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ITMI20120661A1 - Composizione per il trattamento delle neuropatie - Google Patents

Composizione per il trattamento delle neuropatie Download PDF

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Publication number
ITMI20120661A1
ITMI20120661A1 IT000661A ITMI20120661A ITMI20120661A1 IT MI20120661 A1 ITMI20120661 A1 IT MI20120661A1 IT 000661 A IT000661 A IT 000661A IT MI20120661 A ITMI20120661 A IT MI20120661A IT MI20120661 A1 ITMI20120661 A1 IT MI20120661A1
Authority
IT
Italy
Prior art keywords
alpha
onochiol
lipoic acid
acid
culture
Prior art date
Application number
IT000661A
Other languages
English (en)
Inventor
Carlo Terruzzi
Fabio Terruzzi
Original Assignee
Giellepi S P A
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Giellepi S P A filed Critical Giellepi S P A
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Priority to US14/395,265 priority patent/US9642834B2/en
Priority to ES13725811.7T priority patent/ES2577385T3/es
Priority to PL13725811T priority patent/PL2838529T3/pl
Priority to EP13725811.7A priority patent/EP2838529B1/en
Priority to RU2014146562A priority patent/RU2636613C2/ru
Priority to PCT/IB2013/053102 priority patent/WO2013156971A1/en
Priority to CN201380020986.2A priority patent/CN104254329B/zh
Priority to PT137258117T priority patent/PT2838529E/pt
Publication of ITMI20120661A1 publication Critical patent/ITMI20120661A1/it
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Description

COMPOSIZIONE PER IL TRATTAMENTO DELLE NEUROPATIE
La presente invenzione riguarda una composizione per il trattamento delle neuropatie, ed in particolare una composizione per il trattamento delle sindromi sensoriali e dolorose proprie della neuropatia periferica.
Sono note numerose composizioni utili per la somministrazione a persone affette da neuropatie.
In particolare, à ̈ noto che le composizioni comprendenti acido alfa-lipoico hanno un effetto benefico nel trattamento delle neuropatie, particolarmente delle neuropatie acquisite periferiche. L’acido alfa-lipoico infatti migliora la barriera antiossidante e deprime lo stress ossidativo aumentando i livelli di glutatione, migliora la velocità della comunicazione nervosa, ottimizzandone così la funzionalità, ed esercita infine un’azione normalizzante nei confronti della sensibilità nervosa, riducendo in tal modo sia il dolore che la torbidità sensoriale.
Studi recenti in vivo hanno confermato gli effetti neuroprotettivi e cardioprotettivi dell’acido alfa-lipoico.
Sono note composizioni dietetiche comprendenti acido alfa-lipoico per una somministrazione giornaliera unica di 300 mg o 600 mg di acido alfa-lipoico, a rilascio rapido o convenzionale.
Gli studi pubblicati “Oral Treatment With α-Lipoic Acid Improves Symptomatic Diabetic Polyneuropathy- The SYDNEY 2 trial†Dan Ziegler et. al., Diabetes Care, Novembre 2006 vol. 29 no. 11, pag. 2365-2370, e “Thioctic Acid and Acetyl-L-Carnitine in the Treatment of Sciatic Pain Caused by a Herniated Disc†Antonio Memeo e Mario Loiero, Clin. Drug Investigation 2008, vol. 28, pag 495-500, riportano che un dosaggio giornaliero di 600 mg di acido alfa-lipoico fornisce il miglior rapporto rischio/beneficio per il trattamento dei sintomi della polineuropatia diabetica e del dolore sciatico. Secondo il primo studio, rispetto al dosaggio giornaliero di 600 mg, i maggiori dosaggi di 1200 mg e 1800 mg non forniscono una migliore risposta in termini di miglioramento dei sintomi di polineuropatia diabetica. Lo studio evidenzia inoltre un aumento dose-dipendente degli effetti collaterali legati all’acido alfa-lipoico, come nausea, vomito e vertigini.
E’ anche noto che la corteccia di Magnolia, un fitoderivato ottenuto dalla Magnolia Officinalis, appartenente alla famiglia delle Magnoliacee, contiene due composti fenolici, onochiolo e magnololo. Alla corteccia di Magnolia vengono attribuite numerose proprietà farmacologiche, per esempio proprietà ansiolitiche, antiinfiammatorie, antimicrobiche, antiossidanti, antiaggregante piastrinica e neurotrofica.
Fukuyama Y., Nakade K., Minoshima Y., Yokoyama R., Zhai H., Mitsumoto Y. “Neurotrophic activity of honokiol on the cultures of fetal rat cortical neurons†Bioorg. Med. Chem. Lett. 2002 Apr. 22;12 (8):1163-6 descrive una attività neurotrofica dell’onochiolo a concentrazioni da 0,1 a 10 µM sulle colture di neuroni corticali di ratto. Nei neuroni corticali, l’onochiolo à ̈ in grado di promuovere la crescita del neurite. Inoltre l’onochiolo si à ̈ dimostrato in grado di aumentare la sopravvivenza e lo sviluppo dei neuroni delle colture primarie.
Per quanto concerne l’attività neurotrofica dell’onochiolo, Lee YJ. et al. “Therapeutic applications of compounds in the magnolia family†, Pharmacol. Ther.
2011; 130(2): 157-76 descrive dosaggi efficaci su ratto compresi tra 0,01g/kg e 0,25g/kg. Non sono noti studi che evidenzino un dosaggio efficace nell’uomo.
US2006251608 descrive formulazioni per il trattamento della pelle invecchiata, comprendenti antiossidanti, co-promotori di antiossidazione, antiinfiammatori, vitamine, minerali e promotori di sintesi del collagene. Non à ̈ menzionata alcuna efficacia di tali formulazioni per il trattamento delle neuropatie. L’acido alfa-lipoico e l’onochiolo sono entrambi menzionati come possibili antiossidanti in tali formulazioni, ma non viene specificamente descritta una combinazione di tali composti.
Sono noti alcuni integratori alimentari per sportivi, utili per migliorare la massa muscolare, la resistenza e la forza fisica, i quali comprendono tra i numerosi componenti anche acido alfa-lipoico e corteccia di magnolia contenente il 2% di onochiolo. Non à ̈ riportato alcun effetto di tali integratori per il trattamento delle neuropatie, ed inoltre la quantità di onochiolo in tali integratori à ̈ estremamente ridotta. In particolare, il rapporto tra onochiolo e acido alfa-lipoico in tali integratori noti risulta essere inferiore allo 0,3%.
Scopo della presente invenzione à ̈ pertanto quello di fornire una composizione comprendente acido alfa-lipoico ed avente una attività migliorata nel trattamento dei sintomi e dei dolori neuropatici. Detto scopo viene conseguito con una composizione le cui caratteristiche principali sono specificate nella prima rivendicazione, ed una formulazione farmaceutica o dietetica le cui caratteristiche sono specificate nella rivendicazione 9. Altre caratteristiche della composizione e della formulazione secondo la presente invenzione sono specificate nelle restanti rivendicazioni.
La composizione secondo la presente invenzione comprende acido alfa-lipoico, o un suo sale o complesso, ed onochiolo, ed à ̈ caratterizzata per il fatto che la quantità in peso dell’onochiolo à ̈ compresa tra 1% ed il 30% rispetto al peso totale dei due componenti onochiolo e acido alfa-lipoico.
L’acido alfa-lipoico contenuto nella composizione secondo la presente invenzione può essere costituito dalla sua forma racemica, ovvero da una miscela delle due forme enantiomeriche R ed S, e/o loro sali o complessi, oppure la composizione secondo la presente invenzione può comprendere solo la forma enantiomerica R biologicamente attiva, o un suo sale o complesso.
Gli inventori hanno infatti sorprendentemente riscontrato che l’efficacia dell’acido alfa-lipoico nel trattamento delle neuropatie e delle sindromi dolorose ad esse associate risulta potenziato, per un effetto di sinergia, dall’associazione di detto acido alfa-lipoico con onochiolo in determinate proporzioni.
In particolare, gli studi condotti dagli inventori hanno evidenziato che in colture primarie di neuroni, una somministrazione di composizioni di acido alfa-lipoico ed onochiolo secondo l’invenzione risulta efficace nel promuovere l’estensione dei neuriti e la sopravvivenza cellulare, mentre una analoga somministrazione di composizioni comprendenti acido alfa-lipoico ed onochiolo in quantità da 0 a 1% non risulta promuovere significativamente l’estensione dei neuriti.
Preferibilmente, la quantità in peso di detto onochiolo nella composizione secondo la presente invenzione à ̈ compresa tra il 2% ed il 15%, più preferibilmente tra il 3% ed il 10% rispetto al peso totale di onochiolo e acido alfa-lipoico.
Si à ̈ infatti trovato che gli intervalli sopra indicati rappresentano i rapporti ottimali tra le concentrazioni di acido alfa-lipoico ed onochiolo, ed in tali rapporti i due principi attivi presentano un evidente effetto sinergico come evidenziato dalla significativa attività dell’associazione rispetto sia a quella dell’acido alfa-lipoico, che a quella dell’onochiolo, usati singolarmente.
Come sali o complessi dell’acido alfa-lipoico, nella composizione secondo la presente invenzione possono essere per esempio utilizzati sali idrosolubili come R-lipoato di sodio o potassio, ed altri sali solubili sia dell’enantiomero R che del racemo RS.
La composizione secondo la rivendicazione precedente comprende inoltre preferibilmente altri principi attivi che, in combinazione con acido alfa-lipoico, o un suo sale o complesso, ed onochiolo, formano una composizione particolarmente efficace nel trattamento delle neuropatie non diabetiche e periferiche.
Preferibilmente, la composizione secondo la presente invenzione comprende quindi acido gamma-linolenico o un suo sale o complesso, per esempio il sale di sodio dell’acido gamma-linolenico. Preferibilmente, la quantità in peso di detto acido gammalinolenico nella composizione secondo la presente invenzione à ̈ compresa tra il 2 e il 30% rispetto al peso totale di onochiolo e acido alfa-lipoico. Più preferibilmente, la quantità in peso di detto acido gamma-linolenico nella composizione secondo la presente invenzione à ̈ compresa tra il 15 e il 25% rispetto al peso totale di onochiolo e acido alfa-lipoico.
La composizione secondo la presente invenzione comprende preferibilmente anche una fonte fisiologicamente accettabile di selenio. Per fonte fisiologicamente accettabile di selenio, nella presente descrizione e nelle rivendicazioni si intende indicare qualsiasi fonte di selenio assimilabile, utilizzabile in composizioni dietetiche o farmaceutiche, per esempio un sale di selenio o selenio complessato con un amminoacido. Preferibilmente, come fonte fisiologicamente accettabile di selenio viene utilizzato un composto scelto nel gruppo formato da selenometionina, selenito di sodio, selenato di sodio e lievito al selenio.
Preferibilmente, la quantità in peso di detta fonte fisiologicamente accettabile di selenio nella composizione secondo la presente invenzione à ̈ tale da fornire una quantità di selenio compresa tra lo 0,0001% e il 2% rispetto al peso totale di onochiolo e acido alfa-lipoico. Più preferibilmente, la quantità in peso di detta fonte fisiologicamente accettabile di selenio nella composizione secondo la presente invenzione à ̈ tale da fornire una quantità di selenio compresa tra lo 0,0001% e lo 0,1% rispetto al peso totale di onochiolo e acido alfa-lipoico.
La composizione secondo la presente invenzione comprende preferibilmente inoltre almeno un componente scelto nel gruppo formato da vitamina C, vitamina E e vitamine del gruppo B, per esempio vitamine B1, B2, B5, B6 e B12.
La composizione secondo l’invenzione può essere formulata in qualsiasi forma adatta per somministrazione orale. In particolare, in un suo aspetto, l’invenzione riguarda una formulazione dietetica o farmaceutica per somministrazione orale, comprendente una composizione come sopra definita, in forma di pillola, compressa, capsula, compressa masticabile, chewing gum, pellets, polvere per sospensione orale, polvere granulare da ricostituire o orosolubile, sospensione orale, sciroppo.
La composizione secondo la presente invenzione può quindi comprendere anche eccipienti, aromi ed altre sostanze approvate per uso alimentare e farmaceutico a seconda del tipo di formulazione desiderata. Eccipienti adatti per la produzione di compresse o capsule sono, per esempio, amido di patata, di frumento o di mais, amido parzialmente pregelatinizzato, cellulosa microcristallina, calcio fosfato bibasico, calcio carbonato, polioli come ad esempio mannitolo e sorbitolo, maltodestrine, lattosio, silice colloidale, biossido di silicio altamente disperso, gliceril beenato, glicole propilenico, polivinilpirrolidone, polivinilpirrolidone reticolato, esteri ed eteri della cellulosa (es. carbossimetilcellulosa, idrossipropilmetil cellulosa, idrossipropil cellulosa), sodio cross caramellose, alginati, carragenine, stearato di magnesio, sodio stearil fumarato, titanio biossido, gelatina, oli vegetali quali ad esempio olio di soia, di girasole, poliglicerol oleato, glicerolo, trigliceridi degli acidi grassi, lecitina.
Preferibilmente, la formulazione secondo l’invenzione à ̈ in forma di compresse o capsule adatte alla somministrazione giornaliera di una quantità di acido alfa-lipoico compresa tra 200 mg e 1300 mg, e di una quantità di onochiolo tra 2,5 mg e 150 mg.
Più preferibilmente, la formulazione secondo l’invenzione à ̈ in forma di compresse o capsule adatte alla somministrazione giornaliera di una quantità da 580 mg a 620 mg di acido alfa-lipoico e di una quantità da 45 mg a 60 mg di onochiolo, oppure adatte alla somministrazione giornaliera di una quantità da 280 mg a 320 mg di acido alfa-lipoico e da 20 mg a 30 mg di onochiolo.
Ancora più preferibilmente, la formulazione secondo l’invenzione à ̈ in forma di compresse o capsule adatte alla somministrazione giornaliera di una quantità di 600 mg di acido alfa-lipoico e di una quantità di 54 mg di onochiolo, oppure adatte alla somministrazione giornaliera di una quantità di 300 mg di acido alfa-lipoico e di 27 mg di onochiolo.
Con l’espressione “adatte alla somministrazione giornaliera di†, nella presente descrizione e nelle rivendicazioni si intende che ciascuna capsula o compressa contiene le quantità complessive indicate di principi attivi, oppure frazioni delle stesse quantità tali da consentire la somministrazione delle quantità complessive mediante più capsule o compresse. Per esempio, capsule o compresse contenenti circa 300 mg di acido alfalipoico e 15 mg di onochiolo si intendono adatte alla somministrazione giornaliera di circa 600 mg di acido alfa-lipoico e 30 mg di onochiolo.
L’acido gamma linolenico o detto suo sale o complesso sono contenuti nella formulazione secondo la presente invenzione in quantità comprese tra 10 mg e 300 mg.
Una formulazione preferita secondo l’invenzione à ̈ adatta alla somministrazione giornaliera di una quantità da 580 mg a 620 mg di acido alfa-lipoico, di una quantità da 45 mg a 60 mg di onochiolo e di una quantità da 125 mg a 140 mg di acido gammalinolenico ed à ̈ nella forma di capsule molli di gelatina. Un’altra formulazione preferita secondo l’invenzione, nella forma di capsule molli di gelatina, à ̈ adatta alla somministrazione giornaliera di una quantità da 280 mg a 320 mg di acido alfa-lipoico, di una quantità da 20 mg a 30 mg di onochiolo e di una quantità da 60 mg a 70 mg di acido gamma-linolenico.
La già descritta fonte fisiologicamente accettabile di selenio à ̈ contenuta nella formulazione secondo la presente invenzione in quantità tale da fornire una quantità di selenio compresa tra 1 µg e 90 µg.
La vitamina C à ̈ preferibilmente compresa nella formulazione secondo la presente invenzione in quantità compresa tra 20 mg e 1000 mg.
La vitamina E à ̈ preferibilmente compresa nella formulazione secondo la presente invenzione in quantità compresa tra 1 mg e 100 mg
La vitamina B1 à ̈ preferibilmente compresa nella formulazione secondo la presente invenzione in quantità compresa tra 1 mg e 5 mg.
La vitamina B2 à ̈ preferibilmente compresa nella formulazione secondo la presente invenzione in quantità compresa tra 1 mg e 5 mg.
La vitamina B5 à ̈ preferibilmente compresa nella formulazione secondo la presente invenzione in quantità compresa tra 1 mg e 20 mg
La vitamina B6 à ̈ preferibilmente compresa nella formulazione secondo la presente invenzione in quantità compresa tra 1 mg e 8 mg
La vitamina B12 à ̈ preferibilmente compresa nella formulazione secondo la presente invenzione in quantità compresa tra 0,001 mg e 0,020 mg.
Una formulazione preferita secondo l’invenzione comprende circa 600 mg di acido alfa-lipoico, circa 54 mg di onochiolo, circa 140 mg di acido gamma linolenico e circa 0,110 mg di sodio selenito.
Un’altra formulazione preferita secondo l’invenzione comprende circa 300 mg di acido alfa-lipoico, circa 27 mg di onochiolo, e circa 66 mg di acido gamma linolenico e circa 0,055 mg di sodio selenito.
La tecnica di preparazione della composizione secondo la presente invenzione viene scelta anch’essa in funzione del tipo di somministrazione e di altre considerazioni di carattere pratico.
Per la preparazione delle formulazioni secondo la presente invenzione può essere utilizzata qualsiasi tecnica nota agli esperti del ramo per la produzione di compresse che impiegano un principio attivo bassofondente, per esempio una compressione diretta dopo miscelazione di polveri, una compressione dopo granulazione (per esempio in letto fluido) ad umido o a secco, una compressione di granuli o pellets. Per la produzione di capsule, può essere utilizzato per esempio il riempimento di involucri preformati (corpo) con polveri, granuli, minicompresse o pellets e successiva chiusura per applicazione di una testa; la formatura di fogli di gelatina con incorporato un plasticizzante opportuno, eventualmente colorate e contemporaneo riempimento con liquidi (es. metodo Sherer) o con solidi (es. metodo Accogel); il gocciolamento di gelatina con plasticizzante ed eventualmente gli attivi, in soluzioni oleose fredde (es. metodo del gocciolamento).
I vantaggi delle composizioni e formulazioni secondo la presente invenzione risulteranno evidenti agli esperti del ramo dai seguenti esempi, con riferimento alle figure annesse in cui:
- la figura 1a mostra una fotografia di una coltura cellulare primaria di neuroni corticali di ratto dopo 7 giorni in EtOH 0,5%;
- la figura 1b mostra una fotografia di una coltura cellulare primaria di neuroni corticali di ratto dopo 7 giorni in EtOH 0,5% addizionato con 40 ng ml<-1>bFGF; - la figura 1c mostra una fotografia di una coltura cellulare primaria di neuroni corticali di ratto dopo 7 giorni in EtOH 0,5% addizionato con una soluzione 10 Î1⁄4M di acido alfa-lipoico 99,7% e onochiolo 0,3%;
- la figura 1d mostra una fotografia di una coltura cellulare primaria di neuroni corticali di ratto dopo 7 giorni in EtOH 0,5% addizionato con una soluzione 10 Î1⁄4M di acido alfa-lipoico 95,5% e onochiolo 4,5%;
- la figura 1e mostra una fotografia di una coltura cellulare primaria di neuroni corticali di ratto dopo 7 giorni in EtOH 0,5% addizionato con una soluzione 10 Î1⁄4M di acido alfa-lipoico 91% e onochiolo 9%;
- la figura 1f mostra una fotografia di una coltura cellulare primaria di neuroni corticali di ratto dopo 7 giorni in EtOH 0,5% addizionato con una soluzione 10 Î1⁄4M di acido alfa-lipoico 46% e onochiolo 54%;
- la figura 1g mostra una fotografia di una coltura cellulare primaria di neuroni corticali di ratto dopo 7 giorni di EtOH 0.5% addizionata con una soluzione 10µM di solo acido alfa-lipoico;
- la figura 1h mostra una fotografia di una coltura cellulare primaria di neuroni corticali di ratto dopo 7 giorni di EtOH 0.5% addizionata con una soluzione 10µM di solo onochiolo;
- la figura 2a mostra una fotografia di una coltura cellulare primaria di neuroni corticali di ratto dopo 4 giorni in EtOH 0,5%;
- la figura 2b mostra una fotografia di una coltura cellulare primaria di neuroni corticali di ratto dopo 4 giorni in EtOH 0,5% addizionato con una soluzione 10 Î1⁄4M di acido alfa-lipoico 99,7% e onochiolo 0,3%;
- la figura 2c mostra una fotografia di una coltura cellulare primaria di neuroni corticali di ratto dopo 4 giorni in EtOH 0,5% addizionato con una soluzione 10 Î1⁄4M di acido alfa-lipoico 91% e onochiolo 9%;
- la figura 2d mostra una fotografia di una coltura cellulare primaria di neuroni corticali di ratto dopo 4 giorni in EtOH 0,5% addizionato con una soluzione 10 Î1⁄4M di acido alfa-lipoico 46% e onochiolo 54%.
Materiali e metodi
La purezza dei composti utilizzati à ̈ stata verificata grazie alla cromatografia liquida ad alta prestazione (HPLC, picco singolo), con risonanza magnetica nucleare (H<1>) e (C<13>) e con spettrometria di massa ad alta risoluzione .
Il mezzo di coltura era mezzo di coltura di Dulbecco modificato (DMEM), il siero di feti di bovini (FBS) e il supplemento B27 furono reperiti presso Gibco BRL (NY,USA). I reagenti PD98059 [2-(2-amino-3-metossifenil)-4H-1-benzopiran-4-one], LY294002 [2-(4-morfolinil)-8-fenil-1(4H)-benzopiran-4one], e KN93 [N.[2-[N-(4-clorocinnamil)-N-metilaminometil]fenil]-N-(2-idrossietil)-4-metossibenzenesolfonammide sale fosfato] furono forniti da Sigma (MO, USA). I fattori di crescita dei fibroblasti (bFGF) ricombinanti umani furono forniti da Upsatate Biotechnology Inc. (NY, USA). Tutti gli altri reagenti utilizzati sono reagenti di massima purezza reperibili sul mercato.
ESEMPIO 1- Studio morfologico
Otto colture primarie cellulari furono preparate come descritto in Abe K et al. “Effects of recombinant human basic fibroblast growth factor and its modified protein CS23 on survival of primary cultured neurons from various regions of fetal rat brain.†, Jpn J Pharmacol 1990; 53(2): 221-7. Tutte le operazioni furono effettuate in condizioni di sterilità.
Le cellule neuronali furono separate da emisferi cerebrali di feti di ratti di 18 giorni (Japan SLC, Inc.) e sospese in 10% di FBS/MEM, poi seminate a 9000 cellule cm<-2>in poli-L-lisina in piastre.
Dopo 24 ore, il mezzo di coltura fu sostituito con un mezzo privo di siero, specifico per la crescita dei neuroni (Neurobasal Medium) supplementato con B27.
Poi, una prima coltura (A) fu utilizzata come coltura di controllo.
Una seconda coltura (B) fu addizionata con 40 ng mL<-1>di bFGF.
Una terza coltura (C) fu addizionata con acido alfa-lipoico 99.7% e onochiolo 0.3% fino a raggiungere la concentrazione complessiva di 10µM .
Una quarta coltura (D) fu addizionata con acido alfa-lipoico 95,5% e onochiolo 4,5% fino a raggiungere la concentrazione complessiva di 10µM.
Una quinta coltura (E) fu addizionata con acido alfa-lipoico 91% e onochiolo 9% fino a raggiungere la concentrazione complessiva di 10µM.
Una sesta coltura (F) fu addizionata con acido alfa-lipoico 46% e onochiolo 54% fino a raggiungere la concentrazione complessiva di 10µM.
Una settima coltura (G) fu addizionata con solo acido alfa-lipoico fino a raggiungere la concentrazione complessiva di 10µM.
Una ottava coltura (H) fu addizionata con solo onochiolo fino a raggiungere la concentrazione complessiva di 10µM.
Dopo essere state incubate per 6 giorni, le cellule delle otto colture furono fissate con formaldeide al 4%.
Sulle otto colture venne poi valutata la lunghezza dei neuriti a livello microscopico. I neuroni furono sottoposti a colorazione immunoistochimica per i microtubuli associati alla proteina - 2 (MAP2) secondo il metodo istochimico per la lunghezza dei neuriti, come descritto in Fukuyama Y et al. “Neurotrophic activity of honokiol on the cultures of fetal rat cortical neurons†, Bioorg. Med. Chem. Lett. 12, 1163-66 (2002). La lunghezza del neurite più esteso del corpo cellulare fu misurata e calcolata utilizzando i programmi software Lumina Vision e Mac-SCOPE, secondo il metodo sopra menzionato descritto in Fukuyama Y. et al. (2002). Le analisi morfometriche furono eseguite misurando la lunghezza del neurite più lungo di ciascun neurone utilizzando Lumina Vision e Mac-Scope software (Yoshiyasu Fukuyama et al.
2002).
I risultati sono mostrati in tabella 1, in cui p indica la significatività statistica ed ns significa “non significativo†.
Tabella 1
Coltura Rapporto ALA/ onochiolo Incremento Incremento lunghezza media rispetto al neurite (µm) riferimento (coltura A) A - 280 1
B - 295 (p=ns) 1,05
C ALA (99.7%) 450 (p= ns) 1,61
onochiolo (0.3%)
D ALA(95.5%) 585.4 (p<0,001)<2,09>
onochiolo (4.5%)
E ALA(91%) 630.7 (p<0,001)<2,25>
onochiolo (9%)
F ALA(46%) 289 (p= ns) 1,03
onochiolo (54%)
G ALA (100%) 285 (p=ns) 1,01
H Onochiolo (100%) 287 (p=ns) 1,02
La lunghezza dei neuriti nelle colture trattate con le composizioni testate secondo l’invenzione, con una concentrazione di onochiolo compresa tra il 4,5% e il 9%, risultò aumentata in maniera significativa (p<0,001), mentre le colture trattate con una composizione comprendente acido alfa-lipoico 99,7% e onochiolo 0,3% non presentavano un aumento statisticamente rilevante della lunghezza dei neuriti. La composizione comprendente acido alfa-lipoico al 95,5% in peso e onochiolo al 4,5% in peso, e quella comprendente acido alfa-lipoico al 91% in peso e onochiolo al 9% in peso risultarono efficaci nel promuovere in maniera significativamente rilevante l’estensione dei neuriti rispetto al controllo (coltura A) e alla coltura addizionata con fattori di crescita (coltura B), e soprattutto anche rispetto alla coltura addizionata con composizione comprendente acido alfa-lipoico al 99,7% in peso e onochiolo allo 0,3% in peso (coltura C). E’ da sottolineare che l’effetto della composizione secondo l’invenzione sia nelle proporzioni di 95,5% di acido alfa-lipoico e 4,5% onochiolo, che in quelle 91% acido alfa-lipoico e 9% di onochiolo, risultarono essere migliori di quello ottenuto con il fattore di crescita bFGF. La composizione comprendente acido alfalipoico al 46% in peso e onochiolo al 54% in peso invece inibì la crescita dei neuriti nella coltura F.
Le composizioni comprendenti solo acido alfa-lipoico o solo onochiolo hanno stimolato in modo del tutto trascurabile la crescita dei neuriti. Ne à ̈ risultato un valore non significativamente differente da quello della composizione controllo.
Anche la figura 1 mostra che, dopo 7 giorni di coltura cellulare, nelle colture C, D ed E (figure 1c, 1d ed 1e) i neuroni presentavano neuriti estesi e contenenti somi neuronali più prominenti e scuri rispetto alla coltura di controllo A (figura 1a), e migliori, soprattutto per quanto riguarda le colture D ed E ( figura 1d ed 1e) rispetto alle colture B (figura 1b) contenenti rispettivamente 40ng mL<-1>di bFGF e le colture dei singoli acido alfa-lipoico (figura 1g) o onochiolo (figura 1h).
I risultati della prova mostrano che le composizioni secondo l’invenzione hanno un effetto indubbio ed imprevedibile sulla differenziazione dei neuroni corticali.
ESEMPIO 2-Valutazione della sopravvivenza neuronale
Quattro colture cellulari primarie furono preparate come descritto in Abe K et al. “Effects of recombinant human basic fibroblast growth factor and its modified protein CS23 on survival of primary cultured neurons from various regions of fetal rat brain†, Jpn J Pharmacol 1990; 53(2): 221-7. Tutte le operazioni furono effettuate in condizioni di sterilità. Le cellule neuronali furono separate da emisferi cerebrali di feti di ratti di 18 giorni (Japan SLC, Inc.) e sospese in 10% di FBS/MEM, poi seminate a 20.000 cellule cm<-2>in poli-L-lisina in piastre.
Dopo 24 ore, il mezzo di coltura fu sostituito con un mezzo privo di siero, specifico per la crescita dei neuroni (Neurobasal Medium ) supplementato con B27.
La procedura delle colture cellulari à ̈ stata essenzialmente la stessa attuata nell’esempio con NBM/B27 eccetto che, come mezzo di coltura esente da siero, fu utilizzato DMEM supplementato con N2 (Cestelli A et al. “Formulation of a novel synthetic medium for selectively culturing rat CNS neurons†. Dev Brain Res 1985, 22,219); ed inoltre furono messe in piastra una densità di cellule pari a 2x10<5>cm<-2>. Poi, una coltura (I) fu utilizzata come coltura di controllo .
Una coltura (L) fu addizionata con acido alfa-lipoico 99.7% e onochiolo 0.3% fino a raggiungere la concentrazione di 10µM.
Una coltura (M) fu addizionata con acido alfa-lipoico 91% e onochiolo 9% fino a raggiungere la concentrazione di 10µM.
Una coltura (N) fu addizionata con acido alfa-lipoico 46% e onochiolo 54% fino a raggiungere la concentrazione di 10µM.
Dopo essere state incubate per 3 giorni, le cellule delle quattro colture furono fissate con formaldeide al 4%.
La sopravvivenza neuronale fu valutata grazie al metodo WST-8 di Tominaga H et al. “A water-soluble tetrazolium salt useful for colorimetric cell viability assay†; Anal Commun 1999, 36,47. Questo metodo utilizza un sale di 2-(2-metossi-4-nitrofenil)-3-(4-nitrofenil)-5-(2.4-disolfofenil)-2H tetrazolio quale indicatore cromogeno per valutare la vitalità cellulare WST-8, e produce risultati sulla vitalità cellulare che sono in linea con quelli ottenuti rispettivamente con il metodo MTT bromuro di 3-(4,5-dimetil-2-tiazolil)-2,5-difenil-2H tetrazolio e con il metodo di captazione della timidina triziata.
I risultati sono mostrati sia in tabella 2, in cui i valori sono espressi come medie, che in figura 2. Nella tabella 2, p indica la significatività statistica ed ns significa “non significativo†.
Tabella 2
Coltura Assorbanza % a 450nm rispetto al riferimento
(coltura I)
I 100.0
L 106.0 (p= ns)
<M>143.1 (p<0,001)
<N>29.7 (p<0,001)
La coltura M presenta valori significativamente superiori rispetto al riferimento I. La coltura I di riferimento, in assenza di principi, attivi determinò la sopravvivenza di un numero esiguo di neuroni. Al contrario, nella coltura M la presenza delle composizioni secondo la presente invenzione alla concentrazione similare di 10µM, mostrò una elevata capacità di far crescere e sopravvivere i neuroni.
ESEMPIO 3
Quattro colture cellulari primarie furono preparate come descritto nell’esempio 2 (come in Abe K et al. “Effects of recombinant human basic fibroblast growth factor and its modified protein CS23 on survival of primary cultured neurons from various regions of fetal rat brain†, Jpn. J. Pharmacol. 1990; 53(2): 221-7).
Poi, una coltura (O) fu utilizzata come coltura di controllo.
Una coltura (P) fu addizionata con di acido alfa-lipoico 91% e onochiolo 9% fino a raggiungere la concentrazione complessiva di 10µM.
Una coltura (Q) fu addizionata con acido alfa-lipoico 91% e onochiolo 9% fino a raggiungere la concentrazione di 10 µM e 0,003 µM di Selenio.
Una coltura (R) fu addizionata con acido alfa-lipoico 91% e onochiolo 9% fino a raggiungere la concentrazione di 10 µM e 0,24 µM di acido gamma linolenico.
Dopo essere state incubate per 3 giorni, le cellule delle quattro colture furono fissate con formaldeide al 4%.
La sopravvivenza dei neuroni fu valutata con il saggio di riduzione WST-8 (Tominaga et al., 1999). I risultati sono mostrati in tabella 3 in cui i valori sono espressi come medie. Inoltre, p indica la significatività statistica.
Tabella 3
Coltura Assorbanza % a 450nm rispetto al riferimento
(coltura O)
O 100.0
<P>143,1 (p<0,001)
<Q>178,9 (p<0,001)
<R>176,5 (p<0,001)
I risultati riportati nella tabella 3 evidenziano che, sorprendentemente, le composizioni secondo forme realizzative preferite dell’invenzione, comprendenti selenio e/o acido gamma linolenico risultano particolarmente efficaci nel migliorare la sopravvivenza delle culture neuronali. In particolare, le composizioni utilizzate nelle colture Q e R risultano significativamente più efficaci rispetto a quelle utilizzate per la coltura di riferimento O ed a quella utilizzata nella coltura P.

Claims (13)

  1. RIVENDICAZIONI 1. Composizione comprendente acido alfa-lipoico, o un suo sale o complesso, ed onochiolo, caratterizzata dal fatto che la quantità in peso di detto onochiolo à ̈ compresa tra 1% ed il 30% rispetto al peso totale di onochiolo e acido alfa-lipoico.
  2. 2. Composizione secondo la precedente rivendicazione, caratterizzata dal fatto che la quantità in peso di detto onochiolo à ̈ compresa tra 2% ed il 15% rispetto al peso totale di onochiolo e acido alfa-lipoico.
  3. 3. Composizione secondo la precedente rivendicazione, caratterizzata dal fatto che la quantità in peso di detto onochiolo à ̈ compresa tra 3% ed il 10% rispetto al peso totale di onochiolo e acido alfa-lipoico.
  4. 4. Composizione secondo la rivendicazione precedente, caratterizzata dal fatto di comprendere acido gamma-linolenico o un suo sale o complesso.
  5. 5. Composizione secondo la rivendicazione precedente, caratterizzata dal fatto che la quantità in peso di detto acido gamma-linolenico à ̈ compresa tra 2% e 30% rispetto al peso totale di onochiolo e acido alfa-lipoico.
  6. 6. Composizione secondo la rivendicazione 3, caratterizzata dal fatto di comprendere una fonte fisiologicamente accettabile di selenio.
  7. 7. Composizione secondo una delle rivendicazioni precedenti, caratterizzata dal fatto di comprendere almeno un componente scelto nel gruppo formato da vitamina C, vitamina E, vitamine del gruppo B.
  8. 8. Composizione secondo una delle precedenti rivendicazioni, per uso nel trattamento delle neuropatie periferiche.
  9. 9. Formulazione dietetica o farmaceutica per somministrazione orale comprendente una composizione secondo una delle precedenti rivendicazioni.
  10. 10. Formulazione secondo la rivendicazione 9 in forma di compresse o capsule adatta alla somministrazione giornaliera di una quantità da 200 mg a 1300 mg di acido alfa-lipoico e da 2,5 mg a 150 mg di onochiolo.
  11. 11. Formulazione secondo la rivendicazione 10 in forma di compresse o capsule adatte alla somministrazione giornaliera di una quantità da 580 mg a 620 mg di acido alfa-lipoico e di una quantità da 45 mg a 60 mg di onochiolo, oppure adatte alla somministrazione giornaliera di una quantità da 280 mg a 320 mg di acido alfa-lipoico e da 20 mg a 30 mg di onochiolo.
  12. 12. Formulazione secondo la rivendicazione 10, in forma di capsule molli di gelatina, adatta alla somministrazione giornaliera di una quantità da 200 mg a 1300 mg di acido alfa-lipoico, da 2,5 mg a 150 mg di onochiolo e da 10 mg a 300 mg di acido gamma-linolenico o un suo sale o complesso.
  13. 13. Formulazione secondo la rivendicazione 11, in forma di capsule molli di gelatina, adatta alla somministrazione giornaliera di una quantità da 580 mg a 620 mg di acido alfa-lipoico, di una quantità da 45 mg a 60 mg di onochiolo e di una quantità da 125 mg a 140 mg di acido gamma-linolenico, oppure adatte alla somministrazione giornaliera di una quantità da 280 mg a 320 mg di acido alfa-lipoico, di una quantità da 20 mg a 30 mg di onochiolo e di una quantità da 60 mg a 70 mg di acido gammalinolenico.
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