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FR2986803A1 - Cytomegalovirus humain oncogenique - Google Patents

Cytomegalovirus humain oncogenique Download PDF

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FR2986803A1
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FR
France
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hcmv
acid sequence
strain
protein
nucleic acid
Prior art date
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Withdrawn
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FR1251324A
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English (en)
Inventor
Georges Herbein
Stephanie Morot-Bizot
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
APEX BIOSOLUTIONS
Universite de Franche-Comte
Original Assignee
APEX BIOSOLUTIONS
Universite de Franche-Comte
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Publication date
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Priority to PCT/IB2013/051142 priority patent/WO2013121351A2/fr
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Abstract

La présente invention concerne l'utilisation d'une séquence d'acides nucléiques codant isolée pour une protéine UL82 ou UL97 d'une souche de cytomégalovirus humain, HCMV, ou d'une séquence d'acides aminés isolée consistant en une séquence d'une protéine UL82 ou UL97 d'une souche de HCMV pour déterminer une propriété oncogénique chez un HCMV.

Description

La présente invention a pour objet, notamment, des séquences d'acides nucléiques et des séquences d'acides aminés isolées et issues d'un cytomégalovirus humain, et leur utilisation comme biomarqueur, actif thérapeutique ou cible thérapeutique, à l'égard du cancer, et plus particulièrement du cancer du sein.
Le terme « cancer » définit un grand groupe de maladies différentes, toutes impliquant une croissance cellulaire non régulée. Dans le cancer, les cellules d'un tissu se divisent et se développent de manière incontrôlée, conduisant à la formation de tumeurs malignes, et éventuellement à l'invasion de tissus ou organes voisins ou éloignés, par le biais du système lymphatique ou de la circulation sanguine, et à la formation de métastases.
Le cancer du sein (ou tumeur maligne du sein) est un type de cancer provenant de tissus mammaires, le plus souvent de la paroi interne des canaux galactophores ou des lobules qui approvisionnent les conduits en lait. Bien que l'écrasante majorité des cancers du sein chez les humains affectent les femmes, certains hommes peuvent également en être affectés. Dans le monde, le cancer du sein constitue environ 20 % des cancers (hors cancers cutanés non- mélanomes) chez les femmes, et plus d'un cancer sur trois chez la femme en France. Le cancer du sein, comme la plupart des cancers, comprend un ensemble de tumeurs hétérogènes avec des caractéristiques cliniques, des évolutions pathologiques, et des réponses thérapeutiques très différentes. Ainsi, les caractéristiques intrinsèques des tumeurs, tels que ces caractères histologiques, immunopathologiques, ou moléculaires conduisent à classer les tumeurs du sein en différents groupes au pronostic souvent différents. Egalement, les caractéristiques extrinsèques des tumeurs, tels que le microenvironnement, peuvent impacter le pronostique des tumeurs du sein (Bertos & Park, J Clin Invest, 2011, 121:3789- 3796). Le pronostic et le taux de survie peuvent varier dans de larges proportions selon le type de cancer, le stade, et la stratégie de traitement adoptée. Ainsi, une meilleure compréhension des caractéristiques sous-jacentes à la carcinogénèse, à l'hétérogénéité des cancers, et notamment des cancers du sein, ainsi que des mécanismes et de leur étiologie, est essentielle pour améliorer les stratégies de traitement, développer de nouvelles thérapies, et améliorer le pronostic vital des patients.
De nombreux facteurs sont connus pour augmenter le risque de carcinogénèse, tel que l'usage du tabac, certaines radiations, le manque d'activité physique, une mauvaise alimentation, l'obésité, les polluants environnementaux, certaines infections, notamment par virus.
Les virus oncogéniques ou virus à propriété ou caractère oncogène sont des virus dotés de la propriété d'induire, chez certains individus, et ce parfois plusieurs années après l'infection initiale, différentes tumeurs. Certains virus deviennent oncogéniques quand ils persistent après l'infection sous forme épisomique se répliquant séparément de la cellule hôte, comme le virus d'Epstein-Barr ou le virus de l'herpès associé au sarcome de Kaposi. D'autres, comme le polyomavirus et les papillomavirus, ne sont cancérigènes que lorsqu'ils s'intègrent dans le génome de la cellule hôte, par exemple à la suite d'un accident biologique. Le caractère oncogène de certains virus impliquent des voies d'action directes, telle que l'insertion de gènes oncogéniques viraux dans la cellule hôte ou l'augmentation de l'activité de gènes oncogéniques (proto-oncogènes) existant dans le génome de la cellule hôte. D'autres virus manifeste leur oncogénicité par induction d'une inflammation chronique non spécifique, comme c'est le cas pour le cancer du foie induit par le virus de l'hépatite C. Les principaux virus associés aux cancers chez l'homme sont le papillomavirus humain, les virus de l'hépatite B et de l'hépatite C, le virus d'Epstein-Barr, le virus humain T- lymphotrope (HTLV), le virus de l'herpès associé au sarcome de Kaposi (KSHV) et le polyomavirus à cellules de Merkel. Bien que le lien entre infection par le cytomégalovirus humain (HCMV) et cancer soit étudié depuis longtemps, il n'est pas reconnu, à ce jour, de propriétés oncogènes propres au cytomégalovirus humain (Human Cytomegalovirus ou HCMV) (Michaelis et al., Neoplasia, 2009, 11:1-9). Le cytomégalovirus humain (Human Cytomegalovirus ou HCMV) est un virus de l'herpès, ubiquitaire, qui affecte une large partie de la population adulte et qui provoque des infections latentes, asymptomatiques, chez les individus en bonne santé. La fréquence d'infection varie de 50 à 100 % dans la population adulte générale. En revanche, il peut provoquer des états pathologiques sévères et souvent fatals, chez les individus immunodéprimés. Des études histologiques et immunohistochimiques ont démontré la présence de cellules infectées par ce virus dans pratiquement tous les organes. Ce virus peut cibler, in vivo, une grande diversité de types cellulaires, tels que les macrophages, les cellules endothéliales, les cellules épithéliales, les fibroblastes, les cellules stromales, les cellules neuronales, les cellules musculaires lisses, et les hépatocytes. Les monocytes du sang et les macrophages tissulaires sont considérés comme servant de cible cellulaire dans les organes infectés et joueraient le rôle de disséminateur viral dans l'organisme ou de réservoir pour le HCMV latent.
De manière surprenante, les inventeurs ont identifiés, comme détaillé dans les exemples ci-après, que certaines souches de HCMV, notamment les souches DB et AD169, sont dotées de propriétés oncogéniques propres et sont aptes à transformer, après infection, des cellules primaires saines, notamment des cellules humaines épithéliales mammaires primaires (ou HuMEC, Human Mammary Epithelial Cells), en cellules malignes. Egalement, les inventeurs ont identifiés que les gènes UL82 et UL97, leur produits d'expression et notamment le niveau d'expression de ces derniers, sont impliqués dans le caractère oncogénique des souches HCMV oncogènes. Ainsi les inventeurs ont identifié que le niveau d'expression des protéines UL82 et UL92, et/ou que des mutations, comme détaillées dans les exemples, au niveau de l'extrémité C-terminale de la protéine UL82, dans la région s'étendant de l'acide aminé 421 à l'acide aminé 540, sont impliqués dans le caractère oncogène des HCMV oncogéniques. Les inventeurs ont déterminés que des mutations dans l'extrémité C-terminale de la protéine UL82 ne sont présentes que dans les séquences des souches HCMV oncogéniques DB et AD169 et non au niveau des souches non-oncogéniques HCMV TB40E et TB40F. Enfin, les inventeurs ont déterminé que les protéines UL97 et UL82, décrites par ailleurs comme inactivant la protéine anti-tumorale Rb (rétinoblasome) en la phosphorylant et en favorisant sa dégradation cellulaire dans le protéasome 26S, sont exprimées en quantité plus importantes au sein de cellules permissives infectées par les souches oncogéniques que par les souches non- oncogéniques. Ainsi, selon un premier objet, la présente invention concerne l'utilisation d'une séquence d'acides nucléiques isolée codant pour une protéine UL82 ou UL97 d'une souche de cytomégalovirus humain, HCMV, ou d'une séquence d'acides aminés isolée consistant en une séquence d'une protéine UL82 ou UL97 d'une souche de HCMV pour déterminer une propriété oncogénique chez un HCMV. Selon un autre de ses objets, la présente invention concerne l'utilisation d'une séquence d'acides nucléiques isolée codant pour une protéine UL82 ou UL97 d'une souche de cytomégalovirus humain, HCMV, ou d'une séquence d'acides aminés isolée consistant en une séquence d'une protéine UL82 ou UL97 d'une souche de HCMV pour déterminer un risque de carcinogénèse ou pour évaluer un pronostic d'un cancer. Selon un mode de réalisation préférée, la carcinogénèse est une carcinogénèse du sein, ou du foie, et de préférence encore une carcinogénèse du sein. Selon un autre de ses objets, la présente invention concerne une séquence d'acides nucléiques isolée codant pour une séquence d'acides aminés d'une protéine UL82 d'une souche de cytomégalovirus humain, HCMV, ladite séquence d'acides aminés comprenant dans une région s'étendant de l'acide aminés 421 à l'acide aminé 540 au moins une mutation ponctuelle. Selon un mode de réalisation préféré, une séquence d'acides nucléiques isolée de l'invention code pour une séquence d'acides aminés choisie parmi une séquence consistant en SEQ ID NO 5, SEQ ID NO 6 ou SEQ ID NO 7. Selon un autre de ses objets, la présente invention concerne une amorce nucléotidique, notamment isolée, consistant en une séquence d'acides nucléiques consécutifs issus d'une séquence d'acides nucléiques de l'invention, ladite amorce convenant spécifiquement au séquençage ou à l'amplification d'une séquence d'acides nucléiques comprenant au moins une séquence d'acides nucléiques de l'invention. Selon un autre de ses objets, la présente invention concerne une sonde nucléotidique, notamment isolée, consistant en une séquence d'acides nucléiques consécutifs issus d'une séquence d'acides nucléiques de l'invention, ladite sonde étant une sonde d'hybridation pour détecter spécifiquement une séquence d'acides nucléiques comprenant au moins une séquence d'acides nucléiques de l'invention. Selon un autre de ses objets, la présente invention concerne un vecteur d'expression, notamment isolé, comprenant au moins une séquence d'acides nucléiques de l'invention.
Selon un autre de ses objets, la présente invention concerne une cellule hôte, notamment isolée, transfectée avec un vecteur d'expression de l'invention. Selon un autre de ses objets, la présente invention concerne une séquence d'acides aminés isolée d'une protéine UL82 d'une souche de cytomégalovirus humain, HCMV, ladite séquence d'acides aminés comprenant dans une région s'étendant de l'acide aminés 421 à l'acide aminé 540 au moins une mutation ponctuelle. Selon un mode de réalisation, une séquence d'acides aminés isolée de l'invention peut consister en une séquence d'acides aminés choisie parmi SEQ ID NO 5, SEQ ID NO 6 ou SEQ ID NO 7. Selon un mode de réalisation préféré, une séquence d'acides aminés isolée de l'invention peut consister en une séquence d'acides aminés choisie parmi SEQ ID NO 6 ou SEQ ID NO 7. Selon un autre de ses objets, la présente invention concerne un anticorps apte à se lier spécifiquement à une séquence d'acides aminés de l'invention.
Selon un autre de ses objets, la présente invention concerne un biomarqueur pour évaluer une propriété oncogénique d'une souche de cytomégalovirus humain, HCMV, ou pour déterminer un risque de carcinogénèse chez un individu en ayant besoin, ou pour déterminer un pronostic d'un cancer chez un individu atteint d'un cancer, ledit biomarqueur consistant en une séquence d'acides nucléiques codant pour une protéine UL82 ou UL97 d'une souche de HCMV ou en une séquence d'acides aminés consistant en une séquence d'une protéine UL82 ou UL97 d'une souche de HCMV. Selon un autre de ses objets, la présente invention concerne un kit de diagnostic contenant au moins une séquence d'acides nucléiques ou au moins une séquence d'acides aminés de l'invention, une amorce nucléotidique de l'invention, une sonde nucléotidique de l'invention, et/ou un anticorps de l'invention. Selon un autre de ses objets, la présente invention concerne un médicament comprenant au moins une séquence d'acides nucléiques de l'invention, ou au moins une une séquence d'acides aminés de l'invention ou au moins une un anticorps de l'invention.
Selon un mode de réalisation préféré, un médicament de l'invention est un vaccin. Selon encore un mode de réalisation préféré, un médicament de l'invention est destiné à prévenir et/ou traiter une carcinogénèse, ou cancer, induit(e) par une infection par HCMV. Selon un mode de réalisation préféré, une carcinogénèse ou un cancer induit par 20 une infection par HCMV est une carcinogénèse ou un cancer du sein ou du foie, et de préférence encore une carcinogénèse ou un cancer du sein. Ainsi un médicament de l'invention peut être destiné à prévenir et/ou traiter un cancer du sein ou du foie. Un individu concerné par l'invention est un individu humain, et de préférence encore est une femme. 25 Selon un autre de ses objets, la présente invention concerne une méthode pour déterminer un risque de carcinogénèse, notamment un cancer du sein, chez un individu en ayant besoin, ou pour évaluer un pronostic d'un cancer, notamment un cancer du sein, chez un individu atteint dudit cancer, comprenant au moins les étapes de: a) déterminer, dans un échantillon biologique isolé, obtenu à partir dudit individu, 30 une présence ou un niveau d'expression ou une activité d'une séquence d'acides nucléiques codant pour une protéine UL82 ou UL97 d'une souche de cytomégalovirus humain, HCMV, ou d'une séquence d'acides aminés consistant en une séquence d'une protéine UL82 ou UL97 d'une souche de HCMV, et b) comparer la détermination de l'étape a) à une détermination contrôle.
Selon un autre de ses objets, la présente invention concerne une méthode pour évaluer un caractère oncogène d'une souche de cytomégalovirus humain, HCMV, comprenant au moins les étapes de : a) déterminer dans un échantillon biologique isolé une présence ou un niveau d'expression ou une activité d'au moins une séquence d'acides nucléiques codant pour une protéine UL82 ou UL97 de ladite souche de HCMV, ou d'une séquence d'acides aminés consistant en une séquence d'une protéine UL82 ou UL97 de ladite souche de HCMV, et b) comparer la détermination de l'étape a) à une détermination contrôle. Selon un autre de ses objets, la présente invention concerne l'utilisation d'une souche de cytomégalovirus humain, HCMV, choisie parmi HCMV-DB et HCMV-AD169 pour déterminer un caractère oncogène d'une souche distincte de HCMV. Dans une telle utilisation, les souches HCMV-DB et HCMV-AD169 sont avantageusement mises en oeuvre à titre de contrôle positif. Selon un autre de ses objets, la présente invention concerne une méthode pour déterminer un risque de carcinogénèse, notamment mammaire, chez un individu en ayant besoin, ou pour déterminer un pronostic d'un cancer chez un individu atteint dudit cancer, comprenant au moins les étapes consistant à : a- infecter des cellules eucaryotes permissives au HCMV au moyen d'une souche de HCMV isolée dudit individu, b- cultiver les cellules infectées à l'étape a- dans une couche basale d'agar mou, c- déterminer la présence ou l'absence de colonies cellulaires en agar mou. Selon un autre de ses objets, la présente invention concerne une méthode pour déterminer un caractère oncogénique d'une souche HCMV comprenant au moins les étapes consistant à : a- infecter des cellules eucaryotes permissives au HCMV au moyen d'une souche de HCMV à tester, b- cultiver les cellules infectées à l'étape a- dans une couche basale d'agar mou, c- déterminer la présence ou l'absence de colonies cellulaires en agar mou. Selon un autre de ses objets, la présente invention concerne une méthode pour 30 déterminer un caractère oncogénique d'une souche de HCMV comprenant au moins les étapes consistant à : a- infecter des cellules eucaryotes permissives au HCMV au moyen d'une souche de HCMV à tester, b- déterminer l'expression génique des cellules infectées à l'étape a-, et c- comparer l'expression génique déterminée à l'étape b- avec des cellules mammaires cancéreuses de type basal/myoépithélial ou l'expression génique de cellules eucaryotes permissives au HCMV infectées par une souche de HCMV oncogénique. Selon un mode de réalisation, les utilisations et méthodes de l'invention peuvent être réalisées in vivo, ex vivo, ou in vitro, et de préférence sont réalisées in vitro ou ex vivo. Au sens de l'invention, on entend par « souche de cytomégalovirus humain (HCMV) oncogénique » une souche de virus apte à induire la transformation d'une cellule eucaryote primaire permissive à l'infection par un tel virus en cellule maligne. Une telle transformation se caractérise, notamment, par la prolifération des cellules en l'absence d'adhésion, et peut être déterminée, par exemple, par la technique de la culture en agar mou, détaillée ci-après. Séquences d'acides nucléiques et d'acides aminés Une séquence d'acides nucléiques de l'invention peut consister en une séquence 15 codant pour une protéine UL82 ou UL97 d'une souche de cytomégalovirus humain, HCMV. De telles séquences sont connues et sont disponibles par exemple dans la base de données EMBL-Bank sous les référence AAR31634.1 (UL82) ou AY642441.1 (UL97). Une séquence d'acides nucléiques codant pour une protéine UL82 peut consister en une séquence d'acides nucléiques SEQ ID NO 1, une séquence d'acides nucléiques 20 présentant une identité de séquence d'au moins 90, de préférence d'au moins 95 %, et de préférence encore d'au moins 99 % avec SEQ ID NO 1 et une activité biologique analogue à SEQ ID NO 1, ou un fragment de SEQ ID NO 1, comprenant au moins 360 acides nucléiques consécutifs issus de ladite séquence d'acides nucléiques, et une activité biologique analogue. De préférence, un fragment convenant à l'invention code pour une séquence d'acides aminés 25 issue de l'extrémité C-terminale la protéine, et consiste en 360 derniers acides nucléiques de SEQ ID NO 1. Une séquence d'acides nucléiques isolée de l'invention peut avantageusement coder pour une séquence d'acides aminés d'une protéine UL82 d'une souche de cytomégalovirus humain, HCMV comprenant dans une région s'étendant de l'acide aminés 30 421 à l'acide aminé 540 au moins un acide aminé muté par substitution ou insertion. De préférence une séquence d'acides nucléiques de l'invention peut consister en une séquence d'acides nucléiques codant pour une séquence d'acides aminés choisie parmi SEQ ID NO 3, SEQ ID NO 4, SEQ ID NO 5, SEQ ID NO 6, ou SEQ ID NO 7, de préférence choisie parmi SEQ ID NO 5, SEQ ID NO 6 ou SEQ ID NO 7, et de préférence encore pour une séquence d'acides aminés consistant en SEQ ID NO 6 ou SEQ ID NO 7. Une séquence d'acides nucléiques codant pour une protéine UL97 peut consister en une séquence d'acides nucléiques SEQ ID NO 2, une séquence d'acides nucléiques présentant une identité de séquence d'au moins 90, de préférence d'au moins 95 %, et de préférence encore d'au moins 99 % avec SEQ ID NO 2 et une activité biologique analogue à SEQ ID NO 2, ou un fragment de SEQ ID NO 2 et comprenant une activité biologique analogue. De préférence une séquence d'acides nucléiques codant pour une protéine UL97 peut consister en une séquence d'acides nucléiques codant pour une séquence d'acides aminés consistant en SEQ ID NO 8. Une séquence d'acide nucléique de l'invention peut être utilisée pour établir, in vitro, ex vivo, in vivo, des cellules de mammifères transfectées, ou des mammifères non-humains transgéniques utiles pour établir de nouveaux outils de diagnostic, de pronostic ou de traitement de troubles pathologiques susceptibles d'être provoqués, au moins en partie, par un HCMV oncogénique, et notamment par une souche HCMV DB ou AD169. Une séquence d'acides nucléiques de l'invention peut être sous-clonée dans tout vecteur d'expression approprié convenant à la manifestation de l'expression d'une séquence d'acides aminés de l'invention dans une cellule hôte appropriée, par exemple un plasmide de 20 type pcDNA3.1. L'obtention de cellules, notamment isolées, de mammifères transfectées ou l'obtention de mammifères non-humains transgéniques peut être effectuée en utilisant toutes méthodes connues dans l'art, et comprenant l'utilisation de tout vecteur d'expression approprié contenant une séquence d'acides nucléiques de l'invention. 25 Aussi, l'invention concerne un vecteur d'expression, notamment isolé, comprenant une séquence d'acides nucléiques de l'invention, ainsi qu'une cellule hôte, notamment isolée, comprenant une séquence d'acides nucléiques de l'invention ou un vecteur d'expression de l'invention. Selon un mode de réalisation, une séquence d'acides nucléiques de l'invention 30 peut également être une séquence, amorce ou sonde nucléotidique, apte à s'hybrider, dans des conditions stringentes, à une séquence d'acides nucléiques SEQ ID NO 1 ou SEQ ID NO 2, une séquence d'acides nucléiques présentant une identité de séquence d'au moins 90, de préférence d'au moins 95 %, et de préférence encore d'au moins 99 % avec SEQ ID NO 1 ou SEQ ID NO 2 et une activité biologique analogue à SEQ ID NO 1 ou SEQ ID NO 2, ou un fragment de SEQ ID NO 1, comprenant au moins 360 acides nucléiques consécutifs issus de ladite séquence d'acides nucléiques, et une activité biologique analogue, ou un fragment de SEQ ID NO 2 et comprenant une activité biologique analogue, les conditions stringentes étant une température inférieure de 20 à 25 °C à Tm, 1xSSC (soluble solid content) et 0,1% de SDS (Sodium Dodecyl Sulfate). Tm (melting temperature) désigne la température de fusion ou de dénaturation des séquences d'acides nucléiques comme l'ADN, à savoir la température pour laquelle 50 % des séquences sont désappariées ou dénaturées (i.e. sous forme simple brin). Les conditions stringentes désignent des conditions spécifiques dans lesquelles des hybrides spécifiques des séquences d'acides nucléiques peuvent se former, mais dans lesquelles des hybrides non-spécifiques ne se forment pas. À titre d'exemple, ce sont les conditions dans lesquelles deux séquences d'acides nucléiques ayant un haut degré d'homologie, par exemple, des séquences d'acides nucléiques ayant 85 % ou plus, de préférence 90 % ou plus, de préférence encore 95 % ou plus, et encore plus préférentiellement 99 % ou plus d'identité s'hybrident, mais dans lesquelles deux séquences d'acides nucléiques d'identité inférieure ne s'hybrident pas. Comme exemple de conditions stringentes, on peut mentionner les conditions dans lesquelles une hybridation se produit à 60 °C, à des concentrations de sel correspondant à 1xSSC, et SDS 0,1 %, de préférence 0,1xSSC et 0,1 % SDS, qui sont des conditions habituelles de lavage dans une hybridation Southern. Une hybridation peut être réalisée selon les méthodes décrites dans Current Protocols in Molecular Biology (Ed. Frederick M. Ausubel et al., 1987), ou toute autre méthode connues de l'homme de l'art. Le terme « amorce » désigne une séquence d'acides nucléiques simple brin capables d'agir comme un point d'initiation de la synthèse d'un produit d'extension d'amorces, et complémentaire de la séquence d'acides nucléiques destinée être copiée. La longueur et la séquence de l'amorce dépendent de la complexité de la séquence d'acides nucléiques à copier et doivent être telles qu'elles permettent d'amorcer spécifiquement la synthèse des produits d'extension. De préférence, une amorce peut être d'au moins environ 10, de préférence d'au moins 15 acides nucléiques. La longueur et la séquence spécifique de l'amorce dépendent également des conditions de mise en oeuvre, comme la température, la force ionique, etc. Une telle amorce convient à l'amplification ou au séquençage de la séquence cible. Une amorce d'amplification ne correspond pas nécessairement exactement à la séquence à copier pour obtenir l'amplification cherchée.
Une méthode d'amplification convenant à l'invention peut être une réaction en chaîne par polymérase (PCR), une réaction en chaîne par ligase (LCR), une amplification basée sur une séquence d'acides nucléiques (NASBA), une amplification basée sur un système de transcription (TAS), une amplification par déplacement de brin (SDA), une amplification par réplicase Q(3, ou toute autre méthode adaptée pour amplifier des séquences d'acides nucléiques utilisant l'extension d'amorce. Pendant l'amplification, les produits amplifiés peuvent être marqués soit en utilisant des amorces marquées avec un marqueur ou en incorporant des acides nucléiques marqués. Les marqueurs peuvent être radio-isotopiques (32P, 35S, etc) ou non-isotopiques, comme la biotine ou la digoxigénine, ou encore être fluorescents, comme le FITC, une cyanine fluorescente, ou le BODIPY. Le terme « sonde » se réfère à une séquence d'acides nucléiques spécifique simple brin, et complémentaire de la séquence d'acides nucléiques cible à détecter. Une sonde d'acides nucléiques selon l'invention peut comprendre une portion d'une séquence d'acides nucléiques de l'invention, et être apte à agir comme une sonde d'hybridation pour la détection spécifique d'une séquence d'acides nucléiques contenant une séquence d'acides nucléiques de l'invention. De préférence, une sonde de l'invention peut consister en 5 à 50 acides nucléiques, de préférence de 10 à 25 acides nucléiques. Une sonde peut être fixée à un support solide, c'est à dire, tout substrat sur lequel une sonde d'acides nucléiques peut être couplée, à condition qu'elle conserve ses caractéristiques d'hybridation, et à condition que le bruit de fond de l'hybridation reste faible. A titre d'exemple de support solide convenant à l'invention on peut citer une plaque de microtitration, une membrane, par exemple de nylon ou de nitrocellulose, ou une microsphère. Une sonde d'acides nucléiques peut être modifiée en vue de faciliter la fixation sur le support ou améliorer l'efficacité de l'hybridation. De telles modifications peuvent consister en un couplage avec différents groupes réactifs, tels que des groupes aliphatiques, des groupes NEZ, des groupes SH, des groupes carboxyliques, ou un couplage avec une biotine ou des haptènes. Une amorce ou une sonde nucléotidique de l'invention apte à s'hybrider dans des conditions stringentes à une séquence d'acides nucléiques de l'invention, en particulier codant pour une protéine UL82, peut notamment consister en une séquence d'acides nucléiques choisies parmi SEQ ID NO 9, SEQ ID NO 10, SEQ ID NO 11, SEQ ID NO 12, SEQ ID NO 13 ou SEQ ID NO 14. Une amorce ou une sonde nucléotidique de l'invention apte à s'hybrider dans des conditions stringentes à une séquence d'acides nucléiques de l'invention, en particulier codant pour une protéine UL97, peut notamment consister en une séquence d'acides nucléiques choisies parmi SEQ ID NO 15, SEQ ID NO 16, SEQ ID NO 17, SEQ ID NO 18, SEQ ID NO 19 ou SEQ ID NO 20.
En outre, l'invention concerne également une séquence d'acides nucléiques isolée apte à réduire et/ou supprimer et/ou prévenir la présence ou l'expression et/ou l'activité d'une séquence d'acides nucléiques ou d'acides aminés de l'invention. Une telle séquence peut être désignée séquence antisens. Une séquence antisens peut, par exemple, être transcrite dans une cellule cible en ARN complémentaires d'ARNm virales et bloquer ainsi leur traduction en protéine, selon la technique décrite dans EP 0 140 308. Alternativement, une séquence antisens peut être introduite en tant que telles dans les cellules cibles sous forme d'ARN. Une séquence d'acide nucléique antisens peut être un siRNA, un miRNA, un shRNA, une séquence hybride ou une séquence synthétique ou semi-synthétique.
Plus particulièrement, une séquence antisens peut être une séquence d'acides nucléiques ou oligonucléotide antisens (ODN), notamment un ODN synthétique comportant des modifications chimiques des acides nucléiques natifs. Un oligonucléotide antisens peut être synthétisé chimiquement par toute méthode connue dans le domaine. De préférence, un oligonucléotide modifié chimiquement peut être préparé à partir d'une structure phosphodiester native afin d'augmenter la stabilité intracellulaire et l'affinité de liaison. Une séquence antisens peut être produite par expression de tout ou partie d'une séquence d'acides nucléiques de l'invention dans un vecteur approprié, où l'initiation de la transcription est orientée de telle sorte qu'un brin antisens est produit comme molécule d'ARN. Une séquence antisens peut généralement comprendre au moins 7, en particulier au moins 12, plus particulièrement au moins environ 20 acides nucléiques, et pas plus de 500, en particulier pas plus d'environ 50, plus particulièrement pas plus d'environ 35 acides nucléiques. La longueur d'une séquence antisens est régi par différents paramètres connus de l'homme de métier, tel que l'efficacité de l'inhibition, la spécificité, et notamment l'absence de réactivité croisée, etc.
Une séquence d'acides aminés de l'invention consiste en une séquence d'acides aminés d'une protéine UL82 ou d'une protéine UL97 d'une souche de HCMV. De telles séquences sont connues et sont disponibles par exemple dans la base de données UniProt sous les référence F5HBC6 (UL82) ou Q5IV10 (UL97).
En particulier, une séquence d'acides aminés de l'invention peut consister en une séquence d'acides aminés codée par une séquence d'acides nucléiques telle que définie précédemment. Une séquence d'acides aminés d'une protéine UL82 peut consister en une séquence d'acides aminés SEQ ID NO 3, une séquence d'acides aminés présentant une identité de séquence d'au moins 90, de préférence d'au moins 95 %, et de préférence encore d'au moins 99 % avec SEQ ID NO 3 et une activité biologique analogue à SEQ ID NO 3, ou un fragment de SEQ ID NO 3 comprenant au moins 160 acides aminés consécutifs issus de SEQ ID NO 3 et une activité biologique analogue. De préférence, un fragment convenant à l'invention est issu de l'extrémité C-terminale, et peut consister en 160 acides aminés contigus consistant en la région s'étendant de l'acide aminé 421 à l'acide aminé 540. Sauf indication contraire, la numérotation des acides aminés de la protéine UL82 indiquée dans le texte est donnée par rapport à SEQ ID NO 3. Une séquence d'acides aminés isolée de l'invention, et en particulier une séquence d'une protéine UL82 ou un fragment de celle-ci, peut comprendre dans une région s'étendant de l'acide aminés 421 à l'acide aminé 540 au moins une mutation ponctuelle. Une mutation ponctuelle est une mutation ne touchant qu'un acide aminé, et peut consister en une délétion d'un acide aminé, une insertion d'un acide aminé ou une substitution d'un acide aminé.
De préférence une séquence d'acides aminés de l'invention comprend au moins une mutation ponctuelle choisie parmi une substitution ou une insertion. De préférence encore, une séquence d'acides aminés de l'invention, et en particulier une séquence d'une protéine UL82 ou un fragment de celle-ci, peut comprendre au moins deux mutations ponctuelles, et de préférence comprend au plus deux mutations ponctuelles. Ces mutations ponctuelles peuvent être deux substitutions ou une substitution et une insertion. Les mutations ponctuelles plus particulièrement considérées par l'invention peuvent consister en une insertion d'une glutamine après la position 424, une substitution d'une alanine par une glycine en position 507, une substitution d'une arginine par une proline en position 464, et/ou une substitution d'une proline par une thréonine en position 539. De préférence, lorsqu'une séquence de l'invention comprend au plus deux mutations ponctuelles, celles-ci peuvent consister en une insertion d'une glutamine après la position 424 (par rapport à SEQ ID NO 3) et une substitution d'une alanine par une glycine en position 507 (ou 508 en prenant en compte l'insertion, numérotation par exemple par rapport à SEQ ID NO 5). Selon un autre mode de réalisation préféré, lorsque d'une séquence de l'invention comprend au plus deux mutations ponctuelles, celles-ci peuvent consister en une substitution d'une arginine par une proline en position 464 et une substitution d'une proline par une thréonine en position 539. De préférence une séquence d'acides aminés de l'invention, d'une protéine UL82 ou d'un fragment de celle-ci, peut consister en une séquence d'acides aminés choisie parmi SEQ ID NO 4, SEQ ID NO 5, SEQ ID NO 6, ou SEQ ID NO 7, et de préférence encore choisie 10 parmi SEQ ID NO 5, SEQ ID NO 6 ou SEQ ID NO 7. De préférence encore, une séquence d'acides aminés de l'invention peut consister en une séquence d'acides aminés choisie parmi SEQ ID NO 6 ou SEQ ID NO 7. Une séquence d'acides aminés d'une protéine UL97 peut consister en une séquence d'acides aminés SEQ ID NO 8. 15 Une séquence d'acides aminés de l'invention peut être produite par toute méthode connue dans le domaine, comme par exemple, en cultivant une cellule hôte de l'invention dans des conditions permettant la synthèse de la séquence d'acides aminés, et l'isolement de cette séquence à partir des cellules cultivées et/ou du milieu de culture. L'isolement et la purification d'une séquence d'acides aminés peuvent être effectués par tout moyen conventionnel, telle 20 qu'une chromatographie préparative d'affinité ou une séparation immunologique. Une séquence d'acides aminés de l'invention comprend non seulement les séquences d'acides aminés produites par recombinaison mais également les séquences d'acides aminés isolées d'un échantillon biologique ou produites par synthèse. Les méthodes d'obtention de ces séquences sont connues dans le domaine, et ne nécessitent pas d'être détaillée dans la présente 25 description. Une identité de séquence de deux séquences d'acides nucléiques ou de deux séquences d'acides aminés peut être déterminée visuellement ou peut être déterminée par toutes méthodes généralement mises en oeuvre dans le domaine, telle que celle mettant en 30 oeuvre l'algorithme BLAST utilisé dans un logiciel disponible sur le site Pubmed (www.ncbi.nlm.nih.gov). Selon l'invention, une activité biologique analogue à une séquence d'acides aminés de l'invention se réfère à une activité oncogénique ou une capacité à induire la transformation de cellules primaires saines en cellules malignes. L'évaluation de la transformation de cellules primaires saines en cellules malignes peut notamment être effectuée comme détaillé dans les exemples ci-après, en particulier au moyen de l'essai en gel d'agar mou (soft agar). Selon l'invention, une activité biologique analogue à une séquence d'acides nucléiques de l'invention se réfère à l'aptitude d'une telle séquence à être traduite en une séquence d'acides aminés de l'invention. Une telle aptitude peut être évaluée par toute méthode connue de l'homme de l'art dans le domaine. Vecteur d'expression La présente invention concerne également un vecteur d'expression, notamment isolé, comprenant au moins une séquence d'acides nucléiques de l'invention. De préférence, un vecteur d'expression de l'invention peut comprendre une séquence d'acides nucléiques codant pour une séquence d'acides aminés consistant en une séquence choisie parmi SEQ ID NO 4, SEQ ID NO 5, SEQ ID NO 6, ou SEQ ID NO 7, de préférence choisie parmi SEQ ID NO 5, SEQ ID NO 6 ou SEQ ID NO 7, et de préférence encore choisie parmi SEQ ID NO 6 ou SEQ ID NO 7. Un vecteur d'expression convenant à l'invention peut être un plasmide, un cosmide, un virus, un bactériophage, et tout autre vecteur habituellement utilisé dans le domaine du génie génétique. Un vecteur approprié à l'invention peut notamment être choisi de manière non limitative parmi un au vecteur d'expression basé sur T7 pour l'expression dans une cellule de mammifères, et de un vecteur dérivé de baculovirus pour l'expression en cellules d'insectes. Comme autre exemple de vecteurs d'expression adaptés, on peut citer le plasmide pcDNA 3.3-TOPO TA ou le pcDNA3.1, et de préférence le pcDNA3.1. Une séquence d'acides nucléiques de l'invention est fonctionnellement liée à des éléments régulateurs dans un vecteur d'expression de l'invention, de sorte à permettre la transcription et la synthèse d'un ARNm, puis la traduction de ce dernier, dans des cellules procaryotes et/ou eucaryotes. Ainsi, un vecteur d'expression peut comprendre une cassette de transcription comprenant un élément d'initiation de la transcription, une séquence d'acide nucléique cible, et un élément de terminaison de la transcription. Une séquence d'acides nucléiques à transcrire peut être liée de manière opérationnelle à un promoteur tel que le promoteur T7, un promoteur métallothionéine I, ou un promoteur polyhédrine. Cellules hôtes La présente invention concerne également une cellule hôte recombinante, transitoire ou stable, notamment isolée, contenant une séquence d'acides nucléiques de l'invention ou un vecteur d'expression de l'invention. Une cellule hôte s'entend comme un organisme ayant incorporé une séquence d'acides nucléiques de l'invention, notamment in vitro et, le cas échéant apte à assurer la synthèse d'une séquence d'acides aminés codée par la séquence d'acides nucléiques. De préférence, une telle cellule peut être une cellule procaryote ou eucaryote, par exemple une cellule de mammifère, humain ou non-humain, une cellule bactérienne, une cellule d'insecte ou une cellule de levure. De préférence, une cellule hôte de l'invention peut comprendre une séquence d'acides nucléiques codant pour une séquence d'acides aminés consistant en une séquence choisie parmi SEQ ID NO 4, SEQ ID NO 5, SEQ ID NO 6, ou SEQ ID NO 7, de préférence choisie parmi SEQ ID NO 5, SEQ ID NO 6 ou SEQ ID NO 7, et de préférence encore choisie parmi SEQ ID NO 6 ou SEQ ID NO 7. Selon un mode de réalisation, un vecteur d'expression tel que défini précédemment peut être utilisé pour introduire une séquence d'acides nucléiques telle que définie précédemment. Les méthodes de transfection des cellules hôtes de l'invention sont celles habituellement mises en oeuvre dans le domaine. A titre d'exemples, on peut citer les méthodes de transfection à base de lipofectamine.
Anticorps La présente invention concerne également un anticorps qui se lie spécifiquement à une séquence d'acides aminés de l'invention. Un anticorps de l'invention peut reconnaître spécifiquement un épitope présent chez des souches de HCMV oncogéniques, telle que les souches DB ou AD169, mais non présent sur chez des souches de HCMV non-oncogéniques, telles que les souches TB40E ou TB40F. De préférence, un anticorps de l'invention peut se lier spécifiquement à une séquence d'acides aminés consistant en une séquence choisie parmi SEQ ID NO 4, SEQ ID NO 5, SEQ ID NO 6 ou SEQ ID NO 7, de préférence choisie parmi SEQ ID NO 5, SEQ ID NO 6 ou SEQ ID NO 7, et de préférence encore choisie parmi SEQ ID NO 6 ou SEQ ID NO 7. Le terme « anticorps » vise à désigner des anticorps polyclonaux, monoclonaux, des anticorps purifiés IgG, IgM, IgA, ou des fragments de de ceux-ci, tels que les fragments Fv, Fv monocaténaire (scFv), F(ab)2, Fab et F(ab)', et des anticorps chimériques ou humanisés.
Un anticorps de l'invention peut être un anticorps monoclonal ou peut désigner une préparation d'anticorps polyclonaux présentant différentes spécificités épitopiques. Dans un mode de réalisation préféré, les anticorps de l'invention sont des anticorps humains. Un anticorps de l'invention peut être préparé par mise en oeuvre d'un antigène contenant ou consistant en une séquence d'acides aminés de l'invention au moyen de toute méthode connue de l'homme de l'art, et notamment comme décrit par Harlow et Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, du Cold Spring Harbor, NY, 1988. Notamment, un anticorps de l'invention peut être obtenu par mise en oeuvre d'une séquence d'acides aminés de l'invention à titre d'immunogène. Une séquence d'acides aminés de l'invention utilisée à titre d'immunogène peut comprendre au moins 8 acides aminés consécutifs issus d'une séquence d'acides aminés définie précédemment. De préférence, une séquence immunogène de l'invention peut être issue d'une séquence SEQ ID NO 4, SEQ ID NO 5, SEQ ID NO 6 ou SEQ ID NO 7, et de préférence 15 encore choisie parmi SEQ ID NO 6 ou SEQ ID NO 7, et comprendre au moins une mutation ponctuelle telle que définie ci-dessus. Un immunogène peut être utilisé en l'état ou conjugué à une molécule porteuse, telle qu'une protéine porteuse. A titre d'exemple de protéines porteuses on peut citer la sérum albumine bovine (BSA), l'albumine de poule, l'hémocyanine de patelle (KLH), la toxine 20 tétanique. Médicament, vaccin et kit La présente invention concerne également la mise en oeuvre d'une séquence d'acides nucléiques ou d'acides aminés ou d'anticorps de l'invention dans un médicament ou 25 un vaccin ou un kit de diagnostic. De préférence, une séquence d'acides nucléiques ou d'acides aminés ou un anticorps plus particulièrement considérés peuvent être une séquence d'acides nucléiques codant pour une séquence d'acides aminés consistant en une séquence choisie parmi SEQ ID NO 4, SEQ ID NO 5, SEQ ID NO 6, ou SEQ ID NO 7, et de préférence encore choisie 30 parmi SEQ ID NO 6 ou SEQ ID NO 7, une séquence d'acides aminés consistant en une séquence choisie parmi SEQ ID NO 4, SEQ ID NO 5, SEQ ID NO 6 ou SEQ ID NO 7, et de préférence encore choisie parmi SEQ ID NO 6 ou SEQ ID NO 7, ou un anticorps se liant spécifiquement à une séquence d'acides aminés consistant en une séquence choisie parmi SEQ ID NO 4, SEQ ID NO 5, SEQ ID NO 6 ou SEQ ID NO 7, et de préférence encore choisie parmi SEQ ID NO 6 ou SEQ ID NO 7. Un médicament ou un vaccin de l'invention convient tout particulièrement pour prévenir et/ou traiter une carcinogénèse ou un cancer, de préférence un cancer induit par une 5 infection à HCMV oncogénique, et notamment une souche AD169 ou DB. Un cancer considéré par l'invention peut être choisi parmi un cancer du sein, de la tête et du cou, du foie, de l'ovaire, du pancréas, de la prostate, du rein, de la peau, du testicule, du poumon, du col de l'utérus, du cerveau, un médulloblastome, un glioblastome, et de préférence peut être un cancer du sein, du foie, de la prostate ou du cerveau, et de préférence 10 encore est un cancer du sein. Au sens de l'invention, par « traitement du cancer », on entend se référer à un traitement destiné à stabiliser, réduire, éliminer, prévenir et/ou guérir un cancer. Au sens de l'invention, le terme « prévenir » se réfère à la réduction d'un risque de survenue d'un événement. 15 L'évaluation de la stabilisation, réduction, guérison ou progression d'un cancer relève des connaissances générales de l'homme de l'art. En particulier, un vaccin de l'invention peut être destiné à induire une réponse immunitaire, chez un individu humain, et de préférence une femme, pour prévenir et/ou traiter une carcinogénèse ou un cancer induit par une infection par une souche de HCMV 20 oncogénique, et notamment une souche AD169 ou DB. Un vaccin de l'invention comprend une séquence d'acides nucléiques ou d'acides aminés de l'invention apte à induire une réponse immunitaire contre une souche de HCMV oncogénique. Un vaccin peut aussi être utile pour le traitement d'un individu, auquel cas il est appelé un vaccin thérapeutique. 25 Un médicament ou un vaccin de l'invention peuvent être formulés avec tout véhicules ou diluants pharmaceutiquement acceptables, et peuvent être préparés sous toute forme galénique convenant au mode d'administration adopté, telle qu'une forme solide, semisolide, liquide ou gaz, et notamment sous forme de comprimés, gélules, poudres, granulés, d'émulsions, suspensions , gels, de microsphères, etc. 30 Un médicament ou un vaccin de l'invention de l'invention peuvent être sous une forme galénique orale, telle qu'un comprimé, une capsule, une pilule, une poudre, des granulés, un élixir, une teinture, une solution, une suspension, un sirop ou une émulsion. Un médicament ou un vaccin de l'invention peuvent également être sous une forme galénique injectable. Les séquences d'acides nucléiques ou d'acides aminés peuvent être alors formulées en l'état ou formulés avec différents véhicules, comme des liposomes ou des polymères de transfection ou de délivrance intracellulaire. A titre de véhicule pharmaceutique acceptable, on peut citer, par exemple, l'eau, l'eau tamponnée, une solution saline à 0,4 %, ou 0,3 % de glycine, du sérum physiologique, du glycérol, de l'éthanol l'acide hyaluronique, des protéines, des polysaccharides, des acides polylactiques, les acides glycolique, des acides aminés, ou des particules virales inactives. Un vaccin de l'invention peut en particulier comprendre un adjuvant pour stimuler la réponse immunitaire. Un adjuvant convenant à l'invention peut être, par exemple, le squalène, l'hydroxyde aluminim (alun), la N-acétyl-muramyl-L-thréonyl-D-isoglutamine (thr10 MDP), la N-acétyl-normuramyl-Lalanyl -D-isoglutamine (ni-MDP), la 5 L-oxy-éthylamine (MTP-PE) et RIBI, qui contiennent des composants extraits de bactéries, le monophosphoryle lipide A, le tréhalose dimycolate, et des éléments de la paroi cellulaire de bactéries(MPL, TDM et SP) dans une émulsion à 2 % de squalène/Tween 80 émulsion, l'adjuvant complet de Freund (CFA) ou l'adjuvant incomplet de Freund (IFA). 15 Un médicament ou un vaccin de l'invention peuvent également comprendre des substances auxiliaires, tels que des agents mouillants ou émulsifiants, des substances tampon, des agents ajustant la tonicité ou le pH, des conservateurs, des agents antioxydants, etc. Un médicament ou un vaccin de l'invention peuvent être stérilisés par des techniques de stérilisation bien connues, ou peuvent être filtrés de manière stérile. Les 20 solutions aqueuses résultantes peuvent être utilisées en l'état, ou être lyophilisées. Une préparation lyophilisée peut ensuite être combinée avec une solution stérile avant administration. Un médicament ou un vaccin de l'invention comprennent des séquences d'acides nucléiques ou d'acides aminés nécessairement en une quantité efficace. 25 Une quantité efficace est une quantité de séquences d'acides nucléiques ou d'acides aminés qui seule, ou avec des doses supplémentaires cumulatives, peut entraîner la réponse souhaitée. Une quantité efficace peut dépendre de divers facteurs, tels que la voie d'administration, si l'administration est en doses uniques ou multiples, et les paramètres de chaque patient dont l'âge, la condition physique, la taille, le poids, le sexe, et le stade de la 30 maladie. Ces facteurs sont bien connus de l'homme de l'art et peuvent être traitées avec pas plus de l'expérimentation de routine. Un médicament ou un vaccin de l'invention peuvent être administrés par toute voie adéquate, telle que la voie orale, buccale, rectale, parentérale, intrapéritonéale, intradermique, transdermique, intra-trachéale, etc.
Un médicament ou un vaccin de l'invention peuvent de préférence être administrés par injection, telle qu'une voie intrapéritonéale, intradermique, sous cutanée ou intramusculaire intravasculaire, ou par voie muqueuse, ou une combinaison des deux. Toute voie muqueuse peut être utilisée, tels que la voie vaginale, la voie rectale, la voie respiratoire, ou la voie nasale. Un kit de l'invention peut comprendre l'ensemble des éléments et réactifs pour effectuer les différentes méthodes de détermination des séquences d'acides nucléiques et d'acides aminés de l'invention détaillées ci-après.
Un tel kit peut comprendre au moins une séquence d'acides nucléiques de l'invention, une amorce nucléotidique de l'invention, une sonde nucléotidique de l'invention, une séquence d'acides aminés de l'invention, et/ou un anticorps de l'invention. Utilisations et méthodes Les séquences d'acides nucléiques et d'acides aminés de l'invention conviennent tout particulièrement à une mise en oeuvre comme biomarqueur. Au sens de l'invention, le terme « biomarqueur » se réfère à une entité présente dans une cellule, un tissu ou un virus, qui peut être déterminée directement ou indirectement, par exemple par visualisation directe ou après isolement et marquage avec une sonde fluorescente ou radioactive, ou encore par une méthode de dosage, et qui est révélateur d'un processus physiologique, biochimique, morphologique ou phénotypique de la cellule, du tissu, ou du virus. Un biomarqueur peut être utilisé pour qualifier un état physiologique, biochimique morphologique ou phénotypique d'un tissu biologique ou d'un organisme, tel qu'un virus ou un mammifère, notamment un être humain. Un biomarqueur de l'invention est notamment isolé.
Les séquences d'acides nucléiques et d'acides aminés de l'invention conviennent tout particulièrement à une mise en oeuvre comme biomarqueur pour déterminer ou qualifier le caractère oncogénique ou non-oncogénique d'une souche de cytomégalovirus humain, ou pour déterminer un risque de carcinogénèse chez un individu en ayant besoin, ou pour déterminer un pronostic d'un cancer chez un individu atteint dudit cancer.
Un cancer considéré par l'invention peut être choisi parmi un cancer du sein, de la tête et du cou, du foie, de l'ovaire, du pancréas, de la prostate, du rein, de la peau du testicule, du poumon, du col de l'utérus, du cerveau, un médulloblastome, un glioblastome et de préférence peut être un cancer du sein, du foie, de la prostate ou du cerveau. De préférence encore, un cancer considéré dans l'invention est un cancer du sein.
Les méthodes de l'invention comprennent au moins les étapes de: a) déterminer, dans un échantillon biologique isolé, une présence ou un niveau d'expression ou une activité d'au moins une séquence d'acides nucléiques ou d'acides aminés de l'invention, et b) comparer la détermination de l'étape a) à une détermination contrôle. Au sens de l'invention, le terme « déterminer » se réfère à une évaluation qualitative et/ou une détection quantitative. Au sens de l'invention, les termes « détermination contrôle » ou « détermination de référence » se réfèrent à une détermination d'un paramètre dans des conditions négatives ou positives. Par exemple un contrôle négatif de l'invention peut être obtenu en utilisant une souche de HCMV non-oncogène, comme des souches TB40-E et TB40-F, ou une souche de HCMV inactivée par la chaleur, par exemple 100 °C pendant 10 min. Comme contrôle positif de l'invention on peut utilisant une souche de HCMV oncogène, comme les souches HCMV-DB et HCMV-AD169. Par exemple, en ce qui concerne la présence ou le niveau d'expression ou d'activité d'une séquence d'acides nucléiques ou d'acides aminés de l'invention, la détermination contrôle négative ou de référence négative peut être une valeur ou une plage de valeurs correspondant au degré de détection ou à un niveau d'expression ou d'activité déterminé dans un échantillon biologique présumé ne pas contenir de séquences d'acides nucléiques ou d'acides aminés de l'invention ou dans un échantillon biologique présumé issu de ou comprenant des cellules eucaryotes permissives infectées par une souche de HCMV non-oncogène. Une détermination contrôle positive ou de référence positive peut être une valeur ou une plage de valeurs correspondant au degré de détection ou à un niveau d'expression ou d'activité déterminé dans un échantillon biologique présumé contenir des séquences d'acides nucléiques ou d'acides aminés de l'invention ou dans un échantillon biologique issu de ou comprenant des cellules eucaryotes permissives infectées par une souche de HCMV non-oncogène Typiquement, pour une méthode de pronostic ou pour déterminer un risque de carcinogénèse, une détermination contrôle négative ou de référence négative peut être obtenue en déterminant la présence ou le niveau d'expression d'une séquence d'acides nucléiques ou d'acides aminés de l'invention dans un ensemble d'individus présumés ne pas avoir un cancer et/ou présumés ne pas être infectés par un HCMV oncogène, ou dans un tissu sain ou présumé sain et/ou présumé ne pas être infecté par un HCMV oncogène.
Selon le degré de déviation entre la valeur déterminée pour un individu à tester et la valeur de détermination contrôle négative ou de référence négative, un pronostic quant au caractère plus ou moins agressif du cancer affectant l'individu testé peut être établi, et, éventuellement, conduire à l'adoption d'une stratégie thérapeutique spécifique, ou un risque de carcinogénèse peut être établi. La détermination contrôle ou de référence n'est pas nécessairement effectuée simultanément avec la détermination chez l'individu à tester, elle peut être une détermination historique, effectuée antérieurement, et stockée sur un support adéquat, par exemple sur un serveur ou un disque dur, dans une base de données informatisée.
La détermination de la présence ou du niveau d'expression ou de l'activité d'une séquence d'acides aminés ou d'acides nucléiques de l'invention peut être réalisée dans un échantillon biologique. Un échantillon biologique peut être isolé et peut être obtenu à partir d'un individu présumé être affecté par un cancer, et notamment un cancer du sein ou du foie, ou à partir d'un individu présumé être affecté par une infection à cytomégalovirus humain, notamment oncogémque. Tel qu'utilisé ici, l'expression « échantillon biologique » vise à désigner tout prélèvement isolé, obtenu chez un individu, tel qu'un prélèvement d'un fluide corporel ou d'un tissu (par exemple, le sérum, le plasma, le sang, le liquide céphalorachidien, l'urine, le lait, un tissu mammaire), ou obtenu à partir de cellules en culture, et susceptible de contenir une séquence d'acides aminés ou d'acides nucléiques de l'invention. Un échantillon biologique peut être une biopsie réalisée à partir d'un tissu, de préférence comprenant une tumeur maligne. La détermination, dans un échantillon biologique isolé, d'une présence ou d'un niveau d'expression ou d'une activité d'au moins une séquence d'acides nucléiques ou d'acides aminés de l'invention, peut être effectuée par toute méthode de biologie cellulaire, de biochimie analytique ou de biologie moléculaire connue dans le domaine comme étant utile pour évaluer ou quantifier la présence ou l'absence, ou un niveau d'expression ou d'activité d'un constituant cellulaire comme une séquence d'acides nucléiques ou d'acides aminés. La détermination peut être effectuée directement dans un échantillon biologique ou après extraction d'une séquence d'acides nucléiques ou d'acides aminés d'intérêt à partir de 1' échantillon. Une augmentation importante des protéines du HCMV UL97 et UL82 (pp71) est observée dans des cellules eucaryotes permissives, par exemple des cellules HuMEC, infectées par des souches oncogènes HCMV-DB et HCMV-AD169. Au contraire cette augmentation n'est pas observée dans des cellules eucaryotes permissives infectées par des souches de HCMV non-oncogènes, par exemple TB40E et TB40F. Au-delà d'un certain seuil d'expression des deux protéines codées par les gènes UL97 et UL82, une souche de HCMV est caractérisé comme étant oncogénique comme cela est le cas pour les souches DB et AD169, et on peut appeler ces souches HCMV, souches à protéines UL82 élevée et/ou UL97 élevée. Au contraire sous ce seuil d'expression une souche de HCMV est caractérisée comme étant non-oncogénique, comme cela est le cas pour les souches TB40-E et TB40-F, et on peut appeler ces souches de HCMV, souches à protéines UL82 faible et/ou UL97 faible. La détermination du niveau d'expression des protéines UL97 et UL82 dans des cellules eucaryotes permissives infectées par un HCMV peut permettre la caractérisation de souches HCMV à pouvoir oncogénique élevé, faible ou nul et peut servir d'outil diagnostique, de prévention et de suivi d'individus infectés, notamment des individus présentant un cancer du sein, mais potentiellement également pour d'autres organes (ovaires, foie, cerveau...).
Par exemple, un niveau d'expression des protéines codées par les gènes UL97 et UL82, d'une souche de HCMV oncogénique peut être d'environ au moins 1,5 fois, notamment 2 fois, voire 3 fois, voire 5 fois, ou encore 10 fois, voire encore 20 fois ou plus, supérieure au niveau d'expression des protéines codées par les gènes UL97 et UL82, d'une souche de HCMV non-oncogémque.
La détermination d'une présence ou d'un niveau d'expression ou d'une activité d'au moins une séquence d'acides nucléiques ou d'acides aminés peut être effectuée par une méthode choisie parmi la spectrométrie de masse tels que la LC-MS, GC-MS, des séparations chromatographiques telles que les séparations sur gel un ou 2-D, des essais par liaison comme les immuno-essais ou l'hybridation, des essais enzymatique tels que l'ELISA ou des tests d'inhibition compétitive. Une détermination peut notamment être effectuée par une méthode choisie parmi le Western-blot, l'immuno-ELISA, la microscopie à fluorescence, la cytométrie de flux, le séquençage direct, l'électrophorèse sur gel, la chromatographie sur colonne, le transfert de Northern ou de Southern, par PCR, RT-PCR ou PCR quantitative. La détermination d'une présence ou d'un niveau d'expression ou d'une activité d'au moins une séquence d'acides nucléiques peut être effectuée par une méthode choisie parmi le séquençage direct, l'électrophorèse sur gel, chromatographie sur colonne, le transfert de Northern ou de Southern, la PCR, la RT-PCR ou la PCR quantitative. Pour être détectée, une séquence d'acides nucléiques peut être amplifiée par des techniques classiques, telles que la réaction en chaîne polymérase (PCR), la PCR nichée (nested PCR) ou de la transcriptase inverse PCR (RT-PCR) pour fournir une quantité suffisante pour l'analyse, puis soumise à une électrophorèse sur gel, et ensuite colorée avec un colorant spécifique pour acide nucléique. Alternativement, un marqueur détectable peut être inclus dans une réaction d'amplification. Un marqueur convenant à l'invention peut être choisi parmi des fluorochromes, tels que l'isothiocyanate de fluorescéine, la rhodamine ou Texas Red ®. Un marqueur peut être un système à deux entités présentant une affinité l'une pour l'autre. Par exemple, une séquence d'acides nucléiques amplifiée est conjuguée à la biotine présentant une haute affinité envers l'avidine qui peut être marquée par une entité détectable directement. Un marqueur peut être conjugué à une ou aux deux amorces. Alternativement encore, un mélange de nucléotides utilisés pour l'amplification peut être marqué de manière à incorporer un marqueur dans le produit d'amplification. Selon un autre mode de réalisation, une séquence d'acides nucléiques peut être détectée par toute méthode d'hybridation de la séquence cherchée avec une sonde d'acides nucléiques marquée avec un marqueur radio-isotopique, fluorescent ou enzymatique. Une méthode de détection d'hybrides formés entre une sonde d'acides nucléiques et une séquence d'acides nucléiques cherchée peut être une méthode dot-blot, une hybridation sandwich ou une hybridation inverse. La détermination d'une présence ou d'un niveau d'expression ou d'une activité d'au moins une séquence d'acides aminés peut être effectuée par une méthode choisie parmi le Western blot, l'immuno-ELISA, la microscopie à fluorescence, ou la cytométrie de flux. La détermination d'une présence ou d'un niveau d'expression ou d'une activité d'au moins une séquence d'acides aminés peut être basée sur les caractéristiques fonctionnelles ou antigéniques de la séquence.
Une détermination peut utiliser la coloration de cellules ou coupes histologiques, réalisées selon les méthodes conventionnelles. Alternativement, une détermination d'une présence ou d'un niveau d'expression ou d'une activité d'au moins une séquence d'acides aminés de l'invention peut inclure l'extraction d'une séquence à partir d'une cellule ou d'un échantillon de tissu, puis la liaison par une sonde marquée spécifique, par exemple un anticorps, et notamment un anticorps de l'invention, et la détection de la sonde. Le marqueur peut être un radio-isotope, un composé fluorescent, une enzyme, ou un substrat enzymatique.
Selon un mode de réalisation, une détermination d'une présence ou d'un niveau d'expression ou d'une activité d'au moins une séquence d'acides aminés de l'invention peut être effectuée par électrophorèse sur gel ou chromatographie sur colonne. Une détermination peut être effectuée par une méthode de type Western-blot comprenant une migration sur gel à une ou deux dimensions, puis éventuellement un transfert sur un buvard, et révélation de la séquence d'acides aminés avec une entité apte à se lier spécifiquement à celle-ci et à être détectée. Une détermination d'une présence ou d'un niveau d'expression ou d'une activité d'au moins une séquence d'acides aminés de l'invention peut être effectuée par des méthodes impliquant une liaison par affinité entre une entité, par exemple un anticorps, de préférence un anticorps de l'invention, et la séquence à détecter. L'entité peut être ajoutée à un échantillon biologique et laissée incuber pendant une période de temps suffisante pour permettre une liaison entre l'entité et la séquence d'acides aminés, par exemple au moins environ 10 minutes. L'entité peut être étiquetée avec un radio-isotope, une enzyme, une molécule fluorescente, une molécule chimioluminescente, ou tout autre marqueur convenant à une détection directe. Alternativement, une seconde entité présentant une affinité pour la première entité, par exemple un anticorps secondaire, peut être utilisée pour amplifier le signal. Ces réactifs sont bien connus dans le domaine. Par exemple, un anticorps primaire peut être conjugué à la biotine, et une avidine conjuguée à une peroxydase de raifort peut être ajoutée comme réactif de deuxième étape. La détection finale peut utiliser un substrat qui subit un changement de couleur en présence de la peroxydase. Un anticorps secondaire couplé à un marqueur fluorescent ou un radio-isotope peut également être utilisé. L'absence ou la présence ou la quantification de l'entité, primaire ou secondaire, marquée peut être ensuite effectuée par toute méthode connue dans le domaine, telle que la cytométrie en flux, la microscopie à fluorescence, la radiographie, le compteur à scintillation, etc. Egalement, une méthode de type sandwich classique, telle que l'ELISA, peut être utilisée. Une méthode de type sandwich comprend la liaison d'un premier anticorps, notamment un anticorps de l'invention, spécifique d'une séquence d'acides aminés de l'invention à un support insoluble. Puis l'incubation du support portant l'anticorps avec un échantillon présumé comprendre une séquence d'acides aminés de l'invention, et une étape d'incubation en présence d'un second anticorps, notamment un anticorps de l'invention, spécifique d'une séquence d'acides aminés de l'invention liée au premier anticorps. Les temps d'incubation doivent être suffisants pour permettre les liaisons recherchées, et peuvent varier, généralement, de 0,1 à 3 heures. Des étapes de lavages peuvent être prévues entre chaque étape d'incubation avec l'une des entités précitées. Le second anticorps peut porter un marqueur ., , permettant sa détection, comme un isotope radioactif, tel que l'iode (1251 121I) le carbone (14C), le soufre (35S), le tritium (3H), l'indium (112In ), un marqueur enzymatique, tel que la glucose oxydase, un marqueur fluorescent, comme la rhodamine, un marqueur d'affinité comme la biotine, ou des molécules chimioluminescentes. Dans certains modes de réalisation, une méthode de l'invention peut être adaptée pour une mise en oeuvre in vivo. Dans ces réalisations, une entité marqué de façon détectable et qui est un spécifique d'une séquence d'acides aminés de l'invention, par exemple un anticorps de l'invention, est administrée à un individu, par exemple par injection, et les cellules marquées sont situées en utilisant des techniques d'imagerie, telle que l'imagerie par résonance magnétique, la tomodensitométrie, etc. De manière préférée, la détermination d'une présence ou d'un niveau d'expression ou d'une activité d'au moins une séquence d'acides aminés peut être effectuée par détection de la séquence d'acides aminés ou d'un anticorps dirigé contre cette séquence d'acides aminés.
Une méthode préférée convenant à l'invention peut être un test ELISA mettant, par exemple, en oeuvre un anticorps lié à un support solide, par exemple, une plaque de microtitrage en polystyrène ou du papier de nitrocellulose. Un anticorps utilisé pour détecter séquence d'acides aminés de l'invention peut -r,) être anticorps de l'invention marqué par un isotope radioactif, comme l'iode (1251 121I le carbone u) le soufre (35S), le tritium (3H), l'indium (112In), un marqueur enzymatique, tel que la glucose oxydase, un marqueur fluorescent, comme la rhodamine, ou un marqueur d'affinité comme la biotine. Une méthode pour déterminer un caractère oncogénique d'une souche HCMV peut également être une méthode comprenant au moins les étapes consistant à : a- infecter des cellules eucaryotes permissives au HCMV au moyen d'une souche de HCMV à tester, b- cultiver les cellules infectées à l'étape a- dans une couche basale d'agar mou, c- déterminer la présence ou l'absence de colonies cellulaires en agar mou. Une méthode pour déterminer pour déterminer un risque de carcinogénèse chez un individu en ayant besoin, ou pour déterminer un pronostic d'un cancer chez un individu atteint dudit cancer peut être une méthode comprenant au moins les étapes consistant à : a- infecter des cellules eucaryotes permissives au HCMV au moyen d'une souche de HCMV isolée dudit individu, b- cultiver les cellules infectées à l'étape a- dans une couche basale d'agar mou, et c- déterminer la présence ou l'absence de colonies cellulaires en agar mou. La présence de colonies cellulaires déterminées à l'étape c- est indicative d'un risque de carcinogénèse. Des cellules eucaryotes permissives convenant à l'invention peuvent être des cellules HMEC. Les cellules peuvent être infectées avec une MOI (multiplicité d'infection - multiplicity of infection) de 1 à 10. A titre d'exemple de milieu d'agar mou (soft agar assay) on peut citer celui commercialier sous la référence CytoSelect 96-well cell transformation assay kit par CELL BIOLABSINC.
Les cellules déposées dans la couche cellulaire d'agar peuvent avoir un nombre compris entre 0,4 et 4 X 105 cellules/ml. Les cellules infectées peuvent être ajoutées dans la couche basale d'agar au jour 1 après, voire au jour 13, ou encore au jour 33. L'apparition de colonies cellulaires en agar mou peut être observée entre 6 et 8 jours après ensemencement. L'observation peut se faire en utilisant un microscope optique à lumière blanche à un grossissement de 10X à 40X. Comme contrôle négatif, peuvent être utilisées des cellules eucaryotes permissives, notamment HuMEC, infectées avec des souches HCMV non oncogènes, telles que les souches HCMV-TB40E et HCMV-TB40F, ou infectées par des souches de HCMV inactivées à 100 °C pendant 10 min. Comme contrôle positif, on peut utiliser des cellules infectées par des souches HCMV oncogéniques, telles que les souches HCMV-DB et HCMVAD169, ou des lignées cellulaires oncogéniques connues comme entraînant la formation de colonies en agar mou, telles que les lignées HeLa et MCF-7. Avantageusement, une méthode de l'invention peut en outre comprendre une étape de quantification de la prolifération cellulaire en agar mou. La prolifération cellulaire en agar mou en absence d'adhérence correspond à la transformation cellulaire. Une telle étape peut être effectuée en enlevant le milieu de culture qui se trouve à la surface de l'agar mou contenant les colonies cellulaires, puis solubilisation de l'agar pour récupérer les colonies cellulaires. Celles-ci peuvent être lysées et mises en contact avec un réactif, par exemple couplé à un fluorochrome, permettant de quantifier des cellules.
Une méthode l'invention permet de mettre en évidence la transformation des cellules épithéliales mammaires primaires par certaines souches de HCMV dites oncogéniques. Au contraire, des souches de HCMV ne transformant pas les cellules eucaryotes permissives sont considérées comme non-oncogéniques.
Une méthode de l'invention permet de cribler les souches de HCMV isolées d'un individu afin de déterminer si ces souches présentent un risque, par exemple élevé, faible ou nul, de carcinogénèse. Cette carcinogénèse peut être mammaire, mais peut également concerner d'autres organes, tels que les ovaires, le foie, ou le cerveau.
Un échantillon biologique permettant d'isoler ces souches peuvent être de tout type, notamment comme défini précédemment, et en particulièrement être du lait, des urines et du sang. Avantageusement, une méthode de l'invention peut constituer un outil de diagnostique, de prévention et de suivi d'individus infectés, notamment de patientes, et en particulier celles présentant un cancer du sein, mais potentiellement également pour un cancer affectant d'autres organes, telles que les ovaires, le foie, ou le cerveau. Une méthode pour déterminer un caractère oncogénique d'une souche HCMV peut également être une méthode comprenant au moins les étapes consistant à : a- infecter des cellules eucaryotes permissives au HCMV au moyen d'une souche 15 de HCMV à tester, b- déterminer l'expression génique des cellules infectées à l'étape a-, et c- comparer l'expression génique déterminée à l'étape b- avec l'expression génique de cellules mammaires cancéreuses de type basal/myoépithélial ou l'expression génique de cellules eucaryotes permissives au HCMV infectées par une souche de HCMV 20 oncogénique. Des cellules eucaryotes permissives peuvent être des cellules HuMEC. Les cellules mammaires cancéreuses de type basal/myoépithélial peuvent être, par exemple, des cellules MDA-MB-231, MDA-MB-468, MDA-MB-231, BT-20, HCC-1937, ou Hs578T. Une souche de HCMV oncogénique peut être HCMV-DB et HCMV-AD169. 25 L'expression génique des cellules peut être effectuée par toute méthode connue de l'homme de l'art, et en particulier par « Breast Cancer microArray » (BCA). Comme contrôle négatif, peuvent être utilisés des souches HCMV non oncogènes, telles que les souches HCMV-TB40E et HCMV-TB40F, ou des souches de HCMV inactivées à 100 °C pendant 10 min. Comme contrôle positif, on peut utiliser des souches HCMV-DB et 30 HCMV-AD169. Une expression génique des cellules infectées similaire à l'expression génique de cellules mammaires cancéreuses de type basal/myoépithélial ou de cellules infectées par une souche de HCMV oncogénique peut être indicatif du caractère oncogène de la souche de HCMV testée.
Selon un mode de réalisation la souche de HCMV peut être une souche HCMV isolée d'un individu souffrant d'un cancer, et en particulier d'un individu affecté d'un cancer du sein. Une souche de HCMV à tester peut être isolée du lait maternel, des urines, du sang ou de tout autre liquide biologique.
Une telle méthode peut également servir pour le pronostic, le diagnostic, la détermination d'un risque de carcinogénèse, la prévention ou le suivi d'individus infectés par une souche de HCMV, notamment d'individus présentant un cancer du sein, mais potentiellement également pour d'autres organes (ovaires, foie, cerveau...). Par ailleurs, cette approche permet de classer un individu chez qui la souche de HCMV a été isolée comme à risque ou non de cancer du sein et permet de suspecter le type de cancer du sein impliqué, les cancers de type basal-like étant de mauvais pronostic et nécessitant d'autant plus un dépistage précoce et un suivi rapproché. Une méthode pour déterminer un caractère oncogénique d'une souche HCMV peut également être une méthode comprenant au moins les étapes consistant à : a- infecter des cellules eucaryotes permissives au HCMV au moyen d'une souche de HCMV à tester et apte à exprimer BRCA1, et b- déterminer l'expression de BRCA1 dans les cellules infectées à l'étape a-, et c- comparer l'expression de BRCA1 déterminée à l'étape b- à une expression de BRCA1 déterminée dans des cellules eucaryotes permissives infectées par une souche de 20 HCMV oncogénique ou des cellules mammaires cancéreuses. Des cellules permissives peuvent être des cellules HuMEC. Une souche de HCMV oncogénique peut être choisie parmi HCMV-DB et HCMV-AD169. A titre de contrôle négatif on peut utiliser des cellules permissives infectées par une souche de HCMV non-oncogénique choisie parmi HCMV-TB40E et HCMV-TB40F, ou une souche de HCMV inactivées à 100 °C 25 pendant 10 min. Des cellules mammaires cancéreuses convenant à la méthode peuvent être telles que définies précédemment. La détermination de l'expression de la protéine BRCA1 dans des cellules eucaryotes permissives infectées par une souche HCMV peut permettre la détection de souches 30 HCMV à pouvoir oncogénique élevé, faible ou nul et peut servir pour le pronostic, le diagnostic, la détermination d'un risque de carcinogénèse, la prévention ou le suivi d'individus infectés par une souche de HCMV, notamment des individus présentant un cancer du sein, mais potentiellement également pour d'autres organes (ovaires, foie, cerveau...). Par ailleurs, cette approche peut permettre de classer l'individu chez qui la souche de HCMV a été isolée comme à risque ou non de cancer du sein (et potentiellement de l'ovaire) et peut permettre de suspecter un type de cancer du sein impliqué, les cancers de type basal-like étant de mauvais pronostic et nécessitant d'autant plus un dépistage précoce et un suivi rapproché.
DESCRIPTION DES FIGURES Figure 1 : Réplication des souches HCMV-DB et HCMV-AD169 dans les cellules HuMEC. Des cellules HuMEC sont infectées avec les souches HCMV-DB (Khan KA et al., Journal of Immunology 2009, 182: 7784-7794) ou la souche HCMV-AD169 (Murphy ED et al., PNAS 2003, 100: 14976-14981) à une « multiplicité d'infection » (multiplicity of infection = M.O.I.) de 1 ou 10 pendant une nuit, suivi d'un lavage intensif le lendemain avec du PBS et d'addition de milieu frais HuMEC et la réplication virale est suivie en fonction du temps par la mesure dans les surnageants de culture ou les lysats cellulaire de la charge virale HCMV en utilisant une technique de qPCR (Khan et al., 2009). Figure 2 : Observation d'un effet cytopathogène (ECP) typique d'une infection 15 par le HCMV (MOI = 10) au jour 29 après infection des cellules HuMEC par la souche HCMV-DB. Microscopie en lumière blanche X 10. Figure 3 : Formation de colonies en « agar mou » ensemencé au jour 1 après infection avec des cellules HuMEC infectées avec les souches HCMV-DB et HCMV-AD169, mais non avec des cellules HMEC infectées avec les souches HCMV-TB40E et HCMV- 20 TB4OF (MOI = 1). La transformation est détectée par la formation de colonies de taille variable dans le milieu d'agar mou en absence d'adhérence. Les contrôles négatifs sont représentés par des cellules HMEC non-infectées ou infectées avec du virus HCMV inactivé à 100 °C pendant 10 min (« heat-inactivated » ou hi virus). Les contrôles positifs sont représentés par deux lignées cellulaires oncogéniques connues comme entrainant la formation 25 de colonies en agar mou, les lignées HeLa et MCF-7. Figure 4 : Transformation en « soft agar » des cellules HuMEC infectées avec HCMV-DB et HCMV-AD169, mais non-transformation des cellules HMEC infectées par les souches HCMV-TB40E et HCMV-TB40F. Des cellules HMEC non-infectées et infectées sont ensemencées au jour 1 après infection. La transformation est quantifiée par la mesure de la 30 prolifération des cellules en « soft agar » en utilisant un test MTT et une mesure de la densité optique à 570 nm. Les cellules transformées MCF-7 servent de contrôle positif. Figure 5 : Etude de l'expression génique par « Breast Cancer microArray » (BCA) des cellules HuMEC non-infectées et infectées par les différentes souches de HCMV (à différentes MOI) et comparaison avec des cellules mammaires cancéreuses de type basal (MDA-MB-231) ou de type luminal (MCF-7). L'expression génique des cellules HuMEC infectées par les souches oncogènes HCMV-DB et HCMV-AD169, mais pas celle des souches non-oncogéniques HCMV-TB40E et HCMV-TB40F, est proche de celle des cellules épithéliales mammaires cancéreuses de type « basal-like » représentées par des cellules telles que les cellules MDA-MB-231 (mais également les cellules MDA-MB-468, MDA-MB-231, BT-20, HCC-1937, Hs578T, cette liste étant non-exhaustive) et non de celle des cellules épithéliales mammaires de type « luminal » représentées par les cellules MCF-7 (mais également les cellules BT-474, MDA-MB-453, T47D, ZR-75-1, cette liste étant non-exhaustive). Il est à noter que les HMEC infectées par les souches oncogènes HCMV-DB et HCMV-AD169 ont un profil triple négatif (négatif pour les récepteurs aux oestrogènes, pour les récepteurs à la progestérone et négatif pour HER2) qui est une des caractéristique des cancers du sein de type « basal-like ». Figure 6 : L'expression de la protéine anti-tumorale BRCA1 est diminuée dans les cellules HuMEC infectées avec les souches oncogènes HCMV-DB et HCMV-AD169, mais pas de manière significative dans les cellules HMEC infectées avec les souches non-oncogènes HCMV-TB40E et HCMV-TB40F. Il est à noter qu'une diminution de l'expression de BRCA1 et/ou une mutation de BRCA1 est observée de manière quasi-constante dans les cancers du sein de type « basal-like » qu'ils soient de type familial ou sporadique. Figure 7 : Une augmentation importante des protéines du HCMV UL97 et UL82 (pp71) est observée dans les cellules HuMEC infectées par les souches oncogènes HCMV-DB et HCMV-AD169. Au contraire cette augmentation n'est pas observée dans les cellules HMEC infectées par les souches de HCMV non-oncogènes TB40E et TB40F. Les protéines UL97 et UL82 ont été décrite comme inactivant la protéine antitumorale Rb (rétinoblasome) en la phosphorylant et en favorisant sa dégradation cellulaire dans le protéasome 26S. L'inactivation de la protéine Rb est également observée avec un autre virus oncogène tel le papillomavirus oncogène. Le niveau d'expression des protéines codées par ces deux gènes est plus élevé pour les souches oncogéniques que pour les souches nononcogéniques, comme ceci est montré dans cette figure. Figure 8 : Détection par PCR des gènes complets et de fragments internes amplifiés des gènes UL82 et UL97. Le panel du haut montre l'amplification par PCR simple du gène complet UL82 de ?pb dans les surnageants de cultures de cellules HMEC infectées par les souches de HCMV AD169 et DB (MOI = 10). Utilisant une PCR nichée un fragment interne spécifique de UL82 de 208 pb est amplifié à partir des mêmes surnageants. Le panel en bas à gauche montre l'amplification par PCR simple d'un fragment interne spécifique du gène UL97 de 312 pb dans les surnageants de cultures de cellules HMEC infectées par les souches de HCMV AD169, DB, TB40E, TB4OF (MOI = 10) ou non-infectées (Ctl -). Le gène entier UL97 de la souche HCMV DB de 2124 pb est amplifié par PCR simple. Figure 9 : Détection par PCR nichée du fragment interne de 208 pb du gène UL82 dans des extraits d'acides nucléiques de biopsies de cancer du sein provenant de 5 patientes (cf aussi Figure 10). Des extraits d'acides nucléiques ont été obtenus à partir du tissu tumoral (T) ou macroscopiquement sain adjacent à la zone tumorale (S) provenant de biopsies mammaires de 5 patientes ayant un cancer du sein. Une PCR nichée a été réalisée afin de détecter un fragment amplifié de 208 pb correspondant au gène UL82 ainsi que le gène beta-actine servant de contrôle interne. Dans 4 cas sur 5 le gène UL82 du HCMV a été mis en évidence soit uniquement dans les extraits de la zone tumorale (patientes 3 et 4), soit à la fois dans la zone tumorale et la zone macroscopiquement saine adjacente (patients 2 et 5). Figure 10 : Tableau récapitulant l'ensemble des données histologiques (type et grade), cellulaires (récepteurs aux oestrogènes, à la progestérone et à HER2) et de PCR nichée pour le gène UL82 de 5 patientes ayant un cancer du sein (cf figure 9). Figure 11 : Tableau récapitulant les différences en amino-acides de la protéine UL82 (pp71) entre les souches oncogènes (HCMV DB, AD169), non-oncogènes (TB40E et TB40F) ainsi qu'une souche HCMV isolée du lait maternel (MS) par rapport à la souche prototypique de référence HCMV Merlin. Il s'agit de substitutions d'acides aminés par rapport à la souche Merlin sauf pour la souche HCMV-DB pour laquelle on observe une insertion de glutamine (Glu) en position 424. Figure 12A, B & C : illustrations des séquences d'acides nucléiques et d'acides aminés considérés dans l'invention.
Les différents aspects de l'invention sont illustrés par les exemples ci-après, qui ne doivent en aucun cas être interprétés comme limitant la portée de celle-ci. EXEMPLES MATERIELS & METHODES Cultures cellulaires Les cellules HuMEC (cellules épithéliales mammaires primaires), MCF7, MDAMB-231 et HeLa ont été obtenues par l'ATCC. Les cellules ont été cultivées dans du milieu HuMEC.
Infection des cellules HuMEC par HCMV Un stock acellulaire de virus a été préparé par la propagation de deux souches de CMV (la souche de laboratoire AD169 et un isolat clinique HCMV-DB) dans des fibroblastes humains MRC5 comme décrit par Coaquette et al. (Clin Infect Dis, 2004;39:155-161) et Khan et al. (J Immunol, 2009;182:7784-7794). AD169 est une souche de HCMV de laboratoire, ayant subi de multiple passages, initialement isolée à partir des adénoïdes d'un enfant (Murphy et al., Proc Natl Acad Sci USA 2003;100:14976-14981). L'isolat clinique HCMV-DB a été isolé à partir d'un échantillon de prélèvement cervical d'une femme de 30 ans, enceinte (Khan et al., J Immunol 2009;182:7784-7794). La souche de HCMV TB40-E a un tropisme pour les cellules endothéliales ainsi que pour les macrophages. La souche TB40-F est dérivée en laboratoire de la souche TB40E après de nombreux passages de cette dernière en culture de cellules fibroblastiques. Les fibroblastes humains MRC5 ont été cultivées dans du MEM avec 10 % de Sérum de Veau Foetal (SVF), de la pénicilline (100 UT/mi) et de la streptomycine (100 mg/m1). Les cellules en monocouche à confluence ont été infectées avec un isolat viral, et les virus ont été recueillis lorsque les effets cytopathiques ont touchés plus de 90 % des cellules. Les surnageants ont été récupérés et clarifiés par centrifugation, puis stockés à moins 80 °C jusqu'à utilisation. Les cellules HuMEC, MCF7 et HeLa ont été infectées à différentes multiplicité d'infection (MOI : Multiplicity of Infection) pendant 2 heures à 37 ° C, puis soigneusement rincées, et recouvertes par du milieu frais.
Les titres de virus ont été déterminés par essai de formation de plaques dans des fibroblastes humains MRC5 comme décrit par Arrode et al. (J Virol, 2002;76:142-150). Prolifération des cellules Pour les tests de prolifération cellulaire, les cellules HuMEC, MCF7 et HeLa ont été laissées non infectées ou sont infectées par une souche de CMV. La prolifération a été mesurée en utilisant le kit de test de prolifération cellulaire MTT (Cayman Chemical # cat 10009365) et la mesure de l'antigène intracellulaire Ki67 Ag par cytométrie en flux, comme décrit par (Sharma et al., Hepatology, 2010;52:1713-1722).
Culture en gel d'agar mou (soft agar) Des cellules HuMEC sont infectées par le HCMV et au jour 1 après l'infection les cellules sont ensemencées dans un milieu d'agar mou (soft agar assay) (CytoSelect 96-well cell transformation assay kit, CELL BIOLABSINC). La préparation d'une couche basale d'agar se fait selon les recommandations du fabriquant. De la même manière, la couche cellulaire d' agar contenant les cellules HMEC infectées par le HCMV, les cellules HuMEC non-infectées ou les cellules de lignée HeLa et MCF-7 est réalisée selon les recommandations du fabriquant. Les cellules déposées dans la couche cellulaire d'agar ont un nombre compris entre 0,4 et 4 X 105 cellules/ml. Les cellules HuMEC infectées par le HCMV (habituellement une MOI de 1 à 10 est utilisée) sont ajoutées dans la couche basale d'agar au jour 1 après infection, ou selon les cas en ensemençant des cellules HuMEC infectées depuis 13 jours ou depuis 33 jours. L'apparition des colonies en agar mou est habituellement observée entre 6 et 8 jours après ensemencement en utilisant un microscope optique à lumière blanche à un grossissement de 10X à 40X. La quantification de la prolifération cellulaire en agar mou en absence d'adhérence (ce qui correspond à la transformation cellulaire) est ensuite effectuée en enlevant le milieu de culture qui se trouve à la surface de l'agar mou contenant les colonies cellulaires, suivi d'une solubilisation de l'agar qui permet de récupérer les colonies cellulaires. Celles-ci ont été ensuite lysées et mises en contact avec un réactif couplé à un fluorochrome permettant de quantifier les cellules qui ont proliférées en agar mou avec l'aide d'un fluoromètre à une longueur d'onde de 485/520 nm, comme indiqué ci-dessus. Ces résultats sont représentés sous forme d'histogramme (OD). Amplification du gène UL82 par PCR nichée L'ADN total a été extrait et purifié en utilisant un kit QIAamp (Qiagen, Valencia, CA) en suivant les recommandations du fabriquant. Les lysats cellulaires de biopsie du sein ont été mélangés avec 300 pl de protéinase K (0.2 mg/ml) dans un tampon composé de100 mM NaC1, 10 mM Tris-Cl, 25 mM EDTA, et 0.5 % SDS (pH 8.0). Après une incubation à 55 °C pendant 3 heures, l'ADN a été extrait deux fois dans un mélange phénol/chloroforme (vol/vol) et ensuite précipité dans de l'éthanol. L'ADN a été dissous dans 20 pl de tampon TE (10 mM Tris, 1 mM EDTA). Pour l'extraction de l'ADN des surnageants de culture de cellules (HuMECs ou MRC5) infectées avec différentes souches de HCMV, 200 pl de surnageant a été récupéré et l'ADN a été extrait en utilisant le kit "QIAamp DNA mini column" selon les instructions du fabriquant.
La première PCR a été réalisée à partir d'un volume de 50 pl contenant 1,5 pl de chacune des amorces externes (10 mM), 2 U de Taq DNA polymérase, et 200ng d'extrait d'ADN à tester. Les amorces externes UL82 utilisées sont les suivantes: * Amorces externes UL82 5'-TAGATGCGGGGTCGACTGCGT-3' (SEQ ID NO 9) 5'-TCAGGCATCGTCCTCGCCCGG-3' (SEQ ID NO 10) Après une dénaturation initiale à 94 °C pendant 5 min, 35 cycles d'amplification de l'ADN ont été réalisés (94 °C pendant 1 min, 60 °C pendant 1 min, 72 °C pendant 1,5 min), suivis d'une extension terminale à 72 °C pendant 5 min.
Ensuite, 10 pl du produit amplifié lors de la première PCR a été soumis à une deuxième PCR pendant 35 cycles dans 50 pl de mélange, contenant 1 pl (10 mM) de chacune des amorces internes UL82 et 1 U de Taq polymérase. Pendant cette deuxième PCR, la durée d'extension a été de 45 sec. Les amorces internes UL82 utilisées ont été les suivantes: * Amorces internes UL82 5' - CGAAAGCATTCTGGATCTGC-3' (SEQ ID NO 11) 5' - TTTCTGCATCACGACTCACC-3' (SEQ ID NO 12) Après cette seconde amplification, 35 pl du produit de PCR a été soumis à électrophorèse dans un gel de 1,5 % d' agarose, marqué au bromure d' éthidium et visualiser sous lumière UV. Un résultat a été considéré positif lorsque l'échantillon testé et un contrôle positif montrent un fragment amplifié de 208 pb. Les fragments amplifiés de 208 pb ont été séquences et n'ont pas montré de différence entre les souches HCMV DB, AD169, TB40E, TB4OF et la souche prototypique HCMV Merlin lorsque la banque de données de séquences NCBI a été utilisée. Amplification du gène complet UL82 par PCR Le gène entier UL82 a été amplifié par PCR en utilisant les amorces suivantes: Amorce sens : 5'-CGGGATCCATGTCTCAGGCATCGTCCTCG-3' (SEQ ID NO Amorce antisens: 5'-CGGAATTCCTAGATGCGGGGTCGACTGC-3' (SEQ ID NO 14) avec des sites de restriction BamH1 et ECoR1 présents respectivement, afin d'amplifier un fragment de 1680 pb. La PCR a été réalisée comme suit. Après une dénaturation initiale à 94 °C pendant 2 min, 35 cycles d'amplification ont été réalisés à 94 °C pendant 30 sec, 60 °C pendant 30 sec, 68 °C pendant 1,5 min, dans un mélange de 50 pl, contenant 20 (10 mIVI) de chacune des amorces et 1 U de Platinum Taq DNA polymérase (Invitrogen USA).
Amplification du gène UL97 par PCR nichée La première PCR a été réalisée à partir d'un volume de 50 ul contenant 2 ul de chacune des amorces externes (10 mIVI), 1 U de Taq DNA polymérase, et 200 ng d'extrait d'ADN à tester. Les amorces externes UL97 utilisées sont les suivantes: * Amorces externes UL97 Amorce sens : 5'- CCAAGCTTATGTCCTCCGCACTTCGGTCT -3' (SEQ ID NO 15) Amorce antisens: 5'- GCGAATTCTTACTCGGGGAACAGTTGACG -3' (SEQ ID NO 16) Après une dénaturation initiale à 94 °C pendant 2 min, 35 cycles d'amplification de l'ADN ont été réalisés (94 °C pendant 30 sec, 60 °C pendant 45 sec, 68 °C pendant 2 min), suivis d'une extension terminale à 68 °C pendant 5 min.
Ensuite, 10 ul du produit amplifié lors de la première PCR ont été soumis à une deuxième PCR pendant 35 cycles dans 50 ul de mélange, contenant 1 ul (10 mIVI) de chacune des amorces internes UL97 et 1 U de Taq polymérase. Pendant cette deuxième PCR, la durée d'extension a été de 1 min. Les amorces internes UL97 utilisées sont les suivantes: * Amorces internes UL97 5' - TCTACGTGCCCAAAGAGGACGATT -3' (SEQ ID NO 17), 5' - TGTGGAAACGTCGATGTACCGTGA -3' (SEQ ID NO 18) Après cette seconde amplification, 35 ul du produit de PCR a été soumis à électrophorèse dans un gel de 1,5 % d'agarose, marqué au bromure d'éthidium et visualisé 13) sous lumière UV. Un résultat a été considéré positif lorsque l'échantillon testé et un contrôle positif montrent un fragment amplifié de 312 pb. Amplification du gène complet UL97 par PCR Le gène complet UL97 a été amplifié par PCR en utilisant les amorces suivantes: Amorce sens : 5'- CCAAGCTTATGTCCTCCGCACTTCGGTCT -3' (SEQ ID NO 19) Amorce antisens: 5'- GCGAATTCTTACTCGGGGAACAGTTGACG -3' (SEQ ID NO 20) Avec des sites de restriction Hind III et EcoR1 présents respectivement, afin d'amplifier un fragment de 2124 pb. La PCR a été réalisée comme suit. Après une dénaturation initiale à 94 °C pendant 2 min, 35 cycles d'amplification ont été réalisés à 94 °C pendant 30 sec, 60 °C pendant 45 sec, 68 °C pendant 2 min, dans un mélange de 50 pl, contenant 2 pl (10 mM) de chacune des 15 amorces et 1 U de Platinum Taq DNA polymérase (Invitrogen USA). Exemple 1 Cinétique de croissance du HCMV dans les cellules épithéliales mammaires primaires HuMEC 20 Des cellules HuMEC sont amenées à confluence dans des flacons T25 ou T75 dans du milieu de culture HuMEC. Ces cellules confluentes sont ensuite infectées avec la souche HCMV-DB (Khan KA et al. Journal of Immunology 2009, 182 : 7784-7794) et la souche HCMV-AD169 (Murphy ED et al., PNAS 2003, 100: 14976-14981) à une « multiplicité d'infection » (multiplicity of infection = M.O.I.) de 1 ou 10 pendant une nuit, 25 suivi d'un lavage intensif le lendemain avec du PBS et d'addition de milieu frais HuMEC. La réplication virale est ensuite suivie en fonction du temps par la mesure dans les surnageants de cultures et les lysats cellulaires de la charge virale HCMV en utilisant une technique de PCR quantitative (qPCR) (Khan2009). Les résultats obtenus présentés en Figure 1 montrent que les cellules épithéliales 30 mammaires humaines sont permissives au HCMV et permettent la réplication du HCMV pendant plusieurs jours in vitro. Les résultats obtenus montrent également que de nouvelles particules virales HCMV sont produites dans le milieu extracellulaire suite à l'infection des HMEC. Enfin, l'ADN du HCMV est détecté directement dans les lysats de cellules HMEC indiquant que le HCMV pénètre bien dans ces cellules et les infecte de manière productive.
Cette mise en évidence de l'infection des cellules HMEC par le HCMV permet avantageusement d'utiliser ces cellules infectées par le HCMV comme contrôle positif pour la détection de cellules mammaires épithéliales humaines infectées par le HCMV ou contenant des protéines et/ou des acides nucléiques du HCMV provenant de patientes présentant une pathologie mammaire potentiellement liée au HCMV. Exemple 2 Mise en évidence d'un effet cytopathogène (ECP) typique d'une infection par le HCMV dans les cellules épithéliales mammaires primaires HuMEC.
Des cellules HuMEC sont amenées à confluence dans des flacons T25 ou T75 dans du milieu de culture HuMEC. Ces cellules confluentes sont ensuite infectées avec la souche HCMV-DB (Khan KA et al. Journal of Immunology 2009, 182: 7784-7794) à une « multiplicité d'infection » (multiplicity of infection = M.O.I.) de 10 pendant une nuit, suivi d'un lavage intensif le lendemain avec du PBS et d'addition de milieu frais HuMEC.
L'observation d'un effet cytopathogène (ECP) typique d'une infection par le HCMV (MOI = 10) après infection des cellules HuMEC par la souche HCMV-DB, mais également avec d'autres souches de HCMV, au bout de quelques jours à quelques semaines est réalisée par une observation au microscope optique en lumière blanche à un grossissement de 10X à 40X. Les résultats obtenus présentés en Figure 2 mettent en évidence une réplication 20 active du HCMV dans les cellules mammaires primaires HMEC avec apparition d'un ECP typique du HCMV constitué de foyers de cellules augmentées de volumes et réfringentes, foyers à extension lente dans le milieu de culture. Exemple 3 25 Transformation et prolifération en absence d'adhérence des cellules épithéliales mammaires primaires HuMEC infectées par le HCMV. Le test en agar mou permet de tester directement l'induction de l'oncogenèse des cellules mammaires primaires humaines HuMEC après une exposition de HCMV. La formation de colonies cellulaires en en gel d'agar mou est un test de croissance indépendant de 30 l'ancrage, et est considéré comme le test le plus rigoureux pour détecter la transformation maligne des cellules. Des cellules HuMEC sont infectées par le HCMV et au jour 1 après l'infection les cellules sont ensemencées dans un milieu d'agar mou (soft agar assay) (CytoSelect 96-well cell transformation assay kit, CELL BIOLABSINC).
La préparation d'une couche basale d'agar se fait selon les recommandations du fabriquant. De la même manière, la couche cellulaire d' agar contenant les cellules HMEC infectées par le HCMV, les cellules HMEC non-infectées ou les cellules de lignée HeLa et MCF-7 est réalisée selon les recommandations du fabriquant. Les cellules déposées dans la couche cellulaire d'agar ont un nombre compris entre 0,4 et 4 X 105 cellules/ml. Les cellules HMEC infectées par le HCMV (habituellement une MOI de 1 à 10 est utilisée) sont ajoutées habituellement dans la couche basale d'agar au jour 1 après infection. L'apparition des colonies en agar mou est habituellement observée entre 6 et 8 jours après ensemencement en utilisant un microscope optique à lumière blanche à un grossissement de 10X à 40X. La formation de colonies en « agar mou » est observée avec des cellules HMEC infectées avec les souches HCMV-DB et HCMV-AD169, mais non avec des cellules HMEC infectées avec les souches HCMV-TB40E et HCMV-TB4OF (MOI = 1). La transformation est détectée par la formation de colonies de taille variable dans le milieu d'agar mou en absence d'adhérence. Les contrôles négatifs sont représentés par des cellules HMEC non-infectées ou infectées avec du virus HCMV inactivé à 100 °C pendant 10 min (« heat-inactivated » ou hi virus). Les contrôles positifs sont représentés par deux lignées cellulaires oncogéniques connues comme entrainant la formation de colonies en agar mou, les lignées HeLa et MCF-7. La quantification de la prolifération cellulaire en agar mou en absence d'adhérence (ce qui correspond à la transformation cellulaire) est ensuite effectuée en enlevant le milieu de culture qui se trouve à la surface de l'agar mou contenant les colonies cellulaires, suivi d'une solubilisation de l'agar qui permet de récupérer les colonies cellulaires. Celles-ci vont ensuite être lysées et un réactif couplé à un fluorochrome permet de quantification des cellules qui ont proliférées en agar mou avec l'aide d'un fluoromètre à une longueur d'onde de 485/520 nm. Ces résultats sont représentés sous forme d'histogramme (OD).
Les résultats obtenus présentés en Figure 3 mettent en évidence la transformation des cellules épithéliales mammaires primaires par certaines souches de HCMV dites oncogéniques. Au contraire, des souches de HCMV ne transformant pas les cellules HuMEC sont considérées comme non-oncogéniques. Au jour 1 post-infection des cellules HuMEC avec une souche d'HCMV (AD169, DB, TB40-F, ou TB40-E), les cellules ont été cultivées dans un gel d'agarose mou pendant 21 Jours. En parallèle, des contrôles appropriés (HuMEC non infectées Figure 3A, HuMEC infectées par HCMV inactivées par la chaleur, Figure 3B Heat-in, comme contrôles négatifs ; MCF7 et HeLa comme contrôles positifs, Figure 3C) ont été effectués.
Au jour 7 (au jour 8 post-infection) a été observée la formation de colonies en gel d'agar mou ensemencé avec des HuMEC infectés par les souches DB souches et AD169 (Figure 3B). En revanche aucune colonies n'a été observée en gel d'agar mou ensemencé avec des HuMEC infectés par les souches TB40-E et TB40-F (Figure 3D).
Ces résultats indiquent que la transformation cellulaire in vitro associée à la perte de l'inhibition de contact et de l'indépendance d'ancrage se produit dans des cellules mammaires primaires humaines infectées par HCMV DB ou HCMV AD169. Cette mise en évidence de souches oncogéniques ainsi que non-oncogéniques de HCMV sur des cellules HMEC permet de cribler les souches de HCMV isolées de patientes afin de déterminer si ces souches présentent un risque élevé, faible ou nul de carcinogénèse essentiellement mammaire, mais potentiellement également pour d'autres organes (ovaires, foie, cerveau...). Les liquides biologiques permettant d'isoler ces souches seront de tout type et plus particulièrement le lait, les urines et le sang. Ces résultats indiquent que l'utilisation de la technique d'agar mou pour la détection de souches HCMV à pouvoir oncogénique élevé, faible ou nul peut servir d'outil diagnostique, de prévention et de suivi des patientes infectées, notamment celles présentant un cancer du sein, mais potentiellement également pour d'autres organes (ovaires, foie, cerveau...).
Exemple 4 Etude de l'expression génique par « Breast Cancer microArray » (BCA) des cellules HuMEC infectées par les différentes souches de HCMV indique que le HCMV induit essentiellement une transformation des cellules épithéliales mammaires primaires HuMEC en un type « basal-like ».
L'étude de l'expression génique par « Breast Cancer microArray » (BCA) des cellules HuMEC non-infectées et infectées par les différentes souches de HCMV (à différentes MOI) a été réalisée et la comparaison est effectuée avec des cellules mammaires cancéreuses de type basal/myoépithélial (MDA-MB-231) ou de type luminal (MCF-7). L'expression génique des cellules HuMEC infectées par les souches oncogènes HCMV-DB et HCMV- AD169, mais pas celle des cellules infectées par des souches non-oncogéniques HCMV- TB40E et HCMV-TB40F, est proche de celle des cellules épithéliales mammaires cancéreuses de type « basal-like » représentées par des cellules telles que les cellules MDA-MB-231 (mais également les cellules MDA-MB-468, MDA-MB-231, BT-20, HCC-1937, Hs578T, cette liste étant non-exhaustive), et non de celle des cellules épithéliales mammaires de type « luminal » représentées par les cellules MCF-7 (mais également les cellules BT-474, MDA-MB-453, T47D, ZR-75-1, cette liste étant non-exhaustive). Il est à noter que les HuMEC infectées par les souches oncogènes HCMV-DB et HCMV-AD169 ont un profil triple négatif (négatif pour les récepteurs aux oestrogènes, pour les récepteurs à la progestérone et négatif pour HER2) qui est une des caractéristique des cancers du sein de type « basal-like ». Ces résultats (Figure 5) indiquent qu'en infectant des cellules épithéliales mammaires primaires par une souche HCMV isolée d'une patiente et lorsque le lysat de ces cellules infectées est testé par un microarray ciblant les gènes modulés dans le cancer du sein (BCA), ont pourra déterminer si cette souche a potentiellement un risque oncogénique ou non.
La souche HCMV pourra être isolée du lait maternel, des urines, du sang ou de tout autre liquide biologique. D'autre part, ces résultats indiquent que l'utilisation de la technique du microarray pour la détection de souches HCMV à pouvoir oncogénique élevé, faible ou nul peut servir d'outil diagnostique, de prévention et de suivi des patientes infectées, notamment celles présentant un cancer du sein, mais potentiellement également pour d'autres organes (ovaires, foie, cerveau...). Par ailleurs, cette approche permet de classer la patiente chez laquelle la souche de HCMV a été isolée comme à risque ou non de cancer du sein et permet de suspecter le type de cancer du sein impliqué, les cancers de type basal-like étant de mauvais pronostic et nécessitant d'autant plus un dépistage précoce et un suivi rapproché.
Exemple 5 Etude de l'expression de la protéine BRCA1 dans les cellules HuMEC infectées par différentes souches de HCMV. Des cellules HuMEC sont infectées par des souches de HCMV oncogéniques, 25 HCMV-DB et HCMV-AD169, ou des souches de HCMV non-oncogéniques HCMV-TB40E et HCMV-TB40F, puis l'expression de BRCA1 est déterminée. L'expression de cette protéine est très diminuée dans les cellules HuMEC infectées par des souches de HCMV oncogéniques, au contraire des cellules infectées par des souches de HCMV non-oncogéniques. Cette diminution de l'expression de la protéine BRCA1 30 traduit également le fait que les souches oncogéniques de HCMV induisent essentiellement une transformation des cellules épithéliales mammaires primaires HMEC en un type « basallike ». L'expression de la protéine anti-tumorale BRCA1 est diminuée dans les cellules HMEC infectées avec les souches oncogènes HCMV-DB et HCMV-AD169, mais pas de manière significative dans les cellules HMEC infectées avec les souches non-oncogènes HCMV-TB40E et HCMV-TB40F. Il est à noter qu'une diminution de l'expression de BRCA1 et/ou une mutation de BRCA1 est observée de manière quasi-constante dans les cancers du sein de type « basal-like » qu'ils soient de type familial ou sporadique.
Ces résultats (Figure 6) indiquent que la mesure de l'expression de la protéine BRCA1 dans les cellules HuMEC infectées par une souche HCMV peut permettre la détection de souches HCMV à pouvoir oncogénique élevé, faible ou nul et pourra servir d'outil diagnostique, de prévention et de suivi des patientes infectées, notamment celles présentant un cancer du sein, mais potentiellement également pour d'autres organes (ovaires, foie, cerveau...). Par ailleurs, cette approche permettra de classer la patiente chez laquelle la souche de HCMV a été isolée comme à risque ou non de cancer du sein (et potentiellement de l'ovaire) et permettra de suspecter le type de cancer du sein impliqué, les cancers de type basal-like étant de mauvais pronostic et nécessitant d'autant plus un dépistage précoce et un suivi rapproché.
Exemple 6 L'expression des protéines du HCMV UL97 et UL82 permet de discriminer entre souche HCMV oncogénique et non-oncogéniques. Une augmentation importante des protéines du HCMV UL97 et UL82 (pp71) est 20 observée dans les cellules HuMEC infectées par les souches oncogènes HCMV-DB et HCMVAD169. Au contraire cette augmentation n'est pas observée dans les cellules HuMEC infectées par les souches de HCMV non-oncogènes TB40E et TB40F. Les protéines UL97 et UL82 ont été décrites comme inactivant la protéine antitumorale Rb (rétinoblasome) en la phosphorylant et en favorisant sa dégradation cellulaire 25 dans le protéasome 26S. L'inactivation de la protéine Rb est également observée avec un autre virus oncogène tel le papillomavirus oncogène. Ces résultats (Figure 7) indiquent que au-delà d'un certain seuil d'expression des deux protéines codées par les gènes UL97 et UL82, le HCMV serait oncogénique comme cela est le cas pour les souches DB et AD169, et on peut appeler ces souches HCMV, souches à 30 protéines UL82 élevée et/ou UL97 élevée. Au contraire sous ce seuil d'expression le HCMV ne serait pas oncogénique comme cela est le cas pour les souches TB40-E et TB40-F, et on pourrait appeler ces souches de HCMV, souches à protéines UL82 faible et/ou UL97 faible. Ces résultats indiquent également que le niveau d'expression des protéines UL97 et UL82 dans les cellules HMEC infectées par le HCMV peut permettre la détection de souches HCMV à pouvoir oncogénique élevé, faible ou nul et peut servir d'outil diagnostique, de prévention et de suivi des patientes infectées, notamment celles présentant un cancer du sein, mais potentiellement également pour d'autres organes (ovaires, foie, cerveau...).
Exemple 8 Détection par PCR des gènes complets et de fragments internes amplifiés des gènes UL82 et UL97 du HCMV. Des séquences issues des gènes UL82 et UL97 ont été identifiées permettant d'amplifier la totalité de ces gènes et/ou une séquence interne de ces gènes. Comme le montre la Figure 8, le panel du haut montre l'amplification par PCR simple du gène complet UL82 de 1680 pb dans les surnageants de cultures de cellules HMEC infectées par les souches de HCMV AD169 et DB (MOI = 10). Utilisant une PCR nichée un fragment interne spécifique de UL82 de 208 pb est amplifié à partir des mêmes surnageants. Le panel en bas à gauche montre l'amplification par PCR simple d'un fragment interne spécifique du gène UL97 de 312 pb dans les surnageants de cultures de cellules HMEC infectées par les souches de HCMV AD169, DB, TB40E, TB4OF (MOI = 10) ou non-infectées (Ctl -). Le gène entier UL97 de la souche HCMV DB de 2124 pb est amplifié par PCR simple. Ces résultats indiquent que des séquences d'acides nucléiques permettant d'amplifier les gènes UL97 et UL82 de souches oncogéniques et non-oncogéniques ont été identifiées. Par ailleurs, ces résultats indiquent qu'à partir des ces séquences des outils diagnostiques, de prévention, thérapeutique et vaccinal peuvent être mis en oeuvre. Exemple 9 Détection par PCR du gène UL82 du HCMV dans des biopsies de cancer du sein.
Comme l'indique la Figure 9, la détection par PCR nichée du fragment interne de 208 pb du gène UL82 dans des extraits d'acides nucléiques de biopsies de cancer du sein provenant de 5 patientes (cf aussi Figure 10) a été réalisée. Des extraits d'acides nucléiques ont été obtenus à partir du tissu tumoral (T) ou macroscopiquement sain adjacent à la zone tumorale (S) provenant de biopsies mammaires de 5 patientes ayant un cancer du sein. Une PCR nichée a été réalisée afin de détecter un fragment amplifié de 208 pb correspondant au gène UL82 ainsi que le gène beta-actine servant de contrôle interne. Dans 4 cas sur 5 le gène UL82 du HCMV a été mis en évidence soit uniquement dans les extraits de la zone tumorale (patientes 3 et 4), soit à la fois dans la zone tumorale et la zone macroscopiquement saine adjacente (patients 2 et 5).
La Figure 10 montre un tableau récapitulant l'ensemble des données histologiques (type et grade), cellulaires (récepteurs aux oestrogènes, à la progestérone et à HER2) et de PCR nichée pour le gène UL82 de 5 patientes ayant un cancer du sein (les résultats des PCR des ces 5 patientes sont représentés dans la Figure 9).
Ces résultats indiquent que la mise en évidence du HCMV par détection de séquences du gène UL82 dans des biopsies de cancer du sein peut être utilisé à titre diagnostic (même de nombreuses années après l'infection de la patiente), de pronostic et potentiellement à des fins thérapeutique en fonction de la présence du HCMV uniquement dans la zone tumorale ou à la fois dans cette dernière ainsi que dans le tissu macroscopiquement sain adjacent. Exemple 11 Identification des séquences d'acides aminés responsables de l'activité oncogène du HCMV La Figure 11 montre un tableau récapitulant les différences en amino-acides de la protéine UL82 (pp71) entre les souches oncogènes (HCMV DB, AD169), non-oncogènes (TB40E et TB40F) ainsi qu'une souche HCMV isolée du lait maternel (MS) par rapport à la souche prototypique de référence HCMV Merlin. Il s'agit de substitutions d'acides aminés par rapport à la souche Merlin sauf pour la souche HCMV-DB pour laquelle on observe une insertion de glutamine (Glu) en position 424. Les mutations au niveau de l'extrémité C- terminale de la protéine UL82, de l'acide-aminé 420 à l'acide aminé 540 (en gras dans le tableau), sont présentes uniquement dans les séquences des souches HCMV oncogéniques DB et AD169 et non au niveau des souches non-oncogéniques HCMV TB40E et TB40F. Ces résultats identifient des séquences de nucléotides du gène UL82 et d'acides aminés de la protéine UL82 impliqué dans l'activité oncogénique du HCMV.
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Claims (21)

  1. REVENDICATIONS1. Utilisation d'une séquence d'acides nucléiques isolée codant pour une protéine UL82 ou UL97 d'une souche de cytomégalovirus humain, HCMV, ou d'une séquence d'acides aminés isolée consistant en une séquence d'une protéine UL82 ou UL97 d'une souche de HCMV pour déterminer une propriété oncogénique chez un HCMV.
  2. 2. Utilisation d'une séquence d'acides nucléiques isolée codant pour une protéine UL82 ou UL97 d'une souche de cytomégalovirus humain, HCMV, ou d'une séquence d'acides aminés isolée consistant en une séquence d'une protéine UL82 ou UL97 d'une souche de HCMV pour déterminer un risque de carcinogénèse ou pour évaluer un pronostic d'un cancer.
  3. 3. Utilisation selon la revendication précédente, dans laquelle la carcinogénèse est une carcinogénèse du sein.
  4. 4. Séquence d'acides nucléiques isolée codant pour une séquence d'acides aminés d'une protéine UL82 d'une souche de cytomégalovirus humain, HCMV, ladite séquence d'acides aminés étant une séquence consistant en SEQ ID NO 5, SEQ ID NO 6 ou SEQ ID NO 7.
  5. 5. Amorce nucléotidique consistant en une séquence d'acides nucléiques consécutifs issus d'une séquence d'acides nucléiques isolée codant pour une protéine UL82 ou UL97 d'une souche de HCMV, ladite amorce convenant spécifiquement au séquençage ou à l'amplification d'une séquence d'acides nucléiques comprenant au moins une séquence d'acides nucléiques isolée codant pour une protéine UL82 ou UL97 d'une souche de HCMV.
  6. 6. Sonde nucléotidique consistant en une séquence d'acides nucléiques consécutifs issus d'une séquence d'acides nucléiques isolée codant pour une protéine UL82 ou UL97 d'une souche de HCMV, ladite sonde étant une sonde d'hybridation pour détecter spécifiquement une séquence d'acides nucléiques comprenant au moins une séquence d'acides nucléiques isolée codant pour une protéine UL82 ou UL97 d'une souche de HCMV.
  7. 7. Vecteur d'expression comprenant au moins une séquence d'acides nucléiques selon la revendication 4.
  8. 8. Cellule hôte isolée transfectée avec un vecteur d'expression selon la revendication 7.
  9. 9. Séquence d'acides aminés isolée d'une protéine UL82 d'une souche de cytomégalovirus humain, HCMV, ladite séquence d'acides aminés consistant en une séquence d'acides aminés choisie parmi SEQ ID NO 5, SEQ ID NO 6 ou SEQ ID NO 7.FR12 51324 REVENDICATIONS MODIFIEES
  10. 10. Anticorps apte à se lier spécifiquement à une séquence d'acides aminés selon la revendication 9.
  11. 11. Biomarqueur pour évaluer une propriété oncogénique d'une souche de cytomégalovirus humain, HCMV, ou pour déterminer un risque de carcinogénèse chez un individu en ayant besoin, ou pour déterminer un pronostic d'un cancer chez un individu atteint dudit cancer, ledit biomarqueur consistant en une séquence d'acides nucléiques codant pour une protéine UL82 ou UL97 d'une souche de HCMV ou en une séquence d'acides aminés consistant en une séquence d'une protéine UL82 ou UL97 d'une souche de HCMV.
  12. 12. Kit de diagnostic contenant au moins une séquence d'acides nucléiques isolée codant pour une protéine UL82 ou UL97 d'une souche de HCMV ou au moins une séquence d'acides aminés isolée consistant en une séquence d'une protéine UL82 ou UL97 d'une souche de HCMV, au moins une amorce nucléotidique selon la revendication 5, au moins une sonde nucléotidique selon la revendication 6, et/ou au moins un anticorps selon la revendication 10.
  13. 13. Médicament comprenant au moins une séquence d'acides nucléiques isolée codant pour une protéine UL82 ou UL97 d'une souche de HCMV ou au moins une séquence d'acides aminés isolée consistant en une séquence d'une protéine UL82 ou UL97 d'une souche de HCMV, ou au moins un anticorps selon la revendication 12.
  14. 14. Médicament selon la revendication précédente, ledit médicament étant un vaccin.
  15. 15. Médicament selon la revendication 13 ou 14, pour prévenir et/ou traiter une carcinogénèse induite par une infection par HCMV.
  16. 16. Méthode pour évaluer un caractère oncogène d'une souche de cytomégalovirus humain, HCMV, comprenant au moins les étapes de: a) déterminer dans un échantillon biologique isolé une présence ou un niveau d'expression ou une activité d'au moins une séquence d'acides nucléiques codant pour une protéine UL82 ou UL97 de ladite souche de HCMV, ou d'une séquence d'acides aminés consistant en une séquence d'une protéine UL82 ou UL97 de ladite souche de HCMV, et b) comparer la détermination de l'étape a) à une détermination contrôle.
  17. 17. Méthode pour déterminer un risque de carcinogénèse, notamment un cancer du sein, chez un individu en ayant besoin, ou pour déterminer un pronostic d'un cancer chez un individu atteint dudit cancer, comprenant au moins les étapes de: a) déterminer, dans un échantillon biologique isolé, obtenu à partir dudit individu, une présence ou un niveau d'expression ou une activité d'une séquence d'acidesFR12 51324 REVENDICATIONS MODIFIEES nucléiques codant pour une protéine UL82 ou UL97 d'une souche de cytomégalovirus humain, HCMV, ou d'une séquence d'acides aminés consistant en une séquence d'une protéine UL82 ou UL97 d'une souche de HCMV, et b) comparer la détermination de l'étape a) à une détermination contrôle.
  18. 18. Utilisation d'une souche de cytomégalovirus humain, HCMV, choisie parmi HCMV-DB et HCMV-AD169 pour déterminer un caractère oncogène d'une souche distincte de HCMV.
  19. 19. Méthode pour déterminer un risque de carcinogénèse, notamment mammaire, chez un individu en ayant besoin, ou pour déterminer un pronostic d'un cancer chez un individu atteint dudit cancer, comprenant au moins les étapes consistant à : a- infecter des cellules eucaryotes permissives au HCMV au moyen d'une souche de HCMV isolée dudit individu, b- cultiver les cellules infectées à l'étape a- dans une couche basale d'agar mou, c- déterminer la présence ou l'absence de colonies cellulaires en agar mou.
  20. 20. Méthode selon la revendication précédente, dans laquelle la présence de colonies cellulaires déterminées à l'étape c- est indicative d'un risque de carcinogénèse.
  21. 21. Méthode pour déterminer un caractère oncogénique d'une souche de HCMV comprenant au moins les étapes consistant à : a- infecter des cellules eucaryotes permissives au HCMV au moyen d'une souche de HCMV à tester, b- déterminer l'expression génique des cellules infectées à l'étape a-, et c- comparer l'expression génique déterminée à l'étape b- avec des cellules mammaires cancéreuses de type basal/myoépithélial ou l'expression génique de cellules eucaryotes permissives au HCMV infectées par une souche de HCMV oncogénique.
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