FR2969605A1 - Derives de 2,3,4,5-tetrahydro-1h-benzo[b]azepine et leur utilisation - Google Patents

Abstract

L'invention concerne un composé de formule (I): dans laquelle R est tel que défini dans la description. L'invention concerne également un ligand fluorescent obtenu à partir du composé de formule (I).

Description

La présente invention concerne des dérivés de la 2,3,4,5-tétrahydro-I1f benzo[b]azépine et leur utilisation comme outil dans un test de liaison sur le récepteur V2 de la vasopressine. Arrière-plan technologique de 'Invention Le récepteur V2 de la vasopressine est un récepteur couplé aux protéines G responsable de l'effet antidiurétique de la vasopressine. Ce récepteur intéresse l'industrie pharmaceutique notamment pour le développement de traitements contre l'hyponatrémie. L'identification de nouveaux ligands de ce récepteur peut se faire en utilisant des tests de criblage basés sur la radioactivité. Ces méthodes présentent cependant plusieurs désavantages comme l'élimination des déchets radioactifs. L'utilisation de tests de criblages basés sur les techniques de fluorescence permet de contourner ces limitations. Leur développement nécessite cependant la préparation de ligands fluorescents, affins et sélectifs du récepteur étudié. Le phénomène de FRET (de l'anglais « Fluorescent Resonance Energy Transfer ») est largement utilisé en biologie, notamment pour étudier des interactions moléculaires. Il est basé sur l'utilisation d'un composé donneur fluorescent (par exemple un complexe de terre rare) et d'un composé accepteur éventuellement fluorescent chacun de ces composés étant couplé à une molécule biologique. Lorsqu'un phénomène biologique provoque le rapprochement de ces molécules, et que le composé donneur est excité, un transfert d'énergie a lieu entre le donneur et l'accepteur et va résulter en une variation de la luminescence émise par le milieu réactionnel. Les études de phénomènes biologiques basées sur la technique de FRET nécessitent l'excitation des fluorophores par une source lumineuse, qui peut être fournie par une lampe flash ou plus généralement un laser, émettant de préférence dans le proche ultra-violet : les lasers à azote et les lasers YAG, tous deux employés dans les fluorimètres disponibles commercialement, émettent de la lumière à 337 nm et 355 nm, respectivement. L'utilisation de tels lasers nécessite néanmoins des fluorophores capables d'absorber la lumière à ces longueurs d'onde. La technologie HTRFO (de l'anglais « Homogeneous Time-Resolved Fluorescence ») est une technologie qui utilise les principes du FRET et de la TRF (de l'anglais « Time-Resolved Fluorescence »). Cette technologie nécessite de pouvoir disposer d'un couple de partenaires donneur/accepteur qui remplit certaines exigences (voir à ce sujet les explications disponibles en se connectant à l'URL suivante : http://www.htrf.com/techn000gy/htrftheory/tr 2969605 Les ligands maqués décrits dans a littérature sont généralement des composés peptidiques et non sélectifs du récepteur V2 (voir par exemple Min/ Rev Mec/ Chem 2008, 8(10), 996-1005). Un ligand fluorescent non peptidique dérivé du motif 2,3,4,5-tétrahydro-lH-benzo[b]azépine a été récemment décrit (Chem Et/r 2008, 14, 6247-6254 ; composé 17a,b). Ce ligand non-peptidique a une affinité moyenne (>50nM pour le récepteur V2, ce qui rend difficile la mise en oeuvre d'un test de criblage basé sur la fluorescence (de type Tag-lite ou FP). Objet de 'Invention Il existe donc un besoin de pouvoir disposer de composés non-peptidiques qui 10 possèdent une bonne affinité pour le récepteur V2 de la vasopressine, et qui sont sélectifs pour ce récepteur vis-à-vis du récepteur Vi de la vasopressine (sous-types (Via, Vip) et du récepteur à l'ocytocine (OT). Il existe également un besoin de pouvoir disposer de ligands fluorescents utiles pour le développement d'un test de liaison sur e récepteur V2, notamment en utilisant a 15 technologie HTRF0. Ainsi, selon un premier aspect, l'invention concerne un composé de formule (1) : RIHN dans laquelle : Ri est l'hydrogène ou un groupe -COR2 ; 20 R2 représente un groupe -(CFI2)mNR3R4 dans lequel m = 2, 3 ou 4 et R3 et R4 représentent chacun l'hydrogène ou R3 et R4 forment un groupe pipérid-4-y e ou pipérazinyle avec l'atome d'azote auxquels ils sont liés ; ou un groupe -(CH2CH20),(C )pNR3R4 dans lequel n = , 4 ou 5, p = 2 ou 3 et R3 25 et R4 sont tels que définis ci-dessus ; ou un groupe dans lequel R5 représente un groupe -(CH2)pNR3R4 dans lequel q = 2 ou 3 et R3 et R4 sont tels que définis ci-dessus ; ou un groupe -(CH2CH2O),(CH2) NR3R4 dans lequel r = 3, 4, 5 ou 6, s = 2 ou 3 et R3 et R4 sont tels que définis ci-dessus.

Selon un mode de réalisation, R1 représente un groupe -COR2 dans lequel R2 représente de préférence :

un groupe -(CH2),,,NR3R4 dans lequel m = 2, 3 ou 4, de préférence m = 2 ou 4, et R3 et R4 représentent chacun l'hydrogène ou R3 et R4 forment un groupe pipérazinyle avec l'atome d'azote auxquels ils sont liés ; ou

un groupe -(CH2CH2O)n(CH2)pNR3R4 dans lequel n = 3 et p = 2, et R3 et R4 représentent de préférence chacun l'hydrogène ; ou

un groupe (CH2 2 C Il H 0 N=N dans lequel R5 représente un groupe -(CH2)2NR3R4 et R3 et R4 représentent de 15 préférence chacun l'hydrogène ; ou

un groupe (CHz)z C N N-R5 O H N=N dans lequel R5 représente un groupe -(CH2CH2O),(CH2)SNR3R4 dans lequel r = 3

ou 6, s = 2 et R3 et R4 représentent de préférence chacun l'hydrogène.

20 Selon un autre aspect, l'invention concerne un ligand fluorescent susceptible d'être utilisé dans un test de liaison sur le récepteur V2. Ce ligand est obtenu par couplage d'un composé de formule (I) avec un composé fluorescent. Le couplage s'effectue de manière conventionnelle entre un résidu -NH ou -NH2 porté par le composé de formule (I) et un composé fluorescent via un groupe réactif, par exemple un groupe

25 NHS.

Les composés fluorescents susceptibles d'être utilisés dans le cadre de l'invention sont avantageusement choisis parmi : les allophycocyanines, en particulier celle connue sous la dénomination commerciale XL665 ; les molécules organiques luminescentes, telles que les rhodamines (en particulier la lissamine rhodamine B), les cyanines, les

30 squaraines, les coumarines, les proflavines, les acridines, les fluorescéines ; les fluorophores connus sous la dénomination Bodipy ; les fluorophores connus sous la dénomination Atto ; les fluorophores connus sous la dénomination Dy, en particulier e composé connu sous la dénomination Dy467 ; les composés connus sous la dénomination AlexaFluor ; le nitrobenzoxadiazole ; les complexes métalliques fluorescents, tels que les cryptates de terre rare, les chélates de terre rare (en particulier les chélates et cryptates d'europium, de terbium, de samarium, de dysprosium, de néodymium, et plus particulièrement le composé connu sous la dénomination Lumi4-Tb); les particules inorganiques luminescentes comme les nanocristaux («quantum dots» en langue anglaise»). De préférence, le composé fluorescent est choisi parmi les rhodamines (en particulier la lissamine rhodamine B), 10 les fluorescéines, les fluorophores connus sous la dénomination Dy (en particulier le composé connu sous la dénomination Dy467), et les cryptates de terre rare (en particulier le composé connu sous la dénomination Lumi4-Tb). Le ligand fluorescent selon l'invention répond à la formule générale (1') : Rl'HN

(1» dans laquelle : R'l représente un résidu de composé fluorescent ou un groupe -COR'2; R'2 représente un groupe -(CH2)mNR'3R4 dans lequel m = 2, 3 ou 4 et soit R'3 représente l'hydrogène et R4 représente un résidu de composé 20 fluorescent, soit R'3 et R4 forment un groupe ; ou un groupe -(CH2CH20)n(CH2)pNR'3R4 dans lequel n = 3, 4 ou 5, p = 2 ou 3 et R'3 et R'4 sont tels que définis ci-dessus ; ou 25 un groupe (Cl-1,),-C Il 0 N=N /NR'6 ou -N NR' 6 dans lequel R'5 représente un groupe -(CH2)gNR'3R4 dans lequel q = 2 ou 3 et R'3 et R'4 sont tels que définis ci-dessus ; ou un groupe -(CH2CH2O),(CH2),NR'3R4 dans lequel r = 3, 4, 5 ou 6, s = 2 ou 3 et R'3 et R4 sont tels que définis ci-dessus ; R'6 représente un résidu de composé fluorescent ; et le composé fluorescent (mentionné dans la définition des groupes R'4 et R'6) est tel que défini ci-dessus. Selon un mode de réalisation, R'1 représente un groupe -COR'2 dans lequel R'2 représente un groupe -(CH2)mNR'3R4 dans lequel m = 2, 3 ou 4, de préférence m = 2 ou 4, et soit R'3 représente l'hydrogène et R4 représente un résidu de composé fluorescent, soit R'3 et R'4 forment un groupe I -N\ N R"6 Selon un autre mode de réalisation, R'1 représente un groupe -COR'2 dans lequel R'2 représente un groupe -(CH2CH2O)n(CH2)pNR'3R'4 dans lequel n = 3 et p = 2, R'3 représente l'hydrogène et R4 représente un résidu de composé fluorescent. Selon un autre mode de réalisation, R'1 représente un groupe -COR'2 dans lequel R'2 représente un groupe (CH,), -C 0 N=N dans lequel R'5 représente un groupe -(CH2)2NR'3R'4, R'3 représente l'hydrogène et R4 20 représente un résidu de composé fluorescent. Selon un autre mode de réalisation, RI représente un groupe -COR'2 dans lequel R'2 représente un groupe (CH2 dans lequel R'5 représente un groupe -(CH2CH2O),(CH2)sNR'3R'4 dans lequel r = 3 ou 6, 25 s = 2, R'3 représente l'hydrogène et R4 représente un résidu de composé fluorescent. Selon un autre aspect, l'invention concerne un ligand susceptible d'être utilisé pour la purification du récepteur V2. Ce ligand est obtenu par couplage d'un composé de formule (I) avec la biotine. Le couplage s'effectue de manière conventionnelle entre un 0 N=N résidu -NH ou -NH2 porté par e composé de formule (1) e a biotine via un groupe réactif, par exemple un groupe NHS. Les composés de formule (1) et (Il ainsi que les composés (1) 'biotinylés' peuvent être préparés selon le mode opératoire décrit dans les schémas 1 à 6. Le schéma 1 décrit un exemple de synthèse effectuée sur support solide. La benzazépine 2 est condensée sur la résine bifonctionnelle (acétylénique-acide) 1 (préparée comme décrit dans Cher Eur J2008, 14, 6247-6254) en utilisant l'agent de couplage PyBop. Il est nécessaire d'utiliser du TMSOTf pour déprotéger sélectivement le groupe protecteur Bac du composé 3. L'amine secondaire 4 est alors capable de 10 réagir avec le chlorure de p-nitrobenzoyle conduisant ainsi au composé 5 qui est réduit en présence de sels d'étain. L'amine aromatique 6 est ensuite condensée sur le chlorure d'o-phénylbenzoyle 8 pour donner la benzazépine 9. Le bras de liaison PEG est introduit au travers d'une cycloaddition dipolaire 1,3 de type « click » en présence de sels de cuivre dont la réactivité a été décrite par B. Sharpless (Angew. Chem. Ire. 15 Ed, 2002, 41, 2596). L'amine PEG benzazépine est ensuite clivée du support solide en présence de TFA pour donner le composé 10 attendu. Le composé 13 peut être préparé de manière similaire à partir de la benzazépine 9 en utilisant le dérivé 11 (azido-PEG-lissamine) puis en clivant le composé 12 du support solide en présence de TFA. 20 Le schéma 2 décrit un exemple de synthèse en solution. La condensation des synthons 7 et 14 conduit à l'ester 15 qui est hydrolysé en milieu acide pour donner l'acide 16 lequel est ensuite condensé avec la benzazépin-5-one 16a pour conduire au dérivé 17. Une amination réductrice permet d'obtenir le composé 18. A partir de ce composé, le composé 19 est obtenu par simple couplage avec un rendement de 90% et le 25 composé 24 est obtenu en deux étapes avec un rendement global de 22%. La synthèse de la lissamine greffée avec différents bras de liaison est décrite dans le Schéma 3. Pour la lissamine possédant un bras de liaison de type pipérazinyle 30, la synthèse commence par une addition de Michaël-1,4 entre la monobenzylpipérazine 25 et l'acrylate de terl,butyle 26 pour conduire au composé 27 avec un rendement de 30 94%. L'amine secondaire est dépmtégée de son groupement benzylique par hydrogénolyse puis condensée sur le chlorosulfonyle de lissamine pour donner le composé 29 dont la fonction acide carboxylique est déprotégée par une solution de TFA. En ce qui concerne la préparation des composés 32 et 34, la synthèse est plus directe puisqu'elle es réalisée en deux étapes à partir de produits commerciaux : - une première étape de couplage entre d'une part amine-ester tert-butylique (31 ou 33 et d'autre part le chlorosulfonyle de lissamine ; - une seconde étape de déprotection du carboxyle en présence de TFA pour conduire respectivement aux composés 32 et 34. L'obtention de benzazépines couplées à a lissamine et possédant différents bras de liaison est décrite dans le schéma 4. Les couplages ont été effectués de façon classique en condensant la benzazépine amine 18 sur les différents dérivés de la lissamine en présence du PyBop comme agent de couplage. De cette façon sont obtenus respectivement les composés 35, 36, 37 et 38. 10 La synthèse des amines 43 et 45 est décrite dans le schéma 5. A partir de la benzazépine acétylénique 21 on réalise une réaction de cycloaddition dipolaire 1,3 en présence de sels de cuivre. Le schéma 6 décrit l'obtention de ligands fluorescents à partir des composés 10, 43 et 45. Les benzazépines conjuguées aux sondes fluorescentes ont été préparées par 15 réaction des dérivés benzazépine amine sur les esters de NHS des sondes fluorescentes selon des méthodes bien connues de l'homme du métier. Les différents réactifs utilisés dans les synthèses décrites ci-dessus sont soit disponibles commercialement soit peuvent être obtenus selon des modes opératoires bien connus de l'homme du métier. Les sondes fluorescentes DY647-NHS et Lumi4-Tb- 20 NHS sont disponibles auprès de la société Cisbio Bioassays. Les autres sondes fluorescentes (isothiocyanate de fluorescéine, lissamine) ainsi que la biotine sont disponibles auprès de la société Sigma-Aldrich. Schéma 1 H2N N 2 Boé PyBOP, DIEA, DMF OH 3 0 Cl pyridine anh, 4-DMAP, CH2Cl2 anh 13 Schéma 2 NH2 1) SOCl2 NMP, CH2C12 anh McO2C HO2C HCI 6N / AcOH 50/50 ,. CO2H 2) DIEA, CH2Cl2 anh 93% 88% 7 CO2Me 14 15 NCS 1) SOCl2, NMP, CF12Cl2 anh 2) py, 4-DMAP, CH2Cl2 anh 74% 16 O HN 77% 4-DMAP CH2C12 0 f HO~~ Il Nom/ O 20 PyBOP, DIEA, DMF anh BpC NH 18 H 1) PyBOP, DIEA, DMF 2) TFA/CH2Cl2 90% Ascorbate de sodiu CuSO4, 5H20 TBTA DMF/H2O (90/10) 26% OH 0 NH2 HN 24 Bn-N NH 25 V 26 Schéma 3 N O O CHCIIMeOHBn-N \N--/ t7 / Pd/C, H ~C Lissamine S02CI ~2 HN \N~ O ' McOH L/ / MEA, CH2C12 O 98% \ 47% 94°la 27 28

29 TFA, H2O 9515 CH202 31 N/- 96% DIEA, DMAP CH2C121DMF 0 TFA/CH2Cl21H2O 82% HCI .H2N O Schéma 4 34 PyBOP, DIEA, DMF 32, PyBOP, DIEA, DMF Lissami ne FIN H N-Lissamine N H 38 N H HN 37 N H \ N N-Lissamine \ H N Lissamine Schéma 5 NaN3 DMF H DCM/TFA Oi Boc'NN3 Tos 83% 41 98% TFA. H2NN3 42 H Boc' N V 44 H c'NOH 39 TsCi Et3N DCM 83% fNI-12 0 '8 HN Ascorbate de sodium CuSO4, 5H2O DMF/H2O (90110) Ascorbate de sodium CuSO4, 5H2O DMF/H2O (90/10) NI-12 29% N H 43 42 21 NH2 Schéma 6 10, R1= '[(CH2)2O]3-(CH2)2-NH2 N i N R3 43, R1= -(CH2)2-NH2 45, R1= '[(CH2)2O]6-(CH2)2-NH2 46, R3= -[(CH2)2O]3-(CH2)2-NHCO-DY647 (74%) 47, R3= -[(CH2)2O]3-(CH2)2-NHCO-Lumi4-Tb (45%) 48, R3= -[(CH2)2O]3-(CH2)2-NH-Biot (77%) 49, R3= -(CH2)2-NHCO-DY647(40%) 50, R3= -(CH2)2-NHCO-Lumi4-Tb (16%) 51, R3= -[(CH2)2O]6-(CH2)2-NHCO-DY647 (89°/a) 52, R3= -[(CH2)2O]6-(CH2)2-NHCO-Lumi4-Tb (38%) DY647, Lumi4-Tb, Biot O HN NH .1H Biot= Les intermédiaires décrits dans les schémas 6 font partie intégrante de 'Invention. Ainsi, selon un autre aspect, 'Invention concerne, à titre d'intermédiaires les composés de formule (II) et (III) : HN Les ligands fluorescents conformes à l'invention ont une structure non peptidique et sont sélectifs pour le récepteur V2 vis-à-vis des récepteurs Via, Vu, et du récepteur à l'ocytocine (OT), tout en gardant une affinité nanomolaire pour le récepteur V2. Dans le contexte de la présente invention, on entend par « sélectif » un rapport des constantes 10 d'affinité Ki (calculées pour chaque récepteur selon l'équation de Cheng-Prusoff) ?. 10, de préférence 50, de préférence encore 100. L'affinité, la sélectivité et la stabilité chimique et métabolique de ces ligands permettent d'envisager notamment: leur utilisation directe dans le cadre d'un est de liaison ligand-récepteur V2 15 basé notamment sur la technique de FRET-HTRF() ; leur utilisation in vivo pour le marquage la visualisation du récepteur V2, en particulier : 0 dans des études d'homo- ou d étérodimérisation du récepteur V2 sur tissus natifs ; ou 20 en imagerie médicale pour le suivi et la localisation des récepteurs V2.

L'invention est illustrée par les préparations et exemples suivants, donnés à titre purement indicatif.

Réactifs Le 5-amino-2,3,4,5-tétrahydro-IH-1-benzazépine- -carboxylate de ert-butyle a été obtenu suivant le protocole décrit dans 1 Comb. Chem. 2007f 9, 487-500 ; la chaîne azido-PEG3-lissamine rhodamine B ainsi que la résine « Solid Phase Organic Taging » (SPOrT) ont été obtenues suivant le protocole décrit dans Chem. Eur. 1 2008, 14, 6247-54. Le 5-aminopentanoate de tert-butyle a été préparé suivant e protocole décrit dans 1 Ore Chem, 2007, 72, 6162-6170. Le chlorure de sulfonyle de la lissamine rhodamine B est un composé commercial, disponible sous forme d'un mélange de deux isomères de substitution du groupement 0 chlorure de sulfonyle en position 2 (ortho) ou 4 (para) de a lissamine. 4 Synthèses phase solide Les réactions sur support solide ont été effectuées dans des tubes en polypropylène 15 équipés de frittés en polyéthylène et de bouchons en polypropylène, sous agitation orbitalaire à température ambiante ou bien dans une étuve tournante Chemflex (Rabbins Scientific) pour les réactions à 60°C. Les résines sont lavées en général avec les solvants suivants : DMF (3 fois), CH202 (3 fois) et MeOH (3 fois). Chaque réaction est contrôlée à l'aide de tests colorimétriques adaptés aux fonctions à identifier 20 (Biotechnology and bloengineering (Combinatorial Chemistry) 2000/2001, 71(2), 110-118, 1 Comb. Chem. 2004, 6, 165-170, 1 Comb. Chem. 2004, 6, 805-810).

Réactions micro-ondes (MW) Les irradiations sous micro-ondes ont été effectuées à l'aide d'un appareil &otage 25 Initiator 2.0.

Chromatographie Les chromatographies sur couches minces ont été effectuées sur des plaques de gel de silice Merck60 F254 sur feuille d'aluminium. 5 15 20 25 30 Les chromatographies liquides à haute pression (HPLC) analytiques, semi-préparatives e préparatives ont respectivement été effectuées sur les appareils suivants : Chaîne P580 Dionex : ^ Colonne analytique ' Chro oie Speer:1WD RP18, 4,6 x 50 mm ^ Colonne semi-préparative: Waters SymrrtetryShr`eld RP18, 0,7pm, 19 x 300 mm Chaîne Agitent Technologies 1200 Séries : ^ Colonne analytique 2 : Agitent a./Ose XDB-C18, 5 pm, 4,6 x 150 mm Chaîne Shimadzu LC-8A ^ Colonne préparative : Waters ColonneX-Bridge, C18, 5 pm, 19 x 100 o Colonne préparative : Vydac C18, 5 pm, 250 x 10

Eluants : A : H20/TFA 0,1 % B : MeOH/H20 95/5 + TFA 0,1 % C: H20/TFA 0,2% D: MeCN E: H20/TEAAc 25 mM, pH 7

Gradients : gradient 1 Colonne analytique 2 Débit 1 mL.min-1, 2 min à 10% de B puis 5 in de 10 à 100% de B

gradient 2 Colonne analytique 1 Débit 7 mLmin-1, 1 min à 0% de C puis 5 min de 0 à l00% de C

gradient 3 Colonne semi-préparative Débit 10 mL.min-1, 5 min à 5% de B, 25 min de 5 à 100% de B puis 5 min à 100% de B gradient 4 Colonne semi-préparative Débit 10 mLmin-1, 5 min à 5% de B, 8 min de 5 à 40% de B, 15 min de 40 à 70% de B, 8 min de 70 à 100% de B puis 5 min à de B

gradient 5 Colonne préparative Waters Débit 20 mL.min-1, 2 min 85% C, 15% D ; 17 min de 15% à 70% de D, min de 70% à 100% de D

gradient 6 Colonne préparative Vydac Débit 5 mL.min-1, 2 min 90°lo E, 100/o D, 17 min de 10% à 70% de D, 1 min de 70% à 100% de D

La détection est réalisée à 220, 254, 320 et 530 nm. Les temps de rétention (Tr) sont 15 exprimés en minutes (min).

Les chromatographies sur colonne de silice ont été réalisées avec le gel de silice Merck 60 (230-400 Mesh ASTM).

20 Les purifications par flash chromatographie ont été effectuées à l'aide de l'appareil Armen Spot IL

Eluants : F : 0 G : MeCN Gradient : gradient 7 Colonne RP18 Débit 15 mL.min- , 0 in de 5 à 100% de G

Spectmmétne de masse (MS) 30 Les spectres de masse (LC-MS) ont été réalisés à l'aide d'un spectrome re Agitent Technologies MSD 1200 SL simple quadripôle à source multimode ESI/AFCI équipé de colonne Thermo Hypersft GOLO 1,9 p m, 0 10 2510 Les spectres de masse à haute résolution (HR-MS) ont été obtenus à l'aide de l'appareil Agitent Q.Tof équipé d'une source d'ionisation par électrospray et d'un analyseur à temps de vol ESI-TOF).

Résonance magnétique nucléaire (RMN) Les spectres RMN ont été enregistrés à 200, 300, 400 et 500 MHz, sur des spectromètres Brucker Advance. Les déplacements chimiques (Ô) ont été exprimés en partie par million (ppm) et les constantes de couplage en hertz (Hz) par rapport aux solvants deutérés standards. Les abréviations suivantes sont utilisées : s : singulet sl : singulet large d : doublet dd : doublet de doublets dt : doublet de triplets t : triplet triplet de doublets triplet large quadruplet multiplet app : apparent td : tl : q : Point de fusion (PO Les points de fusion ont été mesurés sur un appareil Sikh/B-540.

15 Liste des abréviations 4-DMAP N,N-diméthyl-4-aminopyridine AcOEt acétate d'éthyle AcOH acide acétique Ala alanine 20 Boc tett-butylcarbonate degré Celsius DIEA N,N-diisopmpyléthylamine DMF diméthylformamide DMSO diméthylsulfoxyde 25 DY647 fluorophore à base de pentaméthine commercialisé par a société Dyomics DY647-NHS dérivé N-hydroxysuccinimide du DY647 eq. Equivalent Et2O h Hept Lumi4Tb Lumi4Tb-NFiS MeCN MeOH min NEt3 NH40Ac NHS NMP PEG Pf PY PyBOP Rf RMN SPOrT TA TBTA TEAAc TFA TMSOTf Tr éther éthylique heure heptane fluorophore commercialisé par la société Cisbio Bioaasay dérivé N-hydroxysuccinimide du Lumi4Tb acétonitrile méthanol minute triéthylamine acétate d'ammonium N-hydroxysuccinimide N-méthyl-2-pyrrolidone polyéthylène glycol point de fusion pyridine hexafluorophosphate de (benzotriazol-1-yloxy)tripyrrolidinophosphonium rapport frontal résonance magnétique nucléaire « étiquetage organique en phase solide » (solid phase organic tagging) température ambiante tris[(1-benzyl-IH-1,2,3-triazol-4-yl)methyl] amine acétate de triéthylammonium acide trifluoroacétique triméthylsilyl trifluorométhanesulfonate temps de rétention Préparation 1 PyBOP, DIEA, DMF OH A la résine SPOrT-0O2H (0,55 mmol) gonflée dans le DMF, a été ajoutée une solution contenant du 5-amino-2,3,4,5-tétrahydro-lH-1-benzazépine-l-carboxylate de ter& butyle (193 mg, 0,74 mmol) en présence de PyBOP (574 mg, 1,10 mmol) et de DIEA (257 pL, 1,47 mmol) dans le DMF (4 mL). Le milieu réactionnel a été agité pendant une nuit à TA, à l'abri de la lumière. Après filtration et lavage, le couplage a été confirmé par le test colorimétrique au malachite (négatif).

Préparation 2 A une solution du composé de la préparation 1 (0,55 mmol) dans le CH202 anhydre, a été ajoutée une solution de TMSOTf (200 pL, 1,10 mmol) en présence de NEt3 (78 pL, 0,55 mmol) dans le CH2C12 anhydre (3 mL). Le mélange a été agité à TA pendant 15 10 min. Après filtration et lavage, la présence de l'amine déprotégée a été confirmée par un test colorimétrique au chloranil (positif). Préparation 3 o o c NO2 ., NO2 4 pyridine anh, 4-DMAP, CH2Cl2 anh 5 15 A une solution du composé de la préparation 2 (0,55 mmol) dans le CH202 anhydre, a été ajoutée une solution de chlorure de 4-nitrobenzoyle (341 mg, 1,84 mmol) en présence de pyridine anhydre (296 pL, 3,68 mmol) dans le CH2Cl2 anhydre (4 mL). Apres ajout de 4-DMAP (5 mg, 0,04 mmol), le milieu réactionnel a été agité à TA pendant une nuit à l'abri de la lumière. Après filtration et lavage, le couplage a été

20 confirmé par un test colorimétrique au chloranil (négatif). Préparation 4 SnC12.2H2O NO2 DMF NH2 Dans un réacteur micro-ondes, le composé de la préparation 3 (0,12 mmol) a été 25 gonflé dans le DMF. On a ajouté une solution de SnC12, 2H2O (543 mg, 2,4 mmol) dans le DMF (2 mL) et le mélange a été agité à TA pendant une nuit Après filtration et lavage avec DMF/AcOH (75/25) (3 fois), DMF/NEt3 (90/10) (3 fois), DMF (3 fois), CH2Cl2 (3 fois), MeOH (3 fois), la réduction a été confirmée par un test colorimétrique au kaiser (positif).

Préparation 5 NH2 CH2Cl2 anh A une solution du composé de la préparation 4 (0,12 mmol) dans le CH202 anhydre, une solution de chlorure d'o-phénylbenzoyle (132 mg, 0,61 mmol) a été ajoutée en présence de DIEA (214 pL, 1,22 mmol) dans le CH2C12 anhydre (1 mL). Apres ajout de 4-DMAP (14 mg, 0,12 mmol), le milieu réactionnel a été agité à TA pendant une nuit à l'abri de la lumière. Après filtration et lavage, le couplage a été confirmé par un test calorimétrique au chloranil (négatif). Exemple 1 H2N N3 1) 2) TFA/H20 (9515) 9 H N A une solution du composé de la préparation 5 (0,05 mmol) dans le DMF/pipéridine 20%, on a ajouté du Cul (44 mg, 0,23 mmol) et de la 11-azido-3,6,9-trioxaundécan-1-amine (27 pL, 0,14 mmol) dans le mélange DMF/pipéridine 20% (1,3 mL). Le milieu réactionnel a été agité 6 h à TA, à l'abri de la lumière. Après filtration et lavage avec un mélange DMF/pipéridine 20% (3 fois), DMF (3 fois), CH202 (3 fois), CH2Cl2/MeOH (3 fois) et MeOH (3 fois), le composé a été séché à l'éther. Après clivage de la résine dans TFA/H20 (95/5) pendant 3 h, purification sur colonne semi-préparative (gradient 3) et lyophilisation, une huile incolore a été obtenue (20 mg, 54%). Tr (gradient 1): 13.03. HR-MS (El) calculé : 817.4032, trouvé : 817.4022. 1H RMN (400 MHz, CDC13): ô 10.26 (s, 1 Fl), 8.55 (d, J = 7.6 Hz, 1 H), 8.37 (t, J = 5.6 Hz, 1 H), 7.75 (st, 2 H), 7.57-7.52 (m, 2 H), 7.48-7.43 (m, 2 H), 7.38-7.21 (m, 9 H), 7.16 (t, J = 7.6 Hz, 1 H), 6.98 (t, J = 6.4 Hz, 1 H), 6.63 (d, J = 7.4 Hz, 1 H), 5.14 (si, 1 H), 4.43 (t, 1= 5.1 Hz, 2 H), 4.30 (t, 1= 6.0 Hz, 1 H), 3.76 (t, .1= 5.3 Hz, 2 H), 3.5 (sl, 1 H), 2.96 (q, 1= 10.9, 5.4 Hz, 2 H), 2.44 (q, _7= 13.8, 7.2 Hz, 2 H), 1.99 (si, 1 H), 1.88 (si, 1 Fi), 1.57 (si, 2 H).

Préparation 6 A une solution du composé de la préparation 5 (0,07 mmol) dans un mélange DMF/pipéridine 20%, on a ajouté successivement du Cul (67 mg, 0,35 mmol) dans un mélange DMF/pipéridine 200/o (1 mL), puis le fluorophore azido-(PEG)3-lissamine 10 [obtenu comme décrit dans Chem Eur 2008, 14, 6247-6254] (161 mg, 0,21 mmol) dans un mélange DMF/pipéridine 20% (0,9 mL). Le milieu réactionnel a été agité 6 h à TA, à l'abri de la lumière. Après filtration et lavage avec DMF/pipéridine 200/0 (3 fois), DMF (3 fois), CH2C12 (3 fois), CH2Cl2/MeOH (3 fois), MeOFI (3 fois) puis à l'éther, on a obtenu le composé couplé à la lissamine qui est utilisé dans la suite de la synthèse 15 sans purification supplémentaire.

Exemple 2 o TFAIH20 (95/5) H re N 13 o o Une solution de TFA/H20 (95/5) a été ajoutée au composé de la préparation 6 (0,07 20 mmol) et le mélange a été agité à TA pendant 3 h. Le composé ainsi obtenu en solution a été récupéré après filtration et rinçage avec CH2Cl2 et IvIe0H. Après purification par chromatographie sur colonne semi-préparative (gradient 4) et lyophilisation, deux produits ont été obtenus sous formes d'isomères ortho et para de a lissamine (65 mg, 68%).

25 mg (26%) en isomère ortho ont été obtenus : 1H RMN (400 MHz, CD30D): 8 8.73 (s, 1 H), 8.36 8.26 d, 1= 7.8 Hz, 1 H), 8.11 (si, 1 H), 7.70 (d, 1 = 7.6 Hz, 1 H), 7.46 (d, = 7.6 Hz, 1 H), 7.38-7.22 (m, 11 H), 7.12 (si, 1 H), 7.10 (si, 1 H), 7.09 (si, 1 H), 7.01 (d, 1 = 8.8 Hz, 2 H), 6.90-6.86 (m, 3 H), 6.81 (d, _1 = 8.8 Hz, 2 H), 6.69 (s, 2 H), 6.52 (d, J = 7.6 Hz, 1 H), 5.26 (si, 1 H), 4.58 (si, 1 H), 4.51 (t app,l= 8.2 Hz, 1 H), 4.40 (si, 1 H), 3.80 (si, H), 3.57-3.47 10 (m, 16 H), 3.07 (si, 1 H), 3.02 (si, 1 H), 2.84 (si, 2 H), 2.73 (si, 1 H), 2.07 (si, 1 H), 1.94 (st, 1 H), 1.75 (si, 1 H), 1.59 (si, 1 H), 1.29 (t, 1= 6.5 Hz, 12 H). Tr (gradient 2) : 4.04. HRMS (El) : calculé pour C72H82NI0013S2 679.2747, trouvé : 679.2746.

40 mg (42%) en isomère para ont été obtenus : 1H RMN (400 MHz, CD30D): 8.77 (s, 1 H), 8.19 (si, 1 H), 8.06 (si, 1 H), 8.03 (d, 1 = 8.0 Hz, 1 H), 7.90 (si, 1 H), 7.71 (d, .1= 7.7 Hz, 1 H), 7.46 (d, 1= 7.7 Hz, 1 H), 7.39-7.20 (m, 11 H), 7.16 (d, J = 7.7 Hz, 1 H), 7.12 (si, 1 H), 7.10 (si, 1 H), 7.04 (t, 1= 7.7 Hz, 1 H), 7.00 (d, 1 = 8.7 Hz, 2 H), 6.85 (t, = 7.3 Hz, 1 H), 6.73 (t, = 10.0 Hz, 20 H), 6.64 (si, 2 H), 6.48 (d, J = 7.7 Hz, 1 H), 5.14 (si, 1 H), 4.50 (si, 2 H), 4.42 (si, 1 H), 3.86 (tl, = 4.8 Hz, 1 H), 3.64 (tl, .1= 4.8 Hz, 1 H), 3.60-3.48 (m, 14 H), 3.27 (si, 2 H), 2.96-2.91 (m, 1 H), 2.65 (d app, 1= 7.2 Hz, 2 H), 2.59-2.54 (m, 1 H), 1.83 (si, 2 H), 1.48 (si, 2 H), 1.25 (t, J = 6.9 Hz, 12 H). Tr (gradient 2) : 4.13. HRMS (El): calculé pour C72H82N10013S2 679.2747, trouvé : 25 679.2740.

Préparation 7 1) SOCl2, NMP, CH2Cl2 anh 2) DEA, CH2Cl2 anh 93% 14 CO2H +

7 15 A une solution de `acide 2-biphénylcarboxylique 1 g, 5,0 mmol) dans 2,5 ml_ de 30 CH202 anhydre à O'C sous argon ont été ajoutés quelques gouttes de NMP et du chlorure de thionyle 9 mL, 25 mmol). Le mélange a été agité 30 min à 00C puis 3 h à TA. Le CH2C12 a ensuite été évaporé et le résidu dissous dans 5 mL de CH202 anhydre. Cette solution a été ajoutée goutte à goutte à 00C sous argon à un mélange de 4-aminobenzoate de méthyle (378 mg, 2,5 mmol) et de MEA (860 pL, 5,0 mmol) dans 4 mL de CH2Cl2 anhydre. L'agitation a été poursuivie 15 min à ()oc puis 2 h à TA. Le mélange a ensuite été dilué dans le CH2C12 puis lavé par de l'eau, de l'acide citrique 10% et NaOH 1M. La phase organique, séchée sur Na2SO4, a alors été évaporée et le résidu précipité dans l'AcOEt. Le produit a été obtenu sous forme d'une poudre blanche (774 mg, 93%). 10 Rf (Hept/AcOEt 50/50): 0.6. Tr (gradient 4.74. Pf: 150-1520C. 1H RMN (300 MHz, CDCI3): ô 7.85-7.93 (m, 3 H), 7.35-7.60 ( 8 H), 7.17 (d, = 8.4 Hz, 2 H), 7.05 (si, 1 H), 3.87 (s, 3 H). 13C RMN (75 MHz, CDCI3): Ô 167.1, 166.5, 141.7, 139.7, 139.6, 134.7, 131.0, 130.6, 130.4, 129.7, 129.1, 128.8, 128.3, 128.0, 125.6, 118.7, 52.0. 15 Préparation 8 HO 6N AcOH 1/1 88% 15 16 Une solution du composé de la préparation 7 (500 mg, 1,51 mmol) dans 50 mL d'un mélange HCI 6N/AcOH 1:1 a été chauffée à reflux pendant 4 h. Le mélange a ensuite 20 été versé dans un mélange eau/glace. Une poudre blanche (419 mg, 88%) a été obtenue après filtration et séchage sous vide. Rf (Hept/AcOEt 50/50): 0.5. Tr (gradient 1): 13.59. Pf: 236-238'C. 1H RMN (200 MHz, DMSO-d6 : Ô 7.20-7.75 (m, 11 ), 7.84 (d, J = 8.6 Hz, 2 , 10.54 (s, 1 H), 12.46 (si, 1 H). 2 13C RMN (75 MHz, DMSO-c/6): 6 168.2, 166.9, 143. 40.9, 139,9, 139.3 6.7, 130.2, 130.0, 128.3, 128.1, 127.8, 127.3, 27.2, 125.4, 118.8. 25 Préparation 9 1) SOCl2, NMP, CH202 anh 2) py, 4-D1MP, CH2Cl2 anh 74% N H 17 16 Un mélange du composé de la preparation 8 (200 mg, 0,63 mmol), de chlorure de thionyle (142 pL, 1,94 mmol) et de NMP (quelques gouttes) dans le CH2Cl2 anhydre (5 mL) a été agité une nuit sous argon à TA. Le milieu a été évaporé à sec et repris dans le CH2Cl2 anhydre (5 mL). Cette solution a été ajoutée lentement à un mélange à 00C sous argon contenant de la 1,2,3,4-tétrahydro-5H-1-benzazépin-5-one (78 mg, 0,48 mmol), de la pyridine anhydre (117 pL, 1,45 mmol) et de la 4-DMAP (12 mg, 0,10 mmol) dans du CH202 anhydre (2 mL). Le milieu a été agité à TA pendant 4h puis

10 dilué dans 5 mL de CH2Cl2, lavé avec HCI IN et avec NaHCO3 saturé. La phase organique a été séchée sur Na2SO4 et évaporée. Après purification sur colonne de silice (Hept/AcOEt 50/50), une poudre beige (165 mg, 74%) a été obtenue.

Rf Hept/AcOEt 40/60): 0.4. Pf: 128-130°C. Tr gradient 1): 14.39.

1H RMN (200 MHz, CDCI3): Ô 7.58-7.51 (m, 2 H 7.28-7.08 (m, 2 H), 6.98-6.91 (m, 2 15 H), 6.78 (t app, 1= 8.6 Hz, 3 H), 6.65 (d app, J = 8.6 Hz, 2 H), 6.40 (dd app, J = 7.0, 1.7 Hz, 1 H), 3.18 (q, J = 7.1 Hz, 4 H), 2.56 (t, = 6.3 Hz, 2 H). 20 o nC RMN (75 MHz, CDCI3): ô 202.2, 170.0, 167.4, 143.2, 139.8, 139.7, 135.0, 134.4, 133.1, 130.9, 130.7, 129.8, 129.5, 129.1, 129.0, 128.8, 128.2, 127.9, 118.8, 40.3, 29.8, 22.8. MS (ES) m/z461.0 ([M+Hr). Exemple 3 17 Un mélange du composé de la préparation 9 (53 mg, 0,12 mmol), de NH40Ac 532 mg, 6,91 mmol) et de NaBF13CN (36 mg, 0,58 mmol) dans le MeOH (2,5 mL) a été irradié sous micro-ondes 2 fois 5 min à 1000C sous 1 bar. Une fois le milieu évaporé et repris dans le CH2Cl2, celui-ci a été lavé avec NaHCO3 saturé puis avec NaCl saturé. Après purification sur colonne semi-préparative (gradient 3) puis lyophilisation, une poudre blanche (31 mg, 57%) a été obtenue. Rf (AcOEt/MeOH 90/10 + E NEW: 0.1. Tr (gradient 1): 1251. Pf: 177-1780C. RMN (400 MHz, DMSO-c/6): Ô 10.30 (si, 1 H), 8.74 (si, 2 H), 7.58-7.53 (m, 2 H), 7.49-7.44 (m, 2 H), 7.39-7.29 (m, 9 H) , 7.14-7.09 (m, 3 H), 6.76 (d, J = 7.1 Hz, 1 H), 10 4.73 (st, 1 1-1), 4.58 (si, 1 H), 2.82 (t, J = 11.3 Hz, 1 H), 2.19 (st, 1 H), 1.92 (si, 1 H), 1.65 (si, 2 H). HR-MS (El) calculé : 462.2176, trouvé : 462.2171.

Exemple 4 15 18 Un mélange du composé de l'exemple 3 (41 mg, 0,09 mmol), de Boc-B-Ala-OH 2 mg, 0,13 mmol) en présence de PyBOP (70 mg, 0,13 mmol) et de DIEA (70 pL, 0,40 mmol) dans le DMF (1,5 mL) a été agité sous argon pendant 15 min. Une fois le DMF évaporé et le résidu repris dans TFA/CH2Cl2. (50/50) (2 mL), le mélange a été agité 1 min 20 avant d'être évaporé. Le résidu a été purifié sur colonne semi-préparative (gradient 3) pour obtenir après lyophilisation une poudre grise (42 g, 90°l0}. Pf: 184 °C ; Tr (gradient 2): 3.79. H RMN (400 MHz, DMSO-c/6): Ô 10.30 (si, 1 H, NH), 8.81 (d, J = 7.2 Hz, 1 H, NH}, 7.75 (si, 2 H, NH2), 7.58-7.52 (m, 2 H), 7.49-7.44 (m, 2 H), 7.38-7.28 (m, 8 H}, 7.24-25 7.20 (m, 3 fi), 7.01 (t, J = 7.2 Hz, 1 H,), 6.66 (d, 1= 7.2 Hz, 1 H), 5.20 (si, 1 H), 4.47 , 3.08 (si, 2 H), 2.92 (t, J = 11.2 Hz, 2.67 (si, 2 H), 2.01 (s .88 1.60 (si, 2 H 0 .> yNH2 HN 19 HR-MS (El) calculé : 533.2547, trouvé : 533.2567. Préparation 10 4-DMAP 0 NH2 77% 24 Une solution contenant de 'anhydride succinique (150 mg, 1,49 mmol) et de la propargylamine (85 pL, 1,24 mmol) a été agitée à TA pendant 1 h en présence de 4-DMAP (152 mg, 1,24 mmol) dans le CH2Cl2 (4 mL). Le milieu a été extrait avec Na2CO3 5% puis la phase aqueuse a été acidifiée avec HCI IN. Le produit a été extrait avec AcOEt, séché sur Na2SO4 puis sous vide. Une poudre blanche (149 mg, 77%) a été obtenue. Rf (CH2Cl2/MeOH + AcOH): 0.5. Pf: 98-1000C. 1H RMN 300 MHz, CDCI3): $5 7.17 (st, 1 H), 3.91 (s, 2 H), 2.58-2.39 (m, 4 ), 2.18 (s, 1 H). 13C RMN (75 MHz, CDCI3): Ô 175.6, 172.6, 79.5, 71.4, 30.5, 29.3, 29.1.

Préparation 11 HAN 0

)LY-1 HN 0 N H PyBOP, DIEA, DMF anh 87% 18 N H 21 Une solution contenant le composé de l'exemple 3 (15 g, 0,10 mmol en présence de PyBOP (61 mg, 0,12 mmol) et de DIEA (51 pL, 0,29 mmol) dans le DMF anhydre (0,3 mL) a été agitée 5 min à TA puis la solution contenant le composé de la préparation 10 (54 mg, 0,117 mmol) dans le DMF anhydre (0,6 mL) a été ajoutée lentement. Le mélange a été agité à TA pendant 16 h. Une fois évaporé, le résidu, repris dans 5 d'AcOEt, a été lavé avec NaHCO3 saturé puis NaCl saturé. Après séchage de la phase organique sur Na2SO4 et évaporation, une huile incolore (47 mg, 87%) a été obtenue.

Tr (gradient 1): 14.18. 1H RMN 400 MHz, CD30D : ô 7.50 (t, J = 7.6 Hz, 2 H), 7.36-7.4 , 4 H), 7.15-7.28

(m, 10 Fi), 6.95 (t, J = 7.8 Fiz, 1 1-1), 5.24-5.27 (m, 3.93 = 2.2 Hz, 2 H), 3.27

4 ), 2.60-2.67 (m, 2 H), 2.52-2.55 (m, 3 H}, .97-206 (m, 2 H 1.60-1.67 (m, 2 Fi), 1.25 ppm (s, 1 H).

13C RMN (75 MHz, CD30D): Ô 141.9, 141.9, 141.4, 141.4, 141.4, 141.4, 140.4, 137.8, 132.5, 131.4, 131.3, 130.3, 129.7, 129.6, 129.5, 129.5, 128.9, 128.6, 128.5, 128.4, 125.6, 120.1, 80.7, 72.3, 51.8, 48.0, 32.7, 31.9, 30.8, 29.6, 26.6.

MS (ES) tn/z 599.2 ([M+H]». 0 Préparation 12 S H2N N3 H N N -"---- 0----'-o--" 0'--' N3 H 22 23 On a ajouté à O°C et sous argon de la 11-azido-3,6,9-trioxaundecan-l-amine (43 pL, 0,21 mmol) à une solution dlsothiocyanate de fluorescéine (100 mg, 0,26 mmol) en présence de NEt3 (30 pL, 0,21 mmol), dans le DMF (3 mL). Le mélange réactionnel a été agité à TA pendant 2 h et le DMF a été évaporé. Après purification par flash chromatographie (gradient 5) et lyophilisation, une poudre orange a été obtenue (140 mg, 87%). Tr (gradient 1): 12.85. Pf : 116-118'C. 1H RMN (400 MHz, CD30D): 5 8.16 (s, , 7.78 (d, = 8.0 Hz, 1 H), 7.15 (d, J = 8.0 20 Hz, 1 H), 6.69-6.67 (m, 4 H), 6.55 (s, 1 H), 6.53 (s, 1 H), 3.81 (si, 2 H 3.72-3.61 (m, 13 H), 3.34-3.31 (m, 3 H). 3c RMN 75 MHz, CD30D): Ô 171.6, 161.7, 154.3, 130.3, 125.8, 113.7, 111.6, 103.7, 71.8, 71.7, 71.6, 71.5, 71.2, 51.9, 45.7. HRMS El): calculé pour C29H3ON508S 608.1810, trouvé : 608.1823. HO , HO NEt3, DMF 87% NCS 2 Exemple 5 21 24 A une solution contenant le composé de la préparation 11 2 g, 0,04 mmol} et e composé de la préparation 12 (26 mg, 0,04 mmol) dans un mélange DMF/H20 (90/10)

(0,8 mL) ont été ajoutés une solution d'ascorbate de sodium (1 mg, 0,005 mmol) dans un minimum d'H20 puis de la TBTA (2 mg, 0,005 mmol) dans un minimum de DMF et enfin du CuSO4.5H2O (0,6 mg, 0,004 mmol) dans l'H20. Après 5 h d'agitation à TA, le DMF a été évaporé et le résidu purifié par chromatographie sur colonne semipréparative (gradient 4). Une poudre orange (12 mg, 26%) a été obtenue après

0 lyophilisation.

Rf (CH2Cl2/MeOH 95/5 + 1% AcOH . 0.7. Tr (gradient 1): 14.48. Pf: 154-155°C. HRMS (El) calculé : 1205.4317, trouvé : 1205.4412. Préparation r-1 I 0 CHO311VIe0H Bn-N NH + ^- Bn-N N / 94% 15 25 26 27 A une solution d'acrylate de tert-butyle {i2,8 g, 100 mmol) dans un mélange de CHCI3/MeOH 50/50 (10 mL) a été ajoutée de la N-benzylpipérazine (588 mg, 3,33 mmol). Le milieu réactionnel a été agité à reflux (80 0C) pendant 8 h. Il a été évaporé puis dilué dans le CH202 pour être filtré sur silice (éluant CH202). Une huile incolore 20 (950 mg, 94% a été obtenue après évaporation du filtrat. Rf (CH2C12/MeOH 92/8) : 0.7. 1H RMN (300 MHz, CDC13): Ô 7.32-7.26 (m, 5 H s, 2 H}, 2.67 (t, = 7.0 Hz, 2 H), 2.50 (si, 8 2.41 7.0 Hz, 2 s 9H). 29 o Préparation 4 A une solution du composé de la préparation 13 940 mg, 3,1 mmol) dans le MeOH (20 mL) a été ajouté du Pd/C 10% (200 mg). Le mélange a été agité 15 h sous H2 (2 bars)

puis le milieu a été filtré sur Celite@ pour donner après évaporation une huile incolore (650 g, 98%). Le produit est utilisé dans la suite de la synthèse sans purification supplémentaire. Préparation 15 r N 27 30 0 Lissamine-SOCl2 DIEA, CH2Cl2 HN N 47°10 28 0

r-N 02S-N N--/ 0--< 29 A une solution du chlorure de sulfonyle de la lissamine rhodamine B (4,53 g, 7,88 mmol) dans le CH202 (50 mL) a été ajouté le composé de la préparation 14 (1,94 g, 9 mmol), puis de la DIEA (6 mL, 34,45 mmol). Le mélange a été agité une nuit à TA puis a été évaporé. Après purification par chromatographie sur colonne de silice (CH2Cl2JMeOH 97/3), on a obtenu deux produits, à savoir les isomères ortho et para de la lissamine. Après lyophilisation Isomère para a été obtenu sous la forme d'une poudre rose (2,81 g, 47°10). MS (ES) m/z 756.2 ( M+H Préparation 16 TFAM20 9515 CH2Cl2 -0 S 0 ~OH 02S-N N 96% N+ 29 30 N+ A une solution contenant le composé de la préparation 15 (2,1 g, 2,78 mmol) dans le CH2Cl2 (100 L) a été ajouté un mélange TFA/H20 95/5 (100 mL). Le mélange a été agité à TA pendant 24 h avant d'être évaporé. Le résidu huileux a été solubilisé dans le CH2Cl2 pour être précipité dans l'Et20. Un solide rose sombre (2,18 g, 96 a été obtenu après filtration. Tr (gradient 1): 11.97. 1H RMN (400 MHz, DMSO d6): Ô 8.09 d, 1.9 Hz, 1 H}, 7.75 (dd, 1= 8.1, 1.9 Hz, 1 H), 7.37 (d, .1= 8.1 Hz, 1 H), 6.81-6.73 (m, 6 H 3.45-3.39 ( 8 H), 3.24-2.77 (m, 8 H), 2.50 (t, .1= 7.4 Hz, 2 H), 2.28-2.26 (m, 12 H). 13c RMN (75 MHz, DMSO-c/6): ô 171.3, 157.1, 156.8, 155.0, 148.3, 135.4, 134.5, 132.6, 131.3, 127.8, 126.5, 114.8, 113.5, 113.4, 95.5, 51.4, 50.5, 45.3, 43.2, 28.5, 10 12.4. HR-MS (El) calculé pour C34H43N408S2 699.2517, trouvé : 699.2543.

Préparation 17 Lissamine-SOCl2 DIEA NH2. lia CH2Cl2 59% 31 15 On a ajouté du 3-[2-(2-aminométhoxyéthoxy)éthoxy]propionate de ter-butyle (1,83 g, 6,6 mmol) puis de la DIEA (6 mL, 34,45 mmol) à O°C à une solution de chlorure de sulfonyle de la lissamine rhodamine B (3,46 g, 6 mmol) dans le CH2Cl2 anhydre (90 mL). Le mélange a été agité 2 h à TA puis il a été dilué avec CH2M (8 mL) pour être extrait avec HCI 0,1 N puis avec NaCl saturé. Après séchage de la phase organique sur 20 Na2SO4, évaporation et purification par chromatographie sur colonne de silice (CH2Cl2/MeOH 95/5), une poudre rose sombre 2,9 g, 59% a été obtenue. MS (ES) m/z818.2 ([M+H]+). 32 Préparation 18 o A une solution du composé de la préparation 7 2,9 g, 3,55 mmol) dans le CH2Cl2 (50 mL) a été ajouté un mélange TFA/H20 95/5 (50 mL). Le mélange a été agité à TA pendant 3 h avant d'être évaporé. Le résidu huileux a été solubilisé dans le CH2Cl2 pour être précipité dans l'Et2O. Un solide rose sombre (2,45 g, 91%) a été obtenu après filtration. Tr (gradient 1): 13.43. 1H RMN (400 MHz, CDCI3): ô 8.65 (s, 1 H), 7.91 d, = 8.0 Hz, 1 H), 7.16 (d, 1= 8.0 0 Hz, 1 H), 7.06 (d, 1= 9.5 Hz, 2 H), 6.71 (dd, = 9.5, 2.5 Hz, 2 H), 6.60 (d, 1= 2.3 Hz, 2 H), 3.63 (t, 1= 6.5 Hz, 2 H), 3.52-3.41 (m, 18 H), 3.10 (t, 1= 5.3 Hz, 2 1-1), 2.45 (t, = 6.4 Hz, 2 H), 1.17 (t, = 7.2 Hz, 12 H). 13C RMN (75 MHz, CDCI3): Ô 173.7, 157.8, 157.6, 155.5, 146.9, 142.2, 133.7, 132.9, 130.2, 127.5, 126.9, 114.1, 113.6, 95.7, 70.4, 70.3, 70.2, 70.1, 69.7, 66.6, 45.8, 42.9, 34.8, 12.4. MS (ES) m/z 762.1 ([M+H]+).

Préparation 19 HCI .H2N 20 On a ajouté, à 00C, de la DIEA 9 mL, 5,20 mmol) à une solution de 5- aminopentanoate de tert-butyle (200 g, 0,9 mol) et de chlorure de sulfonyle de la lissamine rhodamine B (501 mg, 0,87 mmol) en présence de 4-DMAP (11 mg, 0,09 mmol) dans le mélange CH2Cl2/DMF 80/20 (9 mL). Le mélange a été agité 30 min à 00C puis une nuit à TA. Le DMF a alors été évaporé et le résidu a été repris dans le CH202 pour être lavé avec HCI (0,1N). Après séchage de la phase organique sur Na2SO4 et évaporation, on a obtenu un résidu qui est utilisé dans la suite de la synthèse sans purification supplémentaire.

Préparation 20 TFAIH20 CH2Cl2 82% HO 02 N-S H 02 N-S H 33a Le composé de la préparation 19 a été repris dans un mélange TFA/H20 (95/5) dans le CH2C12. Le mélange a été agité à TA pendant 3 h avant d'être évaporé. Le résidu huileux a été solubilisé dans le CH2Cl2 pour être précipité dans l'Et20. Un solide rose 10 sombre (470 mg, 82%) a été obtenu après filtration. Tr (gradient 1): 15.42. 1H RMN (400 MHz, DMSO d6): 8.41 d, .7= 1.9 Hz, 1 H), 7.93 (dd, J= 8.1, 1.9 Hz, 1 H), 7.47 (d, 1= 8.1 Hz, 1 H), 7.05 (d, 1= 2.2 Hz, 1 H), 7.03 (d, 1= 2.2 Hz, 1 H), 6.99-6.96 (m, 2 H), 6.94 (d, 1= 2.2 Hz, 2 H), 3.67-3.61 (m, 8 H), 2.89-2.84(m,2 H), 2.19 15 (t, 1= 7.1 Hz, 1 H), 1.53-1.42 (m, 4 H), 1.23-1.19 (m, 12 H). 13C RMN (75 MHz, CDCI3): Ô 157.9, 157.3, 155.7, 142.6, 133.9, 132.9, 130.3, 127.9, 126.8, 1 14.2, 113.8, 95.8, 49.2, 46.2, 45.9, 42.7, 33.5, 28.9, 21.8, 2.5. HR-MS (El) calculé pour C32H40N308S2 658.2251, trouvé : 658.2258.

20 Exemple 6 PyBop, DIEA DMF 67% A une solution du composé de a préparation 16 (1 eq) en présence de PyBOP (1 eq) et de DIEA (5 eq) dans le DMF anhydre a été ajouté le composé de l'exemple 3 (15 g 0,03 mmol, eq). Le mélange réactionnel a été agité 2 h à TA puis e mélange a été évaporé pour être purifié par flash chromatographie (gradient 7). On a ainsi obtenu une poudre rose (24 mg, 67°l0}. Tr (gradient 1): 14.54. Pf: 233-2340C. RMN (400 MHz, CD30D): Ô 8.61 (s, 1 H), 8.02 (d, J = 8.1 Hz, 1 H), 7.53-7.21 (m, 16 H), 7.10-6.94 (m, 10 H), 6.83-6.67 (m, 4 H), 6.59 (d, 1= 7.5 Hz, 1 H), 5.30 (d, J = 10.0 Hz, 1 H), 4.54 (si, 1 H), 3.65-3.54 (m, 8 H), 3.27 (si, 3 H), 3.04 (si, 1 H), 2.87-2.28 (m, 7 H), 2.05 (si, 2 H), 1.66 (si, 2 H), 1.30-1.26 (m, 12 H). 13C RMN (75 MHz, CD30D): Ô 173.5, 171.2, 170.9, 159.1, 157.4, 156.9, 147.6, 141.7, 10 141.2, 139.9, 139.0, 137.4, 135.9, 133.6, 133.5, 132.3, 132.0, 131.2, 130.3, 129.8, 129.5, 129.3, 128.8, 128.6, 128.6, 128.4, 128.3, 125.6, 119.9, 115.1, 114.9, 96.9, 54.9, 53.0, 51.6, 47.2, 46.8, 34.0, 32.4, 26.3, 13.0. HR-MS (El) calculé pour C64H68N7O9S2 1142.4514, trouvé : 1142.4495.

15 Exemple 7 H N-Lissamine 0 >-r-c' HN N H 18 Ce composé a été obtenu sous la forme d'une poudre rose (15 mg, 40%) selon le protocole décrit à l'exemple 6 en utilisant le composé de la préparation 18 5 mg, 0,03 mmol) à la place du composé de la préparation 16. 20 Tr (gradient 1): 15.54. Pf: 182-183 °C. 1H RMN (400 MHz, CDCI3): ô 8.83 (s, 1 H), 8.0 d, = 7.9 Hz, 1 H), 7.73 (d, J = 7.9 Hz, 1 H), 7.46 (d, J = 7.6 Hz, 1 H), 7.41-7.27 (m, 0 H), 7.21-7.18 (m, 3 H), 7.06 (t, J = 7.7 Hz, 2 H), 6.85-6.73 (m, 4 H), 6.64 (si, 2 ), 6.47 (d, J = 7.6 Hz, 1 H), 5.18 (si, 1 H), 4.50 (sl 1 H), 3.85 (t, J = 6.2 Hz, 2 H), 3.71-3.65 (m, 10 H), 3.56-3.46 (m, 10 H), 25 3.25 (si, 2 2.92 (si, 1 H}, 1.90 (si, 2 H 1.63 sl, 1 H}, 1.54 (si, 1 H), 1.27-1.24 (m, 12 H).

C RMN (75 MHz, CDCI3): ô 158.4, 158.0, 155.8, 142.7, 140.9, 139.9, 139.1, 133.8, 133.4, 130.8, 130.5, 130.2, 129.8, 129.5, 129.1, 128.8, 128.3, 128,2, 127,9, 127,9, 127,6, 127,4, 127,3, 125,1, 118,8, 114,5, 113,9, 95.9, 77.4, 70.5, 70.4, 70.4, 70.3, 69.9, 67.9, 50.9, 46.9, 46.1, 43.3, 36.8, 31.2, 25.6, 12.8. HR-MS (El) calculé pour C66H73N6012S2 1205.4722, trouvé : 1205.4703.

Exemple 8 PyBOP, Dl DMF, 34 50% 18 /Lissamine N H Ce composé a été obtenu sous la forme d'une poudre rose (5 mg, 50%) selon le 10 protocole décrit à l'exemple 6 en utilisant le composé de la préparation 20 (4 mg, 0,01 mmol) à la place du composé de la préparation 16. Tr (gradient 1): 15.54. Pf: 202-203 °C. 1H RMN (400 MHz, CDCI3): Ô 8.65 (s, 1 H), 7.98 (d, J = 8.0 Hz, 1 H), 7.57 (d, J = 7.9 Hz, 1 H), 7.40 (d, J = 7.7 Hz, 1 H), 7.32 (d, J = 6.8 Hz, 4 H), 7.23-7.16 (m, 7 H), 7.11- 15 7.04 (m, 5 H), 6.84 (t, J=7.5 Hz, 1 H), 6.76 ( td, J = 9.5, 2.3 Hz, 2 Fi), 6.63 (si, 2 H), 6.46 (s, J = 7.5 Hz, 1 H), 5.19 (d, J = 10.4 Hz, 1 Fi), 4.46 (si, 1 H), 3.53-3.46 (m, 8 H), 3.30-3.29 (m, 1 H), 2.95 (si, 1 H), 2.27 (t, J = 7.6 Hz, 2 H), 1.99 (si, 1 H), 1.88 (si, 1 H), 1.75-1.66 (m, 2 H), 1.59-1.51 (m, 4 H), 1.35-1.30 (m, 4 Fi), 1.24-1.20 (m, 12 H). 13C RMN (75 MHz, CDCI3): 169.9, 158.9, 157.9, 155.7, 146.8, 145.8, 142.9, 140.6, 20 139.9, 138.7, 135.8, 133.6, 132.9, 130.5, 130.3, 129.5, 128.7, 128.6, 128.4, 127.8, 127.6, 127. 5, 126.8, 124.3, 118.7, 114,2, 113.8, 95.8, 54.4, 46.8, 45.9, 42.6, 42.6, 35.6, 31.2, 29.1, 22.9, 12.6. HR-MS (El) calculé pour C62H65N609S2. 1101.4249, trouvé: 1101.4245.

Exemple 9 H2N lfissamine HN Lissamine-S02CI MEA, OMAR CH2CIAMF 62% 18 N H A une solution du composé de 'exemple 12 g 0,03 mmol) et de chlorure de sulfonyle de la lissamine rhodamine B (23 mg, 0,04 mmol) dans un mélange de CH2Cl2/DMF 50/50 (0,4 mL) ont été ajoutées successivement de la 4-DMAP (1 mg) et de la DIEA (23 SIL, 0,13 mmol). Le mélange réactionnel a été agité à TA pendant 1 h et e mélange CH2Cl2JDMF a été évaporé. Après purification par flash chromatographie (gradient 7) et lyophilisation, une poudre rose (16 mg, 62%) a été obtenue. Tr (gradient 1): 15.09. Pf: 234 °C.

RMN (400 MHz, CDCI3): 8.92 (s, 1 H), 8.04 (d, 1= 8.0 Hz, 1 H), 7.72 (s, 1 H), 7.55 (d, 1= 7.9 Hz, 1 H), 7.38 (d, 1= 7.3 Hz, 2H), 7.27-7.25 (m, 5 H), 7.19 (d, 1= 8.2 Hz, 2 1-1), 7.12 (d, 1= 8.2 Hz, 2 H), 7.02 (d, 1= 8.2 Hz, 2 H), 6.96 (t, 1= 10.5 Hz, 2 H), 6.81 (t, 1= 7.5 Hz, 1H),6.64-6.57(m,5 H), 6.46 (d, 1= 7.4 Hz, 1 H), 4.86 (d, = 9.5 Hz, 1 H), 4.34 (t, = 9.4 Hz, 1 H), 3.54-3.43 ( 8 H), 3.00 (t, 1= 9.4 Hz, 1 H), 2.09 (si, 2 H), 1.83 (st, 1 H), 1.23-1.18 (m, 12 H). nC RMN (75 MHz, CDCI3): Ô 167.5, 158.1, 158.0, 155.7, 140.3, 140.1, 137.6, 135.3, 13 3.8, 13 3.6, 133.5, 131.2, 13 0.6, 130.5, 13 0.2, 129.2, 12 9.1, 12 8.8, 128.8, 12 8.4, 127.9, 127.6, 127.5, 127.4, 126.5, 118.9, 114.5, 114.5, 113.8, 95.7, 54.6, 46.5, 46.0, 33.2, 25.1, 12.8.

HR-MS (El) calculé pour C57H56N508S2. 1002.3565, trouvé: 1002.3568.

Préparation 21 Tsa Et.3N B OH Boc` 0 Tos 39 A une solution de 2-hydroxyéthylcarbamate de ert-butyle (220 mg, 1,42 mmol) dans le CH202, ont été ajoutés du chlorure de tosy e (406 mg, 2,13 mmol) puis à 00C de la NEt3 0,4 mL, 2,84 mmol). Le milieu réactionnel a alors été agité 10 min à 00C puis 2 h H N DOM 83% à TA. Après évaporation, le résidu a été purifié par flash chromatographie ep AcOEt 80/20) pour obtenir une poudre blanche (370 g 8 Rf (Hept/AcOEt 50/50): 0.6. (off: 63-640C. 1H RMN (400 MHz, CDCI3): 3 7.69 (d, J = 7.6 Hz, 2 Fi), 7.26 (d, J = 7.6 Hz, 2 4.97 (si, 1 H), 3.98 (t, 1= 4.9 Hz, 2 H), 3.28 (si, 2 H), 2.53 (s, 3 H), 1.31 (s, 9 Fi). 13C RMN 75 MHz, CDCI3): 8 155.7, 145.0, 132.7, 130.0, 127.9, 79.7, 69.4, 39.7, 28.3, 21.6. Préparation 22 NaN3 H Boc,N,N3 Tos DMF 40 83% 41 A une solution du composé de la préparation 21 (370 mg, 1,17 mmol) dans le DMF anhydre (3 mL) a été ajouté de l'azoture de sodium (153 mg, 2,35 mmol). La solution a été agitée à 50°C pendant 3 h. Après évaporation du DMF, le résidu a été repris dans l'AcOEt, lavé à l'eau et séché sur Na2SO4. Après évaporation et purification par flash 15 chromatographie (Hept/AcOEt 90/10), une huile incolore (180 mg, 83 9k) a été obtenue. Rf (Hept/AcOEt 50/50): 0.7. 1H RMN (400 MHz, CDC3): 8 3.34 (t, J = 5.1 Hz, 2 H), .23 (t, = 5.1 Hz, 2 H), 1.38 (s, 9 H). 20 13C RMN (75 MHz, CDCI3): 155.9, 79.9, 51.4, 40.3, 28.5. Préparation 23 H DCMITFA Boc'N'''-'N 50150 TFA. 41 98% 42 Une solution du composé de la préparation 22 dans un mélange CH2Cl2/TFA (50/50) a 25 été agitée à TA pendant 2 h. Après évaporation et lyophilisation, une poudre blanche (190 mg, 98 %) a été obtenue. 1H RMN (400 MHz, CD30D): 8 3.68 ( , 5.6 Hz 2 H), 3.90 (t, J = 5.6 Hz, 2 H). nC RMN 7 MHz, CD30D 8 49.6, 40.0. 10 38 Exemple IO NH2 A une solution du composé de la préparation 11 (30 mg, 0,05 mmol, 1 eq.) et du composé de la préparation 23 (1,2 eq.) dans un mélange DMF/H20 (9/1) ont été ajoutés une solution d'ascorbate de sodium (0,1 eq.) dans un minimum d'H20 puis du CuSO4.5H2O (0,1 eq.) dans l'H20. Après 2 h d'agitation à TA, le DMF a été évaporé et le résidu purifié par chromatographie sur colonne semi-préparative (gradient 3). Après lyophilisation, une poudre blanche (10 mg, 29 °Io) a été obtenue. Tr (gradient 1): 8.08. 10 RMN (400 MHz, CD30D): 8 7.90 (s, 1 H), 7.55 (t, J = 7.8 Hz, 2 H), 7.46 (d, J = 7.8 Hz, 2 H), 7.40 (d, J = 7.8 Hz, 2 H), 7.33-7.23 (m, 8 H), 7.19 (t, J = 7.3 Hz, 1 H), 7.01 (t, J = 7.3 Hz, 1 H), 6.66 (d, 1= 7.3 Hz, 2 H), 5.30 (dd, J = 11.3, 3.5 Hz, 1 H), 5.10-4.94 (m, 2 H), 4.60-4.33 (m, 6 H), 2.74-2.71 (m, 2 H), 2.62-2.58 (m, 2 H), 2.14-2.00 (m, 2 H), 1.72-1.67 (m, 2 H). 15 HR-MS El): calculé pour C39H40N8O4. 684.3173, trouvé: 685.3254 [M+H]÷.

Exemple Il NH2 0 Nom/ N3 ~°l H2 6 44 Ascorbate de sodium CuSO4, 5H20 M.4F/H20 (90110) 33% o 21 Le composé du titre a été obtenu à partir du composé de la préparation 11 (23 mg, 20 0,04 mmol) e de 20-azido-3,6,9,12,15,18-hexaoxoéicosan-l-amine (disponible auprès de la société Iris Biotech G bH) en suivant le protocole décrit à l'exemple 10. Après purification par chromatographie sur colonne semi-préparative (gradient 3) et lyophilisation, une poudre blanche (12 g 33 %) est obtenue. Tr (gradient 1): 8.34. 1H RMN (400 MHz, CD30D): 3 7.89 (s, 1 H), 7.55 (t, J = 7.8 Hz, 2 Fi), 7.46 d, = 7.8 Hz, 2 H), 7.41 (d, 1= 7.8 Hz, 2 H), 7.33-7.24 (m, 8 H), 7.20 (t, J = 7.3 Hz, 1 H), 7.01 (t, J = 7.4 Hz, 1 H), 6.66 (d, J = 7.4 Hz, 2 H), 5.31 (dd, J = 11.4, 3.5 Hz, 1 Fi), 4.59-4.38 (m, 6 H), 3.77 (t, J = 4.8 Hz, 2 H), 3.71-3.54 (m, 22 H), 3.09-3.07 (m, 2 H), 2.74-2.70 (m, 2 H), 2.61-2.57 (m, 2 fi), 2.15-2.00 (m, 2 H), 1.74-1.65 (m, 2 H).

HR-MS (El): calculé pour C51HEAN8010. 949.4745, trouvé: 948.4826 [M+H]+.

Exemple 12 H N Ce' N H HN,Dy647 On a introduit dans un tube Eppendorf une solution du composé de l'exemple 1 (2 pmol, 87 pL, 23 nM) dans du DMSO anhydre. A cette solution ont été ajoutées une solution de DY647-NHS (1,52 mg, 2 pmol) dissous dans du DMSO anhydre (152 pL), puis de la DIEA (5 pL, 14,7 pmol). Le mélange a été agité à température ambiante e sous atmosphère inerte pendant 1 h. L'avancement de la réaction a été suivi par HPLC. Après cette période, la réaction était totale. La solution a été diluée dans une solution de MeCN contenant 0,2% d'acide trifluoroacétique (8 mL) puis a été purifiée par HPLC préparative (gradient 5). Les fractions ont été collectées et concentrées sous pression réduite pour donner un solide bleu (1,48 pmol, 74%). SM (ESI) m/z:1443 (M+H+ 721.52 [(M+2H 2 2 Exemple 13 On a introduit dans un tube Eppendorf une solution du composé de 'exemple 1 (400 nmol, 17,5 pL, 22,7 nM) dans du DMSO anhydre. A cette solution ont été ajoutées une solution de Lumi4-Tb-NHS (400 nmol) dissous dans du DMSO anhydre (56 pL), puis de la DIEA (1 pL, 2,94 pmol). Le mélange a été agité à température ambiante et sous atmosphère inerte pendant 1 h. L'avancement de la réaction a été suivi par HPLC. Après cette période, la réaction était totale. La solution a été diluée dans une solution d'acétate de triéthylamine à 25 mM, pH 7 (8 mL) puis a été purifiée par HPLC préparative (gradient 6). Les fractions ont été collectées et concentrées sous pression réduite pour donner un solide blanc (180 nmol, 450/0). SM (ESI) m/z: 1117.02 [(M+2H)2+]/2.

Exemple 14 On a introduit dans un tube Eppendorf une solution du composé de l'exemple 1 400 nmol, 17,6 pL, 22,7 nM) dans du DMSO anhydre. A cette solution ont été ajoutées une Biot= 4015 solution de Biotine-NHS 0,16 mg, 480 nmol) dissous dans du DMSO anhydre (100 p puis de la DIEA (0,1 pL, 290 nmol). Le mélange a été agité à température ambiante e sous atmosphère inerte pendant 1 h. L'avancement de la réaction a été suivi par HPLC. Après cette période, la réaction était totale. La solution a été diluée dans une solution de MeCN contenant 0,2% d'acide trifluoroacétique (8 mL) puis a été purifiée par HPLC préparative (gradient 5). Les fractions ont été collectées et concentrées sous pression réduite pour donner un solide blanc (310 nmol, 77%). SM (ESI) m/z. 1043.85 (M+H)+.

Exemple 15 DY 647 \N=N H 49 Ce composé (405 nmol, 40%) a été obtenu en utilisant le protocole décrit à l'exemple 12 à partir du composé de l'exemple 10 (1 pmol). SM (ESI) m/z : 1310.98 (M+H)+. 50 Ce composé (165 nmol, 16°l0) a été obtenu en utilisant le protocole décrit à l'exemple 13 à partir du composé de l'exemple 10 (1 p ol SM (ESI) mjz : 1061.29 20 (M+H+Na 2. 42 Exemple 17 467 51 Ce composé (890 nmol, 89%) a été obtenu en utilisant le protocole décrit à l'exemple 12 à partir du composé de l'exemple 11 1 pmol). SM (ESI) m/z : 1574.43 (M+ )+. Exemple 18 i4Tb 51 Ce composé (380 nmol, 38%) a été obtenu en utilisant le protocole décrit à l'exemple 13 à partir du composé de l'exemple 11 (1 pmol). SM (ESI) m/z : 1193.82 10 (M+H+Na)2+/2.

Evaluation biologique des composés A. Dans un premier temps, on a évalué l'affinité (déterminée par un es de liaison en utilisant un radioligand) et l'activité (caractère agoniste/antagoniste du récepteur V2) 15 de composés représentatifs de l'invention fonctionnalisés par la lissamine. L'argininevasopressine (AVP) et la 2-phényl-4'-[1,45,6-tétrahydroimidazo[4,5-d][l]benzazépin-6-yl)-carbonyl] -benzanilide ( Chem Pharm Bull 1997, 45(11), 1870-1874) on été utilisées comme composés de référence. Les résultats sont présentés dans le tableau 1. 20 Tableau 1 Composé Affinité Activité (nM)b (nM}a Kart nad AVP 1,36 t 0,45` 0,29 ± 0,05 - N 0,57 f 0,18 - 0,096 t 0,030 N 1 Exemple 2* 4,0 ± 0,7 - 1,96 f 0,34 Exemple 6 12,7 ± 0,7 - 2,03 ± 0,04 Exemple 7 16,8 ± 1,0 - 8,91 ± 0,49 Exemple 8 7,6 ± 0,7 - 0,66 t 0,12 Exemple 9 25,3 ± 2,5 - 3,80 f 0,36 * isomère para a La constante d'inhibition Ki des composes testés pour le récepteur humain de la vasopressine (V2R) a été déterminée sur des membranes cellulaires CHO (Chinese Hamster Ovary) par dosage de liaison par compétition (déplacement de [3H]AVP). b Les constantes Kas et K;nact des composes testés ont été déterminées en utilisant des cellules CHO exprimant V2R de manière stable et en mesurant l'accumulation de cAMP. Les résultats sont exprimées sous la forme moyenne écart-type de la moyenne à partir de trois expériences séparées répétées trois fois chacune. Kact traduit le caractère antagoniste d'un composé et K;nact traduit le caractère agoniste d'un composé. ` L'affinité d'AVP a été déterminée directement par dosage de liaison par saturation en utilisant [3H]-AVP comme indiqué ci-dessus afin de calculer le Kd de [3H]-AVP.

Ces résultats montrent le caractère affin et agoniste V2 des composés de Iinvention.

B. On a également évalué l'affinité (déterminée par un test de liaison en utilisant un radioligand), l'activité (caractère agoniste/antagoniste du récepteur V2), et l'application en HTRF de composés représentatifs de l'invention fonctionnalisés par la fluorescéine, le DY647 ou le Lumi4Tb. Les résultats sont présentés dans le tableau 2. 2969605 Tableau 2 Affinité Composé (nM)a Activité (nM)b HTRF-FRET` ± 5,2 9,1 ± 0,3 17,2 ± 3,8 7,3 exemple 5 26 exemple 12 exemple 13 exemple 15 exemple 16 exemple 17 14,6 exemple 18 40,6 0,78 ± 0,21 11 0,052 f 0,005 2,33 ± 1,23 0,095 ± 0,038 3,17 ± 0,78 0,069 ± 0,014 1,38 t 0,56 0,42 t 0,12 2,1 ± 0,87 0,38 0,1 2,53 ± 1,19 3,64 ± 0,86 6,2 ± 2,13 a,b cf tableau 1 ` Ces expériences ont été réalisées avec le récepteur V2 marqué soit avec le Lumi4Tb ou le DY647 selon la nature du ligand utilisé (donneur ou accepteur). Ce 5 récepteur est obtenu après transfection de cellules Cos-7 exprimant le récepteur V2 marqué. Après incubation de 20 h à 4°C, le couple ligand-récepteur est excité à 337 nm et l'émission de fluorescence a été mesurée à 620 nm et 665 nm. Le signal spécifique a été calculé selon l'équation : deltaF=(R-Rneg)/(Rneg) ou R est le rapport de la fluorescence à 665 nm et de la fluorescence à 620 nm, calculé pour chaque 10 essai et Rneg est le même rapport pour les mesures contrôles sans ligand.

Ces résultats montrent le caractère affin et agoniste V2 des composés de l'invention, et leur excellente aptitude à être utilisés dans un test de liaison HTRF.

C. On a également évalué la sélectivité des composés de l'invention vis-à-vis des récepteurs Vl (sous-types Via, Vi)) et V2 de la vasopressine, et du récepteur à l'ocytocine (OT). L'arginine-vasopressine (AVP), la 2-phényl-4'-[1,4,5,6-tétrahydmimidazo[4,5-d][1]benzazépin-6-yl)-carbonyl] -benzanilide (Chem Pharm Bull 1997, 45(111870-1874) ainsi que le composé 17a,b décrit dans Chem Eur J 2008, 20 14, 6247-6254 (isomère ortho = « composé A » ; isomère para = « composé B »), ont été utilisés comme composés de référence. Les résultats sont présentés dans le tableau 3.

Tableau 3 Affinité (K, n V2 Via Vie OT 1,48 ± 0,08b 0,7 0,17 0,49 ± 0,06 1,65 ± 0,49 0,57±0,18 2,74±0,19 nd 109±34 187,7 ± 24,7 >1000 >1000 307 ± 18 54,3 ± 6,6 >1000 >1000 495 ± 101 4,0 ± 0,7 >1000 >1000 >1000 26,1 ± 5,2 >1000 >1000 665 ± 47 9,1 ± 0,3 1753 ± 338 >1000 808 ± 61 17,2 ± 3,8 750 ± 89 >1000 304 ± 70 Ki des composes testés pour les différents récepteurs a été déterminée sur des membranes cellulaires CHO par dosage de liaison par compétition (déplacement de [3H]AVP). Un K,> 1000 indique que le déplacement de [3H]AVP avec le composé testé à une concentration de 10 µM n'a conduit à aucune compétition ou à une inhibition inférieure à 50%. b cf tableau 1

nd non déterminé Ces résultats montrent le caractère agoniste, sélectif (vis-à-vis des récepteurs Via, Vib et OT) et affin des composés de l'invention. Composé AVP * isomère para a La constante d'inhibition composé A composé B exemple 2* exemple 5 exemple 12 exemple 13

Claims (8)

1. REVENDICATIONS1. dans laquelle : R1 est l'hydrogène ou un groupe -COR2; REVENDICATIONS1. dans laquelle : R1 est l'hydrogène ou un groupe -COR2; R2 représente un groupe -(CH2)n,NR3R4 dans lequel m = 2, 3 ou 4 et R3 et R4 représentent 10 chacun l'hydrogène ou R3 et R4 forment un groupe pipérid-4-yle ou pipérazinyle avec l'atome d'azote auxquels ils sont liés ; ou un groupe -(CH2CH2O)n(CH2)pNR3R4 dans lequel n = 3, 4 ou 5, p = 2 ou 3 et R3 et R4 sont tels que définis ci-dessus ; ou un groupe H2 z Q h N=N dans lequel R5 représente un groupe -(CH2)gNR3R4 dans lequel q = 2 ou 3 et R3 et R4 sont tels que définis ci-dessus ; ou un groupe -(CH2CH2O)r(CH2)SNR3R4 dans lequel r = 3, 4, 5 ou 6, s = 2 ou 3 et R3 et R4 sont tels que définis ci-dessus.
2. 2. Composé selon ia revendication 1 dans lequel RI est un groupe -COR2.
3. 3. Composé selon la revendication 2 dans lequel R2 représente un groupe -(CH Z)~,NR3R4 dans lequel m = 2 ou 4 et R3 et R4 représentent chacun l'hydrogène ou 25 R3 et R4 forment un groupe pipérazinyle avec l'atome d'azote auxquels ils sent liés.
4. 4. Composé selon la revendication 2 dans lequel R2 représente un groupe -(CH2CH20XCH2)pNR3R4 dans lequel n = 3 et p = 2. Composé de formule R1HN (I) 15 20
5. 5. Composé selon la revendication 2 dans lequel R2 représente un groupe -R5 dans lequel R5 représente un groupe -(CH2)2NR3R4.
6. 6. Composé selon la revendication 2 dans lequel R2 représente un groupe N-R5 0 N=N dans lequel R5 représente un groupe -(CH2CH20)r(CH2)2NR3R4 dans lequel r = 3 ou 6 et s=2.
7. 7. Ligand fluorescent obtenu par couplage d'un composé de formule (1) tel que défini dans l'une quelconque des revendications 1 à 6 avec un composé fluorescent.
8. 8. Ligand fluorescent selon la revendication 7, dans lequel le composé fluorescent 15 est choisi parmi : les allophycocyanines, en particulier celle connue sous la dénomination commerciale XL665 ; les molécules organiques luminescentes, telles que les rhodamines (en particulier la lissamine rhodamine B), les cyanines, les squaraines, les coumarines, les proflavines, les acridines, les fluorescéines ; les fluorophores connus sous la dénomination Bodipy ; les fluorophores connus sous la dénomination 20 Atto ; les fluorophores connus sous la dénomination Dy, en particulier le composé connu sous la dénomination Dy467 ; les composés connus sous la dénomination AlexaFluor ; le nitrobenzoxadiazole ; les complexes métalliques fluorescents, tels que les cryptates de terre rare, les chélates de terre rare (en particulier les chélates e cryptates d'europium, de terbium, de samarium, de dysprosium, de néodymium, et 2 tout particulièrement le composé connu sous la dénomination Lumi4-Tb); les particules inorganiques luminescentes comme les nanocristaux. Ligand fluorescent selon la revendication 8, dans lequel le composé fluorescent es choisi parmi les rhodamines (en particulier la Iîssamine rhodamine B), les 30 fluorescéines, les fluorophores connus sous la dénomination Dy (en particulier le H Y2 - C . 2 Il 0 N=--N 0 (CH2 Il )2 -Ccomposé connu sous la dénomination Dy467), et les c ptates de terre rare en particulier le composé connu sous a dénomination Lumi4-Tb). 10. Composé de formule (II) ou (III) : HN (m) 11. Utilisation d'un ligand fluorescent tel que défini dans l'une quelconque des revendications 7 à 9 dans un test de liaison sur le récepteur V2 de la vasopressine. 12. Utilisation d'un ligand fluorescent tel que défini dans 'une quelconque des revendications 7 à 9 pour le marquage ou la visualisation du récepteur V2.