ITMI20101300A1 - BIOTECHNOLOGICAL PRODUCTION OF CONDROITIN - Google Patents
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Classifications
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Description
Descrizione di una domanda di brevetto d?invenzione avente per titolo: ?PRODUZIONE BIOTECNOLOGICA DI CONDROITINA? Description of an invention patent application entitled:? BIOTECHNOLOGICAL PRODUCTION OF CHONDROITIN?
Scopo dell?invenzione Purpose of the invention
La presente invenzione riguarda un nuovo ceppo microbico ricombinante capace di produrre condroitina e un metodo di produzione biotecnologica di condroitina. The present invention relates to a new recombinant microbial strain capable of producing chondroitin and a biotechnological production method of chondroitin.
In questa invenzione il termine condroitina biologica sta ad indicare un polisaccaride lineare definito come un glicosaminoglicano lineare costituito da residui alternati di acido glucuronico (GIcUA) e N-acetil-D-galattosamina (GaINAc) legati da legami ?1-3 (GlcUA ? GalNAc) e ?1-4 (GalNAc ? GlcUA). In this invention the term biological chondroitin indicates a linear polysaccharide defined as a linear glycosaminoglycan consisting of alternating residues of glucuronic acid (GIcUA) and N-acetyl-D-galactosamine (GaINAc) linked by? 1-3 bonds (GlcUA? GalNAc ) and? 1-4 (GalNAc? GlcUA).
Stato dell?arte dell?invenzione State of the art of invention
La condroitina solfato ? un glicosaminoglicano in cui l?acido glucuronico (GIcUA) e l?N-acetil-D-galattosamina (GaINAc) sono legati linearmente e in modo alternato da legami ?1-3 e ?1-4, rispettivamente, a formare una catena polisaccaridica lineare che ha diversi gradi di solfatazione nei residui di GalNAc. Chondroitin sulfate? a glycosaminoglycan in which glucuronic acid (GIcUA) and N-acetyl-D-galactosamine (GaINAc) are linked linearly and alternately by? 1-3 and? 1-4 bonds, respectively, to form a linear polysaccharide chain which has different degrees of sulfation in the GalNAc residues.
La condroitina solfato ? presente nelle cartilagini e nei tessuti connettivi degli animali ed ha un importante funzione nell?adesione cellulare, nella rigenerazione dei tessuti, nella crescita neuronale e altri fenomeni biologici simili. Chondroitin sulfate? present in the cartilages and connective tissues of animals and has an important function in cell adhesion, tissue regeneration, neuronal growth and other similar biological phenomena.
La produzione di condroitina da fonti non animali costituisce un passo importante e appetibile, verso la produzione della condroitina solfato non derivata da animali. The production of chondroitin from non-animal sources is an important and palatable step towards the production of non-animal derived chondroitin sulfate.
I brevetti attualmente disponibili descrivono vari metodi di produzione di condroitina non estratta da animali. Currently available patents describe various methods of producing non-animal chondroitin.
Inoltre, sono gi? stati clonati e sequenziati diversi geni codificanti la condroitina sintasi, derivanti sia da animali che da microrganismi. Also, are they already? several genes encoding chondroitin synthase, deriving from both animals and microorganisms, have been cloned and sequenced.
E? stato fornito un metodo di produzione del polisaccaride condroitina attraverso l?uso di un batterio Gram-positivo ricombinante del genere Bacillus, in cui ? stato introdotto il gene della condroitina sintasi derivato dalla Pasteurella multocida (US 2007/0281342 A1). AND? a method of production of the chondroitin polysaccharide has been provided through the use of a recombinant Gram-positive bacterium of the genus Bacillus, in which? the chondroitin synthase gene derived from Pasteurella multocida was introduced (US 2007/0281342 A1).
Una successiva invenzione descrive un metodo di produzione della condroitina attraverso l?introduzione dei geni kfoC e kfoA, derivanti da Escherichia coli O5:K4:H4, in un ceppo batterico produttore di UDP-acido glucuronico (WO2008/133350). A subsequent invention describes a method of producing chondroitin through the introduction of the kfoC and kfoA genes, deriving from Escherichia coli O5: K4: H4, in a bacterial strain producing UDP-glucuronic acid (WO2008 / 133350).
Un?altra invenzione descrive la sintesi di condroitina in vitro con un sistema enzimatico composto sia dalla condroitina sintasi di Escherichia coli O5:K4:H4 che dai precursori della reazione (US2009/0263867 A1). Another invention describes the synthesis of chondroitin in vitro with an enzymatic system composed of both the chondroitin synthase of Escherichia coli O5: K4: H4 and the precursors of the reaction (US2009 / 0263867 A1).
E? noto che Escherichia coli O5:K4:H4 ? in grado di produrre un polisaccaride capsulare (il polisaccaride K4), avente la stessa struttura di base della condroitina, nel quale per? risultano attaccati residui di fruttosio a residui di acido glucuronico. In tal caso il polisaccaride K4 ? formato da unit? ripetute di un trisaccaride che comprende un residuo di GaINAc, un residuo di GlcUA e un residuo di fruttosio legato al gruppo idossilico sul carbonio C3 del residuo di GIcUA. Le unit? sono tra loro collegate in modo che il residuo di acido glucuronico (GIcUA) di una unit? lega l?N-acetil-D-galattosamina (GaINAc) della precedente unit? con un legame ?1-4 mentre l?N-acetil-D-galattosamina (GaINAc) ? legata all?acido glucuronico (GIcUA) dell?unit? successiva con un legame ?1-3. Il polisaccaride lineare risultante ? cos? identico alla condroitina. I residui di fruttosio costituiscono le ramificazioni di questo polisaccaride lineare. AND? known Escherichia coli O5: K4: H4? capable of producing a capsular polysaccharide (the K4 polysaccharide), having the same basic structure as chondroitin, in which for? residues of fructose are attached to residues of glucuronic acid. In which case the K4 polysaccharide? formed by unit? repeated of a trisaccharide comprising a residue of GaINAc, a residue of GlcUA and a residue of fructose linked to the hydroxyl group on the C3 carbon of the GIcUA residue. The units are connected together so that the glucuronic acid residue (GIcUA) of a unit? binds the N-acetyl-D-galactosamine (GaINAc) of the previous unit? with a? 1-4 bond while l? N-acetyl-D-galactosamine (GaINAc)? linked to the glucuronic acid (GIcUA) of the unit? next with a tie? 1-3. The resulting linear polysaccharide? cos? identical to chondroitin. Fructose residues form the ramifications of this linear polysaccharide.
Sebbene in Escherichia coli O5:K4:H4 siano stati largamente studiati sia i geni del cluster dell?antigene capsulare che le vie metaboliche responsabili della produzione degli zuccheri costituenti il polisaccaride lineare l?attivit? glicosil-trasferasica responsabile dell?aggiunta dei residui di fruttosio al polisaccaride lineare a formare il polisaccaride K4 non ? stata ancora identificata. Although in Escherichia coli O5: K4: H4 both the genes of the capsular antigen cluster and the metabolic pathways responsible for the production of the sugars constituting the linear polysaccharide have been extensively studied. glycosyl-transferase responsible for adding fructose residues to the linear polysaccharide to form the K4 polysaccharide non? still been identified.
La novit? caratterizzante la presente invenzione ? la produzione diretta di condroitina ad alto peso molecolare da parte di un microrganismo ricombinante ottenuta bloccando selettivamente l?aggiunta di residui carboidratici alla condroitina in un microrganismo che ? naturalmente capace di produrre un derivato glicosilato della condroitina eliminando cos? la necessit? di sottoporre il polisaccaride K4 alla rimozione dei residui di fruttosio legati ai residui di GIcUA per ottenere la condroitina. The novelty? characterizing the present invention? the direct production of high molecular weight chondroitin by a recombinant microorganism obtained by selectively blocking the addition of carbohydrate residues to chondroitin in a microorganism that? naturally capable of producing a glycosylated derivative of chondroitin thus eliminating? the need? to subject the K4 polysaccharide to the removal of fructose residues linked to GIcUA residues to obtain chondroitin.
Descrizione dettagliata dell?invenzione Detailed description of the invention
Uno scopo della presente invenzione ? fornire un microrganismo ricombinante capace di produrre condroitina, definita come un glicosaminoglicano lineare formato da residui alternati di acido D-glucuronico (GIcUA) e N-acetil-D-galattosamina (GaINAc), legati rispettivamente con legami ?1-3 e ?1-4, ottenuta bloccando selettivamente l?aggiunta di residui carboidratici (fruttosio) alla condroitina inun microrganismo che ? naturalmente capace di produrre un derivato glicosilato della condroitina. A purpose of the present invention? provide a recombinant microorganism capable of producing chondroitin, defined as a linear glycosaminoglycan formed by alternating residues of D-glucuronic acid (GIcUA) and N-acetyl-D-galactosamine (GaINAc), linked respectively with bonds? 1-3 and? 1- 4, obtained by selectively blocking the addition of carbohydrate residues (fructose) to chondroitin in a microorganism that? naturally capable of producing a glycosylated derivative of chondroitin.
Il microrganismo in accordo con la presente invenzione ? un microrganismo in cui l?aggiunta di residui carboidratici al glicosaminoglicano ? bloccata in seguito all?inattivazione dell?enzima, o degli enzimi, responsabili di tale aggiunta. L?inattivazione dell?enzima (enzimi) responsabile dell?aggiunta dei residui carboidratici ? ottenuta in seguito alla modificazione del gene (geni) codificante quell?enzima (enzimi), modificazione che include delezione, sostituzione, totale o in parte, del suddetto gene (geni) o inserzione di una sequenza nucleotidica addizionale. The microorganism in accordance with the present invention? a microorganism in which the addition of carbohydrate residues to the glycosaminoglycan? blocked following the inactivation of the enzyme, or enzymes, responsible for this addition. The inactivation of the enzyme (enzymes) responsible for the addition of carbohydrate residues? obtained following the modification of the gene (s) encoding that enzyme (s), a modification which includes deletion, replacement, total or part, of the aforementioned gene (s) or insertion of an additional nucleotide sequence.
Il microrganismo ricombinante della presente invenzione ? derivato preferibilmente da un batterio naturalmente capace di produrre di un derivato glicosilato della condroitina. The recombinant microorganism of the present invention? preferably derived from a bacterium naturally capable of producing a glycosylated derivative of chondroitin.
Il batterio capace di produrre un derivato glicosilato della condroitina appartiene preferibilmente alla famiglia delle Enterobacteriaceae e pi? preferibilmente appartiene al genere Escherichia. The bacterium capable of producing a glycosylated derivative of chondroitin preferably belongs to the Enterobacteriaceae family and pi? preferably it belongs to the genus Escherichia.
Il batterio Escherichia naturalmente capace di produrre un derivato glicosilato della condroitina preferibilmente appartiene alla specie Escherichia coli e pi? preferibilmente appartiene al gruppo 2 dell?antigene capsulare K, che include sierotipi ben noti come il K1, il K5, il K7, il K12. Meglio se, il batterio naturalmente capace di produrre un derivato glicosilato della condroitina, da cui ? ottenuto il microrganismo ricombinanate di questa invenzione, ? il sierotipo O5:K4:H4 di Escherichia coli. The bacterium Escherichia naturally capable of producing a glycosylated derivative of chondroitin preferably belongs to the species Escherichia coli and pi? preferably it belongs to group 2 of the K capsular antigen, which includes well known serotypes such as K1, K5, K7, K12. Better if, the bacterium naturally capable of producing a glycosylated derivative of chondroitin, from which? obtained the recombinanated microorganism of this invention,? the O5: K4: H4 serotype of Escherichia coli.
In accordo con uno degli aspetti di questa invenzione, il sierotipo O5:K4:H4 di Escherichia coli naturalmente capace di produrre un derivato glicosilato della condroitina, conosciuto come polisaccaride K4, ? stato sottoposto a modificazioni genetiche che hanno condotto al blocco selettivo dell?aggiunta di residui carboidratici al polisaccaride lineare condroitina. According to one aspect of this invention, Escherichia coli serotype O5: K4: H4 naturally capable of producing a glycosylated derivative of chondroitin, known as the K4 polysaccharide,? underwent genetic modifications that led to the selective blocking of the addition of carbohydrate residues to the linear polysaccharide chondroitin.
Sebbene, in accordo con un aspetto rappresentativo di questa invenzione, il batterio ricombinante capace di produrre condroitina ? ottenuto da Escherichia coli O5:K4:H4, pu? essere impiegato qualsiasi microrganismo appartenente al gruppo capsulare antigenico K, indipendentemente dal fatto che condivida alcuna omologia genica con Escherichia coli O5:K4:H4. Esempi dei suddetti microrganismi includono batteri appartenenti al genere Haemophilus come l?H. influenzae, Campylobacter come il C. jejuni, Gloecapsa come la G. Gelatinosa e Vibrio come il V.cholerae. Although, according to a representative aspect of this invention, the recombinant bacterium is capable of producing chondroitin? obtained from Escherichia coli O5: K4: H4, pu? any organism belonging to the antigenic capsular group K may be employed, regardless of whether it shares any gene homology with Escherichia coli O5: K4: H4. Examples of the aforementioned microorganisms include bacteria belonging to the genus Haemophilus such as H. influenzae, Campylobacter such as C. jejuni, Gloecapsa such as G. Gelatinosa and Vibrio such as V. cholerae.
Il batterio preferibilmente utilizzato per ottenere il microrganismo ricombinante della presente invenzione ? il ceppo selvaggio U1-41 di Escherichia coli O5:K4:H4, disponibile presso l?ATCC (American Type Culture Collection), con il numero di accesso ATCC23502. The bacterium preferably used to obtain the recombinant microorganism of the present invention? the wild U1-41 strain of Escherichia coli O5: K4: H4, available from the American Type Culture Collection (ATCC), under access number ATCC23502.
In questa invenzione il ceppo ricombinante, derivato dal ceppo U1-41 di Escherichia coli O5:K4:H4 (da questo momento indicato come E.coli K4), ? ottenuto dalla delezione del gene kfoE, codificante una presunta glicosiltrasferasi, facente parte del cluster dei geni capsulari. In this invention the recombinant strain, derived from the U1-41 strain of Escherichia coli O5: K4: H4 (henceforth referred to as E.coli K4),? obtained from the deletion of the kfoE gene, encoding a presumed glycosyltransferase, which is part of the capsular gene cluster.
La presente invenzione spiega in che modo l?inattivazione del gene kfoE conduca alla diretta produzione del polisaccaride K4, privo del residuo di fruttosio, cioe la condroitina. The present invention explains how the inactivation of the kfoE gene leads to the direct production of the K4 polysaccharide, devoid of the fructose residue, ie chondroitin.
E? noto che il gene kfoE ? localizzato all?interno del cluster di geni dell?antigene capsulare di E.coli K4 (GenBank AB079602), cluster che gli scopritori hanno trovato omologo in modo significativo a geni presenti in altri microrganismi analogamente coinvolti nella produzione della capsula. Nella presente invenzione, il gene kfoE derivato da E.coli K4 ? un gene che codifica una proteina selezionata tra le seguenti (A), (B), (C): AND? known that the kfoE gene? located within the gene cluster of the E. coli K4 capsular antigen (GenBank AB079602), a cluster that the discoverers found significantly homologous to genes present in other microorganisms similarly involved in the capsule production. In the present invention, the kfoE gene derived from E.coli K4? a gene encoding a protein selected from the following (A), (B), (C):
(A) una proteina che comprende la sequenza aminoacidica identificata dalla SEQ ID N?2 (A) a protein comprising the amino acid sequence identified by SEQ ID N? 2
(B) una proteina che comprende la sequenza aminoacidica della SEQ ID N?2 modificata per delezione, sostituzione o inserzione di uno o pi? aminoacidi e avente l?attivit? glicosil-trasferasica, preferibilmente l?attivit? fruttosil-transferasica. (B) a protein comprising the amino acid sequence of SEQ ID N? 2 modified by deletion, substitution or insertion of one or more? amino acids and having the? activity? glycosyl-transferase, preferably the activity? fructosyl-transferase.
(C) una proteina che comprende una sequenza aminoacidica che ha un?omologia di almeno il 50% alla sequenza aminoacidica della SEQ ID N?2 e avente l?attivit? glicosil-trasferasica, preferibilmente attivit? fruttosiltransferasica. (C) a protein comprising an amino acid sequence that has a homology of at least 50% to the amino acid sequence of SEQ ID N? 2 and having the? glycosyl-transferase, preferably activity? fructosyltransferase.
Il gene kfoE derivato da E.coli K4 ? un DNA selezionato tra le seguenti (a), (b), (c): The kfoE gene derived from E.coli K4? a DNA selected from the following (a), (b), (c):
(a) un DNA che comprende la sequenza nucleotidica della SEQ ID N?1 (b) un DNA che ibridizza con un DNA avente la sequenza nucleotidica complementare alla SEQ ID N?1 e che codifica una proteina avente l?attivit? glicosil-trasferasica, preferibilmente attivit? fruttosil-trasferasica. (a) a DNA comprising the nucleotide sequence of the SEQ ID N? 1 (b) a DNA that hybridizes with a DNA having the nucleotide sequence complementary to the SEQ ID N? 1 and encoding a protein having the? glycosyl-transferase, preferably activity? fructosyl-transferase.
(c) un DNA che comprende una sequenza nucleotidica che ha un?omologia di almeno il 50% alla sequenza nucleotidica della SEQ ID N?1 e codifica una proteina avente l?attivit? glicosil-trasferasica, preferibilmente attivit? fruttosil-trasferasica. (c) a DNA comprising a nucleotide sequence that has a homology of at least 50% to the nucleotide sequence of the SEQ ID N? 1 and encodes a protein having the? glycosyl-transferase, preferably activity? fructosyl-transferase.
In accordo con uno degli aspetti preferiti di questa invenzione, il ceppo ricombinante di E.coli K4 di questa invenzione ? stato ottenuto usando un metodo in grado di inattivare geni cromosomali in cui i primers di PCR utilizzati presentano omologia con il gene bersaglio (Datsenko and Wanner, PNAS 2000 N?12 vol.97, 6640-6645). According to one of the preferred aspects of this invention, the recombinant strain of E. coli K4 of this invention? was obtained using a method capable of inactivating chromosomal genes in which the PCR primers used have homology with the target gene (Datsenko and Wanner, PNAS 2000 N? 12 vol. 97, 6640-6645).
Il ceppo ricombinante di E.coli K4 di questa invenzione ? stato sottoposto a inattivazione del gene cromosomale kfoE in primo momento per sostituzione della gran parte della sua sequenza nucleotidica con un gene esogeno codificante la resistenza alla kanamicina (?prima modificazione genetica?) e poi eliminando successivamente il gene inserito attraverso l?espressione di un plasmide codificante una FLP ricombinasi (?seconda modificazione genetica?). The recombinant strain of E.coli K4 of this invention? was subjected to inactivation of the chromosomal gene kfoE first by replacing most of its nucleotide sequence with an exogenous gene encoding resistance to kanamycin (? first genetic modification?) and then subsequently eliminating the inserted gene through the expression of a plasmid encoding a recombinase FLP (? second genetic modification?).
Il ceppo ricombinante di E.coli K4 ottenuto dopo la prima modificazione genetica, denominato E.coli K4 (?KfoE/KanR) ? stato depositato presso la Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, in accordo con il Trattato di Budapest, con il numero di accesso DSM23578. Il ceppo ricombinante di E.coli K4 ottenuto dopo la seconda modificazione genetica, denominato E.coli K4 (?KfoE) ? stato depositato presso la Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, in accordo con il Trattato di Budapest, con il numero di accesso DSM23644. L?inattivazione del gene kfoE ? stata ottenuta per mezzo di 3 successive trasformazioni batteriche in primo luogo attraverso l?espressione di un plasmide recante il sistema Red Recombinase (pKD46), in secondo momento con un frammento di DNA derivato da un plasmide stampo (pDK4) opportunamente modificato per fornire l?omologia al gene kfoE ed infine con un plasmide helper che esprime l?enzima FLP ricombinasi (pCP20). The recombinant strain of E.coli K4 obtained after the first genetic modification, named E.coli K4 (? KfoE / KanR)? was filed with the Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, in accordance with the Budapest Treaty, under the access number DSM23578. The recombinant strain of E.coli K4 obtained after the second genetic modification, named E.coli K4 (? KfoE)? was filed with the Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, in accordance with the Budapest Treaty, under the access number DSM23644. Inactivation of the kfoE gene? was obtained by means of 3 successive bacterial transformations firstly through the expression of a plasmid bearing the Red Recombinase system (pKD46), then with a DNA fragment derived from a template plasmid (pDK4) suitably modified to provide l? homology to the kfoE gene and finally with a helper plasmid expressing the FLP recombinase enzyme (pCP20).
Allo scopo di ottenere la prima modificazione genetica di E.coli K4, sono stati usati il plasmide pKD46 (GenBank: AY048746) e il frammento lineare di DNA. In order to obtain the first genetic modification of E. coli K4, the plasmid pKD46 (GenBank: AY048746) and the linear fragment of DNA were used.
Il plasmide pKD46 usato nella prima trasformazione di E.coli K4 ? composto da 2154 nucleotidi derivanti dal fago lambda e dal gene codificante la resistenza all?ampicillina. Questo plasmide aumenta la frequenza di ricombinazione in presenza di frammenti lineari di DNA. The pKD46 plasmid used in the first transformation of E.coli K4? composed of 2154 nucleotides deriving from the lambda phage and the gene encoding resistance to ampicillin. This plasmid increases the recombination frequency in the presence of linear DNA fragments.
Il frammento lineare di DNA usato nella successiva trasformazione di E.coli K4 ? stato ottenuto per PCR usando diverse coppie di primers con sequenze omologhe sia al gene kfoE che al DNA stampo del plasmide pKD4 (GenBank: AY 048743), recante la cassetta di resistenza alla kanamicina. The linear fragment of DNA used in the subsequent transformation of E. coli K4? was obtained by PCR using different pairs of primers with sequences homologous both to the kfoE gene and to the template DNA of the pKD4 plasmid (GenBank: AY 048743), bearing the kanamycin resistance cassette.
Con questa procedura ? stato generato un frammento di DNA lineare avente la cassetta codificante la resitenza alla kanamicina, fiancheggiata dalle estremit? 5? e 3? omologhe al gene kfoE. With this procedure? was generated a linear DNA fragment having the cassette encoding the resistance to kanamycin, flanked by the ends? 5? and 3? homologous to the kfoE gene.
In un aspetto di questa invenzione, la trasformazione batterica ? stata eseguita per elettroporazione scelta per la sua efficienza nel generare facilmente i doppi trasformanti che possono essere selezionati su piastre contenenti sia l?ampicillina che la kanamicina. In one aspect of this invention, bacterial transformation? was performed by electroporation chosen for its efficiency in easily generating the double transformants that can be selected on plates containing both ampicillin and kanamycin.
Ad ogni modo, sebbene l?elettroporazione sia la tecnica preferita, lo stesso risultato potrebbe essere raggiunto mediante qualsiasi altro metodo di trasformazione come il metodo del calcio cloruro oppure la trasformazione con DEAE-destrani. However, although electroporation is the preferred technique, the same result could be achieved by any other transformation method such as the calcium chloride method or the transformation with DEAE-dextrans.
Per verificare la corretta localizzazione della delezione cromosomica nei trasformanti E.coli K4 (?kfoE/kanR), sono state eseguite alcune PCR usando due coppie di primers locus specifici: la prima coppia di primers ha potuto dimostrare la formazione di una nuova giunzione tra l?estremit? 5? residua del gene kfoE e il gene kan inserito mentre la seconda coppia di primers ha potuto dimostrare la formazione di una nuova giunzione tra il gene kan inserito e l?estremit? 3? residua del gene kfoE. To verify the correct localization of the chromosomal deletion in the E.coli K4 transformants (? KfoE / kanR), some PCRs were performed using two pairs of locus specific primers: the first pair of primers was able to demonstrate the formation of a new junction between the ? extremity? 5? residual of the kfoE gene and the inserted kan gene while the second pair of primers was able to demonstrate the formation of a new junction between the inserted kan gene and the extremity? 3? residue of the kfoE gene.
Il plasmide helper utilizzato per la rimozione della cassetta di resitenza alla kanamicina (?seconda modificazione genetica?) ? il plasmide pCP20, che contiene sia il gene di lievito Flp ricombinasi che il gene per la resistenza all?ampicillina. The helper plasmid used for the removal of the kanamycin resistance cassette (? Second genetic modification?)? the pCP20 plasmid, which contains both the yeast recombinase gene Flp and the ampicillin resistance gene.
Entrambi i plasmidi pKD46 e pCP20 sono vettori temperatura-sensibili per cui vengono persi dai ceppi trasformanti di E.coli K4 in seguito ad una fase di crescita a 43?C. Both pKD46 and pCP20 plasmids are temperature-sensitive vectors and are therefore lost by the transforming strains of E. coli K4 following a growth phase at 43 ° C.
A conferma della sostituzione totale o parziale del gene kfoE con la cassetta di resistenza alla kanamicina ? stata eseguita un?analisi di sequenza sul ceppo E.coli K4 (?kfoE/KanR). Confirming the total or partial replacement of the kfoE gene with the kanamycin resistance cassette? A sequence analysis was performed on the E.coli K4 strain (? kfoE / KanR).
Analogamente per verificare la successiva delezione della cassetta di resistenza alla kanamicina, risultante nella produzione finale di un ceppo batterico avente il gene kfoE distrutto, ? stata eseguita un?analisi di sequenza sul ceppo E.coli K4 (?kfoE). Similarly to verify the subsequent deletion of the kanamycin resistance cassette, resulting in the final production of a bacterial strain having the kfoE gene destroyed,? A sequence analysis was performed on the E. coli K4 (? kfoE) strain.
Il metodo utilizzato per la riuscita costruzione di un ceppo ricombinante di E.coli K4 capace di produrre una variante non glicosilata di un glicosaminoglicano naturale ? di applicabilit? generale e pu? essere vantaggiosamente utilizzato per altri prodotti glicosilati per i quali i quali fosse interessante prevenire questo tipo di glicosilazione. Concludendo, ? stato sviluppato un metodo generale per l?ottenimento di microrganismi capaci di produrre varianti non glicosilate di glicosaminoglicani naturali. Un altro obiettivo di questa invenzione ? fornire un metodo di produzione biotecnologica della condroitina che comprende le seguenti fasi: The method used for the successful construction of a recombinant strain of E. coli K4 capable of producing a non-glycosylated variant of a natural glycosaminoglycan? of applicability? general and can? be advantageously used for other glycosylated products for which it was interesting to prevent this type of glycosylation. In conclusion,? A general method has been developed for obtaining microorganisms capable of producing non-glycosylated variants of natural glycosaminoglycans. Another goal of this invention? provide a biotechnological chondroitin production method that includes the following steps:
(1) coltura del microrganismo ricombinante capace di produrre condroitina, definita come glicosaminoglicano lineare costituito da residui alternati di acido D-glucuronico (GlcUA) e di N-acetil-D-galattosamina (GalNAc) legati da legami ?1-3 (GlcUA ? GalNAc) e ?1-4 (GalNAc ? GlcUA), dove il suddetto microrganismo ricombinante ? stato ottenuto bloccando selettivamente l?aggiunta di residui carboidratici (fruttosio) al polisaccaride lineare condroitina (1) culture of the recombinant microorganism capable of producing chondroitin, defined as linear glycosaminoglycan consisting of alternating residues of D-glucuronic acid (GlcUA) and N-acetyl-D-galactosamine (GalNAc) linked by? 1-3 (GlcUA? GalNAc) and? 1-4 (GalNAc? GlcUA), where the aforementioned recombinant organism? obtained by selectively blocking the addition of carbohydrate residues (fructose) to the linear polysaccharide chondroitin
e And
(2) recupero della condroitina dal brodo di coltura. (2) recovery of chondroitin from the culture broth.
Ciascun microrganismo ricombinante ottenuto in accordo con il metodo descritto sopra capace di bloccare selettivamente l?aggiunta di residui carboidratici (fruttosio) al polisaccaride lineare condroitina pu? essere usato nella fase di coltura. Each recombinant microorganism obtained according to the method described above capable of selectively blocking the addition of carbohydrate residues (fructose) to the linear polysaccharide chondroitin can? be used in the culture phase.
In accordo con uno degli aspetti preferiti di questa invenzione, un batterio ricombinante ottenuto da E.coli K4, cio? E. coli DSM23644, viene impiegato come microrganismo ricombinante capace di produrre condroitina nel suddetto metodo di produzione di condroitina ricombinante. According to one of the preferred aspects of this invention, a recombinant bacterium obtained from E. coli K4, i.e. E. coli DSM23644, is used as a recombinant microorganism capable of producing chondroitin in the aforementioned recombinant chondroitin production method.
Il metodo adoperato per la coltura del batterio E.coli DSM23644 ? un metodo generale applicabile alla coltura di tutti i membri del genere Escherichia. Il suddetto metodo si basa sull?uso preferenziale ma non esclusivo di un terreno di coltura contenente per litro: K2HPO43H2O 9.7 g, KH2PO48 g, sodio citrato 5H2O 0.5 g, MgCl2 7H2O 0.2 g, idrolizzato di caseina 20 g, ammonio solfato 20 g, glucosio 2 g, estratto di lievito 10 g. Maggiori rese di produzione della condroitina possono essere ottenute modificando opportunamente la composizione del terreno di coltura di base e/o fornendo ulteriori nutrienti alla coltura per mezzo di aggiunte di substrati. The method used for the culture of the bacterium E. coli DSM23644? a general method applicable to the cultivation of all members of the genus Escherichia. The above method is based on the preferential but not exclusive use of a culture medium containing per liter: K2HPO43H2O 9.7 g, KH2PO48 g, sodium citrate 5H2O 0.5 g, MgCl2 7H2O 0.2 g, casein hydrolyzate 20 g, ammonium sulphate 20 g, glucose 2 g, yeast extract 10 g. Higher chondroitin production yields can be achieved by suitably modifying the composition of the base culture medium and / or providing additional nutrients to the culture by means of substrate additions.
Le condizioni di coltura sono definite allo scopo di massimizzare crescita batterica e produzione di condroitina. Tipicamente la coltura viene eseguita a temperature comprese tra 25?C e 40?C da 8 h a 72 h. Culture conditions are defined in order to maximize bacterial growth and chondroitin production. Typically the culture is performed at temperatures between 25 ° C and 40 ° C from 8 h to 72 h.
Il surnatante viene raccolto preferibilmente per centrifugazione e usato per la purificazione e la caratterizzazione della condroitina prodotta. The supernatant is preferably collected by centrifugation and used for purification and characterization of the produced chondroitin.
La purificazione della condroitina viene eseguita in accordo con un adattamento dei metodi descritti da Rodriguez e Jann (Eur.J.Biochem.117, 117-124, FEBS 1988). The purification of chondroitin is performed according to an adaptation of the methods described by Rodriguez and Jann (Eur.J.Biochem.117, 117-124, FEBS 1988).
Brevemente, il metodo adottato per purificare la condroitina ? basato su diversi passaggi di precipitazione a partire dal surnatante della coltura e un passaggio finale di essiccamento sotto vuoto. Briefly, the method used to purify chondroitin? based on several precipitation steps starting from the culture supernatant and a final vacuum drying step.
L?identit? del prodotto recuperato pu? essere accertato da una serie di metodi, preferibilmente da una combinazione di metodi che forniscano l?evidenza della strutturra della catena polisaccaridica e dell?assenza dei residui di futtosio. The identity of the recovered product pu? be ascertained by a series of methods, preferably by a combination of methods that provide evidence of the structure of the polysaccharide chain and the absence of fuctose residues.
L?assenza di fruttosio dal prodotto recuperato pu? essere vantaggiosamente verificata per mezzo di un?idrolisi acida del prodotto, in condizioni in cui ? noto si liberi il fruttosio dal polisaccaride K4 nativo, seguita da un dosaggio specifico del fruttosio di conseguenza liberato. Questo test dimostra in modo consistente che il prodotto recuperato dalle colture del batterio E.coli DSM23644 non contiene fruttosio contrariamente al polisaccaride K4 nativo ottenuto dal ceppo selvaggio U1-41 di Escherichia coli O5:K4:H4 che produce in maniera consistente un polisaccaride contenente fruttosio nelle quantit? attese dalla formula di struttura del polisaccaride K4. The absence of fructose from the recovered product can? be advantageously verified by means of an acid hydrolysis of the product, in conditions in which? It is known that fructose is released from the native K4 polysaccharide, followed by a specific dosage of the fructose released as a result. This test consistently demonstrates that the product recovered from the cultures of E. coli DSM23644 bacterium does not contain fructose in contrast to the native K4 polysaccharide obtained from the wild U1-41 strain of Escherichia coli O5: K4: H4 which consistently produces a fructose-containing polysaccharide in the quantities? expected from the structural formula of the polysaccharide K4.
Una ulteriore conferma dell?identit? del prodotto recuperato dalle colture del batterio E.coli DSM23644 ? stata ottenuta sottoponendo il prodotto a digestione enzimatica con Condroitinasi ABC, che ? noto degradare completamente il polisaccaride condroitina in assenza di fruttosio, ma non il polisaccaride nativo K4, producendo i disaccaridi. In altre parole, la Condroitinasi ABC ? incapace di digerire il polisaccaride K4 nativo. Le digestioni con Condroitinasi ABC del prodotto recuperato dalle colture del batterio E.coli DSM23644 hanno prodotto le quantit? attese del prodotto disaccaride nel caso di completa digestione, confermando cos? la natura della struttura di base del polisaccaride e contemporaneamente l?assenza di residui di fruttosio. A further confirmation of the identity? of the product recovered from the cultures of the bacterium E.coli DSM23644? been obtained by subjecting the product to enzymatic digestion with ABC chondroitinase, which? known to completely degrade the chondroitin polysaccharide in the absence of fructose, but not the native polysaccharide K4, producing the disaccharides. In other words, ABC Chondroitinase? unable to digest native K4 polysaccharide. The digestions with ABC chondroitinase of the product recovered from the cultures of the bacterium E. coli DSM23644 have produced the quantities? expectations of the disaccharide product in the case of complete digestion, confirming cos? the nature of the basic structure of the polysaccharide and at the same time the absence of fructose residues.
Descrizione delle figure Description of the figures
Fig. 1: mostra un diagramma delle trasformazioni del ceppo U1-41 di Escherichia coli O5:K4:H4 risultanti nella costruzione di E.coli K4 (?kfoE/kanR) ed E.coli K4 (?kfoE): Fig. 1: shows a diagram of the transformations of the U1-41 strain of Escherichia coli O5: K4: H4 resulting in the construction of E.coli K4 (? KfoE / kanR) and E.coli K4 (? KfoE):
a) frammento di DNA, contenente la resitenza alla kanamicina (kanamicina), fiancheggiata da 2 sequenze di ricombinazione FRT (Flippase Recognition Targets); il gene della kanamicina ? derivato dal plasmide templato pKD4 usando i siti di appaiamento P1 e P2. a) DNA fragment, containing kanamycin (kanamycin) resistance, flanked by 2 FRT (Flippase Recognition Targets) recombination sequences; the kanamycin gene? derived from the pKD4 template plasmid using the P1 and P2 pairing sites.
b) Cluster dettagliato dei gene per l?antigene K nel cromosoma del ceppo U1-41 di E.coli O5:K4:H4, dove kfoD e kfoF sono i geni fiancheggianti kfoE. c) DNA cromosomale di E.coli K4 (?kfoE/kanR) contenente l?inserto della resistenza alla kanamicina che interrompe il gene kfoE. b) Detailed gene cluster for the K antigen in the chromosome of E.coli O5: K4: H4 strain U1-41, where kfoD and kfoF are the kfoE flanking genes. c) E.coli K4 chromosomal DNA (? kfoE / kanR) containing the kanamycin resistance insert that interrupts the kfoE gene.
d) DNA cromosomale di E.coli K4 (?kfoE) contenente la delezione finale della gran parte del gene kfoE. d) E. coli K4 chromosomal DNA (? kfoE) containing the final deletion of most of the kfoE gene.
Fig. 2: mostra i risultati delle PCR eseguite sui 3 trasformanti di E.coli K4 (?kfoE/kanR) per verificare la sequenza delle regioni fiancheggianti le estremit? 3? and 5? rimanenti del gene kfoE: Fig. 2: shows the results of the PCR performed on the 3 transformants of E.coli K4 (? KfoE / kanR) to verify the sequence of the regions flanking the extremities. 3? and 5? remaining of the kfoE gene:
Le corsie 1 e 10 mostrano il marker di peso molecolare (1Kb ladder) Le corsie 2-4 mostrano i prodotti di PCR relativi all?estremit? residua al 3? del gene kfoE nei 3 trasformanti. Lanes 1 and 10 show the molecular weight marker (1Kb ladder). Lanes 2-4 show the PCR products relative to the extremity. residual at 3? of the kfoE gene in the 3 transformants.
Le corsie 6-8 mostrano i prodotti di PCR relativi all?estremit? residua al 5? del gene kfoE nei 3 trasformanti. Lanes 6-8 show the PCR products related to the extremity. residual at 5? of the kfoE gene in the 3 transformants.
Le corsie 5 e 9 mostrano i prodotti di PCR del ceppo selvaggio U1-41 di Escherichia coli O5:K4:H4 usando rispettivamente le coppie di primers per le estremit? 3? e 5?. Lanes 5 and 9 show the PCR products of the wild U1-41 strain of Escherichia coli O5: K4: H4 using the primer pairs for the extremities, respectively. 3? and 5 ?.
Fig. 3: mostra un cromatogramma del prodotto di E.coli DSM23644 analizzato per Elettroforesi Capillare (EC), in cui ? mostrato il ?-disaccaride insaturo (?di-0S), tipico della digestione con Condroitinase ABC (picco 8). Fig. 3: shows a chromatogram of the product of E.coli DSM23644 analyzed by Capillary Electrophoresis (EC), in which? shown the unsaturated? -disaccharide (? di-0S), typical of digestion with Chondroitinase ABC (peak 8).
Fig. 4 : mostra uno spettro 13C-NMR della condroitina prodotta da E.coli DSM23644, ottenuta in accordo con l?esempio 3. Fig. 4: shows a 13C-NMR spectrum of the chondroitin produced by E. coli DSM23644, obtained in accordance with example 3.
Esempi Examples
Esempio 1: Example 1:
Costruzione del ceppo E. coli K4 (?kfoE/kanR) Construction of the E. coli K4 strain (? KfoE / kanR)
La costruzione del frammento di DNA lineare che contiene sia il gene kanR che le estremit? omologhe del gene kfoE (Fig. 1a) ? stata realizzata mediante PCR utilizzando il vettore pKD4 come templato e i seguenti primers di PCR: The construction of the linear DNA fragment that contains both the kanR gene and the ends? homologs of the kfoE gene (Fig. 1a)? was performed by PCR using the pKD4 vector as template and the following PCR primers:
OL151: atgcttctaataatgtctggttcctatgttcaacaagaatgtgtaggctggagctgcttc (SEQ ID N? 3) OL151: atgcttctaataatgtctggttcctatgttcaacaagaatgtgtaggctggagctgcttc (SEQ ID N? 3)
OL152: tcatactgcagcctccttaaaaatttcatataatctaaatgcacatatgaatatcctcct ta (SEQ ID N?4) OL152: tcatactgcagcctccttaaaaatttcatataatctaaatgcacatatgaatatcctcct ta (SEQ ID N? 4)
In ogni sequenza di oligonucleotidi, i primi 40 nucleotidi sono omologhi al gene kfoE e i restanti 20 nucleotidi forniscono l?omologia al plasmide templato pKD4 (siti di appaiamento P1 e P2). In each oligonucleotide sequence, the first 40 nucleotides are homologous to the kfoE gene and the remaining 20 nucleotides provide homology to the pKD4 template plasmid (P1 and P2 pairing sites).
La PCR ? stata effettuata su 120 ng di DNA stampo secondo le seguenti condizioni: The PCR? was performed on 120 ng of template DNA under the following conditions:
a 94?C x 3 min, (94?C x 1 min, 43?C x 1 min, 68?C x 2.5 min) x 30 cicli, 68?C x 10 min, 4?C x 10 min at 94? C x 3 min, (94? C x 1 min, 43? C x 1 min, 68? C x 2.5 min) x 30 cycles, 68? C x 10 min, 4? C x 10 min
Il prodotto di PCR ? stato purificato da gel e i batteri sono stati trasformati. The PCR product? been purified by gel and the bacteria were transformed.
Il ceppo U1-41 di Escherichia coli O5:K4:H4 (Fig. 1b) ? stato preparato e trasformato mediante elettroporazione con il plasmide pKD46 secondo i metodi di Datsenko e Wanner (PNAS, June 2000, vol 97, N ? 12, 6.640-6.645), poi seminato su piastre contenenti ampicillina. The U1-41 strain of Escherichia coli O5: K4: H4 (Fig. 1b)? was prepared and transformed by electroporation with the plasmid pKD46 according to the methods of Datsenko and Wanner (PNAS, June 2000, vol 97, N? 12, 6.640-6.645), then seeded on plates containing ampicillin.
I trasformanti ampicillina-resistenti sono stati individuati e isolati. Ampicillin-resistant transformants were identified and isolated.
I 2 trasformanti sono stati verificati per estrazione del plasmide e PCR utilizzando i primers e le condizioni che seguono: The 2 transformants were verified by plasmid extraction and PCR using the following primers and conditions:
OL149: ccactcataaatcctcatagag (SEQ ID N?5) OL149: ccactcataaatcctcatagag (SEQ ID N? 5)
OL150: ccaacttacttctgacaacgat (SEQ ID N?6) OL150: ccaacttacttctgacaacgat (SEQ ID N? 6)
a 94?C x 3 min, (94?C x 1 min, 43?C x 1 min, 68?C x 2.5 min) x 30 cicli, 68?C x 10 min, 4?C x 10 min at 94? C x 3 min, (94? C x 1 min, 43? C x 1 min, 68? C x 2.5 min) x 30 cycles, 68? C x 10 min, 4? C x 10 min
Il prodotto di PCR ? stato analizzato per elettroforesi su gel di agarosio al 2% identificando un prodotto di 1799 bp, in completo accordo con le dimensioni del prodotto atteso. The PCR product? was analyzed by electrophoresis on 2% agarose gel identifying a product of 1799 bp, in complete agreement with the size of the expected product.
Uno dei due trasformanti con il pKD46 ? stato sottoposto ad una successiva elettroporazione utilizzando il frammento di DNA avente sia la cassetta della resistenza alla kanamicina che le estremit? omologhe al gene kfoE. One of the two transformants with the pKD46? was subjected to a subsequent electroporation using the DNA fragment having both the kanamycin resistance cassette and the ends? homologous to the kfoE gene.
I ricombinanti aventi la mutazione per delezione del gene kfoE sono stati selezionati in piastre di terreni contenenti sia ampicillina che kanamicina. Tre doppi trasformanti sono stati verificati mediante PCR per amplificazione di entrambe le regioni fiancheggianti le estremit? 3' e 5' del gene kfoE, utilizzando i primers appropriati riportati di seguito: Recombinants having the kfoE gene deletion mutation were selected in media plates containing both ampicillin and kanamycin. Three double transformants were verified by PCR for amplification of both regions flanking the extremities. 3 'and 5' of the kfoE gene, using the following appropriate primers:
OL153: aatccgacggggactgtagatt (SEQ ID N?7) OL153: aatccgacggggactgtagatt (SEQ ID N? 7)
OL142: aactgttcgccaggctcaag (SEQ ID N?8) OL142: aactgttcgccaggctcaag (SEQ ID N? 8)
OL143: gcgttttcccttgtccagat (SEQ ID N?9) OL143: gcgttttcccttgtccagat (SEQ ID N? 9)
OL154: gctaatgtatatgattgccaggt (SEQ ID N?10) OL154: gctaatgtatatgattgccaggt (SEQ ID N? 10)
a 95?C x 5 min, (94?C x 1 min, 47?C x 1 min, 68?C x 2 min) x 30 cicli, 68?C x 10 min, 4?C x 10 min at 95? C x 5 min, (94? C x 1 min, 47? C x 1 min, 68? C x 2 min) x 30 cycles, 68? C x 10 min, 4? C x 10 min
I prodotti di PCR sono stati analizzati per elettroforesi su gel di agarosio al 2% identificando due prodotti, uno di 1773 bp derivato dall?amplificazione dell?estremit? 3? e l?altro di 769 bp derivato dall?amplificazione dell?estremit? 5? del gene kfoE rispettivamente, in pieno accordo con la dimensione dei prodotti attesi (Fig.2). The PCR products were analyzed by 2% agarose gel electrophoresis identifying two products, one of 1773 bp derived from extremity amplification. 3? and the other of 769 bp derived from the amplification of the extremity? 5? of the kfoE gene respectively, in full agreement with the size of the expected products (Fig. 2).
Un'ulteriore conferma del corretto inserimento del gene della resistenza alla kanamicina ? stata ottenuta mediante analisi di sequenza di E. coli K4 (?kfoE / kanR) (Fig.1c), utilizzando i seguenti oligonucleotidi: A further confirmation of the correct insertion of the kanamycin resistance gene? was obtained by sequence analysis of E. coli K4 (? kfoE / kanR) (Fig.1c), using the following oligonucleotides:
OL153: aatccgacggggactgtagatt (SEQ ID N?7) OL153: aatccgacggggactgtagatt (SEQ ID N? 7)
OL154: gctaatgtatatgattgccaggt (SEQ ID N?10) OL154: gctaatgtatatgattgccaggt (SEQ ID N? 10)
Esempio 2: Example 2:
Costruzione del ceppo E. coli K4 (?kfoE) Construction of the E. coli K4 (? KfoE) strain
Allo scopo di ottenere il ceppo di E. coli K4 (?kfoE) senza la cassetta di resistenza alla kanamicina e avente una delezione della maggior parte del gene kfoE con l?attesa perdita di funzione, ? stata effettuata una ulteriore trasformazione del ceppo di E. coli K4 (?kfoE / kanR) con il plasmide pCP20. In order to obtain the E. coli K4 (? KfoE) strain without the kanamycin resistance cassette and having a deletion of most of the kfoE gene with the expected loss of function,? A further transformation of the E. coli K4 strain (? kfoE / kanR) was carried out with the pCP20 plasmid.
Dopo il passaggio di elettroporazione, i trasformanti sono stati selezionati su piastre contenenti ampicillina a 30 ?C e poi purificati da colonia. After the electroporation step, the transformants were selected on plates containing ampicillin at 30 ° C and then purified from the colony.
I presunti trasformanti sono stati coltivati su piastre non selettive a 43?C e poi testati per verificare la perdita di tutte le resistenze agli antibiotici. The alleged transformants were grown on non-selective plates at 43 ° C and then tested for loss of all antibiotic resistance.
I ceppi trasformanti di E. coli K4 (?kfoE) sono stati verificati per sequenziamento delle regioni fiancheggianti le estremit? 3' e 5' rimanenti del gene kfoE (Fig.1d), utilizzando i seguenti oligonucleotidi: The transformant strains of E. coli K4 (? KfoE) were verified by sequencing of the regions flanking the extremities. 3 'and 5' remaining of the kfoE gene (Fig.1d), using the following oligonucleotides:
OL166: tgaggtgattgttggtaaaccttggtg (SEQ ID N?11) OL166: tgaggtgattgttggtaaaccttggtg (SEQ ID N? 11)
OL169: tactgtttctgcttgcccccgagtt (SEQ ID N?12) OL169: tactgtttctgcttgcccccgagtt (SEQ ID N? 12)
La sequenza nucleotidica risultante ? identificata dalla SEQ ID N?13. The resulting nucleotide sequence? identified by SEQ ID N? 13.
Esempio 3: Example 3:
Coltura di E.coli DSM23644 e analisi della condroitina Cultivation of E.coli DSM23644 and analysis of chondroitin
La coltura di E.coli DSM23644 ? stata effettuata in accordo con Rodriguez e Jann (Eur.J.Biochem.117, 117-124, FEBS 1988). The culture of E.coli DSM23644? was carried out in agreement with Rodriguez and Jann (Eur.J.Biochem.117, 117-124, FEBS 1988).
Brevemente, la coltura vegetativa ? stata eseguita a partire da 0.5 ml di una coltura stock scongelata, inoculando una beuta contenente 20 ml di un terreno di coltura contenente per litro: K2HPO4 3H2O 9.7 g, KH2PO48 g, sodio citrato 5H2O 0.5 g, MgCl2 7H2O 0.2 g, idrolizzato di caseina 20 g, ammonio solfato 20 g, glucosio 2 g, estratto di lievito 10 g, incubata a 37?C per 16h, in agitazione su shaker rotativo a 180 giri / min con 2,5 cm di eccentrico. Briefly, the vegetative crop? was performed starting from 0.5 ml of a thawed stock culture, by inoculating a flask containing 20 ml of a culture medium containing per liter: K2HPO4 3H2O 9.7 g, KH2PO48 g, sodium citrate 5H2O 0.5 g, MgCl2 7H2O 0.2 g, casein hydrolyzate 20 g, ammonium sulphate 20 g, glucose 2 g, yeast extract 10 g, incubated at 37 ° C for 16h, stirring on a rotary shaker at 180 rpm with 2.5 cm of eccentric.
La successiva fase fermentativa ? stata effettuata in coltura batch, in una beuta da 500ml con frangiflutti contenente 85 ml del terreno di coltura descritto in precedenza, inoculata con lo 0,05% di cultura vegetativa preparata come descritto sopra ed incubata a 37?C per 48 ore in agitazione su shaker rotativo a 180 giri / min con 25 cm di eccentrico. The next fermentation phase? was carried out in batch culture, in a 500ml flask with breakwater containing 85 ml of the culture medium described above, inoculated with 0.05% of vegetative culture prepared as described above and incubated at 37 ° C for 48 hours under agitation on 180 rpm rotary shaker with 25 cm eccentric.
Al termine dell?incubazione la coltura ? stata raccolta per centrifugazione e il surnatante ? stato sottoposto a purificazione con lo scopo di isolare e caratterizzare la condroitina prodotta. At the end of the incubation, the culture? was collected by centrifugation and the supernatant? was subjected to purification in order to isolate and characterize the chondroitin produced.
La purificazione della condroitina ? stata realizzata in accordo con un adattamento del metodo descritto da Rodriguez e Jann (Eur.J.Biochem. The purification of chondroitin? was carried out in accordance with an adaptation of the method described by Rodriguez and Jann (Eur.J.Biochem.
117, 117-124, FEBS 1988). 117, 117-124, FEBS 1988).
Brevemente, il polisaccaride ? stato precipitato dal surnatante della coltura con il Cetavlon (alchil-trimetilammonio bromuro, CAS N?7192-88-3), estratto con NaOH 0.5M a 3?C, neutralizzato e successivamente purificato con 3 cicli di precipitazione con etanolo all?80%. Briefly, the polysaccharide? was precipitated from the culture supernatant with Cetavlon (alkyl-trimethylammonium bromide, CAS N? 7192-88-3), extracted with 0.5M NaOH at 3? C, neutralized and subsequently purified with 3 precipitation cycles with 80% ethanol .
Uno step finale di purificazione ? stato eseguito con una soluzione al 90% di fenolo freddo con pH 6.8 per precipitare le proteine contaminanti recuperando cos? la fase acquosa per centifugazione. La condroitina purificata ? stata recuperata dalla fase acquosa per precipitazione in etanolo 80% ed essiccata sotto vuoto. A final step of purification? was performed with a 90% solution of cold phenol with pH 6.8 to precipitate the contaminating proteins thus recovering? the aqueous phase by centifugation. The purified chondroitin? it was recovered from the aqueous phase by precipitation in 80% ethanol and dried under vacuum.
Diversi approcci analitici sono stati utilizzati per l'accertamento della natura della condroitina prodotta. Different analytical approaches have been used to ascertain the nature of the chondroitin produced.
Il primo approccio si ? basato sulla presenza o assenza di fruttosio nel prodotto recuperato dalla cultura dopo idrolisi acida effettuata con 0,2 M acido trifluoroacetico per 1 ora a 99?C. The first approach yes? based on the presence or absence of fructose in the product recovered from the culture after acid hydrolysis carried out with 0.2 M trifluoroacetic acid for 1 hour at 99 ° C.
Al fine di quantificare il fruttosio presente nel prodotto recuperato, il fruttosio libero ? stato dosato sia prima che dopo l?idrolisi. Il fruttosio ? stato dosato enzimaticamente utilizzando il kit EnzyPlus Sucrose/D-Glucose/D-Fructose fornito da BIOCONTROL (BioControl Systems Inc. USA) In order to quantify the fructose present in the recovered product, the free fructose? been dosed both before and after hydrolysis. Fructose? been enzymatically dosed using the EnzyPlus Sucrose / D-Glucose / D-Fructose kit provided by BIOCONTROL (BioControl Systems Inc. USA)
La differenza tra il fruttosio libero presente dopo idrolisi e quello presente prima dell?idrolisi ? stato considerato come fruttosio legato alla molecola. Il prodotto recuperato dalla cultura di E.coli DSM23644 non ha mostrato la presenza di fruttosio legato, confermando che questo ceppo produce un polisaccaride senza fruttosio. The difference between the free fructose present after hydrolysis and that present before hydrolysis? been considered to be fructose bound to the molecule. The product recovered from the culture of E. coli DSM23644 did not show the presence of bound fructose, confirming that this strain produces a fructose-free polysaccharide.
L'assenza di fruttosio legato al polisaccaride recuperato da colture di E.coli DSM 23644 come descritto in precedenza ? stata confermata dalla digestione enzimatica con Condroitinasi ABC. ? stato dimostrato che la condroitina purificata dopo digestione con Condroitinasi ABC d? il ?-disaccaride insaturo (?di-0S) tipico della digestione della condroitina come confermato dall? Elettroforesi Capillare (CE), utilizzando la tecnica della Cromatografia Micellare Elettrocinetica (MECK) (Fig.3). The absence of fructose bound to the polysaccharide recovered from cultures of E. coli DSM 23644 as described above? was confirmed by enzymatic digestion with ABC chondroitinase. ? it has been shown that purified chondroitin after digestion with Chondroitinase ABC d? the unsaturated? -disaccharide (? di-0S) typical of the digestion of chondroitin as confirmed by? Capillary Electrophoresis (CE), using the Electrokinetic Micellar Chromatography (MECK) technique (Fig. 3).
La conferma della struttura del ?di-0S ? stata ottenuta mediante l'uso di un ?-disaccaride standard di riferimento appropriato (equivalente della eluizione elettroforetica). The confirmation of the structure of the? Di-0S? was obtained using an appropriate reference standard? -disaccharide (equivalent of electrophoretic elution).
La determinazione quantitativa del ?di-0S ottenuto ? stata raggiunta per mezzo di una curva di calibrazione esterna. The quantitative determination of the? Di-0S obtained? achieved by means of an external calibration curve.
Infine, il polisaccaride condroitina purificato prodotto da E.coli DSM23644 ? stato caratterizzato con l?NMR al C13 (Fig.4). Finally, the purified chondroitin polysaccharide produced by E.coli DSM23644? characterized with C13 NMR (Fig. 4).
Questa tecnica ha mostrato che il prodotto in questione ? spettralmente identico al prodotto ottenuto dopo l'eliminazione del fruttosio dal polisaccaride K4 nativo per idrolisi acida. This technique showed that the product in question? spectrally identical to the product obtained after the elimination of fructose from the native K4 polysaccharide by acid hydrolysis.
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