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FR2774394A1 - Composes transfectants sensibles aux conditions reductrices, compositions pharmaceutiques les contenant, et leurs applications - Google Patents

Composes transfectants sensibles aux conditions reductrices, compositions pharmaceutiques les contenant, et leurs applications Download PDF

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FR2774394A1
FR2774394A1 FR9801065A FR9801065A FR2774394A1 FR 2774394 A1 FR2774394 A1 FR 2774394A1 FR 9801065 A FR9801065 A FR 9801065A FR 9801065 A FR9801065 A FR 9801065A FR 2774394 A1 FR2774394 A1 FR 2774394A1
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FR
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transfer agent
nucleic acid
nucleic acids
transfer
composition according
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FR9801065A
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Gerardo Byk
Catherine Dubertret
Bruno Pitard
Daniel Scherman
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Aventis Pharma SA
Original Assignee
Rhone Poulenc Rorer SA
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    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
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    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • C12N15/88—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation using microencapsulation, e.g. using amphiphile liposome vesicle
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Abstract

La présente invention se rapporte à un nouvel agent pour le transfert d'acides nucléiques dans les cellules. Cet agent est plus particulièrement caractérisé en ce qu'il est capable de complexer les acides nucléiques en milieu oxydant, et en ce qu'il est déstabilisé et/ ou se désagrège en milieu réducteur. L'invention concerne également les compositions comprenant un tel agent, et ses utilisations pour le transfert in vitro, in vivo, ou ex vivo d'acides nucléiques d'intérêt dans différents types cellulaires.

Description

La présente invention se rapporte à un nouvel agent pour le transfert d'acides nucléiques dans les cellules. Cet agent est plus particulièrement caractérisé en ce qu'il est capable de complexer les acides nucléiques en milieu oxydant, et en ce qu'il est déstabilisé et/ou se désagrège en milieu réducteur. Ce nouvel agent est utilisable pour transférer des acides nucléiques d'intérêt dans différents types cellulaires, aussi bien in vitro qu' in vivo, ou ex vivo.
Avec le développement des biotechnologies, la possibilité de transférer efficacement des acides nucléiques dans les cellules est devenue une nécessité. II peut s'agir du transfert d'acides nucléiques dans des cellules in vitro, par exemple pour la production de protéines recombinantes, ou au laboratoire, pour l'étude de la régulation de l'expression de gènes, le clonage de gènes, ou toute autre manipulation impliquant l'ADN. II peut également s'agir du transfert d'acides nucléiques dans des cellules in vivo, par exemple pour la création d'animaux transgéniques, la réalisation de vaccins, des études de marquage ou également des approches thérapeutiques. II peut encore s'agir du transfert d'acides nucléiques dans des cellules ex vivo, dans des approches de greffes de moelle osseuse, d'immunothérapie ou d'autres méthodes impliquant le transfert de gènes dans des cellules prélevées d'un organisme, en vue de leur réadministration ultérieure.
Différents types de vecteurs synthétiques ont été développés pour améliorer le transfert des acides nucléiques dans les cellules. Parmi ces vecteurs, les lipides cationiques possèdent des propriétés intéressantes. Ces vecteurs sont constitués d'une partie polaire, cationique, interagissant avec les acides nucléiques, et d'une partie lipidique, hydrophobe, favorisant la pénétration cellulaire. Des exemples
particuliers de lipides cationiques sont notamment les lipides monocationiques
(DOTMA : Lipofectin certains détergents cationiques (DDAB); les lipopolyami
nes, en particulier la dioctadécylamidoglycyl spermine (DOGS) ou la 5carboxyspermylamide de la palm itoylphosphatidyléthanolam ine (DPPES), dont la
préparation a été décrite par exemple dans la demande de brevet EP 394 111. On
peut également mentionner plus particulièrement les produits cités dans les de mandes WO 96/17823 et WO 97/18185 (incorporées à la présente par référence), et notamment le RPR 120 531 et le RPR 120 535.
La présente invention se rapporte à un nouveau type d'agents de transfert d'acides nucléiques, possédant des propriétés améliorées par rapport aux vecteurs décrits précédemment. Plus précisément, la présente invention est relative à des agents de transfert d'acides nucléiques sensibles aux conditions réductrices. Ces nouveaux agents sont ainsi capables (i) de complexer efficacement les acides nucléiques en milieu oxydant (à savoir dans des conditions atmosphériques), grâce à leur partie hydrophile cationique, (ii) de transférer ces acides nucléiques dans les cellules, en raison de leurs propriétés lipophiles, et (iii) de libérer efficacement, soit lors du passage membranaire, soit à l'intérieur de la cellule, les acides nucléiques complexés. Ces nouveaux agents de transfert sont donc avantageux dans la mesure où ils augmentent l'efficacité du transfert de gènes dans les cellules. En effet, les systèmes de transfert de gènes antérieurs sont basés sur la réalisation de complexes stables entre l'acide nucléique et l'agent. Ces complexes, s'ils sont nécessaires au transfert efficace des acides nucléiques dans les cellules, limitent néanmoins l'accès desdits acides nucléiques aux différents compartiments cellulaires et à la machinerie cellulaire de transcription. Ainsi, une fraction seulement des acides nucléiques complexés sera effectivement amplifiée et/ou transcrite en produits d'intérêt. Ce type de phénomène a été notamment illustré dans l'article
"Cellular and Molecular Barriers to Gene Transfer by a Cationic Lipid" (Zabner, J.;
Fasbender, A.J.; Moninger, T.; Poellinger, K.A. and Welsh, M.; J. Biol. Chem.
], N" 32, 18997-19007). Ces travaux montrent en effet qu'un acide nucléique
injecté dans le noyau des cellules sous forme complexée à un lipide n'est pas ou
peu transcrit, alors que ce même acide nucléique, administré sans vecteur ("ADN
nu") est efficacement transcrit.
Les nouveaux agents de transfert selon l'invention permettent avantageusement
d'améliorer l'efficacité de libération intracellulaire des acides nucléiques, sans di
minuer l'efficacité de transfert intracellulaire. Ces nouveaux agents permettent no tamment d'utiliser des doses de complexe acide nucléique/agent de transfert plus réduites, et de minimiser la toxicité éventuelle de ces complexes.
Un autre avantage des agents de l'invention réside également dans leur toxicité intrinsèque réduite. En effet, l'agent étant dégradé dans la cellule, il n'exerce pas l'effet toxique observé par les vecteurs de transfert classiques.
Un autre aspect avantageux des agents de l'invention réside dans le fait qu'ils génèrent, dans la cellule, des produits de type chaînes alkyle polyaminées qui sont des déstabilisants des membranes. De ce fait, ces agents permettent non seulement une dissociation efficace du complexe entre l'acide nucléique et l'agent de transfert, mais également une libération améliorée des acides nucléiques dans les compartiments cellulaires par déstabilisation des membranes. Ces agents ont donc un double effet positif sur l'efficacité de libération des acides nucléiques dans les cellules.
Un premier objet de l'invention concerne donc des agents de transfert d'acides nucléiques caractérisés en ce qu'ils forment, en milieu oxydant, des complexes avec des acides nucléiques, et ils sont déstabilisés et/ou dégradés en milieu réducteur et libèrent les acides nucléiques complexés.
Un agent de transfert préféré selon l'invention est un lipide cationique comprenant une région hydrophile cationique capable de s'associer de manière non-covalente avec des acides nucléiques, et une région lipophile qui facilite le passage à travers la membrane cellulaire, ces deux régions étant reliées l'une à l'autre par l'intermédiaire d'un bras dit "espaceur".
La région hydrophile cationique présente dans les agents selon l'invention est préférentiellement une région polyamine. Avantageusement, la région polyamine répond à la formule générale: H2N-(-(CH)m-NH-)a-H dans laquelle m est un nombre entier supérieur ou égal à 2 et I est un nombre entier supérieur ou égal à 1, m pouvant varier entre les différents groupes de carbone compris entre deux amines. Préférentiellement, m est compris entre 2 et 6 inclusi vement, et I est compris entre 1 et 5 inclusivement. Encore plus préférentiellement, la région polyamine est représentée par la spermine ou par un analogue polyaminé ayant conservé ses propriétés de liaison à l'acide nucléique. Une autre région polyamine préférée répond à la formule générale suivante:
Figure img00040001

dans laquelle R1, R2, et R3 représentent indépendamment l'un de l'autre un atome d'hydrogène ou un groupement-(CH2)q-NRR' avec q pouvant varier entre 1, 2, 3, 4, 5, et 6 ceci de manière indépendante entre les différents groupements R1, R2, et
R3, et R et R' représentent indépendamment l'un de l'autre un atome d'hydrogène ou un groupement -(CH2)q-NH2 avec q défini comme précédemment, et m et n représentent indépendamment l'un de l'autre un nombre entier pouvant varier entre 0 et 6 avec, lorsque n est supérieur à 1, m pouvant prendre des valeurs différentes et
R3 des significations différentes au sein de la formule générale ci-dessus (WO 97/18185).
La région lipophile présente dans les agents selon l'invention peut être constituée d'une ou plusieurs chaînes aliphatiques, éventuellement d'un ou plusieurs dérivés de stéroïde, d'un lipide naturel ou synthétique, ou éventuellement d'une combinaison de ceux-ci, de préférence capable de former des phases lamellaires ou hexagonales.
Ces structures sont caractérisées par des distances entre les lamelles ou les tubes qui dépendent de la longueur de la chaîne aliphatique grasse ou de la partie polaire du lipide.
Dans un mode préféré de mise en oeuvre, la région lipophile est composée de deux chaînes aliphatiques grasses au moins. Encore plus préférentiellement, elle est composée de deux ou trois chaînes aliphatiques grasses.
Le terme "chaîne aliphatique grasse" désigne au sens de l'invention une chaîne aliphatique, saturée ou non, fluorée ou non, ramifiée ou linéaire, comprenant de dix à vingt-deux atomes de carbone, de préférence douze à vingt-deux. On peut citer plus particulièrement les groupements aliphatiques en C12, C13, C14, C16, C18, C19, etc..., et notamment les groupements (CH2)11CH3, (CH2)12CH3, (CH2)13CH3, et (CH2)17CH.
Dans un autre mode préféré de mise en oeuvre, la région lipophile comprend au moins un dérivé d'un stéroïde. II peut être plus particulièrement choisi parmi le cholestérol, l'acide cholique, ou la cholestérylamine.
La région polyamine et la région lipophile peuvent être reliées entre elles par l'intermédiaire d'un bras dit "espaceur". L'espaceur peut être décrit non-limitativement comme un groupement acide ou amine comportant des fonctions hydrolysables, connu de l'homme du métier.
De manière préférée, la région dite espaceur comporte une chaîne aliphatique ou aromatique. Préférentiellement, la région espaceur est choisie parmi les groupements amide, carbamate, ester, éther, cycles aromatiques, etc.
Les agents de l'invention sont, de manière particulièrement avantageuse, des dérivés de la famille des lipopolyamines ou des lipopolyaminoguanidines.
La capacité des agents de l'invention à se déstabiliser et/ou à se dégrader en milieu réducteur résulte avantageusement de la présence, dans leur structure, d'une ou plusieurs fonctions sensibles aux conditions réductrices.
Avantageusement, lesdites fonctions sont des liaisons sensibles aux conditions réductrices du milieu intracellulaire, et notamment des liaisons covalentes. Il s'agit préférentiellement d'un ou plusieurs ponts disulfure.
Les ponts disulfure présentent la propriété de constituer des liaisons covalentes stables en milieu oxydant, et de se casser en milieu réducteur, selon le schéma suivant:
X-S-S-Y o X-SH + HS-Y
Ce type de structure se retrouve par exemple dans certaines protéines possédant des acides aminés cystéine, et contribue à leur structure tridimensionnelle et donc à leur activité biologique. Des ponts disulfure ont par ailleurs déjà été introduits dans certaines protéines chimériques, et en particulier dans des immunotoxines, pour relier le domaine de ciblage au domaine actif.
La demanderesse a maintenant montré que ce type de fonction pouvait être introduit dans un vecteur synthétique de transfert d'acides nucléiques, en particulier de type lipide cationique. La demanderesse a également montré que la présence de ce type de fonction dans le vecteur n'affectait pas sa capacité de complexer les acides nucléiques en milieu non-réducteur. Elle montre aussi que les propriétés de transfert d'acides nucléiques de ces agents sont conservées, voire même améliorées. La demanderesse a notamment mis en évidence que les propriétés de transfert sont significativement améliorées lorsque la lipophilie de ces agents est suffisante et qu'ils sont utilisés en quantité adéquate. Plus particulièrement, il a été montré que l'un des intérêts majeurs d'augmenter la lipophilie de ces agents, ou bien d'introduire une chaîne dérivée d'un stéroïde, est l'induction d'une résistance au sérum améliorée. Par ailleurs, les complexes formés sont déstabilisés et/ou désagrégés en milieu réducteur, ce qui permet de dissocier l'acide nucléique et ainsi de le rendre accessible à la machinerie de transcription cellulaire.
Les agents de transfert selon l'invention présentent donc la propriété de se déstabiliser et/ou de se dégrader en milieu réducteur. Les termes "déstabilisé" et "dégradé" désignent généralement au sens de l'invention toute modification structurale de l'agent conduisant à la dissociation partielle ou totale du complexe formé entre l'acide nucléique et l'agent de transfert. Cette dissociation aboutit préférentiellement à la libération de l'acide nucléique. Plus précisément, la modification structurale correspond à une rupture d'au moins une liaison covalente présente dans la molécule. Cette rupture déstabilise le complexe, ou bien détruit l'intégrité du complexe qui se désagrège ensuite progressivement pour aboutir à des éléments dissociés. Préférentiellement, ladite liaison covalente est une liaison disulfure.
La dégradation du complexe peut être aisément contrôlée en microscopie ou par électrophorèse.
Les agents selon l'invention se complexent donc efficacement aux acides nucléiques en milieu oxydant, et sont déstabilisés et/ou se désagrègent en milieu réducteur. L'avantage de ce type de vecteur réside dans le fait que le milieu intracellulaire, en particulier le cytoplasme et surtout les endosomes, est un milieu réducteur dans lequel les ponts disulfure sont réduits. Ces vecteurs permettent donc une libération conditionnelle des acides nucléiques dans les cellules, en raison du potentiel rédox existant.
On entend au sens de l'invention par milieu réducteur un milieu réducteur naturel, par exemple le milieu intracellulaire ou membranaire. Un milieu réducteur artificiel représentatif des conditions naturelles est par exemple un milieu comportant 0,1 % à 20% de DTT (dithiotreitol).
Par opposition, on entend par milieu oxydant tout milieu qui est en contact avec l'oxygène de l'atmosphère et qui ne contient pas d'agent réducteur, notamment le milieu extracellulaire. Un milieu oxydant représentatif est par exemple constitué d'une solution isotonique de chlorure de sodium 150 mM, ou d'une solution contenant 5% de glucose.
L'agent de transfert selon l'invention peut comporter une ou plusieurs liaisons sensibles aux conditions réductrices (e.g. ponts disulfure). Le nombre de ces liaisons est déterminé par l'homme du métier en fonction de la structure de l'agent de transfert. Avantageusement, I'agent comporte un ou deux ponts disulfure, et de préférence un pont disulfure.
Dans l'agent de transfert, les ponts disulfure peuvent être positionnés en différents endroits. La position dépend du nombre de ponts, et de la structure de l'agent.
Selon une première variante, le pont disulfure est positionné de sorte que sa réduction entraîne une séparation de la région cationique et de la région lipophile.
Pour cela, il est par exemple possible de positionner le pont disulfure dans la région charnière entre les deux domaines de l'agent, en particulier au sein de l'espaceur. II est également possible de positionner le pont disulfure dans le domaine cationique, à proximité de la région charnière avec le domaine lipophile ou, réci proquement, dans le domaine lipophile, à proximité de la région charnière avec le domaine cationique.
Selon un autre mode de réalisation, le pont disulfure est positionné de sorte que sa réduction entraîne une dégradation partielle de la région lipophile. C'est en effet la région lipophile qui assure l'intégrité du complexe, et sa perturbation permet de conduire à la déstabilisation et/ou à la dégradation progressive de celui-ci. Cette dégradation partielle peut correspondre notamment à une réduction de la taille d'une chaîne grasse aliphatique ou à la perte d'une chaîne aliphatique lorsque la région lipophile en compte plusieurs, ou encore à la perte de la chaîne dérivée d'un stéroïde. De manière particulièrement avantageuse, le pont disulfure est positionné de sorte que sa réduction entraîne la perte d'une chaîne grasse aliphatique ou bien d'une chaîne dérivée d'un stéroïde présente dans la région lipophile. On entend par perte d'une chaîne grasse aliphatique soit la perte complète de celle-ci, soit une perte partielle, la partie restante étant alors trop courte pour constituer une chaîne grasse (inférieure à C10).
Selon un autre mode de réalisation, le pont disulfure est positionné entre les deux bras espaceurs d'une lipopolyamine symétrique, de sorte que sa réduction entraîne le dédoublement de la lipopolyamine.
Des agents de transfert préférés selon l'invention comprennent:
- comme région hydrophile cationique une région polyamine,
- comme région lipophile au moins deux chaînes aliphatiques grasses, ou bien au moins une chaîne dérivée d'un stéroïde et une chaîne aliphatique, et,
- un pont disulfure dont la réduction conduit à la perte d'une chaîne aliphatique au moins, ou bien d'une chaîne dérivée d'un stéroïde au moins.
De manière particulièrement avantageuse, les agents de transfert de l'invention comprennent une région polyamine, trois chaînes aliphatiques dont deux au moins sont grasses, et un pont disulfure conduisant, en milieu réducteur, à la perte d'une chaîne aliphatique.
D'autres agents de transfert particulièrement avantageux comprennent une région polyamine, une chaîne aliphatique et une chaîne dérivée d'un stéroïde, et un pont disulfure conduisant en milieu réducteur à la perte de la chaîne dérivée d'un sté roïde.
D'autres agents de transfert particulièrement avantageux sont constitués de deux lipopolyamines symétriques, et d'un pont disulfure conduisant en milieu réducteur à leur dédoublement.
De tels agents sont illustrés dans les exemples. On peut citer à titre non-limitatif les composés suivants: - NH2(CH2)3NH(CH2)4NH(CH2)3NHCH2COCys[S-S-(CH2)4CH3]-N[(CH2)17CH3]2:
Figure img00090001

- NH2(CH2)3NH(CH2)4NH(CH2)3NHCH2COCys[S-S-(CH2)17CH3]-NH(CH2)17CH3:
Figure img00090002

NH2(CH2)3NH(CH2)4NH(CH2)3NHCH2COCys[S-S-(CH2)11CH3]-N H(CH2)17CH3:
Figure img00090003

- NH2(CH2)3NH(CH2)4NH(CH2)3NHCH2COCys[S-S-(CH2)11CH3]-N[(CH2)17CH3]2 :
Figure img00100001

- NH2(CH2)3NH(CH2)4NH(CH2)3NHCH2COCys[S-S-Cholestérol]-NH (CH2)17CH3 :
Figure img00100002

- [N H2(CHZ)3NH(CH2)4N H(CH2)3NHCH2COCySNH(CH2)17CH312 :
Figure img00100003

- N H2(CH2)3N H (CH2)4N H (CH2)3N HCH2CON H (CH2)2-S-S-CH2-CO-N[(CH2)17CH3]2:
Figure img00100004
Un autre objet de l'invention concerne une composition comprenant un agent de transfert tel que défini ci-avant, et un acide nucléique. Préférentiellement, I'agent de transfert et l'acide nucléique sont présents en quantités telles que le rapport des charges positives de l'agent sur les charges négatives de l'acide nucléique soit compris entre 0,1 et 50. Ce rapport peut être ajusté aisément par l'homme du métier en fonction de l'agent utilisé, de l'acide nucléique, et du type de cellules à transfecter. Avantageusement, ce rapport se situe entre 3 et 12 nanomoles d'agent selon l'invention par pg d'acide nucléique, et de manière préférée entre 6 et 9 nanomoles d'agent transfectant par pg d'acide nucléique.
On entend au sens de l'invention par "acide nucléique" aussi bien un acide désoxyribonucléique qu'un acide ribonucléique. Il peut s'agir de séquences naturelles ou artificielles, et notamment d'ADN génomique (ADNg), d'ADN complémentaire (ADNc), d'ARN messager (ARNm), d'ARN de transfert (ARNt), d'ARN ribosomique (ARNr), de séquences hybrides ou de séquences synthétiques ou semisynthétiques, d'oligonucléotides modifiés ou non. Ces acides nucléiques peuvent être d'origine humaine, animale, végétale, bactérienne, virale, etc. Ils peuvent être obtenus par toute technique connue de l'homme du métier, et notamment par criblage de banques, par synthèse chimique1 ou encore par des méthodes mixtes incluant la modification chimique ou enzymatique de séquences obtenues par criblage de banques. Ils peuvent être modifiés chimiquement.
Concernant plus particulièrement les acides désoxyribonucléiques, ils peuvent être simple ou double brin, de même que des oligonucléotides courts ou des séquences plus longues. En particulier, les acides nucléiques sont avantageusement constitués par des plasmides, vecteurs, épisomes, cassettes d'expression, etc. Ces acides désoxyribonucléiques peuvent porter des gènes thérapeutiques, des séquences régulatrices de la transcription ou de la réplication, des séquences antisens modifiées ou non, des régions de liaison à d'autres composants cellulaires, etc.
Au sens de l'invention, on entend par gène thérapeutique notamment tout gène codant pour un produit protéique ayant un effet thérapeutique. Le produit protéique ainsi codé peut être une protéine, un peptide, etc. Ce produit protéique peut être homologue vis-à-vis de la cellule cible (c'est-à-dire un produit qui est normalement exprimé dans la cellule cible lorsque celle-ci ne présente aucune pathologie). Dans ce cas, l'expression d'une protéine permet par exemple de pallier une expression insuffisante dans la cellule ou l'expression d'une protéine inactive ou faiblement active en raison d'une modification, ou encore de surexprimer ladite protéine. Le gène thérapeutique peut aussi coder pour un mutant d'une protéine cellulaire, ayant une stabilité accrue, une activité modifiée, etc. Le produit protéique peut également être hétérologue vis-à-vis de la cellule cible. Dans ce cas, une protéine exprimée peut par exemple compléter ou apporter une activité déficiente dans la cellule, lui permettant de lutter contre une pathologie, ou stimuler une réponse immunitaire.
Parmi les produits thérapeutiques au sens de la présente invention, on peut citer plus particulièrement les enzymes, les dérivés sanguins, les hormones, les lymphokines: interleukines, interférons, TNF, etc (FR 9203120), les facteurs de croissance, les neurotransmetteurs ou leurs précurseurs ou enzymes de synthèse, les facteurs trophiques : BDNF, CNTF, NGF, IGF, GMF, aFGF, bFGF, NT3, NT5,
HARP/pléiotrophine, etc la dystrophine ou une minidystrophine (FR 9111947), la protéine CFTR associée à la mucoviscidose, les gènes suppresseurs de tumeurs p53, Rb, RaplA, DCC, k-rev, etc (FR 93 04745), les gènes codant pour des facteurs impliqués dans la coagulation : Facteurs Vll, VIII, IX, les gènes intervenant dans la réparation de 'ADN, les gènes suicides (thymidine kinase, cytosine déaminase), les gènes de l'hémoglobine ou d'autres transporteurs protéiques, les gènes correspondant aux protéines impliquées dans le métabolisme des lipides, de type apolipoprotéine choisie parmi les apolipoprotéines A-l, A-ll, A-IV, B, C-l, C-ll, C-lll,
D, E, F, G, H, J et apo(a), les enzymes du métabolisme comme par exemple la lipoprotéine lipase, la lipase hépatique, la lécithine cholestérol acyltransférase, la 7 alpha cholestérol hydroxylase, la phosphatidique acide phosphatase, ou encore des protéines de transfert de lipides comme la protéine de transfert des esters de cholesterol et la protéine de transfert des phospholipides, une protéine de liaisons des HDL ou encore un récepteur choisi par exemple parmi les récepteurs LDL, récepteurs des chylomicrons-remnants et les récepteurs scavenger.etc.
L'acide nucléique thérapeutique peut également être un gène ou une séquence antisens, dont l'expression dans la cellule cible permet de contrôler l'expression de gènes ou la transcription d'ARNm cellulaires. De telles séquences peuvent, par exemple, être transcrites dans la cellule cible en ARN complémentaires d'ARNm cellulaires et bloquer ainsi leur traduction en protéine, selon la technique décrite dans le brevet EP 140 308. Les gènes thérapeutiques comprenent également les séquences codant pour des ribozymes, qui sont capables de détruire sélectivement des ARN cibles (EP 321 201).
Comme indiqué plus haut, l'acide nucléique peut également comporter un ou plusieurs gènes codant pour un peptide antigénique, capable de générer chez l'homme ou l'animal une réponse immunitaire. Dans ce mode particulier de mise en oeuvre, I'invention permet donc la réalisation soit de vaccins soit de traitements immunothérapeutiques appliqués à l'homme ou à l'animal, notamment contre des microorganismes, des virus ou des cancers. II peut s'agir notamment de peptides antigéniques spécifiques du virus d'Epstein Barr, du virus HIV, du virus de l'hépatite B (EP 185 573), du virus de la pseudo-rage, du "syncitia forming virus, d'autres virus ou encore spécifiques de tumeurs (EP 259 212).
Préférentiellement, l'acide nucléique comprend également des séquences permettant l'expression du gène thérapeutique et/ou du gène codant pour le peptide antigénique dans la cellule ou l'organe désiré. II peut s'agir des séquences qui sont naturellement responsables de l'expression du gène considéré lorsque ces séquences sont susceptibles de fonctionner dans la cellule infectée. II peut également s'agir de séquences d'origine différente (responsables de l'expression d'autres protéines, ou même synthétiques). Notamment, il peut s'agir de séquences promotrices de gènes eucaryotes ou viraux. Par exemple, il peut s'agir de séquences promotrices issues du génome de la cellule que l'on désire infecter. De même, il peut s'agir de séquences promotrices issues du génome d'un virus. A cet égard, on peut citer par exemple les promoteurs des gènes E1A, MLP, CMV, RSV, etc. En outre, ces séquences d'expression peuvent être modifiées par addition de séquences d'activation, de régulation, etc. Il peut aussi s'agir de promoteur, inductible ou répressible.
Par ailleurs, I'acide nucléique peut également comporter, en particulier en amont du gène thérapeutique, une séquence signal dirigeant le produit thérapeutique synthétisé dans les voies de sécrétion de la cellule cible. Cette séquence signal peut être la séquence signal naturelle du produit thérapeutique, mais il peut également s'agir de toute autre séquence signal fonctionnelle, ou d'une séquence signal artificielle. L'acide nucléique peut également comporter une séquence signal dirigeant le produit thérapeutique synthétisé vers un compartiment particulier de la cellule.
Les compositions peuvent en outre comporter des adjuvants capables de s'associer au complexe agent de transfert/acide nucléique et d'en améliorer le pouvoir transfectant.
Dans cette optique, les compositions selon l'invention peuvent comprendre comme adjuvant un ou plusieurs lipides neutres. De telles compositions sont particulièrement avantageuses, notamment lorsque le rapport de charges positives de l'agent sur les charges négatives de l'acide nucléique est faible. La demanderesse a en effet montré que l'addition d'un lipide neutre permet d'améliorer la formation de particules nucléolipidiques et, de manière surprenante, de favoriser la pénétration cellulaire en déstabilisant la membrane.
Plus préférentiellement, les lipides neutres utilisés dans le cadre de la présente invention sont des lipides à deux chaînes grasses.
De manière particulièrement avantageuse, on utilise des lipides naturels ou synthétiques, zwitterioniques ou dépourvus de charge ionique dans les conditions physiologiques. Ils peuvent être choisis plus particulièrement parmi la dioleoylphosphatidyléthanolamine (DOPE), l'oléoylpalmitoylphosphatidyléthanolamine (POPE), les di-stéaroyl, -palmitoyl, -cholestéryl, -mirystoylphosphatidyléthanolamines ainsi que leurs dérivés N-méthylés un à trois fois, les phosphatidyl glycérols, les glycosyldiacylglycérols, les cérébrosides (tels que notamment les galactocérébrosides), les sphingolipides (tels que notamment les sphingomyélines), ou encore les asialogangliosides (tels que notamment les asialoGM1 et
GM2). Ces différents lipides peuvent être obtenus soit par synthèse, soit par extraction à partir d'organes (par exemple le cerveau) ou d'oeufs, par des techniques classiques bien connues de l'homme du métier. En particulier, l'extraction des lipides naturels peut être réalisée au moyen de solvants organiques (voir également
Lehninger Biochemistry).
Très récemment, la demanderesse a démontré qu'il était également particulièrement avantageux d'employer à titre d'adjuvant, un composé intervenant ou non directement au niveau de la condensation dudit acide nucléique (WO 96/25508).
La présence d'un tel composé, au sein d'une composition transfectante à base d'une lipopolyamine, permet de diminuer considérablement la quantité de cet agent, avec les conséquences bénéfiques qui en découle sur le plan toxicologique, sans porter un préjudice quelconque à l'activité transfectante de ladite composition.
Au contraire, celle-ci possède avantageusement un niveau de transfection supérieur.
Par composé intervenant au niveau de la condensation de l'acide nucléique, on entend définir un composé compactant, directement ou non, l'acide nucléique. Plus précisément, ce composé peut soit agir directement au niveau de l'acide nucléique à transfecter soit intervenir au niveau d'un composé annexe qui lui est directement impliqué dans la condensation de cet acide nucléique. De préférence, il agit directement au niveau de l'acide nucléique.
Selon un mode de réalisation préféré, cet agent intervenant au niveau de la condensation de l'acide nucléique est constitué, en tout ou partie, de motifs peptid tone, d'une nucléoline, d'une protamine et/ou de l'un de leurs dérivés. Un tel composé peut avantageusement être incorporé dans la composition revendiquée.
Préférentiellement, les compositions de l'invention comprennent de 0,01 à 20 équivalents d'adjuvant pour un équivalent d'acides nucléiques en poids/poids, et plus préférentiellement de 0,5 à 5.
Les compositions selon l'invention peuvent également mettre en oeuvre un ou plusieurs éléments de ciblage permettant de diriger les complexes nucléiques vers des recepteurs ou des ligands à la surface de la cellules. A titre d'exemple, la composition de la présente invention peut comprendre un ou plusieurs anticorps dirigés contre des molécules de la surface cellulaire, ou encore un ou plusieurs ligands de recepteurs membranaires comme l'insuline, la transferrine, I'acide folique ou tout autre facteur de croissance, cytokines ou vitamines. Avantageusement, la composition peut utiliser des lectines, modifiées ou non, afin de cibler des polysaccharides particuliers à la surface de la cellule ou sur la matrice extracellulaire avoisinante. Des protéines à motif RGD, des peptides contenant un tandem de motifs
RGD, cyclique ou non, ainsi que des peptides polylysine peuvent ainsi être utilisés.
Plus récemment, il a également été décrit des peptides ligands, naturels ou synthétiques, intéressants notamment pour leur sélectivité vis à vis de cellules spécifiques et capables de promouvoir efficacement l'internalisation au niveau de ces cellules. ( Bary et al. Nature Medicine, 2, 1996, 299-305). Ces agents de ciblages sont généralement conjugués à l'agent de transfection cationique considéré.
L'invention s'étend également à toute composition telle que définie ci-avant et comprenant en outre un ou plusieurs autres agents connus pour transfecter l'acide nucléique. Notamment, on peut citer les produits décrits dans le brevet EP 394 111 et dans les demandes de brevet WO 96/17823, ou WO 97/18185 (incorporées à la présente par référence), et plus particulièrement les composés RPR 120528, RPR 121650, ou RPR 120535.
La demanderesse a récemment démontré l'existance d'une synergie entre un virion comme agent de transduction d'un gène d'intérêt thérapeutique, et le lipofectant comme assistant de transfection.
Un autre objet de l'invention concerne donc les compositions qui associent à l'agent de transfection selon l'invention un ou plusieurs virus non enveloppés recombinants et comprenant dans leur génome au moins un acide nucléique exogène.
Les composés selon l'invention sont particulièrement intéressants pour leur utilisation dans le transfert d'acides nucléiques dans des cellules primaires ou dans des lignées établies. II peut s'agir de cellules fibroblastiques, musculaires, nerveuses (neurones, astrocytes, cellules gliales), hépatiques, hématopoiétiques (lymphocytes, CD34, dendritiques, etc...), épithéliales, etc..., sous forme différenciées ou pluripotentes (précurseurs).
Un autre objet de la présente invention concerne également l'utilisation d'un composé selon l'invention pour le transfert d'acides nucléiques dans les cellules in vitro, in vivo, ou ex vivo.
Les compositions selon l'invention peuvent être formulées en vue d'administrations par voie topique, cutanée, orale, rectale, vaginale, parentérale, intranasale, intraveineuse, intramusculaire, sous-cutanée, intraoculaire, transdermique, intratrachéale, intrapéritonéale, etc... De préférence, les compositions pharmaceutiques de l'invention contiennent un véhicule pharmaceutiquement acceptable pour une formulation injectable, notamment pour une injection directe au niveau de l'organe désiré, ou pour une administration par voie topique (sur peau et/ou muqueuse). II peut s'agir en particulier de solutions stériles, isotoniques, ou de compositions sèches, notamment lyophilisées, qui, par addition selon le cas d'eau stérilisée ou de sérum physiologique, permettent la constitution de solutions injectables. Les doses d'acide nucléique utilisées pour l'injection ainsi que le nombre d'administrations peuvent être adaptées en fonction de différents paramètres, et notamment en fonction du mode d'administration utilisé, de la pathologie concernée, du gène à expri mer, ou encore de la durée du traitement recherchée. En ce qui concerne plus particulièrement le mode d'administration, il peut s'agir soit d'une injection directe dans les tissus ou les voies circulatoires, soit d'un traitement de cellules en culture suivi de leur réimplantation par injection ou greffe.
L'invention se rapporte en outre à une méthode de transfert d'acides nucléiques dans les cellules comprenant les étapes suivantes:
(1) la mise en contact de l'acide nucléique avec un agent de transfert tel que défini ci-avant, pour former un complexe acide nucléique/agent de transfert,
(2) la mise en contact des cellules avec le complexe formé en (1).
Dans le cas d'une composition comprenant un ou plusieurs autres agents de transfection et/ou un ou plusieurs adjuvants, l'étape (1) est précédée d'une étape de mise en contact des différents agents de transfection et/ou d'une étape de mise en contact de l'agent de transfection avec le ou les adjuvants.
Les complexes agent selon l'invention/acide nucléique sont formés en mélangeant volume à volume deux solutions contenant l'une l'agent de transfection selon l'invention sous forme de micelles ou de phase lamellaire hexagonale, et l'autre l'acide nucléique à transfecter. Les complexes se forment en quelques secondes.
Ils peuvent être chargés négativement, positivement, ou être neutres, en fonction de la quantité de lipide ajoutée à l'acide nucléique (Pitard B. et al., Proc. Natl.
Acad. Sci. USA, Vol. 94, pp. 14412-14417, December 1997). Les tailles de ces complexes varient entre 50 et 300 nm en diamètre (mesuré par diffusion quasiélastique de la lumière et par microscopie électronique à transmission). Par ailleurs, la morphologie des complexes varie avec le rapport de charge R (rapport des charges positives apportées par le lipide cationique et des charges négatives apportées par l'acide nucléique). Par exemple, les complexes chargés négativement sont entourés de molécules d'acide nucléique. Par contre, les complexes chargés positivement présentent des lipides cationiques à leur surface. Quant aux complexes neutres, ils sont colloïdalement instables. La demanderesse a ainsi montré qu'il était possible de les stabiliser par ajout d'un agent de surface non ioni que en quantité suffisante. Des agents de surface préférés sont notamment les poloxamères, les polyoxyéthylène alcools, le polyoxyéthylènenonylphényléther, ou bien les PEG (polyéthylèneglycol) à tête polyéther benzylique dendritique.
La mise en contact des cellules avec le complexe peut être réalisée par incubation des cellules avec ledit complexe (pour des utilisations in vitro ou ex vivo), ou par injection du complexe dans un organisme (pour des utilisations in vivo). L'incubation est réalisée de préférence en présence de par exemple de 0,01 à 1000 pg d'acide nucléique pour 106 cellules.
La présente invention fournit ainsi une méthode particulièrement avantageuse pour le traitement de maladies comprenant l'administration in vivo, ex vivo, ou in vitro d'un acide nucléique apte à corriger ladite maladie, associé à un composé selon l'invention. Plus particulièrement, cette méthode est applicable aux maladies résultant d'une déficience ou d'un manque en produit protéique ou nucléique. L'acide nucléique administré code pour ledit produit protéique ou contient ledit produit nucléique.
La présente invention sera plus complètement décrite à l'aide des figures et des exemples qui suivent et qui doivent être considérés comme illustratifs et non limitatifs.
Figures
Figure 1: Suivi de l'influence de la concentration en dithiotreitol sur la libération de l'ADN à partir de complexes composé (VII)/ADN (6 nmoles) par électrophorèse sur gel d'agarose à 0,8%.
Les zones a, b, c, d, et e correspondent respectivement à des concentrations de 0 mmol, 0,1 mmol, 0,2 mmol, 1 mmol, et 5 mmol de dithiotreitol.
Fiaure 2: Structure des complexes composé (VII)/ADN au rapport de charges (+/-) de 6.
Fiaure 3 : Activité de transfection du composé (VI) dans les cellules HepG2, en l'absence de sérum, comparativement au RPR 120535.
Fiaure 4 : Activité de transfection du composé (I) et du composé (IV) dans les cellules HepG2 et HeLa, en présence et en l'absence de sérum, comparativement au RPR 120535.
Fiaure 5 : Activité de transfection du composé (II) dans les cellules HepG2, en présence et en l'absence de sérum, comparativement au RPR 120535.
Fiaure 6 : Activité de transfection du composé (V) dans les cellules HepG2 et He
La, en présence et en l'absence de sérum, comparativement au RPR 120535B.
Exemples 1. SYNTHESES CHIMIQUES DES LIPIDES CATIONIQUES SENSIBLES AUX
CONDITIONS REDUCTRICES A MATERIEL - La triéthylamine, la N-éthyldiisopropylamine, la dioctadécylamine, la Na, Na' diBoccystine, et le réactif BOP sont disponibles dans le commerce.
II en va de même pour l'amylamine, l'octadécylamine, le penthanethiol, le dodécanethiol, l'octadécanethiol, et le thiocholestérol.
- Le BocNH(CH2)3 NBoc(CH2)4 NBoc(CH2)3 NBocCH2CO2H a été synthétisé au laboratoire suivant le mode opératoire décrit dans la demande WO 97/18185 et dans l'article Byk G., Frederic M., and Scherman D., Tetrahedron Letters (1997) 38, 3219-3222.
B. METHODES a) Analyses spectroscopiques
Les spectres RMN Proton ont été enregistrés sur des spectromètres Brucker 250 et 400 MHz. b) Techniques de chromatographie
Les analvses HPLC (Hiah Performance Liauid ChromatoaraDhv) sont réalisées sur un appareil HITACHI équipé d'un autosampler AS-2000A, d'une pompe L-6200A, d'un détecteur UV L 4000 à 220nm, et d'un intégrateur calculateur D 2500. La colonne utilisée, commercialisée par APPLIED BIOSYSTEMS, est en acier inoxydable 3 cm de longueur et de 4.6 mm de diamètre. Les phases mobiles sont l'eau et l'acétonitrile additionnées d'acide trifluoroacétique, et la phase stationnaire est
Aquapore butyl 7 micron. Le débit varie entre 1 et 4 ml/min.
Les chromatoaraphies sur couche mince (CCM) sont effectuées sur plaque aluminium 20x20 recouvertes de gel de silice. c) Purification HPLC préparative - L'appareillage utilisé est un ensemble pour la chromatographie en phase liquide en mode gradient, permettant une détection U.V.. Cette chaîne préparative est composée de:
Pompe A : GILSON modèle 305 équipée d'une tête 50 SC.
Pompe B : GILSON modèle 303 équipée d'une tête 50 SC.
Pompe iniection : GILSON modèle 303 équipée d'une tête 25 SC.
Module de Dression : GILSON modèle 806.
Mélangeur: GILSON modèle 811 C équipé d'une tête de 23 ml.
Détecteur UV : GILSON modèle 119 équipé d'une cellule préparative, et réglé à 220 nm.
Collecteur de fraction : GILSON modèle 202 équipé de portoirs n" 21.
Intéarateur: SHIMADZU modèle C-R6A.
Colonne: Colonne C4 (10 mm) en acier inoxydable de 25 cm de longueur et de 2,2 cm de diamètre commercialisée par VYDAC modèle 214 TP 1022.
- La solution de produit à purifier est chargée sur la colonne par la pompe d'injection au débit de 15 ml/min. Les phases mobiles sont l'eau et l'acétonitrile.
C SYNTHESES CHIMIQUES a) Lipopolyamines à chaînes grasses réductibles par leur pont disulfure
Ces molécules sont de structure générale:
Figure img00220001
<tb> <SEP> ,Lipide
<tb> Polyami <SEP> n <SEP> e- <SEP> Espaceu <SEP> r
<tb> <SEP> -Lipide
<tb>
Elles ont été construites de la manière suivante:
Etape
Figure img00220002
Etape 2)
Figure img00220003
Etape 3)
Figure img00220004
Les exemples suivants, donnés à titre non-limitatif, illustrent ces lipopolyamines 3.1: R1 = (CH2)4CH3; R2 = (CH2)17CH3; R3 = (CH2)17CH3 [composé (I)] 3.2: R1 = (CH2)17CH3; R2 = (CH2)17CH3; R3 = H [composé (II)] 3.3: R1 = (CH2)11CH3; R2 = (CH2)17CH3; R3 = H [composé (III)] 3.4: R1 = (CH2)11CH3; R2 = (CH2)17CH3; R3 = (CH2)17CH3 [composé (IV)] 3.5: R1 = Cholestéryl; R2 = (CH2)17CH3; R3 = H [composé (V)]
ETAPE 1
PREPARATION 1.1: NHBocCys[S-S-(CH2)4CH3]-OH
La N&alpha;, Na '-di-Boc cystine (6,81 mmol) est dissoute dans du diméthylformamide (20 ml). A cette solution est ajoutée de la triéthylamine (58,1 mmol) puis du 1pentanethiol (6,81 mmol). Le mélange est agité 2 heures à température ambiante.
La triéthylamine est évaporée puis le concentrât est additionné à une solution de
KHSO4 0,5 M (300 ml). Le produit qui précipite est extrait par 3 fois 100 ml de chloroforme. On réunit les phases organiques que l'on sèche sur du sulfate de magnésium anhydre, puis on évapore le chloroforme. L'extrait sec est solubilisé par du diéthyl éther (100 ml) puis est extrait par 3 fois 50 ml d'une solution de NaHCO3 saturée. Les phases aqueuses rassemblées sont neutralisées par addition jusqu'à pH = 3 d'une solution de KHSO4 0,5 M (350 ml). Le produit qui précipite est extrait par 3 fois 100 ml de chloroforme. Les phases organiques rassemblées sont lavées par 2 fois 50 ml d'une solution de NaCI saturée puis séchées sur du sulfate de magnésium an hydre. Le chloroforme est évaporé au rotoévaporateur. Le produit obtenu est élué par un mélange chloroforme/méthanol (9/1 V/v) sur une colonne de silice.
On obtient 2,31 mmol de produit (R = 34%).
CCM Rf = 0,63 (CHCI3/MeOH, 9:1). pur PREPARATION 1.2: NHBocCys[S-S-(CH2)17CH3]-OH
La Na, Na '-di-Boc-cystine (6,81 mmol) est dissoute dans du diméthylformamide (20 ml). A cette solution est ajoutée de la triéthylamine (58,1 mmol) puis du 1octadécanethiol (6,81 mmol). Le mélange est agité 2 heures à 40"C. La triéthylamine est évaporée au rotoévaporateur puis le concentrât est additionné à une so- lution de KHSO4 0.5 M (300 ml). Le produit qui précipite est extrait par 3 fois 100 ml de chloroforme. On réunit les phases organiques que l'on sèche sur du sulfate de magnésium anhydre, puis on évapore le chloroforme. L'extrait sec est solubilisé par du diéthyl éther (100 ml) puis est lavé par 3 fois 50 ml d'une solution de Na
HCO3 saturée. La phase éthérée est acidifiée par battages avec 2 fois 100 ml d'une solution de KHSO4 0,5 M, puis lavée par 2 fois 50 ml d'une solution de NaCI saturée. La phase éthérée est séchée sur du sulfate de magnésium anhydre puis est évaporée à sec au rotoévaporateur. Le produit brut obtenu est cristallisé dans de l'éther de pétrole.
On obtient 1,36 mmol de produit (R = 20%).
CCM Rf = 0,67 (CHCldMeOH, 9:1), HPLC Rt = 17,80 min.
PREPARATION 1.3: NHBocCys[S-S-Cholestérol]-OH
La synthèse est identique à la préparation 1.2 mais en utilisant du thiocholestérol.
On obtient un rendement de 58%.
CCM Rf = 0,59 (CHCI3/MeOH, 9:1), HPLC Rt = 19,16 min.
PREPARATION 1.4: NHBocCys[S-S-(CH2)11CH3]-OH
La synthèse est identique à la préparation 1.2 mais à température ambiante et en utilisant du 1-dodécanethiol.
On obtient un rendement de 40%.
CCM Rf = 0,69 (CHCI3/MeOH, 9:1), HPLC Rt = 13,23 min.
ETAPE 2
PREPARATION 2.1: NHBocCys[S-S-(CH2)4CH3]-N[(CH2)17CH3]2
Le produit obtenu en 1.1 (1,15 mmol) est dissout dans du dichlorométhane (10 ml) et on ajoute N-éthyldiisopropylamine (2,86 mmol), dioctadécylamine (1,15 mmol), et BOP (1,27 mmol).
Le mélange est agité durant 2 heures et suivi par CCM et HPLC.
Le dichlorométhane est évaporé au rotoévaporateur. Le brut est repris dans du chloroforme (100 ml) puis lavé successivement par 3 fois 50 ml de KHSO4 0,5 M, puis par 3 fois 50 ml d'une solution de NaHCO3 saturée , et enfin par 2 fois 50 ml d'une solution de NaCI saturée. La phase organique est séchée sur du sulfate de magnésium an hydre, puis le chloroforme est évaporé au rotoévaporateur. On obtient un rendement de 64%.
CCM Rf = 0,90 (CHCI3/MeOH, 9:1), HPLC Rt = 25,96 min.
PREPARATION 2.2: NHBocCys[S-S-(CH2)17CH3]-NH(CH2)17CH3
La synthèse est identique à la préparation 2.1 mais en utilisant le produit obtenu dans la préparation 1.2 comme réactif de départ.
On obtient un rendement de 97%.
CCM Rf = 0,89 (CHCI3/MeOH, 9:1), HPLC Rt = 24,84 min.
PREPARATION 2.3 : NHBocCys[S-S-(CH2)1 1CH3]-NH(CH2)17CH3
La synthèse est identique à la préparation 2.1 mais en utilisant le produit de la préparation 1.4 comme réactif de départ.
On obtient un rendement de 86%.
CCM Rf = 0,90 (CHCI3/MeOH, 9:1), HPLC Rt = 22,22 min.
PREPARATION 2.4: NHBocCys[S-S-(CH2)1 1CH3]-N[(CH2)17CH3]2
La synthèse est identique à la préparation 2.1 mais en utilisant de la dioctadécylamine et le produit de la préparation 1.4 comme réactifs de départ.
On obtient un rendement de 85%.
CCM Rf = 0,90 (CHCI3/MeOH, 9:1).
PREPARATION 2.5: NHBocCys[S-S-Cholestérol]-NH(CH2)17CH3
La synthèse est identique à la préparation 2.1 mais en utilisant de l'octadécylamine et le produit de la préparation 1.3 comme réactifs de départ.
On obtient un rendement de 90%.
CCM Rf = 0,88 (CHCI3/MeOH, 9:1), HPLC Rt = 26,98 min.
ETAPE 3
PREPARATION 3.1 [composé (i)]: NH2(CH2)3NH(CH2)4NH(CH2)3NHCH2COCys- [S-S-(CH2)4CH3]-N[(CH2)17CH3)2
L'acide trifluoroacétique (10 ml) est ajouté au produit de la préparation 2.1. Le milieu est agité durant 1,5 heures et le clivage du BOC est suivi par HPLC. L'acide trifluoroacétique est évaporé, et pour chasser les traces on évapore 3 fois 5 ml de diéthyl éther.
L'extrait sec est dissout dans 10 ml de dichlorométhane, puis on ajoute Néthyldiisopropylamine (3,34 mmol), BocNH(CH2)3 NBoc(CH2)4 NBoc(CH2)3
NBocCH2CO2H (0,644 mmol) et BOP (0,708 mmol). Le mélange est agité durant 2 heures et la réaction est suivie par CCM et HPLC.
Le dichlorométhane est évaporé au rotoévaporateur. Le brut est repris dans du chloroforme (100 ml) puis lavé successivement par 3 fois 50 ml de KHSO4 0,5 M, puis par 3 fois 50 ml d'une solution de NaHCO3 saturée, et enfin par 2 fois 50 ml d'une solution de NaCI saturée. La phase organique est séchée sur du sulfate de magnésium anhydre puis le chloroforme est évaporé au rotoévaporateur.
L'acide trifluoroacétique (10 ml) est ajouté à l'extrait sec. Le milieu est agité durant 1,5 heures et le clivage des BOC est suivi par HPLC. L'acide trifluoroacétique est évaporé, et pour chasser les traces on évapore 3 fois 5 ml de diéthyl éther.
Le produit brut obtenu est purifié par HPLC préparative. Les fractions intéressantes sont regroupées et lyophilisées.
On obtient 0,081 mmol de produit salifié (R =11%).
HPLC Rt = 17,79 min.
Spectre de RMN 1H (400 MHz, (CD3)2SO d6, d en ppm) : 0,90 (mt, 9H : CH3 des deux octadécylamino et CH3 du pentyldisulfanyl) ; de 1,15 à 1,50 (mt, 64H 15 CH2 d'un des deux octadécylamino - 15 CH2 de l'autre octadécylamino) et 2 CH2 du pentyldisulfanyl) ; 1,47 (mt, 2H 1 CH2 d'un des deux octadécylamino) ; de 1,55 à 1,75 (mt, 4H 1 CH2 d'un des deux octadécylamino et 1 CH2 du pentyldisulfanyl) 1,65 (mf, 4H : les 2 CH2 centraux du butyle) ; de 1,85 à 2,05 (mt, 4H : le CH2 central des deux propyles) ; de 2,70 à 2,85 (mt, 1 H: 1 H du CH2S de la cystéine) ; 2,78 (mt, 2H : SCH2 du pentyldisulfanyl) ; de 2,85 à 3,50 (mt: les 2 NCH2 du butyle - les 2 NCH2 des deux propyles - I'autre H du CH2S de la cystéine et le NCH2 des deux octadécylamino); 3,80 (s large, 2H : NCH2CON du glycylamino) ; 5,07 (mt, 1 H
CONCHCON de la cystéine) ; 9,05 (d, J = 8 Hz, 1 H : CONH de la cystéine) ; 7,95 8,85 et de 8,90 à 9,15 (respectivement 2 mfs et mf étalé: les H correspondant aux
NH et NH2). spectre n"= 508 487
MH+= 969 PREPARATION 3.2 [composé (il)1: NH2(CH2)3NH(CH2)4NH(CH2)3NHCH2COCys [S-S-(CH2)17CH3]-NH(CH2)17CH3
La procédure est identique à celle décrite dans la préparation 3.1, mais en partant du produit obtenu dans la préparation 2.2.
On obtient un rendement de 31 % en produit salifié.
HPLC Rt = 15,63 min.
Spectre de RMN 1H (400 MHz, (CD3)2SO d6, d en ppm) : 0,89 (t, J = 7,5 Hz, 6H
CH3 de l'octadécylamino et CH3 de l'octadécyldisulfanyl) ; de 1,15 à 1,45 (mt, 60H : 15 CH2 de l'octadécylamino et 15 CH2 de l'octadécyldisulfanyl) ; 1,42 (mt 1 des
CH2 de l'octadécylamino) ; de 1,55 à 1,70 (mt, 2H 1 des CH2 de
l'octadécyldisulfanyl) ; 1,66 (mf, 4H : les 2 CH2 centraux du butyle) ; de 1,85 à 2,05 (mt, 4H : le CH2 central des deux propyles) ; 2,76 (t, J = 7,5 Hz, 2H : SCH2 de l'octadécyldisulfanyl) ; de 2,85 à 3,10 (mt, 14H : les 2 NCH2 du butyle - les 2 NCH2 des deux propyles - 1H du NCH2 de l'octadécylamino et 1 H du CH2S de la cys téine) ; 3,10 (dd, J = 13,5 et 6 Hz, 1H : I'autre H du CH2S de la cystéine) ; 3,18 (mt, 1 H : I'autre H du NCH2 de l'octadécylamino) ; 3,82 (AB très limite, 2H : NCH2CON du glycylamino) ; 4,60 (mt, 1 H : CONCHCON de la cystéine) ; 8,27 (t, J = 5,5 Hz, 1 H : CONH de l'octadécylamino) ; 8,90 (d, J = 8,5 Hz, 1 H : CONH de la cystéine) ; 7,95 - 8,82 et 9,07 (3 mfs: les H correspondant aux NH et NH2).
Spectre n =508 186
MH+=899 PREPARATION 3.3 [composé (III)]: NH2(CH2)3NH(CH2)4NH(CH2)3NHCH2COCys- [S-S-(CH2)11CH3]-NH(CH2)17CH3
La procédure est identique à celle décrite dans la préparation 3.1, mais en partant du produit obtenu dans la préparation 2.3.
On obtient un rendement de 26,5% en produit salifié.
HPLC Rt = 12,36 min.
Spectre de RMN 'H (400 MHz, (CD3)2SO d6, d en ppm) : 0,90 (t, J = 7,5 Hz, 6H
CH3 de l'octadécylamino et CH3 du dodécyldisulfanyl) ; de 1,15 à 1,50 (mt, 48H 15
CH2 de l'octadécylamino et 9 CH2 du dodécyldisulfanyl) ; 1,43 (mt 1 CH2 de l'octadécylamino) ; de 1,55 à 1,70 (mt, 2H 1 CH2 du dodécyldisulfanyl) ; 1,65 (mf, 4H : les 2 CH2 centraux du butyle) ; de 1,85 à 2,05 (mt, 4H : le CH2 central des deux propyles) ; 2,76 (t, J = 7,5 Hz, 2H : SCH2 du dodécyldisulfanyl) ; 2,80 à 3,05 (mt, 14H : les 2 NCH2 du butyle - les 2 NCH2 des deux propyles - 1H du NCH2 de l'octadécylamino et 1H du CH2S de la cystéine) ; 3,11 (dd, J = 13,5 et 6 Hz, 1H
I'autre H du CH2S de la cystéine) ; 3,17 (mt, 1H : I'autre H du NCH2 de l'octadécylamino) ; 3,83 (AB limite, 2H: NCH2CON du glycylamino) ; 4,60 (mt, 1H : CONCHCON de la cystéine) ; 8,25 (t, J = 5,5 Hz , 1H : CONH de l'octadécylamino) ; 8,99 (d, J = 8,5 Hz, 1H : CONH de la cystéine) ; 7,96 - 8,84 et 9,09 (3 mfs: les H correspondant aux NH et NH2) Spectre n"= 508 306
MH+= 815
PREPARATION 3.4 [composé (1V)]: NH2(CH2)3NH(CH2)4NH(CH2)3NHCH2COCys [S-S-(CH2)11CH3]-N[(CH2)17CH3]2
Le produit obtenu par la préparation 2.4 est engagé dans une synthèse identique à la préparation 3.1.
On obtient un rendement de 39% en produit salifié.
HPLC Rt = 19,75 min.
Spectre de RMN 'H (400 MHz, (CD3)2SO d6, d en ppm) : 0,87 (t, J = 7,5 Hz, 9H
CH3 des deux octadécylamino et CH3 du dodécyldisulfanyl) ; de 1,15 à 1,50 (mt, 78H:15 CH2 d'un des deux octadécylamino - 15 CH2 de l'autre octadécylamino) et 9 CH2 du dodécyldisulfanyl) ; 1,47 (mt, 2H 1 CH2 d'un des deux octadécylamino) de 1,50 à 1,70 (mt, 4H 1 CH2 d'un des deux octadécylamino et 1 CH2 du dodécyldisulfanyl) ; 1,68 (mf, 4H : les 2 CH2 centraux du butyle) ; de 1,85 à 2,10 (mt, 4H : le CH2 central des deux propyles) ; 2,77 (t, J = 7,5 Hz, 2H : SCH2 du dodécyldisul fanyl) ; 2,80 (mt, 1 H: :1 H du CH2S de la cystéine) ; de 2,70 à 3,50 (mt: les 2 NCH2 du butyle - les 2 NCH2 des deux propyles - I'autre H du CH2S de la cystéine et le
NCH2 des deux octadécylamino) ; 3,80 (s large, 2H : NCH2CON du glycylamino) 5,05 (mt, 1H : CONCHCON de la cystéine) ; 9,07 (d, J = 8 Hz, 1H : CONH de la cystéine) ; de 7,75 à 8,20 et de 8,65 à 9,25 (2 mfs étalés: les H correspondant aux
NH et NH2). Spectre n"= 508 367
MH+= 1067
PREPARATION 3.5 [composé (V)] : NH2(CH2)3NH(CH2)4NH(CH2)3NHCH2COCys [S-S-Cholesterol]-NH (CH2)17CH3
Le produit obtenu par la préparation 2.5 est engagé dans une synthèse identique à la préparation 3.1 sauf pour le clivage final des BOC pour lequel on utilise le mé lange suivant:10 ml de TFA, 0,5 ml d'eau, 0,5 ml de thioanisol, et 0,75 g de phénol.
On obtient un rendement de 5,6% en produit salifié
HPLC Rt = 16,59 min.
Spectre de RMN 1H (400 MHz, (CD3)2SO d6, à une température de 383K, d en ppm) : 0,74 et 1,05 (2 s, 3H chacun : CH3 en 18 et CH3 en 19 du cholesté ryle) ; de 0,80 à 0,95 (mt: les H correspondant au CH3 de l'octadécylamino et aux CH3 en 26 - CH3 en 27 et CH3 en 21 du cholestéryle) ; 1,77 (mt: les 4H correspondant aux 2 CH2 centraux du butyle) ; de 1,85 à 2,10 (mt : les 4H correspondant au CH2 central des deux propyles) ; de 2,90 à 3,25 (mt : les 16H correspondant aux 2 NCH2 du butyle - aux 2 NCH2 des deux propyles au CH2S de la cystéine et au NCH2 de 'octadécylamino) ; 3,63 (AB limite, 2H : NCH2CON du glycylamino) ; 4,61 (mt, 1 H : CONCHCON de la cystéine) 5,39 (mt, 1 H : CH en 6 du cholestéryle) ; 7,69 (mt, 1 H : CONH de
'octadécylamino) ; 8,25 (mf, 1 H : CONH de la cystéine). Pour tous les autres protons du cholestéryle et de l'octadécylamino, les signaux correspondant sortent entre 0,60 et 3,00 ppm. Spectre n =508 883
MH+= 1015 b) Lipopolyamines à pont disulfure situé dans l'espaceur
Ces molécules de structure générale:
espaceur conte-
région polyamine --- nant le pont S-S région lipophile ont été construites de la manière suivante
Figure img00300001
<tb> Etape <SEP> ()
<tb> <SEP> 0
<tb> <SEP> o;N <SEP> sS-SR) <SEP> HS <SEP> Jk <SEP> R, <SEP> S
<tb> <SEP> o <SEP> )
<tb> <SEP> o <SEP> OH
<tb> Egpe <SEP> BoP. <SEP> OEAH,O, <SEP> 2)
<tb> <SEP> AN <SEP> '5S <SEP> j <SEP> H <SEP> Ha <SEP> BOP. <SEP> DIEASH2CI2
<tb> Etape <SEP> 3)
<tb> <SEP> a)TFA
<tb> <SEP> b) <SEP> BOP. <SEP> DIEA}CH2CI2
<tb> <SEP> Y <SEP> r <SEP> c) <SEP> TFA <SEP> NHNHN <SEP> S
<tb> <SEP> ov;N <SEP> ss <SEP> 1 <SEP> 32 <SEP> 9 <SEP> N%N~NH <SEP> > <SEP> . <SEP> P2 <SEP> R
<tb>
L'exemple suivant, donné à titre non-limitatif, illustre une de ces lipopolyamines: R1 = R2 = (CH2)17CH3 [composé (Vll)] PREPARATION 1: Boc-NHCH2CH2-SS-CH2COOH 1,12 g (3,18 mmol) de D-tertiobutyloxycarbonylcystamine (Boc-NHCH2CH2-SS
CH2CH2NHBoc) est dissout dans 20 ml de chloroforme. On ajoute 2,7 ml (20 mmol) de triéthylamine puis 0,27 ml (3,18 mmol) d'acide thioglycolique (HSCH2COOH). Le mélange est agité pendant deux heures, et la réaction est suivie par CCM (CHCI3/MeOH: 9/1). La réaction est arrêtée par addition de 50 ml d'une solution de
KHSO4 saturée et de 50 ml de chloroforme. La phase organique est lavée par une solution de KHSO4 (3 fois 50 ml), évaporée, puis séchée sur sulfate de magnésium an hydre. Le produit obtenu est à nouveau mis en solution dans 50 ml d'éther éthylique, puis extrait à l'aide d'une solution de NaHCO3 (3 fois 50 ml). La phase aqueuse est rincée avec de l'éther et acidifiée jusqu'à pH = 3 avec une solution de
KHSO4. Le produit est extrait de la phase aqueuse par une solution de CHCl3 (3 fois 50 ml) qui est ensuite évaporée. Le produit résiduel est séché, et on obtient ainsi 320 mg de Boc-NHCH2CH2-SS-CH2COOH pur.
Le rendement est de 40 %. MS: 267 (MH+) PREPARATION 2: Boc-NHCH2CH2-SS-CH2CON[(CH2)17CH3]2 0,29 g de Boc-NHCH2CH2-SS-CH2COOH (1,1 mmol) et 0,522 mg de dioctadécylamine (1 mmol) sont dissous dans 10 ml de CHC13. 0,7 ml de TEA sont ajoutés (6 mmol) ainsi que 0,500 g de réactif BOP (1,1 mmol). On agite le mélange une heure pendant laquelle la réaction est suivie par CCM. La phase organique est ensuite lavée avec 3 fois 50 ml d'une solution de KHSO4 et 3 fois 50 ml d'une solution de
NaHCO3, et évaporée. Le produit obtenu est séché sur sulfate de magnésium anhydre, et on obtient ainsi 0,7 g de Boc-NHCH2CH2-SS-CH2CON[(CH2)17CH3]2 par
HPLC.
Le rendement est de 90 % en produit pur.
HPLC analytique: Rt= 23,48 min.
MS :770.
PREPARATION 3 [composé (VIl)] : NH2(CH2)3NH(CH2)4NH(CH2)3NHCH2CO NH(CH2)2-S-S-CH2-CO-N[(CH2)17CH3]2 10 ml d'acide trifluoroacétique sont ajoutés à 0,335 g de Boc-NHCH2CH2-SS
CH2CON[(CH2) 17CH3]2 (0,435 mmol). Le mélange est agité pendant 1 heure et 30 minutes, et le clivage du BOC est suivi par HPLC. L'acide trifluoroacétique est évaporé, et pour chasser les traces on évapore 3 fois 5 ml de diéthyl éther.
L'extrait sec est dissout dans 10 ml de dimethylformamide, puis on ajoute 0,36 ml de N-éthyldiisopropylamine (2 mmol) jusqu'à pH =9. On ajoute 0,33 g de
BocNH(CH2)3 NBoc(CH2)4 NBoc(CH2)3 NBocCH2CO2H (0,5 mmol) et 0,221 g de réactif BOP (0,5 mmol), et le mélange est agité pendant 2 heures. La réaction est suivie par CCM et HPLC.
Après 2 heures, on ajoute 50 ml de dichlorométhane. Le brut est lavé successivement par 3 fois 50 ml d'une solution de KHSO4 0,5 M, puis par 3 fois 50 ml d'une solution de NaHCO3 saturée, et enfin par 2 fois 50 ml d'une solution de NaCI saturée. La phase organique est séchée sur du sulfate de magnésium anhydre, puis le dichlorométhane est évaporé au rotoévaporateur.
10 ml d'acide trifluoroacétique sont ajoutés à l'extrait sec, et le mélange est agité
pendant 1 heure et 30 minutes. Le clivage des BOC est suivi par HPLC. L'acide trifluoroacétique est ensuite évaporé, et pour chasser les traces on évapore 3 fois
5 ml de diéthyl éther. Le produit brut obtenu est purifié par HPLC préparative, et les
fractions intéressantes sont regroupées et lyophilisées. On obtient ainsi 0,3 g de NH2(CH2)3NH(CH2)4NH(CH2)3NHCH2CONH(CH2)2-S-S-CH2-CO]-N[(CH2)17CH3]2 salifié TFA.
Le rendement total est de 50%. HPLC: Rt = 15,23 min.
Spectre de R.M.N. 1H (250 MHz, (CD3)2SO d6 avec ajout de quelques gouttes de
CD3COOD d4, à une température de 343 K, d en ppm) : 0,88 (t, J = 6,5 Hz, 6H
CH3 des chaînes grasses) ; de 1,20 à 1,40 (mt, 60H : CH2 centraux des chaînes grasses) ; 1,52 (mf, 4H 1 CH2 de chaque chaîne grasse) ; 1,70 (mt, 4H : (CH2)2 centraux du butyle) ; de 1,90 à 2,10 (mt: les 4H correspondant au CH2 central des 2 propyles) ; de 2,85 à 3,10 (mts, 12H : les NCH2 du butyle et des 2 propyles) 2,90 (t, J = 7 Hz, 2H : CH2S) ; 3,28 (mf, 4H : NCH2 des chaînes grasses); 3,50 (t, J = 7 Hz, 2H : CH2NCO) ; 3,68 et 3,76 (2 s larges, 2H chacun : NCH2CON et
CONCH2S). c) lipopolyamines symétriques dédoublables par pont disulfure
Ces molécules de structure générale:
Figure img00320001
<tb> Polyamine-Espaceur-Lipide
<tb> <SEP> S
<tb> <SEP> S
<tb> Polyamine-Espaceur-Lipide
<tb> ont été construites de la manière suivante
Etape 1)
Figure img00330001
Etape
Figure img00330002
L'exemple suivant, donné à titre non-limitatif, illustre une de ces lipopolyamines: R1 = (CH2)17CH3; R2 = H [composé (Vl)]
ETAPE 1 pur PREPARATION 1: [NHBoc-CH(CO-NH(CH2)17CH3)CH2-S-]2
La Na, Na'-diBoc cystine (0,57 mmol) est dissoute dans du chloroforme (15 ml) et on ajoute N-éthyldiisopropylamine (5,67 mmol), octadécylamine (0,10 mmol) et
BOP (1,24 mmol).
Le mélange est agité durant 2 heures et suivi par CCM et HPLC.
Le chloroforme est évaporé au rotoévaporateur. Le brut est repris dans de l'acétate d'éthyle (100 ml) puis lavé successivement par 3 fois 50 ml de KHSO4 0,5 M, puis par 3 fois 50 ml d'une solution de NaHCO3 saturée, et enfin par 2 fois 50 ml d'une solution de NaCI saturée. La phase organique est séchée sur du sulfate de magnésium anhydre puis l'acétate d'éthyle est évaporé au rotoévaporateur.
On obtient 0,346 mmol de produit (R = 69%).
CCM Rf = 0,94 (CHCI3/MeOH, 9:1).
ETAPE 2
PREPARATION 2 [composé (VI)] : [NH2(CH2)3NH(CH2)4NH(CH2)3NHCH2CO CyNH(cH2)17cH3]2
L'acide trifluoroacétique (5 ml) est ajouté au produit obtenu par la préparation 1. Le mélange est agité durant 1,5 heures et le clivage du BOC est suivi par HPLC.
L'acide trifluoroacétique est évaporé, et pour chasser les traces on évapore 3 fois 5 ml de diéthyl éther.
L'extrait sec est dissout dans du dichlorométhane (25 ml), puis on ajoute Néthyldiisopropylamine (3,44 mmol), BocNH(CH2)3 NBoc(CH2)4 NBoc(CH2)3
NBocCH2CO2H (0,697 mmol) et BOP (0,86 mmol). Le mélange est agité durant 2 heures et la réaction est suivie par CCM et HPLC.
Le dichlorométhane est évaporé au rotoévaporateur. Le brut est repris dans de l'acétate d'éthyle (100 ml) puis est lavé successivement par 3 fois 50 ml de KHSO4 0,5 M, puis par 3 fois 50 ml d'une solution de NaHCO3 saturée, et enfin par 2 fois 50 ml d'une solution de NaCI saturée. La phase organique est séchée sur du sulfate de magnésium anhydre puis l'acétate d'éthyle est évaporé au rotoévaporateur.
CCM Rf = 0,90 (CHCI3/MeOH, 9:1), HPLC Rt = 26,10 min.
L'acide trifluoroacétique (5 ml) est ajouté à l'extrait sec. Le mélange est agité durant 1,5 heures et le clivage des BOC est suivi par HPLC. L'acide trifluoroacétique est évaporé, et pour chasser les traces on évapore 3 fois 5 ml de diéthyl éther.
Le produit brut obtenu est purifié par HPLC préparative. Les fractions intéressantes sont regroupées et lyophilisées.
On obtient 0,099 mmol de produit salifié (R = 28,5%), HPLC Rt = 10,55 min.
Spectre de RMN 1H (400 MHz, (CD3)2SO d6, d en ppm) : 0,91 (t, J = 7,5 Hz, 6H
CH3 des deux octadécylamino) ; de 1,10 à 1,40 (mt, 60H 15 CH2 d'un des deux octadécylamino et 15 CH2 de l'autre octadécylamino) ; 1,43 (mt, 4H 1 CH2 des deux octadécylamino) ; 1,64 (mf, 8H : les 2 CH2 centraux des deux butyles) ; de 1,85 à 2,10 (mt, 8H : le CH2 central des quatre propyles) ; de 2,80 à 3,15 (mt, 32H : les 2 NCH2 des deux butyles - les 2 NCH2 des quatre propyles - le NCH2 des deux octadécylamino et le CH2S des deux cystéines); 3,84 (mf, 4H : le NCH2CON des deux glycylamino) ; 4,60 (mt, 2H : le CONCHCON des deux cystéines) ; 8,27 (mf, 2H : le CONH des deux octadécylamino) ; 8,95 (mf, 2H : le CONH des deux cystéines) ; 7,97 - 8,87 et 9,15 (3 mfs : les H correspondant aux NH et NH2).
Spectre n"= 508 233.
MH+ = 1227.
2. COMPARAISON DES COMPLEXES COMPOSE (VII)/ADN ET RPR120535/ADN a. MATERIEL UTILISE - L'ADN qui a servi à réaliser les échantillons est le pXL2774.
- Le lipide cationique portant un pont disulfure est le composé (VII) . Une solution aqueuse de ce lipide à 10 mmol est réalisée par chauffage à 50"C pendant 30 minutes, puis la solution est refroidie à température ambiante avant utilisation.
- Les complexes lipide cationique/ADN sont formés par mélange équivolumétrique de deux solutions : I'une contenant l'ADN à 20 g d'ADN/ml dans 150 mmol de
NaCI et l'autre contenant le lipide à la concentration désirée dans l'eau.
ES. METHODES - Electrophorèse sur gel d'agarose à 0,8 %.
- La mesure du diamètre hydrodynamique a été réalisée avec un Coulter N4Plus, en utilisant des cuves plastiques (quatre faces transparentes) remplies avec 800 Ml des différentes solutions. La mesure a été réalisée à 90 C en mode unimodale.
- Les expériences de diffusion de rayons X aux petits angles sont réalisées au synchrotron (LURE) à Orsay (France) sur la ligne D43. Les échantillons sont préparés à 0,5 mg d'ADN/ml, puis centrifugés. Les culots sont disposés dans une cellule dont les deux fenêtres sont constituées de kapton. Un monochromateur au germanium (111 réflection) permet la sélection de la longueur d'onde de 0,138 nm.
C. COMPARAISON DES COMPLEXES COMPOSE (VII)/ADN ET RPR 120 535/ADN
La taille des complexes lipide cationique/ADN a été mesurée par diffusion quasiélastique de la lumière. Nous avons comparé la taille des complexes lipide cationique/ADN obtenue avec deux lipides : le composé (VII) et le RPR 120 535 (décrit dans la demande de brevet WO 97/18185). Les mêmes tailles ont été obtenues au rapport de 6 nmoles lipide cationique/ADN, à savoir 140 nm en diamètre hydrodynamique.
D. LIBERATION DE L'ADN
Nous avons voulu vérifier que lorsque les complexes sont incubés dans un milieu réducteur, le pont disulfure du lipide est coupé, libérant ainsi l'ADN contenu au sein des complexes. Nous avons donc incubé pendant 10 minutes ces complexes en présence d'un agent réducteur (dithiotreitol) et déposé les échantillons sur un gel d'électrophorèse.
La figure 1 montre que lorsque des concentrations croissantes de Dithiotreitol sont ajoutées aux complexes composé (VII)/ADN, I'ADN est progressivement libéré des complexes. Par contre, lorsque les complexes sont incubés en absence de dithiotreitol, tout l'ADN reste associé avec le lipide cationique pour former des complexes qui ne peuvent pas migrer dans le gel.
La même expérience que celle présentée ci-dessus a été réalisée avec le RPR 120535 qui ne possède pas de pont disulfure. Nous avons observé que le dithiotreitol ne permet pas la libération de l'ADN à partir de complexes RPR120535/ADN.
Par conséquent, nous pouvons conclure que le composé (VII) est capable de libérer 'ADN lorsque les complexes sont dans un milieu réducteur, parce qu'il possède un pont disulfure qui peut être coupé dans ces conditions.
3. DETERMINATION DE LA STRUCTURE DU COMPLEXE COMPOSE (VII)/ADN
A MATERIEL UTILISE II s'agit du même matériel que précédemment.
B. METHODES - Les expériences de diffusion de rayons X aux petits angles sont réalisées au synchrotron (LURE) à Orsay (France) sur la ligne D43. Les échantillons sont préparés à 0,5 mg d'ADN/ml, puis centrifugés. Les culots sont disposés dans une cellule dont les deux fenêtres sont constituées de kapton. Un monochromateur au germanium (111 réflection) permet la sélection de la longueur d'onde de 0,138 nm. m DETERMINATION DE LA STRUCTURE DU COMPLEXE COMPOSE (VII)/ADN
La structure du complexe composé (VII)/ADN a été déterminée par diffusion de rayons X aux petits angles. Comme cela est représenté sur la figure 2, la structure obtenue est une structure lamellaire dans laquelle l'ADN est intercalé à la façon d'un sandwich entre des bicouches de lipides, avec une périodicité de 8 nm.
3. UTILISATION DES PRODUITS SELON L'INVENTION POUR LA
TRANSFECTION IN VITRO DE MATERIEL GENETIQUE
A. MATERIEL GENETIQUE UTILISE
Le plasmide utilisé est décrit dans le brevet FR 95/10825 déposé le 15/09/95.
Cette construction pCOR~pXL2774 comporte le gène codant pour la luciférase sous promoteur du gène très précoce du Cytomegalovirus humain [hCMV-IE].
Les solutions d'acide nucléique sont diluées à 20 llg/ml dans du sérum physiologique (NaCI 0,15 M).
B SOLUTIONS CYTOFECTANTES (préparation extemporanée)
Les produits décrits dans l'invention sont mis en solution dans l'eau à concentration variant de 40 à 160 pmol et mélangés volume à volume avec la solution d'ADN. La concentration saline finale est de 75 mmol.
C. TRANSFECTION
Les cellules sont cultivées dans les conditions appropriées en microplaques de 24 puits (2 cm2/puits) et sont transfectées alors qu'elles sont en phase exponentielle de croissance et à 50-70 % de la confluence.
Les cellules sont lavées par 2 fois 500 pI de milieu dépourvu de protéines sériques et remises en croissance soit en milieu sans sérum (transfection en absence de sérum), soit en milieu complet (transfection en présence de sérum). 50 ,ul de mélange cytofectant (0,5 pg ADN/puits) sont ajoutés aux cellules (3 puits/condition vecteur-ADN). Quand les cellules sont transfectées en l'absence de sérum, le milieu de croissance est supplémenté 2 heures après la transfection par la quantité appropriée de sérum.
L'efficacité de transfection est évaluée à 48 heures post-transfection par une mesure de l'expression de la luciférase selon les recommandations données pour l'utilisation du kit Promena (Luciférase Assay System). La toxicité des mélanges cytofectants est estimée par une mesure des concentrations protéiques dans les lysats cellulaires.
D. RESULTATS a) Lipopolyamines symétriques dédoublables par réduction d'un pont disulfure : composé (VI) (figure 3)
Ce produit décrit dans l'invention a été utilisé comparativement au lipide cationique RPR120 535 (figure 1, sel de TFA, brevet WO 97/18185) comme vecteur d'ADN, pour transfecter la lignée cellulaire HepG2.
Pour ce type cellulaire, la toxicité du composé (VI) est du même ordre de grandeur que celle du RPR120 535 : quand la transfection est effectuée en l'absence de protéines sériques, la survie est de 80% pour les cellules HepG2, pour des doses de 160 pM en lipide cationique.
L'efficacité maximum de transfection est obtenue pour un ratio de lipide cationi que/pg d'ADN de 4 à 8 nanomoles. L'expression du transgène obtenue avec l'utilisation du composé (VI) comparativement à celle obtenue avec le RPR120 535 est supérieure (4 fois) pour des transfections de cellules HepG2 b) Lipopolyamines dont la partie lipidique est composée de deux chaînes al- kyles en C18 et d'une troisième chaîne alkyle liée par un pont disulfure: composés (I) et (IV) (figure 4)
Ces deux produits décrits dans l'invention ne présentent pas de toxicité significative jusqu'à 160 pM en lipide cationique, aussi bien pour des cellules HeLa que pour des cellules HepG2.
Par rapport aux expressions du transgène obtenues avec le RPR120 535 (brevet
FR 95/13490 du 14/11/1995), I'addition d'une troisième chaîne lipidique en Cs [composé (I)] permet d'obtenir des résultats de transfection en l'absence de protéines sériques du même ordre de grandeur. Par contre, dans les mêmes conditions de transfection, si la troisième chaîne lipidique est en C12 [composé (il)1,
I'expression du transgène est augmentée d'un facteur d'environ 2 fois pour les cellules HeLa et d'environ 9 fois pour les cellules HepG2.
De plus, un des intérêts majeurs de l'augmentation de la lipophilie des lipides cationiques par addition d'une troisième chaîne alkyle est mis en évidence dans des expériences de transfection en présence de protéines sériques. Dans ce cas, il n'y a en effet aucune inhibition significative due à la présence des protéines sériques, ce qui en fait des candidats de choix pour des transfections in vivo. c) Lipopolyamines dont la partie lipidique est composée de deux chaînes alkyles en C18 dont l'une est liée par un pont disulfure : composé (II) (figure 5)
Ce produit décrit dans l'invention ne présente pas de toxicité significative aux doses utilisées vis à vis des cellules HepG2 (160,ut en lipide cationique).
*Pour des transfections en absence de protéines sériques, le niveau d'expression du transgène est jusqu'à 3 fois suprérieur par rapport au composé RPR 120 535.
De plus, la transfection est nettement améliorée (jusqu'à 40 fois) en présence de protéines sériques. Donc, de façon tout à fait inattendue, il n'y a aucun effet inhibiteur dû à la présence de sérum. d) Lipopolyamines dont la partie lipidique contient une chaîne dérivée d'un stéroïde liée par un pont disulfure : composé (V) (figure 6)
Ce composé décrit dans l'invention ne présente pas de toxicité significative aux doses utilisées vis-à-vis des cellules HeLa ou HepG2 (160 pM en lipide cationique).
La liaison d'un cholestérol au lieu d'une chaîne alkyle apporte un gain très significatif quant à l'expression du transgène et de plus, dans ce cas, aucune inhibition n'a pu être constatée en présence de protéines sériques, ce qui rend ce produit très attractif pour une utilisation en transfection in vivo.

Claims (31)

  1. REVENDICATIONS 1. Agent de transfert d'acides nucléiques caractérisé en ce qu'il forme, en milieu oxydant, des complexes avec des acides nucléiques, et il est déstabilisé et/ou dégradé en milieu réducteur et permet de libérer les acides nucléiques complexés.
  2. 2. Agent de transfert d'acides nucléiques caractérisé en ce qu'il s'agit d'un lipide cationique comprenant une région hydrophile cationique capable de s'associer de manière non-covalente avec des acides nucléiques et une région lipophile qui facilite le passage à travers la membrane cellulaire, ces deux régions étant reliées l'une à l'autre par l'intermédiaire d'un bras dit "espaceur", et comprenant une ou plusieurs liaisons sensibles aux conditions réductrices.
  3. 3. Agent de transfert selon la revendication 2 caractérisé en ce que la région hydrophile cationique est une région polyamine.
  4. 4. Agent de transfert selon la revendication 2 caractérisé en ce que la région lipophile est constituée d'une ou plusieurs chaînes aliphatiques, éventuellement d'un ou plusieurs dérivés de stéroïde, d'un lipide naturel ou synthétique, et/ou éventuellement d'une combinaison de ceux-ci.
  5. 5. Agent de transfert selon la revendication 4 caractérisé en ce que la région lipophile est constituée de deux chaînes aliphatiques grasses au moins.
  6. 6. Agent de transfert selon la revendication 4 caractérisé en ce que la région lipophile est constituée d'un dérivé de stéroïde au moins.
  7. 7. Agent de transfert selon la revendication 6 caractérisé en ce que le dérivé de stéroïde est choisi parmi le cholestérol, l'acide cholique, et la cholestérylamine.
  8. 8. Agent de transfert selon la revendication 2 caractérisé en ce que la/les liaison(s) sensible(s) aux conditions réductrices est un/des pont(s) disulfure.
  9. 9. Agent de transfert selon la revendication 8 caractérisé en ce qu'il comporte un ou deux ponts disulfure.
  10. 10. Agent de transfert selon la revendication 9 caractérisé en ce qu'il comporte un pont disulfure positionné de sorte que sa réduction entraîne une séparation de la région hydrophile cationique et de la région lipophile.
  11. 11. Agent de transfert selon la revendication 9 caractérisé en ce qu'il comporte un pont disulfure positionné de sorte que sa réduction entraîne une dégradation partielle de la région lipophile.
  12. 12. Agent de transfert selon la revendication 9 caractérisé en ce qu'il comporte un pont disulfure positionné de sorte que sa réduction entraîne la perte d'une chaîne grasse aliphatique présente dans la région lipophile.
  13. 13. Agent de transfert selon la revendication 9 caractérisé en ce qu'il comporte un pont disulfure positionné de sorte que sa réduction entraîne la perte d'une chaîne dérivée d'un stéroide.
  14. 14. Agent de transfert selon la revendication 9 caractérisé en ce qu'il comporte un pont disulfure positionné entre les deux bras espaceurs d'une lipopolyamine symétrique, de sorte que sa réduction entraîne le dédoublement de la lipopolyamine.
  15. 15. Agent de transfert selon la revendication 1 ou 2 caractérisé en ce qu'il est choisi parmi
    NH2(C H2)3NH(CH2)4NH(CH2)3NHCH2COCys[S-S-(CH2)4CH3]-N[(CH2)17CH3]2 (I);
    NH2(C H2)3NH(CH2)4NH(CH2)3NHCH2COCys[S-S-(CH2)17CH3]-N H(CH2) 17CH3 (11); NH2(C H2)3NH(CH2)4NH(CH2)3NHCH2COCys[S-S-(CH2)l 1CH3i-NH(CH2) 17CH3 (III);
    NH2(C H2)3NH(CH2)4NH(CH2)3NHCH2COCys[S-S-(CH2)11 CH3]-N[(CHz)17CH3]2 (il); NH2(CH2)3NH(CH2)4NH(CH2)3NHCH2COCys[S-S-Cholestérol]-NH (CH2)17CH3 (V); [NH2(CH2)3NH(CH2)4NH(CH2)3NHCH2COCyNH(CH2)17CH] (VI);
    NH2(CH2)3NH(CH2)4NH(CH2)3NHCH2CONH(CH2)2-S-S-CH2-CO-N[(CH2)17CH3]2 (vil).
  16. 16. Composition transfectante caractérisée en ce qu'elle comprend un agent de transfert tel que défini dans les revendications 1 à 15 et un acide nucléique.
  17. 17. Composition transfectante selon la revendication 16 caractérisée en ce que l'acide nucléique est un acide désoxyribonucléique ou bien un acide ribonucléique.
  18. 18. Composition transfectante selon la revendication 16 caractérisée en ce que l'acide nucléique est modifié chimiquement.
  19. 19. Composition transfectante selon la revendication 16 caractérisée en ce que l'acide nucléique est un antisens.
  20. 20. Composition transfectante selon la revendication 16 caractérisée en ce que l'acide nucléique comporte un gène thérapeutique.
  21. 21. Composition transfectante selon les revendications 16 à 20 caractérisée en ce qu'elle comprend en outre un adjuvant constitué par un ou plusieurs lipides neutres choisis parmi les lipides synthétiques ou naturels, zwitterioniques ou dépourvus de charge ionique dans les conditions physiologiques.
  22. 22. Composition transfectante selon la revendication 21 caractérisée en ce que le ou les lipides neutres sont le cholestérol ou bien des lipides à deux chaînes grasses de type dioleoylphosphatidyléthanolami ne (DOPE), oléoylpalmitoylphosphati- dyléthanolamine (POPE), les di-stéaroyl, -palmitoyl, -cholestéryl, -mirystoyl
    phosphatidyléthanolamines ainsi que leurs dérivés N-méthylés 1 à 3 fois, les phos
    phatidylglycérols, les glycosyldiacylglycérols, les cérébrosides (tels que notamment
    les galactocérébrosides), les sphingolipides (tels que notamment les sphingomyé lines), ou encore les asialogangliosides (tels que notamment les asialoGM1 et
    GM2).
  23. 23. Composition transfectante selon la revendication 16 caractérisée en ce qu'elle comporte en outre un adjuvant qui est ou qui comprend un composé dérivant en tout ou en partie d'une histone, d'une nucléoline, et/ou d'une protamine ou bien ledit composé est constitué en tout ou en partie de motifs peptidiques (KTPKKAKKP) et/ou (ATPAKKAA) répétés de manière continue ou non, le nombre de motifs pouvant varier entre 2 et 10.
  24. 24. Composition transfectante selon la revendication 16 caractérisée en ce qu'elle associe en outre à l'agent de transfert un élément de ciblage.
  25. 25. Composition transfectante selon la revendication 24 caractérisée en ce que ledit élément de ciblage est choisi parmi les anticorps dirigés contre des molécules de la surface cellulaire, des ligands de recepteurs membranaires comme l'insuline, la transferrine, l'acide folique ou tout autre facteur de croissance, cytokines ou vitamines, des lectines, modifiées ou non, des protéines à motif RGD, des peptides contenant un tandem de motifs RGD, cyclique ou non, des peptides polylysine ainsi que des peptides ligands naturels ou synthétiques.
  26. 26. Composition transfectante selon la revendication 16 caractérisée en ce qu'elle comprend en outre un ou plusieurs autres agents connus pour la transfection d'acides nucléiques.
  27. 27. Composition transfectante selon la revendication 16 caractérisée en ce qu'elle incorpore en outre au moins un agent de surface non ionique de type poloxamères, les polyoxyéthylène alcools, le polyoxyéthylènenonylphényléther, ou bien les polyéthylèneglycol à tête polyéther benzylique dendritique.
  28. 28. Composition transfectante caractérisée en ce que l'on associe à un agent de transfection tel que défini dans les revendications 1 à 15 un ou plusieurs virus non enveloppés recombinants et comprenant dans leur génome au moins un acide nucléique exogène.
  29. 29. Utilisation d'un agent de transfert tel que défini dans les revendications 1 à 15 pour le transfert in vitro ou ex vivo d'acides nucléiques dans les cellules.
  30. 30. Méthode de transfert d'acides nucléiques dans les cellules in vitro ou ex vivo caractérisée en ce qu'elle comprend les étapes suivantes
    (1) la mise en contact de l'acide nucléique avec un agent de transfert tel que défini dans les revendications 1 à 15 pour former un complexe acide nucléique / agent de transfert, précédée le cas échéant de la mise en contact préalable de l'agent de transfection avec un ou plusieurs autres agents connus pour la transfection d'acides nucléiques et/ou avec un ou plusieurs adjuvants,
    (2) la mise en contact des cellules avec le complexe formé en (1).
  31. 31. Procédé de préparation d'une composition transfectante telle que définie dans les revendications précédentes caractérisé en ce que l'on met en contact un acide nucléique avec un agent de transfert tel que défini dans les revendications 1 à 15 pour former un complexe acide nucléique/agent de transfert, précédé le cas échéant de la mise en contact préalable de l'agent de transfection avec un ou plusieurs autres agents connus pour la transfection d'acides nucléiques et/ou avec un ou plusieurs adjuvants.
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