ITRM20100442A1 - Uso di hmgb1 come marcatore biologico di infiammazione intestinale umana, metodo non invasivo per la sua rilevazione in campioni fecali e kit relativo. - Google Patents

Description

USO DI HMGB1 COME MARCATORE BIOLOGICO DI INFIAMMAZIONE INTESTINALE UMANA, METODO NON INVASIVO PER LA SUA RILEVAZIONE IN CAMPIONI FECALI E KIT RELATIVO;

DESCRIZIONE

La presente invenzione riguarda materiali e metodi per individuare e diagnosticare infiammazioni intestinali croniche (IBD, da “Inflammatory Bowel Disease†) nell’uomo. In particolare si descrive un metodo non invasivo per misurare uno stato infiammatorio intestinale nell’uomo attraverso la presenza della proteina HMGB1 in estratti fecali ed il coinvolgimento di tale proteina nella patogenesi delle malattie infiammatorie croniche intestinali, più specificatamente della Malattia di Crohn (MC) e della colite ulcerosa(CU). L’invenzione comprende anche il kit colorimetrico per attuare tale metodo.

Campo dell’invenzione

High-mobility group box 1 (HMGB1) à ̈ una proteina nucleare nonistonica associata alla cromatina, emersa come prototipo di molecole DAMP (da “damage-associated molecular patterns†) in grado di rispondere a stimoli di danno tissutale inducendo una risposta infiammatoria (1). HMGB1 à ̈ secreta attivamente da macrofagi (2) ed enterociti (3) in seguito a stimoli proinfiammatori, come LPS, TNFalpha, IL-1beta, IL-6, e IL-8 (4) ed à ̈ rilasciata da cellule necrotiche, ma non da cellule apoptotiche (5). HMGB1, quando secreta nello spazio extracellulare, forma complessi altamente infiammatori con diverse molecole: DNA a singolo filamento, LPS, IL-1beta e nucleosomi, che interagendo con i rispettivi recettori, quali TLR9, TLR4, IL-1R e TLR2, attivano la risposta immunitaria innata. Alternativamente, HMGB1 può legare, senza formare complessi, il recettore per i prodotti finali di glicosilazione RAGE (da “ Receptor for Advanced Glucation End†products) (6).

HMGB1 extracellulare induce la produzione di mediatori infiammatori (4) e può giocare un importante ruolo nella patogenesi di malattie autoimmuni o infiammatorie, tra cui l’artrite reumatoide (7), il lupus eritematoso sistemico (8) e la polimiosite (9).

HMGB1 e tratto gastrointestinale: stato dell’arte Segnali di stress, danno tissutale o presenza di antigeni microbici nella mucosa intestinale attivano le cellule della risposta immunitaria innata, quali macrofagi e cellule dendritiche, innescando la risposta infiammatoria.

La presenza di HMGB1, rilasciata nella matrice extracellulare in seguito a stimoli infiammatori, sembra influenzare in modo significativo la funzionalità della barriera intestinale, alterando la permeabilità delle cellule epiteliali intestinali e determinando un maggiore ingresso di antigeni microbici. Studi in vitro ed in vivo hanno infatti messo in relazione la presenza di HMGB1 secreta da enterociti immunostimolati, o da altre cellule del sistema immunitario, e disfunzioni della barriera intestinale (10-15). Inoltre, poichà ̈ causa il rilascio di citochine infiammatorie, HMGB1 à ̈ anche potenzialmente coinvolta nell’infiammazione del colon, come dimostrato in modelli animali (16, 17) e in forme di colite necrotizzante (18,19).

La diminuzione di HMGB1 secreta, mediante molecole anti-HMGB1, sembra correlare con un miglioramento sia d e l danno a l l a barriera intestinale c h e dell’infiammazione mucosale (11,13,14,16,19,20).

In un recente articolo di Davà ̈ et al., (16) sono stati illustrati i risultati relativi all’impiego su modello murino soggetto a colite cronica di un agente antiinfiammatorio come l’etil piruvato per ridurre la secrezione di HMGB1. Test effettuati su campioni fecali hanno evidenziato che i livelli di HMGB1 nelle stesse feci diminuiscono a seguito di somministrazione di etilpiruvato.

Tuttavia, gli esperimenti condotti nello studio di Davà ̈ sulla colite si riferiscono unicamente ad un modello murino, ed à ̈ noto che non sempre i risultati così ottenuti sono estendibili in maniera automatica all’uomo e alle sue patologie; infatti molto spesso i dati conseguiti utilizzando modelli animali non co rri spo nd ono a ciò ch e s i t ro va poi ne lla corrispettiva malattia umana, sia in termini di marcatori molecolari, che di decorso clinico della malattia e di risposta a specifici trattamenti terapeutici.

Il modello murino utilizzato nel lavoro in questione à ̈ inoltre costituito da un ceppo di topi geneticamente modificato in cui à ̈ deleto il gene codificante l’IL-10, una citochina anti-infiammatoria, motivo per cui il topo sviluppa la colite. Questa à ̈ una condizione piuttosto distante dalla malattia umana in cui concause molto più complesse determinano l’insorgenza della malattia.

E’ noto infatti che la variabilità genetica ed ambientale che caratterizza l’uomo, non à ̈ assolutamente riproducibile nei modelli animali da laboratorio. In particolare, le malattie infiammatorie intestinali sono patologie multifattoriali dove la variabilità genetica e quella ambientale svolgono un ruolo importante nell’insorgenza e nello sviluppo della malattia.

Infatti, ad oggi, sono stati individuati più di trenta loci di suscettibilità per la MC e poco meno per la CU, e non tutte le persone affette esprimono le stesse varianti geniche, così come, avere la variante genica non significa sviluppare necessariamente la malattia: esiste, cioà ̈, una grande variabilità genetica tra le persone con malattia infiammatoria, diversamente dal modello murino dove l’omogeneità genetica à ̈ pressochà ̈ totale.

Inoltre, la pressione ambientale, in termini di abitudini di vita (dieta, fumo, stress) così come l’uso di farmaci o l’esposizione ad agenti nocivi ambientali, à ̈ diversa da individuo ad individuo ed anch’essa svolge un ruolo determinante nell’insorgenza della malattia e nella composizione della flora intestinale che risulta pertanto diversa da individuo ad individuo. A tal proposito, à ̈ importante ricordare che studi molto recenti svolti da prestigiosi gruppi nazionali ed internazionali sottolineano il ruolo fondamentale della flora batterica commensale nella malattia infiammatoria intestinale, che infatti risulta modificata negli individui malati rispetto ai sani. Anche in questo caso, il modello murino, vivendo in condizioni standard, non subisce affatto, o comunque enormemente meno, la pressione ambientale ed anche il profilo microbiologico à ̈ molto meno variabile tra gli individui, essendo la dieta la medesima per tutti.

Ruolo di HMGB1 nell’infiammazione intestinale nell’uomo

Pochissimi sono gli studi sul ruolo di HMGB1 nell’infiammazione intestinale nell’uomo: una recente pubblicazione individua nei ligandi di RAGE, tra cui quindi anche HMGB1, possibili “biomarkers†di malattia di patologie come l’artrite e la colite (21); una seconda individua in HMGB1 un nuovo antigene degli ANCA (anticorpi anti-citoplasma dei neutrofili), in quanto osservata nel siero di pazienti con colite ulcerosa (22).

Proteine utilizzate come marcatori di infiammazione intestinale

I marcatori biologici costituiscono un metodo non invasivo per misurare obiettivamente l'infiammazione e possono svolgere un ruolo primario o secondario nella valutazione di alcune patologie (23), tra cui le malattie infiammatorie croniche intestinali (IBD, da “Inflammatory Bowel Disease†).

Tali marcatori possono essere classificati come sierologici o fecali ed essere utilizzati per diagnosticare un processo specifico, stratificare la malattia in diversi sottotipi, stimarne l’attività, l'evoluzione e la prognosi, predire la risposta ad un trattamento terapeutico o una recidiva (24).

I marcatori sierologici disponibili per diverse malattie infiammatorie, tra cui le IBD, sono: il tasso di sedimentazione eritrocitaria (ESR), la proteina C-reattiva (C RP ), g li an ti co rp i ant i-neutrofili citoplasmatici (ANCA) e gli anti-anticorpi anti-Saccharomyces cerevisiae (ASCA) (24). Tuttavia, essi mostrano bassa sensibilità e specificità per l'infiammazione intestinale e correlano scarsamente con i sintomi e gli indici di attività della malattia (24).

Al contrario i marcatori fecali presentano maggiore specificità per la diagnosi di malattie gastrointestinali, come le IBD, perché i loro livelli non aumentano in patologie che non coinvolgono l’apparato digerente (25, 26), inoltre hanno il vantaggio di non richiedere necessariamente l’analisi endoscopica per valutare l'attività della malattia (26, 27). La lactoferrina e la calprotectina costituiscono i marcatori fecali di infiammazione intestinale più utilizzati al momento (24, 25, 28, 29). Infatti, la presenza di queste proteine nelle feci costituisce una misura ragionevolmente accurata di attività di malattia, di predizione di recidive, di identificazione di gruppi ad elevato rischio tra pazienti con coliti severe e di monitoraggio degli effetti di terapie mediche.

Data la crescente esigenza di individuare metodi non invasivi per rilevare l’infiammazione gastrointestinale, sempre più sensibili e specifici, ma anche economici, molta attenzione continua ad essere rivolta all’identificazione di nuove molecole che soddisfino queste caratteristiche.

Obiettivo e risultati preliminari

Data la ormai nota abilità di HMGB1 a rilasciare segnali per il reclutamento del repertorio cellulare infiammatorio e ad attivare la risposta immunitaria in seguito a stimoli esogeni o endogeni, gli inventori si sono proposti di indagare il possibile coinvolgimento di questa proteina nella patogenesi delle malattie infiammatorie croniche intestinali umane, più specificatamente della MC e della CU.

La MC à ̈ caratterizzata dalla presenza di infiammazione transmurale che può interessare un tratto qualunque della via digestiva, dalla bocca all’ano.

Tipicamente si ha il coinvolgimento di più tratti in maniera discontinua. L’infiammazione coinvolge tutta la parete del tratto interessato e spesso si estende al vicino mesentere ed ai linfonodi. Più frequentemente interessa il tratto terminale dell’ileo ed il colon.

Nella CU il processo infiammatorio à ̈ confinato al colon ed interessa la sola mucosa. L’interessamento del retto à ̈ costante e può essere accompagnato dall’interessamento di un tratto variabile di colon a monte.

Attualmente la prevalenza di queste patologie nei paesi occidentali (Europa e Nord America) si attesta intorno a 70-150 casi ogni 100.000 abitanti per la CU e 20-40 casi ogni 100.000 abitanti per la MC. Sono prevalentemente patologie della tarda adolescenza e dell’età giovane-adulta, con un picco massimo di esordio tra i 15 e i 35 anni.

In questo contesto, molta rilevanza à ̈ stata data dagli inventori, al ritrovamento di HMGB1 nelle feci di pazienti pediatrici affetti da IBD, in quanto à ̈ noto che la proteina esercita la sua attività infiammatoria quando secreta nella matrice extracellulare e le feci costituiscono per l’appunto quanto prodotto ed eliminato dall’intestino. I dati ottenuti sono stati poi confrontati con quelli di un gruppo di controllo.

Si à ̈ sorprendentemente constatato che i livelli di HMGB1 osservati nelle feci dei pazienti con IBD risultano significativamente aumentati rispetto a quelli dei controlli sani (Fig. 1). Ciò ha permesso di stabilire che la determinazione di HMGB1 nelle feci di un paziente può essere utilizzata come marcatore di infiammazione intestinale. Inoltre, à ̈ risultato evidente che i pazienti con una moderata severità di malattia (gruppo con indice di malattia PCDAI/PUCAI <25/60), perchà ̈ sottoposti a trattamento terapeutico, mostrano una ridotta presenza di HMGB1, rispetto a quelli con malattia severa. Pertanto, questa proteina, oltre ad essere un buon marcatore di infiammazione, sembra anche potersi considerare un buon indicatore di risposta alla terapia (Fig 1). La metodologia messa a punto allo scopo à ̈ qui di seguito illustrata.

Preparazione del campione fecale

Campioni fecali sono stati ottenuti da pazienti pediatrici con IBD (Tab. 1), con diverso grado di severità di malattia, e da controlli sani, reclutati presso l’Unità di Gastroenterologia ed Epatologia Pediatrica della Sapienza Università di Roma-Policlinico Umberto I, diretta dal Prof. Salvatore Cucchiara. I campioni, raccolti in contenitori sterili per feci, sono stati conservati a -20°C fino al momento delle analisi molecolari.

Pesatura delle feci e sospensione nel tampone Ogni campione di feci (della grandezza circa di un nocciolo, equivalente al contenuto del cucchiaino interno ad un contenitore standard per feci) à ̈ stato prelevato con una punta sterile dal contenitore, messo in una provetta eppendorf da 1.5 ml e pesato, utilizzando una bilancia digitale, dopo tara. Il campione à ̈ stato risospeso in tampone di estrazione (tampone fosfato salino pH7.2 PBS (fosfato buffer solution) con detergente e sodio azide (ScheBo Biotech)), fino ad ottenere una concentrazione di 500 mg/ml.

Omogeneizzazione ed estrazione delle feci

Si à ̈ proceduto a miscelare il campione vigorosamente con vortex per un minuto a temperatura ambiente (TA); il campione à ̈ stato poi posto in agitazione orbitale per un’ora a TA. Si à ̈ proceduto a miscelazione e centrifugazione per 5 minuti a 5000RPM alla temperatura di 4°C. Si à ̈ poi prelevato il supernatante, definito estratto fecale, e valutata la concentrazione proteica mediante saggio Bradford (Biolabs). Il campione a questo punto può essere analizzato immediatamente con saggio western blot o conservato alla temperatura di -80°C e successivamente analizzato.

Analisi degli estratti fecali mediante western blot

E’ stato aggiunto un equivalente volume di 2X Sample Buffer (100mM Tris-Cl pH6.8, 10% betamercaptoetanolo, 4% SDS, 20% glicerolo, 0.2% blu di bromofenolo) a 20Î1⁄4g di estratto fecale; il campione à ̈ stato quindi bollito per 5minuti e centrifugato brevemente. Si à ̈ proceduto all’analisi degli estratti mediante western blot (WB). L’estratto fecale à ̈ stato separato utilizzando un gel di SDS-poliacrilamide al 12% e poi trasferito su un filtro di PVDF (Amersham), mediante elettrotrasferimento, per 1ora a 70 Volts. I siti aspecifici sono stati bloccati incubando il filtro per 1 ora a TA con Blocking Buffer (0.02M Tris-Cl pH7.6, 0.137M NaCl, 5% latte in polvere privo di grassi), di seguito il filtro à ̈ stato incubato per 16 ore a 4°C con anticorpo policlonale anti-HMGB1 (commercializzato dalla Sigma con il numero di catalogo H9593), diluito 1:1000 in Antibody Buffer (0.02M Tris-Cl pH7.6, 0.137M NaCl, 3% latte in polvere privo di grassi). Sono stati quindi effettuati tre lavaggi da 5 minuti in TBS-T 0.1%Tween (0.02M Tris-Cl pH7.6, 0.137M NaCl, 0.1%Tween), e successivamente, il filtro à ̈ stato incubato per 1 ora a TA con un anticorpo secondario anti-rabbit, coniugato ad una perossidasi (SantaCruz), diluito 1:4000 in Antibody Buffer. Sono stati ancora effettuati tre lavaggi da 5 minuti in TBS-T 0.1%Tween e si à ̈ poi proceduto alla rilevazione del segnale chemiluminescente utilizzando ECLplus (Amersham) e lastre autoradiografiche (Kodak).

La Tab.1 riporta l’elenco dei pazienti, divisi per tipo di malattia e severità di malattia, arruolati.

TABELLA 1

Paziente PCDAI/PUCAI MC SEVERA (>25)

MC1 25

MC2 35

MC3 35

MC LIEVE7MODERATA (<25)

MC1a 15

MC2a 5

MC3a 10

MC4a 5

MC5a 22.5

MC6a 17.5

MC7a 25

CU SEVERA CU1 65

CU2 60

CU3 75

CU4 60

CU LIEVE/MODERATA

CU1a 0

CU2a 5

CU3a 10

CU4a 0

CU5a 5

CU6a 0

CU7a 15

CU8a 15

La Fig.1 mostra i risultati di HMGB1 in campioni fecali, ottenuti mediante analisi western blot.

Sia nella Fig. 1 che nella Tab.1, MC indica Malattia di Crohn e CU indica rettocolite ulcerosa. Inoltre i numeri tra parentesi indicano il PCDAI (Paediatric Crohn's Disease Activity Index) relativo alla MC ed il PUCAI (Pediatric Ulcerative Colitis Activity Index) relativo alla CU. Tali indici rappresentano una misura dell’attività di malattia in pazienti pediatrici affetti da IBD.

Come si può vedere dalla Fig.1, i pazienti con IBD mostrano un significativo aumento di HMGB1 nelle feci rispetto ai controlli sani. Inoltre, vi à ̈ una relazione diretta tra i livelli di HMGB1 e il grado di severità della malattia. In conclusione, HMGB1, oltre ad essere un buon marcatore di infiammazione, sembra anche potersi considerare un buon indicatore della severità della malattia e pertanto si potrebbe utilizzare come marcatore di risposta alla terapia.

Da quanto fin qui descritto risulta evidente l’importanza della presente invenzione: l’impiego di HMGB1 come marcatore biologico ed il metodo per rilevarne la presenza in campioni fecali, costituisce un notevole passo avanti per poter diagnosticare in modo sicuro e non invasivo la presenza ed il livello di una infiammazione intestinale umana, evitando di ripetere frequentemente le indagini strumentali che risultano fortemente traumatici per la maggior parte dei pazienti.

E’ opportuno evidenziare che per l’analisi degli estratti fecali non à ̈ solo utilizzabile il saggio western blot. Gli stessi inventori hanno infatti rivolto la loro attenzione anche alla messa a punto di un protocollo di analisi per rilevare la presenza di HMGB1 nelle feci mediante saggio ELISA, utilizzando lo stesso anticorpo che à ̈ stato utilizzato per il saggio western blot e che ha dato più che discreti risultati in termini di specificità e sensibilità verso la proteina bersaglio. Pertanto, si sta procedendo alla realizzazione di un kit ELISA valido per la rilevazione della proteina nelle feci, alternativo a quello attualmente disponibile in commercio, ottimizzato per identificare la proteina soprattutto nel siero. La scelta di fornire un protocollo ELISA, oltre al western blot, à ̈ dettata dal fatto che questa tecnica à ̈ semplice e soprattutto consente di quantificare meglio la reazione; infatti, l'intensità del colore della piastra ELISA à ̈ proporzionale al numero di complessi antigenean tic orp o (pr ima rio ) f orm ati e qu ind i a lla concentrazione dell'antigene (in grado di legare l'anticorpo primario) nel campione analizzato.

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Claims (12)

1. RIVENDICAZIONI 1) Un metodo non invasivo per rilevare, diagnosticare e prognosticare condizioni infiammatorie intestinali di un paziente umano, caratterizzato dal fatto che prevede di rilevare il livello di HMGB1 in campioni fecali dello stesso paziente.
2. 2) Un metodo in cui la diminuizione del livello di HMGB1 in un campione delle feci à ̈ utilizzata come un marker di risposta ad un trattamento dato.
3. 3) Un metodo come alla rivendicazione 1 in cui dette condizioni infiammatorie intestinali sono selezionate nel gruppo consistente nelle malattie infiammatorie croniche intestinali (IBD) , specificatamente la Malattia di Crohn (MC) e la colite ulcerosa (CU).
4. 4) Un metodo come alle rivendicazioni 1 e 2 in cui il paziente umano à ̈ un paziente pediatrico affetto da IBD.
5. 5) Un metodo come alle rivendicazioni precedenti caratterizzato dal fatto che prevede le seguenti fasi:  pesature del campione di feci e sospensione del campione in tampone di estrazione PBS;  omogeneizzazione del campione ed estrazione dopo centrifugazione dell’estratto fecale supernatante ;  valutazione della concentrazione proteica mediante saggio Bradford;  analisi dell’estratto fecale mediante western blot.
6. 6) Metodo come alla rivendicazione precedente caratterizzato dal fatto che durante l’analisi degli estratti mediante western blot l’estratto fecale trasferito su filtro di PVDF viene incubato con anticorpo policlonale anti-HMGB1 .
7. 7) Metodo come alla rivendicazione precedente caratterizzato dal fatto che detto anticorpo policlonale anti-HMGB1 Ã ̈ commercializzato dalla Sigma-Aldrich Co. con il numero di catalogo H9593.
8. 8) Metodo come alla rivendicazione 5 caratterizzato dal fatto che l’analisi dell’estratto fecale viene effettuata mediante saggio ELISA.
9. 9) Metodo come alla rivendicazione precedente caratterizzato dal fatto che nel saggio ELISA si utilizza come anticorpo lo stesso anticorpo policlonale utilizzato nel saggio western blot.
10. 10) Metodo come alla rivendicazione precedente caratterizzato dal fatto che tale anticorpo policlonale anti-HMGB1 Ã ̈ un anticorpo policlonale commercializzato dalla SIGMA-ALDRICH Co. con il numero di catalogo nr. H9593.
11. 11) Un kit colorimetrico per la rivelazione della proteina HMGB1 in campioni fecali umani secondo il metodo delle rivendicazioni precedenti, basato sulla reazione specifica antigene-anticorpo, caratterizzato dal fatto che tale anticorpo à ̈ un anticorpo policlonale anti-HMGB1.
12. 12) Un kit colorimetrico come alla rivendicazione precedente caratterizzato dal fatto che tale anticorpo à ̈ un anticorpo policlonale commercializzato dalla Sgma Aldrich Co. con il numero di catalogo H9593.