FR2813885A1

FR2813885A1 - Nouveau melange d'oligosaccharides non sulfates a base de fucose, composition cosmetique ou pharmaceutique le comprenant, et son utilisation en cosmetique ou en pharmacie

Info

Publication number: FR2813885A1
Application number: FR0011545A
Authority: FR
Inventors: Ladislas Robert; Alexandre Michel Robert; Catherine Sylvie Robert; Jean Luc Gesztesi
Original assignee: Industria e Comercio de Cosmeticos Natura Ltda
Current assignee: Industria e Comercio de Cosmeticos Natura Ltda
Priority date: 2000-09-11
Filing date: 2000-09-11
Publication date: 2002-03-15
Anticipated expiration: 2020-09-11
Also published as: BR0100955A; PE20020313A1; AR030645A1; FR2813885B1

Abstract

La présente invention concerne un mélange d'oligosaccharides non sulfatés à base de fucose, caractérisé en ce qu'il comprend des oligosaccharides de moins de 13 unités saccharidiques comprenant au moins une unité fucose en position terminale non réductrice, et en ce qu'il est susceptible d'être obtenu par un procédé comprenant au moins une étape de dégradation d'un polysaccharide issu d'un microorganisme du genre Klebsiella pneumoniae subsp. pneumoniae.Ce nouveau mélange présente des activités significatives sur différents composants de la peau, se traduisant par un résultat anti-vieillissement nettement visible, notamment par un épaississement spectaculaire de la peau.

Description

Titre : Nouveau mélange d'oligosaccharides non sulfatés à base de fucose, composition cosmétique ou pharmaceutique le comprenant, et son utilisation en cosmétique ou en pharmacie.

La présente invention concerne un nouveau mélange d'oligosaccharides non sulfatés à base de fucose et son utilisation notamment dans des produits à application topique, pour lesquels une activité sur le tissu epithelial ou conjonctif est recherchée, en particulier des produits anti-âge, tels que des produits pharmaceutiques ou vétérinaires, et plus particulièrement, dans des produits cosmétiques.

Au cours du vieillissement, la peau s'amincit d'environ 6% en moyenne tous les dix ans (Skin thickness changes in normal aging skin, Branchet et al, Gerontology, 1990,36 : 28-35). Les mécanismes sous-jacents du vieillissement sont intrinsèques et extrinsèques. Les mécanismes intrinsèques comportent un ralentissement de la prolifération cellulaire et une perte importante de la matrice extracellulaire cutanée (MEC). Cette perte est surtout le résultat de la baisse de la synthèse de la MEC et de la synthèse croissante avec l'âge, d'enzymes de dégradation pouvant attaquer la matrice cutanée (D. L. ROBERT : Le vieillissement, CNRS, Belin, 1994; Docteur L. ROBERT : Le vieillissement, faits et théories, DOMINOS, Flammarion, 1995). Les protéases responsables sont essentiellement les métallo-protéases matricielles (MMP) dont plusieurs (ainsi que des sérines-protéases) peuvent dégrader la plupart des constituants de la matrice cutanée et en particulier les fibres élastiques.

Ces dernières années, de nombreuses recherches ont eu pour objet d'obtenir des composés actifs contre certains effets du vieillissement cutané. Un premier objectif est de ralentir ce processus. Un autre objectif est d'obtenir un résultat d'épaississement de la peau, notamment du derme.

Les saccharides et polysaccharides sont des substances bien connues en cosmétique, notamment pour leurs propriétés hydratantes. Tel est le cas par exemple du monosaccharides fucose et des polysaccharides en contenant.

Le fucose est un déoxyhexose proche du galactose dont il possède la conformation stérique. Toutefois, la structure du fucose diffère de manière essentielle de celle du galactose en ce que l'atome de carbone-6 comporte un groupe méthyle

(-CH3) et non un groupe alcool primaire (-CH20H). Ce groupe méthyle confère en effet à la molécule du fucose un caractère hydrophobe partiel intéressant, compensé par les autres groupes hydroxyle sur les quatre autres atomes de carbone présents.

Le fucose apparaît tôt au cours de la phylogenèse, les polysaccharides de certaines algues et de champignons en contiennent en quantité relativement importante, seul ou en combinaison avec d'autres composés chimiques. Il peut également apparaître sous forme sulfatée comme dans les fucanes. Le fucose est par ailleurs répandu dans le règne végétal et certaines bactéries en synthétisent aussi.

Cependant, malgré le nombre important de travaux sur le fucose et les polysaccharides en contenant, les résultats obtenus jusqu'à ce jour n'étaient guère satisfaisants en vue d'une application à échelle industrielle, notamment dans un produit cosmétique.

En particulier, outre le rapport coût/efficacité médiocre du monosaccharide fucose, les polysaccharides contenant du fucose déjà connus ne présentent pas une activité significative permettant de lutter efficacement contre le vieillissement cutané comme exposé ci-dessus.

Ainsi, par exemple, les fucanes sont des polymères sulfatés de haut poids moléculaires (> 20kD). WO 99/32099 (IFREMER) décrit de nouvelles utilisations des fucanes dans le cadre de la réparation des lésions du tissu conjonctif. Toutefois, les fucanes, par leur taille et leur charge, ne peuvent interagir efficacement avec toutes les couches cellulaires de la peau. Qui plus est, les fucanes peuvent au contraire activer les MMP-2, propriété rédhibitoire pour un traitement cosmétique du vieillissement normal de la peau.

FR-2 750 863 (L'OREAL) décrit l'utilisation d'un polyholoside, notamment un polysaccharide comprenant du fucose, pour favoriser la desquamation, c'est à dire favoriser l'élimination des cellules mortes situées à la surface de la couche cornée de l'épiderme (page 3, lignes 6 et 7) et/ou pour stimuler le renouvellement épidermique, c'est à dire provoquer une élimination forcée de la couche cornée accélérant le renouvellement (page 1, lignes 13-23), ces effets suscitant un résultat assimilé selon FR-2 750 863 à un résultat anti-vieillissement cutané. Toutefois, le polysaccharide tel que décrit dans FR-2 750 863, de par sa masse moléculaire et sa

structure, ne permet pas d'interagir de manière satisfaisante avec les différents constituants de la peau.

On a maintenant constaté de manière tout à fait surprenante et inattendue qu'un nouveau mélange d'oligosaccharides contenant du fucose, pouvant être obtenu par un traitement spécifique d'un microorganisme sélectionné, présente des activités significatives sur différents composants de la peau, se traduisant par un véritable résultat anti-vieillissement, nettement visible, notamment par un épaississement spectaculaire de la peau.

La présente invention a ainsi pour objet un mélange d'oligosaccharides non sulfatés à base de fucose, caractérisé en ce qu'il comprend des oligosaccharides de moins de 13 unités saccharidiques comprenant au moins une unité fucose en position terminale non réductrice, et en ce qu'il est susceptible d'être obtenu par un procédé comprenant au moins une étape de dégradation d'un polysaccharide issu d'un microorganisme du genre Klebsiella pneumoniae subsp. pneumoniae.

Par "oligosaccharide non sulfaté à base de fucose" on entend selon l'invention, en accord avec les connaissances générales de l'homme du métier, un oligosaccharide contenant au moins une unité saccharidique fucose et ne comportant pas de groupe sulfate -O(SO3)-. Les fucanes sont en particulier exclus de cette définition.

Par "oligosaccharide comprenant au moins une unité fucose en position terminale non réductrice" on entend selon l'invention, en accord avec les connaissances générales de l'homme du métier, un oligosaccharide contenant au moins une unité saccharidique fucose en position terminale de la chaîne de l'oligosaccharide, cette unité fucose étant reliée à l'unité saccharidique suivante du reste de l'oligosaccharide par une liaison de type acétal.

Les nombres d'unités saccharidiques peuvent être mesurées à l'aide de techniques bien connues de l'homme du métier, en particulier en utilisant la technique de chromatographie HPLC telle que celle décrite dans les exemples ci-après.

De préférence, le mélange d'oligosaccharides selon l'invention comprend, par rapport au poids total du mélange, au moins 15% en poids, et plus particulièrement de préférence de 20 à 50 % en poids, d'oligosaccharides de moins de 13 unités saccharidiques comprenant au moins une unité fucose en position terminale non réductrice.

Plus particulièrement, le mélange d'oligosaccharides selon l'invention est caractérisé en ce qu'il comprend en outre, par rapport au poids total du mélange, de 25 à 45 % en poids d'oligosaccharides ayant de 13à 24 unités saccharidiques comprenant au moins une unité fucose en position terminale non réductrice.

Plus particulièrement encore, le mélange d'oligosaccharides selon l'invention est caractérisé en ce qu'il comprend en outre, par rapport au poids total du mélange, de 15à 35 % en poids d'oligosaccharides de plus de 54 unités saccharidiques comprenant au moins une unité fucose en position terminale non réductrice.

Le mélange d'oligosaccharides étant susceptible d'être obtenu par un procédé comprenant au moins une étape de dégradation d'un polysaccharide issu d'un microorganisme du genre Klebsiella pneumoniae subsp. pneumoniae, les oligosaccharides comprennent de préférence, au moins en partie, le motif de répétition fucose-galactose-acide galacturonique.

En particulier, le mélange d'oligosaccharides selon l'invention est susceptible d'être obtenu par le procédé comprenant les étapes consistant à : a) faire croître le microorganisme du genre Klebsiella pneumoniae subsp. pneumoniae dans un milieu nutritif aqueux par fermentation aérobie d'une source de glucide assimilable; b) récupérer le polysaccharide formé à partir du moût de fermentation; c) soumettre le polysaccharide à une hydrolyse modérée; d) soumettre le produit d'hydrolyse de l'étape c) à une hydrolyse enzymatique ; et e) désactiver l'enzyme puis récupérer le mélange d'oligosaccharides ainsi formé.

Plus particulièrement, ces étapes a) à e) peuvent être décrites de la manière suivante.

Etapea)
On utilise de préférence le microorganisme Klebsiella pneumoniae subsp. pneumoniae est le microorganisme déposé à la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes sous le numéro 1-1507, ou un mutant de ce dernier. Ce microorganisme est par ailleurs décrit en détails dans la demande WO 96/23057.

Le milieu nutritif aqueux peut être tout milieu aqueux connu de l'homme du métier, contenant des sources de carbone, d'azote et des sels minéraux tels que ceux décrits dans la demande WO 96/23057.

On peut conduire la fermentation à des températures de l'ordre de 25 à 35 C, à un pH d'environ 6,0 à 7,5, dans des conditions d'aération et d'agitation, pendant des durées de l'ordre de 2 à 4 jours.

La fermentation peut être effectuée dans un fermenteur classique en inoculant du milieu nutritif préalablement stérilisé, par exemple par chauffage à une température de l'ordre de 120 C ou par filtration stérilisante.

Etape b)
A la fin de la période de fermentation, on récupère le moût de fermentation duquel on isole un polysaccharide riche en fucose de la manière suivante.

On soumet le moût de fermentation à un traitement thermique à une température notamment comprise entre environ 100 et environ 130 C, de préférence entre environ 115 et environ 125 C pendant un temps notamment d'environ 30 minutes à environ 2 heures et de préférence d'environ 40 minutes à environ 1 heure et à un pH notamment compris entre environ 2 et environ 5,5 et de préférence entre environ 3 et environ 5,5.

Le produit du traitement thermique est filtré selon des moyens classiques tels qu'une filtre presse avec plaques.

On obtient ainsi un polysaccharide limpide, visqueux et exempt de toute cellule.

On réalise ensuite une précipitation dans un solvant alcool, de préférence un solvant alcool choisi parmi l'éthanol, l'isopropanol et les mélanges de ces derniers. On utilise en particulier environ 1 à environ 3,0 volume de solvant pour 1 volume de polysaccharide et de préférence environ 1,3 à environ 2,0 volume de solvant pour 1 volume de polysaccharide.

On effectue ensuite un séchage sous vide à une température notamment comprise entre environ 20 et environ 60 C et de préférence entre environ 30 et environ 50 C, jusqu'à obtention d'une poudre.

Etapes c) et d) : hydrolyse du polysaccharide
Il s'agit d'une combinaison d'étapes essentielle. On a en effet constaté de manière surprenante et inattendue que la combinaison d'une étape d'hydrolyse modérée, de préférence par irradiation aux rayons gamma et/ou par protolyse, avec une étape

d'hydrolyse enzymatique, permet d'obtenir avantageusement un rendement global d'hydrolyse suffisant, proche de celui d'une hydrolyse classique telle qu'une hydrolyse acide, mais avec l'avantage de coupures spécifiques d'une hydrolyse enzymatique. En particulier, une hydrolyse classique acide ne permet pas d'obtenir le mélange d'oligosaccharides spécifiques selon l'invention dans la mesure où elle conduit à l'obtention de coupures statistiques, rédhibitoires quant à leur caractère aléatoire. Les composés résultant d'une hydrolyse acide classique se sont d'ailleurs révélés biologiquement inactifs.

Etape c) : modérée du polysaccharide
L'hydrolyse modérée est réalisée par un traitement au rayons gamma, un traitement de protolyse ou par ces deux traitements successifs. De préférence, on réalise successivement un traitement au rayons gamma puis un traitement de protolyse.

Le traitement par les rayons gamma s'avère provoquer une baisse sensible de la viscosité de par une dégradation limitée, attribuable à l'action de radicaux libres. Il peut être réalisé avec des moyens d'irradiation bien connus de l'homme du métier.

Ce traitement par des rayons gamma, rayons très pénétrants, présente en outre l'avantage de stériliser le polysaccharide en tuant les germes présents qui pourraient induire une inflammation ou même provoquer un granulome. On prévient ainsi toute attaque bactérienne sans devoir ajouter au milieu des produits antiseptiques qui eux pourraient interférer de manière indésirable avec les activités biologiques du produit final.

La poudre de polysaccharide obtenue à l'étape b), éventuellement irradiée aux rayons gamma, peut donc également être soumise à un traitement de protolyse. Elle est pour cela mise en solution aqueuse à raison notamment de 1 à 20 % en poids et de préférence de 2 à 10 % en poids, par rapport au poids total de la solution aqueuse.

La solution aqueuse est soumise à un traitement thermique, c'est à dire à un chauffage à une température notamment comprise entre environ 75 et environ 120 C et de préférence entre environ 90 et environ 100 C, pendant un temps notamment compris entre 1 et 6 heures, en présence d'une résine génératrice de protons telles que celles commercialisée et bien connues de l'homme du métier, c'est à dire une résine générant des protons qui entraînent une coupure des liaisons glycosidiques avec fixation d'une molécule d'eau.

Etape d) : hydrolyse enzymatique
On introduit un tampon acide tel que le tampon acide citrique (4,15 g/kg)hydrogénophosphate disodique (environ 10,75 g/kg) dans l'hydrolysat obtenu à l'étape b). On règle la température de la solution à une température notamment comprise entre environ 25 et environ 45 C et de préférence entre environ 30 et environ 40 C.

On introduit une préparation enzymatique comprenant au moins une endofucosidase, de préférence la Fermizyme HCP telle que commercialisée par la société Gist Brocades, selon une teneur notamment comprise entre environ 2 et environ 20 % en poids, et de préférence entre environ 5 et environ 15 % en poids, par rapport au poids initial de poudre de polysaccharide utilisée.

Le mélange ainsi obtenu est maintenu sous agitation pendant un temps notamment compris entre environ 8 et environ 24 heures et de préférence entre environ 10 et environ 20 heures, à une température notamment comprise entre environ 25 et environ 45 C et de préférence comprise entre environ 30 et environ 40 C, le pH étant réglé à 6 par la présence du mélange tampon.

Etapee)
Le produit d'hydrolyse obtenu à l'issue de l'étape d) est filtré selon des moyens classiques tels qu'une filtre presse avec plaques.

La solution recueillie est ensuite traitée thermiquement à une température notamment comprise entre environ 75 et environ 120 C et de préférence entre environ 90 et environ 105 C, pendant un temps notamment compris entre environ 10 et environ 45 minutes et de préférence entre environ 20 et environ 35 minutes, afin de désactiver l'enzyme et plus particulièrement l'activité fucosidase de cette enzyme spécifique.

On laisse refroidir à une température notamment comprise entre environ 20 et environ 40 C .

Lors du refroidissement, des conservateurs peuvent être ajoutés à la solution.

On filtre ensuite l'ensemble dans des conditions stériles puis on réalise le conditionnement.

Le mélange d'oligosaccharides selon l'invention ainsi obtenu peut être caractérisé à l'aide de techniques bien connues de l'homme du métier notamment par HPLC, chromatographie sur couche mince et autres méthodes et dosages chimiques.

On peut ainsi constater que les oligosaccharides du mélange selon l'invention sont tels que tels que le fucose se retrouve majoritairement en bout de chaîne, en position terminale non réductrice.

Le mélange d'oligosacharides est tout particulièrement approprié comme actif dans une composition cosmétique notamment anti-âge ou dans une composition pharmaceutique notamment dermatologique (application topique). En particulier, les effets biologiques constatés de ce mélange d'oligosaccharides s'avèrent comparables voire supérieurs à ceux du monosaccharide fucose.

Ainsi, la présente invention a également pour objet une composition cosmétique ou pharmaceutique, caractérisée en ce qu'elle comprend, en tant qu'agent cosmétiquement ou pharmaceutiquement actif, au moins un mélange d'oligosaccharides tel que décrit ci-dessus et au moins un excipient cosmétiquement ou pharmaceutiquement acceptable.

Lorsque la composition est une composition pharmaceutique, il s'agit de préférence d'une composition dermatologique, en vue d'une application topique, avec donc bien entendu au moins un excipient pharmaceutique approprié pour une telle application dermatologique.

L'excipient cosmétiquement ou pharmaceutiquement acceptable peut être tout excipient parmi ceux connus de l'homme du métier en vue d'obtenir une composition selon l'invention sous forme d'une crème, d'une lotion, d'un gel, d'une pommade, etc, éventuellement sous la forme d'une émulsion avec en outre des composants connus de l'homme du métier, pour améliorer, modifier ou stabiliser la composition d'un point de vue cosmétique ou pharmaceutique.

L'expression excipient pharmaceutiquement acceptable englobe les excipients adaptés à un usage vétérinaire de la composition selon l'invention.

La composition selon l'invention peut en particulier contenir d'autres additifs et aides à la formulation, tels que des agents antioxydants pour combattre les radicaux libres. On peut citer notamment la vitamine E pure ou le di-alpha- tocophérol et ses dérivés, et le 2,6-di-ter-buthyl-p-cresol (BHT).

Avantageusement, la composition selon l'invention peut en particulier comprendre en outre au moins un additif choisi dans le groupe constitué par les agents structurants de la peau (tels que le squalane et les sphingolipides), les agents humectants

(tels que la glycérine et l'hydroxy prosilan C), les émollients (tels que le buthylène glycol et le lactate de céthyle), les silicones (telles que la cyclométhicone), les agents de protection solaires (tels que les Parsol 1789 et Eusolex 6300), les émulsifiants (notamment le Carbopol 1342 associé à la triéthanolamine et la lécithine de soja), les épaississants (notamment la gomme de xanthane), les agents séquestrants (notamment l'EDTA), les antioxydants (tels que le BHT décrit ci-dessus) les fragrances, les conservateurs, l'eau et les mélanges de ceux-ci.

Bien entendu, les conditions opératoires pour préparer la composition cosmétique ou pharmaceutique selon l'invention font parties des connaissances générales de l'homme du métier.

De préférence, le mélange d'oligosaccharides est présent selon une proportion comprise entre environ 0,001 et environ 20 % en poids, et plus particulièrement de préférence entre environ 0,1et environ 10 % en poids, par rapport au poids total de cette composition cosmétique ou pharmaceutique.

Sans vouloir toutefois être tenu à une quelconque théorie, l'activité avantageuse du mélange d'oligosaccharides selon l'invention, illustrée par les exemples ci-après, résulterait en particulier de sa très grande capacité d'interagir avec les membranes cellulaires, via les fonctions hydrophobes des groupes méthyles du fucose hautement disponibles, et de son interaction avec le récepteur fucose-mannose des cellules cutanées, macrophages ou cellules de Langerhans (Condaminet et al : epidermal Langerhans cells express the mannose-fucose binding receptor, Eur. J. Immunol. 1998. 28 : 3541-3551). L'ensemble de ces effets peut être caractérisé comme un effet stimulateur de la communication cellulaire.

Ainsi, la présente invention a également pour objet l'utilisation du mélange d'oligosaccharides tel que décrit ci-dessus, pour la préparation d'une composition destinée à stimuler la communication cellulaire entre les cellules de la peau.

Par ailleurs, la présente invention a également pour objet l'utilisation du mélange d'oligosaccharides tel que décrit ci-dessus pour la préparation d'une composition destinée à stimuler la prolifération cellulaire des kératynocytes de la peau.

En outre, la présente invention a également pour objet l'utilisation du mélange d'oligosaccharides tel que décrit ci-dessus pour la préparation d'une composition destinée à stimuler la prolifération cellulaire des fibroblastes de la peau.

Enfin, la présente invention a également pour objet l'utilisation du mélange d'oligosaccharides tel que décrit ci-dessus, pour la préparation d'une composition destinée à inhiber la synthèse des protéases de type élastase par les fibroblastes de la peau.

Les fibroblastes de la peau humaine synthétisent plusieurs protéases dont certaines présentent une activité de type élastase. Ceci est particulièrement vrai pour des MMP-2 et MMP-9 et pour les MMP membranaires.

L'hyaluronane ajouté aux fibroblastes à faibles concentrations (1 à 2 mg/ml) augmente l'activité de type élastase de façon significative. Or, nous avons pu constater de manière surprenante et inattendue que le mélange d'oligosaccharides selon l'invention inhibe cette stimulation. Comme l' hyaluronane est constamment présent dans l'environnement péricellulaire, cette activité inhibitrice peut être considérée comme permettant de réduire la dégradation de la matrice cutanée avec l'âge.

Ainsi, la présente invention a également pour objet l'utilisation du mélange d'oligosaccharides tel que décrit ci-dessus, pour la préparation d'une composition destinée à inhiber la surexpression des protéases MMP-2 et MMP-9 induite par l'hyaluronane.

Plus particulièrement, la présente invention a également pour objet l'utilisation du mélange d'oligosaccharides tel que décrit ci-dessus, pour la préparation d'une composition destinée à inhiber la synthèse des protéases MMP-2 et MMP-9 par les fibroblastes de la peau.

Par ailleurs, il a récemment été montré que l'activité des MMP est critique dans le cas de la sensibilisation par contact (M. C Lebre et al, Arcg. Dermatol. Res., 1999, 291 : 447-452). En présence d'inhibiteurs de MMP, les cellules de Langerhans de l'épiderme ne peuvent migrer à travers le derme comme c'est le cas lors d'une sensibilisation par contact. L'inhibition de l'activité des MMP par le mélange d'oligosaccharides selon l'invention procure ainsi un véritable effet d'abaissement de la sensibilité de la peau à l'irritation.

La présente invention a par conséquent également pour objet l'utilisation du mélange d'oligosaccharides tel que décrit ci-dessus, pour la préparation d'une composition destinée à diminuer la sensibilité de la peau à l'irritation.

Le mélange d'oligosaccharides selon l'invention permet d'obtenir des effets d'augmentation de l'épaisseur de l'épiderme et du derme. Ces deux effets sont statistiquement hautement significatifs. L'épaisseur de la peau diminuant avec l'âge, cet effet trophique du mélange d'oligosaccharides selon l'invention est extrêmement important dans la prévention du vieillissement cutané.

Plus particulièrement, on peut observer un renforcement des faisceaux de collagène du derme d'une peau traité avec le mélange d'oligosaccharides selon l'invention. Compte tenu de l'importance du rôle de ces faisceaux de collagène dans la fermeté de la peau, il s'agit là d'un résultat anti-vieillissement majeur.

La présente invention a par conséquent également pour objet l'utilisation du mélange d'oligosaccharides tel que décrit ci-dessus, pour la préparation d'une composition destinée à stimuler le dépôt de fibres de collagène dans le derme.

Le mélange d'oligosaccharides est utilisé comme décrit ci-dessus de préférence selon une proportion comprise entre environ 0,001 et environ 20% en poids, et plus particulièrement de préférence entre environ 0,1et environ 10 % en poids, par rapport au poids total de la composition.

La composition ainsi préparée comprend en outre un excipient cosmétiquement ou pharmaceutiquement (notamment dermatologiquement) acceptable, tels que ceux connus de l'homme du métier.

Enfin, la présente invention a encore pour objet une méthode de traitement cosmétique de la peau, caractérisée en ce qu'on applique sur la peau une composition cosmétique comprenant au moins un mélange d'oligosaccharides tel que décrit cidessus. La composition cosmétique comprend en outre un excipient cosmétiquement acceptable, tels que ceux connus de l'homme du métier.

Les exemples suivants sont destinés à illustrer la présente invention et ne doivent en aucun cas être interprétés comme pouvant en limiter la portée.

La Figure 1 est un histogramme reportant les résultats présentés à l'exemple 3.b.l, en termes de pourcentage d'efficacité pour la réduction du rapport forme active/forme inactive des MMP-2 et MMP-9 secrétées par des explants de peau.

La Figure 2 est un histogramme reportant les résultats présentés à l'exemple 3.b.l, en termes de pourcentage d'efficacité pour la réduction du rapport forme

active/forme inactive des MMP-2 et MMP-9 secrétées par des explants de peau stimulés par l'hyaluronane.

La Figure 3 est un histogramme reportant les résultats présentés à l'exemple 3. b.2, en termes de pourcentage d'efficacité pour la réduction de l'expression de la MMP-2 d'explants de peau.

Exemple 1 : préparation d'un mélange d'oligosaccharides selon l'invention a) Fermentation
On utilise le microorganisme Klebsiella pneumoniae subsp. pneumoniae est le microorganisme déposé à la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes sous le numéro 1-1507. Le milieu nutritif et autres conditions de la fermentation sont les suivants.

Préparation des inoculums Milieu de culture : Néosorb# 70-07 (teneur en sorbitol : 70 % M.S.; Vendu par ROQUETTE FRERES, Lille/ France): 17,90 g/1 (soit 12,5 g/1 de sorbitol) Peptone Biokar 104003 (hydrolysat de protéines, vendu par SOLABIA-BIOKAR, Pantin, France) : 4,50g/l Extrait de levure : 0,05 g/l KH2PO4 : 1,50 g/1 K2HPO4 : 4,50 g/1 MGS04, 7H20 : 0,20 g/1 Pluronic# PE 61000 (agent anti-mousse, Vendu par BASF, D-6700 Ludwigshafen, Allemagne) : 0,50 g/1 Mise en solution dans de l'eau.

Condition de culture : Stérilisation à 121 C pendant 30 minutes Température de culture : 30 C Taux d'inoculation : 5 à 10 % Aération :1 VVM PH non régulé (pH d'environ 7,00) Durée de culture : 24 heures

Milieu de production Milieu de culture : Néosorb 70-07 : 54,00 g/1 (soit 38g/1 de sorbitol) Peptone Biokar #b 104003 : 4,50 g/1 Extrait de levure : 0,05 g/l KH2PO4 4 : 1,50 g/I MgS04, 7H2O : 0,20 g/1 Pluronic # PE 61000 : 0,50 g/1 Mise en solution dans de l'eau.

Conditions de culture (Fermenteur Chemap ayant un volume utile de 350 litres) : Stérilisation à 120 C pendant 45 minutes Température de culture : 30 C Taux d'inoculation : environ 5 % Agitation : 300 rpm (agitateur de type Rushton) Aération : 1 VVM PH régulé à 7,0 par NaOH 7 N Pression: 100à200mbars Durée de culture : 60 à 65 heures Valeurs moyennes obtenues en production : Viscosité en fin de cycle : : 40000 Mpa. s (Viscosimètres Brookfield DV-II+ modèle LV, mobile SP 31, chambre SC4-34/13R, 30 C) Concentration du polysaccharide produit dans le milieu, calculée en L-fucose : 2 g/I (méthode de Dische et Shettles) Sorbitol consommé : > 35 g/l (en sorbitol) NaOH à 20% en poids consommée : 15 litres/m3 Début de régulation du pH : 16 à17 heures après inoculation du fermenteur Extrait sec final du milieu de fermentation : -20 g/1 b) Récupération du polysacharide formé
On soumet le moût de fermentation à un traitement thermique à une température de 120 C pendant 45 minutes et à un pH de 5,5. Le produit du traitement thermique est filtré à l'aide d'une filtre presse avec plaques type Seitz. On obtient ainsi un polysaccharide limpide, visqueux et exempt de toute cellule. On réalise ensuite une précipitation dans un 1,5 volume d'éthanol pour 1 volume de polysaccharide. On effectue ensuite un séchage sous vide à une température de 25 C jusqu'à obtention

d'une poudre. Compte tenu du microorganisme utilisé, ce polysaccharide est composé, d'unités répétitives trisaccharidiques fucose-galactose- acide galacturonique, et présente ainsi la structure suivante :

c) Hydrolyse modérée du polysaccharide
La poudre de polysaccharide est mise en solution aqueuse à raison de 5 % en poids, par rapport au poids total de la solution aqueuse. La solution aqueuse est soumise à un traitement thermique, c'est à dire à un chauffage à 100 C, pendant 3 heures, en présence d'une résine génératrice de protons. d) Hydrolyse enzymatique
On introduit le mélange tampon acide citrique (4,15g/kg)-hydrogénophosphate disodique (environ 10,75 g/kg) dans l'hydrolysat. On règle la température de la solution à 37 C. On introduit la préparation enzymatique Fermizyme HCP telle que commercialisée par la société Gist Brocades, selon une teneur de 10 % en poids, par rapport au poids initial de poudre de polysaccharide utilisée, c'est à dire 0,05% en poids par rapport à la masse totale de la solution aqueuse après remise en eau de la poudre comme décrit ci-dessus pour l'hydrolyse modérée par protolyse.

Le mélange ainsi obtenu est maintenu sous agitation pendant 15 heures à une température de 37 C, le pH étant réglé à 6 par la présence du mélange tampon. e) Désactivation de l'enzyme et récupération du mélange d'oligos acch arides
Le produit d'hydrolyse est filtré avec une filtre presse avec plaques type Seitz.

La solution recueillie est ensuite traitée thermiquement à 100 C pendant 30 minutes, pour désactiver l'enzyme. On laisse refroidir à une température de 25 C. Lors du refroidissement, les conservateurs phénoxy éthanol (1% en poids) et phénonip (0,3 % en poids) sont ajoutés à la solution. On filtre ensuite l'ensemble dans des conditions stériles.

Le mélange d'oligosaccharides ainsi obtenu est dénommé "Mélange-1 ".

Exemple 2 : caractérisation HPLC du Mélange-1
Le fractionnement du Mélange-1 obtenu à l'exemple 1 a été réalisé dans le dessin de déterminer la proportion d'oligo- et polysaccharides dans sa composition. a) Fractionnement par chromatographie d'exclusion préparative sur la colonne " Xk 50/60 Superdex 75 prepgrade "
Nous avons passé 50ml du Mélange-1 concentré à 50mg/ml, sur une colonne préparative " XK 50/60 Superdex 75 prepgrade " (chromatographie d'exclusion) et nous avons collecté 95 fractions, passées ensuite en HPLC .

Tableau 1 : techniques concernant la colonne préparative
XK 50/60 Superdex 75 prepgrade

<tb>
<tb> Remplissage <SEP> Superdex <SEP> 75 <SEP> prepgrade <SEP> (34 <SEP> m)
<tb> Taille <SEP> de <SEP> la <SEP> colonne <SEP> Hauteur <SEP> : <SEP> cm
<tb> Diamètre <SEP> : <SEP> 60 <SEP> mm
<tb> Type <SEP> de <SEP> colonne <SEP> XK <SEP> 50/60
<tb> Intervalle <SEP> utilisable <SEP> de <SEP> 5 <SEP> x <SEP> 102 <SEP> Da <SEP> - <SEP> 3 <SEP> x <SEP> 104 <SEP> Da
<tb> fractionnement <SEP> ~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~
<tb> Échantillon <SEP> injecté <SEP> : <SEP> 50 <SEP> ml <SEP> du <SEP> mélange <SEP> - <SEP> 1 <SEP> à <SEP> la <SEP> concentration <SEP> de
<tb> 50 <SEP> mg/ml. <SEP> (au <SEP> total <SEP> : <SEP> = <SEP> 2,50 <SEP> g)
<tb> Vitesse <SEP> d'élution <SEP> 1 <SEP> ml/ <SEP> minute
<tb> Nombre <SEP> de <SEP> fractions <SEP> 95 <SEP> fractions <SEP> de <SEP> 12,5 <SEP> ml <SEP> chacune
<tb> collectées
<tb> Phase <SEP> mobile <SEP> PBS
<tb>

Après fractionnement du Mélange-1sur la colonne " XK 50/60 Superdex 75 prepgrade, on recueille 95 fractions dont 45 contiennent des osides. b) Caractérisation des fractions obtenues par HPLC (chromatographie d'exclusion) colonnes ultrahydrogel 120 et ultrahydrogel 250
L'objectif de cette deuxième partie de notre étude était de passer sur une colonne d'exclusion HPLC (colonnes Utrahydrogel 120 et 250) toutes les 95 fractions du Mélange-1pour analyser les poids moléculaires et la concentration des composants de ces fractions.

Nous avons travaillé pour cette étude avec un système HPLC de Waters dont la description suit.

Tableau 2 : caractéristiques techniques du système de chromatographie HPLC utilisé

<tb>
<tb> Appareil <SEP> HPLC <SEP> Waters <SEP> 600
<tb> Colonnes <SEP> Ultrahydrogel <SEP> 120 <SEP> (taille <SEP> de <SEP> pores <SEP> : <SEP> 120 <SEP> Â) <SEP> et <SEP> Ultrahydrogel <SEP> 2
<tb> (taille <SEP> de <SEP> pores <SEP> : <SEP> 250 <SEP> ) <SEP> de <SEP> Waters. <SEP> Taille <SEP> : <SEP> 7,8 <SEP> mm <SEP> x <SEP> 300 <SEP> m
<tb> contenant <SEP> le <SEP> gel <SEP> de <SEP> polymétacrylate <SEP> hydroxylé
<tb> Échantillons <SEP> injectés <SEP> 20 <SEP> (il <SEP> par <SEP> injecteur <SEP> automatique
<tb> Élution <SEP> 0,10 <SEP> M <SEP> NaN03 <SEP>
<tb> Temps <SEP> de <SEP> l'élution <SEP> 50 <SEP> minutes/ <SEP> échantillons
<tb> Vitesse <SEP> de <SEP> l'élution <SEP> 0,5 <SEP> ml/ <SEP> minute.
<tb>

Détection <SEP> Par <SEP> mesure <SEP> de <SEP> l'indice <SEP> de <SEP> réfraction <SEP> avec <SEP> un <SEP> réfractomètre
<tb> Waters <SEP> 410.
<tb>

Tableau 3 : de poids moléculaires de polyéthylène glycol (Fluka) utilisés pour la chromatographie d'exclusion par HPLC

<tb>
<tb> Poids <SEP> moléculaire <SEP> TEMPS <SEP> D'ELUTION <SEP> (MINUTES)
<tb> 400 <SEP> 37,892
<tb> 600 <SEP> 36,026
<tb> 1000 <SEP> 33,940
<tb> 2000 <SEP> 31,154
<tb> 4000 <SEP> 28,896
<tb> 6000 <SEP> 27,868
<tb> 8000 <SEP> 26,946
<tb> 12000 <SEP> 26,192
<tb> 20000 <SEP> 25,308
<tb> 35000 <SEP> 24,216
<tb>
c) Résultats
Les poids moléculaires des composants des fractions étudiées ont été calculés en utilisant l'équation suivante, obtenue avec les standards de poids moléculaire de Fluka décrits au tableau 3 :
Poids moléculaire des composants : = 55290000 * 10^(-0,13942* x) R'=0,982 x = temps d'élution (minutes)

La première fraction contenant des composants du Mélange-1est la fraction n 44 et la dernière est la fraction n 89, ce qui veut dire que même le composant du poids moléculaire le moins élevé est sorti après 89 fractions recueillies (après une élution de 89 x 12,5 ml = 1112,5 ml). Les fractions recueillies contiennent des mono-, oligo- et polysaccharides de 184Da (mélange de monosaccharides) jusqu'à environ 21 kDa. Cette dernière fraction contient donc des polysaccharides composés en moyenne de 117 unités monosaccharidiques ou de 39 unités trisaccharidiques.

La majorité des fractions, exceptées les fractions n 77, 78,79, 81,82, 83,84, 85 et 86, contiennent un seul pic saccharidique (séparation limitée par la sensibilité de la méthode de séparation utilisée).

La concentration approximative des composants des différentes fractions a pu être déterminée en utilisant une gamme d'étalon de fucose aux concentrations croissantes. Cette sorte de gamme étalon " mono-compositionnelle " a pu être utilisée grâce au système de détection (mesure de l'indice de réfraction avec un réfractomètre).

Selon ces résultats, une solution de 1 g/ml de fucose donne en moyenne un pic de surface 29409 (unités arbitraires du système). En connaissant les surfaces des pics analysés, nous avons donc pu calculer leurs concentrations apparentes.

Les résultats obtenus montrent que le Mélange-1contient environ 26% de petits osides (jusqu'à 2Kda, environ 4 unités trisaccharidiques), environ 36% d'oligosaccharides (jusqu'à 4Kda, 8 unités trisaccharidiques) et environ 23% de polysaccharides de poids moléculaire supérieur à lOkDa (18 unités trisaccharidiques).

Compte tenu du microorganisme et de l'enzyme spécifique (endo-fucosidase) utilisés pour la préparation du Mélange-1, il apparaît que les oligosaccharides du Mélange comportent une unité fucose en position terminale non réductrice.

Exemple 3 : activité du fucose et du Mélange-1 sur l'activité des métalloprotéases matricielles de peau humaine
Il s'agit d'étudier l'effet du monosacharide fucose et du mélange d'oligosaccharides "Mélange-1"tel que préparé à l'exemple 1 ci-dessus sur l'activité des métalloprotéases matricielles (ou MMP) des fibroblastes à l'état quiescent ou stimulés par le hyaluronane. Nous avons réalisé ces tests à partir de cultures cellulaires de

fibroblastes de peau humaine cultivés en monocouches mais aussi à partir de culture d'explants pour étudier l'effet des différents traitements dans un environnement cellulaire plus proche de celui de la peau. En effet, les fibroblastes dermiques sont entourés d'une matrice extracellulaire abondante in vivo, la culture d'explant est donc un type de culture reconstituant l'environnement naturel des cellules et permettant ainsi d'étudier l'effet des traitements sur l'activité MMP des fibroblastes dans des conditions proches des conditions physiologiques. a) Méthode a.l) Culture d'expiant de peau a. 1.1) Activité MMP des explants de peau non stimulés
Des explants de peau provenant d'une peau de ventre d'une femme de 54 ans sont cultivés dans un milieu DMEM sans rouge de phénol (GIBCO) sous agitation à 37 C pendant 48 heures avec les différents traitements. Les échantillons sont testés à une concentration de lOug/ml.

Récupération des échantillons : Milieu extracellulaire : 1 ml de milieu Milieu intracellulaire : explant broyé à l'ultraturax dans 1 ml de tampon MMP Composition du tampon MMP : 0,1M Tris-HCI, pH 7,5,0,1 M NaCl, 10 mM CaCl2, 1 mM acétate de zinc
0,01 % Brij 35, 0,01 % NaN3 Zymographie : La gélatine, substrat des MMP-s, est copolymérisée à 1 mg/ml final avec un gel de polyacrylamide à 10%. Les milieux extracellulaires provenant des cultures d'explant de peau sont déposés sur le haut du gel, l'électrophorèse est faite à 150 volts. Les gels sont ensuite incubés dans du tampon MMP pendant 24 heures sous agitation à 37 C. Les gels sont alors colorés au bleu de Coomassie puis décolorés à l'eau distillée. Les plages de lyse, correspondant à une activité MMP, apparaissent comme blanches alors que le fond du gel est bleu. En fonction de la distance de migration des

protéines, on peut déterminer les poids moléculaires des enzymes ayant digéré la gélatine. L'activité MMP est quantifiée par analyse morphométrique à l'aide du logiciel Visiolab. a.1.2) Activité MMP des explants de peau stimulés avec 1 mg/ml d'hyaluronane
Le protocole des études est le même que celui utilisé pour l'étude de l'activité MMP des explants de peau non stimulés mais avec du hyaluronane à une concentration de 1 mg/ml et les échantillons d'oligosaccharides à une concentration de 10 g/ml, ajoutés dans le milieu de culture. a. 2) Culture de fibroblastes de peau a. 2.1) Activité MMP des fibroblastes de peau non stimulés
Des fibroblastes de peau provenant d'une peau de ventre d'une femme de 45 ans sont cultivés jusqu'au 7ème passage cellulaire dans un milieu DMEM Glutamax (GIBCO) contenant 1% d'antibiotiques et de fongicide et 10% de sérum de veau f#tal et sont utilisés pour l'expérimentation. Les fibroblastes sont ensemencés dans des plaques 6 puits à une densité de 5.104 cellules par puits. Lorsqu'ils sont à confluence, le milieu de culture est remplacé par un milieu DMEM sans rouge de phénol contenant 0,1% de BSA et contenant les différentes substances à traiter à une concentration de 10 g/ml. Après 24 heures de culture à 37 C (5% (v/v) CO2, 95% (v/v) air) les échantillons sont récupérés.

Milieu extracellulaire : 1 ml de milieu + 2 rinçages avec 0,25 ml de PBS Milieu intracellulaire : tapis cellulaire soniqué avec 1 ml de tampon MMP Composition du tampon MMP : 0,1 M Tris-HCl, pH 7,5,0,1 M NaCl, 10 mM CaCl2, 1 mM acétate de zinc
0,01 % Brij 35, 0,01 % NaN3 Comme dans le cas des cultures d'explants de peau, les milieux de cultures des fibroblastes sont étudiés en zymographie.

a. 2.2) Activité MMP des fibroblastes de peau stimulés avec lmg/ml de hyaluronane
Le protocole des études est le même que celui utilisé pour l'étude de l'activité MMP des fibroblastes de peau non stimulés mais avec du hyaluronane à une concentration de 1 mg/ml et les échantillons d'oligosaccharides à une concentration de 10 g/ml, ajoutés dans le milieu de culture. b) Résultats b.l) Activité MMP des explants de peau
Les MMP-s sont des enzymes qui sont sécrétées sous formes de zymogènes, inactives. Leur activation se fait par clivage protéolytique, la forme active de l'enzyme peut alors dégrader les composés de la matrice extracellulaire. Il est donc important de connaître non seulement le niveau d'expression des MMP-s mais aussi la proportion de MMP présente sous forme active, seule capable in vivo de dégrader la matrice extracellulaire, ainsi que les enzymes capables d'activer les formes latentes. Les résultats sont donc présentés sous forme du rapport de la forme active/ forme inactive de l'enzyme et les pourcentages par rapport au témoin sont calculés pour montrer l'efficacité du fucose et du Mélange-1sur leur faculté à diminuer la proportion active des MMP et inhiber éventuellement l'activation de la forme inactive.

Tableau 4 : activité MMP des explants de peau non stimulés Rapport de la forme active de l'enzyme/forme inactive % d'efficacité des traitements : réduction de ce rapport

<tb>
<tb> MMP-9 <SEP> % <SEP> MMP-2 <SEP> %
<tb> Active/Inactive <SEP> d'efficacité <SEP> Active/Inactiv <SEP> d'efficacité
<tb> e
<tb> Contrôle <SEP> 5,48 <SEP> 0,85
<tb> Fucose <SEP> 10 <SEP> g/ml <SEP> 2,38 <SEP> 57 <SEP> % <SEP> 0,80 <SEP> 6 <SEP> %
<tb> Mélange-1 <SEP> 10 <SEP> g/ml <SEP> 3,09 <SEP> 46 <SEP> % <SEP> 0,67 <SEP> 21 <SEP> %
<tb>
Ces résultats sont également présentés sous forme de l'histogramme à la Figure 1.

Le fucose et le Mélange-1sont capables de diminuer le rapport de la forme active de l'enzyme/forme inactive. Ce phénomène est plus important pour la MMP-9 que pour la MMP-2. Cette diminution de ce rapport implique que la quantité d'enzyme active, donc capable de dégrader in vivo la matrice extracellulaire, est moins importante lorsque les explants de peau sont cultivés en présence de fucose ou du Mélange-1.

Tableau 5 : activité MMP des explants de peau stimulés avec 1 mg/ml d'hyaluronane Rapport de la forme active de l'enzyme/forme inactive % d'efficacité des traitements : réduction de ce rapport

<tb>
<tb> MMP-9 <SEP> % <SEP> MMP-2 <SEP> %
<tb> Active/Inactive <SEP> d'efficacité <SEP> Active/Inactive <SEP> d'efficacité
<tb> Contrôle <SEP> 7,08 <SEP> - <SEP> 1,58 <SEP> Fucose <SEP> 10 <SEP> g/ml <SEP> 3,54 <SEP> 50% <SEP> 1,65 <SEP> Ns
<tb> Mélange- <SEP> 1 <SEP> 10 <SEP> g/ml <SEP> 1,98 <SEP> 72 <SEP> % <SEP> 0,98 <SEP> 38 <SEP> % <SEP>
<tb>
Ces résultats sont également présentés sous forme de l'histogramme à la Figure 2.

La présence d'hyaluronane dans le milieu de culture des explants de peau provoque une augmentation de la forme active des MMP-s. Le fucose et le Mélange-1 réduisent cette augmentation et sont donc capables d'inhiber cette stimulation de libération d'enzymes actives. b. 2) Activité MMP des fibroblastes
Lorsque les fibroblastes sont cultivés en monocouche, seule la MMP-2 largement sécrétée est visible avec une très faible quantité de MMP-9 néanmoins présente. Seule la forme inactive de l'enzyme MMP-2 est libérée.

Tableau 6 : activité MMP des explants de peau non stimulés % d'efficacité des traitements : réduction de l'expression de la MMP-2

<tb>
<tb>
<tb> d'efficacité
<tb> Contrôle
<tb> Fucose <SEP> 10 <SEP> g/ml <SEP> 6 <SEP> % <SEP>
<tb> Mélange-1 <SEP> 10 <SEP> g/ml <SEP> 22 <SEP> %
<tb>
Ces résultats sont également présentés sous forme de l'histogramme à la Figure 3.

On peut observer que le fucose et le Mélange-1diminuent l'expression de la MMP-2. Le Mélange-1semble être plus efficace que le fucose pour diminuer cette expression.

Tableau 7 : activité MMP des explants de peau stimulés avec 1 mg/ml d'hyaluronane % d'efficacité des traitements : réduction de l'expression de la MMP-2 par rapport au contrôle

<tb>
<tb>
<tb> d'efficacité
<tb> Contrôle
<tb> Fucose <SEP> 10 <SEP> g/ml <SEP> 11 <SEP> %
<tb> Mélange-1 <SEP> $10 <SEP> g/ml <SEP> 30 <SEP> %
<tb>
c) Conclusion
Il apparaît de ces expériences que le fucose ainsi que le Mélange-1sont capables de diminuer la synthèse ainsi que l'activation des MMP-2 et 9 par les fibroblastes de

peau humaine. De même, le fucose et le Mélange-1sont capables de freiner d'une façon efficace la surexpression des métalloprotéases en présence d'hyaluronane. Étant donné le rôle important de ces métallo-endopeptidases dans la dégradation de la matrice extracellulaire cutanée au cours du vieillissement, il s'agit là d'un effet "antivieillissement" majeur.

Exemple 4: activité du fucose et du Mélange-1 sur les fibroblastes de peau humaine
L'objectif de cette étude a été d'analyser l'action du Mélange-1 de l'exemple 1 sur l'un des paramètres caractéristiques de la communication cellulaire et de l'action de prévention du vieillissement des fibroblastes de peau humaine, à savoir, stimulation de la prolifération cellulaire des fibroblastes de peau humaine a) Méthodologie : étude de la prolifération cellulaire
Les fibroblastes de peau humaine utilisés dans cette étude proviennent d'un prélèvement cutané d'une femme de 20 ans (26ème passage). Les cellules sont cultivées dans des plaques de 12 puits, dans un milieu de culture DMEM avec 10% de sérum de veau f#tal (SVF), 1% d'antibiotiques et d'antifongiques (PSF), et luCi/ml de [3H]thymidine (ICN) pendant 72 heures en présence des produits à tester à 2 concentrations finales pour chaque échantillon : lug/ml et 10 g/ml.

Après 72 heures de culture en étuve (5% (v/v) CO2, 95% (v/v) air) à 37 C en présence des échantillons, les cellules sont lavées quatre fois avec du PBS, puis le tapis cellulaire détaché par 0,05% de trypsine. Trois ml de liquide de scintillation sont ensuite ajoutés par échantillon, puis la radioactivité incorporée dans les cellules est lue dans un compteur à scintillation. b) Résultats : action sur la prolifération cellulaire
L'incubation de 72 heures des fibroblastes avec les deux échantillons testés (concentrations de lug/ml et lOug/ml) stimule d'une façon significative la prolifération cellulaire par comparaison avec les cellules non traitées (voir tableau 8 ci-après).

Tableau 8 : de différentes concentrations du Mélange-1 sur la prolifération cellulaire des fibroblastes de peau humaine (prolifération par rapport au contrôle)

<tb>
<tb> Efficacité <SEP> par
<tb> rapport <SEP> du <SEP> p <SEP> par <SEP> rapport
<tb> Produit <SEP> Concentration <SEP> contrôle <SEP> au <SEP> contrôle
<tb> Contrôle
<tb> ***
<tb> Mélange-1 <SEP> 1 <SEP> g/ml <SEP> +48,2% <SEP> 0,000
<tb> **
<tb> Mélange-1 <SEP> 10 <SEP> g/ml <SEP> +30,8% <SEP> 0,002
<tb>
Exemple 5 : crèmeanti-âge

<tb>
<tb> % <SEP> (en <SEP> poids)
<tb> Composant
<tb> Eau <SEP> q.s.p <SEP> 100%
<tb> Sodium <SEP> benzoate <SEP> 0,2
<tb> Disodium <SEP> EDTA <SEP> 0,08
<tb> Glycerin <SEP> 2,00
<tb> Butylène <SEP> Glycol <SEP> 4,00
<tb> Carbomer <SEP> ETD <SEP> 2020 <SEP> 0,20
<tb> Ceteareth-20 <SEP> 1,00
<tb> Mineral <SEP> Oil <SEP> 3,00
<tb> Squalane <SEP> 2,00
<tb> Octyl <SEP> Palmitate <SEP> 6,00
<tb> Shea <SEP> Butter <SEP> 2,50
<tb> Cetearyl <SEP> Alcohol <SEP> 1,00
<tb> Rosa <SEP> AFF <SEP> Rubiginosa <SEP> Seed <SEP> Oil <SEP> 0,20
<tb> Decyl <SEP> Oleate <SEP> 0,50
<tb> Octyl <SEP> Methoxycinnamate <SEP> 5,00
<tb> Butyl <SEP> Methoxy-dibenzoylmethane <SEP> 0,50
<tb> BHA <SEP> 0,01
<tb> Cyclomethicone <SEP> 5,00
<tb> Cyclomethicone <SEP> & <SEP> Dimethiconol <SEP> 2,00
<tb> Dimethicone <SEP> 2,00
<tb> Fragrance <SEP> (Crematest <SEP> Feno) <SEP> 0,09
<tb> Fragrance <SEP> (Chemoderm) <SEP> 0,09
<tb> Triethanolamine <SEP> 0,30
<tb> 2-Bromo-2-Nitropropane-1,3-Diol <SEP> 0,02
<tb> Mélange-1 <SEP> 0,50
<tb>

Exemple 6 : crème anti-âge

<tb>
<tb> % <SEP> (en <SEP> poids)
<tb> Composant
<tb> Eau <SEP> q.s.p <SEP> 100%
<tb> Sodium <SEP> benzoate <SEP> 0,2
<tb> Disodium <SEP> EDTA <SEP> 0,08
<tb> Glycerin <SEP> 2,00
<tb> Butylène <SEP> Glycol <SEP> 4,00
<tb> Carbomer <SEP> ETD <SEP> 2020 <SEP> 0,20
<tb> Ceteareth-20 <SEP> 1,00
<tb> Mineral <SEP> Oil <SEP> 3,00
<tb> Squalane <SEP> 2,00
<tb> Octyl <SEP> Palmitate <SEP> 6,00
<tb> Shea <SEP> Butter <SEP> 2,50
<tb> Cetearyl <SEP> Alcohol <SEP> 1,00
<tb> Rosa <SEP> AFF <SEP> Rubiginosa <SEP> Seed <SEP> Oil <SEP> 0,20
<tb> Decyl <SEP> Oleate <SEP> 0,50
<tb> BHA <SEP> 0,01
<tb> Cyclomethicone <SEP> 5,00
<tb> Cyclomethicone <SEP> & <SEP> Dimethiconol <SEP> 2,00
<tb> Dimethicone <SEP> 2,00
<tb> Fragrance <SEP> (Crematest <SEP> Feno) <SEP> 0,09
<tb> Fragrance <SEP> (Chemoderm) <SEP> 0,09
<tb> Triethanolamine <SEP> 0,30
<tb> 2-Bromo-2-Nitropropane-1,3-Diol <SEP> 0,02
<tb> Mélange- <SEP> 0,50
<tb>

Claims

Revendications

1. Mélange d'oligosaccharides non sulfatés à base de fucose, caractérisé en ce qu'il comprend des oligosaccharides de moins de 13 unités saccharidiques comprenant au moins une unité fucose en position terminale non réductrice, et en ce qu'il est susceptible d'être obtenu par un procédé comprenant au moins une étape de dégradation d'un polysaccharide issu d'un microorganisme du genre Klebsiella pneumoniae subsp. pneumoniae.

2. Mélange d'oligosaccharides selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il comprend, par rapport au poids total du mélange, au moins 15 % en poids d'oligosaccharides de moins de 13unités saccharidiques comprenant au moins une unité fucose en position terminale non réductrice

3. Mélange d'oligosaccharides selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce qu'il comprend, par rapport au poids total du mélange, de 20 à 50 % en poids d'oligosaccharides de moins de 13unités saccharidiques comprenant au moins une unité fucose en position terminale non réductrice.

4. Mélange d'oligosaccharides selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il comprend en outre, par rapport au poids total du mélange, de 25 à 45 % en poids d'oligosaccharides ayant de 13 à 24 unités saccharidiques comprenant au moins une unité fucose en position terminale non réductrice.

5. Mélange d'oligosaccharides selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il comprend en outre, par rapport au poids total du mélange, de 15 à 35 % en poids d'oligosaccharides de plus de 54 unités saccharidiques comprenant au moins une unité fucose en position terminale non réductrice.

6. Mélange d'oligosaccharides selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que les oligosaccharides comprennent, au moins en partie, le motif de répétition fucose-galactose-acide galacturonique.

7. Mélange d'oligosaccharides selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il est susceptible d'être obtenu par le procédé comprenant les étapes consistant à : a) faire croître le microorganisme du genre Klebsiella pneumoniae subsp. pneumoniae dans un milieu nutritif aqueux par fermentation aérobie d'une source de glucide assimilable;

b) récupérer le polysaccharide formé à partir du moût de fermentation; c) soumettre le polysaccharide à une hydrolyse modérée; d) soumettre le produit d'hydrolyse de l'étape c) à une hydrolyse enzymatique ; et e) désactiver l'enzyme puis récupérer le mélange d'oligosaccharides ainsi formé.

8. Mélange d'oligosaccharides selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que le microorganisme Klebsiella pneumoniae subsp. pneumoniae est le microorganisme déposé à la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes sous le numéro 1-1507, ou un mutant de ce dernier.

9. Mélange d'oligosaccharides selon la revendication 7 ou 8, caractérisé en ce l'hydrolyse modérée est réalisée par un traitement choisi dans le groupe constitué par les traitements aux rayons gamma, les traitements de protolyse et les combinaisons de ces traitements.

10. Mélange d'oligosaccharides selon l'une quelconque des revendications 7 à 9, caractérisé en ce que l'hydrolyse enzymatique est réalisée avec au moins une endofucosidase

11. Mélange selon la revendication 10, caractérisé en ce que l'endo-fucosidase est la Fermizyme HCP.

12. Composition cosmétique ou pharmaceutique, caractérisée en ce qu'elle comprend, en tant qu'agent cosmétiquement ou pharmaceutiquement actif, au moins un mélange d'oligosaccharides selon l'une quelconque des revendications précédentes et au moins un excipient cosmétiquement ou pharmaceutiquement acceptable.

13. Composition selon la revendication 12, caractérisée en ce qu'elle est une composition dermatologique.

14. Composition selon la revendication 12 ou 13, caractérisée en ce que le mélange d'oligosaccharides est présent selon une proportion comprise entre environ 0,001et environ 20% en poids, par rapport au poids total de la composition.

15. Utilisation du mélange d'oligosaccharides selon l'une quelconque des revendications 1 à 11, pour la préparation d'une composition destinée à stimuler la communication cellulaire entre les cellules de la peau.

16. Utilisation du mélange d'oligosaccharides selon l'une quelconque des revendications 1 à 11, pour la préparation d'une composition destinée à stimuler la prolifération cellulaire des kératynocytes de la peau.

17. Utilisation du mélange d'oligosaccharides selon l'une quelconque des revendications 1 à 11, pour la préparation d'une composition destinée à stimuler la prolifération cellulaire des fibroblastes de la peau.

18. Utilisation du mélange d'oligosaccharides selon l'une quelconque des revendications 1 à 11, pour la préparation d'une composition destinée à inhiber la synthèse des protéases de type élastase par les fibroblastes de la peau.

19. Utilisation du mélange d'oligosaccharides selon l'une quelconque des revendications 1 à 11, pour la préparation d'une composition destinée à inhiber la surexpression des protéases MMP-2 et MMP-9 induite par l'hyaluronane.

20. Utilisation selon la revendication 18 ou 19, caractérisée en que la composition est destinée à inhiber la synthèse des protéases MMP-2 et MMP-9 par les fibroblastes de la peau.

21. Utilisation selon la revendication 19 ou 20, caractérisée en que la composition est destinée à diminuer la sensibilité de la peau à l'irritation.

22. Utilisation du mélange d'oligosaccharides selon l'une quelconque des revendications 1 à 11, pour la préparation d'une composition destinée à stimuler le dépôt de fibres de collagène dans le derme.

23. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 15 à 22, caractérisée en ce que le mélange d'oligosaccharides est utilisé selon une proportion comprise entre environ 0,001 et environ 20% en poids, par rapport au poids total de la composition.

24. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 15 à 23, caractérisée en ce que la composition préparée comprend en outre un excipient cosmétiquement ou pharmaceutiquement acceptable.

25. Méthode de traitement cosmétique de la peau, caractérisée en ce qu'on applique sur la peau une composition cosmétique comprenant au moins un mélange d'oligosaccharides tel que défini à l'une quelconque des revendications 1 à 11.

26 . Méthode de traitement cosmétique selon la revendication 25, caractérisée en ce que la composition cosmétique comprend en outre un excipient cosmétiquement acceptable.