FR2960291A1 - Methode et dispositif de microscopie interferentielle plein champ a haute resolution - Google Patents

Abstract

L'invention concerne un dispositif de microscopie interférentielle plein champ en lumière incohérente d'un échantillon volumique et diffusant (106). Le dispositif comprend un dispositif d'interférence (100) entre une onde de référence (401) obtenue par réflexion d'une onde incidente sur un miroir (105) d'un bras de référence du dispositif d'interférence et une onde objet (402) obtenue par rétrodiffusion de l'onde incidente par une tranche de l'échantillon, un dispositif d'acquisition (108) d'au moins un premier signal d'interférence et d'au moins un second signal d'interférence résultant de l'interférence des ondes de référence et objet, les au moins deux signaux d'interférence présentant un déphasage, une unité de traitement (403) des signaux d'interférence pour calculer une image de la tranche de l'échantillon. Selon un aspect, le dispositif d'interférence comprend en outre un élément optique (404) de modification de la phase du front d'onde et le dispositif de microscopie comprend une unité de contrôle (405) dudit élément optique, reliée à l'unité de traitement (403), l'élément optique de modification de la phase étant contrôlé par optimisation d'un paramètre statistique d'au moins une partie de l'image calculée par l'unité de traitement.

Description

METHODE ET DISPOSITIF DE MICROSCOPIE INTERFERENTIELLE PLEIN CHAMP A HAUTE RESOLUTION ETAT DE L'ART Domaine technique de l'invention La présente invention concerne une méthode et un dispositif de microscopie interférentielle plein champ à haute résolution, notamment pour l'imagerie cellulaire. Etat de l'art La figure 1 présente un schéma de principe d'un microscope interférentiel plein champ en lumière incohérente ou microscope par cohérence optique plein champ, basée sur une technique d'imagerie également connue sous le nom d'OCT plein champ (OCT étant l'abréviation de l'acronyme « Optical Cohence Tomography »). Cette technique d'imagerie est par exemple décrite dans l'article « Full-field optical coherence tmography » de A.

Dubois et C. Boccara, extrait de l'ouvrage « Optical Coherence Tomography - Technology and Applications » - Wolfgang Drexler - James G. Fujimoto - Editors - Springer 2009. La microscopie basée sur l'OCT plein champ en lumière faiblement cohérente est également décrite dans la demande de brevet français FR2817030. Le dispositif 1, tel qu'illustré sur la figure 1, s'articule autour d'un interféromètre de Michelson 100 éclairé par une source 101 de faible longueur de cohérence, par exemple une lampe halogène. L'interféromètre comprend un élément séparateur de faisceau 102, par exemple un cube séparateur non polarisant, formant deux bras, et dans ces deux bras, se trouvent deux objectifs de microscope identiques 103, 104. Un tel dispositif est appelé interféromètre de Linnik. Dans l'un des bras, qui sera par la suite nommé bras de référence, se trouve une surface plane 105 de réflectivité uniforme, placée dans le plan focal objet de l'objectif de microscope 104. Dans l'autre bras, qui sera par la suite nommé bras objet, se trouve un échantillon 106, volumique et diffusant, dont on souhaite reconstruire la cartographie tridimensionnelle de l'amplitude de rétrodiffusion. En sortie de cet interféromètre, un doublet achromatique de grande focale, typiquement 300mm, permet de conjuguer les plans focaux objets des deux objectifs sur un capteur multicanal 108, par exemple une caméra CCD. Pour bénéficier d'une résolution transverse limitée par la diffraction, la focale de cette lentille est choisie de sorte à ne pas sous échantillonner la fonction d'étalement d'un objet ponctuel ou PSF (acronyme de « Point Spread Function ») des objectifs. Des lames de verre 109, 110 sont prévues sur chacun des bras pour compenser la dispersion. La source de lumière 101 ayant une faible longueur de cohérence, des interférences entre la lumière réfléchie par la surface de référence 105 et celle rétrodiffusée par l'échantillon 106 n'ont lieu que lorsque les chemins optiques dans les deux bras sont égaux, à la longueur de cohérence effective près. Il existe donc une tranche virtuelle dans l'objet, appelée tranche de cohérence, pour laquelle l'information de rétrodiffusion est relative à l'état d'interférence perçue par la caméra. La lumière rétrodiffusée de part et d'autre de cette tranche n'étant pas cohérente avec celle réfléchie par la référence, elle contribue à un fond global dans le signal. En modulant la différence de marche relative des deux bras de l'interféromètre, par un déplacement axial de la surface de référence 105 au moyen d'une platine piézo-électrique 111, seul l'état d'interférence portant l'information de la tranche de cohérence est modulé, le fond restant constant. Une synchronisation de cette modulation avec la prise d'images par la caméra permet d'enregistrer différents états d'interférence. Une combinaison non linéaire des images permet ensuite de démoduler l'information de la tranche de cohérence, et de discriminer ainsi l'information des photons balistiques rétrodiffusés uniquement par cette tranche, de l'information de ceux ayant subi une diffusion ailleurs dans l'échantillon. L'intensité enregistrée en chaque pixel de la caméra contenant un terme constant et un terme modulé, lui-même composé d'une amplitude et d'une phase, trois états d'interférence au minimum doivent théoriquement être enregistrés pour extraire l'amplitude complexe du terme modulé. Ces trois phases du signal étant choisies dans une période de modulation, l'amplitude du déplacement de la surface de référence n'excède pas, par conséquent, la demi-longueur d'onde centrale du spectre effectif de l'instrument. Une image tomographique plein champ peut alors être acquise dans le volume de l'échantillon, et un déplacement de ce dernier par rapport au plan de cohérence permet l'enregistrement de l'information tridimensionnelle. Des reconstructions dans toutes les directions, ou d'autres représentations volumiques peuvent ensuite être réalisées. Grâce à la microscopie OCT plein champ, il est ainsi possible d'atteindre avec une source lumineuse de bande spectrale supérieure à 300 nm centrée vers 750 nm par exemple une résolution spatiale anatomopathologique correspondant à une résolution cellulaire (environ 1 micron dans les trois dimensions) à une profondeur atteignant 1 millimètre dans les tissus vivants. Pour ce faire, il est généralement prévu de faire fonctionner l'objectif 104 sur le bras de référence en immersion (en général dans l'eau, dont l'indice de réfraction n est de 1,33) avec une correction adaptée des aberrations géométriques et chromatiques. La conservation de cette précision de 1 micron en X, Y et Z à la profondeur requise suppose un milieu homogène (eau pure) d'indice optique fixe pour conserver l'égalité du chemin optique entre le bras de référence et le bras de mesure (objet) de l'interféromètre et ce dans les deux dimensions (sur toute la surface d'analyse). Or, lorsque l'on analyse un tissu biologique, on s'aperçoit d'une part, que l'indice optique macroscopique est rarement égal à celui de l'eau (il est en général supérieur) et d'autre part, qu'il varie localement aussi bien transversalement qu'en profondeur, selon les structures biologiques à analyser. Pour les OCT traditionnels à balayage mécanique ou en fréquence, ces effets sont peu visibles car l'ouverture numérique est faible, ces systèmes travaillant avec une grande profondeur de champ, de l'ordre de la profondeur explorée. En microscopie OCT plein champ, lorsque l'on travaille à haute résolution (résolution de 1 micron dans les trois dimensions), la déposante a montré que ces effets de perte de résolution deviennent sensibles selon les tissus biologiques à observer à des profondeurs comprises entre 20 et 200 microns. Un objectif de la présente invention est de gagner en résolution sur l'image, et par voie de conséquence, en profondeur d'analyse. Pour cela, l'invention consiste à modifier de façon contrôlée en deux dimensions le plan d'onde sur le bras objet de l'interféromètre pour corriger des déformations du front d'onde dans le milieu biologique dues aux variations locales d'indice des différentes cellules traversées par le faisceau lumineux. Pour cela l'invention propose une nouvelle approche de l'Optique Adaptative (OA) asservie grâce aux propriétés statistiques du signal d'OCT.

RESUME DE L'INVENTION Selon un premier aspect, l'invention concerne un dispositif de microscopie interférentielle plein champ en lumière incohérente d'un échantillon volumique et diffusant comprenant une source d'émission d'une onde incidente de bande spectrale donnée, un dispositif d'interférence entre une onde de référence obtenue par réflexion de l'onde incidente sur un miroir d'un bras de référence du dispositif d'interférence et une onde objet obtenue par rétrodiffusion de l'onde incidente par une franche de l'échantillon à une épaisseur donnée, l'échantillon étant disposé sur un bras objet du dispositif d'interférence. Il comprend en outre un dispositif d'acquisition multicanal d'au moins un premier signal d'interférence et d'au moins un second signal d'interférence résultant de l'interférence des ondes de référence et objet, les au moins deux signaux d'interférence présentant un déphasage obtenu en faisant varier la différence de marche relative entre les deux bras du dispositif d'interférence et une unité de traitement des signaux d'interférence pour calculer une image de la tranche de l'échantillon. Le dispositif d'interférence comprend en outre un élément optique de modification de la phase du front d'onde et le dispositif de microscopie comprend une unité de contrôle dudit élément optique, reliée à l'unité de traitement, l'élément optique de modification de la phase étant contrôlé par optimisation d'un paramètre statistique d'au moins une partie de l'image calculée par l'unité de traitement. Selon une variante, l'élément optique de modification de la phase est positionné sur le bras objet, permettant le contrôle de la phase de l'onde incidente sur l'échantillon. Selon une variante, le dispositif d'interférence comprend sur chacun des bras un objectif de microscope et l'élément optique de modification de la phase est positionné sur une pupille ou une image de la pupille de l'objectif de microscope du bras objet. Selon une variante, l'élément optique de déformation de la phase est un miroir 15 déformable. Selon une variante, le calcul de l'image de la tranche de l'échantillon comprend la soustraction d'au moins deux signaux d'interférence présentant un déphasage de it et l'élément optique de modification de la phase est contrôlé par optimisation de l'écart type mesuré sur au moins une partie des valeurs des points de l'image calculée. 20 Selon une variante, le calcul de l'image de la tranche de l'échantillon comprend en outre le calcul de la valeur absolue de ladite soustraction et l'élément optique de modification de la phase est contrôlé par optimisation de la valeur moyenne, de l'écart type ou du contraste, mesuré sur au moins une partie des valeurs des points de l'image calculée. Selon une variante, l'optimisation du paramètre statistique comprend la mesure dudit 25 paramètre pour trois états de l'élément optique de modification de la phase correspondant à l'introduction de respectivement trois valeurs données d'une aberration optique. Selon une variante, le dispositif d'interférence est de type Linnik, comprenant un élément séparateur de faisceau permettant de former lesdits bras objet et de référence, et sur chacun des bras un objectif de microscope. 30 Selon une variante, le dispositif d'interférence comprend sur l'un de ses bras une densité variable et sur l'autre bras une lame de compensation de la différence de marche introduite par la densité variable. Selon un deuxième aspect, l'invention concerne une méthode de microscopie interférentielle plein champ en lumière incohérente d'un échantillon volumique et diffusant 35 comprenant l'émission d'une onde incidente de bande spectrale donnée, l'interférence entre une onde de référence obtenue par réflexion de l'onde incidente sur un miroir d'un bras de référence et une onde objet (402) obtenue par rétrodiffusion de l'onde incidente par une tranche de l'échantillon à une épaisseur donnée, l'échantillon étant disposé sur un bras objet du dispositif d'interférence. Elle comprend en outre l'acquisition d'au moins un premier signal d'interférence et d'au moins un second signal d'interférence résultant de l'interférence des ondes de référence et objet, les au moins deux signaux d'interférence présentant un déphasage obtenu en faisant varier la différence de marche relative entre les deux bras du dispositif d'interférence, le traitement des signaux d'interférence pour calculer une image de la tranche de l'échantillon et le contrôle de la phase de l'onde incidente sur l'échantillon par optimisation d'un paramètre statistique d'au moins une partie de l'image calculée à partir du traitement des signaux d'interférence. Selon une variante, le calcul de l'image de la tranche de l'échantillon comprend la soustraction d'au moins deux signaux d'interférence présentant un déphasage de it et le contrôle de la phase de l'onde incidente sur l'échantillon est effectué par optimisation de l'écart type mesuré sur au moins une partie des valeurs des points de l'image. Selon une variante, le calcul de l'image de la tranche de l'échantillon comprend en outre le calcul de la valeur absolue de ladite soustraction et le contrôle de la phase de l'onde incidente sur l'échantillon est effectué par optimisation de la valeur moyenne, de l'écart type ou du contraste, mesuré sur au moins une partie des valeurs des points de l'image.

Selon une variante, le contrôle de la phase de l'onde incidente sur l'échantillon comprend, pour une aberration optique donnée, la mesure d'un nombre donné de valeurs du paramètre statistique après introduction sur la phase de l'onde incidente sur l'échantillon d'autant de valeurs de ladite aberration optique, le calcul de la valeur de l'aberration rendant maximale la valeur dudit paramètre, l'introduction sur la phase de l'onde incidente sur l'échantillon de ladite valeur de l'aberration. Selon une variante, le nombre de valeurs de l'aberration optique introduite est de trois. BREVE DESCRIPTION DES DESSINS D'autres avantages et caractéristiques de l'invention apparaîtront à la lecture de la description, illustrée par les figures suivantes : - Figures 1 (déjà décrite), un schéma de principe d'un microscope interférentiel plein champ en lumière faiblement cohérente selon l'art antérieur ; - Figure 2, un schéma expliquant l'origine de la nature aléatoire d'un signal OCT ; - Figures 3A à 3C, trois images représentant respectivement une figure de speckle, la superposition de 16 figures de speckle non corrélées, la superposition de 100 figures de speckle non corrélées ; - Figure 4, un exemple de réalisation d'un microscope interférentiel plein champ selon l'invention ; - Figures 5A et 5B deux autres exemples de réalisation d'un microscope interférentiel plein champ selon l'invention.

DESCRIPTION DETAILLEE La présente invention présente une méthode de microscopie interférentielle originale avec optique adaptative, qui utilise une propriété statistique particulière des images acquises par la technique d'imagerie OCT plein champ lors de l'exploration en profondeur de milieux diffusants, liée au caractère aléatoire des signaux.

L'origine du caractère aléatoire d'un signal OCT plein champ est expliquée schématiquement par la figure 2. L'onde incidente 201 est focalisée dans un volume élémentaire de l'échantillon 202, ou voxel. La section du voxel en l'absence d'aberrations est donnée par la tache de diffraction de l'objectif de microscope 103. La tranche d'où revient l'onde rétrodiffusée et qui correspond à la longueur du voxel a une épaisseur L égale à la longueur de cohérence temporelle de la source divisé par deux fois l'indice de réfraction du milieu. L'onde rétrodiffusée 203 résulte de la somme d'ondelettes rétrodiffusées par les structures 204 qui ont des positions aléatoires dans le voxel considéré. L'onde rétrodiffusée est détectée par interférence avec l'onde de référence, non représentée ici. Le caractère aléatoire des structures qui forment l'échantillon donne une allure de speckle aux images OCT. Le mot anglais «speckle » est utilisé de façon courante à la place de « tavelures » pour représenter la granularité laser observée quand un objet diffusant est éclairé par un laser très cohérent. Ici le phénomène décrit est de nature différente mais mathématiquement il peut être représenté dans les deux cas par une marche aléatoire dans le plan complexe (voir par exemple Goodman « Speckle phenomena in optics », Roberts and Company Publishers, October 30 2006). Une image entachée de speckle est représentée sur la figure 3a. Le speckle possède de manière générale une propriété particulière dans la distribution des intensités. Le contraste, égal au rapport de l'écart type à la valeur moyenne de la distribution des intensités, est égal à l'unité. D'une manière générale, les utilisateurs de la microscopie OCT cherchent à se débarrasser autant que possible du speckle dans les images en lissant la distribution des intensités souvent au détriment de la résolution. La déposante a montré que l'on pouvait au contraire tirer parti du caractère aléatoire de l'image OCT et du speckle pour mettre en oeuvre une méthode d'optique adaptative. D'une part, du fait des propriétés de réflexion locale aléatoire des échantillons étudiés, la déposante a montré qu'il est possible d'obtenir une image en intensité de l'échantillon avec seulement deux états d'interférence déphasés de it, obtenus par exemple par deux positions du miroir de référence. L'image est alors calculée en faisant la différence (ou le module de la différence) des deux signaux d'interférence, ce qui supprime le fond tout en gardant l'essentiel des propriétés statistiques de l'image. Par ailleurs, les aberrations géométriques introduites par les hétérogénéités macroscopiques des structures traversées de tailles largement supérieures à celles microscopiques des diffuseurs ont pour conséquence un élargissement de la tache focale de l'onde incidente dans l'échantillon. L'image est alors le produit de convolution de l'image idéale, sans aberrations, par la tache de diffusion qui résulte de la présence d'aberrations. Si la tache occupe une surface correspondant à celle occupée par N grains de speckle alors la convolution de l'image idéale par la tache de diffusion revient à superposer un nombre N de speckles non corrélés, entraînant une division du contraste par la racine carrée de N. A titre d'exemple les figures 3b et 3c représentent la superposition de 16 et de 100 speckles non corrélés. On peut aisément vérifier par calcul sur ces images que le contraste, défini comme le rapport entre l'écart type et la moyenne calculés sur la distribution d'intensités, est bien, respectivement, de 0,25 et 0,1. Le signal OCT obtenu est ainsi directement lié à la présence d'aberrations. Les paramètres statistiques de l'image sont influencés par la présence des aberrations. La convolution de l'image « idéale » par la tache de focalisation entraîne en effet une diminution de la valeur des paramètres statistiques de l'image tels que l'écart type ou l'intensité moyenne. L'invention comprend l'introduction d'une correction variable du front d'onde incident sur l'échantillon permettant de corriger tout ou partie des aberrations introduites par les hétérogénéités macroscopiques des structures dans l'échantillon. Cette correction variable est contrôlée par optimisation d'un des paramètres statistiques de l'image de la tranche de l'échantillon obtenue.

La figure 4 représente un exemple de réalisation d'un dispositif de microscopie interférentiel selon l'invention. Le dispositif 4 de l'exemple de la figure 4 est basé sur l'utilisation d'un interféromètre 100 de type Linnik tel que décrit sur la figure 1. Les éléments identiques sont indiqués par les mêmes références. Le dispositif comprend notamment une source d'émission 101 d'une onde incidente à faible cohérence spatiale et temporelle. Il s'agit par exemple d'une lampe halogène de bande spectrale supérieure à 300 nm, classiquement utilisée comme source d'éclairage de lumière froide en microscopie (voir par exemple la source KL1500 LCD - Cold Light Source de chez Olympus). L'interféromètre 100 comprend un bras de référence avec un objectif de microscope 104 et un miroir de référence 106 monté sur une platine piézo-électrique 111 et un bras objet avec un objectif de microscope 103 identique à l'objectif 104. Par exemple il s'agit d'objectifs à ouverture numérique moyenne (de l'ordre de 0,4), dimensionnés pour travailler en conjugaison infini - foyer, et corrigés du chromatisme sur un spectre large (par exemple la série UMPLFLN-W à immersion de chez Olympus). L'onde incidente émise par la source 101 est séparée par exemple au moyen d'un cube séparateur 102 pour former une onde de référence 401 réfléchie par le miroir de référence sur le bras de référence et une onde objet 402 rétrodiffusée par une tranche d'un échantillon 106 monté par exemple sur une platine du bras de référence. En sortie de l'interféromètre, un doublet achromatique permet de conjuguer les plans focaux objets des deux objectifs sur un dispositif d'acquisition multicanal bidimensionnel 108 (nécessairement bidimensionnel ?), par exemple une caméra CCD. Cette optique est choisie de manière à ce que le grandissement obtenu par combinaison de l'objectif et de ce doublet assure un échantillonnage correct par les pixels du détecteur de la tache de diffraction de l'objectif - au moins 2 pixels par tache de diffraction selon le théorème de Shannon. Les focales typiques vont de 300 à 500 mm en fonction de l'ouverture des objectifs et de la taille des pixels de la caméra. Comme cela a déjà été décrit, la source de lumière 101 ayant une faible longueur de cohérence, des interférences entre la lumière réfléchie par la surface de référence 105 et celle rétrodiffusée par l'échantillon 106 n'ont lieu que lorsque les chemins optiques dans les deux bras sont égaux, à la longueur de cohérence effective près. En faisant varier la différence de marche relative entre les deux bras de l'interféromètre grâce à la platine 111, on introduit un déphasage entre les signaux d'interférence résultant de l'interférence entre l'onde de référence et l'onde objet. Ainsi, typiquement, pour appliquer un déphasage de it en configuration Linnik, il faut appliquer un mouvement de Xo/4n sur le miroir de référence (n étant l'indice du milieu de propagation face au miroir de référence et Xo la longueur d'onde moyenne de la source d'émission, typiquement autour de 750 nm).

Le dispositif 4 comprend par ailleurs une unité de traitement 403 des signaux d'interférence permettant de calculer une image de la franche de l'échantillon. Selon un aspect de l'invention, le dispositif d'interférence 100 comprend un élément optique de modification de la phase du front d'onde et le dispositif 4 comprend une unité de contrôle 405 dudit élément optique, reliée à l'unité de traitement 403. L'élément optique de modification de la phase est par exemple un miroir déformable, à membrane continue ou segmentée ou une matrice à cristaux liquides. Un miroir déformable tel que le modèle Mirao52e (Imagine Eyes - Paris - France) disposant de 52 actuateurs disposés sous une membrane déformable réfléchissante peut convenir.

Avantageusement, l'élément optique de modification de la phase est placé sur le bras objet de l'interféromètre. Cela permet de corriger les aberrations de l'onde objet liées aux hétérogénéités de structure dans l'échantillon afin d'obtenir une onde objet de qualité optique comparable à l'onde de référence et de gagner ainsi en résolution. Avantageusement, l'élément optique de modification de la phase est positionné dans une pupille d'entrée de l'objectif de microscope 103 du bras objet ou une image de la pupille afin que le faisceau reste centré sur ledit élément pour tous les points du champ. Les diverses aberrations qui contribuent à l'élargissement de la tache de diffusion peuvent être associées à des déformations du front d'onde qui peuvent s'exprimer sur une base de polynômes orthogonaux permettant de modifier le niveau d'une aberration présente sans influencer le niveau des autres aberrations. Ces polynômes sont connus sous le nom de polynômes de Lukosz et sont par exemple décrits dans l'article de D. Debarre et al. «Image Based Adaptative Optics Through Optimisation of Low Spatial Frequences », Optics Express (2007), vol.15 (13), pp 8176 - 8190. D'autres décompositions du front d'onde sont utilisables, comme par exemple celle décrite dans l'article de B. Wang et al. « Optimum deformable mirror modes for sensorless adaptive optics », Optics Communications 282 (2009), 4467-4474. La base orthogonale décrite utilise les modes de déformations propres du miroir déformable considéré pour construire une base de représentation des aberrations présentant les mêmes propriétés que les polynômes de Lukosz, mais prenant mieux en compte les déformations réellement effectuées par le miroir déformable. Les aberrations les plus classiques sont le défaut de mise au point ou `defocus', l'aberration sphérique - introduite par exemple par une lame à face plane et parallèle disposée sur le trajet de focalisation d'un objectif de microscope, comme une lamelle de microscope, ou encore la coma. Un objectif de la présente invention est alors d'annuler l'influence de chacune des aberrations qui contribue à la dégradation d'un paramètre statistique du signal OCT résultant de l'acquisition d'une image de la tranche d'échantillon.

Selon un exemple, l'image est calculée en faisant la différence de deux signaux d'interférence présentant un déphasage de it (ces deux signaux étant obtenues en faisant varier la différence de marche relative entre les deux bras de l'interféromètre, par exemple grâce au déplacement de la platine piézoélectrique) ou en faisant la moyenne sur un nombre donné d'images ainsi calculées. La valeur moyenne des valeurs des points de l'image ainsi calculée est nulle dans ce cas. Par contre la valeur de l'écart type (a), donné par : où I(x, y) est la valeur d'un point de coordonnées (x, y) de l'image, et M, N sont les nombres respectifs des points de l'image selon les deux dimensions, mi est la moyenne, est non nulle et va se trouver diminuée en présence d'aberrations, du fait de la sommations de speckles non corrélés, comme cela a été décrit précédemment. Selon un exemple, on fait varier au moyen de l'unité de contrôle 405 et par action spécifique sur l'élément de modification du front d'onde 404 le niveau de chacune des aberrations que l'on cherche à annuler en optimisant la valeur calculée de l'écart type. La déposante a montré qu'en général, 3 mesures par aberration à corriger suffisent pour atteindre l'objectif grâce aux propriétés des polynômes orthogonaux choisis. En effet, l'évolution de la qualité de l'image suivant des paramètres statistiques propres au signal OCT tels que décrits précédemment peut être représenté sous forme quadratique, en particulier le maximum de cette courbe d'évolution peut être approximé par une parabole. Il est alors possible pour chaque aberration, à partir de trois valeurs du paramètre considéré obtenues au moyen de l'unité de contrôle 405 par action spécifique sur l'élément de modification du front d'onde 404 correspondant à l'aberration considérée, de reconstruire la parabole représentant au mieux cette évolution, et d'en déduire la valeur optimale de l'aberration. Par répétition de ce processus d'optimisation pour chaque aberration, il est possible de déduire les paramètres optimaux de contrôle de l'élément de modification de la phase 404, c'est-à-dire la forme du front d'onde permettant d'optimiser l'image obtenue par compensation des défauts introduits le long du trajet optique. Selon un autre exemple, l'image est calculée en prenant la valeur absolue de la différence de deux signaux d'interférence présentant un déphasage de it, ou en faisant la moyenne sur un nombre donné d'images ainsi calculées. Dans ce cas, un paramètre statistique caractéristique de l'image peut être par exemple la valeur moyenne des valeurs des points de l'image, l'écart type, ou le contraste égal au rapport de l'écart type par la valeur moyenne.

Selon une variante, et notamment si le champ est large, on pourra travailler sur une partie de l'image seulement. En effet, il est possible qu'une correction « moyenne » effectuée sur l'ensemble de l'image ne soit pas optimale pour tout le champ. Il est alors préférable de ne travailler que sur une partie de l'image, voire de faire plusieurs corrections successives sur plusieurs parties de l'image et de recombiner ces différentes images entre elles. Selon une variante, on peut également prévoir d'inclure sur l'un des bras de l'interféromètre, par exemple le bras de référence, une densité optique variable 406. La densité optique a pour but de régler le niveau d'intensité lumineuse relative des ondes de référence et objet. La déposante a montré en effet que l'optimum du signal d'interférence et par conséquent du contraste de l'image résultante est obtenu pour un niveau d'intensité lumineux relatif des deux bras sensiblement équivalent. Ce schéma permet d'optimiser le signal d'OCT obtenu par un dispositif adaptatif prenant en compte les variations de réflectivité provenant de divers spécimens biologiques. L'optimisation du niveau d'intensité lumineuse du bras de l'interféromètre considéré est par exemple réalisée en utilisant un jeu de densités optiques différentes et interchangeables, en prenant soin d'insérer sur l'autre bras de l'interféromètre un moyen de compensation de la différence de marche et de la dispersion introduits par la densité considérée, par exemple une lame à face plane et parallèle transparente 407, de même matériau et de même épaisseur que la densité considérée. Les figures 5A et 5B présentent deux variantes de réalisation d'un microscope interférentiel plein champ selon l'invention. La figure 5A présente un microscope interférentiel 5 basé sur un interféromètre 100 de type Michelson et la figure 5B présente un microscope interférentiel 6 basé sur un interféromètre 100 de type Mirau. Sur ces deux figures, les éléments identiques au montage de la figure 4 sont indiqués par les mêmes références.

Dans l'exemple de la figure 5A, l'interféromètre 100 comprend un objectif de microscope unique 501 et une lame de séparation permettant de former le bras de référence sur lequel se trouve le miroir de référence 105 et l'élément de modulation 111 du miroir, et le bras objet sur lequel se trouve l'échantillon 506 et l'élément optique de modification de la phase 404. Un avantage de ce dispositif est de permettre d'utiliser un objectif unique et donc de minimiser les aberrations différentielles entre les 2 bras de l'interféromètre de type Linnik précédemment décrit. Dans l'exemple de la figure 5B, l'interféromètre 100 comprend un objectif de microscope unique 503 à la sortie duquel est positionné le miroir de référence 105 monté sur la platine 111 de translation, et une lame semi-réflechissante 504 permettant de former le bras de référence, et le bras objet sur lequel se trouve l'échantillon 506 et l'élément optique de modification de la phase 404. Comme précédemment, ce dispositif met en oeuvre un objectif unique. Bien que décrite à travers un certain nombre d'exemples de réalisation détaillés, le dispositif de microscopie interférentielle et la méthode selon l'invention comprennent différentes variantes, modifications et perfectionnements qui apparaîtront de façon évidente à l'homme de l'art, étant entendu que ces différentes variantes, modifications et perfectionnements font partie de la portée de l'invention, telle que définie par les revendications qui suivent.10

Claims (14)

1. REVENDICATIONS1. Dispositif de microscopie interférentielle (4) plein champ en lumière incohérente d'un échantillon volumique et diffusant (106) comprenant - une source d'émission (101) d'une onde incidente de bande spectrale donnée, - un dispositif d'interférence (100) entre une onde de référence (401) obtenue par réflexion de l'onde incidente sur un miroir (105) d'un bras de référence du dispositif d'interférence et une onde objet (402) obtenue par rétrodiffusion de l'onde incidente par une tranche de l'échantillon à une épaisseur donnée, l'échantillon étant disposé sur un bras objet du dispositif d'interférence, - un dispositif d'acquisition multicanal (108) d'au moins un premier signal d'interférence et d'au moins un second signal d'interférence résultant de l'interférence des ondes de référence et objet, les au moins deux signaux d'interférence présentant un déphasage obtenu en faisant varier la différence de marche relative entre les deux bras du dispositif d'interférence, - une unité de traitement (403) des signaux d'interférence pour calculer une image de la franche de l'échantillon, le dispositif de microscopie étant caractérisé en ce que - le dispositif d'interférence comprend en outre un élément optique (404) de modification de la phase du front d'onde et - le dispositif de microscopie comprend une unité de contrôle (405) dudit élément optique, reliée à l'unité de traitement (403), l'élément optique (404) de modification de la phase étant contrôlé par optimisation d'un paramètre statistique d'au moins une partie de l'image calculée par l'unité de traitement.
2. 2. Dispositif de microscopie selon la revendication 1 dans lequel l'élément optique (404) de modification de la phase est positionné sur le bras objet, pour le contrôle de la phase de l'onde incidente sur l'échantillon.
3. 3. Dispositif de microscopie selon la revendication 2 dans lequel le dispositif d'interférence comprenant sur chacun des bras un objectif de microscope (103, 104), l'élément optique de modification de la phase est positionné sur une pupille ou une image de la pupille de l'objectif de microscope (103) du bras objet.
4. 4. Dispositif selon l'une des revendications précédentes, dans lequel l'élément optique (404) de déformation de la phase est un miroir déformable.
5. 5. Dispositif de microscopie selon l'une des revendications précédentes dans lequel le calcul de l'image de la tranche de l'échantillon comprend la soustraction d'au moins deux signaux d'interférence présentant un déphasage de it et l'élément optique de modification de la phase est contrôlé par optimisation de l'écart type mesuré sur au moins une partie des valeurs des points de l'image ainsi calculée.
6. 6. Dispositif de microscopie selon la revendication 5 dans lequel le calcul de l'image de la tranche de l'échantillon comprend en outre le calcul de la valeur absolue de ladite soustraction et l'élément optique de modification de la phase est contrôlé par optimisation de la valeur moyenne, de l'écart type ou du contraste, mesuré sur au moins une partie des valeurs des points de l'image ainsi calculée.
7. 7. Dispositif selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel l'optimisation du paramètre statistique comprend la mesure dudit paramètre pour trois états de l'élément optique de modification de la phase correspondant à l'introduction de respectivement trois valeurs données d'une aberration optique.
8. 8. Dispositif de microscopie selon l'une des revendications précédentes, dans lequel le dispositif d'interférence est de type Linnik, comprenant un élément séparateur de faisceau (102) permettant de former lesdits bras objet et de référence, et sur chacun des bras un objectif de microscope (103, 104).
9. 9. Dispositif de microscopie selon l'une des revendications précédentes, dans lequel le dispositif d'interférence comprend sur l'un de ses bras une densité variable (406) et sur l'autre bras une lame de compensation (407) de la différence de marche introduite par la densité variable.
10. 10. Méthode de microscopie interférentielle plein champ en lumière incohérente d'un échantillon volumique et diffusant (106) comprenant : - l'émission d'une onde incidente de bande spectrale donnée, - l'interférence entre une onde de référence (401) obtenue par réflexion de l'onde incidente sur un miroir (105) d'un bras de référence et une onde objet - 10 -
11. 11. 15 (402) obtenue par rétrodiffusion de l'onde incidente par une tranche de l'échantillon à une épaisseur donnée, l'échantillon étant disposé sur un bras objet du dispositif d'interférence, - l'acquisition d'au moins un premier signal d'interférence et d'au moins un second signal d'interférence résultant de l'interférence des ondes de référence et objet, les au moins deux signaux d'interférence présentant un déphasage obtenu en faisant varier la différence de marche relative entre les deux bras du dispositif d'interférence, le traitement des signaux d'interférence pour calculer une image de la tranche de l'échantillon, le contrôle de la phase de l'onde incidente sur l'échantillon par optimisation d'un paramètre statistique d'au moins une partie de l'image calculée à partir du traitement des signaux d'interférence. Méthode de microscopie selon la revendication 10 dans laquelle le calcul de 15 l'image de la tranche de l'échantillon comprend la soustraction d'au moins deux signaux d'interférence présentant un déphasage de it et le contrôle de la phase de l'onde incidente sur l'échantillon est effectué par optimisation de l'écart type mesuré sur au moins une partie des valeurs des points de l'image.
12. 12. Méthode de microscopie selon la revendication 11 dans lequel le calcul de 20 l'image de la tranche de l'échantillon comprend en outre le calcul de la valeur absolue de ladite soustraction et le contrôle de la phase de l'onde incidente sur l'échantillon est effectué par optimisation de la valeur moyenne, de l'écart type ou du contraste, mesuré sur au moins une partie des valeurs des points de l'image.
13. 13. Méthode de microscopie selon l'une quelconque des 10 à 13, dans lequel le 25 contrôle de la phase de l'onde incidente sur l'échantillon comprend, pour une aberration optique donnée, la mesure d'un nombre donné de valeurs du paramètre statistique après introduction sur la phase de l'onde incidente sur l'échantillon d'autant de valeurs de ladite aberration optique, le calcul de la valeur de l'aberration rendant maximale la valeur dudit paramètre, l'introduction sur la phase de l'onde incidente sur l'échantillon de ladite valeur 30 de l'aberration.
14. 14. Méthode de microscopie selon la revendication 13, dans laquelle le nombre de valeurs de l'aberration optique introduite est de trois.