FR2901796A1

FR2901796A1 - Procede d'extraction d'une ou de plusieurs proteines presentes dans du lait

Info

Publication number: FR2901796A1
Application number: FR0604864A
Authority: FR
Inventors: Alain Lejars; Michel Nogre; Michel Tellier
Original assignee: LFB SA
Current assignee: LFB SA
Priority date: 2006-05-31
Filing date: 2006-05-31
Publication date: 2007-12-07
Also published as: KR20150008455A; TW200808188A; IL195183A0; JP2013163689A; AR061429A1; EP2038296A2; KR101579811B1; US20100047428A1; AU2007266951B2; KR20090028694A; JP5279087B2; TWI394534B; KR101593494B1; AU2007266951C1; JP2009538884A; CA2652495C; CN103910779A; BRPI0712005A2; WO2007138198A3; AU2007266951A1

Abstract

L'invention concerne un procédé d'extraction d'au moins une protéine présente dans du lait, ladite protéine présentant une affinité pour les ions calcium complexés ou non dudit lait, comprenant les étapes suivantes consistant à :a) libérer la protéine par la précipitation de composés de calcium obtenue par mise en contact du lait avec un sel soluble, dont l'anion est choisi pour son aptitude à former dans un tel milieu lesdits composés de calcium insolubles, pour ainsi obtenir une phase liquide enrichie en la protéine,b) séparer la phase liquide enrichie en la protéine du précipité de composés de calcium, ladite phase liquide étant en outre séparée en une phase lipidique et en une phase aqueuse non lipidique comprenant la protéine, etc) récupérer la phase aqueuse non lipidique comprenant la protéine.

Description

La présente invention se rapporte à un procédé d'extraction d'une ou

plusieurs protéines présentes dans du lait, lesdites protéines présentant une affinité pour les ions calcium complexés ou non dudit lait. Dans le cadre de l'invention, on entend par ions calcium complexés ou non soit les sels phosphocalciques liées aux caséines pour former une structure micellaire colloïdale de caséines, soit de tels sels non liés aux caséines et qui sont donc libres. De tels ions sont également les différents sels et/ou complexes organiques et/ou inorganiques de calcium autres que ceux cités ci-dessus, solubles dans le lait. Les protéines présentant une affinité pour les ions calcium du lait représentent celles qui y sont naturellement présentes, tels que les lactalbumines, les lactoglobulines et les immunoglobulines. Ces protéines peuvent également représenter des protéines recombinantes présentes dans le lait d'animaux transgéniques, comme par exemples les facteurs de la coagulation sanguine, en particulier le facteur VII, le facteur VIII et le facteur IX. La majeure partie des médicaments disponibles dans le commerce correspond à des substances chimiques obtenues par synthèse. En effet, jusqu'à récemment, la médecine moderne a fortement compté sur les médicaments produits par voie de synthèse chimique pour le traitement ou le diagnostic des maladies. Toutefois, les protéines représentent une partie essentielle des molécules portant une information biologique. C'est le cas notamment d'un grand nombre d'hormones, de facteurs de croissance, de facteurs sanguins de coagulation ou encore d'anticorps. D'une manière générale, les protéines sont des polymères à base d'acides aminés le plus souvent de haut poids moléculaire ne pouvant pas être obtenus à des coûts raisonnables par synthèse chimique. De telles protéines à usage thérapeutique sont habituellement isolées et purifiées à partir, par exemple, d'organismes vivants, de tissus ou de sang humain ou animal. C'est le cas notamment de l'insuline extraite du pancréas de porc, des facteurs de la coagulation, tels que le facteur VIII ou le facteur IX, extraits du plasma sanguin, ou les immunoglobulines. Bien que les procédés de préparation des protéines ci--dessus soient largement utilisés aujourd'hui, ils présentent toutefois des inconvénients. La faible teneur de certaines protéines, telle que l'érythropoïétine, extraite à partir de plaquettes du sang, ne permet pas de les isoler en quantités suffisantes pour satisfaire les besoins thérapeutiques saris cesse croissants. De plus, la présence de virus, de prions ou d'autres agents pathogènes dans le plasma nécessite d'inclure dans les procédés de fabrication de protéines plasmatiques des étapes supplémentaires d'inactivation virale et/ou d'élimination virale afin d'obtenir de tels produits utilisables à des fins thérapeutiques. Pour pallier ces inconvénients, on a recourt au génie génétique, technique également largement utilisée pour la synthèse d'une protéines à partir d'un gène isolé, transféré dans une cellule, qui prend alors en charge la sécrétion de la protéine considérée. Une telle protéine, obtenue hors de son système cellulaire d'origine, est dite recombinante . Selon cette technique, différents systèmes cellulaires peuvent être utilisés. Les systèmes bactériens, par exemple E. Coli, sont très utilisés et efficaces. Ils permettent la production de protéines recombinantes à faible coût. Cependant, de tels systèmes sont limités à la préparation de protéines simples, non glycosylées, qui ne requièrent pas de processus élaboré de repliement.

Les systèmes fongiques sont également utilisés pour la production de protéines sécrétées. L'inconvénient de ces systèmes fongiques réside dans le fait qu'ils sont à la source de modifications post- traductionnelles, consistant par exemple en un greffage de motifs glycanniques et de groupes sulfates, qui affectent fortement les propriétés pharmacocinétiques des protéines produites, notamment par l'addition de divers groupements de dérivés du mannose.

Les systèmes utilisant des baculovirus permettent de produire des protéines très variées, telles que les protéines vaccinales ou l'hormone de croissance, mais leur application à l'échelle industrielle n'est pas optimisée.

On utilise également la culture de cellules de mammifères pour la préparation de protéines recombinantes complexes, telles que les anticorps monoclonaux. Les systèmes d'expression cellulaire conduisent à des protéines recombinantes correctement repliées et modifiées. Le faible rendement par rapport au coût de production est un inconvénient majeur. Une variante à de tels systèmes cellulaires consiste à mettre en œuvre des plantes transgéniques pour l'obtention de protéines en des quantités importantes. Ces systèmes engendrent toutefois des modifications post-traductionnelles spécifiques aux plantes, en particulier par addition aux protéines produites de résidus de xylose fortement immunogènes, limitant ainsi leur utilisation à des fins thérapeutiques. Une alternative aux systèmes cellulaires cités précédemment consiste à utiliser les animaux transgéniques pour la production de vaccins recombinants ou de protéines thérapeutiques complexes.

Les protéines ainsi obtenues présentent une glycosylation proche de celle de l'être humain et sont correctement repliées. Ces protéines complexes ne sont pas constituées que d'une chaîne polypeptidique simple comme par exemple l'hormone de croissance, mais elles sont modifiées de diverses manières après l'assemblage des acides aminés, notamment par des clivages spécifiques, des glycosylations et des carboxyméthylations. Dans la grande majorité des cas, de telles modifications ne peuvent pas être effectuées par des cellules bactériennes ou de levures. En revanche, les animaux transgéniques permettent de combiner à la fois les niveaux d'expression rencontrés dans les systèmes cellulaires de bactéries et les modifications post-traductionnelles obtenues par l'intermédiaire de cultures cellulaires, tout en engendrant des coûts de production plus faibles que par la mise en oeuvre des systèmes d'expression cellulaires. Parmi les matières biologiques d'animaux transgéniques, le lait a fait l'objet de travaux ayant conduit à le considérer comme une source de sécrétion très satisfaisante de protéines recombinantes.

Les protéines recombinantes, produites à partir de lait d'animaux transgéniques, peuvent être obtenues aisément par greffage du gène codant pour la protéine d'intérêt sur la région régulatrice d'un des gènes de synthèse de protéines du lait qui va diriger celle-ci spécifiquement dans la glande mammaire, puis sa sécrétion dans le lait. A titre d'exemple, on peut citer la demande de brevet EP 0 527 063 qui décrit la production d'une protéine d'intérêt dans le lait d'un mammifère transgénique, l'expression du gène codant pour la protéine d'intérêt étant contrôlée par un promoteur d'une protéine du lactosérum. D'autres demandes de brevet ou brevets décrivent la préparation d'anticorps (EP 0 741 515), de collagène (WO 96/03051), de facteur IX humain (US 6 046 380 et de complexes facteur VIII/facteur von Willebrand (EP 0 807 170) dans le lait de mammifères transgéniques.

Malgré les résultats satisfaisants de ces méthodes en termes d'expression des protéines, l'utilisation du lait comme source de protéines recombinantes présente des inconvénients. L'inconvénient majeur réside dans les difficultés, d'une part, de les extraire du lait avec un rendement satisfaisant et, d'autre part, de les purifier subséquemment. En effet, le lait est un mélange constitué à 90% d'eau comprenant divers constituants que l'on peut regrouper en trois catégories. La première catégorie, appelée lactosérum (ou petit lait), est constituée de glucides, de protéines solubles, de minéraux et de vitamines hydrosolubles. La deuxième catégorie, appelée phase lipidique (ou crème), contient des matières grasses sous forme d'émulsion. La troisième catégorie, dénommée phase protéinique, est constituée d'environ 80% de caséines, lesquelles forment un ensemble de protéines précipitables à un pH de 4,6 ou sous l'action de la présure, coagulant enzymatique, en présence de calcium. Les différentes caséines forment un complexe micellaire colloïdal, pouvant atteindre des diamètres d'environ 0,5 m, avec des sels phosphocalciques, se présentant par exemple sous la forme d'agrégats ( clusters ) de phosphate tricalcique, soit Ca9(PO4)6.

De telles micelles sont formées de sous-unités de caséines constituées d'une couche hydrophile riche en caséine-K entourant un noyau hydrophobe, les sels phosphocalciques étant liés par interaction électrostatique sur la couche hydrophile. Ces selF; phosphocalciques peuvent également être présents dans le volume interne de la micelle sans être liés à la caséine. Cette phase protéinique contient également des protéines solubles, telles que les lactalbumines et les lactoglobulines, ainsi que les albumines et les immunoglobulines provenant du sang. En fonction de la nature de la protéine recombinante sécrétée dans le lait d'animaux transgéniques, celle-ci peut être présente dans le lactosérum ou dans la phase protéinique, voire dans les deux à la fois. La richesse et la complexité de chaque catégorie de constituants du lait rend d'autant plus difficile la mise en oeuvre d'une extraction de cette protéine, notamment celle piégée dans les micelles de caséines. Une autre difficulté réside dans le fait que la présence majoritaire de cette protéine dans l'une des deux phases n'est pas prévisible avec certitude.

Une protéine recombinante peut également présenter des affinités pour les ions calcium du lait qui sont présents sous la forme soit de sels et/ou divers complexes solubles, soit de sels phosphocalciques des micelles de caséines. Ces affinités se traduisent par des liaisons électrostatiques entre la protéine et les cations divalents du calcium. Les affinités protéine/ions calcium permettent de définir les constantes d'affinités qui, en fonction de leur valeur, déterminent la force de liaison. De façon générale, la majeure partie des protéines présentant une affinité pour les ions calcium est liée aux sels phosphocalciques des micelles. Son extraction nécessite la mise en œuvre d'étapes complexes, ce qui pose des problèmes de mise en œuvre et de rendement.

La solution classique utilisée dans l'industrie laitière pour isoler les protéines consistant à une pasteurisation suivie d'une coagulation enzymatique ou précipitation acide (pH 4,6) ne peut s'appliquer dans ce cas, car les protéines recombinantes sont souvent dénaturées sous l'effet combiné de la température et du pH. De plus, le piégeage des protéines dans les micelles de caséines conduit à de faibles rendements d'extraction. D'autres solutions consistant à mettre en œuvre des méthodes physiques de fractionnement du lait par les techniques de filtration, de centrifugation et/ou de sédimentation ou de précipitation conduisent également à des rendements d'extraction inacceptables et à des protéines recombinantes extraites de faible pureté. Le document EP 0 264 166 décrit la sécrétion d'une protéine désirée dans du lait d'animaux génétiquement transformés. Ce document ne mentionne pas d'étapes de purification de cette protéine à partir du lait. Le brevet US 4 519 945 décrit un procédé d'extraction d'une protéine recombinante par la préparation d'un précipité de caséines et de lactosérum à partir du lait, mettant en oeuvre des étapes d'acidification et de chauffage, comme mentionné précédemment. Ce procédé engendre une perte significative de l'activité de la protéine considérée et un faible rendement d'extraction.

Le brevet US 6 984 772 divulgue un procédé de purification du fibrinogène recombinant à partir de lait d'un mammifère transgénique. Ce procédé comprend une étape de séparation du lactosérum du culot de caséines et de la phase protéinique par des centrifugations successives. Le lactosérum est isolé puis conservé pour la suite du procédé conduisant à une solution de fibrinogène purifiée. Toutefois, ce procédé ne peut être appliqué à la production, à rendement satisfaisant, de protéines recombinantes piégées dans et/ou sur les micelles de caséines, telles que les facteurs plasmatiques de la coagulation, par exemple le facteur VII, le facteur VIII et le facteur IX. La demande de brevet WO 2004/076695 décrit un procédé de filtration de protéines recombinantes à partir de lait d'animaux transgéniques. Ce procédé comprend une première étape de clarification du lait, c'est-à-dire une étape consistant à éliminer les composants du lait de façon à obtenir une solution susceptible d'être filtrable à travers une membrane de filtre dont les pores présentent un diamètre de 0,2 m. Une telle étape aboutit à une élimination de micelles de caséines. Par conséquent, la mise en oeuvre de cette étape peut être rédhibitoire, en termes de rendement, si les micelles de caséines sont susceptibles de contenir une protéine d'intérêt piégée au sein de leur structure. Le brevet US 6 183 803 décrit un procédé de d'isolation de protéines naturellement présentes dans le lait, telles que les lactalbumines, et de protéines recombinantes, par exemple l'albumine humaine ou l'al- antitrypsine, à partir de lait. Ce procédé comprend une étape initiale de mise en contact du lait comprenant une protéine d'intérêt avec un agent chélatant. Ceci engendre la déstructuration des micelles de caséines, ce qui conduit à un sérum de lait clarifié comprenant les caséines, les protéines du lactosérum et la protéine d'intérêt. Le procédé comprend ensuite une étape de restructuration des micelles de caséines par ajout au milieu liquide (sérum de lait clarifié) de sels de cations divalents insolubles. Ces micelles précipitent, ce qui conduit à une phase liquide comprenant la protéine d'intérêt qui n'est pas piégée par les micelles, étant donné que les sels saturent les sites de liaison électrostatique des caséines. Selon ce procédé, la séparation de la protéine d'intérêt est donc effectuée au final par restructuration des micelles et leur précipitation. Ce procédé est de mise en oeuvre complexe et ne peut être appliqué aux protéines ayant une affinité relativement éle7ée pour les ions calcium. Les protéines de la coagulation, et notamment celles connues comme étant synthétisées sous l'influence de la vitamine K, se trouve dans cette catégorie. Partant d'un double constat que les procédés de séparation et de purification de certaines catégories de protéines recombinantes sécrétées dans le lait d'animaux transgéniques présentes dans le lactosérum conduisent à des rendements très faibles, et de ceux d'autres catégories de protéines qui sont piégées dans les micelles de caséines, sont de mise en oeuvre complexe, la Demanderesse s'est fixée pour objectif de mettre à disposition un procédé d'extraction, à partir du lait, de protéines constitutives du lait, naturelles ou non, telles que le facteur VII, le facteur VIII et le facteur IX recombinants, présentant une affinité pour les formes ioniques du calcium du lait, de mise en oeuvre simplifiée, conduisant en outre à un rendement de production satisfaisant, tout en conservant l'activité biologique de la protéine. L'invention concerne donc un procédé d'extraction d'au moins une protéine présente dans du lait, ladite protéine présentant une affinité pour les ions calcium complexés ou non dudit lait, comprenant les étapes suivantes consistant à : a) libérer la protéine par la précipitation de composés de calcium obtenue par mise en contact du lait avec un sel soluble, dont l'anion est choisi pour son aptitude à former dans un tel milieu lesdits composés de calcium insolubles, pour ainsi obtenir une phase liquide enrichie en la protéine, b) séparer la phase liquide enrichie en la 25 protéine du précipité de composés de calcium, ladite phase liquide étant en outre séparée en une phase lipidique et en une phase aqueuse non lipidique comprenant la protéine, et c) récupérer la phase aqueuse non _Lipidique 30 comprenant la protéine. La Demanderesse a constaté d'une manière surprenante que le fait d'ajouter un sel soluble, dont l'anion est choisi pour sa capacité à former des précipités de composés de calcium dans le lait, 35 contenant une protéine, notamment recombinante, présentant une affinité pour les ions calcium complexés ou non, c'est-à-dire présentant des sites de fixation aux ions calcium, permet la précipitation des composés de calcium, alors que la protéine d'intérêt est libérée de ces ions complexés ou non et se retrouve en solution dans la phase liquide.

Les ions calcium complexés ou non, comme indiqué plus haut, représentent les différents sels et/ou complexes organiques et/ou inorganiques de calcium solubles dans le lait. Ces sels ou complexes peuvent être présents dans le volume interne de la micelle de caséine (voir plus loin à la Figure 1). Ces ions calcium représentent également les sels phosphocalciques en interaction avec les micelles de caséines, notamment sous forme d'agrégats ( clusters ). Ces sels sont également présents dans le lait sous forme de phosphate monocalcique et/ou de phosphate dicalcique, qui sont en équilibre avec les autres formes ioniques de calcium en fonction des réactions chimiques et biochimiques mises en oeuvre. Enfin, ces ions calcium représentent des complexes calcium/caséine, c'est-à-dire représentant des sous-unités de caséine auxquelles sont associées, par interaction électrostatique, les sels phosphocalciques. Ces complexes calcium/caséine désignent aussi les micelles de caséines associées avec les sels phosphocalciques et avec les sels et/ou complexes organiques et/ou inorganiques de calcium solubles. On entend par composés de calcium insolubles, des sels ou complexes de calcium dont la solubilité dans le lait est inférieure à 0,5%.

Dans la majeure partie des cas, les protéines d'intérêt seront majoritairement associées aux sels phosphocalciques des micelles de caséines. On entend ainsi par protéine présentant une affinité pour les ions calcium complexés ou non, toute protéine ayant un nombre suffisant de sites de fixation aux ions calcium pour y être associée, totalement ou partiellement, ou pour être associée, totalement ou partiellement, aux sels phophocalciques des micelles de caséines. A titre d'exemple, dans le cas de protéines d'intérêt présentant de nombreux sites de fixation aux ions calcium, par exemple 8 à 10 domaines GLA, qui sont des domaines riches en acides 'y-carboxyglutamiques permettant de fixer les ions calcium, au moins 70% jusqu'à 90% des protéines d'intérêt sont piégées dans et/ou sur les micelles de caséine. Pour d'autres protéines présentant de moindres sites de fixation aux ions calcium, par exemple 2 à 8 domaines GLA, au moins 30% jusqu'à 60% de celles-ci sont piégées dans et/ou sur les micelles de caséines. Enfin, même les protéines présentant très peu de sites de fixation aux ions calcium, par exemple 0 à 2 domaines GLA, sont susceptibles d'être piégées dans et/ou sur les micelles de caséine, par exemple à raison d'au moins 5% jusqu'à 20%. De telles quantités de protéines piégées ne sont pas négligeables pour la mise en œuvre d'un procédé à l'échelle industrielle, qui implique le fait d'atteindre un rendement le plus important possible. Le reste des protéines d'intérêt, non piégées dans et/sur les micelles, présentent une affinité pour les autres formes d'ions calcium du lait citées ci-dessus.

Par conséquent, le procédé de l'invention peut s'appliquer à l'extraction de protéines dont au moins 2% jusqu'à 10%, ou au moins 40% jusqu'à 60% ou, en particulier, au moins 90% sont associées à ces ions calcium.

Une telle affinité de la protéine pour les ions calcium peut résulter des interactions de la protéine non. modifiée ou modifiée in vivo ou in vitro par exemple par des modifications post-traductionnelles. Ainsi, les protéines présentant de nombreux sites 35 de fixation aux ions calcium complexés ou non peuvent se retrouver associées aux différentes formes de calcium présentes dans le lait.

Sans être liée par une quelconque interprétation des mécanismes observés, la Demanderesse suppose que l'ajout du sel soluble déplace l'équilibre des sels phosphocalciques des micelles, notamment le rapport calcium/phosphate, provoquant ainsi leur déstructuration et la précipitation d'agrégats de sous-unités de caséines. Les protéines d'intérêt associées aux sels phosphocalciques piégées dans et/ou sur les micelles sont libérées dans le milieu lors de cette déstructuration. De plus, les protéines d'intérêt sont alors également libérées ou dissociées des sels phosphocalciques, car ceux-ci précipitent sous la forme de composés de calcium insolubles sous l'effet du sel soluble utilisé dans le procédé de l'invention. De même, les protéines d'intérêt qui peuvent également être associées aux sels ou complexes organiques et/ou inorganiques de calcium solubles en seraient également dissociées, par le même type de réaction. Un exemple d'un tel mécanisme est illustré à la 20 Figure 1. Dans le cadre de l'invention, le sel soluble représente tout sel permettant d'obtenir l'effet voulu. Le sel soluble utilisé dans le procédé de l'invention peut être ajouté dans le lait à une 25 concentration choisie par l'homme du métier pour parvenir à la libération de la protéine de ces interactions avec les ions calcium. A ce titre, il s'agit d'une concentration suffisante pour permettre la libération d'au moins 20%, ou avantageusement d'au 30 moins 30% jusqu'à 50% des protéines d'intérêt. De manière particulièrement avantageuse, il s'agit d'une concentration suffisante pour permettre la séparation d'au moins 60% jusqu'à 80%, ou d'au moins 90% des protéines d'intérêt. 35 De plus, le procédé de l'invention peut également s'appliquer à des protéines dont une partie seulement présente des sites de fixation aux ions calcium. Par exemple, le procédé de l'invention peut s'appliquer à l'extraction de protéines présentes dans le lait dont 1% du total est associé aux ions calcium. Le procédé peut également s'appliquer à des protéines dont au moins 2% jusqu'à 10%, ou au moins 40% jusqu'à 60% ou, en particulier, au moins 90% sont associées à ces ions calcium. Le procédé de l'invention permet la précipitation notamment des agrégats de sous-unités de caséines. Cette précipitation est due à la déstructuration des micelles de caséines, comme indiqué plus haut. La mise en oeuvre du procédé de l'invention déstabilise, par la précipitation, l'état colloïdal dans lequel se trouve le lait. Le procédé de l'invention est donc un procédé permettant le passage du lait d'un état colloïdal à un état liquide, ce qui correspond à une extraction directe colloïdes/liquides.

Le procédé de l'invention permet également d'obtenir le lactosérum et la phase lipidique dont la coloration est plus claire que celle du lait de départ. En effet, ce sont les caséines liées aux ions calcium qui donnent leur couleur blanche au lait. Une fois précipitées, elles ne peuvent plus conférer cette couleur au lait.

Le procédé de l'invention présente donc plusieurs avantages : il est d'abord d'une mise en œuvre très aisée, puisqu'il permet la séparation des protéines d'intérêt par des étapes de mise en œuvre simplifiée. De plus, il permet une récupération des protéines d'intérêt dans la phase aqueuse non lipidique avec un très bon rendement. Avantageusement, le procédé d'extraction de l'invention a un rendement d'au moins 50%, ou d'au moins 60%, ou bien encore d'au moins 80%.

De manière particulièrement avantageuse, le rendement est d'au moins 90%. Ce procédé va également permettre d'obtenir la phase aqueuse non lipidique comprenant la protéine d'intérêt sous une forme compatible avec la mise en oeuvre d'étapes ultérieures de purification de celle-ci, notamment des étapes de chromatographie. Enfin, les protéines d'intérêt sont encore biologiquement actives, étant donné que les étapes du procédé de l'invention sont mises en œuvre à un pH n'altérant pas leur activité biologique. Le pH est avantageusement basique, par exemple voisin de 8.

Par sel soluble selon l'invention on entend un sel 15 dont la solubilité dans le lait est d'au moins 0,5 partie de sel par partie de lait (p/p). Avantageusement, le sel soluble, utilisé dans le procédé, est un sel de phosphate. Le sel peut être dans une solution aqueuse qui est ajoutée au lait, ou il 20 peut être ajouté directement' au lait sous forme de poudre. De préférence, le sel de phosphate est choisi dans le groupe constitué par le phosphate de sodium, le phosphate de lithium, le phosphate de potassium, le 25 phosphate de rubidium et le phosphate de césium, et est, en particulier, le phosphate de sodium. En variante, le sel utilisé pour la mise en œuvre du procédé de l'invention peut être un oxalate d'un métal alcalin, en particulier l'oxalate de sodium ou de 30 potassium, ou un carbonate d'un métal alcalin, en particulier le carbonate de sodium ou de potassium, ou leur mélange. Avantageusement, la concentration du sel en solution aqueuse, qui est ainsi préparée pour la mise 35 en œuvre du procédé, est comprise entre 100 mM et 3 M, de façon plus préférée, entre 200 mM et 500 mM et, en particulier, entre 200 mM et 300 mM.

Le lait dans lequel se trouve la protéine d'intérêt à extraire peut être du lait brut non écrémé ou du lait écrémé. L'avantage d'appliquer le procédé de l'invention à du lait écrémé réside dans le fait qu'il contient une quantité plus faible de lipides. Le procédé peut aussi être appliqué à du lait frais ou congelé.

L'étape b) permet la séparation de la phase liquide en une phase lipidique et une phase aqueuse non lipidique comprenant la protéine qui est de préférence effectuée par centrifugation. La phase aqueuse non lipidique est assimilée à du lactosérum. Cette étape de séparation permet également d'isoler les agrégats de sous-unités micellaires de caséines et le précipité de composés de calcium. La phase aqueuse non lipidique comprenant la protéine est séparée de la phase lipidique. Cette étape permet d'obtenir avantageusement une 20 phase aqueuse non lipidique limpide.

Le procédé peut en outre comprendre, après l'étape c), une étape de filtration de la phase aqueuse non lipidique effectuée successivement sur des filtres de 25 porosité décroissante, de préférence, de 1 m puis de 0,45 m. L'utilisation de ces filtres, tels qu'à base de fibres de verre, permet de réduire la teneur en lipides éventuellement encore présents, globules gras et de phospholipides naturellement présents dans le 30 lait. Une porosité inférieure à 0,5 m permet de maintenir la qualité bactériologique de la phase aqueuse non lipidique, ainsi que des supports de purification mis en oeuvre postérieurement (u:trafiltres, colonne de chromatographie etc.) (voir 35 plus loin). La phase lipidique est, de préférence, filtrée à travers ces filtres qui retiennent ainsi complètement les globules lipidiques du lait, et le filtrat est clair. Cette étape peut être suivie d'une étape de concentration/dialyse par ultrafiltration.

La concentration permet de réduire le volume de la phase aqueuse non lipidique en vue de sa conservation. La membrane d'ultrafiltration est choisie par l'homme du métier en fonction des caractéristiques de la protéine d'intérêt. De façon générale, un seuil de coupure dont la tailledes pores est inférieure ou égale au poids moléculaire de la protéine d'intérêt permet de concentrer le produit sans perte notable. Par exemple, une membrane de taille de pores à 50 kDa permet de concentrer sans perte du FVII dont le poids moléculaire est de 50 kDa. La dialyse est destinée à conditionner la phase aqueuse de protéines pour des étapes ultérieures éventuelles de purification, notamment par chromatographie. Elle permet également d'éliminer les composants de faible taille moléculaire, comme les lactoses, les sels, les peptides, les protéoses peptones et tout agent pouvant nuire à la conservation du produit. De préférence, le tampon de dialyse est une 25 solution de phosphate de sodium 0,025 M-0,050 M, pH 7,5-8,5. La phase aqueuse non lipidique obtenue après l'étape c), ou, le cas échéant, obtenue après les étapes de filtration et/ou de concentration/dialyse, 30 peut être congelée et stockée à une température de - 30 C dans l'attente de la mise en oeuvre d'étapes ultérieures de leur purification. Le procédé de l'invention permet ainsi l'extraction et, le cas échéant, la séparation d'une ou 35 de plusieurs protéines d'intérêt des ions calcium du lait auxquels elles sont liées par des interactions électrostatiques.

La protéine peut être une protéine naturellement présente dans le lait, et représente, à titre d'exemple, la 0-lactoglobuline, la lactoferrine, l'a-lactalbumine, les immunoglobulines ou les protéoses peptones, ou leur mélange.

La protéine peut également être une protéine non naturellement présente dans le lait. On peut citer à titre d'exemple le facteur VII, le facteur VIII, le facteur IX, le facteur X, l'alpha-1 anti-trypsine, l'anti-thrombine III, l'albumine, le fibrinogène, l'insuline, la protéine basique de la myéline, la proinsuline, l'activateur tissulaire du plasminogène et les anticorps.

Ainsi, selon une forme de mise en oeuvre préférée de l'invention, le lait contenant la protéine d'intérêt est un lait transgénique. En effet, les protéines non naturellement présentes dans le lait pourront y être synthétisé par des mammifères transgéniques non-humains, grâce aux techniques de l'ADN recombinant et de la transgénèse.

Ces techniques, bien connues de l'homme du métier, 25 permettent de synthétiser toute protéine d'intérêt dans le lait d'un animal transgénique. Une telle protéine est alors une protéine recombinante ou transgénique, ces deux termes étant considérés comme équivalents dans la présente demande, 30 synthétisée grâce aux techniques de l'ADN recombinant. On entend par animal transgénique tout animal non-humain ayant incorporé dans son génome un fragment d'ADN exogène, notamment codant pour une protéine d'intérêt, cet animal exprimant la protéine codée par 35 l'ADN exogène, et susceptible de transmettre l'ADN exogène à sa descendante.

A ce titre, tout mammifère non-humain est adapté à la production d'un tel lait. Avantageusement, on peut utiliser la lapine, la brebis, la chèvre, la vache, la truie et la souris, 5 cette liste n'étant pas limitative.

La sécrétion par les glandes mammaires de la protéine d'intérêt, permettant sa sécrétion dans le lait du mammifère transgénique, implique le contrôle de 10 l'expression de la protéine recombinante de manière tissus-dépendante. De telles méthodes de contrôle sont bien connues de l'homme du métier. Le contrôle de l'expression est effectué grâce à des séquences permettant l'expression 15 de la protéine vers un tissu particulier de l'animal. Ces séquences sont notamment les séquences promoteur, ainsi que les séquences peptides signal. Des exemples de promoteurs bien connus de l'homme du métier sont le promoteur WAP (whey acidic protein), 20 le promoteur de la caséine, le promoteur de la 0-lactoglobuline, cette liste n'étant pas limitative.

Une méthode de production d'une protéine recombinante dans le lait d'un animal transgénique peut 25 comporter les étapes suivantes : une molécule d'ADN synthétique comprenant un gène codant pour une protéine d'intérêt, ce gène étant sous le contrôle d'un promoteur d'une protéine sécrétée naturellement dans le lait, est intégrée dans un embryon d'un mammifère non 30 humain. L'embryon est ensuite placé dans une femelle de mammifère de la même espèce laquelle donne ainsi naissance à un animal transgénique. Une fois que ce sujet s'est suffisamment développé, la lactation du mammifère est induite, puis le lait collecté. Le lait 35 contient alors la protéine recombinante d'intérêt.

Un exemple de procédé de préparation de protéine dans le lait d'une femelle de mammifère autre que l'être humain est donné dans le document EP 0 527 063, dont l'enseignement peut être repris pour la production 5 de la protéine d'intérêt de l'invention. Un plasmide contenant le promoteur WAP est fabriqué par introduction d'une séquence comportant le promoteur du gène WAP, ce plasmide étant réalisé de manière à pouvoir recevoir un gène étranger placé sous 10 la dépendance du promoteur WAP. Le gène codant pour une protéine d'intérêt est intégré, et placé sous la dépendance du promoteur WAP. Le plasmide contenant le promoteur et le gène codant pour la protéine d'intérêt sont utilisés pour obtenir des animaux transgéniques, 15 par exemple des lapines, par microinjection dans le pronucléus mâle d'embryons de lapins. Les embryons sont ensuite transférés dans l'oviducte de femelles hormonalement préparées. La présence des transgènes est révélée par la technique de Southern à partir de l'ADN 20 extrait des lapereaux transgéniques obtenus. Les concentrations dans le lait des animaux sont évaluées à l'aide de tests radioimmunologiques spécifiques.

Avantageusement, la protéine'produite dans le lait 25 et extraite selon le procédé de l'invention est une protéine de la coagulation, ou facteur de coagulation. En effet, il est connu que de telles protéines présentent une forte affinité pour le calcium (Hibbard et al. (1980), J Biol Checn. 1980, Jan 25; 255(2):638- 30 451. Selon un aspect particulier de l'invention, le facteur de la coagulation est activé pendant le procédé d'extraction de l'invention. Il peut s'agir notamment de protéines vitamine K-dépendantes , qui sont des facteurs indispensables à la coagulation du sang. 35 Avantageusement, la protéine produite dans le lait et extraite selon le procédé de l'invention est une protéine comportant des GLA-domaines , qui ont la capacité de fixer le calcium, ou encore des protéines comportant des domaine EGF (epidermal growth factor) ou d'autres domaines identifiés comme ayant une capacité à fixer des ions calcium, tels que des structures dites en main EF (motif hélice-bouclehélice permettant la fixation de l'ion calcium). Par ailleurs, les protéines calcium-dépendantes sont également des protéines susceptibles de pouvoir 10 être purifiées par le procédé de l'invention, notamment les anticorps ou les anticorps monoclonaux. Avantageusement, la protéine de l'invention est choisie parmi le facteur II (FII), le facteur VII (FVII), le facteur IX (FIX) et le facteur X (FX), ainsi 15 que leurs formes activées, la protéine C, la protéine C activée, la protéine S et la protéine Z, ou leur mélange.

De manière particulièrement avantageuse, la 20 protéine de l'invention est le FVII, ou le FVII activé (FVIIa). A cet égard, le FVII ou le FVIIa peut être produit selon l'enseignement du document EP 0 527 063, et dont le résumé de la méthode est donné ci-avant. Un fragment 25 d'ADN dont la séquence est celle du FVII humain est alors placé sous le contrôle du promoteur WAP. Par exemple, une telle séquence d'ADN figure sous le numéro de séquence lb décrite dans le document EP 0 200 421. Avantageusement, le FVII de l'invention est 30 activé. Le FVIIa résulte, in vivo, du clivage du zymogène par différentes protéases (FIXa, FXa, FVIIa) en deux chaînes réunies par un pont disulfure. Le FVIIa seul a très peu d'activité enzymatique, mais complexé avec son cofacteur, le facteur tissulaire (FT), il 35 déclenche le processus de la coagulation en activant le FX et le FIX.

Le FVIIa présente une activité coagulante 25 à 100 fois supérieure à celle du FVII lorsqu'ils interagissent avec le facteur tissulaire (FT). Dans un mode de réalisation de l'invention, le 5 FVII peut être activé in vitro par les facteurs Xa, VIIa, IIa, IXa et XIIa. Le FVII de l'invention peut également être activé pendant son procédé de purification.

10 La Demanderesse a constaté de manière surprenante que la protéine d'intérêt, même placée sous le contrôle d'un promoteur d'une protéine naturellement produite dans le lactosérum, comme le promoteur WAP par exemple, est néanmoins susceptible de se trouver associée aux 15 ions calcium, et donc aux micelles de caséines.

Ainsi, le procédé de l'invention peut être utilisé pour la séparation de protéines recombinantes produites sous le contrôle d'un promoteur d'une protéine du 20 lactosérum. Par ailleurs, le procédé de l'invention est particulièrement adapté à la séparation de protéines recombinantes produites sous le contrôle d'un promoteur de caséines. 25 La protéine peut également être choisie parmi le facteur VIII, l'alpha-1 anti-trypsine, l'anti-thrombine III, l'albumine, le fibrinogène, l'insuline, la protéine basique de la myéline, la proinsuline, 30 l'activateur tissulaire du plasminogène et les anticorps, ou leur mélange.

Le procédé de l'invention peut également être utilisé pour la préparation d'une protéine recombinante 35 lactique. Dans ce cas, il peut s'agir d'une protéine lactique synthétisée par la glande mammaire d'un animal d'une autre espèce (Simons et al, (1987), Aug 6-12 ; 328(6130):530-2). A ce titre, on peut citer comme exemple la lactoferrine, la lactoglobuline, le lysozyme, la lactalbumine.

Un autre objet de l'invention concerne une phase aqueuse non lipidique du lait comprenant au moins une protéine susceptible d'être obtenue par le procédé de l'invention. Une telle phase comporte au moins 50%, ou avantageusement au moins de 60% jusqu'à 80% du total des protéines d'intérêt à purifier par rapport au lait n'ayant pas subi les étapes du procédé. De manière particulièrement avantageuse, la phase aqueuse non lipidique comprend au moins 90% du total des protéines d'intérêt présentes dans le lait avant extraction. Selon une mise en œuvre préférée de l'invention, la protéine d'intérêt présente dans la phase aqueuse non lipidique est le facteur VII (FVII) ou le facteur VII activé (FVIIa).

La phase aqueuse non lipidique de l'invention, même si elle ne contient plus de micelles de caséines et de composés de calcium insolubles, comprend toutefois encore majoritairement des impuretés. Par conséquent, il est nécessaire, selon les cas, de procéder à une purification de la protéine dans la phase aqueuse. Le procédé de l'invention peut en outre comprendre des étapes ultérieures de purification de la phase aqueuse non lipidique comprenant la ou les protéines d'intérêt, obtenue après l'étape c) ou, éventuellement, après les étapes de filtration et de concentration/dialyse mises en œuvre après cette étape c). Ainsi, l'étape c) est suivie d'une étape d) de chromatographie d'affinité avantageusement mise en oeuvre sur une colonne chromatographique dont le support est un gel d'hydroxyapatite (Calo(PO4)6(OH)2) ou un gel de fluoroapatite (Calo(PO4)6F2). Ainsi, la protéine de la phase aqueuse non lipidique est retenue par le support, la majeure partie des protéines lactiques non retenue étant éliminée.

La colonne chromatographique est de préférence équilibrée en tampon A à base de phosphate de sodium 0,025 M-0,035 M, pH 7,5-8,5. La phase aqueuse non lipidique est injectée sur la colonne, ce qui permet la rétention de la protéine d'intérêt. La fraction non retenue est éliminée par percolation du tampon A, jusqu'au retour à la ligne de base (RLB), ce qui assure une bonne élimination des composés indésirables, telles que les protéines lactiques. L'élution de la protéine est effectuée par un tampon à base d'un sel de phosphate, tel que le phosphate de sodium ou de potassium ou leur mélange, à une concentration prédéterminée, de préférence représentant un tampon B à base de phosphate de sodium 0,:25 M-0,35 M, pH 7,5-8,5. La fraction éluée est collectée jusqu'au retour à la ligne de base. Grâce à cette étape, plus de 90% du total des protéines lactiques sont éliminés et plus de 90% des protéines d'intérêt sont récupérées. La pureté de cette fraction éluée est d'environ 5% à cette étape.

La pureté est définie comme étant le rapport massique entre la protéine d'intérêt et les protéines totales présentes dans l'échantillon, la fraction ou l' é_luat considéré. Avantageusement, l'activité spécifique de la ou des protéines est accrue d'un facteur 10 à 25 du fait de l'affinité de la protéine d'intérêt au support chromatographique. L'éluat obtenu à l'issue de l'étape d) est ensuite avantageusement soumis à une filtration tangentielle.

La membrane de filtration tangentielle est choisie par l'homme du métier en fonction des caractéristiques de la protéine d'intérêt. De façon générale, un seuil de coupure dont la taille des pores est deux fois supérieure au poids moléculaire de la protéine d'intérêt permet de filtrer avantageusement le produit. Par exemple, une membrane de tailles de pores de 100 kDa permet de filtrer le FVII avec un bon rendement. Le but de cette étape de filtration est de réduire la charge notamment en protéines de poids moléculaire supérieur à celui de la protéine d'intérêt et, en particulier, d'éliminer les formes atypiques de la protéine d'intérêt (par exemple des protéines sous forme polymérisée), ainsi que des protéases susceptibles, à terme, de la dégrader. De façon très préférée, l'éluat filtré obtenu est ensuite concentré et dialysé. Un système approprié a déjà été décrit pour l'étape de concentration/dialyse par ultrafiltration.

Selon une mise en oeuvre préférée de l'invention, le procédé comprend au moins une étape de chromatographie d'échange d'ions pour ainsi purifier la protéine d'intérêt, et, en particulier, deux étapes chromatographiques successives sur des échangeurs d'ions. Le choix du support échangeur d'ions et des 25 tampons d'équilibrage, de lavage et d'élution dépendent de la nature de la protéine à purifier. Cette ou ces étapes peuvent être effectuées directement après l'étape c), ou, éventuellement, après les étapes de chromatographie d'affinité et/ou de 30 filtration tangentielle. De préférence, l'au moins une étape et les deux étapes de chromatographie sont des chromatographies d'échange d'anions. La deuxième étape chromatographique est destinée à 35 limiter une éventuelle dégradation protéolytique de la protéine.

A titre d'exemple, on utilise, pour la première étape chromatographique de purification du facteur VII à partir de la phase aqueuse non lipidique, un support chromatographique de type gel Q-Sepharose FF sur lequel le facteur VII est retenu. Il est utilisé un tampon d'élution à base de Tris, de préférence 0,05 M, et de chlorure de calcium, de préférence 0,025 M-0,05 M, pH 7,0-8,0, afin d'obtenir un éluat de facteur VII de pureté intermédiaire, c'est-à-dire d'une pureté de 25% à 75%. L'éluat de FVII peut ensuite être soumis à une étape de dialyse, comme décrit précédemment, dont le tampon est une solution de chlorure de sodium 0,15 M. Pour la deuxième étape chromatographique, on utilise, par exemple pour la purification de l'éluat de facteur VII obtenu par l'étape précédente, éventuellement dilué pour permettre de nouveau son adsorption, un support chromatographique de type gel QSepharose FF sur lequel le facteur VII est retenu. On utilise un tampon d'élution à base de Tris, de préférence 0,05 M, et de chlorure de calcium, de préférence 0,005 M, pH 7,0-8,0, pour l'élution d'une fraction de facteur VII de haute pureté, soit d'une pureté supérieure à 90%.

Selon une mise en œuvre préférée de l'invention, le procédé comprend, après les deux étapes chromatographiques d'échange d'anions, une troisième étape chromatographique d'échange d'anions. Cette étape permet la formulation de la composition enrichie en la 30 protéine, de manière à la rendre adaptée à une utilisation médicale. A titre d'exemple, l'éluat obtenu par la deuxième étape chromatographique d'échange d'anions est injecté, après dilution, sur une colonne remplie de support de 35 type gel Q-Sepharose FF sur lequel le facteur VII est retenu. Le facteur VII retenu sur le support est élué par un tampon constitué de Tris, de préférence 0,02 M, et de chlorure de sodium 0,20-0,30 M, pH 6,5-7,5. Par conséquent, les trois étapes de chromatographies sur gel échangeur d'anions permettent de purifier encore la protéine d'intérêt. De plus, elles permettent la concentration et la formulation de la, composition de la protéine d'intérêt.

Selon une mise en oeuvre préférée de l'invention, et lorsque la protéine d'intérêt à purifier est un facteur de la coagulation, au moins l'une des trois étapes de chromatographies sur les supports échangeurs d'anions permettent l'activation de tout ou partie du facteur de la coagulation. Avantageusement, la première chromatographie permet l'activation du facteur de la coagulation.

Le procédé de l'invention peut comprendre également au moins l'une des étapes suivantes : formulation, inactivation virale et stérilisation. De façon générale, le procédé peut comprendre, avant l'étape de chromatographie d'affinité, une étape de traitement anti-viral qui est avantageusement effectuée par solvant/détergent, en particulier en présence d'un mélange de Tween 80 (1% p/v) et de TnBP (tri-nbutylphosphate)(0,3% v/v,), ce qui permet d'inactiver les virus enveloppés. En outre, l'éluat issu de la deuxième étape chromatographique sur échangeur d'anions est de préférence soumis à une étape de nanofiltration pour une élimination efficace des virus, en particulier des virus non enveloppés, tels que le parvovirus B19. Il est possible d'utiliser des filtres ASAHI PLANOVATM15 permettant la rétention des virus ayant une taille supérieure à 15 nm.35 D'autres aspects et avantages de l'invention seront décrits dans les exemples qui suivent, qui doivent être considérés comme illustratifs et ne limitent pas l'étendue de l'invention.

Exemples Les exemples ci-après illustrent l'application du procédé d'extraction et de purification de l'invention à la préparation d'un concentré de facteur VII activé 10 (FVIIa) à partir de laits de lapines transgéniques (FVII-tg : FVII transgénique).

Ces laits bruts proviennent de la première lactation de cinq femelles F1 (2ème génération des 15 lignées fondatrices). Les femelles ont été sélectionnées sur la base du taux de sécrétion lactique en FVII antigène (FVII:Ag). Le kit STAGO (ASSERACHROM VII) a permis de suivre la teneur en FVII humain de J04 à J25 (J : jour de traite) à partir de la première 20 lactation. Cette sécrétion était relativement stable pour ces femelles (entre 188 et 844 UI /ml de FVII), selon la femelle et le jour de collecte).

Le procédé de purification retenu a permis de 25 purifier, par exemple, 12 mg de FVII-tg à partir d'un pool de 500 ml de lait brut. Le rendement global de purification est de 22%.

Ce concentré est pur selon l'analyse par 30 électrophorèse SDS-PAGE en condition non réduite, et présente un clivage complet des chaînes lourde et légère en condition réduite, ce qui traduit la transformation totale en FVII activé (FVIIa) au cours du procédé. 35 Exemple 1 : extraction du FVII à partir du lait On considère 500 ml de lait brut non écrémé qui sont dilués par 9 volumes de tampon phosphate de sodium 0,25 M, pH 8,2. Après 30 minutes d'agitation à température ambiante, la phase aqueuse enrichie en 5 FVII est centrifugée à 10 000g durant 1 heure à 15 C (centrifugeuse Sorvall Evolution RC - 6700 tours/min - rotor SLC-6000). 6 pots d'environ 835 ml sont nécessaires. Après centrifugation, trois phases sont 10 présentes : une phase lipidique en surface (crème), une phase aqueuse non lipidique claire enrichie en FVII (phase majoritaire) et une phase blanche solide en culot (précipités de caséines non solubles et de composés de calcium). 15 La phase aqueuse non lipidique FVII est collectée à la pompe péristaltique jusqu'à la phase crémeuse. La phase crémeuse est collectée à part. La phase solide (précipité) est éliminée.

20 La phase aqueuse non lipidique, comprenant toutefois encore de très faibles quantités de lipides, est filtrée sur une séquence de filtres (Pall SLK7002U010ZP - préfiltre en fibres de verre de taille de pores de 1 m - puis Pall SLK7002NXP - Nylon 66 de 25 taille de pores de 0,45 m). En fin de filtration, la phase lipidique est passée sur cette séquence de filtration qui retient complètement les globules lipidiques du lait, et le filtrat est clair.

30 La phase aqueuse non lipidique filtrée est ensuite dialysée sur membrane d'ultrafiltration (Millipore Biomax 50 kDa - 0,1 m2) pour la rendre compatible avec la phase de chromatographie. Le FVII de poids moléculaire d'environ 50 kDa ne filtre pas à 35 travers la membrane, contrairement aux sels, sucres et peptides du lait. Dans un premier temps, la solution (environ 5 000 ml) est concentrée à 500 ml, puis une dialyse par ultrafiltration en maintenant le volume constant permet d'éliminer les électrolytes et de conditionner la matière biologique pour l'étape de chromatographie. Le tampon de dialyse est un tampon phosphate de sodium 0,025M, pH 8,2.

On peut assimiler cette phase aqueuse non lipidique comprenant le FVII à du lactosérum enrichi en FVII-tg. Cette préparation est stockée à -30 C avant la poursuite du procédé.

Le rendement global de récupération du FVII par cette étape est très satisfaisant : 90% (91% extraction au phosphate + 99% Dialyse/concentration).

La phase aqueuse non lipidique comprenant le FVII à l'issue de cette étape est parfaitement limpide et est compatible avec les étapes chromatographiques qui font suite. Environ 93 000 UI de FVII-tg sont extraites à ce 20 stade. La pureté en FVII de cette préparation est de l'ordre de 0,2%. Exemple 2 : procédé de purification du FVIIa 25 1. Chromatographie sur gel d'hydroxyapatite

Une colonne Amicon 90 (9 cm de diamètre - 64 cm2 de section) est remplie avec du gel BioRad Ceramic Hydroxyapatite type I (CHT-I). 30 Le gel est équilibré en tampon A constitué d'un mélange de phosphate de sodium 0,025 M et de chlorure de sodium 0,04 M, pH 8,0. La totalité de la préparation conservée à -30 C est décongelée au bain- 35 marie à 37 C jusqu'à dissolution complète du glaçon puis est injectée sur le gel (débit linéaire 100 cm/h, soit 105 ml/min). La fraction non-retenue est éliminée par passage d'un tampon constitué de phosphate de sodium 0,025 M et de chlorure de sodium 0,04 M, pH 8,2, jusqu'au retour à la ligne de base (RLB).

L'élution de la fraction contenant le FVII-tg se fait par le tampon B constitué de phosphate de sodium 0,25 M et de chlorure de sodium 0,4 M, pH 8,0. La fraction éluée est collectée jusqu'au retour à la ligne de base.

Cette chromatographie permet de récupérer plus de 90% du FVII-tg, tout en éliminant plus de 95% des protéines lactiques. L'activité spécifique (A.S.) est multipliée par 25. Environ 85 000 UI de FVII-tg de pureté de 4% sont disponibles à ce stade.

2. Filtration tangentielle 100 kDa et concentration/dialyse 50 kDa La totalité de l'éluat de l'étape précédente est filtrée en mode tangentiel sur une membrane d'ultrafiltration 100 kDa (Pall OMEGA SC 100K - 0,1 m2). Le FVII est filtré à travers la membrane 100 kDa, alors que les protéines de poids moléculaire supérieur à 1100 kDa ne sont pas filtrables.

La fraction filtrée est ensuite concentrée à environ 500 ml, puis dialysée sur l'ultrafiltre 50 kDa déjà décrit à l'Exemple 1. Le tampon de dialyse est du chlorure de sodium 0,15 M.

A ce stade du procédé, le produit est stocké à -30 C avant passage en chromatographie d'échange d'ions. Cette étape a permis de réduire la charge en protéines de poids moléculaire supérieur à 100 kDa et35 en particulier des pro-enzymes. Le traitement membranaire 100 kDa permet de retenir environ 50% des protéines dont les protéines de haut poids moléculaire, tout en filtrant 95% du FVII-tg, soit 82 000 UI de FVII-tg. Ce traitement permet de réduire les risques d'hydrolyse protéolytique lors des étapes avales. 3. Chromatographies sur gel Q-Sepharose FF 10 Ces trois chromatographies successives sur gel échangeur d'ions Q-Sepharose Fast Flow (QSFF) sont réalisées pour purifier le principe actif, permettre l'activation du FVII en FVII activé (FVIIa) et 15 finalement concentrer et formuler la composition en FVII. 3.1 Etape Q-Sepharose FF 1 - élution High Calcium 20 Une colonne de 2,6 cm de diamètre (5,3 cm2 de section) est remplie de 100 ml de gel Q-Sepharose FF (GE Healthcare). Le gel est équilibré en tampon Tris 0,05 M, pH 7 `i 25 La totalité de fraction conservée à -30 C est décongelée au bain-marie à 37 C jusqu'à dissolution complète du glaçon. La fraction est diluée au [v/v] avec le tampon d'équilibrage avant injection sur le 30 gel (débit 13 ml/min, soit débit linéaire de 150 cm/h), puis la fraction non retenue est éliminée par passage du tampon jusqu'au RLB.

Une première fraction protéique à faible teneur 35 en FVII est éluée à 9 ml/min (soit 100 cm/h) par un tampon de Tris 0,05 M et de chlorure de sodium 0,15 M, pH 7,5, et est ensuite éliminée.

Une deuxième fraction protéique riche en FVII est 5 éluée à 9 ml/min (soit 100 cm/h) par un tampon de Tris 0,05 M, de chlorure de sodium 0,05 M et de chlorure de calcium 0,05 M, pH 7,5. Cette deuxième fraction est dialysée sur l'ultrafiltre 50 kDa déjà décrit à l'Exemple 1. Le 10 tampon de dialyse est du chlorure de sodium 0,15 M. Cette fraction est conservée à +4 C durant une nuit avant le 2ème passage en chromatographie d'échange d'anions.

15 Cette étape permet de récupérer 73% du FVII (soit 60000 UI de FVII-tg), tout en éliminant 80% des protéines accompagnantes. Elle permet également l'activation du FVII en FVIIa.

3.2 Etape Q-Sepharose FF 2 - élution Low 20 Calcium Une colonne de 2,5 cm de diamètre (4,9 cm2 de section) est remplie de 30 ml de gel Q-Sepharose FF (GE Healthcare). 25 Le gel est équilibré en tampon Tris 0,05 M, pH 7,5. La fraction éluée précédente (deuxième fraction), conservée à +4 C, est diluée avant injection sur le gel (débit 9 ml/min, soit débit linéaire de 100 cm/h). 30 Une fraction contenant du FVII de très haute pureté est éluée à 4,5 ml/min (soit 50 cm/h) en tampon de Tris 0,05 M, de chlorure de sodium 0,05 M et de chlorure de calcium 0,005 M, pH 7,5. 35 Environ 23 000 UI de FVII-tg ont été purifiées, soit 12 mg de FVII-tg.

Cette étape permet d'éliminer plus de 95% des protéines accompagnantes (protéines du lait de lapine). Cet éluat, de pureté supérieure à 90%, présente des caractéristiques structurales et fonctionnelles proches des molécules naturelles du FVII humain. Il est concentré et formulé par le troisième passage en chromatographie d'échanges d'ions. 3.3 Etape Q-Sepharose FF 3 - élution Sodium Une colonne de 2,5 cm de diamètre (4,9 cm2 de section) est remplie de 10 ml de gel Q-Sepharose FF 15 (GE Healthcare). Le gel est équilibré en tampon Tris 0,05 M, pH 7,5.

La fraction éluée purifiée de l'étape précédente 20 est diluée cinq fois avec de l'eau purifiée pour injection (PPI) avant injection sur le gel(débit 4,5 ml/min, soit débit linéaire de 50 cm/h). Le FVII-tg est ensuite élué à un débit de 3 ml/min (soit 36 cm/h) par le tampon de Tris 0,02 M et 25 de chlorure de sodium 0,28 M, pH 7,0.

Un concentré de FVII-tg a été préparé dont la pureté est supérieure à 95%. Le produit est compatible avec une injection par voie intraveineuse. Le procédé 30 a un rendement cumulé de 22%, ce qui permet de purifier au moins 20 mg de FVII par litre de lait mis en œuvre. Le Tableau A résume les étapes du procédé selon une mise en oeuvre préférée de l'invention, et fournit 35 les différents rendements, la pureté et les activités spécifiques obtenus à chaque étape. Tableau A cté& I I I I Ior~a~m0 v~(nI) pmtéires Q-Ettité 1~iltFV>I/ >d> / AS R>retéF\4I (rrg) Fvn:g(1) ( l~ ol c lait Flat 500 4275) 103450 100'/o 10î/o 2,4 0,12% Clatific ia 1i i e 4785 N) 93660 91% 91% -Gtrufradicn/Lial~se(LF501 1 667 29010 93233 9)% 90'/0 3,1 020/o F]tot 1-1}c}tgidite(CfII_1) 2614 1071 85102 92% 80,0 4,(P/o Filtration Carentielle (lF 100I~ 45) 518 81684 95% 72% 157,6 7,9% Fluet QSFF1 ~gh Cà 1 1) 402 105 59757 73% 58% 572 2B ,60/o F]tet ( F2(1crwGi-H) 157 12,8 22447 38/ 22% 1749 87% Hui ÇSFF3 (Bothar 42,5 12,7 21929 98'/o 21% 1727 8H'/o -Ptncitit fini (sténlisaticn 0,2 5) 12,4 23197 109/0 22% 1878 94% Rdt : Rendement

Claims

Revendications

1. Procédé d'extraction d'au moins une protéine présente dans du lait, ladite protéine présentant une affinité pour les ions calcium complexés ou non dudit lait, comprenant les étapes suivantes consistant à : a) libérer la protéine par la précipitation de composés de calcium obtenue par mise en contact du lait avec un sel soluble, dont l'anion est choisi pour son aptitude à former dans un tel milieu lesdits composés de calcium insolubles, pour ainsi obtenir une phase liquide enrichie en la protéine, b) séparer la phase liquide enrichie en la protéine du précipité de composés de calcium, ladite phase liquide étant en outre séparée en une phase lipidique et en une phase aqueuse non lipidique comprenant la protéine, et c) récupérer la phase aqueuse non lipidique 20 comprenant la protéine.

2. Procédé selon la revendication 1, dans lequel le sel soluble est un sel de phosphate. 25

3. Procédé selon la revendication 2, dans lequel le sel de phosphate est choisi dans le groupe constitué par le phosphate de sodium, le phosphate de lithium, le phosphate de potassium, le phosphate de rubidium et le phosphate de césium, et est, en particulier, le 30 phosphate de sodium.

4. Procédé selon la revendication 1, dans lequel le sel est un oxalate d'un métal alcalin, en particulier l'oxalate de sodium ou de potassium, ou un 35 carbonate d'un métal alcalin, en particulier le carbonate de sodium ou de potassium, ou leur mélange.

5. Procédé selon l'une des revendications 1 à 4, dans lequel la concentration du sel en solution aqueuse est comprise entre 100 mM et 3 M, de façon plus préférée, entre 200 mM et 500 mM et, en particulier, entre 200 mM et 300 mM.

6. Procédé selon l'une des revendications 1 à 5, dans lequel l'étape b) est effectuée par 10 centrifugation.

7. Procédé selon l'une des revendications 1 à 6, comprenant, après l'étape c), une étape de filtration de la phase aqueuse 15 successivement sur des non lipidique effectuée filtres de porosité décroissante, de préférence de 1 pm puis de 0,45 m, suivie d'une étape de concentration/dialyse par ultrafiltration. 20

8. Procédé selon l'une des revendications 1 à 7, dans lequel la phase lipidique est filtrée à travers des filtres de porosité décroissante, de préférence de 1 m puis de 0,45 m. 25

9. Procédé selon l'une des revendications 1 à 8, dans lequel la protéine est une protéine non naturellement présente dans le lait.

10. Procédé selon l'une des revendications 1 à 9, 30 dans lequel le lait est un lait de mammifère non-humain transgénique.

11. Procédé selon la revendication 10, dans lequel ledit mammifère est sélectionné parmi la lapine, la 35 brebis, la chèvre, la vache, la truie et la souris.

12. Procédé selon l'une des revendications 9 à 11, dans lequel la protéine est une protéine de la coagulation.

13. Procédé selon la revendication 12, dans lequel la protéine est choisie parmi le facteur II, le facteur VI:E, le facteur IX et le facteur X, ainsi que leurs formes activées, la protéine C, la protéine C activée, la protéine S et la protéine Z, ou leur mélange .

14. Procédé selon l'une des revendications 9 à 11, dans lequel la protéine est une protéine comportant des GLA-domaines, des domaines EGF (epidermial growth factor) ou d'autres domaines identifiés comme ayant une capacité à fixer les ions calcium.

15. Procédé selon l'une des revendications 9 à 11, dans lequel la protéine est une protéine vitamine K-dépendante.

16. Procédé selon l'une des revendications 9 à 11, dans lequel la protéine est une protéine calcium-dépendante. 25

17. Procédé selon l'une des revendications 9 à 11, dans lequel la protéine est choisie parmi le facteur VIII, l'alpha-1 anti-trypsine, l'anti-thrombine III, l'albumine, le fibrinogène, l'insuline, la protéine basique de la myéline, la proinsuline, l'activateur 30 tissulaire du plasminogène et les anticorps, ou leur mélange.

18. Procédé selon l'une des revendications 9 à 11, dans lequel la protéine est la lactoferrine, la 35 lactoglobuline, le lysozyme ou la lactalbumine.20

19. Phase aqueuse non lipidique du lait comprenant au moins une protéine, susceptible d'être obtenue par le procédé selon l'une des revendications 1 à 18.

20. Procédé selon l'une des revendications 1 à 18, dans lequel l'étape c) est suivie d'une étape d) de chromatographie d'affinité, l'élution de la protéine étant effectuée par un tampon à base d'un sel de phosphate à une concentration prédéterminée.

21. Procédé selon la revendication 20, dans lequel la chromatographie d'affinité est mise en oeuvre sur une colonne chromatographique dont le support est un gel d'hydroxyapatite (Ca10(PO4)6(OH)2) ou un gel de f luoroapati te (Ca10 (PO4) 6F2) .

22. Procédé selon la revendication 20 ou 21, dans lequel l'éluat obtenu à l'issue de l'étape d) est ensuite soumis à une filtration tangentielle.

23. Procédé selon l'une des revendications 1 à 18, comprenant au moins une étape de chromatographie d'échange d'ions, et, en particulier deux étapes chromatographiques successives sur des échangeurs d'ions effectuées directement après l'étape c).

24. Procédé selon la revendication 23, dans lequel l'au moins une étape et les deux étapes de chromatographie sont des chromatographies d'échange d'anions.

25. Procédé selon la revendication 24, comprenant, après les deux étapes chromatographiques d'échange d'anions, une troisième étape chromatographique d'échange d'anions. 5

26. Procédé selon l'une des revendications 20 à 25, comprenant, avant l'étape de chromatographie d'affinité, une étape de traitement anti-viral qui est effectuée par solvant/détergent.

27. Procédé selon l'une des revendications 23 à 25, dans lequel l'éluat issu de la deuxième étape chromatographique sur échangeur d'anions est soumis à une étape de nanofiltration. 10