sono state sintetizzate artificialmente. In particolare, in entrambi i casi, il tratto sintetizzato à ̈ corrisposto alla sequenza compresa tra il sito Bfr I, presente nella parte terminale del promotore della glutelina 4 di riso (GluB4) e il sito Xba I, presente al 3’ dei leader stessi (Fig. 4B e 4C). Più precisamente, tale tratto à ̈ risultato pari a 328 bp per LLTCK (Fig. 1B), e 315 bp (Fig. 4C) per STE.

Per la realizzazione dei vettori di espressione finali si à ̈ preceduto attraverso una serie di sub-clonazioni intermedie che hanno permesso l’assemblaggio finale delle cassette di espressione. Nei diversi passaggi molecolari, si à ̈ proceduto in modo parallelo per i due leader.

Innanzitutto, si à ̈ eseguita la sostituzione del leader nativo a valle del promotore GluB4, con i leader sintetici LLTCK e STE. Punto di partenza à ̈ stato il vettore pGEM-T/GluB4-NAT, contenente il promotore della gluteiina 4 in fusione con il leader nativo (GenBank acc. n° AY427571). Il tratto terminale del promotore GluB4 (dal sito Bfr I) e il leader nativo sono stati eliminati mediante digestione con gli enzimi Bfr I e Xba I e sostituiti con la nuova sequenza sintetizzata. Sono stati in tal modo realizzati i due vettori intermedi pGEM-T/GluB4-LLTCK e pGEM-T/GluB4-STE, successivamente verificati tramite analisi PCR, digestione enzimatica e sequenziamento.

L’assemblaggio delle cassette di espressione finali à ̈ stato condotto a partire dal vettore pUC18/GluB4ter. Tale vettore à ̈ stato sottoposto a due sub-clonazioni successive per l’inserimento del complesso GluB4-LLTCK (o GluB4-STE) e del gene reporter, rispettivamente. In particolare, nella prima sub-clonazione, pUC18/GluB4ter à ̈ stato digerito con gli enzimi di restrizione Sph I e Xba I per la saldatura dei tratti GluB4-LLTCK e GluB4-STE, estratti dai vettori pGEM-T/GluB4-LLTCK e pGEM-T/GluB4-STE, rispettivamente. Nella seconda sub-clonazione, i vettori intermedi pUC18/GluB4-LLTCK::GluB4ter e pUC18/GluB4-STE::GLUB4ter sono stati aperti mediante digestione con Xba I e Sac I per l’inserimento del gene reporter (hGCasi), estratto a sua volta dal vettore pMS/hGCasi mediante gli stessi enzimi. Sono stati in tal modo ottenuti i due vettori pUC18 contenenti le cassette di espressione interamente assemblate, ovvero pUC18/GluB4-LLTCK::GCasi::GluB4ter e pUC18/GluB4-STE::GCasi::GluB4 ter.

Per la realizzazione dei vettori finali, le due cassette di espressione GluB4-LLTCK::GCasi::GluB4ter e GluB4-STE::GCasi::GluB4ter sono state singolarmente estratte, ad esempio mediante doppia digestione con Eco RI, dai rispettivi pUC18 e clonate nel vettore di espressione finale pCAMBIA1300/PMI in modo da costituire (Fig. 4A):

pC AMBI A 1300/PMI/GluB4-LLTCK: : GCasi : : GluB4ter e

pCAMBIA1300/PMI/GluB4-STE::GCasi::GluB4ter.

Esempio 3 : Trasformazione genetica di Nicotiana tabacum mediata da Agrobacterium tumefaciens

Per la trasformazione genetica del tabacco (Nicotiana tabacum, cv. Xanthi) mediata da A. tumefaciens à ̈ stato utilizzato il protocollo di Horsch e coll. (1985). Qui di seguito sono brevemente descritte le principali fasi dell’intera procedura.

Disinfezione dei semi

Per la preparazione di semi di tabacco da utilizzare nella trasformazione, Ã ̈ stata innanzitutto eseguita una disinfezione secondo il seguente protocollo:

In una provetta sterile da 2 mL mettere un piccolo quantitativo di seme. Aggiungere circa 1 mL di etanolo 95%. Tenere 2 min e agitare vigorosamente. Eliminare l’etanolo aiutandosi con una pipetta. Aggiungere 1 mL di ipoclorito 2 %. Lasciare in incubazione per 20 min, agitare, eliminare e aggiungere 1 mL di acqua sterile; risciacquare così i semi per 5 volte. Lasciare nella provetta l’acqua dell’ultimo risciacquo. Prelevare una certa quantità di seme e acqua, utilizzando un puntale a cui à ̈ stata asportata la punta in condizioni di sterilità, e disporla su substrato MS 10 in piastra o in baby jar.

Servendosi di un’ansa per batteriologia oppure di una pipetta Pasteur piegata a L, distribuire delicatamente i semi.

Porre le piastre a germinare alla luce in cella climatica a 28 °C.

Trasformazione con A. tumefaciens

La trasformazione di materiale fogliare di Î . tabacum mediante l’impiego di A. tumefaciens à ̈ stata svolta secondo le seguenti fasi:

• sotto cappa riempire 4-5 provette da 2 mL, con 1.8 mL di LB-broth sterile. Procedere all’ inoculo di A. tumefaciens prelevando con un stuzzicadenti sterile una quantità piccola ma visibile di colonia batterica cresciuta su piastra e stemperarla in una provetta; agitare in maniera vigorosa;

• prelevare una foglia di tabacco (piantine di circa un mese) e usando un foratappi sterile, ricavare dalla lamina fogliare dischi aventi diametro di 7 mm; con l’aiuto di una pinzetta, porre i dischetti su una piastra di substrato MS10; disporre 30 dischi per piastra. Per ogni ceppo batterico ottenere un totale di almeno 200 dischi. Preparare due piastre di controllo dove porre dischetti che non verranno infettati e che resteranno sempre su MS 10;

• attuare l’infezione dei dischetti con A. tumefaciens; versare sulla piastra contenente i dischetti il contenuto di una provetta, inoculata poco prima con il batterio. Agitare gentilmente con movimento rotatorio, in modo da bagnare tutti i dischi e rimuovere il liquido in eccesso con una pipetta. Sistemare in modo regolare i dischi aiutandosi con le pinzette;

<â– >incubare le piastre per una notte a illuminazione costante a temperatura di 28 °C in camera di crescita;

· trasferire su substrato MS10 Cefotaxime 500 mg/L i dischi fogliari;

• incubare le piastre per 6 giorni in condizione di illuminazione costante e temperatura di 24 °C;

• dopo 8 giorni dall’inizio della trasformazione, trasferire i dischi fogliari su substrato MS10 Cefotaxime 500 mg/L-Kanamicina 200 mg/L per la selezione dei calli trasformati. Incubare alle medesime condizioni per 14 giorni;

• tagliare i germogli costituiti da almeno due foglie, non chimerici e di aspetto normale e trasferirli su substrato per la radicazione (MS 0 con Cefotaxime 500 mg/L -Kanamicina 200 mg/L - IBA 2 mg/L);

• trasferire le piante radicate in terra o in coltura idroponica per la crescita, pulendo delicatamente le radici dal substrato di radicazione con acqua. Sistemare le piante in cella climatica di crescita mantenendo una temperatura di 26-30 °C, con fotoperiodo di 16 h luce/ 8 h di buio.

Esempio 4, Trasformazione genetica di Orvza sativa mediata da Aerobacterium tumefaciens

Per la trasformazione di riso, varietà CR W3, à ̈ stato utilizzato il protocollo di Hiei et al. (1994), modificato da Hoge (Rice Research Group, Institute of Plant Science, Leiden University) e Guiderdoni (programma Biotrop, Cirad, Montpellier, France) fino all’ottenimento dei calli trasformati. Per la successiva fase di selezione à ̈ stato applicato il protocollo di Datta e Datta (2006). Qui di seguito sono brevemente descritte le principali fasi dell’intera procedura.

Preparazione e sviluppo di calli embriogenici da scutello di riso

La trasformazione di riso à ̈ avvenuta su calli embriogenici derivati da saltello, Per indurre la proliferazione di calli da tessuto saltellare à ̈ stato utilizzato il seguente protocollo operativo:

• à ̈ stata eseguita la sbramatura (eliminazione delle glume) dei semi di riso;

• per eliminare potenziali patogeni e saprofiti contaminanti in grado di interferire con la produzione dei calli, si à ̈ proceduto alla disinfezione delle cariossidi private delle glume:

a. il primo trattamento di disinfezione ha previsto la permanenza dei semi sbramati per 2 min in una soluzione di etanolo al 70%;

b. dopo il passaggio in etanolo, i semi sono stati trasferiti in una soluzione di ipoclorito di sodio al 5% con 2 gocce di detergente Tween20 e ivi mantenuti in agitazione lenta per 30 min;

c. per eliminare ogni traccia di ipoclorito di sodio che avrebbe potuto inibire l’induzione a callo degli scutelli, sono stati eseguiti una serie di lavaggi in acqua sterile della durata di 15 min ciascuno;

• dopo aver effettuato l’ultimo lavaggio, i semi sono stati asciugati su carta bibula sterile;

• sulla superficie del substrato per l’induzione a callo (CIM, callus-induction medium), dispensato nel volume di 25 mL all’interno di piastre Petri (0 90 mm), sono stati posizionati 12 semi per piastra;

• le piastre così ottenute sono state incubate al buio, a una temperatura di 28 °C per 21 giorni; dopo 1 settimana di incubazione si à ̈ proceduto all’eliminazione dell’endosperma e della radichetta per favorire lo sviluppo del callo proveniente dallo saltello (lo saltello si riconosce per la sua massa compatta, parzialmente inclusa nell’endosperma di colorazione gialla);

<â– >dopo 3 settimane di induzione, si à ̈ operato il trasferimento del callo su substrato CIM rinnovato, a cui ha fatto seguito la frammentazione delle masse callose senza l’utilizzo di bisturi, seguendo le linee di fratturazione naturalmente presenti sul callo; · la sub-coltura à ̈ stata fatta proseguire per altri 10 giorni in modo da sviluppare il callo embriogenico e renderlo idoneo alla trasformazione.

Co-coltura dei calli con A. tumefaciens EHA 105

1. Per ottenere quantità sufficienti di A. tumefaciens per la trasformazione, il ceppo portante il plasmide contenente la cassetta di interesse e il gene per la fosfomannosio isomerasi sono stati incubati per 3 giorni a 30 °C in LB-agar;

2. ottenute le colture di agrobatterio, le relative patine di crescita batterica sono state prelevate e sospese nel mezzo liquido di co-coltura (CCML, co-cultivation medium liquid), fino a ottenere una O.D. 600 di circa 1.0, corrispondente a 3 -5 -10<9>cellule/mL; 3. i calli migliori, cioà ̈ quelli con un diametro di circa 2 mm, compatti e dal colore tendente al bianco, sono stati trasferiti in una piastra Petri contenente 35 mL di sospensione batterica e lasciati in immersione per 15 min in agitazione;

4. si à ̈ proseguito quindi all’asciugatura del callo utilizzando carta bibula sterile; 5. à ̈ stato disposto un numero massimo di 20 calli per piastra Petri high-edge (Sarstedt) contenente il substrato solido per la co-coltura (CCMS, co-cultivation medium solidified);

6. i calli sono stati quindi incubati in ambiente buio, a una temperatura di 25 °C per 3 giorni.

Selezione dei calli basata su PMI

Dopo aver effettuato la co-coltura dei calli embriogenici di riso assieme all’agrobatterio, si à ̈ proceduto alla selezione dei tessuti trasformati sfruttando il sistema di selezione basato su PMI (fosfomannosio isomerasi) come marker selezionabile e mannosio come agente selettivo. Tale metodo prevede l’impiego di substrati di coltura contenenti concentrazioni crescenti di mannosio e concentrazioni decrescenti di saccarosio.

La procedura impiegata à ̈ stata la seguente:

• trasferimento dei calli provenienti dalla co-coltura con A. tumefaciens su substrato PSM (pre-selection medium) privo di mannosio e contenente il 3% di saccarosio; incubazione per 1 settimana al buio a una temperatura di 28 °C;

• trasferimento dei calli su substrato di selezione SMI (selection medium I) contenente 2% saccarosio e 1.5% mannosio e incubazione al buio per 2 settimane a una temperatura di 28 °C;

• trasferimento dei calli su substrato di selezione SMII (selection medium II) contenente 1% saccarosio e 2% mannosio e incubazione al buio per 2 settimane a una temperatura di 28 °C;

segue rigenerazione.

Rigenerazione di piantine di riso da calli trasformati

La rigenerazione delle piantine putativamente trasformate à ̈ avvenuta grazie a un’opportuna stimolazione ormonale del callo trasformato seguendo la procedura qui riportata:

1. i calli embriogenici di riso selezionati sono stati trasferiti su piastre Petri high-edge contenenti il substrato per la pre-rigenerazione PRM (pre-regeneration medium) contenente 0.5% saccarosio e 2.5% mannosio e incubazione al buio per 2 settimane a una temperatura di 28 °C;

2. dopo il passaggio sul substrato PRM i calli sono stati trasferiti sul substrato per la rigenerazione RM (regeneration medium), privo di mannosio, nel numero massimo di 8-10 unità per piastra Petri high-edge. La crescita delle piantine à ̈ avvenuta in presenza di luce, a 28 °C per 3-4 settimane;

3. quando le piantine sono risultate sufficientemente grandi da poter essere separate dal callo (> 3 cm di altezza), si à ̈ proceduto al loro trasferimento in tubi di coltura contenenti 25 mL del substrato per la radicazione rm (rooting medium);

4. la sub-coltura all’interno dei tubi à ̈ proseguita per circa 3 settimane sempre a 28 °C alla luce;

5. a conclusione del processo rigenerativo, le piante sono state trasferite in torba e allevate in serra.

Esempio 5: Estrazione di proteine totali da tessuto fogliare di tabacco trasformato per saggio 4-MUG

La procedura di seguito descritta permette di produrre e conservare estratti fogliari di tabacco preservando l’attività enzimatica della proteina GUS per molto tempo. • In una provetta da 1.5 mL pesare 15 mg PVP (polivinilpirrolidone, MW >40000 g/mol) e aggiungervi 200 Î1⁄4L di tampone di estrazione (vedi Tab. 3), agitare mediante vortex e lasciare in incubazione a 4 °C per almeno 30 min;

• Estrarre il succo fogliare tramite pressa Meku Pollahne;

• Prelevare 100 pL di succo e addizionarlo alla miscela tampone-PVP, mantenendo il tutto in ghiaccio;

· Centrifugare per 15 min a 4 °C a 11500xg;

• Prelevare il surnatante (-200 pL) e trasferirlo molto rapidamente in una nuova provetta;

• Congelare immediatamente mediante azoto liquido e conservare a -80 °C.

Tab. 3: Composizione del tampone di estrazione

Componenti Quantità per 100 mL

NaHPO4pH 7.0 5 mL da stock 1 M

DTT 5 mM 0.5 mL da stock 1M

1 mM Na2EDTA 0.2 mL da stock 0.5 M

Sodium Lauryl Sarcosine 0.1% 1 mL da stock 10%

Triton X-100 0.1% 1 mL da stock 10%

A volume con H2O 100 mL

La procedura à ̈ stata applicata indistintamente su tutti i campioni sottoposti ad analisi fluorimetrica. Ciascuna pianta trasformata à ̈ stata analizzata in triplicato utilizzando estratti prelevati da 3 foglie in fase di distensione avanzata presenti nella parte apicale della pianta.

Esempio 6: Saggio fluorimetrico 4-MUG

Per una valutazione del contenuto di proteina reporter GUS negli estratti proteici fogliari ottenuti dalle piante trasformate, à ̈ stato effettuato un saggio fluorimetrico specifico. Il substrato impiegato à ̈ il 4-Metilumbelliferil-β-D-glucuronide (MUG), che genera il composto fluorescente 4-metilumbelliferone (4-MU) in presenza dell’enzima GUS. Il protocollo di seguito riportato à ̈ derivato dalla procedura standard indicata da Jefferson (1987), ed à ̈ stato adattato per eseguire il saggio in piastre.

• In una piastra da 96 pozzetti (low binding, Sarstedt) addizionare 10 Î1⁄4L di estratto GUS a 130 Î1⁄4L di soluzione MUG (Tab. 4);

• Lasciare in incubazione per 1 h a 37 °C;

• Prelevare 20 Î1⁄4L di reazione e addizionarli rapidamente a 230 Î1⁄4L di Na2CO30.2 M (soluzione di stop) in piastra opaca da 96 pozzetti (effettuare almeno 2 ripetizioni per campione);

• Nella piastra opaca eseguire anche una curva di taratura con 4-MU (1 mM e diluizioni successive 1 :2 per un totale di 4-5 punti);

• Lettura dei valori mediante fluorimetro a piastra;

· Elaborazione dei risultati mediante software Curve Fitting Data Analysis (Promega).

Tab. 4: Composizione della soluzione 4-MUG _ _

Componenti Quantità per 100 mL

MUG (MW 352.3) 1.2 mM 0.042 g

Tampone di estrazione GUS (Tab. 3) 100 mL

Esempio 7 : Estrazione di proteine totali da semi di riso trasformati

Per ottenere estratti di proteine totali da saggiare mediante DAS-ELISA Ã ̈ stato messo a punto un protocollo di estrazione che ha previsto le seguenti fasi:

• Raccolta delle pannocchie mature da ciascun individuo;

• Essiccazione delle pannocchie in locale asciutto e areato per circa 3 giorni fino al raggiungimento di una umidità relativa del seme pari al 14%;

• Campionatura casuale di 40 semi per ciascuna linea;

· Sbramatura dei semi con sbramino manuale da tavolo per riso;

• Macinazione del campione con micromulino a vibrazione MM2 (Retsch) alla velocità di 20 Hz per 2 minuti e prelievo di 70 mg della farina ottenuta;

• Omogeneizzazione in mortaio della farina con 1 mL di tampone di estrazione (Tris HCl 50 mM, NaCl 0.5 M, pH=7.0);

• Successiva diluizione con ulteriori 7 mL del medesimo tampone;

• Incubazione in agitazione continua a 4 °C per 1 h;

• Prelievo di 1 mL e centrifugazione a 20000xg per 40 min a 4 °C;

· Recupero della fase liquida contenente le proteine e conservazione a -20 °C.

Esempio 8: Analisi DAS-ELISA

Il saggio DAS-ELISA, basato su un doppio riconoscimento immunologico, à ̈ stato utilizzato per valutare il contenuto in GCasi dei singoli estratti proteici. Per l’analisi, i campioni sono stati diluiti 1:30. Qui di seguito vengono riportate le principali fasi del saggio:

• Distribuzione in ogni pozzetto di 100 Î1⁄4L di anticorpo anti-GCasi policlonale non coniugato diluito a 2 ng/Î1⁄4L in soluzione di coating (PBS diluito 1:5, sodio azide 0.01%);

• Incubazione della piastra ovemight a 4 °C;

· Rimozione dell’ anticorpo;

• Distribuzione di 250-300 Î1⁄4L di soluzione di blocking (PBS BSA 2.5% sodio azide 0.01%) in ogni pozzetto;

• Incubazione della piastra a 25 °C per 20 min;

• Rimozione della soluzione di blocking;

· Distribuzione di 50 Î1⁄4L/pozzetto di ciascuna diluizione dello standard (200, 100, 50 e 25 pg/ Î1⁄4L di imiglucerasi commerciale; Sanofi-Genzyme), di ciascun campione da analizzare e del bianco, costituito dalla soluzione di diluizione (PBS Tween20 0.1% BSA 1%);

• Incubazione della piastra per 30 min a 37 °C sotto agitazione;

· Esecuzione di 3 lavaggi ripetuti dei pozzetti con 300 Î1⁄4L/pozzetto di soluzione di lavaggio (PBS Tween200.1%);

• Distribuzione di 50 Î1⁄4L/pozzetto di anticorpo policlonale anti-GCasi coniugato alla perossidasi di rafano, diluito a 0.4 ng/Î1⁄4L in soluzione di diluizione;

• Incubazione della piastra per 30 min a 37 °C sotto agitazione;

<â– >Esecuzione di 3 lavaggi ripetuti dei pozzetti con 300 Î1⁄4L/pozzetto di soluzione di lavaggio (PBS Tween200.1%);

• Distribuzione di 100 Î1⁄4L/pozzetto di soluzione di TMB;

• Incubazione della piastra per circa 10 min a 25 °C;

• Blocco della reazione con 100 Î1⁄4L/pozzetto di soluzione di stop (acido cloridrico 1 M);

• Lettura della piastra a 450 nm con lettore per piastre Modulus II (Promega);

• Elaborazione dei dati mediante software Curve Fitting Data Analysis (Promega) con assegnazione dei valori di concentrazione nota degli standard. I valori di concentrazione dei campioni sono stati ottenuti utilizzando una curva lineare a quattro parametri, considerando il fattore di diluizione adottato al fine di ottenere le concentrazioni reali degli estratti.

BIBLIOGRAFIA

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Claims (9)

1. RIVENDICAZIONI 1. DNA artificiale di una regione leader 5’-UTR, detto DNA artificiale essendo efficace nell’aumentare l’espressione di proteine ricombinanti in pianta, detto DNA artificiale comprendendo, lungo la direzione 5’→3’, un sito iniziatore Inr ed una sequenza consenso Kozak o simil-Kozak, detto DNA artificiale comprendendo inoltre, tra il sito iniziatore Inr e la sequenza consenso Kozak o simil-Kozak: una pluralità di regioni poli(CAA) o (CAA)n, formate ciascuna da un oligonucleotide che consiste di due o più copie di un elemento CAA contigue l’una all’altra, ed una pluralità di regioni poli(CT) o (CT)min numero uguale alle regioni poli(CAA) e formate ciascuna da un oligonucleotide che consiste di due o più copie di un elemento CT contigue l’una all’altra, in cui almeno una, opzionalmente ciascuna, regione poli(CAA) à ̈, lungo la direzione 5’— >3’, a monte di una regione poli(CT) ed almeno una regione poli(CAA) à ̈, lungo la direzione 5’→3’, contigua con una regione poli(CT), con la previsione che detto DNA artificiale non contiene alcuno dei seguenti componenti: motivi ricchi in AT, elementi trinucleotidici ATT, elementi trinucleotidici CTG e tratti omopolimerici, ovvero di sequenze composte da più di 3, opzionalmente più di 4, nucleotidi uguali.
2. 2. DNA artificiale come nella rivendicazione 1, in cui n à ̈ un numero intero, che può essere selezionato uguale o differente tra le regioni poli(CAA), maggiore od uguale a 2, opzionalmente compreso tra 3 e 9, opzionalmente tra 4 e 8, opzionalmente tra 5 e 7.
3. 3. DNA artificiale come nella rivendicazione 1 o 2, in cui m à ̈ un numero intero, che può essere selezionato uguale o differente tra le regioni poli(CT), maggiore od uguale a 2, opzionalmente compreso tra 3 e 5.
4. 4. DNA artificiale come in una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti, contenente due regioni poli(CAA) e due regioni poli(CT), in cui una prima regione poli(CAA) Ã ̈ a monte di una prima regione poli(CT) ed una seconda regione poli(CAA) Ã ̈ a valle di detta prima regione poli(CT) ed a monte di una seconda regione poli(CT).
5. 5. DNA artificiale come in una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti, in cui il sito iniziatore Inr à ̈ il sito di inizio trascrizione 5’-ACACG-3’ di CaMV 35S oppure à ̈ un sito iniziatore Inr con sequenza consenso 5’-YYANWYY-3’, in cui: Y=C, T; N=A, C, G, T; W=A, T.
6. 6. DNA artificiale come in una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti comprendente la sequenza mostrata in SEQ ID NO: 1.
7. 7. DNA artificiale come in una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti da 1 a 5 comprendente la sequenza mostrata in SEQ ID NO: 2.
8. 8. Vettore di espressione comprendente DNA artificiale di una regione leader 5’-UTR efficace nell 'aumentare l’espressione di proteine ricombinanti in pianta come in una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 7.
9. 9. Metodo per la produzione di proteine ricombinanti in pianta, comprendente la trasformazione delle piante utilizzando un vettore di espressione come nella rivendicazione 8.