HUP0300548A2 - Poliol-ifn-béta konjugátumok - Google Patents
Poliol-ifn-béta konjugátumok Download PDFInfo
- Publication number
- HUP0300548A2 HUP0300548A2 HU0300548A HUP0300548A HUP0300548A2 HU P0300548 A2 HUP0300548 A2 HU P0300548A2 HU 0300548 A HU0300548 A HU 0300548A HU P0300548 A HUP0300548 A HU P0300548A HU P0300548 A2 HUP0300548 A2 HU P0300548A2
- Authority
- HU
- Hungary
- Prior art keywords
- peg
- residue
- polyol
- ifn
- interferon
- Prior art date
Links
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 claims abstract description 134
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 claims abstract description 128
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 44
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims abstract description 32
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims abstract description 26
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims abstract description 25
- 150000003077 polyols Chemical group 0.000 claims abstract description 24
- 230000001588 bifunctional effect Effects 0.000 claims abstract description 16
- 229920005862 polyol Polymers 0.000 claims abstract description 13
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims abstract description 5
- 108090000467 Interferon-beta Proteins 0.000 claims description 47
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 18
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 16
- 230000008878 coupling Effects 0.000 claims description 13
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 claims description 13
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 claims description 13
- -1 succinimidyl esters Chemical class 0.000 claims description 12
- HAXFWIACAGNFHA-UHFFFAOYSA-N aldrithiol Chemical compound C=1C=CC=NC=1SSC1=CC=CC=N1 HAXFWIACAGNFHA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- 239000000376 reactant Substances 0.000 claims description 10
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims description 9
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims description 9
- 102000003996 Interferon-beta Human genes 0.000 claims description 7
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 claims description 7
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 7
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 claims description 6
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 claims description 6
- 229920001427 mPEG Polymers 0.000 claims description 6
- 101001054334 Homo sapiens Interferon beta Proteins 0.000 claims description 5
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 claims description 5
- 229960001388 interferon-beta Drugs 0.000 claims description 5
- 125000003396 thiol group Chemical group [H]S* 0.000 claims description 5
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 claims description 4
- AEMRFAOFKBGASW-UHFFFAOYSA-N Glycolic acid Chemical compound OCC(O)=O AEMRFAOFKBGASW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- AFOSIXZFDONLBT-UHFFFAOYSA-N divinyl sulfone Chemical compound C=CS(=O)(=O)C=C AFOSIXZFDONLBT-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 claims description 4
- 238000001542 size-exclusion chromatography Methods 0.000 claims description 4
- 229920001577 copolymer Polymers 0.000 claims description 3
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 claims description 3
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 claims description 3
- 229920001515 polyalkylene glycol Polymers 0.000 claims description 3
- 229920001451 polypropylene glycol Polymers 0.000 claims description 3
- LOVPHSMOAVXQIH-UHFFFAOYSA-N (4-nitrophenyl) hydrogen carbonate Chemical class OC(=O)OC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 LOVPHSMOAVXQIH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- AWAFMFHOLVZLFG-UHFFFAOYSA-N 1-iodoaziridine-2,3-dione Chemical compound IN1C(=O)C1=O AWAFMFHOLVZLFG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 150000003923 2,5-pyrrolediones Chemical class 0.000 claims description 2
- BTBWSRPRAGXJJV-UHFFFAOYSA-N 2h-benzotriazole;carbonic acid Chemical class OC(O)=O.C1=CC=C2NN=NC2=C1 BTBWSRPRAGXJJV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 claims description 2
- PEEHTFAAVSWFBL-UHFFFAOYSA-N Maleimide Chemical compound O=C1NC(=O)C=C1 PEEHTFAAVSWFBL-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims description 2
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 claims description 2
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 claims description 2
- 230000001363 autoimmune Effects 0.000 claims description 2
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 claims description 2
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 claims description 2
- 239000011616 biotin Substances 0.000 claims description 2
- 150000001735 carboxylic acids Chemical class 0.000 claims description 2
- 238000004191 hydrophobic interaction chromatography Methods 0.000 claims description 2
- 208000027866 inflammatory disease Diseases 0.000 claims description 2
- PGLTVOMIXTUURA-UHFFFAOYSA-N iodoacetamide Chemical class NC(=O)CI PGLTVOMIXTUURA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 claims description 2
- 239000012948 isocyanate Substances 0.000 claims description 2
- 150000002513 isocyanates Chemical class 0.000 claims description 2
- 238000004366 reverse phase liquid chromatography Methods 0.000 claims description 2
- 125000003827 glycol group Chemical group 0.000 claims 2
- JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N lactic acid Chemical compound CC(O)C(O)=O JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 2
- 150000001299 aldehydes Chemical class 0.000 claims 1
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims 1
- 150000002118 epoxides Chemical class 0.000 claims 1
- 229940042795 hydrazides for tuberculosis treatment Drugs 0.000 claims 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 claims 1
- 235000014655 lactic acid Nutrition 0.000 claims 1
- 239000004310 lactic acid Substances 0.000 claims 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 abstract description 3
- 101100498071 Neurospora crassa (strain ATCC 24698 / 74-OR23-1A / CBS 708.71 / DSM 1257 / FGSC 987) cys-17 gene Proteins 0.000 abstract 1
- 102100026720 Interferon beta Human genes 0.000 description 40
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 25
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 23
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 23
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 22
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 19
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 19
- 230000006320 pegylation Effects 0.000 description 15
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 14
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 13
- 238000005251 capillar electrophoresis Methods 0.000 description 10
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 description 9
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 9
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 9
- 230000000840 anti-viral effect Effects 0.000 description 9
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 8
- 239000012911 assay medium Substances 0.000 description 8
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 7
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 7
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 6
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 6
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 6
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 6
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 5
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 5
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 5
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 5
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 5
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 5
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 102100040019 Interferon alpha-1/13 Human genes 0.000 description 4
- 239000004743 Polypropylene Substances 0.000 description 4
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 4
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 4
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 4
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 4
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 4
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 4
- 229920001155 polypropylene Polymers 0.000 description 4
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 4
- 239000007974 sodium acetate buffer Substances 0.000 description 4
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 4
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 4
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 4
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 4
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 4
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 3
- 239000012505 Superdex™ Substances 0.000 description 3
- 101000654530 Tupaia virus (isolate Tupaia/Thailand/-/1986) Small hydrophobic protein Proteins 0.000 description 3
- 241000711975 Vesicular stomatitis virus Species 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 3
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 3
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 3
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 3
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 3
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 3
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 3
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 3
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 3
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 3
- 238000007911 parenteral administration Methods 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 208000035143 Bacterial infection Diseases 0.000 description 2
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 2
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 2
- 230000005526 G1 to G0 transition Effects 0.000 description 2
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010047761 Interferon-alpha Proteins 0.000 description 2
- 102000006992 Interferon-alpha Human genes 0.000 description 2
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 2
- 229930182816 L-glutamine Natural products 0.000 description 2
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 2
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 2
- 108090000526 Papain Proteins 0.000 description 2
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 2
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 2
- 229920003171 Poly (ethylene oxide) Polymers 0.000 description 2
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 2
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N Sodium azide Chemical compound [Na+].[N-]=[N+]=[N-] PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000036693 Thrombopoietin Human genes 0.000 description 2
- 108010041111 Thrombopoietin Proteins 0.000 description 2
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 2
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 2
- 230000006978 adaptation Effects 0.000 description 2
- 230000001028 anti-proliverative effect Effects 0.000 description 2
- 208000022362 bacterial infectious disease Diseases 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 239000001569 carbon dioxide Substances 0.000 description 2
- 229910002092 carbon dioxide Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000007385 chemical modification Methods 0.000 description 2
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 2
- 230000000120 cytopathologic effect Effects 0.000 description 2
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 2
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 2
- 229940079322 interferon Drugs 0.000 description 2
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 238000001906 matrix-assisted laser desorption--ionisation mass spectrometry Methods 0.000 description 2
- 125000000956 methoxy group Chemical group [H]C([H])([H])O* 0.000 description 2
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 2
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 2
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 2
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 2
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 2
- 238000004393 prognosis Methods 0.000 description 2
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 2
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 2
- 208000002491 severe combined immunodeficiency Diseases 0.000 description 2
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 2
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 2
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 2
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 2
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 2
- 150000003573 thiols Chemical class 0.000 description 2
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 2
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 1
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 1
- 101710169336 5'-deoxyadenosine deaminase Proteins 0.000 description 1
- 101710191936 70 kDa protein Proteins 0.000 description 1
- ZCYVEMRRCGMTRW-UHFFFAOYSA-N 7553-56-2 Chemical compound [I] ZCYVEMRRCGMTRW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000030507 AIDS Diseases 0.000 description 1
- 208000024893 Acute lymphoblastic leukemia Diseases 0.000 description 1
- 229930024421 Adenine Natural products 0.000 description 1
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N Adenine Chemical compound NC1=NC=NC2=C1N=CN2 GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000055025 Adenosine deaminases Human genes 0.000 description 1
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 1
- 208000003950 B-cell lymphoma Diseases 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- IAYPIBMASNFSPL-UHFFFAOYSA-N Ethylene oxide Chemical compound C1CO1 IAYPIBMASNFSPL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000005176 Hepatitis C Diseases 0.000 description 1
- 101000651236 Homo sapiens NCK-interacting protein with SH3 domain Proteins 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- 108010005714 Interferon beta-1b Proteins 0.000 description 1
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 description 1
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 description 1
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical compound NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 125000000729 N-terminal amino-acid group Chemical group 0.000 description 1
- 108091006006 PEGylated Proteins Proteins 0.000 description 1
- ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N Potassium Chemical compound [K] ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GOOHAUXETOMSMM-UHFFFAOYSA-N Propylene oxide Chemical compound CC1CO1 GOOHAUXETOMSMM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 1
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 1
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 1
- 206010040070 Septic Shock Diseases 0.000 description 1
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N Thymidine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 description 1
- GSEJCLTVZPLZKY-UHFFFAOYSA-N Triethanolamine Chemical compound OCCN(CCO)CCO GSEJCLTVZPLZKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 1
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 1
- 125000002252 acyl group Chemical group 0.000 description 1
- 229940060205 adagen Drugs 0.000 description 1
- 229960000643 adenine Drugs 0.000 description 1
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 1
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 1
- 150000008431 aliphatic amides Chemical class 0.000 description 1
- 230000003698 anagen phase Effects 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000003435 aroyl group Chemical group 0.000 description 1
- 239000012131 assay buffer Substances 0.000 description 1
- 208000037979 autoimmune inflammatory disease Diseases 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 229940021459 betaseron Drugs 0.000 description 1
- 230000000975 bioactive effect Effects 0.000 description 1
- 238000004166 bioassay Methods 0.000 description 1
- 239000013060 biological fluid Substances 0.000 description 1
- 159000000007 calcium salts Chemical class 0.000 description 1
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 1
- 125000001589 carboacyl group Chemical group 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- VDQQXEISLMTGAB-UHFFFAOYSA-N chloramine T Chemical compound [Na+].CC1=CC=C(S(=O)(=O)[N-]Cl)C=C1 VDQQXEISLMTGAB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000011097 chromatography purification Methods 0.000 description 1
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 239000008121 dextrose Substances 0.000 description 1
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 1
- 238000002224 dissection Methods 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 1
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 1
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 1
- 230000024924 glomerular filtration Effects 0.000 description 1
- JFCQEDHGNNZCLN-UHFFFAOYSA-N glutaric acid Chemical compound OC(=O)CCCC(O)=O JFCQEDHGNNZCLN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 1
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 102000051179 human NCKIPSD Human genes 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 229920001477 hydrophilic polymer Polymers 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 1
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 238000010255 intramuscular injection Methods 0.000 description 1
- 238000010253 intravenous injection Methods 0.000 description 1
- 229910052740 iodine Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011630 iodine Substances 0.000 description 1
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 206010025135 lupus erythematosus Diseases 0.000 description 1
- 125000003588 lysine group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 150000007522 mineralic acids Chemical class 0.000 description 1
- 108091005573 modified proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000035118 modified proteins Human genes 0.000 description 1
- 201000006417 multiple sclerosis Diseases 0.000 description 1
- OHDXDNUPVVYWOV-UHFFFAOYSA-N n-methyl-1-(2-naphthalen-1-ylsulfanylphenyl)methanamine Chemical compound CNCC1=CC=CC=C1SC1=CC=CC2=CC=CC=C12 OHDXDNUPVVYWOV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000000822 natural killer cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 1
- 150000007524 organic acids Chemical class 0.000 description 1
- 235000005985 organic acids Nutrition 0.000 description 1
- 150000007530 organic bases Chemical class 0.000 description 1
- 229940055729 papain Drugs 0.000 description 1
- 235000019834 papain Nutrition 0.000 description 1
- 238000005192 partition Methods 0.000 description 1
- 108010001564 pegaspargase Proteins 0.000 description 1
- WXZMFSXDPGVJKK-UHFFFAOYSA-N pentaerythritol Chemical compound OCC(CO)(CO)CO WXZMFSXDPGVJKK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000825 pharmaceutical preparation Substances 0.000 description 1
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 1
- 125000002467 phosphate group Chemical group [H]OP(=O)(O[H])O[*] 0.000 description 1
- 230000000704 physical effect Effects 0.000 description 1
- 229920000233 poly(alkylene oxides) Polymers 0.000 description 1
- 229920000747 poly(lactic acid) Polymers 0.000 description 1
- 229920001606 poly(lactic acid-co-glycolic acid) Polymers 0.000 description 1
- 229920005606 polypropylene copolymer Polymers 0.000 description 1
- 239000011591 potassium Substances 0.000 description 1
- 229910052700 potassium Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 238000009256 replacement therapy Methods 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 238000004007 reversed phase HPLC Methods 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 206010039073 rheumatoid arthritis Diseases 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 230000036303 septic shock Effects 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 description 1
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-L succinate(2-) Chemical compound [O-]C(=O)CCC([O-])=O KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 1
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 238000004809 thin layer chromatography Methods 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 1
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 1
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 1
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
- A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
- A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
- A61K47/60—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes the organic macromolecular compound being a polyoxyalkylene oligomer, polymer or dendrimer, e.g. PEG, PPG, PEO or polyglycerol
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
- A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/04—Antibacterial agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
- A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
- A61P31/18—Antivirals for RNA viruses for HIV
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
- A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P39/00—General protective or antinoxious agents
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Public Health (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Immunology (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Oncology (AREA)
- Virology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Rheumatology (AREA)
- Pain & Pain Management (AREA)
- Neurosurgery (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- AIDS & HIV (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Neurology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
- Physical Education & Sports Medicine (AREA)
- Transplantation (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
A találmány poliol-interferon-b konjugátumokra vonatkozik, amelyekbenegy poliolmaradék kovalensen kapcsolódik a humán interferon-b Cys17-hez. A fenti poliol-interferon-b konjugátumot úgy állítják elő, hogyaz interferon-b-tiol-reaktív poliollal reagáltatva egy poliol-maradékot kötnek helyspecifikusan és kovalensen a humán interferon-bCys17-hez, majd a kapott konjugátumot kinyerik. A fenti eljárástpolietilénglikol (PEG) maradékok kapcsolása esetén úgy végzik, hogy apolipeptidet először egy kis móltömegű heterobifunkciós vagyhomobifunkciós PEG-maradékkal reagáltatják, majd a polipeptidhezkötött kis móltömegű PEG-maradékot egy monofunkciós vagy bifunkciósPEG-maradékkal reagáltatva ez utóbbi monofunkciós vagy bifunkciós PEG-maradékot a kis móltömegű PEG-maradék szabad végéhez kötve alakítjákki a PEG-polipeptid konjugátumot. A PEG-polipeptid konjugátumokgyógyszerként alkalmazhatók. Ó
Description
KÖZZÉTÉTELI
PÉLDÁNY yrUZ
POLIOL-IFN-BÉTA KONJUGÁTUMOK
A találmány poliol-IFN-béta konjugátumokra vonatkozik, ahol a poliol egység kovalensen kötődik a Cys17-hez. A találmány tárgya továbbá eljárás ezek hely-specifikus előállítására, valamint ezek alkalmazására bakteriális fertőzések, virális fertőzések, autoimmun betegségek és gyulladásos betegségek terápiájában, prognózisában vagy diagnózisában. A találmány tárgyát képezi továbbá eljárás két vagy több PEG-maradék polipeptidhez történő lépésenként! kapcsolására.
A humán fibroblaszt interferon (IFN-β) antivirális aktivitással rendelkezik, és képes a daganatos sejtek elleni természetes gyilkos sejteket is stimulálni. Ez egy körülbelül 20000 Da méretű polipeptid, amelyet vírusok és kettős-szálú RNS-ek indukálnak. A fibroblaszt interferont kódoló gén nukleotidszekvenciájából - amelyet rekombináns DNS módszerrel klónoztak Derynk és munkatársai [Nature 285, 542-547 (1980)] - következtettek a protein teljes aminosavszekvenciájára. A protein 166 aminosav hosszúságú.
Shepard és munkatársai [Nature 294, 563-565 (1981)] ismertettek egy mutációt a 842. bázisnál (Cys -> Tyr a 141-es helyzetben), amely az antivirális aktivitás megszüntetéséhez vezetett, és leírtak egy, a 1119-1121. nukleotidok delécióját tartalmazó variáns kiónt.
93177-12247A Sí
- 2 Mark és munkatársai [Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 81(18). 5662-5666 (1984)] egy mesterséges mutációt inszertáltak a 469. bázis (T) adeninnal (A) történő helyettesítésével, amely 17-es helyzetben egy Cys -> Ser aminosavcserét okozott. Az így kapott IFN-β a leírás szerint ugyanolyan aktív, mint az „natív” IFN-β, és stabil hosszútávú tárolás során (-70 °C-on).
A hidrofil polimer polietilénglikol (PEG), más néven poli(etilén-oxid) (PEO) kovalens kapcsolása különféle molekulákhoz fontos alkalmazásokkal bír a biotechnológiában és gyógyászatban. Leggyakoribb formájában a PEG egy lineáris polimer, amely mindkét terminálisán hidroxilcsoportokat tartalmaz:
HO-CH2-CH2O(CH2CH2O)nCH2CH2-OH.
Ez a képlet rövidebben mint HO-PEG-OH jelölhető, ahol -PEG- jelenti a polimer vázat a terminális csoportok nélkül, azaz
-PEG- jelentése -CH2CH2O(CH2CH2O)nCH2CH2-.
A PEG-et gyakran metoxi-PEG-OH-ként (m-PEG) alkalmazzák, amelyben az egyik terminusz egy viszonylag inert metoxicsoport, míg a másik terminusz egy hidroxilcsoport, amely kémiai módosításoknak vethető alá:
CH3O-(CH2CH2O)n-CH2CH2-OH.
Gyakran használják az elágazó PEG-eket is. Az elágazó PEG-eket az R(-PEG-OH)m képlettel ábrázolhatjuk, amelyben R
- 3 egy centrális mag maradékot, például pentaeritritet vagy glicerint jelent, és m jelenti az elágazó „karok” számát. Az elágazó karok száma (m) háromtól százig, vagy még nagyobb értékig változhat. A hidroxilcsoportokat kémiai módosításnak lehet alávetni.
Egy másik elágazó forma, például a WO 96/21469 számon publikált szabadalmi leírásban ismertetett, egyetlen terminuszt tartalmaz, amely a kémiai módosítás helye. Az ilyen típusú PEG a (CH3O-PEG-)pR-X képlettel ábrázolható, ahol p = 2 vagy 3, és R jelentése központi mag, például lizin vagy glicerin, és X jelentése funkciós csoport, például karboxilcsoport, amelyet kémiailag aktiválni lehet. Egy másik elágazó forma, a „függő PEG” a reakcióképes csoportokat, például karboxilcsoportot a PEG váza mentén tartalmazza a PEG-láncok vége helyett.
A PEG fenti formáin kívül olyan polimer is előállítható, amely a vázban gyenge vagy lebontható kötéseket tartalmaz. Például Harris az US 06/026716 számú szabadalmi bejelentésben bemutatta, hogy a polimer váz észterkötéseket tartalmazó PEG is előállítható, amelyek hidrolizálhatók. A hidrolízis a polimer alacsonyabb móltömegű fragmensekre történő hasadását eredményezi, az alábbi reakcióvázlat szerint:
-PEG-CO2-PEG- + H2O -> -PEG-CO2H + HO-PEG-.
A találmány értelmében a polietilénglikol vagy PEG kifejezés magában foglalja az összes fent említett származékokat is.
Az etilén-oxid és propilén-oxid polimerjei kémiailag nagyon hasonlítanak a PEG-hez, és ezeket PEG helyett számos al- 4 kalmazásban lehet használni. Ezek a
HO-CH2CHRO(CH2CHRO)nCH2CHR-OH általános képlettel ábrázolhatok, ahol R jelentése H vagy CH3.
A PEG egy nagyon hasznos polimer, amely nagy vízoldhatósággal, valamint számos szerves oldószerben is nagy oldhatósággal rendelkezik. A PEG ezenkívül nem toxikus és nem immunogén. Amikor a PEG-et kémiailag kapcsolják egy vízoldhatatlan vegyülethez (PEG-ilezés), a kapott konjugátum általában vízoldható, valamint számos szerves oldószerben is oldódik.
A PEG-protein konjugátumokat jelenleg protein-helyettesítéses terápiában alkalmazzák, valamint egyéb gyógyászati alkalmazásai is vannak. Például a PEG-ilezett adenozin-dezaminázt (ADAGÉN®) súlyos, kombinált immunhiány betegség (SCIDS) kezelésére alkalmazzák, a PEG-ilezett L-aszparaginázt (ONCAPSPAR®) akut limfoblasztos leukémia (ALL) kezelésére alkalmazzák, és a PEG-ilezett interferon-α, amely a vizsgálatok harmadik fázisában van, hepatitis C kezelésére alkalmazható.
A klinikai hatékonysággal rendelkező PEG-protein konjugátumok általános áttekintését lásd N. L. Burnham munkájában [Am. J. Hosp. Pharm. 15, 210-218 (1994)].
Számos eljárást kifejlesztettek a proteinek PEG-ilezésére. A PEG kapcsolását a proteinen levő reakcióképes csoportokhoz rendszerint elektrofil módon aktivált PEG-származékok alkalmazásával végzik. A PEG kapcsolása a lizin-maradékok a- és ε-amino-csoportjaihoz és az N-terminálishoz termékek elegyéből álló konjugátumot eredményez.
- 5 Általában az ilyen konjugátumok egy proteinmolekulához kapcsolt több PEG molekula populációjából állnak (PEGmerek), a PEG molekulák száma O-tól a proteinben lévő aminocsoportok számáig változik. Az egyszeresen módosítottprotein molekulában a PEG egység számos különböző amino-helyhez kapcsolódhat.
A nem-specifikus PEG-ilezés fenti típusa több konjugátumot eredményezett, amelyek szinte inaktívak voltak. Az aktivitás csökkenése rendszerint a protein aktív kötő doménjének leárnyékolásából eredt, ez a helyzet sok citokin és antitest esetén. Például Katre és munkatársai (US 4766106 és US 4917888 számú szabadalmi leírások) ismertetik az IFN-B és IL-2 PEG-ilezését metoxi-polietilénglikolil-N-szukcinimidil-glutarát és metoxi-polietilénglikolil-N-szukcinimidil-szukcinát nagy feleslegével. Mindkét proteint mikroba gazdasejtekben állították elő, amelyek lehetővé tették a szabad cisztein szerinné történő helyspecifikus mutációját. A mutáció az IFN-B mikrobás expressziójában szükséges volt a protein hajtogatott szerkezetének kialakulásához. Közelebbről, a fenti kísérletekben alkalmazott IFN-B a Betaseron® néven forgalmazott termék, amelyben a Cys17 maradék szerinnel van helyettesítve. Ezenkívül a glikozilezés hiánya csökkentette az oldhatóságot vizes oldatban. A nem—specifikus PEG-ilezés fokozott oldhatóságot eredményezett, de fő problémaként megmaradt az aktivitás és hozam csökkent szintje.
Az EP 593868 számú szabadalmi leírásban (amelynek címe PEG-interferon konjugátumok) PEG-IFN-oc konjugátumok előállítását ismertetik. Azonban a PEG-ilezési reakció nem hely-specifikus, ezért a PEG-IFN-α konjugátumok helyzeti izomer
- 6 jeinek elegyét kapták [lásd még Monkarsh és munkatársai, ACS Symp. Ser. 680, 207-216 (1997)].
Kinstler és munkatársai (EP-A 675201) bemutatták a megakariocita növekedési és fejlődés faktor (MGDF) N-terminális maradékának szelektív módosítását mPEG-propionaldehiddel. Ezáltal reprodukálható PEG-ilezést és farmakokinetikai tulajdonságokat kaptak sarzsról-sarzsra. Gilbert és munkatársai (US 5711944) bizonyították, hogy a PEG-ilezett IFN-α optimális aktivitással állítható elő. Ebben az esetben fáradságos tisztítási lépés kellett az optimális konjugátum előállításához.
A citokinek többsége, és egyéb proteinek sem rendelkeznek specifikus PEG-kapcsolódási hellyel, és a fenti példáktól eltekintve nagyon valószínű, hogy a PEG-ilezési reakcióban képződött izomerek némelyike teljesen vagy részlegesen inaktív lesz, ezáltal a végtermék elegy aktivitása csökken.
Tehát a hely-specifikus monoPEG-ilezés nagyon kívánatos lenne az ilyen protein konjugátumok előállításában.
Woghiren és munkatársai [Bioconjugate Chem. 4(5), 314-318 (1993)] előállítottak egy tiol-szelektív PEG-származékot egy ilyen hely-specifikus PEG-ilezéshez. Egy ortopiridil-diszulfid reakcióképes csoport formájában lévő stabil, tiol-védett PEG-származékról kimutatták, hogy specifikusan kötődik a papain proteinben lévő szabad ciszteinhez. A papain és PEG a között így kialakult diszulfid kötés enyhe redukciós körülmények között hasítható volt, ezáltal natív protein keletkezett.
A leírásban említett dokumentumokról nem állítjuk, hogy a technika állásának ideillő részét képezik, vagy az igénypontok szabadalmazhatóságát tekintve figyelembe veendő anyag. Az
- 7 idézett dokumentumok tartalmára vagy adataira való hivatkozás pusztán információs jellegű, amely a bejelentés benyújtásának időpontjában rendelkezésünkre állt, és ezek helyességéért nem szavatolunk.
A találmány poliol-IFN-B konjugátumokra, és főleg PEG-IFN-B konjugátumokra vonatkozik, amelyekben a poliol egység kovalensen kötődik a Cys17-hez. A specifikus konjugációt azáltal érjük el, hogy egy tiol-reaktív poliol reagenst reagáltatunk az IFN-B Cys17 maradékával. Az ilyen konjugátumok várhatólag fokozott hatékonyságot mutatnak in vivo. Célunk semleges pH-η fokozott oldhatóság, fokozott stabilitás (csökkent aggregáció), csökkent immunogén jelleg és a natív IFN-B aktivitásának megőrzése volt. Az ilyen konjugáció eredménye a kívánt hatás eléréséhez szükséges dózis nagyságának csökkenése a gyógyászati készítmény forma egyszerűsödése és stabilizálása, és a hosszútávú hatékonyság valószínű növekedése lehet.
A találmány tárgyát képezi továbbá eljárás PEG-maradékok lépésenként! sorozatos kapcsolása egy polipeptidhez.
A leírás ábráit röviden az alábbiakban ismertetjük.
Az 1. ábrán látható a PEG-IFN-B konjugátum kapilláris elektroforézis (CE) görbéje tisztítás előtt.
A 2A-2C ábrán látható a PEG-IFN-B konjugátum tisztítása méret szerinti kizárásos kromatográfiával (Superose 12): 2A ábra - első átvezetés; 2B ábra - második átvezetés; 2C ábra - harmadik átvezetés.
A 3. ábrán látható a harmadik kromatográfiás tisztítással kapott tisztított PEG-IFN-B konjugátum SDS-PAGE kromatogramja. 1. és 4. sáv: protein móltömeg standardek, 2. sáv: „na- 8 tív” IFN-β, 3. sáv: PEG-IFN-β konjugátum.
A 4. ábrán látható a tisztított PEG-IFN-β konjugátum kapilláris elektroforézis (CE) görbéje, ahol az IFN-β mPEG-OPSS5kval van PEG-ilezve.
Az 5. ábrán látható a tisztított PEG-INF-β konjugátum MALDI MS spektruma.
A 6. ábrán látható egy összehasonlítás a natív IFN-β és a PEG-IFN-β konjugátum antivirális aktivitása között. A WISH sejteket az IFN-β minták megadott koncentrációinak jelenlétében inkubáltuk 24 órán keresztül a vezikuláris stomatitis vírus citopatikus dózisával történő provokálás előtt. A citopatikus hatást további 48 óra elteltével határoztuk meg MTT konverzióval.
A 7. ábrán látható az IFN-β és a PEG-IFN kötődési profilja Daudi sejtekben.
A 8. ábrán látható az IFN-β és PEG-IFN farmakokinetikai profilja, egérnek történő intravénás adagolás után. A pontozott vonalak jelzik az LOQ vizsgálatot az egyes standard görbékhez.
A 9. ábrán látható az IFN-β és PEG-IFN farmakokinetikai profilja, egérnek történő szubkután adagolást követően. A pontozott vonalak jelzik az LOQ vizsgálatot az egyes standard görbékhez.
A találmányt részletesen az alábbiakban ismertetjük.
A találmány azon a felismerésen alapul, hogy egy poliolmaradék, közelebbről egy PEG-maradék kapcsolása a humán IFN-β Cys17 maradékához előre nem várt módon fokozta (vagy legalábbis nem változtatta meg, vagy nem csökkentette) az IFN-β biológiai aktivitását a natív humán interferon-B-hoz viszonyítva. Tehát az IFN-β a Cys17 maradékhoz kapcsolt políol-ma- 9 radékkal nemcsak azonos vagy fokozott IFN-β biológiai aktivitást mutat, hanem ez a poliol-IFN-β konjugátum a polil-maradék által biztosított kívánatos tulajdonságokkal, például fokozott oldhatósággal rendelkezik.
IFN-β alatt a leírásban humán fibroblaszt interferont értünk, amely biológiai folyadékokból történő izolálással vagy prokariota vagy eukarióta gazdasejtekből DNS rekombináns módszerekkel állítható elő, valamint ennek sóit, funkcionális származékait, prekurzorait és aktív frakcióit, feltéve, hogy ezek tartalmazzák a természetben előforduló forma 17-es helyzetében lévő cisztein-maradékot.
A találmány szerinti poliol-IFN-β konjugátum poliol-maradéka bármely vízoldható, egyenes vagy elágazó szénláncú mono- vagy bifunkciós poli(alkilén-oxid) lehet. Rendszerint a poliol egy polialkilénglikol, például polietilénglikol (PEG). Azonban szakember számára nyilvánvaló, hogy egyéb poliolok, például polipropilénglikol és polietilénglikol és polipropilénglikol kopolimerjei is alkalmazhatók a találmány értelmében.
A leírás PEG-maradék alatt például - a korlátozás szándéka nélkül - egyenes vagy elágazó szénláncú PEG, metoxi-PEG, hidrolitikusan vagy enzimatikusan hasítható PEG, függő PEG, dendrimer PEG, PEG és egy vagy több poliol kopolimerjei, és PEG és PLGA [poli(tejsav)/glikolsav] kopolimerjei értendők.
Só alatt a leírásban a vegyületnek mind a karboxilcsoportokkal előállítható sóit, mind az aminocsoportokkal előállítható sóit értjük, amelyek ismert módon állíthatók elő. A karboxilcsoportok sói közé tartoznak a szervetlen sók, például nátrium-, kálium-, kalciumsók, és a szerves bázisokkal képzett sók, pél- 10 dául egy aminnal, így például trietanol-aminnal, argininnel vagy lizinnel alkotott sók. Az aminocsoportok sói közé tartoznak például a szervetlen savakkal, így például sósavval, és a szerves savakkal, például ecetsavval képzett sók.
Funkcionális származékok alatt a leírásban az aminosavak oldalláncában lévő funkciós csoportokból, vagy a terminális Nvagy C-csoportokból ismert módon előállított származékokat értjük, ha azok gyógyászatilag elfogadhatók, azaz nem rontják le a protein aktivitását, vagy ezektől nem lesz toxikus az ezeket tartalmazó gyógyászati készítmény. Ilyen származékok közé tartoznak például a karboxilcsoportok észterei vagy alifás amidjai, és a szabad aminocsoportok N-acil-származékai, vagy a szabad hidroxilcsoportok O-acil-származékai, amelyek acilcsoportokkal, például alkanoil- vagy aroilcsoportokkal állíthatók elő.
Prekurzor alatt olyan vegyületeket értünk, amelyek az emberi vagy állati testben IFN-B-vá alakulnak át.
A protein aktív frakciói alatt a találmány értelmében a vegyület polipeptid láncának bármely fragmentumát vagy prekurzorát értjük, önmagukban, vagy a kapcsolódó hozzájuk kötött molekulákkal vagy maradékokkal, például cukrok vagy foszfátok maradékaival kombinációban, vagy a peptidmolekula aggregátumait, ha ezek a fragmentumok vagy prekurzorok gyógyszerként az IFN-β aktivitásával rendelkeznek.
A találmány szerinti konjugátumokat bármely ismert eljárással előállíthatjuk. A találmány egyik kiviteli módja szerint az IFN-B-t PEG-ilező szerrel reagáltatjuk megfelelő oldószerben, és a kívánt konjugátumot izoláljuk és tisztítjuk, például egy vagy több kromatográfiás módszer alkalmazásával.
11 - <·: Ί 7:<::
«· · ·» · β·
Kromatográfiás módszer alatt a leírásban bármely olyan technikát értünk, amelyet egy elegy komponenseinek szétválasztására lehet alkalmazni azáltal, hogy az elegyet egy hordozóra (stacioner fázis) visszük fel, amelyen egy oldószer (mobil fázis) folyik keresztül. A kromatográfiás módszerek elválasztási elvei a mobil bázis és a stacioner fázis eltérő fizikai tulajdonságain alapulnak.
A kromatográfiás eljárások típusai közelebbről szakirodalomból jól ismertek, ilyenek például a folyadék-, nagynyomású folyadék-, ioncserés, adszorpciós, affinitás!, megoszlásos, hidrofób, fordított fázisú, gélszűréses, ultraszűréses vagy vékonyréteg-kromatográfiás eljárások.
Tiol-reaktív PEG-ilező szer alatt a leírásban bármely olyan PEG-származékot értünk, amely a cisztein-maradék tiolcsoportjával képes reagálni. Ez lehet például egy funkciós csoportot, például ortopiridil-diszulfidot, vinilszulfont, maleimidet, jódacetimidet vagy egyebet tartalmazó PEG. A találmány egyik előnyös kiviteli módja szerint a tiol-reaktív PEG-ilező szer a PEG ortopiridil-diszulfid (OPSS) származéka.
A PEG-ilező szert vagy mono-metoxilezett formájában alkalmazzuk, amikor csak az egyik vég használható fel a konjugáláshoz, vagy bifunkciós formában, amikor mindkét vég felhasználható a konjugáláshoz, például olyan konjugátum előállítására, amelyben két IFN-B kapcsolódik kovalensen ugyanazon PEG-maradékhoz. A PEG-ilező szer móltömege előnyösen 500 és 100000 közötti.
A találmány szerinti konjugátumok előállítását tipikusan az alábbi eljárással végezzük.
- 12 Ν-κ ρΗ<7 Protein-SH + m PEG-S~S\/------*- mPEG-S-S-Protein ^^^^^B-mericaptoetanol
Protein-S-H + mPEG-S-H + HOCH2CH2-S-S-CH2CH2OH
A fenti reakcióvázlat második sora a PEG-protein kötés hasítását mutatja be. Az mPEG-OPSS-származékok erősen szelektívek szabad szulfidrilcsoportokra, és gyorsan reagálnak savas pH körülmények között, ahol az IFN-Β stabil. A nagy szelektivitást a konjugátum natív IFN-Β formává és PEG-gé történő redukciójával bizonyíthatjuk.
A protein és a PEG-maradékok között képződött diszulfid-kötésről kimutattuk, hogy a keringésben stabilak, azonban a sejtkörnyezetbe történő bejutás után redukálhatok. Ezért várható, hogy az a konjugátum, amely nem jut be a sejtbe, stabil marad a keringésben, amíg onnan ki nem tisztul. Megjegyezzük, hogy a fenti reakció hely-specifikus, mivel a humán IFN-Β természetes formájában a 31-es és 141-es helyzetben jelenlévő másik két cisztein-maradék nem reagál a tiol-reaktív PEG-ilező szerrrel, ugyanis ezek diszulfid-hidat alkotnak.
A találmány tárgya továbbá eljárás két vagy több PEG-maradék polipeptidhez történő lépésenként! kapcsolására. Az eljárás azon a felismerésen alapul, hogy egy kis móltömegű aktivált PEG tökéletesebben reagál a proteinen lévő sztérikusan gátolt reakcióhellyel, mint egy nagy móltömegű aktivált PEG. A terápiás hatású drága proteinek PEG-módosításának költségkímélő
- 13 nek kell lennie annak érdekében, hogy a PEG konjugátum előállítása gyakorlatban megvalósítható legyen. Ezenkívül a PEG-protein konjugátum glomeruláris kiszűrődésének csökkentése és farmakológiai tulajdonságainak optimalizálása érdekében a konjugátumnak a 70 kDa móltömegű proteinnel ekvivalens effektív mérettel kell rendelkeznie. Ez azt jelenti, hogy egy olyan hely-specifikus módosításhoz, ahol egyetlen PEG-et kapcsolunk, a PEG-származéknak előnyösen 20 kDa-nál nagyobb móltömeggel kell rendelkeznie. Ha a módosítás helye szférikusán zsúfolt, a nagyméretű PEG-maradékon lévő reakcióképes csoport nehezen fér hozzá a módosítás helyéhez, ezáltal kis hozamokat kapunk. A polipeptid PEG-ilezésére szolgáló találmány szerinti előnyös eljárással úgy növeljük a hely-specifikus PEG-ilezés hozamát, hogy először egy kisméretű hetero- vagy homobifunkciós PEG-maradékot kapcsolunk, amely - viszonylag kisebb mérete következtében - képes reagálni a szférikusán zsúfolt helyekkel. Ezután a kisméretű PEG-hez egy nagy móltömegű PEG-származékot kapcsolva nagy hozammal kapjuk a kívánt PEG-ilezett proteint.
A találmány szerinti eljárás tehát egy vagy több maradék polipeptidhez történő sorozatos, lépésenként! kapcsolására alkalmas oly módon, hogy először egy kis móltömegű heterobifunkciós vagy homobifunkciós PEG-maradékot kapcsolunk a polipeptidhez, majd a polipeptidhez kapcsolt kis móltömegű PEG-maradék szabad végéhez ezután monofunkciós vagy bifunkciós PEG-maradékot kapcsolunk. Két vagy több PEG-maradék polipeptidhez - amely előnyösen az IFN-β, ahol a PEG kapcsolódásának előnyös helye egy szférikusán zsúfolt helyen loka
- 14 lizálódó Cys17 - történő sorozatos lépésenként! kapcsolása után a PEG-polipeptid konjugátumot egy vagy több tisztítási módszerrel, például ioncserés kromatográfiával, méret szerinti kizárásos kromatográfiával, hidrofób kölcsönhatáson alapuló kromatográfiával, affinitás! kromatográfiával és fordított fázisú kromatográfiával tisztíthatjuk.
A kis móltömegű PEG-maradék képlete
W-CH2CH2O(CH2CH2O)nCH2CH2-X, ahol W és X jelentése olyan csoport, amelyek egymástól függetlenül amin, szulfidril, karboxil vagy hidroxil funkciós csoportokkal reagálva a kis móltömegű PEG-maradékot a polipeptidhez kapcsolják. W és X jelentését előnyösen egymástól függetlenül ortopiridil-diszulfid, maleimidek, vinil-szulfonok, jódacetamidok, aminok, tiolok, karbonsavak, aktív észterek, benzotriazol-karbonátok, p-nitrofenol-karbonátok, izocianátok és biotin közül választjuk. A kis móltömegű PEG-maradék móltömege előnyösen körülbelül 100 és 5000 Da között lehet.
A polipeptidhez kapcsolt, kis móltömegű PEG szabad végéhez kapcsolandó monofunkciós vagy bifunkciós PEG-maradék móltömege előnyösen körülbelül 100 Da és 200 kDa között van, és ez előnyösen egy metoxi-PEG, elágazó láncú PEG, hidrolitikusan vagy enzimatikusan hasítható PEG, függő PEG vagy dendrimer PEG. A monofunkciós vagy bifunkciós PEG általános képlete
Y-CH2CH2O(CH2CH2O)mCH2CH2-Z,
- 15 - ·::.· ·· • · · » • · · · · « w ahol Y a polipeptidhez kapcsolódott kis móltömegü PEG-maradék szabad végén lévő terminális csoporttal reagálni képes csoportot jelent, és Z jelentése -OCH3, vagy egy olyan csoport, amely X-szel reagálni képes, ezáltal bifunkciós konjugátumot képez.
Az egy vagy több PEG-maradék lépésenként! kapcsolására szolgáló fenti eljárással előállított PEG-polipeptid konjugátum hatóanyagként olyan gyógyszerek vagy gyógyászati készítmények előállítására alkalmazható, amelyek a fenti polipeptiddel hatékonyan kezelhető betegségek vagy rendellenességek kezelésére alkalmazhatók.
A találmány további tárgyát alapvetően tiszta formában lévő konjugátumok képezik, amelyek hatóanyagként alkalmazhatók gyógyászati készítményekben bakteriális és virális fertőzések, valamint autoimmun, gyulladásos betegségek és tumorok kezelésére, diagnózisára és prgnózisára. Az ilyen gyógyászati készítmények a találmány további tárgyát jelentik.
A fenti betegségekre a korlátozás szándéka nélkül említjük az alábbiakat: szeptikus sokk, AIDS, reumás arthritis, lupus erythematosus és szklerózis multiplex.
A találmány további előnyei és kiviteli alakjai az alábbi leírásból nyilvánvalóak.
A találmány értelmében a találmány szerinti konjugátumok farmakológiailag hatékony mennyiségei olyan egyedeknek adagolhatok, amelyekben fennáll a veszélye a fent említett betegségek kifejlődésének, vagy olyan egyedeknek, amelyekben a fenti betegségek már megmutatkoztak.
Az adagolást a hatóanyaggal összeférhető bármely adago- 16 lási módszerrel elvégezhetjük. Előnyös a parenterális adagolás, például a szubkután, intramuszkuláris vagy intravénás injekció. A beadandó hatóanyag dózisa a gyógyászati előírásoktól függően változik, a beteg életkora, testtömege és egyedi válasza alapján.
A dózis 10 pg és 1 mg között változhat naponta egy átlagos, 75 kg testtömegű beteg esetén, az előnyös napi dózis 20 pg és 200 pg között lehet.
A parenterális adagolásra alkalmas gyógyászati készítményt hatóanyagot és megfelelő vivőanyagot tartalmazó injektálható formában állíthatjuk elő. Vivőanyagként parenterális adagolásra jól ismert anyagok alkalmazhatók, például víz, sóoldat, Ringer-oldat és/vagy dextróz. A vivőanyag tartalmazhat kis mennyiségben segédanyagokat is, a gyógyászati készítmény stabilitásának és izotonicitásának biztosításához. Az oldatok előállítását gyógyszerkészítésben szokásosan alkalmazott módszerek szerint végezhetjük.
A találmányt közelebbről specifikus kiviteli alakokkal ismertetjük, azonban magától értetődően a szakember számára nyilvánvaló módosítások és helyettesítések szintén a találmány tárgykörébe tartoznak.
A találmányt közelebbről - a korlátozás szándéka nélkül az alábbi példákkal ismertetjük.
1. példa
PEG-IFN-B konjugátum előállítása
IFN-B módosítása mPEGsK-OPSS-sel
A PEG-IFN-B konjugátum előállítására rekombináns humán IFN-B-t alkalmaztunk, amely 50 mmol/1 nátrium-acetát puffer
- 17 ben (pH 3,6) 0,37 mg/ml koncentrációban stabil. Körülbelül 1,0 ml 6 mol/1 koncentrációjú karbamidot adtunk 2 ml 0,37 mg/ml koncentrációjú IFN-B-oldathoz (0,74 mg, 3,7 x IO’8 mol). 1 mól IFN-B-hoz 50 mól moláris feleslegben adtunk mPEG5K-OPSS-t, és a két anyagot polipropilén csőben reagáltattuk 37 °C-on 2 órán keresztül, vagy 50 °C-on 1 órán keresztül. A reakcióelegyet kapilláris elektroforézissel (CE) analizáltuk, hogy meghatározzuk a tisztítás előtt a PEG-ilezési reakcióval keletkezett PEG-IFN-B konjugátum mennyiségét (1. ábra). A fenti reakció tipikus hozama 50% PEG-IFN-B. A reakcióelegyből a reakciótermékeket 0,22 mm-es fecskendős szűrővel elválasztottuk, és a szűrt oldatot ezután méret szerinti kizárásos oszlopra (Superose 12 vagy Superdex 75, Pharmacia) vittük fel, és 50 mmol/1 nátrium-foszfát, 150 mmol/1 NaCl (pH 7,0) pufferrel eluáltuk. A 2A ábrán látható a PEG-IFN-B konjugátum Superose 12 méret szerinti kizárásos kromatográfiás oszlopon történő tisztításával kapott elúciós profil. A csúcsokat összegyűjtöttük, és SDS-PAGE eljárással analizáltuk (3. ábra). A PEG-IFN-B konjugátumot tartalmazó frakciókat egyesítettük, és a koncentrátumot ugyanazon méret szerinti kizárásos oszlopra vittük fel a PEG-IFN-B konjugátum további tisztítása céljából, a „natív” IFN-Β csúcs közelsége miatt (2B ábra). Ezt az eljárást megismételtük (harmadik felvitel), hogy a terméket tiszta formában nyerjük (2C ábra). A 4. és 5. ábrán látható a tisztított PEG-IFN-B konjugátum kapilláris elektroforézis görbéje, és MALDI MS spektruma.
IFN-Β módosítása mPEG^oK-OPSS-sel
Rekombináns humán IFN-B-ból stabil, 0,36 mg/ml oldatot állítottuk elő 50 mmol/1 nátrium-acetát pufferben (pH 3,6).
- 18 3 ml 0,36 mg/ml koncentrációjú IFN-β oldathoz (1,08 mg, 4,9 x 10'8 mól) körülbelül 36 mg mPEG3oK-OPSS-t adtunk 3 ml ionmentes vízben, és a két reaktánst polipropilén csőben 50 °C-on 2 órán keresztül reagáltattuk. A reakcióelegyet kapilláris elektroforézissel analizáltuk a módosítás mértékének meghatározására. A tipikus hozam ebben a reakcióban <30%. Az oldatot ezután méret szerinti kizárásos oszlopra (Superose 12, Pharmacia) vittük fel, és 50 mmol/1 nátrium-foszfát, 150 mmol/1 NaCl (pH 7,0) pufferrel eluáltuk. A csúcsokat összegyűjtöttük, és SDS-PAGE módszerrel analizáltuk azok tartalmát.
2. példa
PEG-IFN-β konjugátum biológiai aktivitása
A PEG-ilezés hatását a humán rekombináns IFN-β antivirális aktivitására úgy határoztuk meg, hogy humán WISH amnionsejteket vagy frissen előállított IFN-B-val (ugyanaz a sarzs, mint amelyet a PEG-ilezésre alkalmaztunk), vagy PEG-IFN-β konjugátummal előinkubáltunk. Az IFN-B-mediálta antivirális aktivitást - amelyet WISH-VSV citopátiás vizsgálattal mértünk - a Novick és munkatársai [J. Immunoi. 129, 2244-2247 (1982)] eljárása alapján kifejlesztett antivirális WISH biovizsgálattal határoztuk meg. A WISH vizsgálatban az alábbi anyagokat alkalmaztuk:
WISH sejtek (ATCC CCL 25), hólyagos szájgyulladás vírus törzstenyészetek (ATCC V-520-001-522), amelyeket -70 °C-on tároltunk, humán rekombináns IFN-β (InterPharm Laboratories LTD, 32075 típus, 205035 számú sarzs), 82 x 106 NE (nemzetközi egység)/ml, specifikus aktivitás: 222 x 106 NE/mg,
- 19 PEG-IFN-β konjugátum, amelyet az 1. példában leírtak szerint állítottunk elő, és PBS-ben (pH 7,4) tartottunk,
WISH tenyésztő közeg (nagy glükóztartalmú MÉM, Earl-féle sókkal + 10% FBS + 0,1% L-glutamin + 100 egység/ml penicillin vagy 100 pg/ml streptomicin),
WISH vizsgálati közeg (nagy glükóztartalmú MÉM, Earl-féle sókkal + 5% FBS + 1,0% L-glutamin + 100 egység/ml penicillin vagy 100 pg/ml streptomicin),
MTT 5 mg/ml PBS-ben, -70 °C-on tárolt.
A WISH vizsgálatot az alábbiak szerint végezzük:
Az IFN-β mintát a kiindulási koncentráció kétszeresére hígítjuk WISH vizsgálati közeggel.
Az IFN-β mintából WISH vizsgálati közeggel háromszoros hígítási sort készítünk laposaljú 96-rezervoáros lemezen, oly módon, hogy minden egyes rezervoár 50 μΐ hígított IFN-β mintát tartalmaz (néhány kontroll rezervoárba 50 μΐ WISH vizsgálati közeget mérünk csak).
A log szaporodási fázisban lévő WISH sejteket tripszin/EDTA oldattal összegyűjtjük, WISH vizsgálati közeggel mossuk, és 0,8 x 106 sejt/ml végkoncentrációra állítjuk be.
Az egyes rezervoárokba 50 μΐ WISH sejtszuszpenziót (4 x 104 sejt/rezervoár) adunk. A sejtekkel érintkeztetett IFN-β végkoncentrációja így egyszeres lesz.
5% szén-dioxidot tartalmazó, párásított inkubátorban 24 órán keresztül történő inkubálás után 50 μΐ 1:10 hígítású (WISH vizsgálati közeggel) VSV törzstenyészetet (ezt a dózist úgy határoztuk meg előzetesen, hogy a WISH sejtek 100%-át lizálja 48 órán belül) adunk az összes rezervoárba, a vírust nem tártál- 20 mazó kontroll rezervoárok kivételével (ezekbe csak azonos térfogatú vizsgálati közeget mérünk).
További 48 óra elteltével 25 μΐ MTT oldatot mérünk az összes rezervoárba, ezután a lemezeket inkubátorban 2 órán keresztül tovább inkubáljuk.
A rezervoárok tartalmát a lemez megfordításával eltávolítjuk, és 200 μΐ 100%-os etanolt mérünk a rezervoárokba. 1 óra elteltével a lemezeket 595 nm-en leolvassuk Soft max Pro software programcsomag és Spectramax spektrofotométer rendszer (Molecular Devices) alkalmazásával.
1. táblázat
PEG-ilezett és ál-PEG-ilezett IFN-béta minták antivirális aktivitása
| IFN-β minta* | EC50** |
| PEG-IFN-β konjugátum | 3,9 +/- 0,7 pg/ml |
| IFN-β | 16,4 +/- 1,0 pg/ml |
IFN-β törzskoncentrációit a mintákban aminosav-analízissel határoztuk meg ** EC50 (+/- S.D.) meghatározása Microcal Origin 4.1 software csomaggal
A 6. ábrából és az 1. táblázat adataiból látható, hogy a PEG-IFN-β konjugátumban az antivirális aktivitás szintje magasabb volt, mint az IFN-B-é a frissen előállított kiindulási sarzsban. Az a megfigyelés, hogy a PEG-IFN-β konjugátum körülbelül négyszer nagyobb bioaktivitással rendelkezik, mint a
- 21 - ·; y γ:
frissen előállított IFN-B, a PEG-IFN-B konjugátum natív IFN-B-hoz viszonyított fokozott stabilitásának következménye is lehet a WISH vizsgálati közeg hozzáadása után.
3, példa
PEG-IFN minták relatív aktivitásának vizsgálata in vitro
A PEG[30 kD]-IFN-B és PEG[2 x 20 kD]-IFN-B relatív bioaktivitását WISH módszerrel határoztuk meg a 2. példa szerinti standard protokoll alkalmazásával (2. táblázat). A három, egymástól független vizsgálatot három különböző egyén végezte különböző időkben.
2, táblázat
PEG-IFN-B relatív antivirális aktivitása
| Relatív interferon aktivitás* (három vizsgálatból) | ||||
| Minta | 1. vizsgálat | 2. vizsgálat | 3. vizsgálat | Átlag (S.D.) |
| PEG[30kD]-IFN-B | 3,2 x nagyobb | 3,1x nagyobb | 1,8 x nagyobb | 3,0 x (0,78) nagyobb |
| PEQ2x20kD}-IFN-B | 4,2 x nagyobb | 1,3 x nagyobb | 0,85 x nagyobb | 2,1 x (1,8) nagyobb |
* EC50 dózisok a standard IFN-B-val történő összehasonlítás minden egyes vizsgálatban szerepelt ** Az összehasonlítást 330 pg/ml IFN-B koncentráció alapján végeztük. A PEG[30 kD]-IFN-B (5,41 pg/ml) és a PEG[2 x 20 kD]-IFN-B (6,86 pg/ml) alapkoncentrációit aminosav-analízissel határoztuk meg.
A PEG-IFN-B kötődését a sejteken lévő receptorához rögzített mennyiségű 125I-IFN-a2a jelenlétében értékeltük ki. Az
I C
IFN-a2a-t I-vel jeleztük radioaktívan, kloramin T módszerrel. Az IFN-a2a-hoz kötődött 125I-t a szabad jódtól úgy választottuk el, hogy a reaktánsokat Sephadex G25 oszlopon vezettük át, és összegyűjtöttük a proteintartalmú frakciókat (Pharmacia). A 125I-IFN-oc2a mennyiségét IFN-a2a ELISA módszerrel (Biosource, USA) határoztuk meg, és meghatároztuk a specifikus aktivitást. Az exponenciális szaporodási fázisban lévő Daudi sejteket összegyűjtöttük, és 2 x 106 sejtet 0,5 nmol/1 125I-IFN-a2a-val szobahőmérsékleten 3 órán keresztül inkubáltunk PEG-IFN-β vagy IFN-a2a különböző koncentrációinak jelenlétében, amelyek hígítását 2% magzati borjúszérumot és 0,1% nátriumazidot tartalmazó RPMI 1640 vizsgálati pufferrel végeztük. Az inkubációs periódus végén a sejteket ftalát.olaj rétegen keresztül centrifugáltuk, és a sejthez kötött radioaktivitást gamma számlálóval mértük. A PEG[30kD]-IFN-B és PEG[2x20kD]-IFN-β kötődése a receptorhoz nagyon hasonló vagy közeli volt az IFN-β kötődési aktivitásához, amint az a 7. ábrából látható.
Ezenkívül, meghatároztuk a relatív aktivitást Daudi sejten (humán B-sejtes limfóma) végzett antiproliferációs vizsgálattal (3. táblázat). Az összes IFN minta koncentrációja 200 ng/ml kétszerese volt. A mintákból háromszoros hígítási sort készítettünk a lemezen, 100 pl végtérfogatban. Az egyes rezervoárokba 1 x 105 sejt/rezervoár (100 μΐ) mennyiségben adtuk a sejteket, és összesen 72 órán keresztül inkubáltuk 37 °C-on szén-dioxidot tartalmazó párásított inkubátorban. 48 óra elteltével triciált (3H) timidint adtunk hozzá 1 pCi/rezervoár mennyiségben, 20 μΐ térfogatban. 72 órás inkubációs periódus végén a lemezről Tömtek Plate Harvester segítségével össze
- 23 - ·; yv:
gyűjtöttük a sejteket. Az eredményeket a 3. táblázatban közöljük, amelyek jelzik, hogy a PEG-ilezés nem eredményezett detektálható IFN-aktivitás veszteséget. Valójában az aktivitás valamivel nagyobb volt, mint a szabad IFN-β aktivitása. Ennek oka az lehet, hogy a szabad IFN-ben inaktív aggregátumok képződnek, vagy a kvantitatív módszerek különbségeiből adódhat az eltérés (aminosav-analízis a PEG-IFN minták, és RP-HPLC IFN-β esetén).
3, táblázat
Daudi antiproliferációs vizsgálat
| IC50 dózis (pg/ml) | Aktivitásnövekedés IFN-hez viszonyítva | |
| IFN-β (1. lemez) | 1153,1 | - |
| PEG[30kD]-IFN (71 A) | 696,6 | 1,6-szoros |
| IFN-β (2. lemez) | 1005,8 | - |
| PEG[40kD]-IFN (71B)________ | 629,4 | 1,7-szeres |
4. példa
Farmakokinetikai vizsgálatok egérben
Intravénás adagolás
Az egereknek 100 ng IFN-β-ί, PEG[30kD]-IFN-B-t vagy PEG[2x20kD]-IFN-B-t injektáltunk, és a megadott időpontokban vérmintát vettünk. Az IFN-β szérumkoncentrációit IFN-B-specifikus ELIAS módszerrel (Toray Industries) határoztuk meg, és az eredményeket a 8. ábrán ismertetjük. 28 db nőstény B6D2F1 egeret (6-8 hetesek, körülbelül 20 g-osak) négy csoportra ősz
- 24 tottunk, az alábbiak szerint: az 1. csoportnak (amely 9 egérből állt) 200 μΐ 500 ng/ml humán IFN-B-t injektáltunk egyetlen bóluszban (végső dózis 100 ng/egér); a 2. csoportnak (9 egér) 200 μΐ ekvivalens mennyiségű PEG[30kD]-IFN-B-t injektáltunk; a 3. csoportnak 200 μΐ ekvivalens mennyiségű PEG[2x20kD]-IFN-Bt injektáltunk, és a 4. csoportnak (3 egér) nem adtunk injekciót, ezek negatív kontrollként szolgáltak. A vérmintákat (körülbelül 200 μΐ/minta) kilenc megadott időpontban vettük, a retro-orbitális vénás plexus roncsolásával, kapilláris cső segítségével. A vérmintákat 1 órán keresztül szobahőmérsékleten alvadni hagytuk, a karimát összegyűjtöttük és mikrocentrifugáltuk. Az elválasztott szérumot -70 °C-on tároltuk addig, amíg az összes mintát levettük. A szérumokat bioaktív humán IFN-B jelenlétére vizsgáltuk Toray vizsgálattal. Az eredmények azt jelzik, hogy a görbe alatti terület (AUC) jelentősen megnőtt a PEG-IFN mintákban a szabad IFN-B-hoz képest és a PEG[2x20kD]-IFN-B minta előnyösebb, mint a PEG[30 kD]—IFN-B.
Szubkután adagolás
Az egereknek szubkután módon IFN-B-t és PEG-IFN-t (100 ng/egér) injektáltunk. A 9. ábrán látható, hogy a görbe alatti összes terület (AUC) drámaian megnőtt a PEG-IFN minták esetén a szabad IFN-B-hoz viszonyítva. A farmakokinetikai vizsgálatok összhangban vannak azzal, hogy a PEG-IFN minták hosszabb felezési idővel és megnövekedett AUC-val rendelkeznek.
5, példa
Kis móltömegű PEG-maradék kapcsolása polipeptidhez
Interferon-béta „címkézése” OPSS-PEG^-hidraziddal
Protein-SH
O
Protein-S-S-PEG2K-C-NH-NH2 zrS-S-pEG2K-C-NH-NH2 N
A rekombináns humán interferon-B-ból 0,33 mg/ml oldatot készítettünk 50 mmol/l nátrium-acetát pufferrel (pH 3,8). Körülbelül 3,6 mg (40 mol% felesleg a protein móljára vonatkoztatva) heterobifunkcionális PEG reagenst, azaz OPSS-PEG2k-hidrazidot adtunk 2 ml ionmentes vízben 3 ml 0,33 mg/ml koncentrációjú IFN-β oldathoz (0,99 mg), és a reaktánsokat polipropilén csőben, 45 °C-on 1 órán keresztül hagytuk reagálni. A reakcióelegyet ezután kapilláris elektroforézissel analizálva meghatároztuk a módosítás mértékét. A tipikus hozam 90-97% volt, az alkalmazott interferon-β és PEG reagens tisztaságától függően. Az oldatot ezután méret szerinti kizárásos oszlopra (Superdex 75, Pharmacia) vittük fel, és 5 mmol/l nátrium-foszfát, 150 mmol/l NaCl (pH 7,0) pufferrel eluáltuk. A csúcsokat összegyűjtöttük, és SDS-PAGE módszerrel analizáltuk. A monoPEG-ilezett interferon-β frakciókat összegyűjtöttük, majd ezt alkalmaztuk a nagy móltömegű PEG-gel végzett további módosítás lépésében.
- 26 Interferon-B „címkézése (OPSS)7-PEGidnn-zal
ProteiirS-S-PEGjjoo-S-S
A rekombináns humán interferon-B-ból 0,33 mg/ml koncentrációjú oldatot készítettünk 50 mmol/1 nátrium-acetát pufferrel (pH 3,8). Körülbelül 6,1 mg (40 mól felesleg a protein móljára vonatkoztatva) homobifunkcionális PEG reagenst, azaz (OPSS)2-PEG34oo-at adtunk 2 ml ionmentes vízben 3 ml 0,33 mg/ml koncentrációjú interferon-B-hoz (0,99 mg), és a két reaktánst polipropilén csőben 2 órán keresztül hagytuk reagálni 50 °C-on. A reakciót nem-redukáló SDS-PAGE módszerrel ellenőriztük, és a végső reakcióelegyet kapilláris elektroforézissel analizáltuk a módosítás mértékének meghatározására. A fenti reakcióban az interferon-B módosítása jellemzően >95%. Az oldatot ezután méret szerinti kizárásos oszlopra (Superdex 75, Pharmacia) vittük fel, és 50 mmol/1 nátrium-foszfát, 150 mmol/1 NaCl (pH 7,0) pufferrel eluáltuk. A csúcsokat összegyűjtöttük, és tartalmukat SDS-PAGE módszerrel analizáltuk. A monoPEGilezett interferon-B frakciókat egyesítettük.
6. példa
Második PEG-maradék kapcsolása kis móltömegű PEG-gel PEG-ilezett polipeptidhez
IFN-S-S-PEG?k-hidrazid módosítása rnPEGmk-aldehiddel (ÁLD)
PrrtenrS^-PEOjK-C-NlhNHi
Protein- S-S-PEG^-C-NH-N^ILmPEGjcK mPEGjQK-CHjCHzCH
Az 5. példa szerint előállított IFN-S-S-PEG2k-hidrazid egyesített frakcióit a proteinhez képest 20 mól feleslegben adtuk az mPEG3ok-ALD-hoz. A reakciót szobahőmérsékleten (25 C) 4 órán keresztül játszattuk le, és a mintát méret szerinti kizárásos oszlopra (Superose 6, Pharmacia) vittük fel, hogy meghatározzuk a módosítás hozamát. A módosítás hozama ebben a reakcióban rendszerint >80% a PEG reagens tisztaságától és a reakciókörülményektől függően.
Miután a találmányt részletesen ismertettük, szakember számára nyilvánvaló, hogy a találmány ekvivalens paraméterek, koncentrációk és körülmények tág körében megvalósítható anélkül, hogy a találmány szellemétől eltérnénk, és ez indokolatlanul sok kísérleti munkát követelne.
Noha a találmányt a fentiekben egy specifikus kiviteli alakokkal ismertettük, nyilvánvaló, hogy azon különféle módosítások hajthatók végre. A találmány oltalmi körébe tartoznak a találmány szellemében általában végzett változtatások, alkalma
- 28 zások vagy adaptációk, amelyek szakember számára kézenfekvőek.
A leírásban idézett irodalmak, így a szakcikkek vagy kivonatok, publikált vagy publikálatlan US vagy egyéb szabadalmi bejelentések, megadott US és egyéb szabadalmak, vagy bármely egyéb dokumentum tartalmát leírásunkba referenciaként beépítettük, beleértve az összes adatot, táblázatot, ábrát és szöveget. Ezenkívül leírásunkba referenciaként beépítettük az irodalmi hivatkozásokban hivatkozott összes szakirodalom teljes tartalmát is.
Az ismert eljárási lépésekre, szokásos eljárási lépésekre, ismert eljárásokra vagy szokásos eljárásokra való hivatkozást semmiképpen nem úgy értjük, hogy a találmány szerinti leírás vagy kiviteli mód a hivatkozott szakirodalomban le lett volna írva, vagy arra kitanítás vagy javaslat található lett volna.
A specifikus kiviteli módok fenti ismertetéséből a találmány általános jellege nyilvánvaló, és egy szakember köteles tudásának alkalmazásával (amelybe beletartozik a fent idézett irodalmak tartalma is) módosítani és/vagy adaptálni képes különféle alkalmazásokra a fenti specifikus kiviteli alakokat túlzott mértékű kísérleti munka végzése és a találmány elvétől való eltérés nélkül. Ezért az ilyen módosítások és adaptációk az ismertetett kiviteli alakok ekvivalenseinek körébe tartoznak, amelynek alapját a leírásban található kitanítás képezi. Magától értetődik, hogy a leírás céljára használt terminológia nem a korlátozást szolgálja, és hogy a leírásban alkalmazott kifejezéseket szakembernek saját tudásával kombinációban a leírásban adott kitanítás tükrében kell értelmeznie.
Claims (25)
- Szabadalmi igénypontok1. Poliol-interferon-β konjugátum, amely humán interferon-β Cys17-jéhez kovalensen kötött poliol-maradékot tartalmaz.
- 2. Az 1. igénypont szerinti poliol-interferon-B konjugátum, amelyben a poliol-maradék egy polialkilénglikol-maradék.
- 3. A 2. igénypont szerinti poliol-interferon-B konjugátum, amelyben a polialkilénglikol-maradék egy polietilénglikol (PEG) maradék.
- 4. Az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti poliol-interferon-B konjugátum, ahol a poliol-interferon-B konjugátum azonos vagy nagyobb interferon-B aktivitással rendelkezik, mint a natív humán interferon-B.
- 5. Eljárás az 1. igénypont szerinti poliol-interferon-B konjugátum előállítására, azzal jellemezve, hogy interferon-B-t tiol-reaktív poliol reaktánssal reagáltatva hely-specifikusan és kovalensen kapcsolunk egy poliol-maradékot a humán interfelon-B Cys -hez; és az így kapott poliol-interferon-B konjugátumot kinyerjük.
- 6. Az 5. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy tiol-reaktív poliolreaktánsként tiol-reaktív PEG-ilező szert alkalmazunk.
- 7. Az 5. vagy 6. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a tiol-reaktív poliol reaktáns mono-metoxilezett.
- 8. Az 5. vagy 6. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a tiol-reaktív poliol reaktáns bifunkciós.
- 9. Az 5. vagy 6. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a tiol-reaktív poliol reaktáns egy poliolszármazék,- 30 amely ortopiridil-diszulfid, vinil-szulfon, maleimid és jódacetimid közül választott funkciós csoportot tartalmaz.
- 10. Az 5. vagy 6. igénypont szerinti eljárás, ahol a tiolreaktív poliol reaktáns egy mono-metoxilezett poliol ortopiridil-diszulfid származéka.
- 11. Az 5. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a reagáltatást savas pH-η hajtjuk végre, ahol az interfon-B stabil.
- 12. Gyógyászati készítmény, amely hatóanyagként az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti poliol-interferon-B konjugátumot, és gyógyászatilag elfogadható hordozót, kötőanyagot vagy segédanyagot tartalmaz.
- 13. A 12. igénypont szerinti gyógyászati készítmény, amelynek hatékony mennyisége fertőzések, tumorok és autoimmun és gyulladásos betegségek kezelésére alkalmazható.
- 14. Eljárás polietilénglikol (PEG) maradékok sorozatos, lépésenként! kapcsolására egy polipeptidhez, azzal jellemezve, hogy egy polipeptidet egyW-CH2CH2O(CH2CH2O)nCH2CH2-X, általános képletű kis móltömegű heterobifunkciós vagy homobifunkciós PEG-maradékkal - ahol W és X jelentése egymástól függetlenül amin, szulfidril, karboxil vagy hidroxil funkciós csoportokkal reagáló csoport - reagáltatva a kis móltömegű PEG-maradékot a polipeptidhez kapcsoljuk; és a polipeptidhez kapcsolt kis móltömegű PEG-maradékot egy monofunkciós vagy bifunkciós PEG-maradékkal reagáltatva a monofunkciós vagy- 31 - C: ·· · ? ·::;«· · · · * ·* bifunkciós PEG-maradékot a kis móltömegű PEG-maradék szabad végéhez kapcsoljuk, és így PEG-polipeptid konjugátumot kapunk.
- 15. A 14. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy egyY-CH2CH2O(CH2CH2O)MCH2CH2-Z általános képletű monofunkciós vagy bifunkciós PEG-maradékot - ahol Y a polipeptidhez kapcsolt kis móltömegű PEG-maradék szabad végén lévén terminális csoporttal reagálni képes csoportot jelent, és Z jelentése -OCH3 vagy az X-szel reagálni képes csoport - alkalmazunk a bifunkciós konjugátum kialakítására.
- 16. A 15. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy monofunkciós vagy bifunkciós PEG-maradékként metoxi-PEG-et, elágazó láncú PEG-et, hidrolítikusan vagy enzimatikusan lebontható PEG-et, függő PEG-et vagy dendrimer PEG-et alkalmazunk.
- 17. A 14. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy W és X jelentését egymástól függetlenül ortopiridil-diszulfid, maleimidek, vinilszulfonok, jódacetamidok, hidrazidok, aldehidek, szukcinimidil-észterek, epoxidok, aminok, tiolok, karbonsavak, aktív észterek, benzotriazol-karbonátok, p-nitrofenolkarbonátok, izocianátok és biotin közül választjuk.
- 18. A 14. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a kis móltömegű PEG-maradék móltömege körülbelül 100-5000 Da.
- 19. A 14. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a monofunkciós vagy bifunkciós PEG-maradék móltömege körülbelül 100 Da - 200 kDa.
- 20. A 14. igénypont szerinti eljárás, ahol a kis móltömegű PEG-maradék és/vagy monofunkciós vagy bifunkciós PEG-maradék egy polietilénglikol kopolimer.
- 21. A 20. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a polietilénglikol kopolimert polietilénglikol/polipropilénglikol kopolimerek és polietilénglikol/poli(tejsav/glikolsav) kopolimerek közül választjuk.
- 22. A 14. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy további lépésként tartalmazza a PEG-polipeptid konjugátum tisztítását a két PEG-maradék polipeptidhez sorozatos, lépésenként történő kapcsolása után.
- 23. A 22. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a tisztítást ioncserés kromatográfia, méret szerinti kizárásos kromatográfia, hidrofób kölcsönhatáson alapuló kromatográfia, affinitási kromatográfia és fordított fázisú kromatográfia közül választott egy vagy több tisztítási módszerrel végezzük.
- 24. A 14-23. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a polipeptid az interferon-β.
- 25. A 14-23. igénypontok bármelyike szerint előállított PEG-polipeptid konjugátumok alkalmazása gyógyszerként.A meghatalmazott:danubiaSzabadalmi és Védjegy Iroda Kft.dr. Kiss Ildikó szabadalmi ügyvivőAktaszámunk: 93177-12247A Sí
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US8333998P | 1998-04-28 | 1998-04-28 | |
| PCT/US1999/009161 WO1999055377A2 (en) | 1998-04-28 | 1999-04-28 | Polyol-ifn-beta conjugates |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| HUP0300548A2 true HUP0300548A2 (hu) | 2003-06-28 |
| HUP0300548A3 HUP0300548A3 (en) | 2005-07-28 |
Family
ID=22177687
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| HU0300548A HUP0300548A3 (en) | 1998-04-28 | 1999-04-28 | Polyol-ifn-betha conjugates |
Country Status (30)
| Country | Link |
|---|---|
| US (3) | US6638500B1 (hu) |
| EP (2) | EP1075281B1 (hu) |
| JP (2) | JP4574007B2 (hu) |
| KR (1) | KR100622796B1 (hu) |
| CN (2) | CN100335503C (hu) |
| AR (1) | AR020070A1 (hu) |
| AT (2) | ATE365563T1 (hu) |
| AU (1) | AU762621B2 (hu) |
| BG (2) | BG65046B1 (hu) |
| BR (1) | BR9910023A (hu) |
| CA (2) | CA2330451A1 (hu) |
| CY (1) | CY1108022T1 (hu) |
| CZ (2) | CZ298579B6 (hu) |
| DE (2) | DE69920002T2 (hu) |
| DK (2) | DK1075281T3 (hu) |
| EA (2) | EA003789B1 (hu) |
| EE (1) | EE05214B1 (hu) |
| ES (2) | ES2285286T3 (hu) |
| HU (1) | HUP0300548A3 (hu) |
| IL (1) | IL139286A (hu) |
| NO (2) | NO329749B1 (hu) |
| NZ (1) | NZ507456A (hu) |
| PL (2) | PL193352B1 (hu) |
| PT (2) | PT1421956E (hu) |
| SI (2) | SI1075281T1 (hu) |
| SK (2) | SK286217B6 (hu) |
| TR (2) | TR200003161T2 (hu) |
| TW (2) | TWI266800B (hu) |
| UA (2) | UA66857C2 (hu) |
| WO (1) | WO1999055377A2 (hu) |
Families Citing this family (81)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5932462A (en) * | 1995-01-10 | 1999-08-03 | Shearwater Polymers, Inc. | Multiarmed, monofunctional, polymer for coupling to molecules and surfaces |
| US7704944B2 (en) | 1997-08-14 | 2010-04-27 | Yeda Research And Development Company Ltd. | Interleukin-18 binding proteins, their preparation and use for the treatment of sepsis |
| US7220717B2 (en) | 1997-08-14 | 2007-05-22 | Yeda Research And Development Company Ltd. | Interleukin-18 binding proteins, their preparation and use |
| IL121860A0 (en) | 1997-08-14 | 1998-02-22 | Yeda Res & Dev | Interleukin-18 binding proteins their preparation and use |
| AU762616B2 (en) * | 1998-10-16 | 2003-07-03 | Biogen Ma Inc. | Polymer conjugates of interferon beta-1a and uses |
| SK287491B6 (sk) * | 1998-10-16 | 2010-11-08 | Biogen Idec Ma Inc. | Fúzne proteíny interferónu- beta-1a a ich použitie |
| CN100512879C (zh) * | 1999-04-23 | 2009-07-15 | 阿尔萨公司 | 用于脂质体中的有可裂解键的缀合物 |
| US7303760B2 (en) * | 1999-04-23 | 2007-12-04 | Alza Corporation | Method for treating multi-drug resistant tumors |
| US7238368B2 (en) * | 1999-04-23 | 2007-07-03 | Alza Corporation | Releasable linkage and compositions containing same |
| US6531122B1 (en) | 1999-08-27 | 2003-03-11 | Maxygen Aps | Interferon-β variants and conjugates |
| US7144574B2 (en) | 1999-08-27 | 2006-12-05 | Maxygen Aps | Interferon β variants and conjugates |
| US7431921B2 (en) | 1999-08-27 | 2008-10-07 | Maxygen Aps | Interferon beta-like molecules |
| TR200101086A3 (hu) * | 1999-10-15 | 2001-08-21 | ||
| EP1270642B1 (en) * | 1999-12-24 | 2011-08-31 | Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. | Branched polyalkylene glycols |
| MXPA02006795A (es) | 2000-01-10 | 2005-04-19 | Maxygen Holdings Ltd | Conjugados g-csf. |
| PL204285B1 (pl) | 2000-02-11 | 2009-12-31 | Bayer Healthcare Llc | Koniugat polipeptydowy, polipeptyd, sekwencja nukleotydowa, wektor ekspresyjny, komórka gospodarz, sposób wytwarzania koniugatu polipeptydowego, środek farmaceutyczny i zastosowanie koniugatu polipeptydowego |
| EP1400550B1 (en) * | 2001-01-30 | 2010-06-23 | Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. | Branched polyalkylene glycols |
| EP1234583A1 (en) * | 2001-02-23 | 2002-08-28 | F. Hoffmann-La Roche Ag | PEG-conjugates of HGF-NK4 |
| WO2002074806A2 (en) | 2001-02-27 | 2002-09-26 | Maxygen Aps | New interferon beta-like molecules |
| BR0211071A (pt) | 2001-07-11 | 2004-12-21 | Maxygen Holdings Ltd | Conjugado polipeptìdico apresentando atividade de g-csf, método para preparar um conjugado de g-csf, composição, método para tratar um mamìfero sofrendo de um nìvel neutrofìlico insuficiente, e, uso do conjugado polipeptìdico |
| HUE047557T2 (hu) | 2002-01-18 | 2020-04-28 | Biogen Ma Inc | Polialkilén polimervegyületek és felhasználásuk |
| TWI334785B (en) | 2002-06-03 | 2010-12-21 | Serono Lab | Use of recombinant ifn-β1a and pharmaceutical composition comprising recombinant ifn-β1a for the treatment of hcv infection in patients of asian race |
| WO2004020468A2 (en) * | 2002-08-28 | 2004-03-11 | Maxygen Aps | Interferon beta-like molecules for treatment of cancer |
| US8129330B2 (en) * | 2002-09-30 | 2012-03-06 | Mountain View Pharmaceuticals, Inc. | Polymer conjugates with decreased antigenicity, methods of preparation and uses thereof |
| PT1667708E (pt) * | 2002-12-26 | 2012-09-14 | Mountain View Pharmaceuticals | Conjugados de interferão-beta-1b e polietileno glicol apresentando uma potência biológica in vitro aumentada |
| BR0317752A (pt) * | 2002-12-26 | 2005-11-22 | Mountain View Pharmaceuticals | Conjugados poliméricos de citocinas, quimiocinas, fatores do crescimento, hormÈnios polipeptìdicos e seus antagonistas com atividade de ligação a receptores conservada |
| DK2085470T3 (da) | 2003-03-20 | 2012-08-06 | Bayer Healthcare Llc | FVII- eller FVIIa-varianter |
| TWI272948B (en) | 2003-05-01 | 2007-02-11 | Ares Trading Sa | HSA-free stabilized interferon liquid formulations |
| GB0316294D0 (en) | 2003-07-11 | 2003-08-13 | Polytherics Ltd | Conjugated biological molecules and their preparation |
| ES2428358T3 (es) | 2003-10-17 | 2013-11-07 | Novo Nordisk A/S | Terapia de combinación |
| AU2008201682B2 (en) * | 2004-02-02 | 2011-02-24 | Ambrx, Inc. | Modified human interferon polypeptides and their uses |
| MXPA06008496A (es) * | 2004-02-02 | 2007-01-30 | Ambrx Inc | Polipeptidos de interferon humano modificados y sus usos. |
| EP1586334A1 (en) * | 2004-04-15 | 2005-10-19 | TRASTEC scpa | G-CSF conjugates with peg |
| BRPI0510654A (pt) | 2004-05-17 | 2007-11-20 | Ares Trading Sa | formulações de interferon em hidrogel |
| US7731948B2 (en) | 2004-06-01 | 2010-06-08 | Ares Trading S.A. | Stabilized interferon liquid formulations |
| BRPI0510527A (pt) | 2004-06-01 | 2007-10-30 | Ares Trading Sa | método de estabilização de proteìnas |
| TW200633718A (en) * | 2004-12-16 | 2006-10-01 | Applied Research Systems | Treatment of hepatitis c in the asian population |
| KR101320936B1 (ko) | 2004-12-21 | 2013-10-23 | 넥타르 테라퓨틱스 | 안정화된 중합체성 티올 시약 |
| BRPI0519170A8 (pt) * | 2004-12-22 | 2018-05-08 | Ambrx Inc | formulações de hormônio de crescimento humano que compreendem um aminoácido não naturalmente codificado |
| US7939496B2 (en) | 2004-12-22 | 2011-05-10 | Ambrx, Inc. | Modified human growth horomone polypeptides and their uses |
| GB2438760A (en) | 2004-12-22 | 2007-12-05 | Ambrx Inc | Methods for expression and purification of recombinant human growth hormone |
| US8633300B2 (en) | 2005-06-17 | 2014-01-21 | Novo Nordisk Healthcare Ag | Selective reduction and derivatization of engineered proteins comprising at least one non-native cysteine |
| CN101257926A (zh) * | 2005-08-04 | 2008-09-03 | 尼克塔治疗亚拉巴马公司 | G-csf部分与聚合物的轭合物 |
| MX2008002596A (es) | 2005-08-26 | 2008-03-14 | Ares Trading Sa | Proceso para la preparacion de interferon beta glicosilado. |
| ZA200801923B (en) | 2005-09-01 | 2009-09-30 | Ares Trading Sa | Treatment of optic neuritis |
| US20070238656A1 (en) * | 2006-04-10 | 2007-10-11 | Eastman Kodak Company | Functionalized poly(ethylene glycol) |
| AU2007248680C1 (en) * | 2006-05-02 | 2014-01-23 | Allozyne, Inc. | Non-natural amino acid substituted polypeptides |
| US20080096819A1 (en) * | 2006-05-02 | 2008-04-24 | Allozyne, Inc. | Amino acid substituted molecules |
| CA2649810A1 (en) | 2006-05-24 | 2007-11-29 | Laboratoires Serono S.A. | Cladribine regimen for treating multiple sclerosis |
| JP2009537609A (ja) | 2006-05-24 | 2009-10-29 | ノボ ノルディスク ヘルス ケア アーゲー | 延長されたｆｉｘアナログ及び誘導体 |
| CN101675071B (zh) * | 2007-05-02 | 2014-06-18 | Ambrx公司 | 经修饰干扰素β多肽和其用途 |
| CA2707840A1 (en) | 2007-08-20 | 2009-02-26 | Allozyne, Inc. | Amino acid substituted molecules |
| DK2234645T3 (da) * | 2007-12-20 | 2012-07-09 | Merck Serono Sa | Peg-interferon-beta-formuleringer |
| NZ602170A (en) | 2008-02-08 | 2014-03-28 | Ambrx Inc | Modified leptin polypeptides and their uses |
| CN101525381B (zh) * | 2008-03-04 | 2012-04-18 | 北京百川飞虹生物科技有限公司 | 一种重组复合干扰素及其表达载体的构建和表达 |
| US20100112660A1 (en) * | 2008-05-30 | 2010-05-06 | Barofold, Inc. | Method for Derivatization of Proteins Using Hydrostatic Pressure |
| US20110124614A1 (en) * | 2008-10-25 | 2011-05-26 | Halina Offner | Methods And Compositions For The Treatment of Autoimmune Disorders |
| DE102009032179A1 (de) * | 2009-07-07 | 2011-01-13 | Biogenerix Ag | Verfahren zur Reinigung von Interferon beta |
| ES2365343B1 (es) | 2009-11-19 | 2012-07-10 | Fundación Centro Nacional De Investigaciones Cardiovasculares Carlos Iii | Uso de cd98 como marcador de receptividad endometrial. |
| JP5914363B2 (ja) | 2010-02-16 | 2016-05-11 | ノヴォ ノルディスク アー／エス | 低減されたｖｗｆ結合を有する因子ｖｉｉｉ分子 |
| AR080993A1 (es) | 2010-04-02 | 2012-05-30 | Hanmi Holdings Co Ltd | Formulacion de accion prolongada de interferon beta donde se usa un fragmento de inmunoglobulina |
| ES2993140T3 (en) | 2010-04-02 | 2024-12-23 | Amunix Pharmaceuticals Inc | Binding fusion proteins, binding fusion protein-drug conjugates, xten-drug conjugates and methods of making and using same |
| JP2013528374A (ja) | 2010-05-10 | 2013-07-11 | パーシード セラピューティクス リミテッド ライアビリティ カンパニー | Ｖｌａ４のポリペプチド阻害剤 |
| US20130183280A1 (en) | 2010-07-15 | 2013-07-18 | Novo Nordisk A/S | Stabilized factor viii variants |
| CN103209992A (zh) | 2010-09-15 | 2013-07-17 | 诺沃—诺迪斯克有限公司 | 具有减少的细胞摄取的因子viii变体 |
| CN103228290A (zh) * | 2011-02-18 | 2013-07-31 | (株)斯坦帝尔 | 包含沉默信息调节因子1表达诱导物质的败血症或者败血性休克的预防或者治疗用组合物 |
| MX2014000031A (es) | 2011-07-01 | 2014-07-09 | Bayer Ip Gmbh | Polipeptidos de fusion de relaxina y usos de los mismos. |
| BR112014007766B1 (pt) * | 2011-10-01 | 2022-05-10 | Glytech, Inc | Polipeptídeo glicosilado, método para fabricação do mesmo e composição farmacêutica |
| WO2013130683A2 (en) | 2012-02-27 | 2013-09-06 | Amunix Operating Inc. | Xten conjugate compositions and methods of making same |
| MX2014010209A (es) | 2012-02-29 | 2014-11-21 | Toray Industries | Agente inhibidor para acumulacion de fluido de la cavidad corporal. |
| KR102186063B1 (ko) | 2013-03-29 | 2020-12-03 | 가부시키가이샤 도우사 고가쿠 겐큐쇼 | 시알릴화 당쇄가 부가된 폴리펩티드 |
| US11759500B2 (en) | 2014-07-24 | 2023-09-19 | Abion Inc. | PEGylated interferon-beta variant |
| WO2016013697A1 (ko) * | 2014-07-24 | 2016-01-28 | 에이비온 주식회사 | 인터페론-베타 변이체의 폴리에틸렌글리콜 배합체 |
| SI3183264T1 (sl) | 2014-08-19 | 2021-03-31 | Biogen Ma Inc. | Metoda pegilacije |
| DK3288577T3 (da) | 2015-05-01 | 2022-01-10 | Allysta Pharmaceuticals Inc | Adiponectin-peptidomimetika til behandling af øjenlidelser |
| KR102718129B1 (ko) * | 2015-06-19 | 2024-10-17 | 에자이 알앤드디 매니지먼트 가부시키가이샤 | cys80 접합된 면역글로불린 |
| RS63070B1 (sr) | 2015-11-09 | 2022-04-29 | Univ Colorado Regents | Kompozicije i postupci za upotrebu u lečenju homocistinurije |
| WO2018195006A1 (en) * | 2017-04-17 | 2018-10-25 | The Regents Of The University Of Colorado, A Body Corporate | Optimization of enzyme replacement therapy for treatment of homocystinuria |
| BR112020010282A2 (pt) | 2017-11-24 | 2020-11-17 | Merck Patent Gmbh | regime de cladribina para uso no tratamento de formas progressivas de esclerose múltipla |
| EP3919128A4 (en) | 2019-01-28 | 2023-01-11 | Toray Industries, Inc. | POLYETHYLENE GLYCOL MODIFIED BODY FOR HEPATORYTE GROWTH FACTOR OR ACTIVE FRAGMENT THEREOF |
| JPWO2020158690A1 (ja) | 2019-01-28 | 2021-12-16 | 東レ株式会社 | 肝細胞増殖因子又はその活性断片のポリエチレングリコール修飾体 |
Family Cites Families (21)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1987000056A1 (en) * | 1985-06-26 | 1987-01-15 | Cetus Corporation | Solubilization of proteins for pharmaceutical compositions using polymer conjugation |
| US5206344A (en) * | 1985-06-26 | 1993-04-27 | Cetus Oncology Corporation | Interleukin-2 muteins and polymer conjugation thereof |
| US4917888A (en) | 1985-06-26 | 1990-04-17 | Cetus Corporation | Solubilization of immunotoxins for pharmaceutical compositions using polymer conjugation |
| US4766106A (en) | 1985-06-26 | 1988-08-23 | Cetus Corporation | Solubilization of proteins for pharmaceutical compositions using polymer conjugation |
| US5208344A (en) * | 1987-07-31 | 1993-05-04 | American Home Products Corporation | Naphthalenepropionic acid derivatives as anti-inflammatory/antiallergic agents |
| US5166322A (en) * | 1989-04-21 | 1992-11-24 | Genetics Institute | Cysteine added variants of interleukin-3 and chemical modifications thereof |
| US5595732A (en) * | 1991-03-25 | 1997-01-21 | Hoffmann-La Roche Inc. | Polyethylene-protein conjugates |
| US5382657A (en) * | 1992-08-26 | 1995-01-17 | Hoffmann-La Roche Inc. | Peg-interferon conjugates |
| DK0730470T3 (da) | 1993-11-10 | 2002-06-03 | Enzon Inc | Forbedrede interferonpolymerkonjugater |
| BR9506017A (pt) | 1994-03-31 | 1997-10-14 | Amagen Inc | Polipeptide poninculeotídeo isolado sequência de Dna e Cdna vetor de Dna célula hospedeira anticorpo composição farmacêutica derivado de Mgdf produto polípeptídeo Mgdf com grupos peg e preparação do mesmo e processo para produzir um polipeptídeo Mgdf humano e uma condição trombocitopênica para aumentar o número de megacarióticos maduroas e de plaquetas em um paciente necessitado dos mesmos e para fixar um polímero solúvel em água a um polipeptídeo Mgdf uma molècula de polietileno glicol a um polipeptideo Mgdf e poipeptideo glicol solúvel em água a um polipeptideo mgdf |
| JPH10500672A (ja) * | 1994-05-18 | 1998-01-20 | インヘイル セラピューティック システムズ，インコーポレイティド | インターフェロンの乾燥粉末製剤に関する方法及び組成物 |
| US5824784A (en) * | 1994-10-12 | 1998-10-20 | Amgen Inc. | N-terminally chemically modified protein compositions and methods |
| US5932462A (en) | 1995-01-10 | 1999-08-03 | Shearwater Polymers, Inc. | Multiarmed, monofunctional, polymer for coupling to molecules and surfaces |
| SE9503380D0 (sv) * | 1995-09-29 | 1995-09-29 | Pharmacia Ab | Protein derivatives |
| TW517067B (en) * | 1996-05-31 | 2003-01-11 | Hoffmann La Roche | Interferon conjugates |
| US5851984A (en) * | 1996-08-16 | 1998-12-22 | Genentech, Inc. | Method of enhancing proliferation or differentiation of hematopoietic stem cells using Wnt polypeptides |
| KR0176625B1 (ko) | 1996-11-05 | 1999-04-01 | 삼성전자주식회사 | 적외선 물체검출장치 |
| ATE200030T1 (de) * | 1997-01-29 | 2001-04-15 | Polymasc Pharmaceuticals Plc | Pegylationsverfahren |
| IL133974A0 (en) * | 1997-07-14 | 2001-04-30 | Bolder Biotechnology Inc | Derivatives of growth hormone and related proteins |
| US6307024B1 (en) * | 1999-03-09 | 2001-10-23 | Zymogenetics, Inc. | Cytokine zalpha11 Ligand |
| US6531122B1 (en) * | 1999-08-27 | 2003-03-11 | Maxygen Aps | Interferon-β variants and conjugates |
-
1999
- 1999-04-28 SI SI9930662T patent/SI1075281T1/xx unknown
- 1999-04-28 AT AT04003053T patent/ATE365563T1/de active
- 1999-04-28 DE DE69920002T patent/DE69920002T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1999-04-28 CN CNB2004100898478A patent/CN100335503C/zh not_active Expired - Fee Related
- 1999-04-28 PL PL344490A patent/PL193352B1/pl not_active IP Right Cessation
- 1999-04-28 WO PCT/US1999/009161 patent/WO1999055377A2/en active IP Right Grant
- 1999-04-28 PT PT04003053T patent/PT1421956E/pt unknown
- 1999-04-28 KR KR1020007011587A patent/KR100622796B1/ko not_active Expired - Fee Related
- 1999-04-28 EE EEP200000614A patent/EE05214B1/xx not_active IP Right Cessation
- 1999-04-28 EP EP99920094A patent/EP1075281B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1999-04-28 CZ CZ20003995A patent/CZ298579B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1999-04-28 CA CA002330451A patent/CA2330451A1/en not_active Abandoned
- 1999-04-28 EP EP04003053A patent/EP1421956B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1999-04-28 TR TR2000/03161T patent/TR200003161T2/xx unknown
- 1999-04-28 CA CA002565375A patent/CA2565375A1/en not_active Abandoned
- 1999-04-28 UA UA2000116719A patent/UA66857C2/uk unknown
- 1999-04-28 AU AU37674/99A patent/AU762621B2/en not_active Ceased
- 1999-04-28 ES ES04003053T patent/ES2285286T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1999-04-28 SK SK1622-2000A patent/SK286217B6/sk not_active IP Right Cessation
- 1999-04-28 DK DK99920094T patent/DK1075281T3/da active
- 1999-04-28 SI SI9930974T patent/SI1421956T1/sl unknown
- 1999-04-28 IL IL13928699A patent/IL139286A/xx not_active IP Right Cessation
- 1999-04-28 AT AT99920094T patent/ATE275422T1/de active
- 1999-04-28 PT PT99920094T patent/PT1075281E/pt unknown
- 1999-04-28 JP JP2000545574A patent/JP4574007B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1999-04-28 EA EA200001111A patent/EA003789B1/ru not_active IP Right Cessation
- 1999-04-28 UA UA20031212655A patent/UA79430C2/uk unknown
- 1999-04-28 DK DK04003053T patent/DK1421956T3/da active
- 1999-04-28 SK SK66-2007A patent/SK286654B6/sk not_active IP Right Cessation
- 1999-04-28 DE DE69936409T patent/DE69936409T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1999-04-28 ES ES99920094T patent/ES2224649T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1999-04-28 BR BR9910023-1A patent/BR9910023A/pt active Search and Examination
- 1999-04-28 HU HU0300548A patent/HUP0300548A3/hu unknown
- 1999-04-28 NZ NZ507456A patent/NZ507456A/en not_active IP Right Cessation
- 1999-04-28 TR TR2001/01751T patent/TR200101751T2/xx unknown
- 1999-04-28 PL PL378728A patent/PL196533B1/pl not_active IP Right Cessation
- 1999-04-28 CN CNB998054968A patent/CN1187094C/zh not_active Expired - Fee Related
- 1999-04-28 CZ CZ20050048A patent/CZ298597B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1999-04-28 EA EA200300382A patent/EA005495B1/ru not_active IP Right Cessation
- 1999-04-29 AR ARP990101987A patent/AR020070A1/es active IP Right Grant
- 1999-07-26 TW TW093123043A patent/TWI266800B/zh active
- 1999-07-26 TW TW088112596A patent/TWI232882B/zh active
-
2000
- 2000-10-17 BG BG109291A patent/BG65046B1/bg unknown
- 2000-10-17 BG BG104871A patent/BG64694B1/bg unknown
- 2000-10-23 NO NO20005337A patent/NO329749B1/no not_active IP Right Cessation
- 2000-10-30 US US09/698,133 patent/US6638500B1/en not_active Expired - Lifetime
-
2003
- 2003-08-28 US US10/649,609 patent/US7357925B2/en not_active Expired - Fee Related
-
2007
- 2007-02-13 US US11/674,476 patent/US7700314B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2007-07-19 CY CY20071100966T patent/CY1108022T1/el unknown
-
2010
- 2010-03-09 NO NO20100324A patent/NO332224B1/no not_active IP Right Cessation
- 2010-04-26 JP JP2010100840A patent/JP2010184929A/ja active Pending
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| HUP0300548A2 (hu) | Poliol-ifn-béta konjugátumok | |
| MXPA00010223A (en) | Polyol-ifn-beta conjugates | |
| HK1076115B (en) | Polyol-ifn-beta conjugates | |
| HK1038194B (en) | Polyol-ifn-beta conjugates |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| FA9A | Lapse of provisional patent protection due to relinquishment or protection considered relinquished |