FR2615865A1 - CHICKEN GENOTYPING TEST - Google Patents
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Abstract
Description
La présente invention concerne un test de génotypage de poulet. The present invention relates to a chicken genotyping test.
Actuellement, il est très intéressant, pour les sélectionneurs et éleveurs de poulets, de pouvoir effectuer le génotypage des poulets par une méthode fiable et dont les résultats soient clairement exploitables. Currently, it is very interesting, for chicken breeders and breeders, to be able to genotype chickens by a reliable method and whose results are clearly exploitable.
Actuellement, ce typage est effectué par des méthodes sérologiques qui sont peu fiables. Currently, this typing is carried out by serological methods which are not very reliable.
L'utilisation du test selon la présente invention permet le génotypage des poulets de façon claire et fiable. The use of the test according to the present invention allows the genotyping of chickens in a clear and reliable manner.
Ce test met en oeuvre la technique des polymorphismes de la longueur des fragments de restriction de l'ADN génomique (RFLP)
Dans le cas présent, ce test utilise une sonde moléculaire provenant d'une chaîne béta d'un antigène de classe II (ou B-L) du complexe majeur dthistocompatibilité du poulet (ou complexe B).This test implements the technique of polymorphisms in the length of restriction fragments of genomic DNA (RFLP).
In the present case, this test uses a molecular probe originating from a beta chain of a class II antigen (or BL) of the major chicken histocompatibility complex (or complex B).
Plus particulièrement, il s'agit d'un test de génotypage de poulets par la technique des polymorphismes de la longueur des fragments de restriction de l'ADN génomique, caractérisé en ce que, après prélèvement de l'ADN de haut poids moléculaire des érythrocytes nucléés du sang du poulet testé, on soumet cet ADN à une fragmentation par au moins une enzyme de restriction et on hybride les fragments obtenus avec une sonde moléculaire provenant d'une chaîne codant pour une chaîne béta d'un antigène de classe II du complexe majeur dthistocompatibilaté du poulet. On identifie les fragments hybridés et leur taille pour affecter un génotype au poulet. More particularly, it is a test of genotyping of chickens by the technique of polymorphisms of the length of the restriction fragments of genomic DNA, characterized in that, after removal of the DNA of high molecular weight from the erythrocytes nucleated from the blood of the chicken tested, this DNA is subjected to fragmentation by at least one restriction enzyme and the fragments obtained are hybridized with a molecular probe originating from a chain coding for a beta chain of a class II antigen of the complex major histocompatibility of chicken. The hybridized fragments and their size are identified to assign a genotype to the chicken.
La sonde utilisée provint donc d'un gène codant pour la chaîne
Béta d'un antigène de classe II ou complexe B de poulet, il peut s'agir de différents clones, soit le clone 14 qui code pour la majeure partie de chaîne béta, ou bien de sous-clones, par exemple le sous-clone codant pour le domaine béta 2 qui sera appelé p250. The probe used therefore came from a gene coding for the chain
Beta of a class II antigen or chicken B complex, it can be different clones, either clone 14 which codes for the major part of beta chain, or else subclones, for example the subclone coding for the beta 2 domain which will be called p250.
Les techniques de prélèvement, d'hybridation et d'identification des fragments sont des techniques connues en elles-mêmes, de même que les opérations de génotypage. Les exemples ci-après sont destinés à mettre en évidence certaines caractéristiques du procédé selon l'invention ainsi que certains avantages liés à sa mise en oeuvre. The techniques for sampling, hybridization and identification of the fragments are techniques known in themselves, as are the genotyping operations. The examples below are intended to demonstrate certain characteristics of the process according to the invention as well as certain advantages linked to its implementation.
Les exemples ci-après comportent tout d'abord la préparation de la sonde et des sous-clones correspondants ainsi que l'étude de sa structure et son utilisation dans des tests de génotypage. The examples below include first of all the preparation of the probe and of the corresponding subclones as well as the study of its structure and its use in genotyping tests.
Sur les figures annexées - la figure I schématise le fragment d'ADN Sacl-EcoRI de 496 bp
provenant du clone de cADN pli Béta-l (Larhammar et al., 1980),
les extrémités GC qui proviennent du clonage sont représentées par
des éléments hachurés, - SP - peptide signal
Béta-l, Béta-2 - premier et second domaine extracellulaire
CP, TM, CY - peptide de connection, domaine transmembranaire,
domaine cytoplasmique
3'UT - extrémité 3' non traduite - la figure 2 est une carte de restriction partielle montrant la stratégie
de séquençage du gène B-LBéta - la figure 3 représente la séquence des exons Béta-2 et transmembranaire
du gène B-LBéta, la séquence d'ADN déterminée est représentée avec sa
séquence traduite et sa comparaison directe avec la séquence de la sonde
HLA-DQBéta (ligne inférieure), les nucléotides identiques présentent un
astérisque, le numérotage part à gauche du site Psti de la séquence
B-LBéta et est conforme à celui de pII Béta-l pour la séquence
HLA-DQBéta.In the appended figures - Figure I schematizes the Sacl-EcoRI DNA fragment of 496 bp
from the beta-1 fold DNA cDNA clone (Larhammar et al., 1980),
the GC ends which come from cloning are represented by
hatched elements, - SP - signal peptide
Beta-1, Beta-2 - first and second extracellular domain
CP, TM, CY - connection peptide, transmembrane domain,
cytoplasmic domain
3'UT - 3 'end not translated - Figure 2 is a partial restriction map showing the strategy
for sequencing the B-LBeta gene - Figure 3 represents the sequence of beta-2 and transmembrane exons
of the B-LBeta gene, the determined DNA sequence is represented with its
translated sequence and its direct comparison with the probe sequence
HLA-DQBeta (bottom line), identical nucleotides have a
asterisk, the numbering starts on the left of the Psti site of the sequence
B-LBeta and conforms to that of pII Beta-1 for the sequence
HLA-DQBeta.
Structure du gène B-LBéta de poulet
Par analyse de restriction enzymatique et analyse "Southern blot", il apparaît que les clones isolés représentent 3 à 5 gènes indépendants dans chaque librairie. L'un des clones d'une librairie
LambdaL47, LambdaBL-Béta-612, qui a été choisi pour des analyses plus complètes, contient le segment d'hybridation sur un fragment d'ADN Hindlil de 3,2 kb qui a été ensuite sous-cloné et analysé en détail par séquençage
d'ADN. La carte de restriction et les séquences obtenues de même que la comparaison directe avec la séquence de la sonde sont indiquées dans les figures 2 et 3. Il existe clairement deux régions homologues dans lesquelles aucune interruption n'existe.La première correspond à un exon Béta 2 typique et est séparée de la seconde qui correspond à un exon transmembranaire de chaîne Béta par 674 nucléotides, une distance du même ordre est observée dans les gènes de la chaîne Béta 2 de classe II humaine ou murine. Ces deux exons contiennent une phase de lecture ouverte qui peut être rattachée par épissage en utilisant les signaux typiques qui sont trouvés aux extrémités. Il doit être noté que ces limites intron/exon provoquent l'interruption du cadre de lecture entre les premières et secondes bases, comme cela est observé dans tous les gènes MHC et autres éléments de la famille des supergènes immunoglobuline.Chicken B-LBeta gene structure
By enzyme restriction analysis and "Southern blot" analysis, it appears that the isolated clones represent 3 to 5 independent genes in each library. One of the clones of a bookstore
LambdaL47, LambdaBL-Beta-612, which was chosen for more complete analyzes, contains the hybridization segment on a 3.2 kb Hindlil DNA fragment which was then subcloned and analyzed in detail by sequencing
DNA. The restriction map and the sequences obtained as well as the direct comparison with the sequence of the probe are indicated in FIGS. 2 and 3. There are clearly two homologous regions in which no interruption exists. The first corresponds to a beta exon 2 typical and is separated from the second which corresponds to a transmembrane beta chain exon by 674 nucleotides, a distance of the same order is observed in the genes of the beta 2 chain of human class II or murine. These two exons contain an open reading phase which can be joined by splicing using the typical signals which are found at the ends. It should be noted that these intron / exon limits cause the reading frame to be interrupted between the first and second bases, as is observed in all MHC genes and other elements of the immunoglobulin supergene family.
MATERIEL ET METHODE
DETERMINATION DE LA SONDE HLA-DQBETA
Un fragment d'ADN SacI-EcoRI de 496 bp provenant du clone
HLA-DQBéta cADN plIBéta-l (Larhammar et al. 1982) a été sous-cloné dans
PUC12 (Vieira et Messing, 1982). Le plasmide ADN a été préparé à partir d'une culture de E. coli saturée pendant une nuit avec extraction par alkali/SDS (Birnboim et Doly, 1979) suivie par une séparation sur deux gradients successifs de CsCl/bromure d'éthidium, restriction avec EcoRI-SacI et isolement du fragment 496 bp après électrophorèse sur gel de polyacrylamide à 5 % par électro-élution et chromatographie sur cellulose
DEAE. Le fragment isolé est marqué par "nick translation" avec une activité spécifique de 2 à 4.108 cpmlpg (Rigby et al., 1977).MATERIAL AND METHOD
DETERMINATION OF THE HLA-DQBETA PROBE
A 496 bp SacI-EcoRI DNA fragment from the clone
HLA-DQBeta cDNA plIBeta-1 (Larhammar et al. 1982) was subcloned into
PUC12 (Vieira and Messing, 1982). The DNA plasmid was prepared from an overnight saturated E. coli culture with alkali / SDS extraction (Birnboim and Doly, 1979) followed by separation on two successive gradients of CsCl / ethidium bromide, restriction with EcoRI-SacI and isolation of the 496 bp fragment after electrophoresis on 5% polyacrylamide gel by electroelution and chromatography on cellulose
DEAE. The isolated fragment is marked by "nick translation" with a specific activity of 2 to 4.108 cpmlpg (Rigby et al., 1977).
La sélection des librairies d'ADN génomiques de poulet est faite à partir d'une librairie génomique de phage Lambda Charon 4A (Dodgson et al. 1979) et une librairie génomique Lambda L47 (Ballivet et al. 1983) qui sont criblés avec la sonde HLA-DQBéta sur filtres dupliqués comme cela a été décrit par Maniatis et al., 1982). Les filtres nitrocellulose (Millipore
HAHY) sont prélavés 2 heures à 42"C dans 50 mM Tris pH 8,0, 1M NaCI, 1M
EDTA, 0,1 % SDS, préhybridés 4 heures à 420C dans 50 % de formamide,
SxDenhardt, 5x SSPE, 0,1 % dans SDS, 1 Ciglml de poly (A), I lig/ml de poly (C), 100 pg/ml d'ADN de spermes de saumon dénaturés.La sonde ayant subi la "nick translation" est alors ajoutée au même tampon et l'hybridation est effectuée pendant 24 heures à 42"C et 24 heures à 37"C, lavée deux fois I heure à 450C et deux fois I heure à 550C dans 2x SSC, 0,1 SDS, puis les filtres sont exposés à un film aux rayons X pendant 3 à 7 jours avec deux écrans d'intensification. Les clones positifs sont purifiés par recriblage dans les mêmes conditions d'hybridation.The selection of chicken genomic DNA libraries is made from a phage Lambda Charon 4A genomic library (Dodgson et al. 1979) and a Lambda L47 genomic library (Ballivet et al. 1983) which are screened with the probe. HLA-DQBeta on duplicate filters as described by Maniatis et al., 1982). Nitrocellulose filters (Millipore
HAHY) are prewashed 2 hours at 42 "C in 50 mM Tris pH 8.0, 1M NaCl, 1M
EDTA, 0.1% SDS, prehybridized 4 hours at 420C in 50% formamide,
SxDenhardt, 5x SSPE, 0.1% in SDS, 1 Ciglml of poly (A), I lig / ml of poly (C), 100 pg / ml DNA of denatured salmon sperm. The probe having undergone the "nick" translation "is then added to the same buffer and the hybridization is carried out for 24 hours at 42" C and 24 hours at 37 "C, washed twice I hour at 450C and twice I hour at 550C in 2x SSC, 0.1 SDS, then the filters are exposed to an X-ray film for 3 to 7 days with two intensification screens. The positive clones are purified by re-screening under the same hybridization conditions.
Les phages d'ADN sont préparés comme cela est décrit par
Maniatis et al. 1982. Une carte de restriction des phages recombinants est déterminée en utilisant l'approche digestion partielle oligo/cos (Rackwitz et al., 1984) et un fragment d'ADN de 3,2 kb Hindi1 hybridant la sonde
HLA-DQBéta est mise en évidence par "Southern blot" en utilisant une membrane de nylon Genescreen (Southern et al., 1975). Ce fragment d'ADN est sous-cloné dans pUC9 (Vieira et Messing, 1982), pour donner le sousclone p14 et de nouveau analysé par restriction en utilisant des digestions simples ou doubles et le "Southern blot" comme cela est décrit précédemment.Deux fragments PstI de 450 bp et 250 bp de longueur s'hybrident à la sonde HLA-DQBéta, de même que les fragments PstI voisins sont sousclonés dans pUC9. p14 et les sous-clones PstI résultant p250, p450 et p650 qui ont été intégrés dans deux fragments contingus de 500 bp et 150 bp en longueur sont utilisés comme séquence d'ADN de détermination en utilisant le processus de dégradation chimique (Maxam et Gilbert, 1980). Les produits de séquençage sont analysés sur. des gels fins de polyacrylamide d'urée (Sanger et Coulson, 1978).DNA phages are prepared as described by
Maniatis et al. 1982. A restriction map of the recombinant phages is determined using the partial digestion oligo / cos approach (Rackwitz et al., 1984) and a 3.2 kb Hindi1 DNA fragment hybridizing the probe.
HLA-DQBeta is demonstrated by "Southern blot" using a Genescreen nylon membrane (Southern et al., 1975). This DNA fragment is subcloned in pUC9 (Vieira and Messing, 1982), to give the subclone p14 and again analyzed by restriction using single or double digests and the "Southern blot" as described above. PstI fragments of 450 bp and 250 bp in length hybridize to the HLA-DQBeta probe, just as the neighboring PstI fragments are subcloned in pUC9. p14 and the resulting PstI subclones p250, p450 and p650 which have been integrated into two contingent fragments of 500 bp and 150 bp in length are used as DNA determination sequence using the chemical degradation process (Maxam and Gilbert, 1980). The sequencing products are analyzed on. fine urea polyacrylamide gels (Sanger and Coulson, 1978).
EXEMPLE I
ISOLEMENT DE CLONE GENOMIQUE DE POULET
Comme cela ressort des la figure 1, on choisit une sonde de 496 bp, fragment -Sacl-EcoRI, dérivé d'un clone HLA-DQBéta (Larhammar et al., 1982). Tout d'abord, on détermine les conditions d'hybridation dans lesquelles cette sonde humaine pourrait détecter une séquence homologue chez le poulet. La sonde DQBéta marquée avec une très haute activité spécifique par "nick translation" est hybridée sur un "Northern blot" et, après lavage dans 2X SSC à 50"C, on détecte une série de bandes dans le mARN de rate de poulet.Parmi celles-ci une bande de 1 200 nucléotides, qui est absente des mARN de foie de poulet, et qui migre légèrement plus vite que l'ARNm mature de 1 300 nucléotides correspondant à la sonde humaine DQBéta, constitue un bon candidat pour un transcript de poulet de classe il. II est probable que les trois autres bandes correspondent à I'ARN ribosomal 185 et 285 et à un produit de dégradation de l'ARN de 28s. Des résultats très similaires sont obtenus après lavage dans 0,2X SSC à 35 C. EXAMPLE I
ISOLATION OF CHICKEN GENOMIC CLONE
As can be seen from FIG. 1, a probe of 496 bp, fragment -Sac1-EcoRI, chosen from a HLA-DQBeta clone (Larhammar et al., 1982) is chosen. First, we determine the hybridization conditions under which this human probe could detect a homologous sequence in chicken. The DQBeta probe labeled with very high specific activity by "nick translation" is hybridized on a "Northern blot" and, after washing in 2X SSC at 50 "C, a series of bands is detected in the mRNA of chicken spleen. these a 1200 nucleotide band, which is absent from chicken liver mRNA, and which migrates slightly faster than the mature mRNA of 1300 nucleotides corresponding to the human probe DQBeta, constitutes a good candidate for a transcript of Class II chicken. The other three bands are likely to correspond to ribosomal RNA 185 and 285 and to a 28s RNA degradation product. Very similar results are obtained after washing in 0.2X SSC at 35 vs.
Puis on utilise la sonde DQBéta pour sélectionner une librairie d'ADN génomique de poulet dans des conditions similaires, aux conditions
6 décrites précédemment. On a étudié 106 plaques de phages de deux librai- ries indépendantes (Dodgson et al., 1979 ; Ballivet et al., 1983). On a obtenu 19 clones à partir de la première librairie et 11 clones à partir de la seconde qui s'hybrident sur des filtres dupliqués qui ont été ensuite purifiés par sélections successives.Then we use the DQBeta probe to select a chicken genomic DNA library under similar conditions, under the conditions
6 described previously. 106 phage plaques from two independent bookstores were studied (Dodgson et al., 1979; Ballivet et al., 1983). 19 clones were obtained from the first library and 11 clones from the second which hybridize on duplicate filters which were then purified by successive selections.
De façon à vérifier que les clones isolés contiennent les gènes qui ont les caractéristiques attendues pour un gène MHC de classe II on a utilisé un phage total marqué pour resonder le même "Northern blot" qui avait été hybridé précédemment avec la sonde DQBéta. La bande de 1 200 nucléotides s'hybride très fortement avec la sonde de poulet dans les
ARN de rate de poulet et l'ARNn de HLA-DQBéta de 1 30-0 nucléotides est détecté seulement sous forme d'une bande très faible.In order to verify that the isolated clones contain the genes which have the characteristics expected for an MHC class II gene, a total phage labeled was used to probe the same "Northern blot" which had been hybridized previously with the DQBeta probe. The 1,200 nucleotide band hybridizes very strongly with the chicken probe in the
Chicken spleen RNA and HLA-DQBeta 1 RNA of 1 30-0 nucleotides is detected only in the form of a very weak band.
Ces résultats montrent de façon très claire qu'il s'agit bien de gènes de B-LBéta de poulet qui ont été isolés. These results show very clearly that these are indeed chicken B-LBeta genes which have been isolated.
EXEMPLE 2
TEST DE GENOTYPAGE
Le génotypage est effectué de - la façon suivante
Le test est basé sur la méthode d'hybridation moléculaire sur filtre d'après Southern ("Southern Blot"?. de 1'ADN de haut poids moléculaire est extrait dSérythrocytes nucléés de 1 ml de sang prélevé sur des animaux consanguins homozygotes pour le complexe B et représentant 4 allèles (haplotypes) de ce complexe : B4, B12,. B14 et B19.EXAMPLE 2
GENOTYPAGE TEST
Genotyping is done in - the following way
The test is based on the method of molecular hybridization on a filter after Southern ("Southern Blot" ?. DNA of high molecular weight is extracted from nucleated erythrocytes from 1 ml of blood taken from inbred animals homozygous for the complex B and representing 4 alleles (haplotypes) of this complex: B4, B12 ,. B14 and B19.
L'ADN purifié par extraction phénolique est clivé par les enzymes de restriction BamHI, HindIII, EcoRI et PvuII. Les fragments de restriction sont séparés par électrophorèse sur gel d'agarose, transférés sur filtre de nylon qui sert ensuite de support d'hybridation avec les sondes moléculaires décrites ci-dessus. The DNA purified by phenolic extraction is cleaved by the restriction enzymes BamHI, HindIII, EcoRI and PvuII. The restriction fragments are separated by agarose gel electrophoresis, transferred to a nylon filter which then serves as a hybridization support with the molecular probes described above.
L'hybridation avec la sonde p14 révèle un ensemble de 5 à 15 bandes d'intensité variable. Certains fragments, en particulier ceux produits par digestion avec les enzymes BamHI et Pvull, ont une taille variable et sont associés de façon spécifique avec l'un ou plusieurs des haplotypes du complexe B. La sonde p250 peut être utilisée pour définir ceux de ces fragments qui contiennent l'exon Béta 2. Hybridization with the p14 probe reveals a set of 5 to 15 bands of variable intensity. Certain fragments, in particular those produced by digestion with the enzymes BamHI and Pvull, have a variable size and are specifically associated with one or more of the haplotypes of complex B. The probe p250 can be used to define those of these fragments which contain the beta 2 exon.
On réitère le processus précédent pour effectuer le génotypage des poulets afin de déterminer les filiations de chaque individu et de contrôler la stabilisation du génotype. We repeat the previous process for genotyping chickens to determine the parentage of each individual and to control the stabilization of the genotype.
Claims (4)
Priority Applications (2)
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Applications Claiming Priority (1)
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Publications (2)
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Family Applications (1)
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Families Citing this family (2)
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1988
- 1988-05-27 WO PCT/FR1988/000270 patent/WO1988009386A2/en unknown
Non-Patent Citations (5)
| Title |
|---|
| CHEMICAL ABSTRACTS, vol. 104, no. 5, 3 février 1986, page 158, résumé no. 29812t, Columbus, Ohio, US; P. CHARDON et al.: "Analysis of the sheep MHC using HLA class I, II, and C4 cDNA probes", & IMMUNOGENETICS 1985, 22(4), 349-58 * |
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Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| FR2615865B1 (en) | 1989-09-22 |
| WO1988009386A3 (en) | 1988-12-29 |
| WO1988009386A2 (en) | 1988-12-01 |
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