FR3019833A1

FR3019833A1 - METHOD FOR DETECTION AND IDENTIFICATION OF DIFFICULT CLOSTRIDIUM

Info

Publication number: FR3019833A1
Application number: FR1453272A
Authority: FR
Inventors: Alain Rambach
Original assignee: Balel S A
Current assignee: Balel S A
Priority date: 2014-04-11
Filing date: 2014-04-11
Publication date: 2015-10-16
Also published as: WO2015155018A1

Abstract

La présente demande a pour objet un nouveau procédé de détection et d'indentification de Clostridium difficile basé sur l'utilisation d'un composé fluorogène substrat de la proline-aminopeptidase.The present application relates to a new method for detecting and identifying Clostridium difficile based on the use of a proline-aminopeptidase substrate fluorogenic compound.

Description

La présente demande a pour objet un nouveau procédé de détection et d'indentification de Clostridium difficile basé sur l'utilisation d'un composé fluorogène substrat de la proline-aminopeptidase. Clostridium difficile est un bacille à Gram positif, anaérobie strict, sporulé, qui est retrouvé dans l'environnement tout comme dans le tube digestif de l'homme et de l'animal. Cette bactérie est le principal agent responsable des diarrhées nosocomiales. En particulier, elle est responsable de 15 à 25 % des diarrhées post-antibiotiques et de la quasi-totalité des colites pseudo-membraneuses, et peut entrainer la mort dans les cas les plus graves Une souche particulière de Clostridium difficile dénommée 027/NAP1/13I est particulièrement virulente et se retrouve sur l'ensemble du territoire métropolitain. De fait, l'incidence des infections à Clostridium difficile a beaucoup augmenté ces dernières années, en Amérique du Nord et en Europe, mettant au premier plan l'importance d'un diagnostic rapide et fiable. Les principaux facteurs de risque d'infection à Clostridium difficile (ICD) sont la prescription d'un traitement antibiotique et l'âge du patient (> 65 ans). Les facteurs qui entraînent une modification de l'écosystème digestif ou la motilité intestinale (laxatifs, ralentisseurs du transit, chirurgie gastro-intestinale...) peuvent également être à l'origine de la survenue d'une ICD. Cependant, il existe aussi des risques de contamination alimentaire, ce qui rend d'autant plus nécessaire le développement d'un test de détection de Clostridium difficile sensible et efficace (Eckert et al., J Med Microbiol, 62(Pt 9): 1435-1438, 2013). Le diagnostic des ICD repose actuellement sur différentes techniques telles que la détection de l'activité toxine (cytotoxicity activity, CTA). Toutefois, cette technique présente des inconvénients, telles que notamment sa durée de mise en oeuvre, et la nécessité de l'expertise de techniciens pour la lecture des résultats. En outre, ce test présente une faible sensibilité. Il est aussi possible d'utiliser un autre test diagnostic, la culture toxigénique (CT).The present application relates to a new method for detecting and identifying Clostridium difficile based on the use of a proline-aminopeptidase substrate fluorogenic compound. Clostridium difficile is a gram-positive, strictly anaerobic, spore-forming bacillus found in the environment as well as in the digestive tract of humans and animals. This bacterium is the main agent responsible for nosocomial diarrhea. In particular, it is responsible for 15-25% of post-antibiotic diarrhea and almost all pseudomembranous colitis, and can lead to death in the most severe cases A particular strain of Clostridium difficile called 027 / NAP1 / 13I is particularly virulent and is found throughout the metropolitan territory. In fact, the incidence of Clostridium difficile infections has increased significantly in recent years in North America and Europe, highlighting the importance of rapid and reliable diagnosis. The main risk factors for Clostridium difficile infection (CDI) are the prescription of antibiotic therapy and the age of the patient (> 65 years). Factors that cause a change in the digestive ecosystem or intestinal motility (laxatives, transit slowing, gastrointestinal surgery ...) can also be the cause of the occurrence of an ICD. However, there are also risks of food contamination, which makes it all the more necessary to develop a sensitive and effective detection test for Clostridium difficile (Eckert et al., J Med Microbiol, 62 (Pt 9): 1435 -1438, 2013). Diagnosis of CDI is currently based on different techniques such as the detection of toxin activity (cytotoxicity activity, CTA). However, this technique has drawbacks, such as in particular its duration of implementation, and the need for the expertise of technicians to read the results. In addition, this test has a low sensitivity. It is also possible to use another diagnostic test, toxigenic culture (CT).

Dans une première étape, les souches de Clostridium difficile sont isolées sur des milieux sélectifs comprenant une base gélosée additionnée d'antibiotiques comme le cyclosérine et la céfoxitine. Les colonies sont habituellement identifiées après 48 heures d'incubation en anaérobiose à 37°C sur la base de leur aspect et de leur odeur. Cette étape de culture peut aussi être mise en oeuvre sur une gélose contenant un composé chromogène spécifique de C. difficile. La demande WO 2009/092982 décrit ainsi un milieu contenant un substrat de la bêta-glucosidase dont l'hydrolyse indique la présence de Clostridium difficile. Cependant, la sensibilité de ce test n'est que de 94 %. Le caractère toxinogène in vitro de la souche isolée est ensuite déterminé dans une deuxième étape, par exemple par une méthode immuno-enzymatique.In a first step, the Clostridium difficile strains are isolated on selective media comprising an agar base supplemented with antibiotics such as cycloserine and cefoxitin. Colonies are usually identified after 48 hours of anaerobiosis incubation at 37 ° C based on appearance and odor. This culture step can also be carried out on an agar containing a specific chromogenic compound of C. difficile. The application WO 2009/092982 thus describes a medium containing a substrate for beta-glucosidase whose hydrolysis indicates the presence of Clostridium difficile. However, the sensitivity of this test is only 94%. The in vitro toxigenic character of the isolated strain is then determined in a second step, for example by an enzyme immunoassay method.

La méthode toxigénique est particulièrement sensible pour le diagnostic d'ICD et permet d'étudier les colonies isolées. Toutefois, cette méthode présente des inconvénients liés à sa durée (2 à 4 jours) et au nombre de manipulations requises. Il existe donc un réel besoin de disposer d'une technique de détection plus simple, plus spécifique, plus directe et moins coûteuse et permettant d'identifier C. difficile dans les échantillons des patients tout en évitant de combiner plusieurs tests générant un délai supplémentaire pour l'obtention des résultats et augmentant le risque de contaminations parasites ou d'erreur ainsi que le risque de la dissémination de la bactérie. De manière surprenante et inattendue, le présent inventeur a montré que l'utilisation d'un composé fluorogène substrat de la proline-aminopeptidase, permet d'identifier rapidement les bactéries Clostridium difficile de façon sensible et spécifique et ce, dès l'étape de culture. En particulier, lorsqu'il est mis en oeuvre sur un milieu solide gélose, le procédé de détection développé par l'inventeur est réalisable directement, par exemple à partir d'un échantillon issu d'un patient, sans nécessiter d'étape d'isolement préalable des différentes souches présentes dans cet échantillon. Par rapport aux procédés antérieurs, le procédé développé par l'inventeur permet une détection directe et rapide des bactéries Clostridium difficile. De façon remarquable, la présente invention permet ainsi de détecter des Clostridium difficile avec une sensibilité de 100 %, alors que les méthodes de l'art antérieur ne permettent au mieux que d'obtenir une sensibilité de 94 %.The toxigenic method is particularly sensitive for the diagnosis of CDI and allows the study of isolated colonies. However, this method has disadvantages related to its duration (2 to 4 days) and the number of manipulations required. There is therefore a real need for a simpler, more specific, more direct and less expensive detection technique that makes it possible to identify C. difficile in patient samples while avoiding combining several tests that generate additional time for obtaining the results and increasing the risk of parasitic contamination or error as well as the risk of the spread of the bacteria. Surprisingly and unexpectedly, the present inventor has shown that the use of a proline-aminopeptidase substrate fluorogenic compound makes it possible to rapidly identify Clostridium difficile bacteria in a sensitive and specific manner and as early as in the culture stage. . In particular, when it is carried out on a solid agar medium, the detection method developed by the inventor can be carried out directly, for example from a sample from a patient, without requiring a step of prior isolation of the different strains present in this sample. Compared with previous methods, the method developed by the inventor allows direct and rapid detection of Clostridium difficile bacteria. Remarkably, the present invention thus makes it possible to detect Clostridium difficile with a sensitivity of 100%, whereas the methods of the prior art only make it possible to obtain a sensitivity of 94%.

En effet, l'inventeur a observé qu'il est possible grâce à la fluorescence de détecter et d'identifier des colonies de Clostridium difficile même dans la région dense de l'isolement où les colonies de bactéries commensales auraient pu cacher le pathogène. La présente invention rend ainsi possible la détection et, avantageusement, l'identification au niveau de l'espèce ou du groupe d'espèces, d'une colonie fluorescente de Clostridium difficile et ce, même en présence de milliers d'autres colonies susceptibles de se développer sur le milieu sélectif solide objet de l'invention. En fait, les colonies de Clostridium difficile détectées par le milieu de l'invention sont fluorescentes tandis que les autres microorganismes ne fluorescent pas. En particulier, le procédé selon l'invention peut être appliqué à la détection de souches de Clostridium difficile choisie dans le groupe constitué des souches 001, 002, 003, 005, 012, 014/020/077, 015, 017, 018, 019, 023, 027, 029, 046, 048, 049, 050, 053, 056, 070, 075, 078/126, 081, 087, 094, 095, 106, 117, 131, 156, 168 et 169 (Eckert et al., Med Mal Infect, 43(2): 67-74, 2013), et encore préférentiellement dans le groupe constitué des souches 027, 014/020/077, 078/126, 015, 002 et 005. Un objet de la présente invention consiste donc en un procédé de détection directe de bactéries Clostridium difficile dans un échantillon comprenant les étapes successives : a) d'inoculation, avec ledit échantillon, d'un milieu de culture comprenant un composé fluorogène substrat de la proline-aminopeptidase, b) d'incubation dudit milieu de culture dans des conditions permettant la croissance des bactéries Clostridium difficile, et c) de détection des colonies de bactéries Clostridium difficile formées sur ledit milieu de culture. Avantageusement, le procédé selon la présente invention comprend en outre une étape d) permettant de conclure à la présence ou non d'une bactérie particulière en fonction de la fluorescence des colonies formées. Il s'agit par conséquent d'une étape d) d'identification de bactéries Clostridium difficile dans ledit échantillon.Indeed, the inventor has observed that it is possible through fluorescence to detect and identify colonies of Clostridium difficile even in the dense region of isolation where colonies of commensal bacteria could have hidden the pathogen. The present invention thus makes possible the detection and, advantageously, the identification at the level of the species or group of species, of a fluorescent colony of Clostridium difficile, even in the presence of thousands of other colonies likely to develop on the solid selective medium object of the invention. In fact, the colonies of Clostridium difficile detected by the medium of the invention are fluorescent while the other microorganisms do not fluoresce. In particular, the method according to the invention can be applied to the detection of strains of Clostridium difficile selected from the group consisting of strains 001, 002, 003, 005, 012, 014/020/077, 015, 017, 018, 019 , 023, 027, 029, 046, 048, 049, 050, 053, 056, 070, 075, 078/126, 081, 087, 094, 095, 106, 117, 131, 156, 168 and 169 (Eckert et al. Med Mal Infect, 43 (2): 67-74, 2013), and even more preferentially in the group consisting of strains 027, 014/020/077, 078/126, 015, 002 and 005. An object of the present invention. The invention thus consists of a method for the direct detection of Clostridium difficile bacteria in a sample comprising the following steps: a) inoculation, with said sample, of a culture medium comprising a proline-aminopeptidase substrate fluorogenic compound, b) incubating said culture medium under conditions allowing the growth of Clostridium difficile bacteria, and c) detecting colonies of Clo bacteria. stridium difficile formed on said culture medium. Advantageously, the method according to the present invention further comprises a step d) making it possible to conclude whether or not there is a particular bacterium as a function of the fluorescence of the colonies formed. It is therefore a step d) identification of Clostridium difficile bacteria in said sample.

On notera à cet égard que l'utilisation d'un composé fluorogène améliore grandement la limite de détection des Clostridium difficile. La détection étant basée sur l'émission par les colonies positives de fluorescence, elle est possible même sur des colonies de très petite taille, qui n'auraient pu être identifiées autrement. De ce fait, la méthode de l'invention permet d'obtenir un résultat après 12-18 heures d'incubation seulement, alors que les méthodes de l'art antérieur requièrent de 24 à 48 heures. Par - échantillon biologique », on entend tout type de prélèvement microbiologique, tel que par exemple un prélèvement de matières alimentaires (produits laitiers, viande, etc.), un prélèvement de sol, un prélèvement sur un mammifère (peau, muqueuses, etc.), de préférence l'homme, ou l'un de ses dérivés comme une préculture issue d'un tel prélèvement. Avantageusement, ledit échantillon biologique est un échantillon biologique liquide, comme de la salive, du sang ou de l'urine, un échantillon biologique solide, comme des fèces ou un produit alimentaire, ou encore un dérivé d'un échantillon biologique liquide ou solide tel qu'une pré-culture d'un tel échantillon biologique liquide ou solide. Avantageusement encore, ledit échantillon biologique comprend différents microorganismes, lesquels peuvent appartenir à des espèces voire à des genres distincts. À titre d'exemple, ledit échantillon biologique comprend au moins deux microorganismes différents, de préférence au moins cinq microorganismes différents et, de manière particulièrement préférée, au moins dix microorganismes différents. Par - milieu de culture », on entend un milieu permettant la croissance dudit au moins un microorganisme spécifique à détecter. Ledit milieu de culture comprend en effet les nutriments nécessaires à la croissance dudit au moins un microorganisme spécifique à détecter. Par - nutriments nécessaires à la croissance dudit au moins un microorganisme spécifique à détecter », on entend la composition d'un milieu de base nécessaire à ladite croissance. L'homme du métier connaît parfaitement la composition de tels milieux et est à même de l'adapter si nécessaire en fonction de la spécificité de certains microorganismes ou de contraintes qui pourraient être liées à certains cas de la présente invention (transparence du milieu par exemple). Ces nutriments sont notamment choisis dans le groupe comprenant du carbone, de l'azote, du soufre, du phosphore, des vitamines, des inducteurs de croissance, des hydrates de carbone, des sels (par exemple calcium, magnésium, manganèse, sodium, potassium), des complexes nutritifs (par exemple des acides aminés, du sang, du sérum, de l'albumine) ainsi que des peptones et des extraits de tissus animaux et végétaux. Le milieu de culture utilisé dans le cadre de la présente invention pour la détection des bactéries Clostridium difficile, et qui constitue un autre objet selon la présente invention, peut être sous forme solide, serai-solide, liquide ou lyophilisée. De préférence, ledit milieu de culture est un milieu gélose, lequel milieu de culture est, à titre d'exemple, à base d'agar. Parmi les présentations des milieux de culture utilisables, on peut ainsi citer les boîtes de Pétri sur lesquelles se développent des microorganismes.It should be noted in this regard that the use of a fluorogenic compound greatly improves the detection limit of Clostridium difficile. Since the detection is based on the fluorescence-positive colony emission, it is possible even on very small colonies, which could not have been identified otherwise. As a result, the method of the invention makes it possible to obtain a result after 12-18 hours of incubation only, whereas the methods of the prior art require 24 to 48 hours. "Biological sample" means any type of microbiological sampling, such as, for example, a sample of food materials (dairy products, meat, etc.), a sample of soil, a sample taken from a mammal (skin, mucous membranes, etc.). ), preferably the man, or one of its derivatives as a preculture resulting from such a sampling. Advantageously, said biological sample is a liquid biological sample, such as saliva, blood or urine, a solid biological sample, such as feces or a food product, or a derivative of a liquid or solid biological sample such as than a preculture of such a biological sample liquid or solid. Advantageously, said biological sample comprises different microorganisms, which may belong to species or even to distinct genera. By way of example, said biological sample comprises at least two different microorganisms, preferably at least five different microorganisms and, particularly preferably, at least ten different microorganisms. By "culture medium" is meant a medium allowing the growth of said at least one specific microorganism to be detected. Said culture medium in fact comprises the nutrients necessary for the growth of said at least one specific microorganism to be detected. Nutrients necessary for the growth of said at least one specific microorganism to be detected "means the composition of a basic medium necessary for said growth. The person skilled in the art is perfectly familiar with the composition of such media and is able to adapt it if necessary depending on the specificity of certain microorganisms or on constraints that could be related to certain cases of the present invention (transparency of the medium, for example ). These nutrients are especially selected from the group comprising carbon, nitrogen, sulfur, phosphorus, vitamins, growth promoters, carbohydrates, salts (for example calcium, magnesium, manganese, sodium, potassium ), nutrient complexes (eg amino acids, blood, serum, albumin) as well as peptones and extracts of animal and plant tissues. The culture medium used in the context of the present invention for the detection of Clostridium difficile bacteria, and which constitutes another object according to the present invention, may be in solid, semi-solid, liquid or freeze-dried form. Preferably, said culture medium is an agar medium, which culture medium is, for example, agar-based. Among the presentations of the culture media that can be used, mention may be made of Petri dishes on which microorganisms develop.

Les milieux de culture selon la présente invention peuvent éventuellement comprendre un ou plusieurs agents antimicrobiens. Par - agent antinnicrobien», on entend tout composé susceptible d'empêcher ou de ralentir la croissance d'un microorganisme. Sans être limitatif, une concentration comprise entre 5 mg/l et 5 g/l est particulièrement adaptée à la présente invention. On peut citer comme agent antinnicrobien, un antibiotique tel que la D-cyclosérine, les céphalosporines, telles que la céfoxitine ou le céfotaxime, la colistine, la polymixine, la fosfomycine, la tobramycine, la gentamicine, l'aztréonam, le triméthoprime, les quinolones telles que l'acide nalidixique, un antifongique tel que notamment l'amphotéricine B, le fluconazole ou l'itraconazole. Par antibiotique, on entend tout composé susceptible d'empêcher ou de ralentir la croissance d'une bactérie. Ils appartiennent notamment aux groupes des céphalosporines, des aminosides, des polypeptides, des sulfamides, des quinolones. A titre indicatif, on peut citer notamment les antibiotiques céfotaxime, ceftazidime, céfoxitine, ceftriaxone, cefpodoxime, aztréonam, trinnéthoprime, tobrannycine, moxalactam, fosfonnycine, D-cyclosérine, polymixine, colistine. Par antifongique, on entend tout composé susceptible d'empêcher ou de ralentir la croissance d'une levure ou d'une moisissure. A titre indicatif, on peut citer notamment l'amphotéricine B, le fluconazole, l'itraconazole, le voriconazole, la cycloheximide. En particulier, il est avantageux d'utiliser des milieux de culture comprenant de la céfoxitine et de la D-cyclosérine. La quantité efficace d'agent antimicrobien à utiliser peut être déterminée simplement par l'homme du métier au regard de ses connaissances générales.The culture media according to the present invention may optionally comprise one or more antimicrobial agents. By "anti-microbial agent" is meant any compound capable of preventing or slowing the growth of a microorganism. Without being limiting, a concentration of between 5 mg / l and 5 g / l is particularly suitable for the present invention. Antibiotics such as D-cycloserine, cephalosporins, such as cefoxitin or cefotaxime, colistin, polymixin, fosfomycin, tobramycin, gentamicin, aztreonam, trimethoprim, quinolones such as nalidixic acid, an antifungal such as in particular amphotericin B, fluconazole or itraconazole. By antibiotic is meant any compound capable of preventing or slowing the growth of a bacterium. They belong in particular to the groups of cephalosporins, aminoglycosides, polypeptides, sulphonamides, quinolones. As an indication, mention may be made in particular of the antibiotics cefotaxime, ceftazidime, cefoxitin, ceftriaxone, cefpodoxime, aztreonam, trinnethoprim, tobrannycin, moxalactam, fosfonnycin, D-cycloserine, polymixin, colistin. By antifungal is meant any compound that can prevent or slow the growth of yeast or mold. As an indication, mention may be made in particular amphotericin B, fluconazole, itraconazole, voriconazole, cycloheximide. In particular, it is advantageous to use culture media comprising cefoxitin and D-cycloserine. The effective amount of antimicrobial agent to be used can be determined simply by those skilled in the art in view of their general knowledge.

Par - mise en culture », on entend l'inoculation dudit milieu de culture par tout ou partie de l'échantillon biologique et incubation dudit milieu de culture inoculé. L'homme du métier adaptera les conditions d'incubation en fonction du milieu de culture, de l'échantillon biologique et du microorganisme spécifique à détecter en fonction de ses connaissances générales. En particulier, selon un mode préféré de réalisation de l'invention, l'incubation de l'étape b) est effectuée en anaérobiose. L'étape d'incubation peut être réalisée à une température d'environ 30°C à 43°C, de préférence 37°C, et ce pendant une durée d'environ 12 à 24 h. Cependant, en fonction des moyens dont il disposera, l'homme du métier pourra adapter la température et la durée de cette étape d'incubation au regard de ses connaissances générales. Par - procédé de détection directe », on entend un procédé qui ne comprend pas d'étape préalable d'isolement des différentes souches bactériennes présentes dans l'échantillon, de préférence un procédé qui ne comprend pas d'étape préalable d'isolement de chacune des souches bactériennes présentes dans l'échantillon. En effet, le procédé selon l'invention permet d'éviter l'étape d'isolement de colonies de bactéries candidates pouvant ensuite être soumises à un test plus précis de confirmation de l'identité des bactéries Clostridium difficile. Il s'applique donc à un échantillon brut comprenant un mélange de bactéries.By "culturing" is meant the inoculation of said culture medium with all or part of the biological sample and incubation of said inoculated culture medium. Those skilled in the art will adapt the incubation conditions according to the culture medium, the biological sample and the specific microorganism to be detected according to his general knowledge. In particular, according to a preferred embodiment of the invention, the incubation of step b) is carried out anaerobically. The incubation step may be carried out at a temperature of about 30 ° C to 43 ° C, preferably 37 ° C, for a period of about 12 to 24 hours. However, depending on the means at his disposal, the skilled person can adapt the temperature and duration of this incubation step in light of his general knowledge. By "direct detection method" is meant a process which does not comprise a prior step of isolating the different bacterial strains present in the sample, preferably a process which does not include a prior isolation step of each bacterial strains present in the sample. Indeed, the method according to the invention makes it possible to avoid the step of isolating colonies of candidate bacteria which can then be subjected to a more precise test for confirming the identity of Clostridium difficile bacteria. It therefore applies to a raw sample comprising a mixture of bacteria.

Par - composé fluorogène », on entend un composé portant un fluorophore libéré après une hydrolyse par une enzyme spécifique. Le fluorophore ainsi libéré peut ainsi émettre de la lumière dans des conditions appropriées et permet ainsi d'identifier les colonies comprenant ladite enzyme. Avantageusement, ladite enzyme est la proline-aminopeptidase. Plus spécifiquement, par - composé fluorogène substrat de la proline-anninopeptidase », on entend donc ici un dérivé de proline comprenant un fluorophore lié de telle façon que le fluorophore est libéré à la suite du clivage dudit dérivé de proline par la proline-aminopeptidase, le clivage de ces composés par la proline-aminopeptidase étant nécessaire pour observer la fluorescence. De tels composés sont déjà connus : on citera notamment la L-proline 7-annido-4-nnéthylcounnarine. A cet égard, l'homme du métier saura déterminer sans peine les longueurs d'ondes d'excitation optimales entrainant l'émission de lumière par le fluorophore. A titre d'exemple, on mentionnera qu'une fluorescence peut être détectée à 460 nm quand la L-Proline 7-annido-4-nnethylcounnarine est excitée à 365 nm. Le substrat fluorogène est typiquement utilisé à une concentration allant de 0,01 à 0,5 g/l environ. Une concentration préférée se situe à 0,1 g/l environ. H est précisé que le substrat fluorogène présent dans le milieu de culture selon la présente invention peut être remplacé, ou associé, à au moins un substrat chromogène. Un deuxième aspect de la présente invention concerne un procédé de détection et/ou de discrimination des souches de Clostridium difficile toxinogènes dans un échantillon à l'aide d'un milieu de culture tel que défini ci-dessus. Dans une première étape de ce procédé, les souches des Clostridium difficile sont identifiées dans ledit échantillon à l'aide du procédé de détection décrit plus haut. Dans une deuxième étape, le pouvoir toxinogénique des souches ainsi identifiées est testé à l'aide d'un test approprié. De tels tests sont bien connus de l'homme du métier et comprennent entre autres le test CTA, les tests immunoenzymatiques et les tests de biologie moléculaire (voir par exemple Eckert et al., Journal des Antiinfectieux, 13(2) : 67-73, 2011). Selon un troisième aspect, l'invention porte sur un milieu de culture sélectif permettant de mettre en oeuvre le procédé tel que décrit ci-dessus. L'objet de la présente invention ne se limite pas à la description ci-dessus. D'autres modes de réalisation et avantages de la présente invention pourront ressortir de l'exemple ci-dessous, fourni ici à titre purement illustratif. Il est clair que ni l'objet ni la portée de la présente invention ne sont limités par cet exemple.By "fluorogenic compound" is meant a compound bearing a fluorophore released after hydrolysis by a specific enzyme. The fluorophore thus released can thus emit light under appropriate conditions and thus makes it possible to identify the colonies comprising said enzyme. Advantageously, said enzyme is proline aminopeptidase. More specifically, the term "proline-anninopeptidase-substrate fluorogenic compound" is therefore intended to mean a proline derivative comprising a fluorophore bonded in such a way that the fluorophore is released as a result of the cleavage of said proline derivative by proline aminopeptidase. cleavage of these compounds by proline aminopeptidase is necessary to observe fluorescence. Such compounds are already known: mention may in particular be made of L-proline 7-annido-4-methylcounnarin. In this regard, the skilled person will easily determine the optimal excitation wavelengths resulting in the emission of light by the fluorophore. By way of example, it will be mentioned that fluorescence can be detected at 460 nm when L-Proline 7-annido-4-nnethylcounnarin is excited at 365 nm. The fluorogenic substrate is typically used at a concentration of about 0.01 to 0.5 g / l. A preferred concentration is about 0.1 g / l. It is specified that the fluorogenic substrate present in the culture medium according to the present invention can be replaced, or associated, with at least one chromogenic substrate. A second aspect of the present invention relates to a method for detecting and / or discriminating toxinogenic Clostridium difficile strains in a sample using a culture medium as defined above. In a first step of this method, the Clostridium difficile strains are identified in said sample using the detection method described above. In a second step, the toxinogenicity of the strains thus identified is tested using an appropriate test. Such tests are well known to the person skilled in the art and include, inter alia, CTA test, enzyme immunoassay tests and molecular biology tests (see, for example, Eckert et al., Journal des Antiinfectieux, 13 (2): 67-73. , 2011). According to a third aspect, the invention relates to a selective culture medium for carrying out the method as described above. The object of the present invention is not limited to the above description. Other embodiments and advantages of the present invention may be apparent from the example below, provided here for illustrative purposes only. It is clear that neither the object nor the scope of the present invention is limited by this example.

Exemple Détection directe de bactéries Clostridium difficile à l'aide d'un milieu selon la présente invention : Différents échantillons contenant des suspensions de bactéries sont étalés directement sur boîte de Pétri comprenant un milieu gélose comprenant: - Peptones et yeast extract 25 g/L - NaCl 5 g/L - Agar 15 g/L - Pyruvate 2 g/L - K2HPO4 4 g/L - Fructose 1 g/L - Cysteine 0,1 g/L - Taurocholate 0,5 g/L - Amphotericine 0,01 g/L - Cycloserine 0,3 g/L - Cefoxitine 0,005 g/L - AMC-proline 0,075 g/L Après incubation pendant 12 à 24 heures, l'analyse visuelle des boîtes de Pétri permet d'identifier directement celles comprenant des colonies Clostridium 20 difficile. Ainsi, le procédé selon l'invention permet, en une seule étape de culture, de détecter spécifiquement et de différencier les bactéries Clostridium difficile, sans nécessité d'une étape préalable d'isolement ni étape ultérieure de différenciation. 25EXAMPLE Direct detection of Clostridium difficile bacteria using a medium according to the present invention: Various samples containing bacterial suspensions are spread directly on a Petri dish comprising an agar medium comprising: Peptones and yeast extract 25 g / L NaCl 5 g / L - Agar 15 g / L - Pyruvate 2 g / L - K2HPO4 4 g / L - Fructose 1 g / L - Cysteine 0.1 g / L - Taurocholate 0.5 g / L - Amphotericin 0.01 g / L - Cycloserine 0.3 g / L - Cefoxitin 0.005 g / L - AMC-proline 0.075 g / L After incubation for 12 to 24 hours, the visual analysis of the Petri dishes makes it possible to identify directly those containing colonies Clostridium 20 difficult. Thus, the method according to the invention makes it possible, in a single culture step, to specifically detect and to differentiate Clostridium difficile bacteria, without the need for a prior isolation step or a subsequent differentiation step. 25

Claims

CLAIMS1) A method for the direct detection of Clostridium difficile bacteria in a sample comprising the following steps: a) inoculation, with said sample, of a culture medium comprising a proline-aminopeptidase substrate fluorogenic compound, b) incubation said culture medium under conditions allowing the growth of Clostridium difficile bacteria, and c) detecting colonies of Clostridium difficile bacteria formed on said culture medium.

2) Method according to claim 1 characterized in that it comprises a step d) identifying Clostridium difficile bacteria in said sample.

3) Process according to any one of claims 1 or 2, characterized in that said fluorogenic compound is L-proline 7-amido-4-methylcoumarine.

4) Process according to any one of claims 1 to 3, characterized in that it does not include a prior step of isolating the different bacterial strains present in the sample.

5) Method according to any one of claims 1 to 4, characterized in that the culture medium is an agar medium

6) Process according to any one of claims 1 to 5, characterized in that the culture medium comprises cefoxitin and D-cycloserine.

A method for detecting and / or discriminating toxinogenic Clostridium difficile strains in a sample, comprising the steps of: a) Detecting Clostridium difficile bacteria in said sample using the method of any of claims 1 to 6, and b) Test the toxinogenic power of the identified strains.

8) Method according to claim 7, characterized in that the test of step b) is a CTA test, an enzyme immunoassay or a molecular biology test.

9) Culture medium for carrying out a process according to any one of claims 1 to 6.