ITRM20070437A1 - Metodo per la generazione ed espansione di cellule t gamma/delta regolatorie cellule cosi' ottenute e loro impieghi - Google Patents

Description

Descrizione dell'Invenzione Industriale avente per titolo:

“Metodo per la generazione ed espansione di cellule T gamma/delta regolatorie, cellule così ottenute e loro impieghi”

Campo dell’invenzione

La presente invenzione riguarda un procedimento in vitro per la generazione e l’espansione di cellule regolatorie T γδ (γδ Treg) che esprimono il fattore di trascrizione Foxp3 a partire da un campione di linfociti del sangue periferico (PBMC, periferal blood mononuclear cells). Le cellule γδ Treg così generate sono utilizzate per indurre in vitro una potente inibizione della proliferazione dei linfociti T αβ negli animali e nell'uomo.

La capacità regolatoria delle cellule ottenute tramite il metodo dell'invenzione può essere sfruttata nel trattamento di malattie autoimmuni, per la prevenzione del rigetto nei trapianti, e, più in generale, nel trattamento dei quadri clinici che traggono beneficio dalla modulazione negativa della risposta immunitaria.

Definizioni

TCR = Il recettore delle cellule T (T celi receptor, TCR) è una proteina dimerica di membrana dei linfociti T che presenta una porzione della propria struttura sulla superficie esterna di queste cellule. Il TCR è costituito in circa il 95% dei linfociti T da un eterodimero costituito da una catena a e da una β (linfociti T αβ), mentre nella restante porzione della popolazione linfocitaria esso è costituito da un eterodimero costituito da una catena proteica γ e una δ (linfociti T γδ). La funzione del recettore TCR consiste nel riconoscimento degli antigeni legati a molecole MHC (Major Histocompatibility Complex, complesso principale di istocompatibiìità) sulla superficie cellulare. Il TCR riconosce l’antigene solo nel contesto delle molecole MHC.

Foxp3 = Foxp3 è un fattore di trascrizione nucleare responsabile della soppressione della proliferazione dei linfociti T αβ. Agisce inibendo la trascrizione dell’IL-2 e aumentando l’espressione di fattori che spengono le risposte immunitarie.

Treg = Le cellule T regolatone note fino ad ora presentano il recettore αβ e sono caratterizzate come di seguito descritto.

- Cellule nTreg: sono le cellule regolatorie naturali che hanno origine nel timo e che esprimono in maniera costitutiva Foxp3. La loro funzione è quella di inibire la proliferazione e la produzione di citochine da parte dei linfociti T nel corso della risposta immunitaria una volta che il patogeno è stato eliminato. È stato dimostrato che sono responsabili del controllo delle malattie autoimmuni in quanto inibiscono i linfociti attivati in maniera patologica contro gli autoantigeni. Nell’uomo le nTreg sono rappresentate dai linfociti T CD4/CD25<high>, hanno una capacità proliferativa in vitro molto bassa e richiedono la presenza di IL-2 esogena per esercitare la propria attività soppressiva. Per svolgere la loro funzione hanno inoltre bisogno della stimolazione del TCR e del contatto cellula-cellula (Paust S. e Cantor H. (2005) Immunol. Rev. 204, 195-207; Baecher-Allan C. e Hafler D.A. (2006) Immunol. Rev. 212, 203-216).

- Cellule iTreg: sono cellule regolatorie adattative indotte. Queste cellule derivano dai linfociti T CD4<+>/CD25 che, in presenza di IL-2, IL-15 e TGF-β, differenziano in cellule regolatorie CD25<+>che esprimono il Foxp3, secernono TGF-β e sono in grado di inibire, con un meccanismo contatto-dipendente, la proliferazione e la produzione di citochine di linfociti T non stimolati. Queste cellule mostrano un fenotipo simile alle cellule regolatorie naturali ma l’espressione del Foxp3 è transiente in quanto necessita della continua presenza di IL-2 e TGF-β nel terreno di coltura (Ramesh K., et al. Journal of Immunology (2007) 178; 7667-7677).

- Cellule Tri: sono cellule regolatorie indotte in seguito a ripetute stimolazioni in vitro dei linfociti CD4<+>umani in presenza di IL- 10. Le Tri inibiscono la risposta T mediata da cellule nei confronti di patogeni, alloantigeni e cellule cancerogene. Le cellule Tri hanno una bassissima capacità proliferativa e la loro capacità soppressiva è mediata da fattori solubili, in particolare dalTIL-10. Non esprimono il Foxp3.

- Cellule Th3: costituiscono l’unico sottogruppo di cellule regolatone che viene indotto da antigeni introdotti nel cavo orale con gli alimenti. La loro capacità soppressiva non è basata sul contatto cellulare diretto ma è mediato dal TGF-β. Non esprimono Foxp3;

- Cellule CD8<+>CD28<+>: sopprimono la risposta immune in maniera dipendente dal contatto fra cellule, interagendo direttamente con le APC (Antigen Presenting Cells, cellule che presentano l'antigene) e rendendo queste ultime tolerogeniche. Le APC sono definite tolerogeniche quando, a causa della mancata espressione di particolari proteine di superficie, la loro interazione con le cellule del sistema immunitario ne induce un blocco della proliferazione invece di attivazione, come normalmente avviene.

Linfociti T αβ = Esprimono sulla propria superficie l'eterodimero αβ del TCR. Comprendono i linfociti T CD4 e i linfociti T CD8. Partecipano all'immunità specifica e si espandono in seguito all'incontro con l’antigene peptidico specifico, presentato nell’ambito di molecole MHC da parte delle cellule specializzate, con il supporto dei linfociti T CD4 helper. Possono esibire sia una attività citotossica diretta (linfociti T CD8<+>) sulle cellule bersaglio (per esempio, cellule contenenti un agente patogeno o cellule tumorali) che una attività di sostegno (CD4 helper) o di inibizione (CD4 Treg) della risposta immune specifica.

Linfociti γδ = Sono linfociti T che esprimono l'eterodimero γδ del TCR. Diversamente dai Hnfociti T αβ, riconoscono antigeni non peptidici attraverso un meccanismo non dipendente dalla presentazione tramite molecole MHC (Bukowsky J.F. J. Immunol. (1995) 154: 998; Morita C. T. Immunity. (1995) 3: 495). Nell'uomo sono presenti due popolazioni di linfociti T γδ:

- I linfociti T γδ con recettore Vy9V32 che rappresentano la popolazione maggioritaria del sangue periferico;

I linfociti T γδ con recettore V61 che rappresentano la popolazione maggioritaria nelle mucose e sono pochissimo rappresentati nel sangue periferico.

I linfociti T Vy9V32 sono coinvolti nella risposta immune contro patogeni intracellulari e malattie ematologiche (Poccia F. et al. Immunol. Today, 1998, 19:253; Poccia e al. Curr. Mol. Med.

2001, 1: 137; Ferrarmi M. et al. Trends Immunol. 2002, 23: 14).

Tecnica Anteriore

L'omeostasi del sistema immunitario dipende dalTequilibrio fra la risposta nei confronti di un patogeno invasore e la tolleranza del sistema immunitario nei confronti degli autoantigeni.

Questo equilibrio è realizzato mediante una rigida selezione a livello del timo, mediante la quale i linfociti T con TCR specifico per antigeni self vengono eliminati, mentre tutti gli altri, in grado di riconoscere antigeni estranei, migrano nei linfonodi a livello periferico, dove può avvenire l’incontro con l’eventuale agente patogeno. Non tutti i linfociti T autoreattivi vengono però eliminati in questa fase, e quelli che sfuggono a questa selezione vanno in circolo. A livello periferico questi cloni potenzialmente autoreattivi vengono inibiti grazie alla presenza di cellule regolatone αβ CD4<+>. Le cellule regolatone CD4<+>hanno a loro volta anche la funzione di spegnere la risposta immunitaria nei confronti di un patogeno, quando quest'ultimo è stato eliminato, evitando che ci sia un danno tissutale dovuto ad una eccessiva risposta immunitaria.

Nelle patologie autoimmuni, i linfociti αβ reattivi nei confronti degli autoantigeni danneggiano i tessuti e gli organi causando danni clinicamente molto rilevanti, come nel caso del diabete di tipo I o della tiroidite autoimmune. Per quanto detto sopra, possono esercitare una risposta autoreattiva potenzialmente patogenica sia linfociti T CD4 che CD8, sfuggiti alla selezione negativa dei cloni autoreattivi a h vello timico.

I linfociti T regolatori (T regulatory cells, Treg) giocano un ruolo molto significativo nella induzione e nel mantenimento della tolleranza da parte degli altri linfociti T. Essi sono infatti responsabili della limitazione della risposta immune e della inibizione dell’induzione delTautoimmunità (Sakaguchi, S. (2004) Ann. Reo. Immunol. 22, 531).

Le cellule Treg sono state finora identificate come linfociti T che esprimono l'eterodimero αβ del TCR e le molecole CD4+CD25<hi>e<h>(Paust S. e Cantor H. (2005) Immunol. Reu. 204, 195-207; Baecher-Allan C. e Hafler D.A. (2006) Immunol. Reu. 212, 203-216). Da studi recenti è emerso che queste cellule Treg esprimono specificamente il fattore nucleare di trascrizione Foxp3. Sembra che Foxp3 sia il gene principale che controlla lo sviluppo e la funzione delle cellule Treg (nTreg e iTreg) e finora la proteina da esso codificata è considerata la migliore molecola identificativa di queste cellule (L.A. Schubert, et al. J. Biol. Chem. (2001) 276, 137672-37679; R. Khattri, et al., Nat. Immunol. (2003) 4, 337; Stephens G.L. et al., J. Immunology (2007) 178, 6901). Altri tipi di cellule T che sono in grado di inibire la proliferazione delle cellule T αβ, come le cellule regolatone di tipo 1 (Tri) che producono IL- 10 e le cellule Th3 che producono TGF-β, non esprimono mai la proteina Foxp3.

Le cellule Treg Foxp3<+>svolgono la loro attività inibitoria mediante il contatto cellula/cellula. Il meccanismo di azione è differente per i diversi sottotipi di Treg Foxp3<+>. In particolare, l’attività inibitoria delle cellule nTreg Foxp3 si basa su un meccanismo indipendente dalle citochine, cioè non coinvolge l’azione di citochine con funzione soppressola, quali l’IL-4, IL- 10 e il TGF-βΙ, ma necessita del contatto cellula-cellula. Sebbene ancora non sia chiaro come avvenga la soppressione, è stato ipotizzato (Toda A. e Piccirillo C.A., J. Leukoc. Biol. (2006) 80) che uno dei possibili meccanismi mediante il quale le Treg inibiscono le cellule effettrici è quello in cui le Treg modulano negativamente la funzione delle APC. Altri studi (Thornton A.M., Shevach E.M. J. Exp^Med. (1998) 188: 287; Gondek D.C. et al. J. of Immunology (2005) 174: 1783) hanno invece dimostrato che la soppressione delle Treg si basa probabilmente su meccanismi ancora diversi. Attualmente non è ben noto nei particolari il meccanismo funzionale utilizzato dalle Treg per inibire la risposta delle cellule CD4 o CD8 effettrici sia in vitro che in vivo, anche se vari autori hanno molto lavorato nel campo (Thornton A.M., Shevach E.M. J. Exp. Med. (1998) 188: 287; Thornton A.M. et al. J. Immunol (2004) 172: 6519; Jonuleit H. et al. J. Exp. Med. (2002) 196: 255).

Sono state formulate due ipotesi sull'origine delle malattie autoimmuni. Secondo la prima, esse dipendono da un ridotto numero o una ridotta funzione delle cellule regolatorie. La seconda prevede che le malattie autoimmuni siano la conseguenza dello sviluppo di cellule T patogeniche resistenti alla regolazione. Per quanto riguarda il diabete, ad esempio, le cellule regolatorie controllano la progressione della malattia inibendo l'attivazione delle cellule effettrici e la loro funzione: Tuttavia, cellule effettrici resistenti alla regolazione si possono accumulare nel tempo dando inizio alla malattia (Tang Q. e Bluestone JA. Immunological Review (2006) 212: 217). Inoltre, esperimenti in vitro hanno dimostrato che le cellule Treg inibiscono la proliferazione di altre cellule T bloccando la produzione di IL-2. Studi in viv.o suggeriscono infine che le cellule regolatorie controllino vari aspetti della risposta immune che comprendono la proliferazione, la produzione di citochine, la migrazione verso i tessuti bersaglio e le funzioni effettrici delle cellule presenti nel tessuto interessato.

Qualsiasi organo alTintemo del sistema cardiocircolatorio, del tratto digerente, del sistema visivo, del sistema endocrino, della pelle, delle articolazioni, dei reni, dei polmoni, del sistema muscolare e del sistema nervoso può venire interessato da una malattia autoimmune (NIH Publication No.02 4858, (2002) "Questione and answers about autoimmunity").

Come conseguenza, il trattamento delle malattie autoimmuni dipende fortemente dal tipo di organo interessato, dalla severità della malattia e dai suoi sintomi. L'approccio clinico generale a questa classe di malattie punta sulla riduzione dei sintomi (che può comprendere la prescrizione di farmaci antidolorifici fino a giungere all'asportazione della parte affetta), sulla preservazione delle funzioni dell'organo colpito (per esempio, tramite l'utilizzo di farmaci antinfiammatori come i corticosteroidi o di terapie ormonali sostitutive) e sulla riduzione della risposta immune generale (per esempio, tramite la terapia con farmaci immunosoppressori quali la ciclosporina e la ciclofosfammide). Questi trattamenti sono tuttavia spesso poco efficaci e/o provocano effetti collaterali negativi.

È quindi chiaro che in realtà non è ancora stata trovata una vera cura per le malattie autoimmuni.

I linfociti T γδ giocano anch'essi un ruolo importante nel regolare la risposta infiammatoria precoce alle infezioni microbiche e quindi prevenire un eccessivo danno tissutale (Fu Y.-X. et al . J. Immunol. (1994) 153: 3101; King D. P. et al. J. Immunol. (1999) 162: 5033; Egan P.J. et al. J. Exp. Med. (2000) 191: 2145; Skeen M.J. et al. Infect. Immun. (2001) 69: 7213; Skeen M.J. et al. J. Leukoc. Biol. (2004) 76: 104; Tagawa T. et al. J. Immunol. (2004) 173: 5156). Evidenze sperimentali suggeriscono che i linfociti T γδ svolgono la loro funzione regolatoria influenzando la chemiotassi e la funzione di cellule effettrici che svolgono un ruolo chiave nell’infiammazione, come i neutrofili (Fu Y.-X. et al. J Immunol. (1994) 153: 3101; D’Souza C.D. et al. J. Immunol. (1997) 158:

1217), i macrofagi (Egan P.J. et al. J. Exp. Med. (2000) 191: 2145; Tagawa T. et al. J Immunol. (2004) 173: 5156), e le cellule NK (Li B. et al. J. Immunol. (1998) 161 1558; Vincent M.S. et al. J. Exp. Med. (1996) 184: 2109).

Poiché le cellule che esprimono il recettore γδ riconoscono antigeni non proteici in maniera non MHC-ristretta assai precocemente nel corso di una infezione, esse sono considerate parte della prima linea di difesa dell’ospite. Inoltre, la somiglianza degli antigeni patogeni riconosciuti dai linfociti T γδ con le molecole espresse dalle cellule danneggiate dell’ospite suggerisce che le risposte dei linfociti T γδ siano indotte più da molecole non specifiche di cellule danneggiate che da una eccessiva presenza di antigeni microbici o antigeni estranei (Hayday A.C. Ann. Reo. Immunol. (2000) 18: 975). L’attivazione precoce dei linfociti T γδ può portare alla produzione di IFNy, essenziale nell’attivazione dei macrofagi e delle cellule NK, importanti nella protezione precoce antibatterica prima che sia attivata la risposta specifica delle cellule T αβ (vedi Hayday A.C. supra)

Nell’uomo, la grande espansione dei linfociti T γδ durante le infezioni di L. monocytogenes, Mycobacterium tuberculosis, Brucella melitensis, and Ehrlichia chaffeensis evidenzia la grande importanza che queste cellule hanno nella risposta immune dell’ospite (Spada F.M. et al. J. Exp. Med. (2000) 191: 937).

Sono noti metodi per espandere in vitro le cellule T γδ a partire da PBMC tramite stimolazione con composti fosforilati di origine batterica contenenti nucleotidi o tramite pirofosfati isoprenoidi quale l'isopentenilpirofosfato (IPP) in presenza di citochine, quali IL-2 e IL-15 (WO 03/070921), allo scopo di ottenere un grande numero di cellule T γδ che possono essere utilizzate nel corso di malattie infettive e di tumori utilizzando le funzioni effettrici note, per esempio la citotossicità e la funzione di induzione della risposta positiva delle cellule αβ tramite citochine, allo scopo di stimolare, aumentandole, le difese immunitarie del soggetto trattato.

Tuttavia, sebbene siano stati fatti molti studi sulle funzioni delle cellule T γδ, tra queste cellule non era mai stata finora evidenziata la possibile esistenza di una sottopopolazione di cellule T γδ con funzione paragonabile a quella dei Treg αβ, owerp caratterizzabili mediante l’espressione del fattore di trascrizione Foxp3 e aventi la funzione di spegnere la risposta di altri linfociti T attivati.

Sommario dell’invenzione

E stato ora trovato e costituisce oggetto della presente invenzione un metodo in vitro per generare ed espandere cellule T γδ che esprimono il fattore di trascrizione Foxp3 con funzione regolatoria. Tali cellule, designate con il nome di γδ Treg, hanno la capacità di inibire la replicazione delle cellule αβ.

Il metodo si basa sulla stimolazione di linfociti con un antigene specifico per i linfociti T γδ, quale l’isopentenilpirofosfato (IPP), in presenza di citochine, quab l’interleuchina-2 (IL-2) e l’interleuchina-15 (IL- 15) e un fattore di crescita quale il Trasforming Growth Factor β-1 (TGF-βΙ). La combinazione di questi reagenti induce l’espressione significativa del fattore di trascrizione Foxp3 sui linfociti T γδ dopo 3 giorni di coltura.

Un oggetto dell’invenzione è quindi un procedimento di produzione di cellule γδ Treg che comprende:

(i) la coltivazione di cellule mononucleate di sangue, eventualmente preventivamente scongelate, in presenza di un attivatore sintetico di hnfociti γδ, di citochine e fattori di crescita in condizioni da assicurare la proliferazione delle cellule γδ Treg; e (ii) recuperare le cellule così ottenute.

Preferibilmente le cellule mononucleate del sangue provengono da citoaferesi. Le cellule utilizzate sono preferibilmente umane e possono provenire da campioni biologici congelati.

Sono altresì oggetto dell’invenzione le colture cellulari ottenute con il processo dell’invenzione, caratterizzate dal comprendere, nell'ambito della popolazione di cellule T γδ almeno il 30% di γδ Treg che esprimono la proteina Foxp3.

Ulteriore oggetto della presente è invenzione la sottopopolazione di cellule regolatone T Vy9V52 aventi le caratteristiche più avanti descritte.

Altro oggetto dell'invenzione sono le composizioni farmaceutiche caratterizzate dal comprendere una popolazione cellulare di cellule T γδ in cui almeno il 30% è costituito da cellule regolatone T γδ esprimenti Foxp3. Preferibilmente le composizioni comprendono ulteriormente un veicolo farmaceuticamente accettabile quale un agente stabilizzate, ad esempio la sieroalbumina umana.

Ancora altro oggetto della presente invenzione è l'uso della sottopopolazione di dette cellule regolatone T γδ esprimenti Foxp3 per scopi farmaceutici, terapeutici, sperimentali, cosmetici e di ricerca, in particolare con riferimento ai quadri clinici che traggono beneficio dalla modulazione negativa della risposta immunitaria, quali, per esempio, le malattie autoimmuni e la prevenzione del rigetto dei trapianti.

Ulteriori oggetti dell'invenzione risulteranno evidenti da quanto qui di seguito descritto.

Breve descrizione delle figure

Figura 1. Induzione dei γδ Treg

-~Figura 2. Caratterizzazione fenotipica dei γδ Treg Figura 3. Inibizione della proliferazione delle cellule αβ da parte dei γδ Treg.

Descrizione dettagliata dell’invenzione

Il metodo in vitro dell'invenzione permette di generare, a partire da un campione biologico, in genere un campione di cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC), una particolare sottopopolazione di cellule T γδ, cioè cellule Vy9V62 ad attività regolatola che, oltre ad esprimere il fattore nucleare di trascrizione Foxp3, mostrano le seguenti ulteriori caratteristiche: a. esprimono i seguenti marcatori di superficie CD25, CTLA-4, CD127, CD45RO, CD69, CD27;

b. hanno capacità regolatola in quanto inibiscono la proliferazione dei linfociti T αβ;

c. l’inibizione da loro esercitata sulla proliferazione dei linfociti αβ non richiede il contatto cellulare ma è mediata da uno o più fattori solubili, in quanto permane anche quando le due popolazioni cellulari (γδ Treg e PBMC stimolati) sono separate da una membrana porosa che non permette il passaggio delle cellule ma solo dei fattori solubili da esse prodotti (esperimento non mostrato).

Le cellule γδ Treg che si ottengono con il metodo dell'invenzione sono CD4 e CD8 negative in quanto derivano dai linfociti T γδ che normalmente non esprimono questi marker. Inoltre, le cellule dell'invenzione sono tutte positive per le proteine CD25 e CTLA-4, che sono tipici marcatori dei leucociti attivati. Le cellule γδ Treg che si ottengono tramite il metodo dell'invenzione sono altresì tutte positive per il marcatore di attivazione CD 127. Il CD127 è una proteina normalmente espressa su tutte le cellule T umane e la cui presenza viene regolata negativamente in seguito all'attivazione dei linfociti T. Nelle cellule αβ Treg, che per definizione esprimono Foxp3, la presenza della proteina CD127 sembra rimanere costantemente soppressa proprio a causa dell'azione di Foxp3 (Weihong L. et al. J Exp Med (2006) 203; 1701. La presenza di CD 127 sulle cellule γδ Treg ottenute tramite il metodo dell'invenzione è quindi una ulteriore caratteristica che le differenzia dalle cellule Treg finora studiate.

Il metodo dell'invenzione per la preparazione di una composizione di cellule comprendenti γδ Treg che esprimono Foxp3 comprende i seguenti stadi:

(i) mettere in coltura una preparazione biologica, preferibilmente di cellule ematiche, tipicamente cellule provenienti da citoaferesi, in presenza di un composto attivatore sintetico di linfociti T, di citochine, tipicamente IL-2 e IL-15, e di un fattore di crescita, tipicamente TGF-beta, per un tempo sufficiente ad ottenere una popolazione cellulare γδ T contenente almeno il 30% di γδ Treg esprimenti Foxp3;

(ii) recuperare le cellule così ottenute, ad esempio tramite separazione eitofluorimetrica, ad esempio con Citofluorimetro (FACS-Vantage, FACS-Aria) (Becton Dickinson) o simili, ovvero mediante metodi immunomagnetici (Molday RS, Yen SP, Rembaum A. Nature (1977) 268:437).

La preparazione biologica dello stadio (i) è in genere un campione di linfociti ottenuto ad esempio tramite purificazione delle PBMC a partire da un normale prelievo di sangue periferico o per citoaferesi, anche precedentemente congelate. Le PBMC da sangue periferico sono preferibilmente isolate tramite Ficoll-Hypaque secondo metodi noti agli esperti nel campo. In particolare, il sangue viene stratificato su un gradiente di densità (Ficoll-Hypaque) e tramite centrifugazione le cellule mononucleate vanno a formare un anello (buffy coat) che viene facilmente raccolto ed utilizzato.

I linfociti presenti nel buffy coat vengono coltivati in terreno adatto fra quelli in commercio, ad esempio in terreno RPMI 1640 completo contenente 10% FBS (Fetal Bovine Serum, siero fetale bovino) inattivato al calore, in presenza di citochine, attivatori di proliferazione e fattori di crescita.

Le citochine sono in particolare interleuchine, più in particolare IL-2, impiegabile preferibilmente ad una concentrazione di circa 20-100U/ml, e IL-15, impiegabile preferibilmente ad una concentrazione di circa 2500-6500U/ml, e relative miscele.

II fattore di crescita appartiene alla famiglia dei TGF-β (Transforming Growth Factor β, fattore di crescita trasformante β) ed è impiegabile ad una concentrazione compresa fra circa 0,5 ng/rnl e 2,5 ng/ml. Esso può essere di origine umana o animale, preferibilmente umana. Particolarmente preferito è il TGF-βΙ. Per gli scopi dell’invenzione sono impiegabili anche varianti naturali o sintetiche dei fattori di crescita, intendendosi per varianti le catene polipeptidiche che, per mutazione, delezione, sostituzione e/o addizione di uno o più amminoacidi, conservano la capacità di generare γδ Treg che esprimono Foxp3.

L’attivatore sintetico è un composto specifico per la proliferazione dei linfociti T γδ, esso è per esempio un fosfoantigene scelto fra quelli descritti in WO95/20673, particolarmente preferito è ΓΙΡΡ (US5639653), impiegabile ad una concentrazione compresa fra 10 pg/ml e 50 pg/ml. Esso è presente solo nello stadio iniziale della coltura, per dare avvio alla proliferazione.

Secondo il metodo dell’invenzione, vantaggiosamente i linfociti vengono messi in coltura inizialmente in presenza di attivatore, citochine e fattori di crescita per almeno tre giorni, preferibilmente per un periodo compreso tra i 3 ed i 10 giorni a 37°C. Ogni 3 giorni metà del terreno di coltura esausto viene sostituito con lo stesso terreno di coltura, ma privo dell'attivatore sintetico specifico, per un periodo di tempo che tipicamente va da 3 a 30 giorni;

Secondo il metodo dell'invenzione, dopo 4 giorni in coltura, da lOOxlO<6>linfociti totali messi in coltura alla concentrazione di 4xl0<6>cellule/ml tipicamente si ottengono:

10-15% di cellule Vy9V52;

- . , 30-50% di γδ Treg tra le Vy9V52.

La sottopopolazione di cellule γδ Treg ottenuta tramite il metodo dell'invenzione può essere usata al momento della preparazione, può venire immessa in sacche di citoaferesi, oppure può venire stabilizzata per la conservazione secondo metodi noti all'esperto nel ramo, eventualmente può essere crioconservata. Generalmente, le cellule vengono mantenute in un mezzo che contiene un agente stabilizzante quale un polimero o una particolare proteina neutra. Un esempio di proteina che viene comunemente usata a questo scopo è la HSA (human serum albumin, albumina di siero umano), della quale sono reperibili in commercio delle preparazioni anche per uso parenterale.

Le cellule ottenute secondo il metodo dell'invenzione possono essere combinate in una composizione farmaceutica comprendente ulteriormente carriere farmaceuticamente accettabili, agenti veicolanti, stabilizzanti, conservanti e eccipienti in sé noti. Tali composizioni possono essere formulate in forma liquida per uso parenterale e possono essere preparate al fine di un utilizzo simultaneo, separato o spaziato nel tempo, eventualmente in combinazione con altre terapie farmacologiche.

I metodi di applicazione/somministrazione delle cellule dell’invenzione possono essere diversi a seconda del tipo di utilizzo e dipendono dal particolare modello terapeutico in oggetto. Nel caso si desideri ad esempio indurre una tolleranza specifica per un organo solido oggetto di trapianto, è auspicabile un trattamento preventivo dell’organo da trapiantare con cellule T regolatone inibenti ottenute da PBMC preferibilmente ma non necessariamente del ricevente, in modo da indurre uno stato di tolleranza limitato al solo sito del tessuto trapiantato, senza modificare in alcun modo la competenza immunologica sistemica. Il trattamento potrebbe consistere nel porre in contatto l’organo da trattare, opportunamente rimosso dalla sua sede naturale, con una quantità efficace di una coltura di cellule γδ Treg esprimenti Foxp3 per un tempo sufficiente a prevenire il rigetto dell’organo una volta trapiantato.

Le popolazioni cellulari dell’invenzione possono essere impiegate nella preparazione di composizioni farmaceutiche per la modulazione delle difese immunitarie in pazienti affetti da malattie autoimmuni per limitare il danno causato da una eccessiva o anormale risposta del sistema immunitario. Qualsiasi organo all'interno del sistema cardiocircolatorio, del tratto digerente, del sistema visivo, del sistema endocrino, della pelle, delle articolazioni, dei reni, dei polmoni, del sistema muscolare e del sistema nervoso può venire interessato da una malattia autoimmune (NIH Publication No.02 4858, (2002) "Questione and answers about autoimmunity").

E’ ragionevole proporre che la terapia Treg infusionale possa venire affiancata alle terapie farmacologiche immunosoppressorie tradizionali. In tale modo può essere previsto l'utilizzo di un più basso dosaggio dei farmaci immunosoppressori, con la conseguente riduzione degli effetti collaterali, fino ad arrivare alla totale soppressione della terapia immunosoppressoria, in seguito alla avvenuta realizzazione di uno stato di tolleranza immunitaria acquisita. I vantaggi rispetto alla terapia con Treg α/β riguardano il maggior numero di cellule ottenibili mediante espansione in vitro, nonché una migliore efficacia dipendente dalla più lunga permanenza del marcatore Foxp3 sulle γδ Treg.

Gli esempi seguenti servono ad illustrare l'invenzione e non sono da considerare limitativi della portata della medesima.

Esempio 1. Generazione in vitro dei γδ Treg.

I linfociti sono stati isolati da buffy coats di donatori sani tramite Ficoll-Hypaque (Pharmacia, Uppsala, Sweden) come sopra descritto e coltivati alla concentrazione di 4xlO<G>cellule/ml in terreno completo (RPMI 1640 con il 10% FBS inattivato al calore, 2 mM L-Glutamina, 100 U/ml penicillina e 100 mg/ml streptomicina) in presenza di interleuchina-2 (IL-2, 100 U/ml), interleuchina-15 (IL- 15, 4500 U/ml), Trasforming Growth Factor- 1 (TGF-βΙ, 1,7 ng/ml) e uno stimolo specifico per il linfociti T Vy9V52, quali l’isopentenilpirofosfato (IPP, 20 pg/ml). Al terzo giorno la metà del terreno di coltura è stato sostituito con terreno fresco e sono state aggiunte di nuovo le citochine e il fattore di crescita. Al quarto giorno, si è proceduto alla valutazione della induzione delle cellule γδ Treg. Le cellule furono lavate con tampone PBS contenente 1% di BSA e 0,1% di sodio azide e furono incubate per 15 minuti a 4°C con i seguenti anticorpi monoclonali contro le proteine umane: anti*V62 coniugato con FITC; anti-CD25 coniugato con PE-C5 e anti- CD 127 coniugato con APC. In seguito fu eseguita anche una colorazione intracellulare con l'anticorpo contro la proteina FoxP3 umana coniugato con PE.

AI 5° giorno è stata eseguita la separazione dei linfociti T Vy9V62 totali tramite il citofluorimetro FACSVantage. Poiché non è possibile utilizzare il marcatore Foxp3 per la selezione delle cellule al citofluorimetro a causa della espressione intracellulare i linfociti T Vy9V62 isolati, arricchiti o meno in γδ Treg sono stati direttamente utilizzati per i test di proliferazione. In Figura 1A e 1B sono illustrati i risultati dell’analisi citofluorimetrica su leucociti umani dopo 4 giorni di coltura in presenza e in assenza degli agenti stimolatori dell'invenzione atti a generare le cellule γδ Treg che esprimono il fattore di trascrizione Foxp3. Nella figura 1A il risultato è espresso come percentuali di cellule T γδ che esprimono Foxp3 ex vivo (cioè nel sangue periferico come raccolto), in presenza di condizioni standard di coltura ( IL-2/IPP) e secondo il metodo dell'invenzione ( IL-2/IPP/IL-15/TGF-fil ), rispetto alla popolazione di cellule T γδ totali. Nella figura 1B sono mostrate le rispettive elaborazioni grafiche dei risultati dell'analisi citofluorimetrica nelle differenti condizioni sopra descritte.

Esempio 2. Analisi fenotipica delle cellule γδ Treg.

I linfociti γδ Treg sono stati analizzati fenotipic amente tramite il citofluorimetro utilizzando i seguenti anticorpi coniugati a fiuorocromi: anti-V32-FITC, anti-CD4-FITC, anti-Foxp3-PE, anti-CD3.-PerCP, anti-CD25-PECy5, anti-CD127-APC, anti-CD27-PC5, anti-CD45RA-APC, anti-CTLA-4-PE, anti-CD45RO-APC, CD69-APC. In Figura 2 è illustrata la caratterizzazione fenotipica dei leucociti γδ Treg tramite analisi citofluorimetrica. È da notare che la fluorescenza mediana del picco per i differenti marcatori (indicata in figura) è maggiore nelle cellule T γδ dell'invenzione che esprimono anche il fattore Foxp3 (riquadro superiore) rispetto alle cellule T γδ che non lo esprimono (riquadro inferiore).

La colorazione per gli antigeni cellulari di superficie fu eseguita lavando le cellule con tampone PBS contenente 1% di BSA e 0,1% di sodio azide e incubandole per 15 minuti a 4°C con gli anticorpi sopra menzionati.

L’espressione di Foxp3 è stata valutata come segue. Le cellule mononucleate del sangue periferico, stimolate per 4 giorni con IL-2, IL- 15 e TGF-β in presenza di IPP, furono prima marcate con un anticorpo fluorescente specifico per la molecole di superficie V32, che identifica i linfociti con TCR Vy9V32 e in seguito furono marcate con un anticorpo monoclonale (BioLegend) con fluorescenza diversa dal precedente, specifico per il fattore di trascrizione citoplasmatico Foxp3 secondo le istruzioni del produttore. In breve, le cellule furono fissate in tampone Fix/Perm Buffer e incubate a temperatura ambiente al buio per 15 minuti. Le cellule furono in seguito lavate e permebilizzate con tampone Perm Buffer e incubate a temperatura ambiente al buio per 10 minuti. In seguito, nelle provette appropriate furono aggiunti Γ anticorpo monoclonale anti-Foxp3 coniugato con PE oppure l'anticorpo di controllo anti-IgG umane, isotipo k, coniugato con PE e furono incubate al buio per 20 minuti.

Le cellule così marcate furono acquisite con un citofluorimetro FACScalibur e la percentuale di cellule con recettore Vy9V52 che esprime Foxp3 fu analizzata utilizzando il software CellQuest (Becton Dickinson Immunocytometry Systems).

Esempio 3. Analisi funzionale delle cellule γδ Treg.

La capacità antiproliferativa delle cellule γδ Treg, è stata misurata utilizzando il metodo del Carboxyfluorescein Diacetate, Succinimidyl Ester (CFDA, SE), un marcatore intracitoplasmatico fluorescente la cui concentrazione intracellulare si dimezza ad ogni divisione cellulare. Tale dimezzamento viene rilevato al citofluorimetro come picchi con intensità di fluorescenza decrescente che rappresentano le cellule che hanno subito una o più divisioni cellulari.

Per questa analisi, linfociti periferici autoioghi furono marcati con Carboxyfluorescein Diacetate Succinimidyl Ester (CFDA SE; Pharmingen-BD), incubandole con CFSE marcato con FITC a temperatura ambiente al buio per 5 minuti. Le cellule furono poi lavate tre volte con tampone PBS supplementato con 5% di FCS e furono risospese nel mezzo di coltura completo. In seguito la proliferazione delle cellule marcate fu provocata coltivandole alla concentrazione di 4xl0<6>cellule/ml in presenza di IL-2 (100 U/ml), in piastre pre-rivestite con anti-CD3 (5 pg/ml) e anti-CD28 (10 pg/ml) da sole o in presenza di:

- cellule T γδ isolate e arricchite in γδ Treg (Foxp3<+>); oppure in presenza di cellule V52-CD25 -Foxp3- isolate; oppure - in presenza di cellule T γδ.

Dopo 5 giorni di coltura la proliferazione delle cellule mononucleate autologhe fu analizzata al citofluorimetro. Nella Figura 3 sono mostrati i risultati dell'esperimento di inibizione della proliferazione sopra descritto. I picchi a destra nei rispettivi profili rappresentano le cellule αβ marcate che non proliferano. I picchi intermedi e a sinistra nei rispettivi profili rappresentano le cellule αβ marcate che hanno proliferato e quindi mostrano una fluorescenza sempre meno intensa. Si noti come solo le cellule γδ Treg ottenute tramite il metodo dell'invenzione che esprimono Foxp3 (γδ Treg) sono capaci di inibire la proliferazione dei linfociti T αβ stimolati (tracciato n°4). Infatti, né l'aggiunta ai linfociti stimolati di una popolazione totale di cellule T γδ purificate (tracciato 2), né quella di una popolazione selezionata di cellule T Vy9V62 che non esprimono Foxp3 (cellule V52-CD25-; tracciato 3) è capace di inibire la proliferazione dei linfociti stimolati.

Claims (26)

1. Rivendicazioni 1. Metodo per la preparazione in vitro di linfociti T γδ che esprimono il fattore di trascrizione Foxp3 con funzione regolatoria comprendente: (i) la coltivazione di un campione biologico di cellule mononucleate del sangue periferico, eventualmente preventivamente scongelate, in presenza di un attivatore sintetico di linfociti, di citochine e fattori di crescita in condizioni da generare ed espandere detti linfociti; e (ii) recuperare le cellule così ottenute.
2. 2. Metodo secondo la rivendicazione 1 in cui le cellule mononucleate del sangue periferico sono prelevate per citoaferesi.
3. 3. Metodo secondo le rivendicazioni 1-2 in cui le cellule sono umane.
4. 4. Metodo secondo le rivendicazioni 1-3 in cui le cellule sono cellule mononucleate del sangue periferico.
5. 5. Metodo secondo le rivendicazioni 1-4 in cui le cellule sono una sottopopolazione di cellule T γδ, denominata Vy9V62.
6. 6. Metodo secondo le rivendicazioni 1-5 in cui le cellule ottenute sono separate per citofluorimetria o per metodi immunomagnetici.
7. 7. Metodo secondo le rivendicazioni 1-6 in cui la coltivazione è condotta in terreno RPMI completo contenente siero fetale bovino.
8. 8. Metodo secondo le rivendicazione 1-7 in cui le citochine sono scelte fra IL-2, impiegabile preferibilmente ad una concentrazione di circa 20-100U/ml, e IL- 15, impiegabile preferibilmente ad una concentrazione di circa 2500-6500U/ml, e relative miscele.
9. 9. Metodo secondo le rivendicazioni 1-8 in cui il fattore di crescita appartiene alla famiglia dei TGF-beta, particolarmente TGF-βΙ, ed è impiegabile ad una concentrazione compresa fra circa 0,5 ng/ml e 2,5 ng/ml.
10. 10. Metodo secondo le rivendicazioni 1-9 in cui l’attivatore sintetico è un composto specifico per la proliferazione dei linfociti T γδ, della classe dei fosfoantigeni, preferibilmente IPP, impiegabile ad una concentrazione compresa fra 10 pg/ml e 50 μg/ml.
11. 11. Metodo secondo le rivendicazioni 1-10 in cui i linfociti vengono messi in coltura inizialmente in presenza di attivatore, citochine e fattori di crescita per almeno tre giorni, preferibilmente per un periodo compreso tra i 3 ed i 10 giorni a 37°C, poi ogni 3 giorni metà del terreno di coltura esausto viene sostituito con lo stesso terreno di coltura, ma privo dell'attivatore sintetico specifico.
12. 12. Metodo secondo le rivendicazioni 1-11 in cui i linfociti totali messi in coltura sono circa lOOxlO<6>alla concentrazione di 4xlO<G>cellule/ml e da essi si ottengono: - 10-15% di cellule Vy9V62; -... 30-50% di γδ Treg tra le Vy9V52.
13. 13. Cellule γδ Treg caratterizzate dal fatto di esprimere il fattore nucleare di trascrizione Foxp3 e di mostrare le seguenti ulteriori caratteristiche: essere CD4 e CD8 negative; esprimere i seguenti marcatori di superficie CD25, CTLA-4, CD127, CD45RO, CD69, CD27.
14. 14. Colture cellulari ottenute con il metodo secondo le rivendicazioni 1-12, caratterizzate dal comprendere almeno il 30% di cellule γδ Treg sulla popolazione totale di linfociti γδ T dopo 4 giorni in coltura.
15. 15. Cellule e colture cellulari secondo le rivendicazioni 13 e 14 da impiegare in campo farmaceutico.
16. 16. Composizioni farmaceutiche caratterizzate dal comprendere le cellule e colture cellulari secondo le rivendicazioni 13 e 14.
17. 17. Composizioni farmaceutiche secondo la rivendicazione 16 comprendenti ulteriormente un veicolo farmaceuticamente accettabile quale un agente stabilizzate, ad es. la siero- albumina umana.
18. 18. Cellule e colture cellulari secondo le rivendicazioni 13 e 14 da impiegare in campo farmaceutico per il trattamento delle patologie che traggono beneficio dalla modulazione negativa della risposta immunitaria.
19. 19. Cellule e colture cellulari secondo le rivendicazioni 13 e 14 da impiegare in campo farmaceutico per il trattamento e la prevenzione del rigetto dei trapianti.
20. 20._ Cellule e colture cellulari secondo le rivendicazioni 13 e 14 da impiegare in campo farmaceutico per il trattamento delle malattie autoimmuni.
21. 21. Cellule e colture cellulari secondo la rivendicazione 20 in cui le malattie autoimmuni sono a carico del sistema cardiocircolatorio, del tratto digerente, del sistema visivo, del sistema endocrino, della pelle, delle articolazioni, dei reni, dei polmoni, del sistema muscolare e del sistema nervoso.
22. 22. Cellule e colture cellulari secondo la rivendicazione 20 in cui le malattie autoimmuni sono scelte fra: diabete autoimmune, sclerosi multipla, allergie, artrite reumatoide, asma, rinite, dermatite atopica
23. 23. Uso di cellule e colture cellulari secondo le rivendicazioni 13 e 14 per scopi farmaceutici, cosmetici e di ricerca.
24. 24. Uso di cellule e colture cellulari secondo le rivendicazioni 13 e 14 da impiegare in campo farmaceutico per il trattamento delle patologie che traggono beneficio dalla modulazione negativa della risposta immunitaria.
25. 25. Uso di cellule e colture cellulari secondo le rivendicazioni 13 e 14 da impiegare in campo farmaceutico per il trattamento e la prevenzione del rigetto dei trapianti.
26. 26. Uso di cellule e colture cellulari secondo le rivendicazioni 13 e 14 da impiegare in campo farmaceutico per il trattamento delle malattie autoimmuni. 27. , Uso secondo la rivendicazione 26 in cui le malattie autoimmuni sono a carico del sistema cardiocircolatorio, del tratto digerente, del sistema visivo, del sistema endocrino, della pelle, delle articolazioni, dei reni, dei polmoni, del sistema muscolare e del sistema nervoso.