FR3094493A1 - Procédé de détection ou de suivi de l’évolution d’une maladie chronique auto-immune par dosage immunologique - Google Patents
Procédé de détection ou de suivi de l’évolution d’une maladie chronique auto-immune par dosage immunologique Download PDFInfo
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Abstract
L’invention a pour objet un procédé ex vivo de détection ou de suivi de l’évolution d’une maladie chronique auto-immune, dans un échantillon de fluide biologique humain ou animal, par dosage immunologique de la présence d’anticorps dans l’échantillon, dont au moins :- un ou plusieurs anticorps dirigé(s) contre au moins une entérobactérie, et- un ou plusieurs anticorps dirigé(s) contre un produit issu de la lipopéroxydation et/ou un ou plusieurs anticorps dirigé(s) contre un produit nitré ou nitrosylé. L’invention concerne également un kit pour la mise en œuvre d’un tel procédé
Description
L’invention concerne la détection ex vivo et le suivi de l’évolution de maladies chroniques auto-immunes chez l’homme ou l’animal.
Les maladies auto-immunes sont des pathologies qui résultent d'un dysfonctionnement du système immunitaire conduisant celui-ci à s’attaquer aux constituants de l’organisme.
En plus de présenter la caractéristique d’être auto-immune, il peut se développer au cours de l’évolution de la maladie des processus prolifératifs et/ou dégénératifs. On parle alors de co-morbidité qui correspond au résultat de l’association entre maladie auto-immune et dégénérative et /ou proliférative.
Les solutions thérapeutiques apportées dépendent du type de maladie auto-immune et elles impliquent souvent des médicaments qui suppriment l’activité du système immunitaire. Ces médicaments ont en outre une efficacité très limitée, voire nulle, sont généralement toxiques et présentent des effets secondaires importants.
Par ailleurs, les traitements sont souvent inefficaces dans les cas très fréquents où les maladies auto-immunes sont diagnostiquées trop tardivement pour pouvoir stopper ou ralentir à temps l’évolution de la maladie. En effet, il n’existe pas de test de diagnostic satisfaisant. Plusieurs analyses de sang sont généralement réalisées afin de rechercher une éventuelle maladie auto-immune. On ne sait généralement pas ce qui déclenche les maladies auto-immunes et les symptômes varient en fonction du trouble qui se développe et de la partie de l’organisme qui est affectée.
De plus, ces pathologies étant chroniques, elles nécessitent un suivi régulier de l’évolution de la maladie et il n’existe pas aujourd’hui de solution simple et fiable qui permette un tel suivi.
L’objectif de l’invention est de pallier les inconvénients de l’art antérieur en proposant un procédé à la fois de détection et de suivi de l’évolution d’une maladie chronique auto-immune chez l’homme ou l’animal, simple à mettre en œuvre, peu invasif, rapide, efficace et fiable.
A cet effet l’invention a pour objet un procédéex vivode détection ou de suivi de l’évolution d’une maladie chronique auto-immune, dans un échantillon de fluide biologique humain ou animal, préférentiellement de plasma et/ou de sérum humain ou animal, par dosage immunologique de la présence d’anticorps dans l’échantillon dont au moins :
- un ou plusieurs anticorps dirigé(s) contre au moins une entérobactérie, c’est-à-dire contre au moins un constituant d’au moins une entérobactérie, et
- un ou plusieurs anticorps dirigé(s) contre un produit issu de la lipopéroxydation et/ou un ou plusieurs anticorps dirigé(s) contre un produit nitré ou nitrosylé.
- un ou plusieurs anticorps dirigé(s) contre au moins une entérobactérie, c’est-à-dire contre au moins un constituant d’au moins une entérobactérie, et
- un ou plusieurs anticorps dirigé(s) contre un produit issu de la lipopéroxydation et/ou un ou plusieurs anticorps dirigé(s) contre un produit nitré ou nitrosylé.
Le procédé peut également comprendre le dosage immunologique de la présence dans l’échantillon :
- au moins un anticorps dirigé contre un produit d’oxydation du tryptophane, et/ou
- au moins un anticorps dirigé contre un produit nitré ou nitrosylé, et/ou
- au moins un anticorps dirigé contreMycobacterium tuberculosis.
- au moins un anticorps dirigé contre un produit d’oxydation du tryptophane, et/ou
- au moins un anticorps dirigé contre un produit nitré ou nitrosylé, et/ou
- au moins un anticorps dirigé contreMycobacterium tuberculosis.
Avantageusement, ce procédé est simple à mettre en œuvre puisqu’il est réalisé sur un échantillon de fluide biologique et qu’il met en œuvre des techniques classiques de dosages immunologiques. Le procédé de dosage immunologique mimeex vivoce qui se passein vivooù des antigènes sont liés à des immunoglobulines (antigènes).
Le procédé selon l’invention peut être mis en œuvre à l’aide d’un kit qui constitue un autre objet de l’invention.
D’autres caractéristiques et avantages de l’invention ressortiront de la description en détails qui va suivre.
Définitions
Par « anticorps circulants » au sens de l’invention, on entend des anticorps que l’on retrouve dans les fluides biologiques humains ou animaux, en particulier dans le sang, le sérum et/ou le plasma d’êtres humains ou d’animaux.
Par « blanc réactif » au sens de l’invention, on entend une solution ou un mélange contenant l’ensemble des réactifs utilisés au cours du procédé selon l’invention, mais qui ne contient pas l’échantillon à analyser. Il permet d’apporter une correction de base aux résultats du dosage. Il définit le bruit de fond du procédé de dosage.
Par « fluide biologique » au sens de l’invention, on entend fluide du corps d’un être humain ou d’un animal, en particulier le sang, le sérum et/ou le plasma, le liquide céphalo rachidien, les liquides pleuraux et intra péritonéaux, les liquides intra articulaires, la salive ou l’urine.
Par «néo-antigène» au sens de l’invention on entend le résultat d’une liaison covalente entre un composé radicalaire (NO, NO2,et…) ou issu de la lipopéroxydation (Malondialdéhyde, Acide Azelaique, etc) ou issu de l’hyperproduction de composés métaboliques (dérivés de tryptophane) et un constituant endogène cellulaire ou tissulaire. Un néo-antigène est également le résultat du démasquage d’un constituant cellulaire (Acide gras, Phosphatidyl inositol, etc) non accessible physiologiquement au système immunitaire, qui , suite à des processus inflammatoires actifs, est exposé au système immunitaire.
Par « produit issu de lipopéroxydation » au sens de l’invention on entend un produit qui résulte de la peroxydation des lipides, c’est à dire l'oxydation des lipides insaturés ou saturés, soit par des espèces radicalaires de l'oxygène et l’azote, soit catalysée par des enzymes. La peroxydation des lipides entraîne leur dégradation en produits dits produits issus de la lipopréoxydation.
Par « produit nitré ou nitrosylé » au sens de l’invention on entend des néoantigènes résultant d’une hyperproduction de NO et/ou de peroxynitrite. Cette hyperproduction résulte de l’activation de la NO synthase inductible principalement dans les cellules du système immunitaire inné par des bactéries, virus, polluants, etc.
Par « produit d’oxydation du tryptophane » au sens de l’invention on entend un métabolite résultant de la dégradation du tryptophane, après l’activation enzymatique des voies IDO (Indolamine Dioxygénase) et/ou TDO (Tryptophane Dioxygénase). Cette activation enzymatique a lieu dans les cellules mono-macrophagiques sous l’action de constituants bactériens, viraux, mycosiques, polluants, cytokines et/ou pro-inflammatoires.
Par « constituant bactérien » on entend un produit de dégradation des bactéries qui résulte de la lyse bactérienne.
Description détaillée de l’invention
L’invention a donc pour objet un procédéex vivode détection ou de suivi de l’évolution d’une maladie chronique auto-immune.
La maladie peut être toute maladie chronique auto-immune, et en particulier il peut s’agir d’une maladie choisie parmi les scléroses en plaques, la polyarthrite et la pelvispondylite rhumatismale.
Le procédé est réaliséex vivo, en dehors du corps humain ou animal, dans un échantillon de fluide biologique humain ou animal, préférentiellement de sérum ou de plasma humain ou animal, qui a été prélevé avant la mise en œuvre du procédé. L’échantillon de fluide biologique est un échantillon qui a été prélevé et conservé selon les normes habituelles et connues de l’homme du métier.
Le procédé selon l’invention est réalisé par dosage immunologique de la présence dans l’échantillon d’anticorps circulants dirigés contre des antigènes spécifiques des maladies chroniques auto-immunes.
Le procédé peut être tout type de procédé de dosage immunologique. Il peut s’agir en particulier d’un dosage Elisa, de tests bandelettes, de tests réalisés à l’aide de billes magnétiques ou encore de test Western Blot. La mise en œuvre de ces tests peut être réalisée selon les connaissances de l’homme du métier.
Dans la mise en œuvre du procédé selon l’invention :
- Les antigènes utilisés pour la mise en œuvre du procédé sont préférentiellement des antigènes synthétisésex vivo. Dans le cas où les antigènes sont des bactéries, ils peuvent être obtenus à partir de cultures bactériennes, ces cultures bactériennes étant préférentiellement identifiées par un système d’identification microbienne automatisé comme le Vitek®.
- Si les antigènes utilisés ne sont pas des bactéries, ils sont préférentiellement couplés (conjugués) à une protéine, telle que la Sérum Albumine Bovine par exemple, pour faciliter la fixation de l’antigène sur le support (plaque, bandelette, etc. en fonction de la méthode de dosage) ; ainsi un anticorps dirigé contre un antigène au sens de la présente invention peut signifier (hors bactéries) anticorps dirigé contre un antigène conjugué que l’expression « conjugué » après l’antigène soit indiquée ou non.
- Les anticorps secondaires, dits anti-isotypes, utilisés, sont fabriqués selon les méthodes classiques connues de l’homme du métier. En particulier, ils peuvent être obtenus comme suit :
* purification d’anticorps (immunoglobulines) humains à partir de sérums témoins
* ces immunoglobulines humaines sont purifiées par chromatographie permettant de séparer les différents isotopes A, M et G pour l’homme, A, M, G et E pour l’animal,
* chaque pic d’électrophorèse (A, M, G ou A, M, G, E) est injecté à des animaux naïfs (rats, lapins par exemple ; animaux non immunisés)
* après trois ou quatre immunisations, la réponse est optimale et les sérums animaux sont prélevés.
* ces sérums sont purifiés ; on obtient ainsi des immunoglobulines (Ig) soit anti-IgA, soit anti IgM, soit anti-IgG ; soit anti-IgE (pour l’animal uniquement),
* sur ces immunoglobulines purifiées, peuvent être ensuite liées une enzyme telle que la peroxydase ou la phosphatase.
* l’excès de réactif est éliminé par chromatographie.
- Les antigènes utilisés pour la mise en œuvre du procédé sont préférentiellement des antigènes synthétisésex vivo. Dans le cas où les antigènes sont des bactéries, ils peuvent être obtenus à partir de cultures bactériennes, ces cultures bactériennes étant préférentiellement identifiées par un système d’identification microbienne automatisé comme le Vitek®.
- Si les antigènes utilisés ne sont pas des bactéries, ils sont préférentiellement couplés (conjugués) à une protéine, telle que la Sérum Albumine Bovine par exemple, pour faciliter la fixation de l’antigène sur le support (plaque, bandelette, etc. en fonction de la méthode de dosage) ; ainsi un anticorps dirigé contre un antigène au sens de la présente invention peut signifier (hors bactéries) anticorps dirigé contre un antigène conjugué que l’expression « conjugué » après l’antigène soit indiquée ou non.
- Les anticorps secondaires, dits anti-isotypes, utilisés, sont fabriqués selon les méthodes classiques connues de l’homme du métier. En particulier, ils peuvent être obtenus comme suit :
* purification d’anticorps (immunoglobulines) humains à partir de sérums témoins
* ces immunoglobulines humaines sont purifiées par chromatographie permettant de séparer les différents isotopes A, M et G pour l’homme, A, M, G et E pour l’animal,
* chaque pic d’électrophorèse (A, M, G ou A, M, G, E) est injecté à des animaux naïfs (rats, lapins par exemple ; animaux non immunisés)
* après trois ou quatre immunisations, la réponse est optimale et les sérums animaux sont prélevés.
* ces sérums sont purifiés ; on obtient ainsi des immunoglobulines (Ig) soit anti-IgA, soit anti IgM, soit anti-IgG ; soit anti-IgE (pour l’animal uniquement),
* sur ces immunoglobulines purifiées, peuvent être ensuite liées une enzyme telle que la peroxydase ou la phosphatase.
* l’excès de réactif est éliminé par chromatographie.
Le procédé selon l’invention comporte préférentiellement un test immuno enzymatique basé sur la méthode Elisa. Le procédé de dosage immunologique peut comprendre les étapes suivantes :
- les antigènes contre lesquels sont dirigés les anticorps que l’on cherche à détecter dans l’échantillon, sont adsorbés et séchés sur des plaques de micro-titration ; cette étape consiste à sensibiliser des plaques de micro-titration avec le ou les antigènes contre lesquels sont dirigés les anticorps dont on cherche à détecter la présence dans l’échantillon.
Les plaques sont ensuite soit directement utilisées pour la mise en œuvre du procédé, soit séchées et conservées en atmosphère sèche et à l’abri de la lumière.
- l’échantillon à tester est ensuite préférentiellement dilué ; cette dilution peut être comprise entre 150 et 1000 fois ;
- de même, de façon préférée, des fluides biologiques tests, appelés étalons internes, qui sont des fluides biologiques de sujets sains, préférentiellement des sérums ou plasma de sujets sains (population représentative et appariée avec celle des malades au moins pour le sexe et l’âge), sont utilisés et préférentiellement dilués ; cette dilution peut être comprise entre 150 et 1000 fois,
- l’échantillon, un blanc réactif et préférentiellement également les étalons internes, sont répartis, de façon préférée en duplicate, dans des puits d’au moins une plaque de micro-titration sensibilisée,
- préférentiellement la ou les plaques sont incubées ; selon un mode de réalisation particulièrement adapté elles sont incubées entre 1h30 et 2h00 à une température de 35 à 39°C,
- préférentiellement la ou les plaques sont lavées, c’est-à-dire rincées, préférentiellement plusieurs fois, dans l’objectif d’éliminer toutes les protéines et immunoglobulines non spécifiques ;
- on ajoute ensuite des anticorps anti immunoglobulines humaines ou animales dit anticorps secondaires, dirigés contre des isotypes A, M ou G pour l’homme, A, M, G ou E chez l’animal ; ces anticorps secondaires sont des anticorps dirigés contre les immunoglobulines liées aux antigènes présents dans les puits des plaques de micro-titration ; les anticorps secondaires sont préférentiellement couplés à une enzyme, et de façon préférée à la peroxydase ou phosphatase alcaline ou biotynilés, pour permettre de faire une réaction colorimétrique,
- préférentiellement les plaques sont de nouveau incubées pendant 1 heure à 2 heures à une température comprise entre 35 et 39°C,
- préférentiellement les plaques sont ensuite de nouveau lavées, c’est-à-dire que l’on procède à plusieurs rinçages de façon à éliminer ce qui n’a pas été spécifiquement reconnu,
- préférentiellement on applique ensuite un substrat de l’enzyme (H202pour la peroxydase ou pour la phosphatase) avec un chromogène , cette étape a pour objectif de visualiser les réactions immunologiques. Le chromogène peut être par exemple le tétra-méthyl-benzédine (TMB) ou DAB Diamino benzedine; une réaction colorimétrique apparaît ; celle-ci est d’autant plus intense qu’il y a d’immunoglobulines humaines ou animales fixées sur les antigènes présents dans les puits ;
- éventuellement incuber de nouveau entre 10 et 30 minutes à une température comprise entre 18 et 20°C ; la réaction est ensuite stoppée, préférentiellement en solution acide ;
- la densité optique de chaque puit des plaques de micro-titration est ensuite lue, préférentiellement à l’aide d’un spectrophotomètre ; la lecture se fait préférentiellement à 450 nm avec un alpha de correction à 650 nm ; ces densités optiques sont ensuite préférentiellement enregistrées dans un logiciel.
- les antigènes contre lesquels sont dirigés les anticorps que l’on cherche à détecter dans l’échantillon, sont adsorbés et séchés sur des plaques de micro-titration ; cette étape consiste à sensibiliser des plaques de micro-titration avec le ou les antigènes contre lesquels sont dirigés les anticorps dont on cherche à détecter la présence dans l’échantillon.
Les plaques sont ensuite soit directement utilisées pour la mise en œuvre du procédé, soit séchées et conservées en atmosphère sèche et à l’abri de la lumière.
- l’échantillon à tester est ensuite préférentiellement dilué ; cette dilution peut être comprise entre 150 et 1000 fois ;
- de même, de façon préférée, des fluides biologiques tests, appelés étalons internes, qui sont des fluides biologiques de sujets sains, préférentiellement des sérums ou plasma de sujets sains (population représentative et appariée avec celle des malades au moins pour le sexe et l’âge), sont utilisés et préférentiellement dilués ; cette dilution peut être comprise entre 150 et 1000 fois,
- l’échantillon, un blanc réactif et préférentiellement également les étalons internes, sont répartis, de façon préférée en duplicate, dans des puits d’au moins une plaque de micro-titration sensibilisée,
- préférentiellement la ou les plaques sont incubées ; selon un mode de réalisation particulièrement adapté elles sont incubées entre 1h30 et 2h00 à une température de 35 à 39°C,
- préférentiellement la ou les plaques sont lavées, c’est-à-dire rincées, préférentiellement plusieurs fois, dans l’objectif d’éliminer toutes les protéines et immunoglobulines non spécifiques ;
- on ajoute ensuite des anticorps anti immunoglobulines humaines ou animales dit anticorps secondaires, dirigés contre des isotypes A, M ou G pour l’homme, A, M, G ou E chez l’animal ; ces anticorps secondaires sont des anticorps dirigés contre les immunoglobulines liées aux antigènes présents dans les puits des plaques de micro-titration ; les anticorps secondaires sont préférentiellement couplés à une enzyme, et de façon préférée à la peroxydase ou phosphatase alcaline ou biotynilés, pour permettre de faire une réaction colorimétrique,
- préférentiellement les plaques sont de nouveau incubées pendant 1 heure à 2 heures à une température comprise entre 35 et 39°C,
- préférentiellement les plaques sont ensuite de nouveau lavées, c’est-à-dire que l’on procède à plusieurs rinçages de façon à éliminer ce qui n’a pas été spécifiquement reconnu,
- préférentiellement on applique ensuite un substrat de l’enzyme (H202pour la peroxydase ou pour la phosphatase) avec un chromogène , cette étape a pour objectif de visualiser les réactions immunologiques. Le chromogène peut être par exemple le tétra-méthyl-benzédine (TMB) ou DAB Diamino benzedine; une réaction colorimétrique apparaît ; celle-ci est d’autant plus intense qu’il y a d’immunoglobulines humaines ou animales fixées sur les antigènes présents dans les puits ;
- éventuellement incuber de nouveau entre 10 et 30 minutes à une température comprise entre 18 et 20°C ; la réaction est ensuite stoppée, préférentiellement en solution acide ;
- la densité optique de chaque puit des plaques de micro-titration est ensuite lue, préférentiellement à l’aide d’un spectrophotomètre ; la lecture se fait préférentiellement à 450 nm avec un alpha de correction à 650 nm ; ces densités optiques sont ensuite préférentiellement enregistrées dans un logiciel.
Un rapport Z est ensuite établi pour chaque antigène testé, par rapport à la densité optique des étalons internes :
Z = (DO de l’échantillon à tester – DO moyenne des étalons internes) / Ecart-type contrôle des étalons internes.
Le test est positif (présence de l’anticorps recherché dans l’échantillon donc maladie confirmée) si Z est supérieur ou égal à + 2 ou inférieur ou égal à -2 :
- si Z est inférieur ou égal à -2, il y a une négativité par rapport aux témoins (étalons internes) : il y a eu activation immune mais les anticorps sont à présent complexés à leurs antigènes (complexes immuns).
- si Z est supérieur ou égal à + 2, il y a positivité par rapport aux témoins (étalons internes) : il y a eu activation immune.
Si Z est compris entre -2 et + 2, les valeurs sont dites normales car elles correspondent à la dispersion gaussienne de la population contrôle : l’anticorps recherché n’est pas présent dans l’échantillon.
Z = (DO de l’échantillon à tester – DO moyenne des étalons internes) / Ecart-type contrôle des étalons internes.
Le test est positif (présence de l’anticorps recherché dans l’échantillon donc maladie confirmée) si Z est supérieur ou égal à + 2 ou inférieur ou égal à -2 :
- si Z est inférieur ou égal à -2, il y a une négativité par rapport aux témoins (étalons internes) : il y a eu activation immune mais les anticorps sont à présent complexés à leurs antigènes (complexes immuns).
- si Z est supérieur ou égal à + 2, il y a positivité par rapport aux témoins (étalons internes) : il y a eu activation immune.
Si Z est compris entre -2 et + 2, les valeurs sont dites normales car elles correspondent à la dispersion gaussienne de la population contrôle : l’anticorps recherché n’est pas présent dans l’échantillon.
Il est ainsi possible de détecter si l’être humain ou l’animal à qui appartient le fluide biologique testé est atteint d’une maladie auto-immune ou non.
De plus le procédé selon l’invention permet également de suivre l’évolution de la maladie. La variation de la valeur Z pour le ou les anticorps recherchés permet de vérifier la variation, l’évolution de la maladie :
- plus Z se rapproche de l’intervalle -2 à +2, plus le taux d’anticorps diminue et la maladie évolue vers une rémission. On peut ainsi vérifier que le traitement est actif sur les processus pathogéniques ;
- tant que Z est supérieur à +2 ou inférieur à -2 la maladie est toujours active.
- plus Z se rapproche de l’intervalle -2 à +2, plus le taux d’anticorps diminue et la maladie évolue vers une rémission. On peut ainsi vérifier que le traitement est actif sur les processus pathogéniques ;
- tant que Z est supérieur à +2 ou inférieur à -2 la maladie est toujours active.
Le dosage d’un ou plusieurs anticorps spécifique(s) permet également de proposer un traitement adapté en fonction du ou des anticorps testés présents dans l’échantillon.
Selon un de mode de réalisation particulier, le procédé selon l’invention comprend au moins la mise en œuvre des étapes suivantes :
- fabriquer au moins une plaque de micro titration sensibilisée avec le ou les antigènes contre lesquels sont dirigés les anticorps dont on cherche à détecter la présence dans l’échantillon, ou utiliser au moins une plaque de micro titration déjà sensibilisée avec ces antigènes,
- répartir sur la plaque la même quantité d’étalons internes, d’échantillon et de blanc réactif,
- ajouter le ou les anticorps secondaires couplé(s) à une enzyme,
- ajouter un substrat de l’enzyme et un chromogène, attendre la coloration des puits,
- stopper la réaction de coloration,
- lire la densité optique des puits à l’aide d’un spectrophotomètre une longueur d’onde appropriée.
- fabriquer au moins une plaque de micro titration sensibilisée avec le ou les antigènes contre lesquels sont dirigés les anticorps dont on cherche à détecter la présence dans l’échantillon, ou utiliser au moins une plaque de micro titration déjà sensibilisée avec ces antigènes,
- répartir sur la plaque la même quantité d’étalons internes, d’échantillon et de blanc réactif,
- ajouter le ou les anticorps secondaires couplé(s) à une enzyme,
- ajouter un substrat de l’enzyme et un chromogène, attendre la coloration des puits,
- stopper la réaction de coloration,
- lire la densité optique des puits à l’aide d’un spectrophotomètre une longueur d’onde appropriée.
Notamment, un mode de réalisation particulièrement adapté de l’invention est un procédé qui comprend au moins la mise en œuvre des étapes suivantes :
- fabriquer au moins une plaque de micro titration sensibilisée avec le ou les antigènes contre lesquels sont dirigés les anticorps dont on cherche à détecter la présence dans l’échantillon, ou utiliser au moins une plaque de micro titration déjà sensibilisée avec ces anticorps,
- diluer l’échantillon à tester et des étalons internes,
- répartir en duplicate sur la plaque la même quantité d’étalons internes dilués, d’échantillon dilué et de blanc réactif,
- incuber,
- laver,
- ajouter le ou les anticorps secondaires couplés à la peroxydase ou phosphatase alcaline ou biotynilés,
- incuber,
- laver,
- ajouter un substrat et un chromogène,
- stopper la réaction en solution acide
- lire à 450 nm avec un alpha de correction à 650 nm.
- fabriquer au moins une plaque de micro titration sensibilisée avec le ou les antigènes contre lesquels sont dirigés les anticorps dont on cherche à détecter la présence dans l’échantillon, ou utiliser au moins une plaque de micro titration déjà sensibilisée avec ces anticorps,
- diluer l’échantillon à tester et des étalons internes,
- répartir en duplicate sur la plaque la même quantité d’étalons internes dilués, d’échantillon dilué et de blanc réactif,
- incuber,
- laver,
- ajouter le ou les anticorps secondaires couplés à la peroxydase ou phosphatase alcaline ou biotynilés,
- incuber,
- laver,
- ajouter un substrat et un chromogène,
- stopper la réaction en solution acide
- lire à 450 nm avec un alpha de correction à 650 nm.
Les anticorps recherchés dans le cadre du procédé selon l’invention, quelques soient les antigènes contre lesquels ils sont dirigés, peuvent être des IgM (immunoglobulines d’isotype M), des IgA (immunoglobulines d’isotype A), ou des IgG (immunoglobulines d’isotype G) et chez l’animal uniquement des IgE (immunoglobulines d’isotype E) :
- les anticorps IgA : sont le résultat d’une activation immunitaire mucosal (intestinal, orl, peau, vésical),
- les anticorps IgM: sont le résultat d’une activation du système immunitaire actuel,
- les anticorps IgG : sont le résultat d’une activation du système immunitaire ancien (immunité mémoire),
- les anticorps IgE (chez l’animal uniquement) sont le résultat de la stimulation des mastocytes qui libèrent de l’histamine, c’est-à-dire qu’ils sont le résultat d’un contact avec des antigènes allergisants.
- les anticorps IgA : sont le résultat d’une activation immunitaire mucosal (intestinal, orl, peau, vésical),
- les anticorps IgM: sont le résultat d’une activation du système immunitaire actuel,
- les anticorps IgG : sont le résultat d’une activation du système immunitaire ancien (immunité mémoire),
- les anticorps IgE (chez l’animal uniquement) sont le résultat de la stimulation des mastocytes qui libèrent de l’histamine, c’est-à-dire qu’ils sont le résultat d’un contact avec des antigènes allergisants.
Le procédé selon l’invention est donc réalisé par dosage immunologique de la présence d’anticorps dans l’échantillon, dont au moins :
- un ou plusieurs anticorps dirigé(s) contre au moins une entérobactérie, et
- un ou plusieurs anticorps dirigé(s) contre un produit issu de la lipopéroxydation et/ou un ou plusieurs anticorps dirigé(s) contre un produit nitré ou nitrosylé.
- un ou plusieurs anticorps dirigé(s) contre au moins une entérobactérie, et
- un ou plusieurs anticorps dirigé(s) contre un produit issu de la lipopéroxydation et/ou un ou plusieurs anticorps dirigé(s) contre un produit nitré ou nitrosylé.
Ainsi le procédé selon l’invention est réalisé par dosage immunologique de la présence d’anticorps dans l’échantillon, dont au moins :
- un ou plusieurs anticorps dirigé(s) contre au moins une entérobactérie, et un ou plusieurs anticorps dirigé(s) contre un produit issu de la lipopéroxydation, ou
- un ou plusieurs anticorps dirigé(s) contre au moins une entérobactérie, et un ou plusieurs anticorps dirigé(s) contre un produit nitré ou nitrosylé, ou
- un ou plusieurs anticorps dirigé(s) contre au moins une entérobactérie, et un ou plusieurs anticorps dirigé(s) contre un produit issu de la lipopéroxydation et un ou plusieurs anticorps dirigé(s) contre un produit nitré ou nitrosylé.
- un ou plusieurs anticorps dirigé(s) contre au moins une entérobactérie, et un ou plusieurs anticorps dirigé(s) contre un produit issu de la lipopéroxydation, ou
- un ou plusieurs anticorps dirigé(s) contre au moins une entérobactérie, et un ou plusieurs anticorps dirigé(s) contre un produit nitré ou nitrosylé, ou
- un ou plusieurs anticorps dirigé(s) contre au moins une entérobactérie, et un ou plusieurs anticorps dirigé(s) contre un produit issu de la lipopéroxydation et un ou plusieurs anticorps dirigé(s) contre un produit nitré ou nitrosylé.
En effet, selon l’invention, si ces anticorps sont présents dans l’échantillon de fluide biologique testé, en particulier dans le sérum et/ou le plasma testé, c’est-à-dire si le test est positif pour au moins ces anticorps, alors cela signifie que la personne est atteinte d’une maladie auto-immune chronique.
Préférentiellement le procédé selon l’invention comprend le dosage immunologique de la présence d’au moins un anticorps dirigé contre une endobactérie (contre un constituant bactérien d’une endobactérie) choisi parmi les anticorps suivants :
- anticorps dirigé(s) contre la bactériePseudomonas putida,
- anticorps dirigé(s) contre la bactérieHafnia alvei,
- anticorps dirigé(s) contre la bactériePseudomonas aeruginosa,
- anticorps dirigé(s) contre la bactériePseudomonas pneumonae,
- anticorps dirigé(s) contre la bactérieMorganella morganii,
- anticorps dirigé(s) contre la bactérieProteus mirabilis
- anticorps dirigé(s) contre la bactérieCitrobacter koserii.
- anticorps dirigé(s) contre la bactériePseudomonas putida,
- anticorps dirigé(s) contre la bactérieHafnia alvei,
- anticorps dirigé(s) contre la bactériePseudomonas aeruginosa,
- anticorps dirigé(s) contre la bactériePseudomonas pneumonae,
- anticorps dirigé(s) contre la bactérieMorganella morganii,
- anticorps dirigé(s) contre la bactérieProteus mirabilis
- anticorps dirigé(s) contre la bactérieCitrobacter koserii.
Les entérobactéries et en particulier les entérobactéries à Gram négatif, possèdent une paroi dont la structure en trois couches leur est spécifique. Cette paroi est constituée de l’extérieur ver l’intérieur : d’une membrane externe, d’une couche mince de peptidoglycane, d’un espace périplasmique qui entoure la membrane cytoplasmique. La membrane externe est constituée d’une double couche lipidique dans laquelle sont incluses des molécules de lipopolysaccharides. Le peptidoglycane constitue une couche rigide, plus mince et plus lâche que chez les bactéries à Gram positif. Il est composé de chaînes linéaires et polyosides reliées entre elles par des peptides. L’espace périplasmique entoure la membrane cytoplasmique.
Ces bactéries sont non pathogènes et peuvent être présentes sur les muqueuses. Toutefois, si elles passent à travers les muqueuses elles peuvent être à l’origine de pathologies chroniques, en particulier de pathologies chroniques auto-immunes. Leur passage transmucosal engendre :
- une activation du système immun inné,
- une activation du système immunitaire adaptatif,
- une activation non spécifique de clones auto réactifs (super antigènes),
- une toxicité directe (lipopolysaccharides, endotoxines)
- une activation de systèmes enzymatiques : NO synthase inductible et 'Indoléamine 2,3-dioxygénase (IDO-1).
- une activation du système immun inné,
- une activation du système immunitaire adaptatif,
- une activation non spécifique de clones auto réactifs (super antigènes),
- une toxicité directe (lipopolysaccharides, endotoxines)
- une activation de systèmes enzymatiques : NO synthase inductible et 'Indoléamine 2,3-dioxygénase (IDO-1).
Selon l’invention, la présence dans le fluide biologique testé, en particulier dans le sérum et/ou dans le plasma d’un ou plusieurs anticorps dirigé(s) contre ces bactéries signifie une hyper perméabilité mucosale, qui participe au développement des maladies auto-immunes.
Préférentiellement, le procédé selon l’invention comprend le dosage immunologique de la présence dans l’échantillon de :
- IgA (et/ou IgE pour les animaux) dirigé(s) contre la bactériePseudomonas putida, et/ou
- IgA (et/ou IgE pour les animaux) dirigé(s) contre la bactérieHafnia alvei, et/ou
- IgA (et/ou IgE pour les animaux) dirigé(s) contre la bactérie Pseudomonas aeruginosa, et/ou
- IgA (et/ou IgE pour les animaux) dirigé(s) contre la bactériePseudomonas pneumonae, et/ou
- IgA (et/ou IgE pour les animaux) dirigé(s) contre la bactérieMorganella morganii, et/ou
- IgA (et/ou IgE pour les animaux) dirigé(s) contre la bactérieProteus mirabilis, et/ou
- IgA (et/ou IgE pour les animaux) dirigé(s) contre la bactérieCitrobacter koserii. et/ou.
- IgA (et/ou IgE pour les animaux) dirigé(s) contre la bactériePseudomonas putida, et/ou
- IgA (et/ou IgE pour les animaux) dirigé(s) contre la bactérieHafnia alvei, et/ou
- IgA (et/ou IgE pour les animaux) dirigé(s) contre la bactérie Pseudomonas aeruginosa, et/ou
- IgA (et/ou IgE pour les animaux) dirigé(s) contre la bactériePseudomonas pneumonae, et/ou
- IgA (et/ou IgE pour les animaux) dirigé(s) contre la bactérieMorganella morganii, et/ou
- IgA (et/ou IgE pour les animaux) dirigé(s) contre la bactérieProteus mirabilis, et/ou
- IgA (et/ou IgE pour les animaux) dirigé(s) contre la bactérieCitrobacter koserii. et/ou.
Préférentiellement le procédé selon l’invention comprend le dosage immunologique de la présence d’au moins un anticorps dirigé contre un produit de la lipopéroxydation choisi parmi les anticorps suivants :
- anticorps dirigé(s) contre l’acide palmitique,
- anticorps dirigé(s) contre l’acide myristique,
- anticorps dirigé(s) contre l’acide oléique,
- anticorps dirigé(s) contre le malondialdéhyde
- anticorps dirigé(s) contre l’acétylcholine
- anticorps dirigé(s) contre l’acide azélaïque,
- anticorps dirigé(s) contre un phospholipide.
- anticorps dirigé(s) contre l’acide palmitique,
- anticorps dirigé(s) contre l’acide myristique,
- anticorps dirigé(s) contre l’acide oléique,
- anticorps dirigé(s) contre le malondialdéhyde
- anticorps dirigé(s) contre l’acétylcholine
- anticorps dirigé(s) contre l’acide azélaïque,
- anticorps dirigé(s) contre un phospholipide.
Le NO est à l’origine de nombreuses espèces radicalaires toxiques nommées oxygénées réactives (ROS). Parmi ces ROS, on peut citer notamment les peroxydes lipidiques et leurs produits de décomposition, les aldéhydes, mais également l’oxygène signulet et les peroxynitrites. Les ROS manifestent leur toxicité lorsqu’ils dépassent les possibilités de défense cellulaire. Ces ROS ont un rôle agressif. Elles s’attaquent aux membranes phospholipidiques, aux protéines et à l’ADN. Lorsqu’elles s’attaquent aux membranes phospholipidiques, l’attaque radicalaire peut modifier les composés lipidiques constituant la cellule et ainsi altérer les messages provenant de l’environnement vers l’intérieur de la cellule, entraînant un dysfonctionnement qui peut être irréversible.
Cette lipopéroxydation est une réaction en cascade qui démarre par l’oxydation des chaînes d’acides gras constitutives des phospholipides, préférentiellement des acides gras insaturés possédant des doubles liaisons carbone-carbone. Ces acides gras insaturés assurent au mieux la fluidité des membranes. Ils deviennent plus instables et plus fragiles.
La lipopéroxydation est rendue possible, d’une part, par l’existence de ces doubles liaisons des acides gras polyinsaturés qui facilite la délocalisation de l’électron libre, et, d’autre part, par la présence d’oxygène moléculaire qui va aisément apparier l’un de ses électrons avec l’électron libre délocalisé.
La lipopéroxydation est rendue possible, d’une part, par l’existence de ces doubles liaisons des acides gras polyinsaturés qui facilite la délocalisation de l’électron libre, et, d’autre part, par la présence d’oxygène moléculaire qui va aisément apparier l’un de ses électrons avec l’électron libre délocalisé.
Il existe plusieurs types de lipopéroxydation :
- une première cascade radicalaire, très active, qui va générer la production de radicaux libres,
- la réaction du radical superoxyde O2-avec le NO qui conduit à la formation de peroxynitrites très agressifs qui vont provoquer la dégradation des acides gras en hydroperoxydes puis en malondialdéhyde (molécule de petite taille, extrêmement réactive avec des résidus aminés, et n’existant normalement pas dans l’organisme).
- un autre type de lipopéroxydation, plus doux, provoque, par hydrolyse une cassure des doubles liaisons des acides gras polyinsaturés avec la formation de diacides, dont un des composés principaux est l’acide azélaïque.
- une première cascade radicalaire, très active, qui va générer la production de radicaux libres,
- la réaction du radical superoxyde O2-avec le NO qui conduit à la formation de peroxynitrites très agressifs qui vont provoquer la dégradation des acides gras en hydroperoxydes puis en malondialdéhyde (molécule de petite taille, extrêmement réactive avec des résidus aminés, et n’existant normalement pas dans l’organisme).
- un autre type de lipopéroxydation, plus doux, provoque, par hydrolyse une cassure des doubles liaisons des acides gras polyinsaturés avec la formation de diacides, dont un des composés principaux est l’acide azélaïque.
La présence de produits issus de la lipopéroxydation chez l’homme ou l’animal provoque une perturbation de constituants cellulaires et membranaires entraînant la formation de néo-antigènes et par conséquent une activation immune et auto-immune à l’origine de la maladie auto-immune
Préférentiellement, le procédé selon l’invention comprend le dosage immunologique de la présence dans l’échantillon de :
- IgA (et/ou IgE pour les animaux) dirigé(s) contre l’acide myristique, et/ou
- IgA (et/ou IgE pour les animaux) dirigé(s) contre l’acide oléique, et/ou
- IgM (et/ou IgE pour les animaux) dirigé(s) contre le malondialdéhyde, et/ou
- IgM (et/ou IgE pour les animaux) dirigé(s) contre l’acétylcholine.
- IgM (et/ou IgE pour les animaux) dirigé(s) contre l’acide azélaïque, et/ou
- IgA et/ou IgM et/ou IgG (et/ou IgE pour les animaux) dirigé(s) contre contre un phospholipide.
- IgM (et/ou IgE pour les animaux) dirigé(s) contre l’acide palmitique.
- IgA (et/ou IgE pour les animaux) dirigé(s) contre l’acide myristique, et/ou
- IgA (et/ou IgE pour les animaux) dirigé(s) contre l’acide oléique, et/ou
- IgM (et/ou IgE pour les animaux) dirigé(s) contre le malondialdéhyde, et/ou
- IgM (et/ou IgE pour les animaux) dirigé(s) contre l’acétylcholine.
- IgM (et/ou IgE pour les animaux) dirigé(s) contre l’acide azélaïque, et/ou
- IgA et/ou IgM et/ou IgG (et/ou IgE pour les animaux) dirigé(s) contre contre un phospholipide.
- IgM (et/ou IgE pour les animaux) dirigé(s) contre l’acide palmitique.
Préférentiellement le procédé selon l’invention comprend le dosage immunologique de la présence d’au moins un anticorps dirigé contre un produit nitré ou nitrosylé choisi parmi les anticorps suivants :
- anticorps dirigé(s) contre la NO-Cystéine,
- anticorps dirigé(s) contre la NO-asparagine,
- anticorps dirigé(s) contre la NO-histidine,
- anticorps dirigé(s) contre la NO-Tyrosine,
- anticorps dirigé(s) contre la NO2-Tyrosine,
- anticorps dirigé(s) contre la NO-citrulline,
- anticorps dirigé(s) contre la NO-arginine,
- anticorps dirigé(s) contre le NO-Tryptophane,
- anticorps dirigé(s) contre la NO-méthionine,
- anticorps dirigé(s) contre la NO-histamine,
- anticorps dirigé(s) contre la NO-phénylalanine,
- anticorps dirigé(s) contre la NO-bovine sérum albumine
- anticorps dirigé(s) contre la NO-proline.
- anticorps dirigé(s) contre la NO-Cystéine,
- anticorps dirigé(s) contre la NO-asparagine,
- anticorps dirigé(s) contre la NO-histidine,
- anticorps dirigé(s) contre la NO-Tyrosine,
- anticorps dirigé(s) contre la NO2-Tyrosine,
- anticorps dirigé(s) contre la NO-citrulline,
- anticorps dirigé(s) contre la NO-arginine,
- anticorps dirigé(s) contre le NO-Tryptophane,
- anticorps dirigé(s) contre la NO-méthionine,
- anticorps dirigé(s) contre la NO-histamine,
- anticorps dirigé(s) contre la NO-phénylalanine,
- anticorps dirigé(s) contre la NO-bovine sérum albumine
- anticorps dirigé(s) contre la NO-proline.
Le NO (monoxyde d’azote) possède un électron célibataire qui lui confère une réactivité très rapide. Elle dépend de ses capacités à partager son électron avec d’autres radicaux ou métaux. Dans les milieux biologiques, la synthèse de NO à partir de la L-arginine passe par un intermédiaire, l’hydroxy-L-arginine (HOA) sous l’action d’une NOSynthase (NOS). L’oxydation au niveau de l’azote terminal de la fonction guanidine conduit à la formation de NO.
Deux types de NOS sont présentes chez la plupart des vertébrés : les NOS dites constitutives (cNOS) et les NOS inductibles (iNOS).
Deux types de NOS sont présentes chez la plupart des vertébrés : les NOS dites constitutives (cNOS) et les NOS inductibles (iNOS).
Les produits nitrés ou nitrosylés sont des néo-antigènes résultant d’une hyperproduction de NO et/ou de peroxynitrite suite à l’activation de la NO synthase inductible principalement dans les cellules du système immunitaire inné par des bactéries, virus, polluants, etc. L’excès de NO et/ou de peroxynitrite entraîne leur liaison sur des protéines endogènes qui deviennent immunogéniques. Les protéines endogènes ainsi modifiées dans leur structure entraînent une activation immune et auto-immune et par conséquent une maladie auto-immune.
Préférentiellement, le procédé selon l’invention comprend le dosage immunologique de la présence dans l’échantillon de :
- IgA (et/ou IgE pour les animaux) dirigé(s) contre la NO-Cystéine, et/ou
- IgA et/ou IgG (et/ou IgE pour les animaux) dirigé(s) contre la NO-asparagine, et/ou
- IgA et/ou IgM (et/ou IgE pour les animaux) dirigé(s) contre la NO-histidine
- IgA et/ou IgM (et/ou IgE pour les animaux) dirigé(s) contre la NO-Tyrosine, et/ou
- IgA et/ou IgM (et/ou IgE pour les animaux) dirigé(s) contre la NO2-Tyrosine, et/ou
- IgA (et/ou IgE pour les animaux) dirigé(s) contre la NO-citrulline, et/ou
- IgA (et/ou IgE pour les animaux) dirigé(s) contre le NO-Tryptophane, et/ou
- IgA (et/ou IgE pour les animaux) dirigé(s) contre la NO-méthionine, et/ou
- IgA (et/ou IgE pour les animaux) dirigé(s) contre la NO-histamine, et/ou
- IgA et/ou IgG et/ou IgM (et/ou IgE pour les animaux) dirigé(s) contre la NO-phénylalanine, et/ou
- IgA et/ou IgG (et/ou IgE pour les animaux) dirigé(s) contre la NO-bovine sérum albumine.
- IgA et/ou IgG (et/ou IgE pour les animaux) dirigé(s) contre la NO-proline.
- IgA (et/ou IgE pour les animaux) dirigé(s) contre la NO-Cystéine, et/ou
- IgA et/ou IgG (et/ou IgE pour les animaux) dirigé(s) contre la NO-asparagine, et/ou
- IgA et/ou IgM (et/ou IgE pour les animaux) dirigé(s) contre la NO-histidine
- IgA et/ou IgM (et/ou IgE pour les animaux) dirigé(s) contre la NO-Tyrosine, et/ou
- IgA et/ou IgM (et/ou IgE pour les animaux) dirigé(s) contre la NO2-Tyrosine, et/ou
- IgA (et/ou IgE pour les animaux) dirigé(s) contre la NO-citrulline, et/ou
- IgA (et/ou IgE pour les animaux) dirigé(s) contre le NO-Tryptophane, et/ou
- IgA (et/ou IgE pour les animaux) dirigé(s) contre la NO-méthionine, et/ou
- IgA (et/ou IgE pour les animaux) dirigé(s) contre la NO-histamine, et/ou
- IgA et/ou IgG et/ou IgM (et/ou IgE pour les animaux) dirigé(s) contre la NO-phénylalanine, et/ou
- IgA et/ou IgG (et/ou IgE pour les animaux) dirigé(s) contre la NO-bovine sérum albumine.
- IgA et/ou IgG (et/ou IgE pour les animaux) dirigé(s) contre la NO-proline.
Le procédé selon l’invention, en plus (soit en même temps, soit dans un test séparé) du dosage immunologique de la présence dans l’échantillon d’un ou plusieurs anticorps dirigé(s) contre au moins une entérobactérie et d’un ou plusieurs anticorps dirigé(s) contre un produit d’oxydation du tryptophane, peut comprendre également le dosage immunologique de la présence dans l’échantillon d’un ou plusieurs autres anticorps. Il peut s’agir préférentiellement :
- d’au moins un anticorps dirigé contre un produit d’oxydation du tryptophane, et/ou
- d’au moins un anticorps dirigé contreMycobacterium tuberculosis.
- d’au moins un anticorps dirigé contre un produit d’oxydation du tryptophane, et/ou
- d’au moins un anticorps dirigé contreMycobacterium tuberculosis.
Préférentiellement le procédé selon l’invention comprend le dosage immunologique de la présence d’au moins un anticorps dirigé contre un produit d’oxydation du tryptophane choisi parmi les anticorps suivants :
- anticorps dirigé(s) contre l’acide kynuérnique,
- anticorps dirigé(s) contre la 3-hydroxykynurénine,
- anticorps dirigé(s) contre l’acide quinolinique,
- anticorps dirigé(s) contre l’acide quinaldique,
- anticorps dirigé(s) contre l’acide xanthurénique,
- anticorps dirigé(s) contre l’acide anthranilique,
- anticorps dirigé(s) contre l’acide 3-hydroxyanthranilique.
- anticorps dirigé(s) contre l’acide kynuérnique,
- anticorps dirigé(s) contre la 3-hydroxykynurénine,
- anticorps dirigé(s) contre l’acide quinolinique,
- anticorps dirigé(s) contre l’acide quinaldique,
- anticorps dirigé(s) contre l’acide xanthurénique,
- anticorps dirigé(s) contre l’acide anthranilique,
- anticorps dirigé(s) contre l’acide 3-hydroxyanthranilique.
Le L-tryptophane est métabolisé en un grand nombre de produits dérivés : neurotransmetteurs, neurohormonaux actifs au niveau du système nerveux. Les plus connus sont la sérotonine et la mélatonine par la voie de la tryptophane hydroxylase.
La voie IDO (Indolamine droxygénase) métabolise également le tryptophane. C’est une voie enzymatique inductible. Elle est présente dans les cellules neuronales microgiales et les cellules de la lignée monocyto-macrophagique. Il existe de nombreuses molécules activatrices de la voie IDO. Les principales sont le TNF-α, les interleukines IL-12 et IL-18, l’interféron-γ, et les microorganismes et leurs dérivés.
La voie IDO (Indolamine droxygénase) métabolise également le tryptophane. C’est une voie enzymatique inductible. Elle est présente dans les cellules neuronales microgiales et les cellules de la lignée monocyto-macrophagique. Il existe de nombreuses molécules activatrices de la voie IDO. Les principales sont le TNF-α, les interleukines IL-12 et IL-18, l’interféron-γ, et les microorganismes et leurs dérivés.
L’IDO dégrade le L-tryptophane en N-formylkynurénine. Un système enzymatique complexe convertit ensuite la N-formylkynurénine en L-kynurénine. Cette dernière est métabolisée en différents composés par de nombreuses enzymes. La kynuréninase convertit la L-Kynurénine en acide anthranilique qui donne l’acide 3-hydroxy-anthranilique. Cet acide peut ensuite être transformé en acide 3-hydroxyanthranilique. La L-kynurénine est aussi dégradée en 3-hydroxykynurénine par la kynurénine 3-hydroxylase. La forme hydroxylée est convertie en acide 3-hydroxyanthranilique par une kynuréninase. Ce dernier composé est métabolisé par l’acide 3-hydroxyanthranilique oxygénase en un produit intermédiaire à l’origine de trois voies distinctes. Il donne soit un acide picolinique par la picolinique carboxylase, soit un acide quinolinique. La L-kynurénine est convertie en kynuréamine par des décarboxylases, ou en acide kynurénique par la kynurénine aminotransférase. Cet acide kynurénique est à l’origine de la synthèse d’acide quinaldique.
La voie IDO limite le pool de L-tryptophane extracellulaire ce qui favorise la réplication d’un grand nombre de cellules, et les produits d’oxydation du tryptophane, c’est-à-dire les produits résultant de l’activation de la voie IDO, induisent soit une apoptose cellulaire soit une immuno toxicité soit une protection cellulaire et tissulaire. Leur hyperproduction provoque la formation de néo-antigènes et par conséquent une maladie auto-immune.
Préférentiellement, le procédé selon l’invention comprend le dosage immunologique de la présence dans l’échantillon de :
- IgA (et/ou IgE pour les animaux) dirigé(s) contre l’acide kynuérnique, et/ou
- IgA (et/ou IgE pour les animaux) dirigé(s) contre la 3-hydroxykynurénine, et/ou
- IgA (et/ou IgE pour les animaux) dirigé(s) contre l’acide quinolinique, et/ou
- IgA (et/ou IgE pour les animaux) dirigé(s) contre l’acide quinaldique,
- IgG (et/ou IgE pour les animaux) dirigé(s) contre l’acide xanthurénique, et/ou
- IgA (et/ou IgE pour les animaux) dirigé(s) contre l’acide anthranilique, et/ou
- IgA (et/ou IgE pour les animaux) dirigé(s) contre l’acide 3-hydroxyanthranilique.
- IgA (et/ou IgE pour les animaux) dirigé(s) contre l’acide kynuérnique, et/ou
- IgA (et/ou IgE pour les animaux) dirigé(s) contre la 3-hydroxykynurénine, et/ou
- IgA (et/ou IgE pour les animaux) dirigé(s) contre l’acide quinolinique, et/ou
- IgA (et/ou IgE pour les animaux) dirigé(s) contre l’acide quinaldique,
- IgG (et/ou IgE pour les animaux) dirigé(s) contre l’acide xanthurénique, et/ou
- IgA (et/ou IgE pour les animaux) dirigé(s) contre l’acide anthranilique, et/ou
- IgA (et/ou IgE pour les animaux) dirigé(s) contre l’acide 3-hydroxyanthranilique.
Selon l’invention, la présence dans le fluide biologique d’au moins un anticorps dirigé contre un produit d’oxydation du tryptophane, en particulier d’IgA et/ou d’Ig M et/ou d’IgG (et/ou IgE pour les animaux), et la présence dans le fluide biologique d’au moins un anticorps dirigé contre une entérobactérie, en particulier d’IgA et/ou d’Ig M et/ou d’IgG (et/ou IgE pour les animaux), signifie obligatoirement que la personne ou l’animal concerné est atteint par une maladie auto-immune.
Le procédé selon l’invention peut comprendre également le dosage immunologique de la présence d’au moins un anticorps dirigé contre au moins un anticorps dirigé contreMycobacterium tuberculosis.
Mycobacterium tuberculosisest une bactérie pathogène à Gram positif responsable de la tuberculose. Elle intervient également chez des patients atteints d’autres maladies tels que des personnes ou animaux atteints de certaines maladies auto-immunes. Elle ne produit de façon incontrôlée sur un terrain favorable pas de toxines libérées mais ces constituants membranaires sont libérés et ont un effet toxique et doit son pouvoir pathogène à sa capacité à se multiplier. La lyse des bactéries libère des constituants antigéniques qui suscitent une réaction immunitaire induisant un état d’hypersensibilité.
Leur présence chez l’homme ou l’animal provoque la libération de constituants membranaires (acide mycolique) dont certains ont une activité toxique et active le système immunitaire inné par des liaisons à des récepteurs spécifiques entrainant une activation immune et auto-immune et par conséquent une maladie auto-immune.
Selon un mode particulier de réalisation, le procédé selon l’invention est spécifiquement destiné à la détection ou le suivi de l’évolution de la sclérose en plaques. Dans ce cas le procédé est préférentiellement réalisé par dosage immunologique de la présence d’anticorps dans l’échantillon, dont au moins :
- un ou plusieurs des anticorps suivants :
* anticorps dirigé(s) contre la bactériePseudomonas putida,
* anticorps dirigé(s) contre la bactérieHafnia alvei,
* anticorps dirigé(s) contre la bactériePseudomonas aeruginosa,
* anticorps dirigé(s) contre la bactériePseudomonas pneumonae,
* anticorps dirigé(s) contre la bactérieMorganella morganii,
* anticorps dirigé(s) contre la bactérieProteus mirabilis
* anticorps dirigé(s) contre la bactérieCitrobacter koserii
- et un ou plusieurs des anticorps suivants :
* anticorps dirigé(s) contre l’acide palmitique,
* anticorps dirigé(s) contre l’acide oléique,
* anticorps dirigé(s) contre le malondialdéhyde
* anticorps dirigé(s) contre l’acétylcholine
* anticorps dirigé(s) contre l’acide azélaïque,
* anticorps dirigé(s) contre un phospholipide
* anticorps dirigé(s) contre la NO-Cystéine,
* anticorps dirigé(s) contre la NO-asparagine,
* anticorps dirigé(s) contre la NO-histidine,
* anticorps dirigé(s) contre la NO-Tyrosine,
* anticorps dirigé(s) contre la NO2-Tyrosine,
* anticorps dirigé(s) contre la NO-citrulline,
* anticorps dirigé(s) contre la NO-arginine,
* anticorps dirigé(s) contre le NO-Tryptophane,
* anticorps dirigé(s) contre la NO-méthionine,
* anticorps dirigé(s) contre la NO-histamine,
* anticorps dirigé(s) contre la NO-phénylalanine,
* anticorps dirigé(s) contre la NO-bovine sérum albumine
* anticorps dirigé(s) contre la NO-proline.
Le procédé dans ce cas peut également comprendre le dosage immunologique de la présence d’un ou plusieurs des anticorps suivants :
- anticorps dirigé(s) contre l’acide kynuérnique,
- anticorps dirigé(s) contre la 3-hydroxykynurénine,
- anticorps dirigé(s) contre l’acide quinolinique,
- anticorps dirigé(s) contre l’acide quinaldique,
- anticorps dirigé(s) contre l’acide xanthurénique,
- anticorps dirigé(s) contre l’acide anthranilique,
- anticorps dirigé(s) contre l’acide 3-hydroxyanthranilique
- un ou plusieurs des anticorps suivants :
* anticorps dirigé(s) contre la bactériePseudomonas putida,
* anticorps dirigé(s) contre la bactérieHafnia alvei,
* anticorps dirigé(s) contre la bactériePseudomonas aeruginosa,
* anticorps dirigé(s) contre la bactériePseudomonas pneumonae,
* anticorps dirigé(s) contre la bactérieMorganella morganii,
* anticorps dirigé(s) contre la bactérieProteus mirabilis
* anticorps dirigé(s) contre la bactérieCitrobacter koserii
- et un ou plusieurs des anticorps suivants :
* anticorps dirigé(s) contre l’acide palmitique,
* anticorps dirigé(s) contre l’acide oléique,
* anticorps dirigé(s) contre le malondialdéhyde
* anticorps dirigé(s) contre l’acétylcholine
* anticorps dirigé(s) contre l’acide azélaïque,
* anticorps dirigé(s) contre un phospholipide
* anticorps dirigé(s) contre la NO-Cystéine,
* anticorps dirigé(s) contre la NO-asparagine,
* anticorps dirigé(s) contre la NO-histidine,
* anticorps dirigé(s) contre la NO-Tyrosine,
* anticorps dirigé(s) contre la NO2-Tyrosine,
* anticorps dirigé(s) contre la NO-citrulline,
* anticorps dirigé(s) contre la NO-arginine,
* anticorps dirigé(s) contre le NO-Tryptophane,
* anticorps dirigé(s) contre la NO-méthionine,
* anticorps dirigé(s) contre la NO-histamine,
* anticorps dirigé(s) contre la NO-phénylalanine,
* anticorps dirigé(s) contre la NO-bovine sérum albumine
* anticorps dirigé(s) contre la NO-proline.
Le procédé dans ce cas peut également comprendre le dosage immunologique de la présence d’un ou plusieurs des anticorps suivants :
- anticorps dirigé(s) contre l’acide kynuérnique,
- anticorps dirigé(s) contre la 3-hydroxykynurénine,
- anticorps dirigé(s) contre l’acide quinolinique,
- anticorps dirigé(s) contre l’acide quinaldique,
- anticorps dirigé(s) contre l’acide xanthurénique,
- anticorps dirigé(s) contre l’acide anthranilique,
- anticorps dirigé(s) contre l’acide 3-hydroxyanthranilique
Selon un mode particulier de réalisation, le procédé selon l’invention est spécifiquement destiné à la détection ou le suivi de l’évolution de la polyarthrite. Dans ce cas le procédé est préférentiellement réalisé par dosage immunologique de la présence d’anticorps dans l’échantillon, dont au moins :
- un ou plusieurs des anticorps suivants :
* anticorps dirigé(s) contre la bactériePseudomonas putida,
* anticorps dirigé(s) contre la bactérieHafnia alvei,
* anticorps dirigé(s) contre la bactériePseudomonas aeruginosa,
* anticorps dirigé(s) contre la bactérieMorganella morganii,
* anticorps dirigé(s) contre la bactérieProteus mirabilis
* anticorps dirigé(s) contre la bactérieCitrobacter koserii
- et un ou plusieurs des anticorps suivants :
* anticorps dirigé(s) contre l’acide palmitique,
* anticorps dirigé(s) contre l’acide myristique,
* anticorps dirigé(s) contre l’acide oléique,
* anticorps dirigé(s) contre le malondialdéhyde
* anticorps dirigé(s) contre l’acétylcholine
* anticorps dirigé(s) contre l’acide azélaïque,
* anticorps dirigé(s) contre un phospholipide
* anticorps dirigé(s) contre la NO-Cystéine,
* anticorps dirigé(s) contre la NO-asparagine,
* anticorps dirigé(s) contre la NO-histidine,
* anticorps dirigé(s) contre la NO-proline.
- un ou plusieurs des anticorps suivants :
* anticorps dirigé(s) contre la bactériePseudomonas putida,
* anticorps dirigé(s) contre la bactérieHafnia alvei,
* anticorps dirigé(s) contre la bactériePseudomonas aeruginosa,
* anticorps dirigé(s) contre la bactérieMorganella morganii,
* anticorps dirigé(s) contre la bactérieProteus mirabilis
* anticorps dirigé(s) contre la bactérieCitrobacter koserii
- et un ou plusieurs des anticorps suivants :
* anticorps dirigé(s) contre l’acide palmitique,
* anticorps dirigé(s) contre l’acide myristique,
* anticorps dirigé(s) contre l’acide oléique,
* anticorps dirigé(s) contre le malondialdéhyde
* anticorps dirigé(s) contre l’acétylcholine
* anticorps dirigé(s) contre l’acide azélaïque,
* anticorps dirigé(s) contre un phospholipide
* anticorps dirigé(s) contre la NO-Cystéine,
* anticorps dirigé(s) contre la NO-asparagine,
* anticorps dirigé(s) contre la NO-histidine,
* anticorps dirigé(s) contre la NO-proline.
Pour mettre en œuvre le procédéex vivode détection et/ou de suivi de l’évolution d’une maladie, l’invention a également pour objet des kits de diagnostic.
En particulier, l’invention a pour objet un kit pour son utilisation dans la détection ou le suivi de l’évolution d’une maladie chronique auto-immune, dans un échantillon de fluide biologique, en particulier dans un échantillon de fluide biologique humain ou animal comprenant au moins le ou les antigènes contre lesquels sont dirigé(s)s les anticorps dont on cherche à détecter la présence dans l’échantillon, à savoir préférentiellement un ou plusieurs anticorps choisis parmi :
- anticorps dirigé(s) contre la bactériePseudomonas putida,
- anticorps dirigé(s) contre la bactérieHafnia alvei,
- anticorps dirigé(s) contre la bactériePseudomonas aeruginosa,
- anticorps dirigé(s) contre la bactériePseudomonas pneumonae,
- anticorps dirigé(s) contre la bactérieMorganella morganii,
- anticorps dirigé(s) contre la bactérieProteus mirabilis
- anticorps dirigé(s) contre la bactérieCitrobacter koserii
- anticorps dirigé(s) contre l’acide palmitique,
- anticorps dirigé(s) contre l’acide myristique,
- anticorps dirigé(s) contre l’acide oléique,
- anticorps dirigé(s) contre le malondialdéhyde
- anticorps dirigé(s) contre l’acétylcholine
- anticorps dirigé(s) contre l’acide azélaïque,
- anticorps dirigé(s) contre un phospholipide
- anticorps dirigé(s) contre la NO-Cystéine,
- anticorps dirigé(s) contre la NO-asparagine,
- anticorps dirigé(s) contre la NO-histidine,
- anticorps dirigé(s) contre la NO-Tyrosine,
- anticorps dirigé(s) contre la NO2-Tyrosine,
- anticorps dirigé(s) contre la NO-citrulline,
- anticorps dirigé(s) contre la NO-arginine,
- anticorps dirigé(s) contre le NO-Tryptophane,
- anticorps dirigé(s) contre la NO-méthionine,
- anticorps dirigé(s) contre la NO-histamine,
- anticorps dirigé(s) contre la NO-phénylalanine,
- anticorps dirigé(s) contre la NO-bovine sérum albumine
- anticorps dirigé(s) contre la NO-proline
- anticorps dirigé(s) contre l’acide kynuérnique,
- anticorps dirigé(s) contre la 3-hydroxykynurénine,
- anticorps dirigé(s) contre l’acide quinolinique,
- anticorps dirigé(s) contre l’acide quinaldique,
- anticorps dirigé(s) contre l’acide xanthurénique,
- anticorps dirigé(s) contre l’acide anthranilique,
- anticorps dirigé(s) contre l’acide 3-hydroxyanthranilique
- anticorps dirigé(s) contreMycobacterium tuberculosis.
- anticorps dirigé(s) contre la bactériePseudomonas putida,
- anticorps dirigé(s) contre la bactérieHafnia alvei,
- anticorps dirigé(s) contre la bactériePseudomonas aeruginosa,
- anticorps dirigé(s) contre la bactériePseudomonas pneumonae,
- anticorps dirigé(s) contre la bactérieMorganella morganii,
- anticorps dirigé(s) contre la bactérieProteus mirabilis
- anticorps dirigé(s) contre la bactérieCitrobacter koserii
- anticorps dirigé(s) contre l’acide palmitique,
- anticorps dirigé(s) contre l’acide myristique,
- anticorps dirigé(s) contre l’acide oléique,
- anticorps dirigé(s) contre le malondialdéhyde
- anticorps dirigé(s) contre l’acétylcholine
- anticorps dirigé(s) contre l’acide azélaïque,
- anticorps dirigé(s) contre un phospholipide
- anticorps dirigé(s) contre la NO-Cystéine,
- anticorps dirigé(s) contre la NO-asparagine,
- anticorps dirigé(s) contre la NO-histidine,
- anticorps dirigé(s) contre la NO-Tyrosine,
- anticorps dirigé(s) contre la NO2-Tyrosine,
- anticorps dirigé(s) contre la NO-citrulline,
- anticorps dirigé(s) contre la NO-arginine,
- anticorps dirigé(s) contre le NO-Tryptophane,
- anticorps dirigé(s) contre la NO-méthionine,
- anticorps dirigé(s) contre la NO-histamine,
- anticorps dirigé(s) contre la NO-phénylalanine,
- anticorps dirigé(s) contre la NO-bovine sérum albumine
- anticorps dirigé(s) contre la NO-proline
- anticorps dirigé(s) contre l’acide kynuérnique,
- anticorps dirigé(s) contre la 3-hydroxykynurénine,
- anticorps dirigé(s) contre l’acide quinolinique,
- anticorps dirigé(s) contre l’acide quinaldique,
- anticorps dirigé(s) contre l’acide xanthurénique,
- anticorps dirigé(s) contre l’acide anthranilique,
- anticorps dirigé(s) contre l’acide 3-hydroxyanthranilique
- anticorps dirigé(s) contreMycobacterium tuberculosis.
Préférentiellement, le kit selon l’invention comprend au moins :
- le ou les antigènes contre lesquels sont dirigés les anticorps dont on cherche à détecter la présence dans l’échantillon, préférentiellement couplés à une protéine lorsqu’il ne s’agit pas de bactéries, et une plaque de micro titration destinée à être sensibilisée avec le ou les antigènes contre lesquels sont dirigés les anticorps dont on cherche à détecter la présence dans l’échantillon, ou une plaque de micro titration déjà sensibilisée avec le ou les antigènes contre lesquels sont dirigés les anticorps dont on cherche à détecter la présence dans l’échantillon, ou une bandelette ou barrette déjà sensibilisée avec le ou les antigènes contre lesquels sont dirigés les anticorps dont on cherche à détecter la présence dans l’échantillon, et
- les étalons permettant d’évaluer la qualité du test et le calcul du z, et/ou
- des tampons et des solutions adaptés à la réalisation d’un test Elisa, et/ou
- le ou les anticorps secondaire(s) en solution, lesdits anticorps secondaire(s) correspondant aux anticorps primaires dont on cherche à détecter la présence dans l’échantillon et avec la même isotypie, et/ou
- des tampons de dilution et de lavage, et/ou
- des tampons de révélation, et/ou
- une solution d’arrêt.
- le ou les antigènes contre lesquels sont dirigés les anticorps dont on cherche à détecter la présence dans l’échantillon, préférentiellement couplés à une protéine lorsqu’il ne s’agit pas de bactéries, et une plaque de micro titration destinée à être sensibilisée avec le ou les antigènes contre lesquels sont dirigés les anticorps dont on cherche à détecter la présence dans l’échantillon, ou une plaque de micro titration déjà sensibilisée avec le ou les antigènes contre lesquels sont dirigés les anticorps dont on cherche à détecter la présence dans l’échantillon, ou une bandelette ou barrette déjà sensibilisée avec le ou les antigènes contre lesquels sont dirigés les anticorps dont on cherche à détecter la présence dans l’échantillon, et
- les étalons permettant d’évaluer la qualité du test et le calcul du z, et/ou
- des tampons et des solutions adaptés à la réalisation d’un test Elisa, et/ou
- le ou les anticorps secondaire(s) en solution, lesdits anticorps secondaire(s) correspondant aux anticorps primaires dont on cherche à détecter la présence dans l’échantillon et avec la même isotypie, et/ou
- des tampons de dilution et de lavage, et/ou
- des tampons de révélation, et/ou
- une solution d’arrêt.
L’invention est à présent illustrée par des exemples et des résultats de mise en œuvre de procédés selon l’invention.
Pour chaque exemple, le protocole a été le suivant :
- prélèvement du plasma du patient
- mise en œuvre du procédé selon l’invention
- résumé des résultats obtenus dans un tableau pour visualiser la détection des anticorps circulants et suivre leur évolution. Si la valeur est < à -2 ou > à +2 la maladie est en train de se développer et si elle passe entre -2 et +2 la maladie est en train de se stabiliser voir de régresser.
- prélèvement du plasma du patient
- mise en œuvre du procédé selon l’invention
- résumé des résultats obtenus dans un tableau pour visualiser la détection des anticorps circulants et suivre leur évolution. Si la valeur est < à -2 ou > à +2 la maladie est en train de se développer et si elle passe entre -2 et +2 la maladie est en train de se stabiliser voir de régresser.
Chaque exemple permet de faire le lien entre le taux d’anticorps et l’état du patient dans sa pathologie.
Exemple 1 : Résultats de la mise en œuvre d’un procédé selon l’invention
sur une personne atteinte de Sclérose en Plaques
sous traitement
Les résultats de la détection et de l’évolution des anticorps circulants au cours de l’évolution de la maladie sont présentés dans le Tableau 1.
| Marqueurs / Ig | 30/08/2016 | 29/12/2016 | 27/03/2017 | 08/08/2017 | 13/01/2018 | 14/05/2018 | 17/09/2018 |
| anti-acide oléique conjugué/M | 2,03 | 2,62 | 3,16 | 2,41 | 2,70 | 3,54 | 1,78 |
| anti-malondialdéhyde conjugué/M | 0,79 | 0,99 | 0,94 | 0,72 | 2,31 | 0,93 | 0,97 |
| anti-phospholipide conjugué/M | 1,32 | 2,58 | 1,36 | 0,77 | 1,55 | 2,83 | 0,54 |
| anti-pseudomonas aeruginosa/M | 2,65 | 1,78 | 1,25 | 1,48 | 2,24 | 3,48 | 2,57 |
| anti-pseudomonas aeruginosa/A | 1,57 | 2,70 | 1,60 | 1,41 | 2,12 | 2,54 | 3,50 |
| anti-mycobacterium tuberculosis/A | -0,82 | -0,81 | -2,25 | -0,94 | -0,61 | -0,96 | -1,28 |
Exemple 2 : Résultats de la mise en œuvre d’un procédé selon l’invention sur une personne atteinte de
sclérose en plaques, sous traitement
Les résultats de la détection et de l’évolution des anticorps circulants au cours de l’évolution de la maladie sont présentés dans le Tableau 2.
| Marqueurs /Ig | 15/08/2016 | 27/02/2017 | 28/08/2017 | 04/04/2018 | 24/09/2018 |
| anti-hafnia alvei/M | 1,12 | 2,69 | 2,82 | -0,70 | 1,53 |
| anti-pseudomonas aeruginosa/M | 2,16 | 5,06 | 4,65 | -0,01 | 2,99 |
| anti-morganella morganii/M | 1,75 | 5,07 | 3,91 | -0,30 | 2,34 |
| anti-pseudomonas putida/M | 3,26 | 6,41 | 7,08 | 0,01 | 4,12 |
| anti-citrobacter koseri/M | 1,71 | 3,84 | 3,87 | -1,03 | 2,12 |
| anti-klebsiella pneumoniae/M | 2,11 | 5,64 | 6,42 | 2,19 | 2,47 |
| anti-pseudomonas aeruginosa/A | 1,51 | 1,34 | 0,77 | 2,56 | 1,23 |
| anti-pseudomonas putida/A | 1,42 | 1,66 | 1,19 | 3,18 | 0,40 |
| anti-klebsiella pneumoniae/A | -0,27 | 5,93 | 0,72 | 7,60 | 3,33 |
| anti-acide oléique conjugué/M | 2,38 | 3,89 | 6,67 | 4,26 | 3,41 |
| anti-malondialdéhyde conjugué/M | 1,47 | 5,17 | 3,87 | 3,83 | 1,41 |
| anti-acide azélaïque conjugué/M | 2,99 | 4,65 | 3,64 | 2,32 | 1,12 |
| anti-phospholipide conjugué/M | 1,86 | 5,86 | 3,63 | 3,00 | 1,39 |
| anti-NO-cystéine conjuguée/M | 0,57 | 4,70 | 2,64 | 2,92 | 1,32 |
| anti-NO2-tyrosine conjuguée/M | 1,43 | 2,65 | 1,94 | 2,90 | 1,47 |
| anti-NO-tryptophane conjugué/M | 0,66 | 2,20 | 1,91 | 2,69 | 1,16 |
| anti-NO-serum albumine/M | 2,98 | 5,21 | 5,09 | 6,39 | 1,66 |
| anti-mycobacterium tuberculosis/G | 3,03 | 3,00 | 4,78 | 3,91 | 2,99 |
Exemple 3 : Résultats de la mise en œuvre d’un procédé selon l’invention sur une personne atteinte
de polyarthrite rhumatoïde sous traitement
.
Les résultats de la détection et de l’évolution des anticorps circulants au cours de l’évolution de la maladie sont présentés dans le Tableau 3.
| Marqueurs /Ig | 07/01/2017 | 12/09/2017 | 17/02/2018 | 02/06/2018 |
| anti-pseudomonas aeruginosa/A | 3,46 | 5,46 | 2,37 | 3,20 |
| anti-pseudomonas putida/A | -0,17 | -0,85 | -1,15 | -1,12 |
| anti-citrobacter koseri/A | -0,38 | -1,11 | 0,18 | 0,76 |
| anti-acide oléique conjugué/M | 12,04 | 10,21 | 12,02 | 16,56 |
| anti-malondialdéhyde conjugué/M | 19,84 | 10,82 | 14,46 | 13,59 |
| anti-acide azélaïque conjugué/M | 6,19 | 3,38 | 4,87 | 5,96 |
| anti-phospholipide conjugué/M | 9,60 | 11,55 | 12,49 | 12,95 |
| anti-NO-cystéine conjuguée/M | 36,52 | 15,74 | 17,57 | 17,72 |
| anti-NO2-tyrosine conjuguée/M | 3,45 | 2,92 | 2,87 | 3,05 |
| anti-NO-tryptophane conjugué/M | 27,15 | 13,00 | 35,52 | 20,01 |
| anti-NO-serum albumine/M | 41,31 | 23,70 | 26,08 | 36,13 |
| anti-phospholipide conjugué/A | 2,00 | -0,77 | -0,32 | -0,45 |
Exemple 4 : Résultats de la mise en œuvre d’un procédé selon l’invention sur une personne atteinte de
polyarthrite rhumatoïde
, sous traitement.
Les résultats de la détection et de l’évolution des anticorps circulants au cours de l’évolution de la maladie sont présentés dans le Tableau 4.
| Marqueurs | 04/07/2016 | 17/10/2016 | 23/01/2017 | 09/05/2017 | 06/09/2017 |
| anti-pseudomonas aeruginosa/M | 1,73 | 2,44 | 2,09 | 1,14 | 2,06 |
| anti-morganella morganii/M | 3,08 | 2,78 | 2,07 | 2,41 | 4,18 |
| anti-pseudomonas putida/M | 2,46 | 2,07 | 3,50 | 2,56 | 2,18 |
| anti-klebsiella pneumoniae/M | 1,31 | 1,62 | 1,36 | 2,63 | 2,62 |
| anti-hafnia alvei/A | 2,90 | 2,70 | 3,29 | 4,72 | 3,82 |
| anti-pseudomonas aeruginosa/A | 9,12 | 5,79 | 6,09 | 4,19 | 7,64 |
| anti-morganella morganii/A | 5,22 | 9,57 | 6,16 | 9,53 | 15,25 |
| anti-pseudomonas putida/A | 9,48 | 6,33 | 4,47 | 8,37 | 4,72 |
| anti-citrobacter koseri/A | 2,16 | 2,57 | 4,01 | 2,92 | 5,75 |
| anti-klebsiella pneumoniae/A | 1,13 | 3,48 | 3,14 | 2,64 | 2,71 |
| anti-acide oléique conjugué/M | 3,64 | -0,75 | 3,29 | 4,48 | 2,97 |
| anti-malondialdéhyde conjugué/M | 2,15 | 2,54 | 2,02 | 3,85 | 1,12 |
| anti-acide azélaïque conjugué/M | 3,01 | 2,66 | 5,10 | 5,35 | 2,69 |
| anti-phospholipide conjugué/M | 3,53 | 1,59 | 3,02 | 3,67 | 3,08 |
| anti-NO-cystéine conjuguée/M | -0,33 | -0,05 | 1,47 | 2,11 | -0,13 |
| anti-NO-serum albumine/M | 0,84 | 0,40 | 2,71 | 2,67 | 1,78 |
| anti-mycobacterium tuberculosis/A | -0,79 | 0,86 | 0,64 | 0,03 | 2,09 |
Claims (14)
- Procédéex vivode détection ou de suivi de l’évolution d’une maladie chronique auto-immune, dans un échantillon de fluide biologique humain ou animal, par dosage immunologique de la présence d’anticorps dans l’échantillon, dont au moins :
- un ou plusieurs anticorps dirigé(s) contre au moins une entérobactérie, choisi(s) parmi les anticorps suivants :
* anticorps dirigé(s) contre la bactériePseudomonas putida,
* anticorps dirigé(s) contre la bactérieHafnia alvei,
* anticorps dirigé(s) contre la bactériePseudomonas aeruginosa,
* anticorps dirigé(s) contre la bactériePseudomonas pneumonae,
* anticorps dirigé(s) contre la bactérieMorganella morganii,
* anticorps dirigé(s) contre la bactérieProteus mirabilis
* anticorps dirigé(s) contre la bactérieCitrobacter koserii, et
- un ou plusieurs anticorps dirigé(s) contre un produit issu de la lipopéroxydation et/ou un ou plusieurs anticorps dirigé(s) contre un produit nitré ou nitrosylé,
le ou les anticorps dirigés contre un produit issu de la lipopéroxydation étant choisi(s) parmi les anticorps suivants :
* anticorps dirigé(s) contre l’acide palmitique,
* anticorps dirigé(s) contre l’acide myristique,
* anticorps dirigé(s) contre l’acide oléique,
* anticorps dirigé(s) contre le malondialdéhyde
* anticorps dirigé(s) contre l’acétylcholine
* anticorps dirigé(s) contre l’acide azélaïque,
* anticorps dirigé(s) contre un phospholipide,
le ou les anticorps dirigés contre un produit nitré ou nitrosylé étant choisi(s) parmi les anticorps suivants :
* anticorps dirigé(s) contre la NO-Cystéine,
* anticorps dirigé(s) contre la NO-asparagine,
* anticorps dirigé(s) contre la NO-histidine,
* anticorps dirigé(s) contre la NO-Tyrosine,
* anticorps dirigé(s) contre la NO2-Tyrosine,
* anticorps dirigé(s) contre la NO-citrulline,
* anticorps dirigé(s) contre la NO-arginine,
* anticorps dirigé(s) contre le NO-Tryptophane,
* anticorps dirigé(s) contre la NO-méthionine,
* anticorps dirigé(s) contre la NO-histamine,
* anticorps dirigé(s) contre la NO-phénylalanine,
* anticorps dirigé(s) contre la NO-bovine sérum albumine
* anticorps dirigé(s) contre la NO-proline. - Procédéex vivode détection ou de suivi de l’évolution d’une maladie chronique auto-immune selon la revendication 1, caractérisé en ce que l’échantillon est un échantillon de sérum ou de plasma humain ou animal.
- Procédéex vivode détection ou de suivi de l’évolution d’une maladie chronique auto-immune selon l’une des précédentes revendications, caractérisé en ce qu’il comprend également le dosage immunologique dans l’échantillon de la présence d’au moins un anticorps dirigé contre un produit d’oxydation du tryptophane, le ou les anticorps dirigés contre un produit d’oxydation du tryptophane étant choisis parmi les anticorps suivants :
- anticorps dirigé(s) contre l’acide kynuérnique,
- anticorps dirigé(s) contre la 3-hydroxykynurénine,
- anticorps dirigé(s) contre l’acide quinolinique,
- anticorps dirigé(s) contre l’acide quinaldique,
- anticorps dirigé(s) contre l’acide xanthurénique,
- anticorps dirigé(s) contre l’acide anthranilique,
- anticorps dirigé(s) contre l’acide 3-hydroxyanthranilique. - Procédéex vivode détection ou de suivi de l’évolution d’une maladie chronique auto-immune selon l’une des précédentes revendications caractérisé en ce qu’il comprend également le dosage immunologique de la présence dans l’échantillon d’au moins un anticorps dirigé contreMycobacterium tuberculosis.
- Procédéex vivode détection ou de suivi de l’évolution d’une maladie chronique auto-immune selon l’une des précédentes revendications, caractérisé en ce que les anticorps sont des immunoglobulines A et/ou des immunoglobulines G et/ou des immunoglobulines M et/ou pour les animaux uniquement des immunoglobulines E.
- Procédéex vivode détection ou de suivi de l’évolution d’une maladie chronique auto-immune selon l’une des précédentes revendications, caractérisé en ce que ladite maladie est choisie parmi la sclérose en plaques, la polyarthrite et Pelvispondylite Rhumatismale.
- Procédéex vivode détection ou de suivi de l’évolution d’une maladie chronique auto-immune selon l’une des précédentes revendications, caractérisé en ce que ladite maladie est la sclérose en plaques et en ce que le procédé est réalisé par dosage immunologique de la présence d’anticorps dans l’échantillon, dont au moins :
- un ou plusieurs des anticorps suivants :
* anticorps dirigé(s) contre la bactériePseudomonas putida,
* anticorps dirigé(s) contre la bactérieHafnia alvei,
* anticorps dirigé(s) contre la bactériePseudomonas aeruginosa,
* anticorps dirigé(s) contre la bactériePseudomonas pneumonae,
* anticorps dirigé(s) contre la bactérieMorganella morganii,
* anticorps dirigé(s) contre la bactérieProteus mirabilis
* anticorps dirigé(s) contre la bactérieCitrobacter koserii
- et un ou plusieurs des anticorps suivants :
* anticorps dirigé(s) contre l’acide palmitique,
* anticorps dirigé(s) contre l’acide oléique,
* anticorps dirigé(s) contre le malondialdéhyde
* anticorps dirigé(s) contre l’acétylcholine
* anticorps dirigé(s) contre l’acide azélaïque,
* anticorps dirigé(s) contre un phospholipide
* anticorps dirigé(s) contre la NO-Cystéine,
* anticorps dirigé(s) contre la NO-asparagine,
* anticorps dirigé(s) contre la NO-histidine,
* anticorps dirigé(s) contre la NO-Tyrosine,
* anticorps dirigé(s) contre la NO2-Tyrosine,
* anticorps dirigé(s) contre la NO-citrulline,
* anticorps dirigé(s) contre la NO-arginine,
* anticorps dirigé(s) contre le NO-Tryptophane,
* anticorps dirigé(s) contre la NO-méthionine,
* anticorps dirigé(s) contre la NO-histamine,
* anticorps dirigé(s) contre la NO-phénylalanine,
* anticorps dirigé(s) contre la NO-bovine sérum albumine
* anticorps dirigé(s) contre la NO-proline. - Procédéex vivode détection ou de suivi de l’évolution d’une maladie chronique auto-immune selon la précédente revendication, caractérisé en ce que le procédé comprend également le dosage immunologique de la présence d’un ou plusieurs des anticorps suivants :
- anticorps dirigé(s) contre l’acide kynuérnique,
- anticorps dirigé(s) contre la 3-hydroxykynurénine,
- anticorps dirigé(s) contre l’acide quinolinique,
- anticorps dirigé(s) contre l’acide quinaldique,
- anticorps dirigé(s) contre l’acide xanthurénique,
- anticorps dirigé(s) contre l’acide anthranilique,
- anticorps dirigé(s) contre l’acide 3-hydroxyanthranilique. - Procédéex vivode détection ou de suivi de l’évolution d’une maladie chronique auto-immune selon l’une des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que ladite maladie est la polyarthrite et en ce que le procédé est réalisé par dosage immunologique de la présence d’anticorps dans l’échantillon, dont au moins :
- un ou plusieurs des anticorps suivants :
* anticorps dirigé(s) contre la bactériePseudomonas putida,
* anticorps dirigé(s) contre la bactérieHafnia alvei,
* anticorps dirigé(s) contre la bactériePseudomonas aeruginosa,
* anticorps dirigé(s) contre la bactérieMorganella morganii,
* anticorps dirigé(s) contre la bactérieProteus mirabilis
* anticorps dirigé(s) contre la bactérieCitrobacter koserii
- et un ou plusieurs des anticorps suivants :
* anticorps dirigé(s) contre l’acide palmitique,
* anticorps dirigé(s) contre l’acide myristique,
* anticorps dirigé(s) contre l’acide oléique,
* anticorps dirigé(s) contre le malondialdéhyde
* anticorps dirigé(s) contre l’acétylcholine
* anticorps dirigé(s) contre l’acide azélaïque,
* anticorps dirigé(s) contre un phospholipide
* anticorps dirigé(s) contre la NO-Cystéine,
* anticorps dirigé(s) contre la NO-asparagine,
* anticorps dirigé(s) contre la NO-histidine,
* anticorps dirigé(s) contre la NO-proline. - Procédéex vivode détection ou de suivi de l’évolution d’une maladie chronique auto-immune selon l’une des précédentes revendications, caractérisé en ce que le dosage immunologique est réalisé par la mise en œuvre d’un procédé immuno-enzymatique.
- Procédéex vivode détection ou de suivi de l’évolution d’une maladie chronique auto-immune selon l’une des précédentes revendications, caractérisé en ce qu’il comprend au moins la mise en œuvre des étapes suivantes :
- fabriquer au moins une plaque de microtitration sensibilisée avec le ou les antigènes contre lesquels sont dirigés les anticorps dont on cherche à détecter la présence dans l’échantillon, ou utiliser au moins une plaque de microtitration déjà sensibilisée avec ces antigènes,
- répartir sur la plaque la même quantité d’étalons internes, d’échantillon et de blanc réactif,
- ajouter le ou les anticorps secondaires couplé(s) à une enzyme,
- ajouter un substrat de l’enzyme et un chromogène, attendre la coloration des puits
- stopper la réaction de coloration,
- lire la densité optique des puits à l’aide d’un spectrophotomètre une longueur d’onde appropriée. - Procédéex vivode détection ou de suivi de l’évolution d’une maladie chronique auto-immune selon la précédente revendication, caractérisé en ce qu’il comprend au moins la mise en œuvre des étapes suivantes :
- fabriquer au moins une plaque de microtitration sensibilisée avec le ou les antigènes contre lesquels sont dirigés les anticorps dont on cherche à détecter la présence dans l’échantillon, ou utiliser au moins une plaque de microtitration déjà sensibilisée avec ces antigènes,
- diluer l’échantillon à tester et des étalons internes,
- répartir en duplicate sur la plaque la même quantité d’étalons internes dilués, d’échantillon dilué et de blanc réactif,
- incuber,
- laver,
- ajouter le ou les anticorps secondaires couplés à la peroxydase ou phosphatase alcaline ou biotynilés,
- incuber,
- laver,
- ajouter un substrat et un chromogène,
- Stopper la réaction en solution acide
- lire à 450 nm avec un alpha de correction à 650 nm. - Kit pour son utilisation dans un procédé de détection ou de suivi de l’évolution d’une maladie chronique auto-immune selon l’une des précédentes revendications, caractérisé en ce qu’il comprend au moins le ou les antigènes contre lesquels sont dirigés les anticorps dont on cherche à détecter la présence dans l’échantillon.
- Kit selon la revendication 13, caractérisé en ce qu’il comprend au moins :
- une plaque de micro titration sensibilisée avec le ou les antigènes contre lesquels sont dirigés les anticorps dont on cherche à détecter la présence dans l’échantillon,
- des tampons et des solutions,
- le ou les anticorps secondaire(s) en solution, anticorps secondaire(s) correspondant aux anticorps dont on cherche à détecter la présence dans l’échantillon.
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