IT202000004564A1 - Processo per la solfatazione diretta di polisaccaridi in solvente ecologicamente accettabile - Google Patents
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Description
Descrizione del brevetto per invenzione industriale avente per titolo: ?PROCESSO PER LA SOLFATAZIONE DIRETTA DI POLISACCARIDI IN SOLVENTE ECOLOGICAMENTE ACCETTABILE?
Campo dell?invenzione
L?invenzione riguarda un nuovo processo di solfatazione, in particolare solfatazione di zuccheri, utilizzando solventi ecologicamente accettabili; il metodo ? applicabile anche a polisaccaridi e consente di preparare glucosammino glicani solfato, per esempio condroitina solfato. Reazioni di questo tipo sono generalmente condotte in solventi tossici e con alto impatto ambientale, quali ad esempio dimetilformammide, dimetilacetammide e simili. Diversamente da quanto noto in precedenza, ? possibile ottenere la reazione di solfatazione in solventi ecologicamente accettabili, come per esempio acido acetico, ottenendo buone rese di trasformazione, un buon controllo del grado di solfatazione ed una buona chemoselettivit?. Inoltre, il metodo non richiede step di protezione/deprotezione dei gruppi ossidrilici ma pu? essere applicato direttamente agli zuccheri non protetti. Inoltre, ? applicabile anche a polisaccaridi, in un ampio intervallo di pesi molecolari. In particolare, pu? essere applicato a glicosamminoglicani e pu? essere utile per la preparazione di eparina, cheratan solfato, dermatan solfato e condroitina solfato.
Background dell?invenzione
I glicosammino glicani (GAGs, o mucopolisaccaridi) sono una famiglia di polisaccaridi formati da una catena lineare di disaccaridi che alterna uno zucchero semplice ad un amminozucchero; sul disaccaride possono essere presenti uno o pi? gruppi solfato, in varie posizioni. Sono presenti in molti tessuti animali ed in particolare abbondanza nel tessuto connettivo, per esempio nella pelle, nelle cartilagini e nei tessuti molli in genere. Tra i GAGs sono compresi eparina ed eparan solfato, condroitina solfato, dermatan solfato, cheratan solfato e acido ialuronico; quest?ultimo ? l?unico che non presenta gruppi solfato. I glicosamminoglicani possono presentare diverso profilo di solfatazione e diverso peso molecolare a seconda della specie animale e dell?organo o tessuto di origine.
La condroitina solfato ? un glicosammino glicano composto da N-acetilglucosammina e da acido glucuronico, presenta dei gruppi solfato in varie posizioni del disaccaride ed ? generalmente presente negli organismi animali in vari tessuti; nell?uomo ? il GAG pi? abbondante ed ? presente in particolare nelle cartilagini. Viene correntemente utilizzata, sia come farmaco iniettabile che come prodotto nutraceutico, nella terapia delle osteoartriti e di altre malattie infiammatorie delle articolazioni, in particolare del ginocchio e della mano, per uso sia umano che veterinario.
La CS viene generalmente ricavata da prodotti di scarto dell?industria alimentare, in particolare da animali da allevamento quali bovini e suini, oppure provenienti dalla pesca, in particolare dagli squali. A seconda del tessuto e della specie di origine, la condroitina solfato si presenta con diverse caratteristiche, in particolare con un diverso profilo di solfatazione ed un diverso peso molecolare; quest?ultimo pu? essere influenzato anche dal metodo di preparazione utilizzato. La CS pu? essere suddivisa in base alla sequenza di disaccaridi che la compongono, i quali possono presentare il gruppo solfato in posizioni diverse e su entrambi gli zuccheri (prevalentemente nelle posizioni 2, 4 e 6): le condroitine A e C presentano un solo gruppo solfato, mentre la B, la E e la D presentano due gruppi solfato.
Inoltre, possono essere presenti anche condroitine non-solfatate e trisolfatate.
La CS di origine animale presente in commercio presenta diversa composizione a seconda della specie e dei tessuti di origine: anche il peso molecolare ? differente, generalmente pi? alto nei prodotti di origine marina e pi? basso in quelli di origine terrestre. Inoltre, la CS di origine animale si presenta come una miscela molto eterogenea rispetto al peso molecolare dei polimeri, essendo costituita da una miscela di polisaccaridi a catena breve (pochi kDa), media e lunga (>100kDa). Per descrivere le caratteristiche della CS, oltre al valore di PM medio si indica anche la polidispersione (dispersione dei valori di PM attorno al valore medio). Una descrizione della composizione per origine del prodotto si trova in WO2012/159655, pag. 2-3, Tabella 1.
Il peso molecolare medio originale della CS (o di altri glicosammino glicani) pu? anche essere ridotto a piacere mediante frammentazione controllata del polisaccaride: nelle CS a basso peso molecolare medio (LMW-CS) di origine animale il valore di polidispersione ? in genere ancora pi? alto, dato che le catene polisaccaridiche vengono frammentate in modo casuale sia nell?idrolisi acida che in quella radicalica.
Oltre alla scarsa standardizzazione del prodotto, il fatto che la CS sia di origine animale comporta ovviamente anche altri rischi, per esempio quelli legati a malattie trasmissibili dall?animale di origine all?uomo o agli animali da compagnia.
Per superare gli svantaggi derivante dall?origine animale, di recente ? stata sviluppata la produzione di condroitina solfato ottenuta per semisintesi: si produce per fermentazione un precursore non solfatato, denominato K4, che viene successivamente trasformato in condroitina solfato. Il K4 ? un polisaccaride avente la stessa struttura lineare della condroitina ma porta anche dei residui di fruttosio e non presenta gruppi solfato: pu? essere prodotto per via fermentativa, per esempio da E. coli O5:K4:H4 come descritto in WO2001/02597A1. Il K4 pu? essere facilmente defruttosilato per idrolisi chimica, originando un polimero lineare, chiamato K4d, corrispondente alla struttura della condroitina non-solfatata; da questo si ottiene la CS.
In una via alternativa, il polisaccaride K4d pu? anche essere prodotto direttamente per fermentazione, utilizzando un opportuno ceppo microbico ricombinante, come descritto in WO2012/004063.
La successiva solfatazione del polisaccaride K4d pu? avvenire in condizioni controllate per modulare il grado di solfatazione (numero di gruppi solfato per unit? disaccaridica) sia riguardo la posizione di introduzione del gruppo solfato, in genere in posizione 4 o in posizione 6. Anche il peso molecolare pu? essere modulato, per esempio sottoponendo un polimero ad alto peso molecolare ad idrolisi acida o radicalica: ? possibile farlo sia prima che dopo la solfatazione, quindi sia sul polisaccaride K4d che sulla la condroitina solfato. Questo processo, nelle sue varianti, consente di produrre una condroitina solfato avente il profilo di solfatazione desiderato, con ottima affidabilit? e senza gli svantaggi caratteristici di un prodotto di origine animale (US2019/231810).
La reazione di solfatazione del polimero K4d ? stata fino ad ora effettuata con vari solfatanti ma utilizzando sempre un solvente organico anidro, in particolare in dimetilformammide (DMF); non ? un processo a basso impatto eco-tossicologico.
La DMF ? un solvente che richiede particolari precauzioni in quanto, oltre che infiammabile, ? pericoloso per l?uomo e per l?ambiente: ? tossico per la pelle e gli occhi, per il sistema respiratorio e per l?apparato riproduttivo. E? particolarmente pericoloso anche perch? nocivo a contatto con la pelle o inalato. Ovviamente, date le caratteristiche di tossicit?, anche i costi ambientali sono elevati: il recupero e lo smaltimento dei reflui contenenti DMF ? costoso. In alternativa alla DMF, nelle reazioni di solfatazione si possono utilizzare dimetilacetammide o N-metil pirrolidone, che per? presentano problemi eco-tossicologici analoghi.
La DMF ? un buon solvente anche per gli agenti solfatanti: per esempio in Chopin et al, BioMed Research International 2015, Article ID508656 si effettua la solfatazione di un glicosammino glicano utilizzando liquidi ionici come solvente di reazione, ma si utilizza comunque DMF per sciogliere i donatori del gruppo solfato (complessi di SO3 con varie basi organiche). Inoltre, la DMF ? in grado di formare un complesso con SO3, che costituisce un possibile agente solfatante.
In alternativa alla DMF, pu? essere utilizzato acetonitrile come solvente nelle reazioni condotte con irraggiamento a microonde: si veda per esempio de Paz Carrera et al, WO2012/035188. Una descrizione generale delle reazioni di solfatazione di molecole organiche, compresi i polisaccaridi, si pu? trovare nella review di Desai et al, Tetrahedron 66, 2907-18 (2010).
Definizioni
K4: polisaccaride glicosammino glicano fruttosilato, non solfatato, avente la seguente formula di struttura:
K4d: polisaccaride glicosammino glicano non solfatato e privo di residui di fruttosio, avente la seguente formula di struttura:
Condroitina solfato: polisaccaride glicosammino glicano solfato, avente la seguente formula di struttura:
Descrizione dell?invenzione
Il processo di solfatazione dell?invenzione consente di utilizzare solventi ecologicamente accettabili, come per esempio acido acetico, mantenendo un buon controllo della reazione sia per quanto riguarda il suo avanzamento, ovvero il grado di solfatazione, che per quanto riguarda la posizione di introduzione del gruppo solfato, ovvero la selettivit?. Inoltre, il processo non richiede step di protezione e deprotezione, con il conseguente risparmio nell?utilizzo di materie prime e nella produzione di reflui. Il processo comporta un aumento di peso molecolare (PM) esclusivamente legato all?introduzione di nuovi gruppi solfato ma non influisce o influisce in maniera controllata sulla lunghezza del polimero, in particolare non provoca frammentazione: nel caso si vogliano LMW-CS, il PM del prodotto finale pu? quindi essere modulato a piacere mediante la combinazione delle modalit? di sintesi (frammentazione controllata del polisaccaride K4d, prima della solfatazione, oppure dopo la solfatazione, sulla condroitina solfato) e delle modalit? di isolamento (isolamento per precipitazione o per ultrafiltrazione). Il nuovo processo consente quindi di produrre una CS avente il profilo di solfatazione, peso molecolare, la polidispersione desiderati, adatta all?impiego in campo nutrizionale e farmaceutico.
Il processo dell?invenzione comporta un minore impatto ecologico grazie all?utilizzo di solventi non inquinanti e con un inferiore produzione di reflui. Nella forma di realizzazione preferita del processo, il prodotto ottenuto ? il sale sodico della condroitina solfato a basso peso molecolare.
In una possibile forma di realizzazione, viene sottoposto a solfatazione un sale del polimero K4d, preferibilmente un sale di tetraalchilammonio, pi? preferibilmente il sale di piridinio oppure un sale di tetrametil-, tetraetil- o tetrabutil- ammonio. In una forma di realizzazione alternativa, si utilizza il polisaccaride K4d in forma acida.
In una forma di realizzazione, viene impiegato come agente solfatante un complesso di SO3 con una base organica, per esempio SO3Py o SO3NEt3, DMF ecc. ecc. In una forma di realizzazione alternativa, viene impiegato come agente solfatante acido clorosolfonico.
In una forma di realizzazione, la reazione di solfatazione viene effettuata utilizzando come solvente acido acetico oppure DMPU (1,3-dimethyl-3,4,5,6-tetrahydro-2-pyrimidinone), o altri solventi.
Il processo dell?invenzione comprende:
a) la dissoluzione o sospensione di un polisaccaride, per esempio un glicosamminoglicano o un suo sale, in idoneo solvente, per esempio acido acetico
b) l?aggiunta di un agente solfatante
c) la conduzione della reazione in condizioni controllate di temperatura, per esempio mantenendo la miscela di reazione tra la temperatura di congelamento dell?acido acetico o di sue miscele con i polisaccaridi oggetto di solfatazione e 70?C, pi? preferibilmente tra 10 e 50?C, ancor pi? preferibilmente tra 10 e 20?C
d) la separazione del prodotto dal solvente di reazione, ad esempio per filtrazione diretta, per precipitazione in solvente organico o mediante cromatografia
e) opzionalmente, la rimozione di sali organici o inorganici ed altre impurezze dalla soluzione di glicosamminoglicano solfato, per esempio mediante dialisi
f) opzionalmente, il recupero del solvente di reazione ottenibile dopo separazione del prodotto desiderato, ed il suo riutilizzo nella reazione di cui al punto a.
Si ottiene in tal modo una soluzione del prodotto desiderato in forma sufficientemente pura per un impiego in campo nutrizionale; se si desidera avere il prodotto in forma solida, ? possibile liofilizzare la soluzione o essiccarla mediante spray-dry o altra tecnica adatta.
Se si desidera ottenere il prodotto di reazione in qualit? adatta ad un uso iniettabile, ? consigliabile rimuovere dalla soluzione di cui sopra eventuali pirogeni, per esempio depirogenazione con carbone, seguita da filtrazione sterilizzante prima dell?essiccamento.
Il processo completo inizia con produzione di polisaccaride capsulare K4, ottenuto per fermentazione di ceppo wild-type Escherichia coli O5:K4:H4 come descritto in WO2001/02597A1. Dopo separazione della biomassa, il surnatante ? soggetto a idrolisi in condizioni controllate per rimuovere i residui di fruttosio: si ottiene una soluzione acquosa di polisaccaride K4d, che corrisponde ad una condroitina non solfatata. Tale prodotto pu? essere ulteriormente purificato, ottenendo una soluzione acquosa del polisaccaride defruttosilato ad alto peso molecolare in forma di sale sodico. Questo viene quindi sottoposto a frammentazione controllata in condizioni acide, analogamente a quanto descritto da Cho et al. in Biol Pharm Bull 27, (1), 47-51. In alternativa, ? possibile utilizzare una procedura di frammentazione radicalica, utilizzando acqua ossigenata e ferro solfato, come descritto in IT 1224260, o utilizzando ipoclorito di sodio come descritto in US 4,977,250. La reazione generalmente viene monitorata in HPLC-SEC per controllare il peso molecolare del prodotto; raggiunto il PM medio desiderato, per esempio tra 5 e 30 kDa, si interrompe la reazione per aggiunta di sodio idrossido, sodio carbonato o altra base fino a pH neutro e si raffredda a temperatura ambiente.
La soluzione acquosa di polimero K4d a basso peso molecolare ? sottoposta a ultrafiltrazione con membrane in polisulfone a cut-off tra 500 e 5000 Dalton: vengono eliminati nel permeato i sali inorganici (principalmente sodio cloruro e sodio solfato) e gli zuccheri a peso molecolare molto basso. In tal modo si seleziona il peso molecolare del polimero in un intervallo ristretto; ? anche possibile combinare due ultrafiltrazioni, una con cut-off pi? alto ed una con cut-off pi? basso, per restringere ulteriormente la distribuzione dei pesi molecolari (ridotta polidispersione).
La frazione di polimero ad alto peso molecolare, ritenuta dalla membrana, pu? essere riciclata nel lotto successivo.
Per ottenere il polisaccaride K4d come sale sodico la soluzione pu? essere concentrata per ultrafiltrazione o per evaporazione su film sottile, quindi essiccata per spray-dry; in alternativa, si pu? isolare il prodotto mediante liofilizzazione. Si ottiene il polisaccaride K4d (condroitina non-solfatata) sostanzialmente puro avente il peso molecolare desiderato: il contenuto di acqua residua ? inferiore al 5%, tipicamente inferiore al 2% (titolazione secondo Karl-Fisher).
Con procedura del tutto analoga a quanto sopra descritto ? possibile ottenere un sale di potassio, di ammonio o altri sali utilizzando le opportune soluzioni per la dialisi o per l?eluizione da resine (per esempio, utilizzando una soluzione di KCl invece di NaCl).
Per ottenere il polimero K4d in forma di acido oppure come sale di ammonio quaternario ? possibile operare come sopra descritto ma, per ridurre i costi, ? preferibile utilizzare una resina a scambio cationico, preferibilmente una resina del tipo acido forte, preferibilmente una resina solfonica. La resina pu? essere basata su un polimero naturale, come l?agarosio, oppure su un polimero sintetico, per esempio un poliacrilato o un polistirene; pu? essere sia rigida che di tipo gel; deve essere funzionalizzata con un gruppo acido forte, per esempio un gruppo solfonico o fosforico. Si pu? operare sia in colonna che in modo batch, la quantit? di resina da impiegare dipende dal suo grado di funzionalizzazione (numero di gruppi funzionali per litro di resina).
La soluzione acquosa di polimero K4d, in reattore provvisto di agitatore meccanico, viene trattata aggiungendo in porzioni successive la resina (in forma acida) fino a raggiungere un pH della soluzione inferiore a 2; la resina viene quindi separata per filtrazione. Si ottiene una soluzione di polisaccaride K4d in forma di acido indissociato, senza osservare frammentazione del polimero; ? anche possibile ottenere il prodotto in forma solida essiccando la soluzione per liofilizzazione o per spray-dry.
Volendo ottenere il prodotto sotto forma di un sale di ammonio quaternario, alla soluzione acida di cui sopra si aggiunge la base opportuna (piridina, tetrabutilammonio idrossido ecc.) quanto basta a raggiungere un pH neutro: si ottiene il prodotto solido per essiccamento spray-dry come descritto sopra, oppure per liofilizzazione.
Si possono ottenere in questo modo il sale di piridinio, di tetrametilammonio, di tetraetilammonio e di tetrabutilammonio, tutti in forma di solido bianco o giallino, con umidit? residua inferiore al 5% e sostanzialmente privi di sodio (inferiore a 0,1%).
Il polimero K4d in forma acida o salificata viene quindi utilizzato per la reazione di solfatazione, descritta in seguito, per ottenere condroitina solfato: dopo dialisi e concentrazione, la soluzione di CS viene essiccata per spray-dry, ottenendo il sale sodico della CS. Il buon controllo della reazione consente di modulare la regioselettivit? ed il grado di solfatazione del polimero. In tal modo, ? possibile preparare un prodotto avente caratteristiche analoghe a quelle della condroitina solfato di origine animale, per esempio con profilo di solfatazione analogo alla CS da squalo o di altre specie animali.
? inoltre possibile selezionare il peso molecolare medio del prodotto finito e sua la distribuzione attorno al valore medio sia frammentando il polimero K4d prima della solfatazione, come sopra descritto, sia frammentando la condroitina solfato ottenuta dopo la solfatazione; in entrambi i casi la frammentazione pu? essere ottenuta mediante meccanismo acido o radicalico, come descritto nella letteratura citata.
I seguenti esempi illustrano l?invenzione in maggior dettaglio. Esempio 1: procedura generale per la preparazione del polimero K4d sale sodico
Il polisaccaride K4d viene ottenuto producendo il polisaccaride capsulare K4 per fermentazione di Escherichia coli come descritto in Manzoni et al, Biotechnol Lett 18, 383-6 (1996); dopo separazione della biomassa, il surnatante ? soggetto a idrolisi in condizioni controllate per rimuovere i residui di fruttosio; si ottiene una soluzione acquosa di polisaccaride K4d, che viene ulteriormente purificato per cromatografia secondo quanto descritto in Rodriguez et al, Eur J Biochem 177, 117-124 (1988) ottenendo una soluzione acquosa del polisaccaride de-fruttosilato ad alto peso molecolare.
Si procede quindi ad una depolimerizzazione acida in condizioni controllate, portando la soluzione a pH compreso tra 1 e 4 per aggiunta di HCl, e scaldando fino a 60-80?C. La reazione viene monitorata in HPLC-SEC per controllare il peso molecolare del prodotto; raggiunto il peso molecolare medio desiderato, tra 5 e 30 kDa, si interrompe la reazione per aggiunta di sodio idrossido fino a pH 7 e si raffredda a 20-25?C.
La soluzione acquosa di polimero K4d a basso peso molecolare ? sottoposta a ultrafiltrazione con membrane in polisulfone a cut-off 2.5kDa, dializzata con acqua e concentrata. Su scala industriale il prodotto viene isolato per essiccamento spray-dry mentre su scala laboratorio si ottiene mediante liofilizzazione. Si ottiene il sale sodico del polisaccaride K4d (condroitina non-solfatata) come polvere biancastra fine: il contenuto di acqua residua ? inferiore al 2% (titolazione secondo Karl-Fisher).
Esempio 2: procedura generale per la preparazione del polimero K4d sale di ammonio quaternario
Il polisaccaride K4d viene ottenuto operando come descritto nell?esempio 1 fino ad ottenere la soluzione acquosa del sale sodico puro, al peso molecolare desiderato, senza necessit? di isolare il prodotto in forma solida.
Tale soluzione viene posta in reattore provvisto di agitatore meccanico, quindi si aggiunge in porzioni successive la resina Amberlite IRA1200H (forma acida), fino a raggiungere un pH inferiore a 2; la resina viene quindi separata per filtrazione. Si ottiene una soluzione di polisaccaride K4d in forma di acido indissociato, senza osservare frammentazione del polimero; ? anche possibile ottenere il prodotto in forma solida essiccando la soluzione per liofilizzazione o per spray-dry.
In sostituzione della resina Amberlite IRA1200H ? possibile utilizzare una resina analoga, per esempio una resina cationica forte a struttura poliacrilica o polivinilica, ottenendo analoghi risultati.
La soluzione acida di cui sopra viene addizionata di base (piridina oppure tetrabutil- tetrametil- tetraetil-ammonio idrossido) quanto basta a raggiungere un valore di pH superiore a 7. Si ottiene il prodotto solido per essiccamento spray-dry oppure per liofilizzazione.
Si ottengono in questo modo il sale di piridinio, di tetrametilammonio, di tetraetilammonio e di tetrabutilammonio, tutti in forma di solido bianco o giallino, con umidit? residua inferiore al 5% e sostanzialmente privi di sodio (inferiore a 0,1%).
Esempio 3: procedura alternativa per la preparazione del polimero K4d In alternativa a quanto descritto nell?esempio 1, ? possibile ottenere il polisaccaride K4d direttamente per fermentazione, utilizzando il ceppo DSM23644 che produce un polisaccaride de-fruttosilato. Per la purificazione del prodotto si procede come descritto in WO2012/004063, si procede a depolimerizzazione acida o radicalica secondo quanto descritto da Cho et al per ottenere il peso molecolare desiderato.
Il prodotto ottenuto ? del tutto identico a quello ottenuto secondo l?esempio 1; ? possibile ottenere un sale di ammonio quaternario operando come descritto nell?esempio 2.
Esempio 4 (comparativo): preparazione di condroitina solfato in solvente DMF
La reazione viene condotta come descritto in WO2012/159655, esempio 4, con la differenza che il polisaccaride K4d utilizzato ha un peso molecolare inferiore, <10 kDa.
In un reattore si caricano 72 ml di dimetilformammide anidra e 1,20 g di polisaccaride K4d sale di tetrabutilammonio, ottenuto come descritto nell?esempio 2. Si aggiungono 3 equivalenti di complesso SO3 DMF e si mantiene la temperatura controllata a circa 10?C. A fine reazione si spegne con bicarbonato di sodio e dializza, isolando il prodotto per liofilizzazione: si ottiene condroitina solfato sodica di peso molecolare <10 kDa e con il profilo di solfatazione riportato in WO2012/159655, pag.16, Tabella 2.
Esempio 5: preparazione della miscela solfatante in acido acetico
In un reattore di vetro, sotto flusso di azoto, si caricano 134 ml di DMF anidra e si raffredda a 5?5?C; si gocciolano 67 g di acido clorosolfonico, mantenendo la temperatura <30?C. Durante l?aggiunta si forma un precipitato bianco; la miscela viene mantenuta sotto agitazione per ulteriori 20 minuti portando la temperatura a 5?5?C. Il solido viene filtrato su un filtro buchner in vetro sinterizzato, sotto azoto, eliminando la DMF. Il reagente solido viene sciolto in acido acetico (73,46 g) sotto agitazione magnetica. La soluzione solfatante risultante viene mantenuta sotto azoto a 4?C al riparo dall?umidit? fino al momento dell?uso.
Esempio 6: preparazione della miscela di acido clorosolfonico in DMPU (1,3-dimetil-3,4,5,6-tetraidro-2-pirimidinone)
In un reattore in vetro sotto flusso di azoto, si caricano 25 ml di DMPU anidro e si porta il solvente sotto agitazione a 5?5?C; si gocciolano 6,42 g di acido clorosolfonico, mantenendo la temperatura <30?C. La soluzione solfatante risultante viene mantenuta a temperatura ambiente sotto azoto e protetta dall?umidit? fino al momento dell?uso.
Esempio 7: preparazione di condroitina solfato a basso peso molecolare in solvente acido acetico
In un reattore in vetro sotto flusso di azoto, si caricano 200 ml di acido acetico anidro e 20 g di polisaccaride K4d sale di tetrabutilammonio, ottenuto come descritto nell?esempio 2. La sospensione risultante viene portata sotto agitazione a circa 13?C, trattata con la soluzione solfatante preparata secondo l?esempio 5 (40,22 g) e mantenuta sotto agitazione alla medesima temperatura per 24 ore. La reazione viene spenta con NaOH 30% (382 ml) e ghiaccio, mantenendo la temperatura <30?C; la sospensione viene portata a pH 7,9 con HCl e filtrata su buchner, il solido (sodio acetato) viene scartato. Le acque madri vengono ultrafiltrate su membrana da ultrafiltrazione (cut-off 2,5 KDa) dializzando con acqua. Il retentato viene concentrato mediante evaporazione sottovuoto, decolorato con carbone decolorante e liofilizzato, ottenendo 10,5 g di condroitina solfato.
Esempio 8: preparazione di condroitina solfato a basso peso molecolare in solvente acido acetico
In un reattore in vetro, sotto flusso di azoto, si caricano 200 ml di acido acetico anidro e 20 g di polisaccaride K4d sale di tetrabutilammonio, ottenuto come descritto nell?esempio 2; si raffredda a circa 13?C e si aggiunge la soluzione solfatante descritta nell?esempio 5 (40,0 g). Dopo 24 ore, la reazione viene spenta con acqua e ghiaccio mantenendo la temperatura <30?C; si procede con ultrafiltrazione e dialisi con acqua, correggendo il pH del retentato tra 5,5 e 7,5. Il retentato viene concentrato, decolorato con carbone e liofilizzato; si ottengono 11,5 g di condroitina solfato.
Esempio 9: preparazione di condroitina solfato a basso peso molecolare in solvente acido acetico
In un reattore in vetro, sotto flusso di azoto, si caricano 800 ml di acido acetico anidro e 80 g di polisaccaride K4d sale di tetrabutilammonio, ottenuto come descritto nell?esempio 2. La sospensione risultante viene portata sotto agitazione a circa 50?C e trattata con la soluzione solfatante preparata secondo l?esempio 5 (161,32 g) e mantenuta sotto agitazione alla medesima temperatura per 1 hr. Parte della sospensione (~200 ml) viene spenta versandola in acqua e ghiaccio (2,5 kg) mantenendo la temperatura <30?C; la soluzione risultante viene ultrafiltrata su membrana da ultrafiltrazione (cut off 2,5 KDa) dializzando con acqua fino a conducibilit? nel permeato < 500 ?S e correggendo il pH del retentato tra 5,5 e 7,5. Il retentato viene concentrato mediante evaporazione, ghiacciato e liofilizzato, ottenendo 8,6 g di condroitina solfato.
Esempio 10: preparazione di condroitina solfato a basso peso molecolare in solvente acido acetico con acido clorosolfonico
In un reattore sotto flusso di azoto, si caricano 200 ml di acido acetico anidro e 20 g di polisaccaride K4d sale di tetrabutilammonio, ottenuto come descritto nell?esempio 2; si raffredda a circa 13?C e aggiunge acido clorosolfonico (8,95 g), mantenendo la temperatura per 24 ore. La sospensione viene poi versata in acqua e ghiaccio, ultrafiltrata e dializzata come descritto nell?esempio 8. Per liofilizzazione si ottengono 12,7 g di condroitina solfato.
Esempio 11: preparazione di condroitina solfato a basso peso molecolare in solvente acido acetico, con acido clorosolfonico
In un reattore in vetro provvisto di agitatore meccanico, termometro, gocciolatore e sotto flusso di azoto, si caricano 600 ml di acido acetico anidro e 60 g di polisaccaride K4d sale di tetrabutilammonio, ottenuto come descritto nell?esempio 2. La sospensione risultante viene portata sotto agitazione a circa 50?C e trattata con acido clorosolfonico (28,8 g) e mantenuta sotto agitazione alla medesima temperatura 10?. Una parte della sospensione (~200 ml) viene spenta versandola in acqua e ghiaccio (2,5 kg) mantenendo la temperatura <30?C; la soluzione risultante viene ultrafiltrata su membrana da ultrafiltrazione, dializzando con acqua fino a conducibilit? nel permeato < 500 ?S e correggendo il pH del retentato tra 5,5 e 7,5. Il retentato viene concentrato mediante evaporazione, ghiacciato e liofilizzato, ottenendo 8,64 g di condroitina solfato.
Esempio 12: preparazione di condroitina solfato a basso peso molecolare in solvente acido acetico con acido clorosolfonico
Si procede come negli esempi precedenti utilizzando 200 ml di acido acetico anidro, 20 g di polisaccaride K4d sale TBA, 10,54 g di acido clorosolfonico, effettuando la reazione a 10-15?C e per 24 ore. Al termine la sospensione viene filtrata su buchner, il cake viene lavato con acido acetico e sciolto in acqua a pH 7,3 per Na2CO3 (q.b.). La soluzione risultante viene ultrafiltrata e dializzata come sopra, il retentato viene liofilizzato, ottenendo 8,58 g di condroitina solfato.
Esempio 13: preparazione di condroitina solfato a basso peso molecolare in solvente DMPU con acido clorosolfonico in DMPU
In un reattore in vetro, sotto flusso di azoto, si caricano 200 ml di DMPU (1,3-dimetil-3,4,5,6-tetraidro-2-pirimidinone) anidro e 20 g di polisaccaride K4d sale TBA. La sospensione risultante viene raffreddata a circa 10?C, trattata con la soluzione solfatante preparata secondo l?esempio 6 (31,4 g) e mantenuta alla medesima temperatura per 1 ora, quindi la reazione viene spenta versandola in Na2CO3 5% aq. fino a pH 8,4. La soluzione risultante viene caricata su una colonna di resina scambiatrice anionica (Amberlite IRA 900 forma OH-), eluendo con acqua e poi con NaCl 2M. La soluzione salina contente la CS viene ultrafiltrata e dializzata su membrana 2,5 KDa, quindi liofilizzata, ottenendo 7,0 g di condroitina solfato.
Esempio 14: Purificazione di condroitina solfato a basso peso molecolare in acido acetico per precipitazione in etanolo e acqua
Si procede alla sintesi come descritto nell?esempio 7, a fine reazione si rimuove il sodio acetato per filtrazione. La soluzione viene gocciolata in etanolo assoluto sotto vigorosa agitazione; ne risulta una sospensione che viene filtrata su filtro buchner, ottenendo 27,1 g di condroitina solfato grezza in forma di solido vetroso. Un?aliquota del solido ottenuto (2,5 g) viene sciolta in NaCl 0,2M (7,5 ml), quindi la soluzione viene gocciolata in EtOH (50 ml) sotto vigorosa agitazione; si ottiene la precipitazione di condroitina solfato pura in forma di solido amorfo (2,16 g).
Esempio 15: Sintesi e purificazione di condroitina solfato a alto peso molecolare in acido acetico
Si procede come descritto nell?esempio 1 per ottenere il polisaccaride K4d (defruttosilato) ad alto peso molecolare in soluzione acquosa; tuttavia, non si procede a depolimerizzazione. Si ottiene il corrispondente sale di tetrabutilammonio mediante resina a scambio ionico come descritto nell?esempio 2.
In un reattore in vetro, sotto flusso di azoto, si caricano 91 ml di acido acetico anidro e 9,1 g di polisaccaride K4d sale di TBA ad alto peso molecolare. La sospensione risultante viene portata sotto agitazione a 10-15?C e trattata con acido clorosolfonico (5,3 g), quindi viene mantenuta sotto agitazione alla medesima temperatura per 2,5 ore. La sospensione viene filtrata su buchner e il cake ottenuto viene sciolto in NaHCO3 10% aq.; la soluzione risultante viene ultrafiltrata e dializzata su membrana da ultrafiltrazione. Per liofilizzazione si ottengono 5,21 g di condroitina solfato.
Esempio 16: Sintesi e purificazione di condroitina solfato a basso peso molecolare (con DMFSO3 polvere) in acido acetico
In un reattore in vetro, sotto flusso di azoto, si caricano 200 ml di acido acetico anidro e 20 g di polisaccaride K4d sale di TBA, ottenuto come descritto nell?esempio 2. La sospensione risultante viene portata sotto agitazione a circa 50?C e trattata con DMF-SO3 complex (Aldrich, 10,95 g) e mantenuta sotto agitazione alla medesima temperatura per 1 ora, quindi si spegne la reazione in ghiaccio e si procede a ultrafiltrazione e dialisi mantenendo il pH del retentato tra 5,5 e 7,5. Si decolora con carbone decolorante e si liofilizza, ottenendo 8,73 g di condroitina solfato.
Claims (11)
- RIVENDICAZIONI 1. Processo di preparazione di glicosamminoglicani solfati per reazione di glicosamminoglicani o di loro sali con un agente solfatante, caratterizzato dal fatto che la reazione ? effettuata in un solvente scelto fra acido acetico e 1,3-dimetil-3,4,5,6-tetraidro-2-pirimidinone, in condizioni controllate di temperatura.
- 2. Processo secondo la rivendicazione 1 in cui il solvente ? acido acetico.
- 3. Processo secondo la rivendicazione 1 o 2 in cui l?agente solfatante ? acido clorosolfonico o un complesso di SO3 con una base organica o con dimetilformammide.
- 4. Processo secondo la rivendicazione 3 in cui la base organica ? piridina o trietilammina.
- 5. Processo secondo una o pi? delle rivendicazioni da 1 a 4 in cui la temperatura ? compresa fra la temperatura di congelamento della miscela di reazione e 70?C, preferibilmente tra 10 e 50?C, pi? preferibilmente tra 10 e 20?C.
- 6. Processo secondo una o pi? delle rivendicazioni da 1 a 5 in cui il glicosamminoglicano ? in forma di sale.
- 7. Processo secondo la rivendicazione 6 in cui il sale ? un sale di tetraalchilammonio o di piridinio.
- 8. Processo secondo una o pi? delle rivendicazioni da 1 a 7 in cui il glicosamminoglicano ? scelto fra condroitina solfato, eparina, eparan solfato, cheratan solfato, dermatan solfato.
- 9. Processo secondo la rivendicazione 8 in cui il glicosamminoglicano ? condroitina solfato.
- 10. Processo secondo una o pi? delle rivendicazioni da 1 a 9 per la preparazione di condroitina solfato sale sodico a basso peso molecolare.
- 11. Processo secondo una o pi? delle rivendicazioni da 1 a 10 in cui il prodotto di solfatazione ? isolato per filtrazione, precipitazione in solvente organico o mediante cromatografia, opzionalmente previa rimozione di sali organici o inorganici mediante dialisi.
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