HU225903B1 - Anticoagulant anti-factor-ix humanized antibody useful in treatment of thrombosis - Google Patents

Description

(54) Trombózis kezelésére alkalmas antikoaguláns humanizált anti-IX faktor ellenanyag (57) Kivonat

A találmány anti-IX-faktor monoklonális ellenanyag alkalmazására vonatkozik, trombotikus és embóliás társult megbetegedések kezelésére szolgáló gyógyszerkészítmények előállításához, ahol az ellenanyag a következők közül van választva:

A leírás terjedelme 74 oldal (ezen belül 9 lap ábra)

SB249413 ellenanyag, ahol a nehéz lánc aminosavszekvenciája a 31. számú szekvenciavázlaton bemutatott aminosavszekvenciának felel meg, és a könnyű lánc aminosavszekvenciája a 44. számú szekvenciavázlaton bemutatott aminosavszekvenciának felel meg;

HU 225 903 Β1

SB249415 ellenanyag, ahol a nehéz lánc aminosavszekvenciája az 52. számú szekvenciavázlaton bemutatott aminosavszekvenciának felel meg, és a könnyű lánc aminosavszekvenciája az 57. számú szekvenciavázlaton bemutatott aminosavszekvenciának felel meg;

SB249416 ellenanyag, ahol a nehéz lánc aminosavszekvenciája az 52. számú szekvenciavázlaton bemutatott aminosavszekvenciának felel meg, és a könnyű lánc aminosavszekvenciája a 62. számú szekvenciavázlaton bemutatott aminosavszekvenciának felel meg;

SB249417 ellenanyag, ahol a nehéz lánc aminosavszekvenciája az 52. számú szekvenciavázlaton bemutatott aminosavszekvenciának felel meg, és a könnyű lánc aminosavszekvenciája a 74. számú szekvenciavázlaton bemutatott aminosavszekvenciának felel meg;

SB257731 ellenanyag, ahol a nehéz lánc aminosavszekvenciája az 52. számú szekvenciavázlaton bemutatott aminosavszekvenciának felel meg, és a könnyű lánc aminosavszekvenciája a 78. számú szekvenciavázlaton bemutatott aminosavszekvenciának felel meg;

SB257732 ellenanyag, ahol a nehéz lánc aminosavszekvenciája a 89. számú szekvenciavázlaton bemutatott aminosavszekvenciának felel meg, és a könnyű lánc aminosavszekvenciája a 99. számú szekvenciavázlaton bemutatott aminosavszekvenciának felel meg;

és az ellenanyag a IX-es faktor elleni önkorlátozó neutralizációs aktivitással rendelkezik.

A találmány humán koagulációs faktorhoz vagy kofaktorhoz kötődő humanizált monoklonális ellenanyagokra (mAb) és a monoklonális ellenanyagok önkorlátozó trombózisinhibitorokként történő alkalmazására vonatkozik.

A véredényeket belülről burkoló vascularis endothelialis sejtek kisebb-nagyobb sérülései normális körülmények között egy egymást követő események sorozatán, az úgynevezett koagulációs „kaszkád”-on keresztül megvalósuló hemosztatikus válaszreakciót váltanak ki. A kaszkád csúcspontját az oldható fibrinogén oldhatatlan fibrinné történő átalakulása jelenti, ahol az oldhatatlan fibrin a vérlemezkékkel együtt a vérkomponenseknek az érből történő kilépését megakadályozó lokalizált vérrögöt vagy thrombust képez. Ezt követően a sebgyógyulás folyamán a vérrög feloldódik és helyreáll a véredény integritása és áramlása.

A sérülés és a vérrögképződés között bekövetkező, szigorúan szabályozott események különféle reakciók sorozataiból állnak. Ezek lényegét nagyon röviden az alábbiak szerint foglalhatjuk össze. A vérben inaktív proenzimformában lévő plazmakoagulációs proteinek és kofaktorok cirkulálnak. Egy sérülés helyén aktív enzimkomplexek állnak össze, amelyek fokozatosan szerin-proteázokká aktiválódnak, ahol az egymás utáni szerin-proteázok mindegyike katalizálja a következő proenzim proteázzá történő aktiválódását. Ebben az enzimatikus kaszkádban minden egyes lépés felerősíti a következő lépés hatását. A koagulációs kaszkádról összefoglaló tanulmány található például a következő szakkönyv első fejezetében; „Thrombosis and Hemorrhage”, J. Loscalzo and A. Schafer, eds., Blackwell, Scientific Publications, Oxford, England (1994).

Egy sérülés helyén a hatékony véralvadás korlátozza a vérvesztést. Amennyiben a vénákban vagy az artériákban nem megfelelő a thrombusképződés, a sérülés gyakran elvérzést és halált okoz. Az abnormális véralvadási aktivitás például a következő patológiás állapotokhoz vezethet és/vagy a következő patológiás állapotokból vagy kezelésekből származhat: infarctus myocardii, instabil angina, atrialis fibrillatio, stroke, vesekárosodás, percutan translumenalis coronaria angioplastica, disseminált intravascularís alvadás, szepszis, pulmonalis embolismus és mélyvénás trombózis. A mesterséges szervek, söntök és protézisek, például a mesterséges szívbillentyűk idegen felületein történő vérrögképződés ugyancsak problematikus.

Az említett patológiás állapotok, valamint egyéb trombotikus és embolikus rendellenességek kezelésére jelenleg alkalmazott engedélyezett antikoaguláns szerek körébe tartozik a szulfátéit poliszacharid heparin és a kis molekulatömegű (low molecular weight; LMW) heparin. Ezeket a szereket parenterális úton adják be. A heparin és az LMW heparin a trombininhibitor antitrombin III aktiválása és valamennyi koagulációs faktor inaktiválása révén gyorsan és tökéletesen gátolja a véralvadást.

Erős hatása miatt azonban a heparinnak és az LMW heparinnak hátrányos tulajdonságai is vannak. Az egyszerű mozgás, valamint az ennek során különféle tárgyakkal történő fizikai érintkezés hatására fellépő ellenőrizhetetlen vérzés jelenti az elsődleges komplikációt, amelyet a folyamatos infúziót kapott betegek 1—7%-ánál, illetve az intermittens boluszdózisokkal kezelt betegek 8-14%-ánál tapasztalnak. Az ellenőrizhetetlen vérzés kockázatának a minimalizálása érdekében folytatólagos vérvétel mellett ex vivő folyamatosan meg kell határozni az alvadási időket, ami jelentősen növeli a terápia költségét, emellett a beteg számára kényelmetlenséget okoz.

Ezenkívül az a terápiás céltartomány, amely egyrészt biztosítja a kívánt nagyságú hatékonyságot, másrészt nem teszi ki a beteget a vérzés veszélyének, rendkívül szűk. Annak a terápiás tartománynak, ami körülbelül 35 és körülbelül 100 másodperc közötti értékű aktivált parciális tromboplasztin időt (activated parttal thromboplastin time; aPTT) eredményez, az alsó határa körülbelül 1 pg heparin/ml plazma értéknek felel meg, míg felső határa 3 pg heparin/ml plazma értéknél kisebb. A heparin koncentrációját 3 pg/ml-re növelve

HU 225 903 Β1 túllépjük a céltartományt, míg 4 pg/ml-nél nagyobb koncentrációknál az alvadási aktivitás nem is detektálható. Az előbbiek alapján nyilvánvaló, hogy rendkívüli gondossággal kell eljárnunk ahhoz, hogy a beteg plazmakoncentrációját a terápiás tartományban tarthassuk.

Egy másik, lassabb és hosszabb tartós hatású engedélyezett antikoaguláns a kumarinszármazék warfarin. A warfarin a protrombin K-vitamin-függő poszttranszlációs modifikációjával és más K-vitamin-függő alvadási faktorokkal konkurálva fejti ki a hatását.

A vér alvadóképességét megszüntető antikoaguláns hatás mind a warfarin, mind pedig a heparin és az LMW heparin esetén csak a terápiás tartománynál némileg nagyobb koncentrációknál alakul ki. Bessos et al. (Thrombosis Research) 40; 863-867 1985. rágcsáló anti-IX-faktor ellenes ellenanyagot írnak le. Az említett rágcsáló-ellenanyag korlátozott neutralizáló aktivitást mutat a IX faktor ellen. Világosan, igény áll fenn olyan antikoaguláns szerre, amely hatékony trombotikus és embolikus rendellenességek kontrollálásában, és még nem okoz kontrollálatlan vérzékenységet vagy annak lehetőségét.

Ennek megfelelően, a találmány tárgya egy, humanizált antikoaguláns faktor monoklonális ellenanyag, mely a koagulációs faktor elleni neutralizáló aktivitással rendelkezik, a monoklonális ellenanyag a következő csoportból van választva: az SB 249413, az SB 249415, az SB 249416, az SB 249417, az SB 257731, az SB 257732.

Ugyancsak a találmány tárgyát képezi az ellenanyagok alkalmazása trombolikus vagy embolikus társult rendellenességek kezelésére szolgáló gyógyszerkészítmények előállításához.

Az ábrák rövid ismertetése

Az 1. ábra a normál humán plazma BC1 és BC2 rágcsáló anti-IX-es faktor monoklonális ellenanyaggal végzett titrálását szemléltető kísérleti eredményeket mutatja be.

A 2. ábra a normál humán plazma 9E4(2)F4 és 11G4(1)B9 rágcsáló anti-IX-es faktor monoklonális ellenanyaggal végzett titrálását szemléltető kísérleti eredményeket mutatja be.

A 3. ábra a normál humán plazmának HFXHC és HFXLC rágcsáló anti-X-es faktor monoklonális ellenanyaggal, valamint a HFXI rágcsáló anti-XI-es faktor ellenanyaggal végzett titrálását szemléltető kísérleti eredményeket mutatja be.

A 4. ábra a heparinnak, az acetil-szalicilsavnak és rágcsáló IX faktor monoklonális ellenanyagoknak egy rágcsáló nyaki verőér trombózis modellben az aktivált parciális tromboplasztin időre (aPTT) 60 percnél kifejtett hatását szemléltető kísérleti eredményeket mutatja be.

Az 5. ábra a heparinnak, az acetil-szalicilsavnak és rágcsáló IX faktor monoklonális ellenanyagoknak egy rágcsáló nyaki verőér trombózis modellben a protrombin időre 60 percnél kifejtett hatását szemléltető kísérleti eredményeket mutatja be.

A 6. ábra a heparinnak, az acetil-szalicilsavnak és rágcsáló IX faktor monoklonális ellenanyagoknak egy rágcsáló nyaki verőér trombózis modellben a nyaki artéria áramlásának elzáródására kifejtett hatását szemléltető kísérleti eredményeket mutatja be.

A 7. ábra a heparinnak, az acetil-szalicilsavnak és rágcsáló IX faktor monoklonális ellenanyagoknak egy rágcsáló nyaki verőér trombózis modellben a vérrög tömegére kifejtett hatását szemléltető kísérleti eredményeket mutatja be.

A 8. ábra a heparinnak, a BC2 rágcsáló IX-es faktor monoklonális ellenanyagnak, egy kiméra IX-es faktor monoklonális ellenanyagnak és humanizált IX-es faktor monoklonális ellenanyagoknak egy rágcsáló nyaki verőér trombózis modellben az aktivált parciális tromboplasztin időre (aPTT) 60 percnél kifejtett hatását szemléltető kísérleti eredményeket mutatja be.

A 9. ábra a heparinnak, a BC2 rágcsáló IX-es faktor monoklonális ellenanyagnak, egy kiméra IX-es faktor monoklonális ellenanyagnak és humanizált IX-es faktor monoklonális ellenanyagoknak, egy rágcsáló nyaki verőér trombózis modellben a vérrög tömegére kifejtett hatását szemléltető kísérleti eredményeket mutatja be.

A jelen találmány humán IX-es faktor ellen irányuló SB 249413, SB 249415, SB 249416, SB 249417, SB 257731 és SB 257732 humanizált monoklonális ellenanyagokra vonatkozik. Különösen előnyös antihumán IX-es monoklonális ellenanyag az SB 249217.

Ezek a termékek különösen hasznosak infarctus myocardii, instabil angina, atrialis fibrillatio, stroke, vesekárosodás, pulmonalis embolismus, mélyvénás trombózis, percutan translumenalis coronaria angioplastica, disseminált intravascularis alvadás, szepszis, mesterséges szervek, söntök és protézisek esetén fellépő trombotikus vagy embolikus rendellenességek kezelésére szolgáló terápiás vagy gyógyszerkészítményekben.

A jelen leírásban alkalmazott „önkorlátozó neutralizáló aktivitás” kifejezés egy ellenanyagnak azt az aktivitását jelöli, amelynek révén az ellenanyag egy IX-es humán koagulációs faktorhoz kötődik, és a koaguláció korlátozott modulációja által gátolja a trombózist. A „koaguláció korlátozott modulációja” kifejezés az alvadási idő növekedésére vonatkozik, amelyet az aktivált parciális tromboplasztin idő (aPTT) meghosszabbodásaként mérünk, ahol a plazma - a növekvő monoklonális antitest koncentráció ellenére - egy maximális értéket elérő aPTT mellett alvadásképes marad. A koagulációnak ez a korlátozott modulációja ellenté3

HU 225 903 Β1 tes azzal a plazmával, amelyet alvadásképtelenné kívánunk tenni, és amely növekvő heparinkoncentrációk jelenlétében korlátlan aPTT-t mutat A találmány szerinti eljárások maximális aPTT-értéke előnyösen a heparin terápiás tartományán belül van. Legelőnyösebben a maximális aPTT körülbelül 35 másodperc és körülbelül 100 másodperc közötti értékű, ami a normál kontroll aPTT-érték körülbelül 1,5-3,5-szeresének felel meg. Az egyik találmány szerinti megoldásban az aPTT a protrombinidő (PT) szignifikáns prolongációja nélkül hosszabbodik meg.

A „módosított ellenanyag kifejezés egy olyan, módosított immunglobulin kódoló szakasz által kódolt proteint jelöl, amelyet egy kiválasztott gazdasejtben végzett expresszálással állíthatunk elő. Az ilyen módosított ellenanyagok szerkesztett (engineered) ellenanyagok (például kiméra vagy humanizált antitestek) vagy olyan ellenanyagfragmensek, amelyekből részben vagy teljesen hiányzik egy immunglobulin állandó szakasz, például az Fv, az Fab, az Fab’ vagy az F(ab’)₂ stb. szakasz.

A „módosított immunglobulin kódoló szakasz” kifejezés egy találmány szerinti módosított ellenanyagot kódoló nukleinsavszekvenciát jelöl. Amennyiben a módosított ellenanyag egy CDR-graftolt vagy humanizált ellenanyag, azokat a szekvenciákat, amelyek a nemhumán immunglobulinból származó, komplementaritást meghatározó szakaszokat (complementarity determining region; CDR) kódolják, egy első, humán változó keretszekvenciákat tartalmazó immunglobulin-partnerbe inszertáljuk. Adott esetben az első immunglobulin partner működőképesen egy második immunglobulin partnerhez kötődik.

Az „első immunglobulin-partner kifejezés egy olyan, humán keretszakaszt vagy humán immunglobulin változó szakaszt kódoló nukleinsavszekvenciára vonatkozik, amelyben a natív (vagy természetes előfordulású) CDR-kódoló szakaszokat egy donor antitestnek a CDRkódoló szakaszai helyettesítik. A humán változó szakasz egy immunglobulin nehéz lánc, könnyű lánc (vagy mindkettő), illetve ezeknek egy analóg vagy funkcionális fragmense lehet. Az ilyen, az ellenanyagok (immunglobulinok) változó szakaszán belül elhelyezkedő CDR szakaszokat a szakterületen ismert eljárásokkal határozhatjuk meg. Például Kábát ismerteti a CDR-ek lokációs szabályait [Kábát ef al., „Sequences of Proteins of Immunoligical Interest, 4th Ed., U. S. Department of Health and Humán Services, National Institutes of Health (1987)]. Ezenkívül ismertek olyan számítógépes programok is, amelyek jól alkalmazhatók a CDR szakaszok/struktúrák azonosítására.

A „második immunglobulin-partner” kifejezés egy proteint vagy peptidet kódoló másik, olyan nukleotidszekvenciát jelöl, amelyhez a keretben vagy adott esetben egy hagyományos linkerszekvencián keresztül (azaz működőképesen) hozzákapcsolódik az első immunglobulin-partner. Előnyösen ez egy immunglobulin gén. A második immunglobulin-partner magában foglalhat egy olyan nukleinsavszekvenciát, amely ugyanazon ellenanyagnak (azaz homológ ellenanyag, ahol az első és a második módosított ellenanyag azonos forrásból származik) vagy egy további lényeges (azaz heterológ) ellenanyagnak a teljes állandó szakaszát kódolja. Ez egy immunglobulin nehéz lánc vagy könnyű lánc (illetve egyetlen polipeptid részeként mindkettő) lehet. A második immunglobulin-partner nem korlátozódik egy egyedi immunglobulinosztályra vagy izotípusra. Ezenkívül a második immunglobulin-partner egy immunglobulin állandó szakasz részletet is tartalmazhat, amilyen például egy Fab-ban vagy egy F(ab)₂-ben található (azaz magában foglalhatja egy megfelelő humán állandó szakasznak vagy keretszakasznak egy diszkrét részletét). A második immunglobulin-partner magában foglalhat egy olyan, például egy fág display könyvtár részét alkotó szekvenciát is, amely egy gazdasejt külső felületén lévő integrális membránproteint kódol, illetve egy analitikai vagy diagnosztikai detektálási célokra szolgáló proteint, például torma-peroxidázt, β-galaktozidázt stb. kódolószekvenciát is tartalmazhat.

Az Fv, Fc, Fd, Fab, Fab' vagy F(ab')₂ jelöléseket a standard jelentéseiknek megfelelően használjuk [lásd például: Hariow ef al., „Antibodies A Laboratory Manual”, Cold Spring Harbor Laboratory (1988)].

A jelen leírásban alkalmazott „szerkesztett (engineered) ellenanyag” kifejezés a módosított ellenanyagnak, például egy teljes hosszúságú szintetikus ellenanyagnak (azaz egy ellenanyagfragmenssel ellentétben egy kiméra vagy humanizált ellenanyagnak) egy olyan típusát jelöli, amelyben egy kiválasztott akceptor ellenanyag könnyű és/vagy nehéz lánc változó szakaszainak egy részét egy vagy több, a kiválasztott epitopra nézve specifikus donor antitest analóg részei helyettesítik. Például az ilyen molekulák körébe tartoznak azok az ellenanyagok, amelyeket egy módosítatlan könnyű lánccal (vagy kiméra könnyű lánccal) társuló humanizált nehéz lánc vagy vice versa jellemez. A szerkesztett ellenanyagokra az is jellemző, hogy a donor antitest kötési specifitásának megtartása érdekében az akceptor ellenanyagok könnyű és/vagy nehéz változó dómén keretszakaszokat kódoló nukleinsavszekvenciák módosítottak. Ezekben az ellenanyagokban az akceptor ellenanyagokból származó egy vagy több CDR-t (előnyösen valamennyi ilyen CDR-t) egy jelen leírás szerinti donor ellenanyagból származó CDR-ek helyettesítik.

A „kiméra ellenanyag” kifejezés a szerkesztett ellenanyagnak egy olyan típusára vonatkozik, amely egy akceptor ellenanyagból származó könnyű és nehéz lánc állandó régiókkal együtt egy donor ellenanyagból származó, természetes előfordulású változó szakaszt (könnyű láncot és nehéz láncokat) tartalmaz.

A „humanizált ellenanyag” kifejezés a tervezett ellenanyagnak egy olyan típusát jelöli, amelynek CDR-jei egy nemhumán donor immunglobulinból származnak, a molekula további immunglobulin-eredetű részei pedig egy vagy több humán immunglobulinból származnak. Ezenkívül a kötési affinitás megőrzése érdekében a keret melletti csoportok módosítva lehetnek [lásd például: Queen ef al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86, 10 029-10 032 (1989); Hodgson ef al., Bio/Technology, 9, 421 (1991)].

HU 225 903 Β1

A „donor ellenanyag” kifejezés egy olyan monoklonális vagy rekombináns ellenanyagot jelöl, amely változó szakaszainak, CDR-jeinek vagy más funkcionális fragmenseinek, illetve ezek analógjainak nukleinsavszekvenciáit átadja egy első immunglobulin partnernek, és így biztosítja azt a módosított immunglobulin kódoló szakaszt, amely a donor ellenanyag antigén specifitásával és neutralizáló aktivitási jellemzőivel rendelkező módosított ellenanyagot eredményezi, A találmány szerinti megoldásban történő felhasználásra alkalmas donor ellenanyagok egyike a BC2 jelzéssel ellátott rágcsáló önkorlátozó neutralizáló monoklonális ellenanyag. A további alkalmas donor ellenanyagok körébe tartoznak - egyebek mellett - a rágcsáló BC1, a 9E4(2)F4, a 11 G4(1)B9, a HFXLC és a HFXI jelzéssel ellátott önkorlátozó neutralizáló monoklonális ellenanyagok.

Az „akceptor ellenanyag kifejezés olyan, a donor ellenanyaggal heterológ monoklonális vagy rekombináns ellenanyagokra vonatkozik, amelyek a nehéz és/vagy könnyű lánc keretszakaszaikat és/vagy nehéz és/vagy könnyű lánc állandó szakaszaikat kódoló nukleinsavszekvenciáikat részben vagy teljes egészében átadják az első immunglobulin-partnernek. Az akceptor ellenanyag előnyösen egy humán ellenanyag.

A „CDR-ek” rövidítés egy ellenanyagnak azokat a komplementaritást meghatározó szakasz (complementarity determining region; CDR) aminosavszekvenciáit jelöli, amelyek az immunglobulin nehéz és könnyű láncok hipervariábilis szakaszai [lásd például: Kábát et al., „Sequences of Proteins of Immunological Interest”, 4th Ed., U. S. Department of Health and Humán Services, National Institutes of Health (1987)]. Egy immunglobulin változó szakaszában három nehéz lánc és három könnyű lánc CDR vagy vagy CDR szakasz van. A jelen leírásban alkalmazott „CDR-ek rövidítés magában foglalja mindhárom nehéz lánc CDR-t vagy mindhárom könnyű lánc CDR, illetve ha erre lehetőség nyílik, az összes nehéz és könnyű lánc CDR-t.

A CDR-ek biztosítják az ellenanyagnak az antigénhez vagy epitophoz kötésére szolgáló kontaktcsoportok legnagyobb részét. A találmány szerinti megoldás szempontjából lényeges CDR-ek donor ellenanyag változó nehéz és könnyű lánc szekvenciákból származnak, és magukban foglalják a természetes előfordulású CDR-eknek azokat az analógjait is, amely analógok rendelkeznek ugyanazzal a kötési specifitással és/vagy neutralizálóképességgel, illetve megtartják ugyanazt a kötési specifitást és/vagy neutralizálóképességet, mint amellyel az az ellenanyag rendelkezik, amelyből az analógok származnak.

A „kötési specifitás és/vagy neutralizálóképesség megosztása” kifejezés például azt jelenti, hogy bár a BC2 monoklonális ellenanyagra jellemző az önkorlátozó neutralizáló aktivitásnak bizonyos mértéke, egy BC2 nukleinsavszekvenciával kódolt CDR megfelelő strukturális környezetben ennél kisebb vagy nagyobb aktivitást mutathat. Várhatóan a BC2 CDR-jei ilyen környezetben mégis felismerik ugyanaz(oka)t az epitopo(ka)t, mint a BC2.

A „funkcionális fragmens” kifejezés egy olyan, részleges nehéz vagy könnyű lánc változó szekvenciát jelöl (például kisebb deléciók az immunglobulin változó szakasz amino- vagy karboxiterminálisánál), amely megtartja ugyanazt a kötési specifitást és/vagy neutralizálóképességet, mint amellyel az az ellenanyag rendelkezik, amelyből a fragmens származik.

Az „analóg” kifejezés legalább egy aminosawal módosított olyan aminosavszekvenciát jelöl, amelyben a kémiai módosítás vagy a néhány (például legfeljebb 10) aminosavszubsztitúciójából vagy átrendezéséből álló modifikáció megengedi, hogy az aminosavszekvencia megtartsa a módosítatlan szekvencia biológiai jellemzőit, például antigén specifitását és nagy affinitását. Az analógok példái közé tartoznak például azok a néma mutációk, amelyeket szubsztitúciók útján hozhatunk létre annak érdekében, hogy a CDR kódoló szakaszokon belül vagy ezek környezetében bizonyos endonukleáz restrikciós helyeket alakíthassunk ki.

Az analógok allélvariációk is lehetnek. Egy „allélvariáció vagy -modifikáció” egy, a találmány szerinti aminosav- vagy peptidszekvenciát kódoló nukleinsavszekvenciában lévő változás lehet. Az ilyen variációk vagy modifikációk például a genetikai kódban lévő degeneráció következményei lehetnek, illetve a kívánt jellemzők biztosításához tudatos szerkesztéssel is kialakíthatók. Az említett variációk vagy modifikációk adott esetben változásokat eredményezhetnek bármely kódolt aminosavszekvenciában.

Az „effektor szerek” kifejezés olyan, nemprotein hordozó molekulákat jelöl, amelyekhez a módosított ellenanyagok és/vagy a donor antitest természetes vagy szintetikus könnyű vagy nehéz láncai vagy a donor antitest egyéb fragmensei hagyományos eszközökkel hozzákapcsolhatók. A nemprotein hordozók - egyebek mellett - a diagnosztika területén alkalmazott szokásos hordozók, például polisztirol- vagy más műanyag gyöngyök, poliszacharidok, például a BIAcore (Pharmacia) rendszerben alkalmazott poliszacharidok, illetve a gyógyászatban felhasználható más olyan nemprotein anyagok lehetnek, amelyek embereknek és állatoknak biztonságosan beadhatók. További effektor szer lehet például egy nehézfématom vagy radioizotópok komplexálására szolgáló makrociklusos kelátképző. Ezeket az effektor szereket, például a polietilénglikolt felhasználhatjuk a módosított antitestek félidejének a megnövelésére is.

Az egyik példa értelmében a találmány szerinti önkorlátozó neutralizáló monoklonális ellenanyag a BC2 rágcsáló monoklonális ellenanyag, amelyet felhasználhatunk egy kiméra vagy humanizált molekula kifejlesztésére. A BC2 monoklonális ellenanyagot az alvadási időre gyakorolt önkorlátozó inhibitor aktivitás jellemzi. Az aPTT-vizsgálattal mérve a BC2 monoklonális ellenanyagnak az alvadási időre gyakorolt hatása körülbelül 100 másodperces maximális értéket mutat. A BC2 monoklonális ellenanyag ezenkívül megköti a IXa faktort, gátolja a IX-» IXa faktorátalakulást, valamint gátolja a IXa-faktor-aktivitást. Az aktivitáshoz két vegyértékű fém kofaktorokra van szükség, ahol a monoklo5

HU 225 903 Β1 nális antitest a Ca²⁺-iont nagyobb előnyben részesíti, mint a Mn²⁺-iont. Az aPTT-vizsgálatban megfigyelt IC₅o-érték körülbelül 50 nM-nak felel meg. A BC2 monoklonális ellenanyag patkánnyal species keresztreaktivitást mutat, ahol a BC2 monoklonális ellenanyag lgG2a izotípusú.

További előnyös donor ellenanyag a BC1, a 9E4(2)F4 és a 11G4(1)B9 rágcsáló monoklonális ellenanyag. Ezeket a monoklonális ellenanyagokat az alvadási időre gyakorolt önkorlátozó inhibitor aktivitás jellemzi. Az aPTT-vizsgálattal mérve az alvadási időre gyakorolt hatás maximális értéke a 9E4(2)F4 esetén körülbelül 90-100 másodperc, míg a 11G4(1)B9 esetén körülbelül 80 másodperc. A BC1 monoklonális ellenanyag ezenkívül megköti a IXa faktort, gátolja a IXafaktor-aktivitást, de nem gátolja a IX->IXa faktorátalakulást. Ez az aktivitás nem igényel fém kofaktort. Az aPTT vizsgálatban a BC1 esetén megfigyelt IC₅₀-érték körülbelül 35 nM-nak felel meg. A BC1 monoklonális ellenanyag lgG1 izotípusú.

Egy további alkalmas donor ellenanyag, amely önkorlátozó inhibitor hatást gyakorol az alvadási időre, a rágcsáló HFXLC monoklonális ellenanyag. Az aPTTvizsgálattal mérve a HFXLC monoklonális ellenanyag esetén az alvadási időre gyakorolt hatásnak a maximális értéke körülbelül 50-60 másodperc. A HFXLC monoklonális ellenanyag megköti a X faktor könnyű láncot, és gátolja a X/Xa faktoraktivitást. Az aPTT vizsgálatban megfigyelt IC₅₀-érték körülbelül 20 nM-nak felel meg.

Egy további alkalmas donor ellenanyag, amely önkorlátozó inhibitor hatást gyakorol az alvadási időre, a rágcsáló HFXI monoklonális ellenanyag. Az aPTT-vizsgálattal mérve a HFXI monoklonális ellenanyag esetén az alvadási időre gyakorolt hatásnak a maximális értéke körülbelül 100 másodperc. A HFXI monoklonális ellenanyag megköti a XI faktort, és gátolja a Xl/XIa faktoraktivitást. Az aPTT-vizsgálatban megfigyelt IC₅₀-érték körülbelül 30 nM-nak felel meg.

Anélkül, hogy a hatásmechanizmus vonatkozásában bármilyen elméleti magyarázathoz mereven ragaszkodnánk, feltételezzük, hogy ezek az ellenanyagok egy nemkompetitív vagy alloszterikus mechanizmus útján szabályozzák a koagulációt, amelynek eredményeként csak részleges gátlás érhető el.

A találmány magában foglalja a megfelelő humán koagulációs faktor vagy kofaktor ellen irányuló monoklonális ellenanyagokból származó Fab fragmensek vagy F(ab’)₂ fragmensek alkalmazását is. Ezeket a fragmenseket felhasználhatjuk mint önkorlátozó neutralizáló aktivitással rendelkező szereket koagulációs faktorokkal szemben. Egy Fab fragmens a teljes könnyű láncot és a nehéz lánc amino-terminális részét tartalmazza. Egy F(ab’)₂ fragmens az a fragmens, amelyet két, diszulfidkötésekkel kapcsolt Fab fragmens alkot. A Fab fragmenseket vagy F(ab’)₂ fragmenseket hagyományos eszközökkel, például a monoklonális ellenanyagnak a megfelelő proteolitikus enzimekkel, papainnal és/vagy pepszinnel végzett hasításával, illetve rekombináns eljárásokkal állíthatjuk elő. Ezeket a Fab fragmenseket vagy F(ab’)₂ fragmenseket felhasználhatjuk önmagukban terápiás, profilaktikus vagy diagnosztikai szerekként.

A változó könnyű lánc és nehéz lánc peptid szekvenciákat kódoló találmány szerinti nukleinsavszekvenciákat vagy ezek fragmenseit felhasználhatjuk specifikus változásoknak a CDR-eket vagy keretszakaszokat kódoló nukleinsavszekvenciákon belül történő mutagén bevezetésére, valamint az így nyert módosított vagy kapcsolt nukleínsavszekvenciának expresszió céljából egy plazmidba történő beépítésére. Például a keret- vagy CDR kódoló szakaszok nukleotidszekvenciájában lévő néma szubsztitúciókat felhasználhatjuk olyan restrikciós enzimhelyek kialakítására, amelyek elősegítik a mutagenizált CDR és/vagy keretszakaszok inszercióját.

A BC2 nehéz lánc változó szakasz nukleinsav- és aminosavszekvenciáját az 5. és 7. számú szekvencia mutatja be. Az ebből a szakaszból származó CDR szekvenciák a 8., 9. és 10. számú szekvenciában láthatók.

A BC2 könnyű lánc változó szakasz nukleinsav- és aminosavszekvenciáját a 6. és 11. számú szekvencia mutatja be. Az ebből a szakaszból származó CDR szekvenciák a 12., 13. és 14. számú szekvenciában láthatók.

A genetikai kód degenerációjának figyelembevételével különféle olyan kódolószekvenciákat állíthatunk össze, amelyek a donor ellenanyag antigén specifitásával rendelkező, találmány szerinti változó nehéz és könnyű lánc aminosavszekvenciákat és CDR szekvenciákat, valamint ezek funkcionális fragmenseit és analógjait kódolják. A változó lánc peptid szekvenciákat vagy CDR-eket kódoló izolált, találmány szerinti nukleinsavszekvenciákat vagy ezek fragmenseit egy második immunglobulin-partnerrel működőképesen kombinálva felhasználhatjuk például találmány szerinti szerkesztett antitestek előállítására.

Különösen előnyös az SB 249413 humanizált ellenanyag, ahol a nehéz lánc a 31. számú szekvenciában megadott aminosavszekvenciával, a könnyű lánc pedig a 44. számú szekvenciában megadott aminosavszekvenciával rendelkezik. Ugyancsak különösen előnyös az SB 249415 humanizált ellenanyag, ahol a nehéz lánc az 52. számú szekvenciában megadott aminosavszekvenciával, a könnyű lánc pedig az 57. számú szekvenciában megadott aminosavszekvenciával rendelkezik. Ugyancsak különösen előnyös az SB 249416 humanizált ellenanyag, ahol a nehéz lánc az 52. számú szekvenciában megadott aminosavszekvenciával, a könnyű lánc pedig a 62. számú szekvenciában megadott aminosavszekvenciával rendelkezik. Ugyancsak különösen előnyös az SB 249417 humanizált ellenanyag, ahol a nehéz lánc az 52. számú szekvenciában megadott aminosavszekvenciával, a könnyű lánc pedig a 74. számú szekvenciában megadott aminosavszekvenciával rendelkezik. Ugyancsak különösen előnyös az SB 257731 humanizált ellenanyag, ahol a nehéz lánc az 52. számú szekvenciában megadott aminosavszekvenciával, a könnyű lánc pedig a 78. számú szek6

HU 225 903 Β1 venciában megadott aminosavszekvenciával rendelkezik. Ugyancsak különösen előnyös az SB 257732 humanizált ellenanyag, ahol a nehéz lánc a 89. számú szekvenciában megadott aminosavszekvenciával, a könnyű lánc pedig a 99. számú szekvenciában megadott aminosavszekvenciával rendelkezik.

Az ezen a területen jártas szakember számára nyilvánvaló, hogy egy szerkesztett ellenanyagot a változó doménben lévő aminosavak változtatásával tovább módosíthatunk anélkül, hogy a donor antitestnek a specifitása és nagy affinitása szükségszerűen károsodna (ebben az esetben tehát egy analógot nyerünk). Valószínűsíthető, hogy a nehéz és könnyű lánc aminosavak a változó dómén keretekben és/vagy a CDR-ekben más aminosavakkal helyettesíthetők. Ezeket a szubsztitúciókat a donor ellenanyag vagy egy egyedi alcsoportból származó konszenzusos szekvenciák szolgáltathatják.

Ezenkívül a találmány szerinti molekulák szelektív jellemzőinek fokozása vagy csökkentése érdekében az állandó szakasz is megváltoztatható (például dimerizációval, az Fc receptorokhoz történő kötéssel vagy a komplementer kötési és aktiválási képesség módosításával [lásd például: Angal et al., Mól. Immunoi., 30, 105-108 (1993); Xu et al., J. Bioi. Chem., 269, 3469-3474 (1994); valamint a 307,434-B. számú európai szabadalmi leírás]}.

Egy kiméra ellenanyagnak megfelelő módosított ellenanyag a fentiekben ismertetett humanizált ellenanyagoktól abban tér el, hogy tartalmazza a teljes nemhumán donor ellenanyag nehéz lánc és könnyű lánc változó szakaszokat, köztük a keretszakaszokat, mindkét lánc esetén a humán immunglobulin állandó szakaszokkal társítva. Feltételezhető, hogy azok kiméra ellenanyagok, amelyek a találmány szerinti humanizált ellenanyagokhoz képest további nemhumán szekvenciát is tartalmaznak, emberekben szignifikáns immunválaszt válthatnak ki.

Az ilyen ellenanyagok (az alábbiakban részletesen tárgyaltaknak megfelelően) jól alkalmazhatók trombotikus és embolikus rendellenességek megelőzésére és kezelésére.

Egy kiválasztott donor monoklonális ellenanyagot, például egy rágcsáló-BC2-ellenanyagot termelő hibridomát hagyományos módon klónozunk, míg a hibridoma nehéz és könnyű lánc variábilis szakaszok DNS-ét az ezen a területen jártas szakember számára ismert, például a Sambrook által ismertetett [Sambrook eí al., Molecular Cloning (A Laboratory Manual), 2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory (1989)] technikák alkalmazásával állíthatjuk elő. A BC2-nek a legalább a CDR-kódoló szakaszokat és az akceptor monoklonális ellenanyag könnyű és/vagy nehéz variábilis dómén keretszakaszoknak a donor monoklonális ellenanyag kötési specifitásának megtartásához szükséges részeit tartalmazó variábilis nehéz és könnyű szakaszait, valamint a humán immunglobulinból származó ellenanyaglánc további immunglobulin-eredetű részeit polinukleotid primerek és reverz transzkriptáz alkalmazásával állítjuk elő. A CDR-kódoló szakaszokat egy ismert adatbázis alkalmazásával és más ellenanyagokkal történő összehasonlítással azonosítjuk.

Ezt követően előállíthatunk egy egér/humán kiméra ellenanyagot, amelyet a kötésképességre nézve vizsgálhatunk. Egy ilyen kiméra ellenanyag a teljes nemhumán donor antitest V_H és V_L szakaszokat tartalmazza, mindkét lánc esetén a humán lg konstans szakaszokkal társítva.

Egy humán ellenanyagból származó nehéz lánc variábilis szakasz homológ keretszakaszait számítógépes adatbázisok, például a KÁBÁT® adatbázis alkalmazásával azonosítjuk, míg akceptor ellenanyagként egy, a BC2-vel homológ humán ellenanyagot választunk. A humán ellenanyag keretszakaszokon belül a BC2 CDR-kódoló szakaszokat tartalmazó szintetikus nehéz lánc variábilis szakaszok szekvenciáit a restrikciós helyek beépítéséhez opcionális nukleotidhelyettesítéssel tervezzük. A tervezett szekvenciát ezt követően hosszú szintetikus oligomerek alkalmazásával szintetizáljuk. Alternatív módon a tervezett szekvenciát polimeráz-láncreakcióval (PCR) kiterjesztett (amplifikált) és korrigált átlapoló oligonukleotidokkal is szintetizálhatjuk. Hasonló módon egy alkalmas könnyű lánc variábilis szakaszt is megtervezhetünk.

Egy humanizált ellenanyagot származtathatunk a kiméra antitestből, illetve előnyösen szintetikus úton állíthatjuk elő, amelynek során a donor monoklonális ellenanyagnak a nehéz és könnyű láncokból származó CDR-kódoló szakaszait megfelelő módon a kiválasztott nehéz és könnyű lánc keretbe inszertáljuk. Egy másik megoldás értelmében egy találmány szerinti humanizált ellenanyagot standard mutagenezis technikák alkalmazásával állíthatunk elő. A kapott humanizált ellenanyag humán keretszakaszokat és donor monoklonális ellenanyag CDR-kódoló szakaszokat tartalmaz. Az így nyert humanizált ellenanyag rekombináns gazdasejtekben, például COS, CHO vagy myelomasejtekben expresszálható. Ennek a technikának az alkalmazásával más humanizált ellenanyagokat is előállíthatunk egyéb alkalmas IX-faktor-specifikus vagy más koagulációsfaktor-specifikus, önkorlátozó, neutralizáló, nagy affinitású, nemhumán ellenanyagokon.

Egy hagyományos expressziós vektort vagy rekombináns plazmidot úgy állítunk elő, hogy ezeket a módosított ellenanyag számára szolgáló kódolószekvenciákat működőképes kapcsolatba hozzuk a gazdasejtben történő replikádé és expresszió, illetve a gazdasejtből történő szekréció szabályozására alkalmas hagyományos regulátor kontrollszekvenciákkal. A regulátorszekvenciák promoterszekvenciákat, például CMV promotert, és szignálszekvenciákat tartalmaznak, amelyek más ismert ellenanyagokból is származhatnak. Hasonló módon állíthatunk elő egy olyan második expressziós vektort is, amely egy komplementer antitest könnyű vagy nehéz láncot kódoló DNS-szekvenciával rendelkezik. Előnyösen ez a második expressziós vektor azonos az elsővel, kivéve azt, hogy a kódolószekvenciák és a választható markerek olyanok, amelyek a lehető legjobban biztosítják, hogy valamennyi polipeptidlánc funkcionálisan expresszálódjon. Egy másik

HU 225 903 Β1 megoldás értelmében a módosított ellenanyag számára szolgáló nehéz és könnyű lánc kódolószekvenciák egyetlen vektoron helyezkedhetnek el.

Egy kiválasztott gazdasejtet hagyományos technikák útján az első és a második vektorral kotranszfektáljuk (vagy egyszerűen egyetlen vektorral transzfektáljuk), és így kialakítjuk az olyan találmány szerinti transzfektált gazdasejtet, amely a rekombináns vagy szintetikus könnyű és nehéz láncok mindegyikét tartalmazza. A találmány szerinti szerkesztett antitest termeléséhez ezt követően a transzfektált sejtet szokásos technikák alkalmazásával tenyésztjük. A rekombináns nehéz lánc és/vagy könnyű lánc asszociátumát tartalmazó humanizált ellenanyagot megfelelő vizsgálati módszerek, például ELISA vagy RIA alkalmazásával a tenyészetből szkríneljük. Hasonló szokásos technikákat alkalmazhatunk más találmány szerinti módosított ellenanyagok és molekulák előállításához is.

A találmány szerinti eljárásokban és a találmány szerinti kompozíciók konstrukciójához alkalmazott klónozási és szubklónozási lépések szempontjából alkalmas vektorokat az ezen a területen jártas szakember egyszerűen ki tudja választani. Például a klónozóvektorok hagyományos pUC sorozatait használhatjuk. Az egyik alkalmazott vektor a pUC19, amelyet többféle kereskedelmi forrásból [például Amersham vagy Pharmacia] is beszerezhetünk. Ezenkívül a klónozáshoz bármely olyan vektort felhasználhatunk, amely alkalmas a könnyű replikációra, nagyszámú klónozóhellyel és (például az antibiotikumrezisztencia szempontjából) számos szelektálható génnel rendelkezik, továbbá amely egyszerűen manipulálható. A klónozóvektor megválasztása nem korlátozza a találmány oltalmi körét, illetve terjedelmét.

A találmány szerinti szerkesztett ellenanyagok expressziójához alkalmazott vektorokat az ezen a területen jártas szakember hasonló módon ki tudja választani bármely hagyományos vektorból. A vektorok ugyancsak tartalmaznak olyan szelektált regulátor szekvenciákat (például CMV promotereket), amelyek a szelektált gazdasejtekben irányítják a heterológ DNS-szekvenciák replikációját és expresszióját. A vektorok tartalmazzák azokat a fentiekben ismertetett DNS-szekvenciákat is, amelyek a szerkesztett ellenanyagot vagy a módosított immunglobulin kódoló szakaszt kódolják. Ezenkívül a vektorokba az egyszerű manipulációhoz szükséges restrikciós helyek inszerciójával módosított szelektált immunglobulin szekvenciák is beépíthetők.

Az expresszíós vektorok a heterológ DNS-szekvenciák expressziójának felerősítésére (amplifikálására) alkalmas génekkel is jellemezhetők, amilyen például az emlős dihidrofolát reduktáz gén (DHFR). A további előnyös vektor szekvenciák közé tartozik egy poli-A szignálszekvencia, például egy borjú növekedési hormonból (BGH) származó poli-A szignálszekvencia, valamint a bétaglobin promoter szekvencia (betaglopro). A találmány szerinti megoldásban felhasználható expressziós vektorokat az ezen a területen jártas szakember számára jól ismert technikák alkalmazásával szintetizálhatjuk.

Az ilyen vektorok komponenseit, például replikonjait, szelekciós génjeit, hatásfokozóit, promotereit, szignálszekvenciáit stb. a kereskedelemből szerezhetjük be vagy természetes forrásokból nyerhetjük, illetve a rekombináns DNS-nek egy kiválasztott gazdaszervezetben történő termelése során az expresszió és/vagy a szekréció irányítására alkalmazott ismert eljárások útján szintetizálhatjuk. Erre a célra számos más, az emlős, bakteriális, rovar, élesztő és fungalis expresszió számára alkalmas, a szakterületen jól ismert expressziós vektort is választhatunk.

Ugyancsak jelen találmány tárgyát képezi egy, a szerkesztett ellenanyagoknak vagy ezek módosított immunglobulin-molekuláinak a kódolószekvenciáit tartalmazó rekombináns plazmiddal transzfektált sejtvonal. A klónozóvektorok klónozására és más manipulációira felhasználható gazdasejtek szintén szokásos sejtek. Legelőnyösebben azonban különféle Escherichia coli törzsekből származó sejteket használunk a klónozóvektorok replikációjára és a találmány szerinti módosított ellenanyagok összeállításának további lépéseiben.

A találmány szerinti szerkesztett ellenanyag vagy módosított ellenanyag expresszálására szolgáló alkalmas gazdasejtek vagy sejtvonalak előnyösen emlőssejtek, például CHO, COS, fibroblasztsejtek (például 3T3 sejt) és myeloid sejtek, még előnyösebben egy CHO vagy egy myeloid sejt. Humán sejteket is felhasználhatunk, és így a humán glikozilezési jellemzőkkel módosított molekulát állíthatjuk elő. Egy másik megoldás értelmében egyéb eukarióta sejtvonalakat is használhatunk. Az alkalmas emlősgazdasejtek kiválasztása, valamint a transzformációs, tenyésztési, amplifikálási, szkrínelési és termék-előállítási, illetve terméktisztítási eljárások a szakterületen jól ismertek [lásd például: Sambrook ef al., supra],

A bakteriális sejtek jól használható, a találmány szerinti rekombináns Fab-ok expresszálására alkalmas gazdasejtek lehetnek [lásd például: Plückthun, A., Immunoi. Rév., 130, 151-188 (1992)]. Azonban tekintettel arra, hogy a bakteriális sejtekben expresszált proteinek igen hajlamosak arra, hogy redőzetlen vagy nem kellőképpen redőzött formában, illetve nem glikozilezett formában jelenjenek meg, valamennyi bakteriális sejtben termelt rekombináns Fab esetén meg kell vizsgálni, hogy a rekombináns Fab megtartotta-e az ellenanyagkötő képességét. Amennyiben a bakteriális sejt által expresszált molekula megfelelően redőzött formában termelődött, a bakteriális sejt alkalmas a gazdasejtként történő felhasználásra. Például a biotechnológia területén különféle Escherichia coli törzsek jól ismert expresszíós gazdasejtek. Az eljárásban különféle B. subtilis, Straptomyces, más bacillus stb. törzseket is felhasználhatunk.

Kívánt esetben gazdasejtekként az ezen a területen jártas szakember számára jól ismert élesztőtörzsek sejtjeit, valamint rovarsejteket, például Drosophila és Lepidoptera sejteket, illetve víruseredetű expresszíós rendszereket is alkalmazhatunk [lásd például: Miller et al., Genetic Engineering, 8, 277-298 (1986) Plenum

HU 225 903 Β1

Press, valamint a közleményben szereplő hivatkozások],

A találmány szerinti vektorok összeállítására szolgáló általános eljárások, a találmány szerinti gazdasejtek előállításához szükséges transzfekciós eljárások, valamint a találmány szerinti módosított ellenanyagoknak az ilyen gazdasejtekből történő előállításához szükséges eljárások kivétel nélkül hagyományosan alkalmazott technikák. Az ily módon előállított találmány szerinti módosított ellenanyagokat hasonló módon, a szakterületen alkalmazott standardmódszereknek megfelelően tisztíthatjuk a sejttenyészet-tartalomból, amelyek során például ammónium-szulfátos kicsapást, affinitáskromatográfiás oszlopokat, oszlopkromatográfiát, gélelektroforézist és más ezekhez hasonló eszközöket használhatunk. Ezek a módszerek a szakember ismeretanyagának részét képezik, a találmány oltalmi körét, illetve terjedelmét nem korlátozzák.

A humanizált ellenanyagok expresszálásának egy további eljárása során az expresszió egy transzgenikus állatban történik, például annak megfelelően, ahogyan az a 4 873 316 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban ismertetésre került. Az eljárás egy, az állat kazein promoterét felhasználó olyan expressziós rendszerre vonatkozik, amelyet ha transzgenikus úton beépítünk egy emlősbe, lehetővé teszi, hogy a nőstény az anyatejében termelje a kívánt rekombináns proteint.

Az előnyös eljárással expresszált szerkesztett ellenanyagot egy megfelelő teszt alkalmazásával vizsgálhatjuk az in vitro aktivitásra nézve. A szerkesztett ellenanyag IX faktorhoz vagy más megfelelő koagulációs faktorhoz történő kötődésének minőségi és mennyiségi értékeléséhez általában szokásos ELISA vizsgálatokat használunk. A neutralizálóhatékonyság igazolásához ezenkívül más in vitro teszteket is alkalmazhatunk, majd ezt követően humán klinikai vizsgálatokat végezhetünk annak értékelése érdekében, hogy a testben a szokásos clearance mechanizmusok mellett milyen mértékű a szerkesztett antitest perzisztenciája.

A variábilis szakasz keretek kisebb módosításaival anélkül növelhető jelentősen az ellenanyagkötés, hogy közben észrevehetően növekedne a recipiensnél az immunogenicitás. Az ilyen szerkesztett ellenanyagokkal hatékonyan kezelhetők ember esetén a koagulácíós faktorok által médiáit állapotok. Ezeket az ellenanyagokat emellett felhasználhatjuk az említett állapotok diagnosztizálására is.

Egy másik megoldás értelmében a gyógyszerkészítményben antikoagulációs faktor monoklonális ellenanyaggal kombinálva acetil-szalicilsavat is alkalmazunk. Néhány esetben a kombináció révén csökkenteni lehet az antikoagulációs faktor monoklonális ellenanyag terápiásán hatékony dózisát.

A találmány szerinti molekulák alkalmazásával indukált terápiás válaszreakciót a molekuláknak a megfelelő koagulációs faktorhoz történő hozzákötődése, majd a koagulációs kaszkádnak az ezt követő önkorlátozó gátlása hozza létre. A gyógyászati felhasználásra szolgáló megfelelő preparátumok és készítmények formájában lévő találmány szerinti molekulák igen előnyösen alkalmazhatók az abnormális alvadási aktivitásra hajlamos vagy abnormális alvadási aktivitású személyek esetén. Az abnormális véralvadási aktivitás például a következő patológiás állapotokhoz vezethet és/vagy a következő patológiás állapotokból vagy kezelésekből származhat: infarctus myocardii, instabil angina, atrialis fibrillatio, síroké, vesekárosodás, pulmonalis embolismus, mélyvénás trombózis, valamint mesterséges szervek és protézisimplantátumok.

A találmány szerinti módosított ellenanyagokat, ellenanyagokat és ezek fragmenseit más olyan ellenanyagokkal, különösen humán monoklonális ellenanyagokkal együtt is felhasználhatjuk, amelyek a szerkesztett ellenanyag által megcélzott állapotért felelős egyéb markerekkel (epitopokkal) szemben reaktívak.

Az abnormális véralvadási állapotok kezelésére a találmány szerinti terápiás anyagokat körülbelül egy naptól körülbelül három héten keresztül, illetve szükség szerint alkalmazhatjuk. Ez lényeges előnyt jelent a jelenleg alkalmazott antikoagulánsokhoz, azaz a heparinhoz és a walfarinhoz képest. A találmány szerinti molekuláknak a humán vérkeringésben tapasztalt relatív tartózkodási idejétől függő kezelési dózist és időtartamot az ezen a területen jártas szakember a kezelendő állapot és a beteg általános egészségi állapotának a figyelembevételével állíthatja be.

A találmány szerinti terápiás anyag beadási módjaként bármely olyan utat alkalmazhatunk, amely alkalmas arra, hogy a szert eljuttassa a gazdaszervezethez. A találmány szerinti módosított ellenanyagok, ellenanyagok, szerkesztett ellenanyagok és ezek fragmensei, valamint a találmány szerinti gyógyszerkészítmények különösen parenteralis, például szubkután, intramuszkuláris, intravénás vagy intranasalis beadásra alkalmasak.

A találmány szerinti terápiás anyagokat olyan gyógyszerkészítményekké formálhatjuk, amelyek egy gyógyászatilag elfogadható hordozóban hatóanyagként a találmány szerinti szerkesztett (például humanizált) ellenanyag hatásos mennyiségét tartalmazzák. Egy másik megoldás értelmében a találmány szerinti gyógyszerkészítmények acetil-szalicilsavat is tartalmazhatnak. A találmány szerinti profilaktikus szer előnyösen egy injekciós beadásra kész, a szerkesztett ellenanyagot tartalmazó, előnyösen fiziológiás pH-η puffereit vizes szuszpenzió vagy oldat. A parenterális beadásra szolgáló kompozíciók szokásosan a találmány szerinti szerkesztett ellenanyagnak vagy koktéljának egy gyógyászatilag elfogadható hordozóval, előnyösen egy vizes hordozóval készített oldatából állnak. Különféle vizes hordozókat, például 0,4%-os vizes nátriumklorid-oldatot, 0,3%-os vizes glicinoldatot stb. alkalmazhatunk. Az oldatok sterilek és szemcsés anyagtól általában mentesek. Az oldatokat hagyományos, jól ismert sterilezési módszerekkel (például szűréssel) sterilezhetjük. A kompozíciók gyógyászatilag elfogadható segédanyagokat, például a megfelelő fiziológiás körülményekhez szükséges anyagokat, így pH-beállító és pufferanyagokat is tartalmazhatnak. A gyógyszerké9

HU 225 903 Β1 szítményekben a találmány szerinti ellenanyag koncentrációja széles határok között változhat. A választott konkrét beadási módtól függően, figyelembe véve a folyadék térfogatát, viszkozitását stb., a hatóanyagkoncentrációja például 0,5 tömeg%-nál kisebb értékű is lehet, de szokásosan legalább körülbelül 1 tömeg%-tól 15-20 tömeg%-ig terjed.

Például egy intramuszkuláris injekció céljára szolgáló találmány szerinti gyógyszerkészítményt 1 ml steril, puffereit vízből, valamint körülbelül 1 ng és körülbelül 100 mg, például körülbelül 50 ng és körülbelül 30 mg vagy még előnyösebben körülbelül 5 mg és körülbelül 25 mg közötti mennyiségű találmány szerinti szerkesztett ellenanyagból állíthatunk elő. Hasonló módon egy intravénás infúzióra szolgáló találmány szerinti gyógyszerkészítményt körülbelül 250 ml Ringer-oldatból, valamint körülbelül 1 mg és körülbelül 30 mg, előnyösen körülbelül 5 mg és körülbelül 25 mg közötti mennyiségű találmány szerinti szerkesztett ellenanyagból állíthatunk elő. A parenterális úton beadható gyógyszerkészítmények jelenleg alkalmazott előállítási eljárásai jól ismertek, illetve az ezen a területen jártas szakember számára könnyen hozzáférhetők. Az ilyen eljárások részletes ismertetésre kerültek például a következő szakkönyvben: Remington’s Pharmaceutical Science, 15th ed., Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania, USA.

A találmány szerinti terápiás hatóanyag - ha gyógyszerkészítménnyé formált - előnyösen egységdózisformákban van. A megfelelő, terápiásán hatásos dózist az ezen a területen jártas szakember könnyen meg tudja határozni. Ember vagy állat trombotikus vagy embolikus rendellenességének hatásos kezeléséhez 70 kg-os testtömeg esetén dózisonként egy találmány szerinti protein vagy ellenanyag körülbelül 0,1 mg és körülbelül 20 mg közötti mennyiségét kell parenterális, előnyösen intravénás vagy intramuszkuláris úton beadni. Az ilyen dózist szükség esetén meghatározott időintervallumokban ismételten be lehet adni; a megismételt beadások gyakoriságát és idejét a kezelőorvos a trombotikus válaszreakciók figyelembevételével határozza meg.

A jelen leírásban ismertetett ellenanyagokat, módosított ellenanyagokat vagy ezek fragmenseit tárolási céllal liofilizálhatjuk, majd közvetlenül a felhasználás előtt egy alkalmas hordozóban helyreállíthatjuk. Ez a technika a hagyományos immunglobulinok esetén a korábbiakban már hatékonynak bizonyult. A liofilizáláshoz és a rekonstitúcióhoz a szakterületen ismert eljárásokat alkalmazhatunk.

Az alábbi példák a találmány oltalmi körét, illetve terjedelmét nem korlátozzák.

1. példa anti-IX faktor monoklonális ellenanyagok előállítása és szkrínelése

Nőstény Balb/C egerekbe Jenny módszerével [Jenny, R. et al., Prep. Biochem., 16, 227-245 (1986)] tisztított humán IX faktort injekcióztunk. Valamennyi egér kezdeti injekcióként egy 100 pg proteinből,

0,15 ml foszfátpufferelt fiziológiás sóoldatból (PBS) és 0,15 ml komplett Freund-féle adjuvánsból álló oldatot kapott. Ezt követően az egereket 2-3 hónapon keresztül kéthetente egy 50 pg proteinből, 0,15 ml PBS-ből és 0,15 ml inkomplett Freund-féle adjuvánsból álló oldattal végzett immunizációs booster (emlékeztető)-oltással kezeltük. Az utolsó emlékeztetőoltást követően, három nappal a lép/myeloma sejtfúziók előtt az egér 50 pg IX faktor PBS-sel készített oldatát kapta. Egy immunizált egérből lépsejteket izoláltunk, majd a lépsejteket polietilénglikol alkalmazásával, ismert módon (Oi, V. T. et al., „Selected Methods in Cellular Immunology”, Mishell, B. B. and Shigii, S. M., eds., Freeman Press, San Fransisco, USA) NS-1 myelomasejtekkel kapcsoltuk. A fúziót követően a sejteket 10% magzati borjúszérumot tartalmazó RPMI 1640 médiumban szuszpendáltuk, majd a szuszpenzió részleteit négy darab 24 vájatú, vájatonként 0,5 ml peritonealis dialízis sejtkondicionált médiumot tartalmazó lemez vájataiba helyeztük. A következő napon valamennyi vájathoz hozzáadtunk 1,0 ml 2Ί0^-4 M hipoxantint, 8-10^-7 M aminopterint és 3,2Ί Ο^-5 M timidint tartalmazó, 10% magzatiborjúszérum-tartalmú RPMI 1640 médiummal készített oldatot. A sejtekről 3-4 naponként eltávolítottuk a médium felét, majd az eltávolított médiumot 1 10^-4 M hipoxantint és 1,6-10^-5 M timidint tartalmazó friss médiummal helyettesítettük.

Körülbelül két héttel később valamennyi vájatból kivettünk 1,0 ml hibridoma médiumot, amelyet ELISA vizsgálat [Jenny, R. J. ef al., Meth. Enzymol., 222, 400-416 (1993)] alkalmazásával az anti-IX-faktor ellenanyagokra nézve teszteltünk. Ennek során a IX faktort egy 96 vájatú mikrotiterlemez műanyag vájatain rögzítettük. Ezt követően tisztított ellenanyag hibridoma felülúszókat vagy hígításokat inkubáltunk a vájatokbán. A vájatokat mostuk, majd torma-peroxidázhoz konjugált kecske rágcsálóellenes immunglobulin második ellenanyaggal és o-dianizidin kromogén szubsztráttai detektáltuk az antitest-antigén komplexek jelenlétét.

Az anti-IX-faktor ellenanyagokat tartalmazó vájatokat korlátozott hígítással szubklónoztuk, majd 96 vájatú lemezeken növesztettük. A klónozott hibridoma sejttenyészetekről nyert felülúszót a fentiekben ismertetett ELISA vizsgálattal a IX faktorhoz kapcsolódó antitestre nézve szkríneltük, ezt követően a pozitív hibridomákból nyert sejteket meghígítottuk, lefagyasztottuk, cseppfolyós nitrogénben tároltuk, majd asciticus tumorokként egerekben növesztettük.

2. példa

Az antikoagulációs faktor ellenanyagoknak a koagulációban kifejtett önkorlátozó hatása Az antikoagulációs faktor ellenanyagok növekvő koncentrációinak a humán plazma aktivált parciális tromboplasztin idejére (aPTT) kifejtett hatását egy fibrométerben (Becton-Dickinson Microbiology Systems, Cockeysville, Maryland, Amerikai Egyesült Államok), az LIB0293-J Baxter-referenciaszámú eljárás 3/93 revíziójának (Baxter Scientific, Edison, New Jersey, Amerikai Egyesült Államok) megfelelően határoztuk meg.

HU 225 903 Β1

A kísérlet megkezdése előtt egy 2-3 ml 0,02 M kalcium-klorid-oldatot tartalmazó 5 ml-es csövet helyeztünk a fibrométer melegítőkamrájába. A humánplazmamintákat vagy frissen vettük le és jégen tartottuk, vagy pedig Hemostasis Reference Plasmából (American Diagnostics, Greenwich, Connecticut, Amerikai Egyesült Államok) állítottuk helyre.

Sertés-bélnyálkahártyából nyert frakcionálatlan heparinból (Sigma Chemical, St. Louis, Missouri, Amerikai Egyesült Államok), sertés-bélnyálkahártyából nyert kis molekulatömegű heparinból (Lovenox®, enoxaparin-nátrium, Rhone-Poulenc Rorer Pharmaceuticals, Collageville, Pennsylvania, Amerikai Egyesült Államok) vagy monoklonális ellenanyag antikoagulánsokból körülbelül 50 μΜ törzsoldatokat, majd ezekből közvetlenül a tesztplazmákba sorozathígításokat készítettünk, összehasonlítóként antikoaguláns nélküli, csak plazmát tartalmazó mintákat alkalmaztunk.

Két fibroTube® fibrométerpohárba 100 μΙ tesztplazmát vagy 100 μΙ antikoagulánst tartalmazó tesztplazmát és 125 μΙ aktin aktivált cefaloplasztin reagenst [aktin reagena; nyúlagyból nyert kefalin ellagsavban (Baxter Scientific, Edison, New Jersey, Amerikai Egyesült Államok)] töltöttünk, majd a poharakat a fibrométer 37 °C hőmérsékletű vájataiba helyeztük.

Egy perccel később egy plazmatartalmú pohárba 100 μΙ aktív reagenst adtunk, majd pipettával összekevertük a pohár tartalmát. Háromperces inkubálás után egy Automatic Pipette/Timer-trigger (Becton-Dickinson Microbiology Systems, Cockeysville, Maryland, Amerikai Egyesült Államok) berendezés alkalmazásával 100 μΙ, előzetesen 37 °C hőmérsékletre melegített kalcium-klorid-oldatot adtunk a palzma/aktin reagens keverékhez. Feljegyeztük az alvadási időket, majd az eredményeket az 1. ábrán összegeztük, ahol az alvadási időket a 300 μΙ-es teljes vizsgálati térfogatban lévő antikoagulánskoncentrációk függvényében ábrázoltuk. A vizsgálatban a IX faktor névleges koncentrációja 30-40 nM.

Az 1. ábrán látható eredmények azt bizonyítják, hogy a BC1 és BC2 rágcsáló anti-IX-faktor monoklonális ellenanyagok növekvő koncentrációi befolyásolják az aPTT alvadási időket. Mindkét monoklonális ellenanyag az aPTT megnyújtásával gátolja az alvadást, és mindkét monoklonális ellenanyagnak az aPTT-re gyakorolt hatása végül egy telítési értéket ér el. Az IC₅₀-értékek hasonlóak (BC1 esetén körülbelül 35 nM, míg a BC2 esetén körülbelül 50 nM az IC₅₀-értéke), azonban a két ellenanyagra adott maximális válaszreakciók jelentősen eltérnek egymástól. A BC1 telítési koncentrációja körülbelül 50%-kal, hozzávetőleg 40 másodpercre növeli az aPTT értékét. A BC2 viszont körülbelül 3,5szeresen, hozzávetőleg 90 másodpercre növeli az aPTT értékét. A heparinnal végzett antikoagulánsterápiában alkalmazott terápiás targetzónát besötétítettük az ábrán. Az eredmények azt jelzik, hogy a két monoklonális ellenanyag két oldalról határolja a heparin terápiás aPTT tartományt.

A BC1 és a BC2 monoklonális ellenanyagok tulajdonságait az I. táblázatban összegezzük. Mindkét BC monoklonális ellenanyag felismeri a zimogént, a IX faktort, valamint az aktív proteáz IXa faktort, azonban csak a BC2 képes a zimogénaktivitás és a proteázaktivitás mindegyikének a gátlására. A BC1 és a BC2 keresztreakciót adott a Cynomolgus majom IX faktorral. Ezenkívül a BC2 a patkány IX faktorral is keresztreakciót adott.

/. táblázat

A IX antifaktor monoklonális ellenanyagok in vitro tulajdonságainak összefoglalása

	BC1	BC2
Köti a IX faktort	igen	igen
Köti a IXa faktort	igen	igen
Gátolja a IX->IXa átalakulást	nem	igen
Gátolja a IXa-aktivitást Xase komplexben	igen	igen
Kofaktorigény	nincs	kétértékű fémek Ca2+>Mn2+
(aPTTmax/aPPTnormál)-100%	150	350
IC50 (nM)	=35	=50
Species keresztreaktivitás	majom	patkány, majom
Izotípus	lgG1	lgG2a

A 2. ábrán látható eredmények azt bizonyítják, hogy az anti-IX-faktor 9E4(2)F4 és 11G4(1)B9 monoklonális ellenanyagok növekvő koncentrációi befolyásolják az aPTT alvadási időket. A vizsgálathoz a plazmát a normális koncentráció felére hígítottuk, amelynek eredményeként 45 másodperces kezdeti aPTT-értéket mértünk. Mindkét monoklonális ellenanyag az aPTT megnyújtásával gátolja az alvadást, és mindkét monoklonális ellenanyagnak az aPTT-re gyakorolt hatása végül egy telítési értéket ér el, A 9E4(2)F4 és a 11G4(1)B9 telítési koncentrációja megnöveli az aPTT értékét, a 9E4(2)F4 esetén körülbelül 90-100 másodpercre, míg a 11G4(1)B9 esetén körülbelül 80 másodpercre. Az eredmények azt mutatják, hogy a két monoklonális ellenanyag a heparin terápiás apTT tartomány felső határértékénél van.

A 3. ábrán látható eredmények azt bizonyítják, hogy az anti-X-faktor HFXLC (versus könnyű lánc epitop), HFXHC (versus nehéz lánc epitop), valamint az anti-XI-faktor HFXI monoklonális ellenanyagok növekvő koncentrációi befolyásolják az aPTT alvadási időket. Ezeket a monoklonális ellenanyagokat a következő helyről kaptuk: Enzyme Research Laboratories (South Bend, Indiana, Amerikai Egyesült Államok). A HFXLC és a HFXI monoklonális ellenanyag az aPTT megnyújtásával gátolja az alvadást, és mindkét monoklonális ellenanyagnak az aPTT-re gyakorolt hatása végül egy telítési értéket ér el. A HFXLC IC₅₀-értéke körülbelül 40 nM; a telítési koncentrációk körülbelül 60 másodpercre növelik az aPTT-t. A HFXI IC₅₀-értéke

HU 225 903 Β1 körülbelül 20 nM; a telítési koncentrációk körülbelül 100 másodpercre növelik az aPTT-t. Az eredmények azt jelzik, hogy a HFXLC a heparin terápiás aPTT tartományán belül van, míg a HFXI a heparin terápiás tartomány felső határértékébe esik. A HFXHC monoklonális ellenanyagnak nincs hatása az aPTT alvadási időkre.

A IXa faktor kofaktorának, azaz a Vili faktornak az ellenanyagjai esetén az aPTT önkorlátozó prolongációját is megfigyeltük. Például az SAF8C-IG antihumán VIII faktor ellenanyag (Affinity Biologicals, Inc.) körülbelül 65 másodperces maximumra növelte az aPTT-t. Az aPTT maximális prolongációjának félértékét körülbelül 100 nM ellenanyaggal értük el.

3. példa

A rágcsáló IX faktor monoklonális ellenanyagok hatékonysága patkány thrombus modellben Az anti-IX-faktor ellenanyagoknak az arterialis thrombosis megelőzésében kifejtett hatásának értékeléséhez a Schumacher által ismertetett patkány nyaki artéria trombózis modellt [Schumacher et al., J. Cardio. Pharm., 22, 526-533 (1993)] adaptáltuk. Ebben a modellben a nyaki artéria felületére felvitt vas(lll)-klorid-oldat által generált oxigéngyökökkel szegmentális sérülést okozunk a nyaki artéria endotheliumán.

A patkányokat pentobarbiton-nátriummal anesztetizáltuk, a jugularis vénát az intravénás injekciók számára, a bal femoralis artériát pedig a vérnyomás méréséhez és a pulzusszám megfigyeléséhez kanüllel láttuk el. A nyaki artériát aszeptikus körülmények között izoláltuk, amelynek során sebészeti úton metszést végeztünk a nyakon, majd a véráramlás méréséhez egy mágneses áramlásmérőt helyeztünk be. Egy stabilizációs periódust követően meghatároztuk a következő változók alapértékeit: a nyaki verőér áramlása, az arterialis nyomás, a pulzusszám, az aktivált parciális tromboplasztin idő (aPTT), valamint a protrombinidő (PT). Ezt követően egy előzetesen lemért, 50 tömeg%-os vizes vas(lIl)-klorid-oldatba merített Whatman szűrőpapírt helyeztünk 15 percre a nyaki artériára. A szűrőpapír alatti endothelialis sejtek teljes sérülése után a vas(lll)-klorid-oldatba merített szűrőpapírt eltávolítottuk, majd a kísérletet a teljes befejeződésig, 60 percen keresztül folytattuk. A kísérlet végén a carotidalis thrombust kivontuk a nyaki artériából és lemértük a tömegét.

Valamennyi szert 15 perccel a nyaki sérülés megindítása előtt adtuk be. A következő kezeléseket vizsgáltuk és hasonlítottuk össze a IX faktor BC2 antitesttel.

1. Heparin: 15, 30, 60 vagy 120 E/kg bolusz, majd 60 percen keresztül 0,5, 1, 2 vagy 4 E/kg/perc infúzió.

2. Acetil-szalicilsav (ASA, aszpirin): 5 mg/kg bolusz.

3. Anti-IX faktor BC2 monoklonális ellenanyag: 1, 3 vagy 6 mg/kg bolusz, majd 60 percen keresztül 0,3, 1 vagy 2 pg/kg/perc infúzió.

4. Heparin: 30 E/kg bolusz + 1 E/kg/perc + 5 mg/kg ASA.

5. Anti-IX faktor BC2 monoklonális ellenanyag: 1 mg/kg + 0,3 pg/kg/perc + 5 mg/kg ASA.

A 4. és 5. ábra az antikoaguláns/antitrombotikus kezelés összehasonlító farmakológiáját mutatja be.

A heparinnak, az ASA-nak és a IX faktor BC2 monoklonális ellenanyagnak az aPTT-re gyakorolt hatása a

4. ábrán, míg a PT-re gyakorolt hatása az 5. ábrán látható.

Az aPTT-t, a vérzési hajlam legfontosabb paraméterét használtuk elsődleges kritériumként a vizsgálatban alkalmazott antikoaguláns/antitrombotikus szerek hatékonyságának az értékeléséhez. A 4. ábrán látható eredmények azt mutatják, hogy az alvadási idő maximális prolongációja esetén az aPTT heparin általi dózisfüggő prolongációja a két nagyobb dózis esetén túllépi a teszt határértékét. Az acetil-szalicilsav önmagában nem növelte szignifikánsan az aPTT-t, viszont ha az acetil-szalicilsavat heparinnal kombináltuk, jelentős szinergetikus hatást figyeltünk meg. A IX faktor monoklonális ellenanyagok csak csekély hatást gyakoroltak az aPTT-re és még a legnagyobb dózis esetén sem lépték túl a klinikai gyakorlatban alkalmazott standard antikoaguláns határ háromszoros értékét. Leglényegesebb, hogy a IX faktor BC2 monoklonális ellenanyag kis dózisának acetil-szalicilsawal alkotott kombinációja nem változtatta meg az aPTT-t.

Az 5. ábrán látható adatok azt jelzik, hogy a heparin két nagyobb dózisa és az acetil-szalicilsav/heparin kombináció a PT-t is szignifikánsan megnöveli, azonban ez a hatás sem az önmagukban, sem pedig az acetil-szalicilsawal alkotott kombinációban alkalmazott IX faktor monoklonális ellenanyag dózisok esetén nem lép fel.

A 6. ábra a heparinnak, az acetil-szalicilsavnak és a IX faktor monoklonális ellenanyagnak a nyaki artéria elzáródására gyakorolt hatását mutatja be. Az eredmények azt jelzik, hogy a sérülésre adott válaszreakcióban a vivőanyaggal kezelt állatok mindegyikének esetén elzáródtak a nyaki artériák. A heparin dózisfüggően gátolta a nyaki artéria elzáródását. A legnagyobb dózis esetén a heparin teljesen megakadályozta a nyaki artéria elzáródását; ennél a dózisnál azonban nem lehetett koagulációt iniciálni. Az acetil-szalicilsav önmagában csak csekély hatást gyakorol a nyaki verőér elzáródására. Az acetil-szalicilsav heparinnal kombinálva sem akadályozta meg teljesen a nyaki verőér elzáródását. A IX faktor monoklonális ellenanyag a két nagyobb dózisnál, amelyeknek nincs a klinikailag kívánatos célon túli prolongált koagulációs hatása, tökéletesen blokkolta a nyakiverőér-elzáródást. A IX faktor monoklonális ellenanyag kisebb dózisa, ami önmagában nem adott biztonságos eredményt, acetil-szalicilsawal kombinálva tökéletesen gátolta a nyaki verőér elzáródását.

A 7. ábra a heparinnak, az acetil-szalicilsavnak és a IX faktor monoklonális ellenanyagnak a thrombus tömegére gyakorolt hatását mutatja be. A heparin dózisfüggően csökkenti a nyaki artériában lévő thrombus tömegét. Azonban a koaguláció tökéletes blokádja ellenére is találtunk valamennyi visszamaradt thrombust a nyaki artériában. Az acetil-szalicilsav önmagában vagy heparinnal (30 E/kg) kombinálva csak részleges hatást gyakorol a thrombus tömegére. A IX faktor dózisfüggően csökkenti a thrombus tömegét, és a nagy dózis látszólag teljesen megakadályozza a thrombusképző12

HU 225 903 Β1 elést. Az anti-IX-faktor monoklonális ellenanyag kis dózisának és acetil-szalicilsavnak a kombinációja a koagulációs paraméterek hátrányos befolyásolása nélkül tökéletesen megakadályozza a nyaki verőér elzáródását, illetve teljesen megakadályozza a thrombusképződést.

A patkány nyaki verőér trombózis modellel kapcsolatos vizsgálatok egyértelműen bizonyítják, hogy a IX faktor monoklonális ellenanyag hatékonyan alkalmazható a trombózis megelőzésére egy nagymértékben trombogén arterialis sérülés modellben. A leglényegesebb, hogy a IX faktor monoklonális ellenanyag az aPTT által meghatározott kívánt terápiás antikoaguláns target tartományán belül bizonyult hatékonynak. Ezenkívül a heparin, azaz a jelenlegi standard antikoaguláns, csak olyan dózisoknál ért el a IX faktor monoklonális ellenanyaggal összehasonlítható hatást, amely dózisok már súlyosan kockáztatják, hogy a koaguláció mértéke elérje azt a szintet, ahol koagulálhatatlan vér alakul ki. Érdekes módon az acetil-szalicilsawal és heparinnal együttesen végzett kezelés esetén megfigyelt potenciálást és szinergizmust tapasztaltuk abban az esetben is, amikor az acetil-szalicilsavat az anti-IX-faktor monoklonális ellenanyaggal együtt alkalmaztuk. Azonban a heparin/acetil-szalicilsav kombinációtól eltérően, amely az antitrombotikus és az antikoaguláns hatás mindegyikét potencírozza, a IX faktor monoklonális ellenanyag/acetil-szalicilsav kombináció az antitrombotikus hatékonyságot anélkül potencírozza, hogy az ex vivő véralvadási paraméterekre érdemi hatást gyakorolna, összefoglalva, az adatok azt mutatják, hogy a heparinhoz, az acetil-szalicilsavhoz vagy a heparín/acetil-szalicilsav kombinációhoz képest a IX faktor monoklonális ellenanyag lényegesen jobb antitrombotikus kapacitással rendelkezik.

4. példa

A patkány trombózis modell pásztázó eletronmikroszkópos vizsgálata

Csoportonként 3 minta esetén, a vas(lll)-klorid felvitele után 15 perccel patkány nyaki artéria szegmenseket vettünk egy színlelt módon kezelt, egy csak vas(lll)kloriddal, valamint egy vas(lll)-kloriddal és 6 mg/kg IX faktor ellenanyaggal kezelt csoportból. Az artériákat formaldehiddel átáramoltatva fixáltuk, majd a sérült terület előtt és után az artériákat lekötöttük. A rögzített artériákat dehidratáltuk, hexametil-diszilazánnal inkubáltuk, majd exszikkátorban szárítottuk. A megszárított artériákat hosszában felnyitottuk, pásztázó elektronmikroszkóp (Scanning Electron Microscopy; SEM) csonkokra helyeztük, majd aranyszórással bevontuk.

A színlelt módon kezelt artériák SEM vizsgálata lényegében normális, alig néhány vérlemezkét tartalmazó endotheliumot mutatott. Az endotheliumban néhány törés fordult elő, ami feltehetően a műtéti beavatkozás során bekövetkezett mechanikus sérülésnek a következménye; az ezek alatti alapmembránt egy vérlemezkeszőnyeg borította be. A színlelt módon kezelt patkányokban nem tapasztaltunk thrombusképzödésre utaló jeleket.

A vas(lll)-kloriddal kezelt artériák SEM vizsgálata nagy fali thrombusokat mutatott, amik a véredény átmérőjének nagy részét elzárták. A thrombusok aggregálódott vérlemezkékből, vörösvérsejtekből, valamint amorf és fibrilláris proteinszerű anyagból álltak. A proteinszerű anyag fibrinnek bizonyult. Az artériák endotheliumának legnagyobb részét a nagy thrombusok elfedték. Ahol látható volt, a vas(lll)-kloriddal kezelt régiót befedő endotheliumot nagyszámú rátapadt vérlemezke és amorf proteinszerű anyag borította.

A IX faktor ellenanyaggal is kezelt patkányokból származó, vas(lll)-kloriddal kezelt artériák SEM vizsgálata azt mutatta, hogy a véredények átmérője túlnyomórészt thrombusmentes. A vas(lll)-kloriddal kezelt régiót borító endothelium jelentősen károsodott, és néhány területet rátapadt vérlemezkék és vérlemezkeaggregátumok borítottak, de proteinszerű anyag nem vagy alig fordult elő.

5. példa

Az anti-IX-faktor BC2 monoklonális ellenanyag nehéz és könnyű lánc cDNS-ének szekvenciaanalízise

A teljes RNS-t TriReagent (Molecular Research Cebter, Inc., Cincinatti, Ohio, Amerikai Egyesült Államok) alkalmazásával, a gyártó által megadott használati utasításnak megfelelően tisztítottuk. Az RNS-t izopropil-alkohollal precipitáltuk, ezt követően 0,5% SDSben feloldottuk, majd 0,5 M nátrium-klorid-koncentrációra állítottuk be. Dynabeds Oligo (dT)₂₅ (Dynal A. S., Laké Success, New York, Amerikai Egyesült Államok) alkalmazásával, a gyártó által megadott használati utasításnak megfelelően poli A⁺ RNS-t izoláltunk. A poli A⁺ RNS-t lemostuk a gyöngyökről, majd TE pufferben szuszpendáltuk. Az RNS 12 részletét (100-100 ng) egy RT-PCR kittel (Boehringer Mannheim; katalógusszám; 1483-188), a gyártó utasításainak megfelelően, az indításhoz egy dT oligót alkalmazva reverz transzkripciónak vetettük alá. A nehéz lánc esetén a 6 RNS/DNS hibrid PCR amplifikációját 25 ciklusban egy rágcsáló lgG2a sarok primer (1. számú szekvencia) és egy nehéz lánc szignálszekvencia primer (2. számú szekvencia) alkalmazásával hajtottuk végre. A könnyű lánc esetén a 6 RNS/DNS hibrid PCR amplifikációját 25 ciklusban egy egér/patkány kappa primer (3. számú szekvencia) és egy degenerált könnyű lánc szignálszekvencia primer (4. számú szekvencia) alkalmazásával végeztük. A 12 amplifikáció nyert PCR-termékeket egyenként egy PCR2000 vektorhoz (TA cloning Kit; Invitrogen; katalógusszám: K2000-01) kapcsoltuk. A rekombináns kiónok kolóniáiból véletlenszerűen mintát vettünk, majd egy ismert alkalikus extrakciós eljárás [Bimbóim and Doly, Nucl. Acids Rés., 7, 1513 (1979)] alkalmazásával minipreparátumokat készítettünk. Az izolált plazmid DNS-t EcoRI alkalmazásával emésztettük, majd 0,8%-os agarózgélen analizáltuk. A nehéz lánc esetén megfelelő, körülbelül 700 bp értékű, valamint a könnyű lánc esetén megfelelő, körülbelül 700 bp értékű kétszálú cDNS inzertumok szekvenciáit a Sanger-módszernek egy módosított változa13

HU 225 903 Β1 tával határoztuk meg. A nehéz és könnyű láncok mind a 12 szekvenciájának összehasonlításával meghatároztunk egy azonos (konszenzusos) BC2 nehéz lánc változó szakasz szekvenciát (5. számú szekvencia), valamint egy azonos könnyű lánc változó szakasz szekvenciát (6. számú szekvencia).

A BC2 nehéz lánc változó szakasz cDNS-szekvenciaanalízise egy 121 tagú aminosavszekvenciát (7. számú szekvencia) kódoló, 363 nukleotidból álló leolvasható (open reading) részletet tárt fel. A nehéz lánc CDR1, és 3 szekvenciát - az előbbi sorrendnek megfelelően - a 8., 9. és 10. számú szekvencia mutatja be.

A BC2 könnyű lánc változó szakasz cDNS-szekvenciaanalízise egy 107 tagú aminosavszekvenciát (11. számú szekvencia) kódoló, 321 nukleotidból álló leolvasható részletet tárt fel. A könnyű lánc CDR1, 2 és szekvenciát - az előbbi sorrendnek megfelelően - a 12., 13. és 14. számú szekvencia mutatja be.

6. példa

Humanizált ellenanyagok

Hat humanizált ellenanyagot (SB 249413, SB 249415, SB 249416, SB 249417, SB 257731, SB 257732) terveztünk annak érdekében, hogy a fentiekben ismertetett rágcsáló-CDR-eket egy humán ellenanyag keretbe helyezhessük.

SB 249413

Az SB 249413 az F9HZHC 1-0 nehéz láncot és az F9HZLC 1-0 könnyű láncot tartalmazza. A szintetikus változó szakaszú humanizált F9HZHC 1-0 nehéz láncot a Kabat-adatbázisban Kabpro:Hhc10w jelöléssel azonosított RF-TS3OL immunglobulinból [Capra, J. D. et al., J. Clin. Invest., 86, 1320-1328 (1990)] nyert nehéz lánc első három keretszakaszának és a korábbiakban ismertetett BC2 nehéz lánc CDR-ek alkalmazásával állítottuk össze. A keretaminosavakban nem végeztünk olyan szubsztitúciót, amely befolyásolhatta volna a CDR-eket. Négy átlapoló szintetikus oligonukleotidot (15., 16., 17. és 18. számú szekvencia) állítottunk elő, amelyek temperálva (annealed) és kitágulva a CDR3-on átnyúló és azt magában foglaló nehéz lánc változó szakaszt reprezentáló aminosavakat kódolják (19. és 20. számú szekvencia). Ezt követően a szintetikus gént PCR-primerekkel (21. és 22. számú szekvencia) amplifikáltuk, pCR2000 vektorhoz (TA cloning Kit; Invitrogen; katalógusszám: K2000-01) kapcsoltuk és Spel, Kpnl restrikciós emésztésből izoláltuk. Előállítottunk egy, a „campath” szignálszekvenciát, ezen belül a változó szakasz első öt aminosavját kódoló második DNS-fragmenst (23. és 24. számú szekvencia), amelynek során egy humanizált anti-Respiratory Syncitial Vírus nehéz láncot (25. számú szekvencia) kódoló konstrukció megfelelő szakaszát két primerrel (26. és 27. számú szekvencia) PCR-amplifikáltuk, majd EcoRI és Spel restrikciós enzimmel emésztést végeztünk. Az így előállított két fragmenst egy olyan, EcoRI, Kpnl emésztett pFHZHC2-6pCD emlőssejt expressziós vektorhoz kapcsoltuk, amely tartalmazta a 4. humán konszenzusos keret és az lgG1 állandó szakasz további részeit. A vektor a WO 94/05690 számon közzétett nemzetközi szabadalmi bejelentésben ismertetett pFHZHC2-3pCD vektorhoz képest egyetlen aminosavmutációt tartalmazott. A 2. keret (49 csoport) utolsó csoportjában egy Ser->Ala mutációt végeztünk, amelynek során a pFHZHC2-3pCD vektort Xbal és EcoR5 enzimmel emésztettük, majd végrehajtottuk egy olyan linker inszercióját, amelyet két szintetikus oligonukleotidból (28. és 29. számú szekvencia) állítottunk elő. Az F9HZHC 1-0 inzertum szekvenciáját a 30. és 31. számú szekvencia mutatja be.

A szintetikus változó szakaszú humanizált F9HZLC 1-0 könnyű láncot a Kabat-adatbázisban Kabpro:Hkl318 jelöléssel azonosított LS8’CL immunglobulinból [Carmack et al., J. Exp. Med., 169, 1631-1643 (1989)] nyert könnyű lánc keretszakaszainak és a korábbiakban ismertetett BC2 könnyű lánc CDR-ek alkalmazásával állítottuk össze. A keretaminosavakban nem végeztünk olyan szubsztitúciót, amely befolyásolhatta volna a CDR-eket. Két átlapoló szintetikus oligonukleotidot (32. és 33. számú szekvencia) állítottunk elő, amelyek temperálva és kitágulva a könnyű lánc változó szakaszt reprezentáló aminosavakat kódolják (34. és 35. számú szekvencia). Ezt követően a szintetikus gént PCR-primerekkel (36. és 37. számú szekvencia) amplifikáltuk, pCR2000 vektorhoz (TA cloning Kit; Invitrogen; katalógusszám: K2000-01) kapcsoltuk és Seal, Sacll restrikciós emésztésből izoláltuk. Előállítottunk egy, a „campath” szignálszekvenciát, ezen belül a változó szakasz első két aminosavját kódoló második DNS-fragmenst (38. és 39. számú szekvencia), amelynek során egy humanizált anti-Respiratory Syncitial Vírus nehéz láncot (25. számú szekvencia) kódoló konstrukció megfelelő szakaszát a két primerrel (26. és 40. számú szekvencia) PCR-amplifikáltuk, majd EcoRI és Seal restrikciós enzimmel emésztést végeztünk. Az így előállított két fragmenst egy olyan, EcoRI, Sacll emésztett pFHzLC1-2pCN emlőssejt expressziós vektorhoz kapcsoltuk, amely tartalmazta a 4. humán konszenzusos keret és a kappa állandó szakasz további részeit. A vektor a WO 94/05690 számon közzétett nemzetközi szabadalmi bejelentésben ismertetett pFHZLC1-1pCN vektorhoz képest egyetlen aminosavmutációt tartalmazott. A 2. keretben egy Ser-»Pro mutációt végeztünk, amelynek során a pFHZLC1-1pCN vektort Smal és Kpnl enzimmel emésztettük, majd végrehajtottuk egy olyan linker inszercióját, amelyet két szintetikus oligonukleotidból (41. és 42. számú szekvencia) állítottunk elő. Az F9HZLC 1-0 inzertum szekvenciáját a 43. és 44. számú szekvencia mutatja be.

SB 249415

Az SB 249415 az F9HZHC 1-1 nehéz láncot és az F9HZLC 1-1 könnyű láncot tartalmazza. Ezek a nehéz- és könnyűlánc-konstrukciók az F9HZHC 1-0 nehéz láncon és az F9HZLC 1-0 könnyű láncon alapulnak, azonban ebben az esetben olyan keretaminosavszubsztitúciókkal rendelkeznek, amelyek befolyásolják a CDR-eket.

Az F9HZHC 1-1 három olyan keretaminosavszubsztitúcióval rendelkezik, ami befolyásolhatja a CDR-t. Két átlapoló szintetikus oligonukleotidot (45. és

HU 225 903 Β1

46. számú szekvencia) állítottunk elő, amelyek temperálva és kitágulva a módosított nehéz lánc változó szakasz módosított részét reprezentáló aminosavakat kódolják (47. és 48. számú szekvencia). Ezt követően a szintetikus gént PCR-primerekkel (49. és 50. számú szekvencia) amplifikáltuk, pCR2000 vektorhoz (TA cloning Kit; Invitrogen; katalógusszám: K2000-01) kapcsoltuk és EcoNI, Kpnl restrikciós emésztésből izoláltuk. Az így előállított fragmenst egy EcoNI, Kpnl emésztett F9HZHC1-0 vektorhoz (30. számú szekvencia) kapcsoltuk. Az F9HZHC1-1 inzertum szekvenciáját az 51. és 52. számú szekvencia mutatja be.

Az F9HZLC1-1 négy olyan keretaminosav-szubsztitúcióval rendelkezik, ami befolyásolhatja a CDR-t. Két szintetikus oligonukleotidot (53. és 54. számú szekvencia) állítottunk elő, amelyek temperálva Kpnl és SamHI kohéziós végekkel rendelkeznek és a könnyű lánc változó szakasz módosított részét reprezentáló aminosavakat kódolják (55. számú szekvencia). A F9HZLC 1-0 könnyű láncot (43. számú szekvencia) Kpnl és BanHI restrikciós enzimmel emésztettük, majd a szintetikus DNS-hez kapcsoltuk. Az F9HZLC 1-1 inzertum szekvenciáját az 56. és 57. számú szekvencia mutatja be.

SB 249416

Az SB 249416 a fentiekben ismertetett F9HZHC 1-1 nehéz láncot és az F9HZLC 1-2 könnyű láncot tartalmazza. A könnyülánc-konstrukció az F9HZLC 1-1 könnyű láncon alapul, azonban ebben az esetben egy további olyan keretaminosav-szubsztitúcióval rendelkezik, amely befolyásolhatja a CDR-t.

Két szintetikus oligonukleotidot (58. és 59. számú szekvencia) állítottunk elő, amelyek temperálva BamHI és Xbal kohéziós végekkel rendelkeznek és a könnyű lánc változó szakasz módosított részét reprezentáló aminosavakat kódolják (60. számú szekvencia). A F9HZLC 1-1 könnyű láncot (56. számú szekvencia) BamHI és Xbal restrikciós enzimmel emésztettük, majd a szintetikus DNS-hez kapcsoltuk. Az F9HZLC 1-2 inzertum szekvenciáját a 61. és 62. számú szekvencia mutatja be.

SB 249417

Az SB 249417 a fentiekben ismertetett F9HZHC 1-1 nehéz láncot (52. számú szekvencia) és az F9HZLC2-0 könnyű láncot tartalmazza. A szintetikus változó szakaszú humanizált F9HZLC2-0 könnyű láncot a Kabat-adatbázisban Kabpro:HKL111 jelöléssel azonosított REI immunglobulinból [Palm and Hílschmann, Z. Physiol. Chem., 354, 1651-1654 (1973)] nyert humán könnyű lánc keretszakaszainak és a korábbiakban ismertetett BC2 könnyű lánc CDR-ek alkalmazásával állítottuk össze, őt aminosav konszenzusos humán szubsztitúcióját vezettük be. Hat olyan keretaminosav rágcsáló szubsztitúciót hajtottunk végre, amelyek befolyásolhatják a PCR-t. Két átlapoló szintetikus oligonukleotidot (63. és 64. számú szekvencia) állítottunk elő, amelyek temperálva és kitágulva a könnyű lánc változó szakaszt reprezentáló aminosavakat kódolják (65. és 66. számú szekvencia). Ezt követően a szintetikus gént PCR-primerekkel (67. és 68. számú szekvencia) amplifikáltuk, pCR2000 vektorhoz (TA cloning Kit; Invitrogen; katalógusszám: K2000-01) kapcsoltuk és Seal, Sacll restrikciós emésztésből izoláltuk. Előállítottunk egy, a „campath” szignálszekvenciát, ezen belül a változó szakasz (38. számú szekvencia) első két aminosavját kódoló második DNS-fragmenst, amelynek során egy humanizált anti-Respiratory Syncitial Vírus nehéz láncot (25. számú szekvencia) kódoló konstrukció megfelelő szakaszát két primerrel (26. és 69. számú szekvencia) PCR-amplifikáltuk, majd EcoRI és Seal restrikciós enzimmel emésztést végeztünk. A két szintetikus oligonukleotid temperálásával (annealing) egy harmadik olyan DNS-fragmenst állítottunk elő, amely egy humán 4. keret maradékát (70. számú szekvencia) kódolja, valamint Sacll és Seal kohéziós végekkel rendelkezik. Az F9HZLC 1-0 könnyű láncot az EcoRI és Seal restrikciós enzimmel emésztettük, majd hozzákapcsoltuk a három DNS-fragmenshez. Az F9HZLC2-0 inzertum szekvenciáját a 73. és 74. számú szekvencia mutatja be.

SB 257731

Az SB 257731 az F9HZHC 1-1 nehéz láncot (52. számú szekvencia) és az F9HZLC 1-3 könnyű láncot tartalmazza, ahol az F9HZLC 1-3 könnyű lánc az F9HZLC 1-2-nek (62. számú szekvencia) egy egyetlen aminosavban eltérő mutációja. Az F9HZLC 1-2-t két primerrel (26. és 69. számú szekvencia) PCR-amplifikáltuk, majd EcoRI és Seal restrikciós enzimmel emésztést végeztünk. Egy 94 bp fragmenst (75. és 76. számú szekvencia) izoláltunk. A fragmenst az EcoRI, Seal emésztett F9HZLC 1-2 nehéz lánchoz kapcsoltuk, és így a F9HZLC 1-3 könnyű láncot nyertük. Az F9HZLC 1-3 inzertum szekvenciáját a 77. és 78. számú szekvencia mutatja be.

SB 257732

Az SB 257732 a szintetikus változó szakasz humanizált F9HZHC 3-0 nehéz láncot és az F9HZLC 3-0 könnyű láncot tartalmazza. Négy átlapoló szintetikus oligonukleotidot (79., 80., 81. és 82. számú szekvencia) állítottunk elő, amelyek temperálva (annealed) és kitágulva a megváltoztatott nehéz lánc változó szakaszt reprezentáló aminosavakat kódolják (83. és 84. számú szekvencia). Ezt követően a szintetikus gént PCR-primerekkel (85. és 86. számú szekvencia) amplifikáltuk, pCR2000 vektorhoz (TA cloning Kit; Invitrogen; katalógusszám: K2000-01) kapcsoltuk és Stul, Kpnl restrikciós emésztésből izoláltuk. Az izolált fragmentumot Síül, Kpnl emésztett F9HZHC1-1 vektorhoz kapcsoltuk (52. számú szekvencia). Az így nyert vektort a szignálszekvencia eltávolítása érdekében EcoRI, Spel enzimmel emésztettük. Előállítottunk egy, a „campath” szignálszekvenciát, ezen belül a változó szakasz első öt aminosavját kódoló DNS-fragmenst (23. számú szekvencia), amelynek során F9HZHC 1-0-t két primerrel (26. és 87. számú szekvencia) PCR-amplifikáltunk, majd EcoRI és Spel restrikciós enzimmel emésztést végeztünk. Az így előállított fragmenst a vektorhoz kapcsoltuk. Az F9HZHC3-0 inzertum szekvenciáját a 88. és 89. számú szekvencia mutatja be.

Négy átlapoló szintetikus oligonukleotidot (90., 91., 92. és 93. számú szekvencia) állítottunk elő, amelyek

HU 225 903 Β1 temperálva (annealed) és kitágulva a könnyű lánc változó szakaszt reprezentáló aminosavakat kódolják (94. és 95. számú szekvencia). Ezt követően a szintetikus gént PCR-primerekkel (96. és 97. számú szekvencia) amplifikáltuk, pCR2000 vektorhoz (TA cloning Kit; Invitrogen; katalógusszám; K2000-01) kapcsoltuk és Seal, Narí restrikciós emésztésből izoláltuk. Az izolált fragmenst Seal, Narí emésztett F9HZLC1-3 vektorhoz kapcsoltuk (77. számú szekvencia). Az F9HZLC3-0 inzertum szekvenciáját a 98. és 99. számú szekvencia mutatja be.

A humanizált anti-IX-faktor monoklonális ellenanyagokat CHO-sejtekben expresszáltuk. 37 °C hőmérsékletű, 5% szén-dioxid+95% levegő atmoszférájú, párásított inkubátorban lévő, 150 fordulat/perc sebességgel mozgatott Innova 2100 rázóasztalon (New Brunswick Scientific) elhelyezett 250 ml-es egyszer használatos Erlenmeyer-lombikokban (Corning) szérummentes médiumban történő szuszpenziós tenyésztéshez adaptált DG-44 sejtvonalat növesztettünk. A sejteket hetente kétszer 4-10⁵ sejt/ml sejtkoncentráció mellett átoltottuk. A pCN-Lc-könnyűlánc és a pCD-Hc-nehézlánc vektorok 15 pg-ját Nőtt enzimmel emésztve linearizáltuk, steril körülmények között koprecipitáltuk, majd 50 μΙ 1X TE pufferben (10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 7,5) szuszpendáltuk. A DNS-t Hensley módszerének [Hensley et al., J. Bioi. Chem., 269, 23 949-23 958 (1994)] megfelelően, Bio-Rad Gene Pulser (Bio-Rad Laboratories) alkalmazásával az Acc-098 sejtekbe elektroporáltuk. 1,2-10⁷ sejtet egyszer 12,5 ml jéghideg PBSucrose oldattal (PBS, 272 mM szacharóz, 7 mM nátrium-foszfát, pH 7,4, 1 mM magnézium-klorid) mostunk, a sejteket 0,8 ml PBS-ben szuszpendáltuk, ezt követően hozzáadtuk 50 pl DNS-oldathoz, majd a keveréket 15 percen keresztül jégen inkubáltuk. A sejteket 380 V feszültség és 25 pF elektromos kapacitás mellett pulzáltuk, majd 10 percen keresztül jégen inkubáltuk. A szelekciót megelőzően a sejteket fenntartómédiumban, 5-10⁵ sejt/vájat mennyiségben 24 órára 96 vájatú tenyésztőlemezekre helyeztük. A sejteket a fenntartómédiumban lévő 400 pg/ml koncentrációjú G418-cal (Geneticin, Life Technologies, Inc.) szembeni rezisztencia alapján szelektáltuk. A vizsgálat előtt 24 órával a sejteket 150 pl fenntartómédiummal fedtük be.

Az egyedi telepekről nyert kondicionált médiumot egy elektrokemilumíneszcenciás (ECL) detektálási módszerrel, Origen analizátoron (IGEN, Inc.) vizsgáltuk [lásd: Yang et al., Biotechnology, 12, 193-194 (1994)].

A vizsgálatok végrehajtásához szükséges oldatokat (vizsgálati puffereket), valamint a berendezés működéséhez szükséges oldatokat (sejttisztító oldatokat) az IGEN cégtől szereztük be. Az ellenanyagokat [antihumán IgG (g-lánc specifikus), Sigma Chemicals; és humán IgG (H+L) F(ab’)₂ fragmentum; Kirkegaard & Perry Laboratories Inc.] 7:1 TAG/protein mólarányban TAGNHS-észterrel jelöltük meg, míg a Protein A-t (Sigma) 20:1 biotín/protein mólarányban biotin-LC-szulfo-NHSészterrel (IGEN, Inc.) jelöltük meg; a jelölések mindegyikét az IGEN használati utasításainak megfelelően hajtottuk végre. A streptavidinbevonatú M-280 mágneses gyöngyöket a Dynaltól szereztük be.

Az immunvizsgálatot az alábbi protokoll alkalmazásával végeztük. Mintánként PBS-ben 600 pg/ml végkoncentrációra hígított, 1,25% Tweent tartalmazó (pH 7,8) 50 pl streptavidinbevonatú gyöngyöt összekevertünk 1 pg/ml végkoncentrációra hígított, 1,25% Tweent tartalmazó (pH 7,8) 50 pl biotin-Protein A-val, a keveréket keverés közben 15 percen keresztül szobahőmérsékleten inkubáltuk, ezt követően hozzáadtuk a TAG ellenanyagok [PBS-ben 1,25 pg/ml végkoncentrációra hígított humán IgG (H+L) F(ab’)₂ fragmens és PBS-ben 0,25 pg/ml végkoncentrációra hígított antihumán IgG (g-lánc-speciflkus)] keverékének 50 μΙ-ét, majd az oldatot hozzáadtuk 50 pl kondicionált médiumhoz és a keveréket egy órán keresztül keverés közben szobahőmérsékleten inkubáltuk. A reakciókeverékhez hozzáadtunk 200 pl vizsgálati puffért, majd az ECL méréshez a mintát az Origen I analizátoron elemeztük. Az eredmények azt mutatták, hogy körülbelül 150 ng/ml átlagos expresszió mellett a vizsgált telepek körülbelül 20-37%-a választott ki 15 ng/ml-nél több ellenanyagot.

A kondicionált médiumból egy Procep A befogó lépés, majd a DNS-terhelés csökkentése érdekében végzett ioncserés kromatográfia alkalmazásával tisztítottuk a humanizált anti-IX-faktor monoklonális ellenanyagokat. A Procep A szorbeálószerrel (Bioprocessing Ltd., Durham, Anglia) egy 1:1 arányú átmérő/magasság mérettel rendelkező oszlopot készítettünk. A derített kondicionált médiumokat körülbelül 150 cm/óra sebességgel töltöttük fel az oszlopra. Az oszlopot egymást követően foszfátpufferelt fiziológiás sóoldattal (PBS), 1 M nátrium-kloridot tartalmazó PBSsel és végül PBS-sel mostuk. A megkötött anyagot 0,1 M ecetsavoldattal végzett elúcióval nyertük ki. Az eluátum pH-ját 5,5-re állítottuk be, majd vízzel 1:4 térfogatarányú hígítást végeztünk. A hígított oldatot felvittük egy előzetesen 20 mM nátrium-acetát-oldattal 80 cm/óra sebesség mellett ekvilibrált, 2,5-13 cm-es S-Spepharose oszlopra. Az oszlopot a stabil alapvonal kialakulásáig az acetátpufferrel mostuk, majd a megkötött proteint 20 mM nátrium-foszfát-oldattal (pH 7,4) 25 cm/óra sebesség mellett eluáltuk. Az eluált anyagot 0,4 pm-es membránon szűrtük, majd 4 °C hőmérsékleten tároltuk.

7. példa

Egér-humán kiméra ellenanyag

100 ng BC2 RNS-t egy RT-PCR kittel (Boehringer Mannheim; katalógusszám: 1483-188), a gyártó utasításainak megfelelően, az indításhoz egy dT oligót alkalmazva reverz transzkripciónak vetettük alá, majd az Seal, Narl végekkel rendelkező BC2 könnyű lánc változó szakasz (102. és 103. számú szekvencia) előállításához szintetikus Seal (100. számú szekvencia) és Narí (101. számú szekvencia) primerekkel PCR amplifikációt hajtottunk végre. Ezt a DNS-t Seal, Narí emésztett F9HZHC1-3-hoz (77. számú szekvencia) kapcsoltuk, és így egy F9HCLC egér-humán kiméra könnyű láncot nyertünk (104. és 105. számú szekvencia).

100 ng BC2 RNS-t egy RT-PCR kittel (Boehringer Mannheim; katalógusszám: 1483-188), a gyártó utasí16

HU 225 903 Β1 fásainak megfelelően, az indításhoz egy dT oligót alkalmazva reverz transzkripciónak vetettük alá, majd az Spel, Nhet végekkel rendelkező BC2 nehéz lánc változó szakasz (108. és 109. számú szekvencia) előállításához szintetikus Spel (106. számú szekvencia) és Nhe\ (107. számú szekvencia) primerekkel PCR amplifikációt hajtottunk végre. A „campath” szignálszekvenciát az RSVHZ19 nehéz láncból (25. számú szekvencia) EcoRI (26. számú szekvencia) és Spel (87. számú szekvencia) primerekkel PCR-amplifikáltuk. Ezt a két DNS-fragmenst egy olyan, a WO 95/07301 számon közzétett nemzetközi szabadalmi bejelentésben ismertetett, EcoRI, Nhel emésztett IL4CHHCpcd vektorhoz kapcsoltuk, és így az IL4 változó szakaszt a BC2 IX faktor egér változó szakasszal helyettesítve egy egérhumán kiméra F9CHHC nehéz láncot állítottunk elő (110. és 111. számú szekvencia).

Az egér-humán kiméra chaFIX ellenanyagot a fentiekben a humanizált konstrukcióknál leírtaknak megfelelően kotranszfektáltuk és tisztítottuk.

8. példa

A humanizált IX faktor monoklonális ellenanyagok hatékonysága patkány thrombus modellben A humanizált anti-IX-faktor ellenanyagoknak az arterialis thrombosis megelőzésében kifejtett hatásának értékeléséhez a 3. példában ismertetett patkány nyaki artéria trombózis modellt alkalmaztuk. Meghatároztuk a következő változók alapértékeit.· a nyaki verőér áramlása, az arterialis nyomás, a pulzusszám, az ér nyitottsága, valamint az aktivált parciális tromboplasztin idő (aPTT). Tizenöt perccel később megkezdtük a nyaki verőér 10 percen keresztül végzett károsítását. A carotidalis thrombust kivontuk a nyaki artériából és lemértük a tömegét.

Valamennyi szert 15 perccel a nyaki sérülés megindítása előtt intravénásán adtuk be. A következő kezeléseket vizsgáltuk és hasonlítottuk össze az anti-IX-faktor BC2 ellenanyaggal.

1. Vivőanyag.

2. chaFIX: 3 mg/kg bolusz.

3. SB 249413: 3 mg/kg bolusz.

4. SB 249415: 3 mg/kg bolusz.

5. SB 249416: 3 mg/kg bolusz.

6. SB 249417: 3 mg/kg bolusz.

7. SB 257731: 3 mg/kg bolusz.

8. Heparin: 60 egység/kg bolusz+2 egység/kg/perc infúzió.

Az aPTT-t, a vérzési hajlam legfontosabb paraméterét használtuk elsődleges kritériumként a vizsgálatban alkalmazott antikoaguláns/antitrombotikus szerek hatékonyságának az értékeléséhez. A 8. ábrán látható eredmények azt mutatják, hogy a humanizált IX faktor SB 249413, SB 249415, SB 249416, SB 249417 és SB 257731 monoklonális antitest a klinikailag elfogadható tartományon belüli 3,0 mg/kg dózis mellett mérsékelt hatást gyakorol az aPTT értékére.

A IX faktor monoklonális ellenanyagoknak a thrombus tömegére gyakorolt hatását a 9. ábra mutatja be. Az eredmények azt jelzik, hogy a humanizált monoklonális ellenanyagok mindegyike azonos mértékben csökkenti a thrombus tömegét.

A patkány nyaki verőér trombózis modellel kapcsolatos vizsgálatok egyértelműen bizonyítják, hogy a humanizált IX faktor monoklonális ellenanyagok hatékonyan alkalmazhatók a trombózis megelőzésére egy nagymértékben trombogén arterialis sérülés modellben. A leglényegesebb, hogy a humanizált IX faktor monoklonális ellenanyagok az aPTT által meghatározott kívánt terápiás antikoaguláns target tartományán belül bizonyultak hatékonynak.

9. példa

Az ellenanyag biokémiai és biofizikai tulajdonságai

Az SB 249417 MALD-MS alkalmazásával meghatározott molekulatömege 148 000 Da volt. Ugyanezt azt értéket kaptuk az SB 249407 analitikai ultracentrifugálásával is. IX faktor és Ca²⁺ jelenlétében a BC2-ből származó ellenanyagok 248 000 Da értékkel szedimentálódtak, ami a monoklonális ellenanyag és két IX faktor molekula össztömegének felel meg. IX faktor jelenlétében vagy IX faktor nélkül nem figyeltünk meg magasabb rendű aggregációra utaló jeleket.

Az SB 249417-hez kötődő IX faktor kinetikáját egy immobilizált protein A felülethez kötött ellenanyaggal végzett BlAcore analízis útján értékeltük. Ennek során 49 nM koncentrációjú rekombináns humán IX faktort (rhFIX, Genetics Institute) használtunk, és a méréseket 5 mM Ca²⁺ jelenlétében hajtottuk végre. A kölcsönhatást gyors asszociáció (kass=2,0-10⁵ M^-1s^_1) és viszonylag lassú disszociáció (^-,88=4,1-10^-4 s^-1) jellemzi. A IX faktor kötés számított Kd-értéke 1,9 nM volt.

Az SB 249417 biofizikai jellemzőit az 1. táblázatban összegezzük.

1. táblázat

Az SB 249417 biofizikai tulajdonságainak összefoglalása

Izotípus	lgG1, kappa
Tisztaság (SDS-PAGE)	>95% (redukálókörülmények között)
Molekulatömeg tömegspektrometria analitikai ultracentrifugálás	148 000 Da 148 000 Da
AIX faktor kötés sztöchiometriája izotermikus titrálásos kalorimetria IX: 1 mól monoklonális antitest	1,5 mól faktor
AIX faktor kötési affinitása izotermikus titrálásos kalo- rimetria bioszenzor	Kd=4 nM (25 °C-on) Kd=2 nM
A IX faktor kötési kinetikája bioszenzor	kass=2,0-105 M-1s-1 kdiss=4,1-1(Hs-i

A 2. táblázat a találmány szerinti monoklonális ellenanyagok IX faktor kötési jellemzőit foglalja össze.

HU 225 903 Β1

A számított disszociációs állandók a kísérleti hibahatáron belül lényegében azonosak.

2. táblázat

Monoklonális ellenanyag	''áss (M-1s-1)	Kiiss (s-1)	Számított KD (nM)
SB 249417	2,0-105	4,1-10-»	1,9
BC2	4,8-105	9,1-10-*	1,9
Chf9	2,4-105	3,0-10-*	1,3
SB 249413	6,5-105	2,8-10-3	3,7-5,1
SB 249415	7,5-105	1,8-10-»	1,1-2,3
SB 249416	5,2-105	4,1-10-*	0,8
SB 257731	9,2-105	9,9-10-*	1,1
SB 257732	1,1-106	1,2-10-3	1,5

Az rhFIX, valamint az SB 249417, a BC2 és más humanizált konstrukciók közötti kölcsönhatást titrálásos mikrokalorimetriával jellemeztük, amely az oldatban lévő kötési kölcsönhatásokat a kötés belső hője alapján méri. A 2 μΜ SB 249417 monoklonális ellenanyagot tartalmazó kaloriméterbe kilencszer 106 μΜ FIX-et injektáltunk. Az első négy injektálás során a kötést exotermikus hőként detektáltuk. Az utolsó öt injektálásnál a monoklonális ellenanyag-kötőhelyek már FIX-szel telítettek voltak és csak a keverés háttérhőit figyeltük meg. Az eredmények azt jelzik, hogy az ekvivalenciapont - a vártnak megfelelően - 2:1 FlX/monoklonális antitest aránynál található. Az adatok nemlineáris legkisebb négyzetek analízisével nyertük a kötési affinitást.

A monoklonális ellenanyagok rhFIX affinitásokat 34 °C és 44 °C közötti hőmérséklet-tartományban, 10 mM kalcium-kloridot és 150 mM nátrium-kloridot tartalmazó 10 mM HEPES-ben (pH 7,4) mértük. A 37 °C-os affinitást közvetlenül meg tudtuk határozni, a 25 °C-os affinitást pedig a van't Hoff-egyenletből számítottuk ki. A 3. táblázatban látható adatok azt jelzik, hogy az SB 249417, a BC2 és más humanizált konstrukciók affinitása - a hibahatáron belül - azonos értékű.

3. táblázat

Anti-FIX monoklonális antitestek titrálásos kalorimetriás eredményei

Monoklonális ellenanyag (mAb)	Kd (nM) 25 °C-on	Kd (nM) 37 ’C-on	Moláris kötési arány FIX/mAb
BC2	10	20	1,4
SB 249413	6	12	1,9
SB 249415	3	7	1,7
SB 249417	4	12	1,5
SB 257732	4	9	1,8

A differenciálkalorlmetriás vizsgálat szerint az SB 249413, az SB 249415, az SB 249417 és az SB

257732 monoklonális ellenanyagok mindegyike nagyon hasonló termikus stabilitást mutat. A monoklonális ellenanyagok 70-75 °C közötti felbontási Tm értékei a termikus úton indukált denaturációval szembeni nagy stabilitásra utalnak.

10. példa

A IX faktor ellenanyag-mediált gátlásának mechanizmusa

Elkészítettük a homológ protein VII faktor keretéhez hozzákapcsolt IX faktor szekvenciákból álló kiméra konstrukciók könyvtárát, majd ezt a könyvtárat használtuk a IX faktor BC2 monoklonális ellenanyag esetén az epitop feltérképezésére [lásd: Cheung et al., Thromb. Rés., 80, 419-427 (1995)]. A kötést egy BIACore 2000 felületi plazmonrezonancia berendezés alkalmazásával mértük. A BC2 ellenanyagot az NHS/EDC reakcióval közvetlenül hozzákapcsoltuk a chiphez. A kötést az adott konstrukciók 0,15 M nátrium-kloridot és 5 mM kalcium-kloridot tartalmazó 25 mM MOPS (pH 7,4) oldattal készített 200 nM koncentrációjú oldataival, 20 μΙ/perc áramlási sebesség és 2 perces érintkezési idő mellett mértük. A disszociációt protein nélküli, egyéb vonatkozásban ugyanolyan pufferrel 3 percen keresztül vizsgáltuk. 50 mM EDTA jelenlétében nem detektáltunk kötést a vad típus esetén. Az adatokat a 4. táblázatban foglaljuk össze.

4. táblázat

A IX faktor konstrukciók BC2 acetonitrilhez történő kötődésének összegzése

Konstrukció	A kötés mértéke
IXa plazma	köti
r-IX	köti
VII plazma	nincs kötés
IX LC/VII HC	köti
IX-A/VII	köti
VII gla/IX	nincs kötés
VII-A/IX	nincs kötés
VII gla (IX 3- 11)/IX	köti
VII gla (IX 3—6)/)X	nagyon gyenge kötés
VII gla (IX 9-11)/)X	nagyon gyenge kötés
IXK5A	köti

Az adatok azt jelzik, hogy a következőket tartalmazó konstrukciók hozzákötődnek a BC2-höz: IX faktor könnyű lánc és VII faktor nehéz lánc (IX LC/VII HC); IX faktor gla és aromás domének (IX-A/VII); a VII faktor gla doménen belül lévő IX faktor gla dómén 3-11 csoportjai: és az 5 csoportnál lizin->alanin szubsztitúciót tartalmazó IX faktor (IX K5A). A VII gla (OX 3-11)/IX konstrukció a vad típusú IX faktorral (IXa plazma és r-IX) ekvivalens BC2 kötést mutatott. A BC2 antitest tehát a IX faktor gla dómén 3-11 csoportjaiban lévő epitophoz kötődik.

Claims (6)

1. Anti-IX-faktor monoklonális ellenanyag alkalmazása, trombotikus és embóliás társult megbetegedések kezelésére szolgáló gyógyszerkészítmények előállításához, ahol az ellenanyag a következők közül van választva:

SB249413 ellenanyag, ahol a nehéz lánc aminosavszekvenciája a 31. számú szekvenciavázlaton bemutatott aminosavszekvenciának felel meg, és a könnyű lánc aminosavszekvenciája a 44. számú szekvenciavázlaton bemutatott aminosavszekvenciának felel meg;

SB249415 ellenanyag, ahol a nehéz lánc aminosavszekvenciája az 52. számú szekvenciavázlaton bemutatott aminosavszekvenciának felel meg, és a könnyű lánc aminosavszekvenciája az 57. számú szekvenciavázlaton bemutatott aminosavszekvenciának felel meg;

SB249416 ellenanyag, ahol a nehéz lánc aminosavszekvenciája az 52. számú szekvenciavázlaton bemutatott aminosavszekvenciának felel meg, és a könnyű lánc aminosavszekvenciája a 62. számú szekvenciavázlaton bemutatott aminosavszekvenciának felel meg;

SB249417 ellenanyag, ahol a nehéz lánc aminosavszekvenciája az 52. számú szekvenciavázlaton bemutatott aminosavszekvenciának felel meg, és a könnyű lánc aminosavszekvenciája a 74. számú szekvenciavázlaton bemutatott aminosavszekvenciának felel meg;

30 SB257731 ellenanyag, ahol a nehéz lánc aminosavszekvenciája az 52. számú szekvenciavázlaton bemutatott aminosavszekvenciának felel meg, és a könnyű lánc aminosavszekvenciája a 78. számú szekvenciavázlaton bemutatott aminosavszekvenciának felel

35 meg;

SB257732 ellenanyag, ahol a nehéz lánc aminosavszekvenciája a 89. számú szekvenciavázlaton bemutatott aminosavszekvenciának felel meg, és a könnyű lánc aminosavszekvenciája a 99. számú szekvencia40 vázlaton bemutatott aminosavszekvenciának felel meg;

és az ellenanyag a IX-es faktor elleni önkorlátozó neutralizációs aktivitással rendelkezik.

2. Az 1. igénypont szerinti alkalmazás, ahol a tár45 sült megbetegedés trombózis infarctus myocardiival, instabil anginával, atrialis fibrillatióval, stroke-kal, vesekárosodással, pulmonalis embolismussal, mélyvénás trombózissal, percutan translumenalis coronaria angioplasticával, disseminált intravascularis alvadással,

50 szepszissel, mesterséges szervekkel, söntökkel vagy protézisekkel kapcsolatos.

3. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti alkalmazás, ahol az ellenanyag kiméra vagy humanizált.

4. Az 1. igénypont szerinti alkalmazás, ahol az el55 lenanyag F_v, Fab, Fab’, F(ab’)₂ közül van választva.

5. Nukleinsav alkalmazása, az 1-4. igénypontok bármelyike szerinti trombózissal vagy embóliával társult megbetegedések kezelésére szolgáló gyógyszerkészítmények előállításához, mely a következő cso60 portból választott monoklonális ellenanyagokat kódolja:

HU 225 903 Β1

SB249413 ellenanyag, ahol a nehéz lánc aminosavszekvenciája a 31. számú szekvenciavázlaton bemutatott aminosavszekvenciának felel meg, és a könnyű lánc aminosavszekvenciája a 44. számú szekvenciavázlaton bemutatott aminosavszekvenciának felel meg;

SB249415 ellenanyag, ahol a nehéz lánc aminosavszekvenciája az 52. számú szekvenciavázlaton bemutatott aminosavszekvenciának felel meg, és a könnyű lánc aminosavszekvenciája az 57. számú szekvenciavázlaton bemutatott aminosavszekvenciának felel meg;

SB249416 ellenanyag, ahol a nehéz lánc aminosavszekvenciája az 52. számú szekvenciavázlaton bemutatott aminosavszekvenciának felel meg, és a könnyű lánc aminosavszekvenciája a 62. számú szekvenciavázlaton bemutatott aminosavszekvenciának felel meg;

SB249417 ellenanyag, ahol a nehéz lánc aminosav5 szekvenciája az 52. számú szekvenciavázlaton bemutatott aminosavszekvenciának felel meg, és a könnyű lánc aminosavszekvenciája a 74. számú szekvenciavázlaton bemutatott aminosavszekvenciának felel meg;

10 SB257731 ellenanyag, ahol a nehéz lánc aminosavszekvenciája az 52. számú szekvenciavázlaton bemutatott aminosavszekvenciának felel meg, és a könnyű lánc aminosavszekvenciája a 78. számú szekvenciavázlaton bemutatott aminosavszekvenciának fe15 lel meg.