FR2672301A1 - Procede et dispositif pour amplifier le nombre d'une sequence definie d'acide nucleique dans un echantillon biologique. - Google Patents

Abstract

Le procédé et le dispositif concernent l'amplification du nombre d'au moins une séquence définie d'acide nucléique ou de sa séquence complémentaire, ci-après nommées séquences cibles, dans un échantillon biologique, caractérisé par le fait, d'une part que le procédé comporte un apport de principes actifs sur le dit échantillon et au moins une étape préliminaire, destinée à augmenter l'accessibilité des acides nucléiques présents dans l'échantillon, suivie d'une étape d'amplification, d'autre part que le dit échantillon ainsi que les principes actifs se trouvent confinés à l'intérieur d'un espace hermétiquement clos durant toute la durée de réalisation du procédé.

Description

La présente invention s'applique au domaine du diagnostic en biologie, qu'il s'agisse de la santé humaine, de la santé animale ou de l'agro-alimentaire. En santé humaine et animale, un tel diagnostic s'applique à la mise en évidence d'une infection par un pathogène et à la détection de maladies génétiques. En agro-alimentaire, ce diagnostic s'applique à la mise en évidence dans les denrées alimentaires d'un contaminant tel qu'un micro-organisme pathogène.

A titre d'exemple, une infection virale chez un individu ne peut, en routine, être décelée qu'à l'aide de tests immunologiques. En effet, dans la plupart des cas ce sont les anticorps dirigés contre le virus qui sont recherchés, ce qui est une preuve indirecte de la présence du virus. Dans certains cas particuliers où la virémie est importante, les antigènes viraux peuvent être directement recherchés dans le sang des individus. C'est le cas par exemple, pour le diagnostic d'une infection par le virus de l'hépatite B (VHB). De manière générale, les tests immunologiques ont des performances moyennes et ceci du fait de leur manque de sensibilité et de spécificité.

Les tests immunologiques les plus performants permettent de détecter de 105 à 106 particules virales par millilitre. Or pour le VHB, un sérum est considéré comme infectieux jusqu'à 102 particules virales par millilitre (Prince et col., 1983). Le nombre de résultats faussement négatifs est donc important, puisque le seuil d'infectiosité est au moins 1000 fois plus faible que le seuil de sensibilité des tests immunologiques.

Le manque de spécificité de ces tests est directement lié aux réactions immunologiques mises en jeu. II en résulte des résultats faussement positifs que l'on tente de mettre en évidence à l'aide d'un second test immunologique, couramment appelé "test de confirmation".

Cette approche est en particulier utilisée pour la détection des virus responsables du SIDA (Syndrome d'lmmunodéficience Acquise)
II existe aujourd'hui dans le domaine de la recherche des méthodes de biologie moléculaire permettant de diagnostiquer une infection par un pathogène avec un sensibilité et une spécificité très supérieures à celles obtenues avec les tests immunologiques. Ces méthodes basées sur l'hybridation moléculaire des acides nucléiques permettent en outre d'avoir une preuve directe de la présence du pathogène, puisque c'est son propre matériel génétique qui est détecté.

Un tel diagnostic, basé sur l'hybridation moléculaire, a pour finalité la mise en évidence d'au moins une séquence définie d'acide désoxyribonucléique (ADN) ou d'acide ribonucléique (ARN) dans un échantillon biologique. Pour les infections par un pathogène (virus, bactérie, parasite, etc...) c'est une séquence précise du matériel génétique du pathogène qui est mise en évidence. Pour les maladies génétiques (plus de 3000 chez l'homme), c'est une anomalie dans une séquence précise de 'ADN génomique qui est révélée. Pour atteindre une très grande sensibilité il est nécessaire d'amplifier in vitro le nombre de molécules d'ADN ou d'ARN qui doivent être mises en évidence. Les séquences d'ADN ou d'ARN ainsi amplifiées sont détectées dans un second temps par hybridation moléculaire à l'aide de sondes nucléiques.

Les meilleurs résultats sont actuellement obtenus en utilisant la technique d'amplification par réaction en chaine d'une ADN polymérase, plus couramment appelée technique PCR ("Polymerase Chai n Reaction") (Saiki et col., 1985).

La technique d'amplification enzymatique in vitro ou technique d'amplification par PCR a été décrite en décembre 1985 et appliquée au diagnostic chez l'homme de l'anémie à hématies falciformes.

Contrairement à tous les systèmes d'amplification décrits jusqu'ici , la technique PCR permet d'amplifier spécifiquement la quantité de séquences d'ADN double brin cible avant qu'elles ne soient détectées par hybridation moléculaire. Le principe de la PCR est d'utiliser de manière répétitive l'activité d'une ADN polymérase pour copier la séquence d'ADN à amplifier. Les bases technologiques de la PCR reposent sur deux points fondamentaux. Le premier point concerne l'utilisation de deux amorces oligonucléotidiques distantes de n nucléotides, I'une complémentaire du brin ADN (+), L'autre du brin ADN (-) et dont les extrémités 3' sont en regard. Le second point concerne l'utilisation répétitive de l'activité d'une ADN polymérase.La conséquence immédiate de ces deux points est que, dans des conditions adéquates toutes les séquences néosynthétisées au cycle (n) peuvent être utilisées comme matrice par l'ADN polymérase ati cycle (n+1). Ainsi toutes les séquences spécifiques présentes après le cycle (n) peuvent être copiées au cycle (n+1). II en résulte une amplification exponentielle du nombre de séquences spécifiques en fonction du nombre de cycles.

Plusieurs étapes successives sont nécessaires au déroulement d'un cycle de PCR. II faut tout d'abord permettre l'hybridation spécifique d'un oligonucléotide avec une séquence d'ADN cible simple brin à amplifier. A partir du complexe d'hybridation ainsi formé une ADN polymérase réalise la synthèse du brin d'ADN complémentaire en utilisant l'oligonucléotide comme amorce et le brin d'ADN cible à amplifier comme matrice. De manière plus précise, un cycle d'amplification est composé de trois étapes. La première étape permet de réaliser la dénaturation des séquences d'ADN double brin à 90-100 C. La seconde étape permet d'aboutir à l'hybridation spécifique des oligonucléotides permise par un abaissement de la température au cours de la phase d' hybridation des amorces.La troisième étape autorise l'extension de l'oligonucléotide hybridé à une température proche de la température optimale de fonctionnement de l'ADN polymérase (37"C pour le fragment de Klenow et 720C pour une ADN polymérase thermorésistante extraite à partir de Thermus aquiticus).

Lors du cycle d'amplification (n+1), les séquences d'ADN simple brin sont synthétisées en utilisant comme matrices les séquences néosynthétisées au cycle (n), ainsi que les séquences présentes à la fin du cycle (n-l). Une séquence néosynthétisée au n ème cycle ne pourra ainsi servir d'amorce au cycle (n+1) que si sa longueur est au moins égale à la distance en bases séparant les deux amorces. Dans ces conditions, le nombre de séquences d'ADN amplifiées spécifiquement varie exponentiellement par rapport au nombre de cycles.

L'amplification à partir de séquences d'ARN nécessite de réaliser une étape préliminaire de synthèse de l'ADN complémentaire (ADNc).

Cette approche est importante pour la détection du génome de rétrovirus comme le virus de l'immunodéficience humaine (VIH) responsable du
SIDA chez l'homme (Ou et col., 1988).

La réaction d'hybridation moléculaire entre deux séquences d'acides nucléiques est directement liée à la température. Cette hybridation basée sur la complémentarité des bases entre deux séquences peut intervenir, entre deux molécules d'ADN, entre deux molécules d'ARN, ou entre une molécule d'ADN et une molécule d'ARN.

L'hybridation moléculaire permet donc de réaliser, soit l'appariement par liaison hydrogène entre deux molécules distinctes, soit l'appariement intra-moléculaire entre deux séquences complémentaires. Dans ce dernier cas, il y a formation de structure dite secondaire de molécules d'ADN ou d'ARN. L'influence de la température sur la réaction d'hybridation est essentielle et chaque séquence d'ADN (ou d'ARN) est définie par son Tm, c'est à dire la température à laquelle 50 % des séquences sont appariées aux séquences complémentaires. Le Tm d'une séquence précise peut être évalué expérimentalement en suivant par spectrophotométrie l'hyperchromicité à 260 nanomètres qui accompagne le désappariement (ou dénaturation) de deux séquences d'ADN complémentaires.La totalité des séquences d'ADN sont sous forme simple brin à température élevée (100"C) et sous forme double brin à température basse (1 0-200C).

Le Tm d'une séquence d'ADN dépend finalement des deux paramètres suivants: de la séquence en bases de 'ADN en question et de la force ionique du milieu. Les Tm généralement rencontrés varient de 20 à 85 "C. Ainsi, la totalité des réactions d'hybridation moléculaire doivent être réalisées dans des conditions thermiques parfaitement définies et contrôlées.

Pour le diagnostic biologique (santé humaine, santé animale, agro-alimentaire) une séquence d'ADN ou d'ARN définie peut être détectée à l'aide de la séquence d'ADN ou d'ARN complémentaire utilisée comme sonde moléculaire . La sonde est préalablement marquée, soit à l'aide d'un isotope radioactif, soit à l'aide d'une modification chimique. Après hybridation entre la séquence cible et la séquence sonde, cette dernière peut être détectée grâce à son marquage.

Dans l'état actuel des connaissances, il est possible de détecter la présence d'une seule molécule d'ADN (acide désoxyribonucléique) ou d'ARN (acide ribonucléique) dans un échantillon biologique en associant la technique PCR et l'hybridation moléculaire à l'aide d'une sonde nucléique. En d'autre terme, les tests basés sur l'hybridation moléculaire permettent d'atteindre une sensibilité extrême puisqu'un seul pathogène peut être mis en évidence dans un échantillon (Wong et col., 1987). Par comparaison avec un test immunologique, le gain en sensibilité est de 10.000 fois environ.

La spécificité des réactions d'hybridation moléculaire est excellente puisqu'il est possible de mettre en évidence une infime variation dans la séquence des bases composant le matériel génétique d'un individu. La modification d'une seule base sur les 3.500.000.000 de bases qui composent le génome humain peut ainsi être mise en évidence.

Malgré cette très grande spécificité des réactions d'hybridation, un test de diagnostic ultra-sensible, associant l'utilisation de la PCR et de l'hybridation moléculaire à l'aide d'une sonde nucléique, n'a pas une bonne spécificité. II n'est en effet pas rare d'obtenir des résultats faussement positifs qui diminuent significativement la spécificité globale du test. Ce phénomène est dû à des contaminations moléculaires accidentelles d'échantillons négatifs par au moins une molécule d'ADN ou d'ARN que l'on cherche à détecter (Lo et col., 1988). Ces contaminations qui altèrent la spécificité globale du test ont lieu entre le prélèvement de l'échantillon biologique et la fin de l'amplification des séquences d'ADN par PCR. Les résultats faussement positifs sont finalement une conséquence directe de la très grande sensibilité du test.

En d'autre terme, l'utilisation d'une technique d'amplification aussi puissante que la PCR, a permis de découvrir l'existence de contaminations moléculaires jusqu'ici insoupçonnées.

La sensibilité extrême atteinte par les tests de diagnostic basés sur la PCR est ainsi à l'origine d'un nouveau type de résultats faussement positifs liés aux contaminations moléculaires. L'ampleur du problème est telle qu'il est aujourd'hui nécessaire d'effectuer les différentes étapes du test dans des locaux différents pour tenter de minimiser ce phénomène.

Ce cloisonnement permet de séparer physiquement les manipulations pré-PCR, réalisées sur des échantillons pauvres en ADN spécifique, des manipulations post-PCR, réalisées sur des échantillons très riches en
ADN spécifique. Un minimum de trois pièces indépendantes (mais 4 de préférence) avec leur propre sas de sécurité commence à être installé dans un grand nombre de laboratoires de recherche dans le monde. Ces pièces sont en surpression ou en dépression selon que l'étape qui s'y déroule est pré-PCR ou post-PCR respectivement.

Ce cloisonnement permet de réduire sensiblement le nombre de résultats faussement positifs mais non de les éliminer totalement. Cette approche reste en tout état de cause coûteuse, et rend très complexe un test qui à la base devait être simple.

II existe actuellement dans le circuit commercial un certain nombre d'appareils ne pouvant exécuter qu'une des 3 ou 4 étapes qui composent un test de diagnostic utilisant la PCR et l'hybridation moléculaire à l'aide d'une sonde nucléique. Les seules étapes ainsi automatisées sont l'étape d'extraction des acides nucléiques à partir de l'échantillon biologique et l'étape d'amplification des séquences d'ADN par PCR.

Pour réaliser l'étape d'extraction des acides nucléiques à partir de l'échantillon biologique, un seul appareil est aujourd'hui disponible sur le marché mondial. C'est un appareil coûteux, ne pouvant traiter qu'un très faible nombre d'échantillons (8 au maximum) en 6 heures environ.

L'ensemble de ses caractéristiques font que cet appareil ne peut être utilisé que dans un laboratoire de recherche très spécialisé.

Entre 12 et 15 appareils différents permettent de réaliser automatiquement l'étape d'amplification des séquences d'ADN par PCR.

La totalité de ces machines soumettent à différentes températures des tubes plastiques jetables et indépendants, d'une capacité variant de 0,75 ml à 1,50 ml. Chaque tube contient l'échantillon biologique à traiter. Deux appareils sont également proposés avec un adaptateur pouvant recevoir une plaque de microtitration.

De manière générale, les appareils existants ont été conçus pour réaliser automatiquement une étape technologique précise. Aucun d'entre eux ne permet de réaliser la totalité d'un test de diagnostic par hybridation moléculaire. Ainsi l'utilisation consécutive d'un appareil d'extraction des acides nucléiques et d'un appareil PCR oblige à effectuer, entre ces deux étapes automatisées, des manipulations sur chaque échantillon. Une telle intervention manuelle est obligatoire entre ces deux étapes et au cours des étapes réalisées après laPCR.

Ces manipulations consistent principalement en l'ouverture et la fermeture des tubes jetables avec bouchon amovible, et en pipettage de précision. Lors de la manipulation des tubes, I'expérimentateur porte des gants en latex ou en vinyle dans un souci de plus grande propreté et surtout pour éviter de contaminer lui même l'échantillon par des nucléases présentes sur la peau. Les nucléases sont des enzymes qui dégradent l'ADN et l'A RN. Malheureusement, les gants sont enduits de talc, ou d'un produit équivalent, qui est une grande source potentielle de contamination de l'échantillon au cours de l'ouverture et de la fermeture du tube. De plus, lorsqu'un tube est ouvert, l'important danger de contamination est encore accentué par la présence de tubes voisins contenant potentiellement des molécules contaminantes. Au cours du pipettage d'une quantité déterminée de liquide dans un tube donneur et du refoulement de ce liquide dans un tube receveur, le liquide pipetté peut être l'échantillon lui même, une solution tampon, une préparation contenant au moins un principe actif (enzymes, oligonucléotides, nucléotides triphosphates, etc...).

Pour chaque échantillon biologique traité, de 12 à 15 pipettages doivenr être effectués à l'aide d'un appareil de pipettage de à précision pour la seule étape pré-PCR consistant en une extraction des acides nucléiques. L'appareil de pipettage de précision est très fréquemment à l'origine de contamination moléculaire entre deux mélanges réactionnels différents. Face à ce problème majeur, les expérimentateurs utilisent de plus en plus des systèmes de pipettage à déplacement positif qui semblent diminuer légèrement le nombre de contaminations, mais dont le coût est élevé.

En tout état de cause, L'ensemble de ces manipulations sont un danger constant en terme de contaminations moléculaires qui risquent de générer des résultats de test faussement positifs. Cette situation est un frein important à l'utilisation des technologies d'hybridation moléculaire pour le diagnostic biologique. Pour la santé humaine en particulier, il ne peut être envisagé de développer un test fiable, du fait du trop grand nombre de résultats faussement positifs.

La situation actuelle est donc aujourd'hui paradoxale, puisqu'il existe des technologies d'une très grande puissance, la PCR en particulier, mais qu'elles ne peuvent pas être utilisées du fait de conditions générales de manipulations inadaptées. Ces conditions de manipulation, pourtant réputées très strictes dans un laboratoire de biologie moléculaire, ne sont pas suffisantes lorsque la sensibilité des tests développés permet la détection d'une seule molécule d'ADN ou d'ARN.

L'impact de l'utilisation des tests de diagnostic par hybridation moléculaire en santé humaine serait considérable puisque diverses estimations rapportent que 10 à 20 % environ des individus testés dans les centres de transfusions, les hôpitaux et les laboratoires spécialisés sont contaminés par un pathogène mais ne sont pas détectés (faux négatifs) par les tests immunologiques conventionnels.

Dans la présente description et dans les revendications, on entendra par le terme "échantillon" un ensemble de molécules à un instant donné au cours du traitement global de l'échantillon biologique, le dit ensemble de molécules étant initialement issu du prélèvement biologique réalisé au cours de l'échantillonnage. Lorsqu'il y a séparation physique en au moins deux familles de molécules, I'échantillon est celui qui contient le plus grand nombre de séquences d'ADN ou d'ARN spécifiques recherchées dans l'état de purification ou d'association avec d'autres molécules le plus avancé par rapport au traitement global composé de plusieurs étapes successives. De la même manière, on entendra par le terme "principe actif" une molécule ou une famille de molécules intervenant au cours du traitement de l'échantillon.Un principe actif peut, en particulier, être une enzyme, un ion, un sel, un nucléotide triphosphate ou un oligonucléotide. Par le terme "séquence cible", on entendra la séquence d'ADN ou d'ARN qui sera spécifiquement amplifiée au cours de l'étape d'amplification. La séquence cible une fois amplifiée pouvant éventuellement être mise en évidence par hybridation moléculaire à l'aide d'au moins une séquence sonde. On entendra par le terme "échantillonnage" le prélèvement de matériel biologique à partir, d'un individu, d'un animal, d'un végétal, ou d'un produit issu de l'industrie agro-alimentaire. Le matériel biologique ainsi prélevé sera appelé "échantillon initial".

L'objectif principal de la présente invention est d'éliminer totalement les problèmes de contaminations moléculaires au cours du traitement automatique d'un échantillon biologique qui comprend une étape d'amplification in vitro du nombre d'une séquence définie d'ADN ou d'ARN. Un tel résultat peut être atteint par l'utilisation d'un procédé pour amplifier le nombre d'au moins une séquence définie d'acide nucléique ou de sa séquence complémentaire, ci-après nommées séquences cibles, dans un échantillon biologique, caractérisé par le fait, d'une part qu'il comporte un apport de principes actifs sur le dit échantillon et au moins une étape préliminaire, destinée à augmenter l'accessibilité des acides nucléiques présents dans l'échantillon, suivie d'une étape d'amplification, d'autre part que le dit échantillon ainsi que les principes actifs se trouvent confinés à l'intérieur d'un espace hermétiquement clos durant toute la durée de réalisation du procédé. Afin de surmonter de manière plus efficace ces problèmes de contaminations moléculaires, le procédé peut avantageusement être caractérisé par le fait que l'échantillonnage se fait directement dans le dit espace hermétiquement clos.

Un tel procédé permet de préférence d'effectuer un test complet de diagnostic biologique comprenant, d'une part une étape préliminaire permettant d'augmenter l'accessibilité de l'ADN et de I'ARN à des molécules contenues dans l'échantillon initial et à au moins un principe actif, comme des enzymes de polymérisation de l'ADN et de 'ARN et des séquences d'ADN et d'ARN partiellement ou totalement complémentaires, d'autre part au moins une étape supplémentaire subséquente à l'étape d'amplification destinée à mettre en évidence la présence éventuelle dans l'échantillon de tout ou partie d'au moins une séquence cible d'acide désoxyribonucléique (ADN) ou d'acide ribonucléique (ARN) dont le nombre s'est accru au cours de l'étape d'amplification.

L'étape d'amplification précitée utilise de préférence, d'une part l'activité d'une ADN polymérase ou d'une ARN polymérase responsable de la synthèse des séquences d'ADN ou d'ARN amplifiées, d'autre part, soit au moins une séquence d'ADN ou d'ARN reconnue comme amorce par l'enzyme précitée et partiellement ou totalement complémentaire d'une partie de séquence cible à amplifier spécifiquement, soit une séquence promotrice parfaitement définie reconnue par l'enzyme et appartenant à la séquence cible à amplifier.

Le procédé en question est avantageusement caractérisé par le fait qu'au moins une étape supplémentaire, située avant ou après l'étape d'amplification, utilise au moins une séquence sonde d'ADN ou d'ARN, modifiée ou non, qui dans des conditions physico-chimiques précises s'hybride spécifiquement par complémentarité entre les bases avec au moins une séquence cible, et qui est présente dans l'échantillon sous forme libre ou supportée.

Sous la forme d'un test complet de diagnostic, le procédé précédemment décrit peut avantageusement être caractérisé par le fait, d'une part que l'étape d'amplification utilise la technique de réaction en chaine de la polymérase (PCR) pour augmenter spécifiquement le nombre de molécules d'une séquence cible définie avec une amorce oligonucléotidique modifiée qui porte une molécule pouvant émettre un signal mesurable, d'autre part qu'après l'amplification l'échantillon soit mis en contact avec une sonde d'ADN supportée, au moins partiellement complémentaire de la séquence cible amplifiée, et que la présence de la dite séquence cible amplifiée spécifiquement retenue sur le dit support est évaluée à l'aide de moyens extérieurs à la barrette permettant de détecter de manière quantitative la molécule émettrice d'un signal portée par les séquences amplifiées.

La mise en oeuvre du procédé possédant l'une quelconque des caractéristiques précédemment citées est le fait d'un dispositif caractérisé en ce qu'il comporte, d'une part au moins une enceinte renfermant des principes actifs nécessaires pour l'étape préliminaire destinée à augmenter l'accessibilité des acides nucléiques, d'autre part au moins une enceinte renfermant les principes actifs nécessaires pour l'étape d'amplification, et que les enceintes sont reliées hermétiquement l'une à l'autre de manière à constituer un ensemble, ci-après nommé barrette, délimitant un espace clos, des moyens étant prévus pour faire circuler et pour réguler thermiquement l'échantillon et les principes actifs. Un tel dispositif utilise de préférence une barrette à usage unique, c'est à dire jetable après le traitement d'un seul échantillon biologique.

De manière avantageuse, le dispositif précédemment cité est caractérisé par le fait, d'une part que les moyens assurant partiellement ou totalement le déplacement de l'échantillon et des principes actifs dans la barrette sont constitués d'une pompe péristaltique agissant sur la paroi souple d'un capillaire appartenant à la barrette, d'autre part que les liaisons entre les différentes enceintes sont des capillaires équipés de moyens destinés à permettre ou à empêcher le passage d'un fluide à un instant donné dans au moins un capillaire précis afin d'assurer le bon déroulement du traitement et que les dits moyens sont constitués d'un élément rigide possédant au moins deux positions dans l'espace, tel qu'une position dite fermée permette de comprimer le capillaire souple en cet endroit afin d'empêcher la circulation d'un fluide, et tel que l'autre position dite ouverte n'ait pas cet effet de compression et autorise le passage d'un fluide en cet endroit du capillaire.

De manière avantageuse, plusieurs barrettes peuvent être regroupées pour former une cartouche permettant de traiter simultanément plusieurs échantillons avec des moyens communs pour assurer la régulation thermique, le déplacement et la circulation sélective des échantillons et des principes actifs.

Le dispositif pour la mise en oeuvre du procédé décrit dans cette invention est constitué, d'une part d'une barrette contenant les principes actifs nécessaires au bon déroulement du procédé, d'autre part de moyens pour assurer le déplacement, la régulation thermique et la circulation sélective de l'échantillon et des principes actifs à l'intérieur de la dite barrette.

La présente invention sera mieux comprise à l'aide du complément de description qui va suivre, qui se réfère aux dessins annexés dans lesquels:
- la figure 1 représente une vue schématique en perspective et partiellement coupée d'une barrette équipant un mode de réalisation préférentiel du dispositif selon l'invention.

- les figures 2, 3 et 4 représentent des vues en coupe de certains composants de la barrette représentée dans la figure 1. II s'agit de la plaque de base comportant un réseau de sillons (figure 2), des capillaires formés par l'association de la plaque de base et d'une plaque perforée (figure 3), des mêmes capillaires représentés dans la figure 3 mais coupés en un site de connection de la plaque perforée avec une enceinte de traitement (figure 4).

- la figure 5 est une illustration schématique du réseau de capillaires permettant les connections entre les enceintes de traitement appartenant à la barrette représentée dans la figure 1, le dit réseau étant équipé de vannes.

- les figures 6, 7, 8 et 9 représentent différentes boucles fonctionnelles du réseau de la figure 5, chaque boucle étant associée à une configuration d'ouverture et de fermeture des vannes.

- la figure 10 représente une vue schématique d'une cartouche équipant un mode de réalisation préférentiel du dispositif selon l'invention.

La barrette, totalement ou partiellement représentée sur les figures 1, 2, 3 et 4, ainsi que la cartouche représentée sur la figure 10, sont à usage unique. Cette approche permet de disposer, à l'intérieur des dites barrette et cartouche, d'un espace hermétiquement clos contenant des principes actifs qui n'ont jamais été en contact avec une source potentielle de contaminations nuisibles au bon déroulement du procédé.

La réutilisation d'au moins une partie de la barrette augmente le risque d'une contamination moléculaire de l'échantillon à un moment donné du traitement, même si la partie réutilisée n'est pas sur le trajet de l'échantillon ou d'un liquide ayant été en contact avec l'échantillon. C'est le cas par exemple d'un dispositif constitué de deux partie connectées, d'une part d'une partie à usage unique à l'intérieur de laquelle se déroule la totalité des déplacements de l'échantillon et des principes actifs, d'autre part d'une partie réutilisable constituée d'une cartouche contenant un gaz qui du fait de sa pression sert au déplacement de l'échantillon et des principes actifs.Bien que la partie jetable puisse porter, près de son extrémité connectable, un système de filtration empêchant le passage de molécules contaminantes préalablement définies, les risques de contamination sont supérieurs à ceux inhérents à l'utilisation d'une barrette à usage unique.

La barrette (figures 1 à 4) et la cartouche (figure 10) précitées sont conçues pour effectuer un test complet de diagnostic défini comme un procédé biologique permettant de réaliser toutes les étapes préliminaires à l'amplification, I'amplification elle même et les étapes subséquentes à l'amplification aboutissant à une analyse finale qualitative, semiquantitative ou quantitative. L'analyse finale précitée est destinée à mettre en évidence la présence éventuelle dans l'échantillon d'au moins une séquence définie d'ADN ou d'ARN dont le nombre s'est accru au cours de l'étape d'amplification.

De manière avantageuse, I'introduction de l'échantillon initial dans la barrette ou la cartouche se fera dès l'échantillonnage à partir d'un individu, d'un animal ou d'un produit issu de l'industrie agro-alimentaire.

L'introduction précitée pourra cependant être réalisée à partir d'un compartiment de stockage servant d'intermédiaire entre le prélèvement et le traitement effectif de l'échantillon dans la barrette ou la cartouche.

La barrette (figures 1 à 4) et la cartouche (figure 10) précitées sont caractérisées par le fait que l'espace hermétiquement clos est entouré d'une barrière physique étanche, avantageusement en matière plastique qui peut posséder des zones de jonction hermétiques entre deux éléments constitutifs distincts. Ces zones de jonction peuvent résulter d'un collage, d'un thermosoudage ou d'un assemblage "en force" de deux éléments précités. Du fait des matériaux de construction utilisés, la barrette ne permet pas le passage de molécules contaminantes de l'extérieur vers l'intérieur, ni de l'intérieur vers l'extérieur. Le passage de telles molécules serait suceptible de perturber le traitement de l'échantillon, en particulier s'il s'agit d'une séquence d'ADN ou d'ARN d'une longueur supérieure ou égale à deux nucléotides. II s'agit principalement d'empêcher le passage de séquences d'ADN ou d'ARN dont le nombre serait susceptible d'être amplifié au cours du traitement de l'échantillon.

La barrette (figure 1) est constituée d'un couvercle (5) fixé sur une plaque de base (1), qui repose elle même sur une plaque perforée souple (2). A l'extrémité de la plaque (1), deux sorties permettent de recevoir chacune un tuyau souple (E7,4) d'un diamètre intérieur de 1,2 mm. Le couvercle (5) protège 6 éléments, (El), (E2), (E3), (E4), (E5) et (E6) fixés sur la plaque (1). Les éléments (E7) et (4) sont connectés à une enceinte (E8) portant une fenêtre (3).

Le procédé biologique qui se déroule à l'intérieur de cette barrette comporte au moins une étape préliminaire destinée à augmenter l'accessibilité des acides nucléiques contenus dans l'échantillon initial.

Ces acides nucléiques seront ainsi plus accessibles à au moins une molécule qui est, soit présente dans l'échantillon au moment de cette étape et issue de l'échantillon initial ou de l'addition d'un principe actif, soit ajoutée sous la forme d'un principe actif lors d'une étape subséquente. L'augmentation de l'accessibilité des acides nucléiques peut être obtenue, soit par modification des molécules et des structures biologiques contenues dans l'échantillon, soit par purification partielle de ces acides nucléiques. Cette étape permettant d'augmenter l'accessibilité des acides nucléiques est nécessaire car toute cellule vivante, tel qu'un virus, une bactérie, ou une cellule d'eucaryote, contient des structures biologiques plus ou moins évoluées destinées à compartimenter la cellule et permettant de protéger des molécules essentielles comme les acides nucléiques.L'accessibilité aux acides nucléiques nécessite donc la destruction partielle ou totale de telles structures qui sont généralement de nature protéique et lipidique. La technique la plus couramment utilisée consiste à détruire ou à modifier suffisamment des molécules composant cette structure biologique. La destruction ou la modification profonde des protéines de structure, soit par une enzyme protéolytique telle que la protéinase K, soit par l'action de la chaleur (traitement à 110"C) est une technique efficace et parfaitement compatible avec le procédé et le dispositif décrits dans cette invention.

La purification partielle des acides nucléiques peut consister en l'élimination partielle des molécules lipidiques et des protéines contenues dans l'échantillon. Cette méthode permet donc de manière indirecte d'altérer les structures biologiques précitées. La première technique consiste à faire passer l'échantillon sur une colonne composée d'une résine ayant une forte affinité pour les protéines à pH neutre et une très faible affinité pour les acides nucléiques. Une seconde technique consiste à faire passer au moins une fois l'échantillon sur une colonne échangeuse d'ions qui retiendra les acides nucléiques par liaisons ioniques entre les phosphates chargés négativement de l'ADN ou de l'ARN et les cations fixés à la colonne.Dans un second temps, un tampon d'élution de forte force ionique sera utilisé pour décrocher l'ADN ou l'ARN en créant une compétition entre l'anion de la colonne et l'anion du sel (Na+ de préférence) pour la fixation sur les charges négatives des phosphates. Cette technique simple est tout à fait compatible avec le procédé et le dispositif décrits dans cette invention. Une troisième technique consiste à extraire des molécules comme les lipides et les protéines à l'aide de solvants organiques comme le phénol et le chloroforme. Une quatrième technique consiste à retenir des séquences définies d'ADN ou d'ARN par hybridation avec des séquences supportées au moins partiellement complémentaires présentes sur une colonne.

L'étape préliminaire destinée à augmenter l'accessibilité des acides nucléiques présents dans l'échantillon peut être un simple chauffage de ce dernier à une température susceptible de dénaturer certaines protéines, c'est à dire à une température de préférence comprise entre 900C et 1 1 00C. En suivant un tel protocole, l'étape préliminaire précitée peut être confondue avec le premier traitement thermique servant à dénaturer les séquences d'ADN et d'ARN au cours de l'étape d'amplification.

De manière avantageuse, deux étapes préliminaires successives sont utilisées au cours du procédé qui se déroule dans la barrette représentée dans la figure 1. La première étape préliminaire consiste en un traitement protéolytique de l'échantillon par la protéinase K. Pour ce faire, I'échantillon est mélangé à cette enzyme dans l'enceinte (E6) puis il se déplace dans l'enceinte (E7) pour y être incubé à 70"C pendant 20 minutes. La seconde étape préliminaire consiste en un passage de l'échantillon, dans des conditions de faible force ionique, sur une colonne échangeuse d'anions située dans (E2). Les acides nucléiques retenus sur la colonne sont ensuite décrochés à l'aide d'un tampon de forte force ionique situé dans (ex).

Dans la barrette représentée sur la figure 1, il est avantageux, après les deux étapes préliminaires successives destinées à augmenter l'accessibilité des acides nucléiques, d'utiliser la réaction en chaine de la polymérase (PCR) avec au moins une amorce oligonucléotidique portant la fluorescéine molécule signal à son extrémité 5'. Ainsi, une partie au moins des séquences néosynthétisées au cours de l'étape d'amplification porteront la dite molécule signal et pourront être reconnues sélectivement au cours d'une étape subséquente. L'ensemble des principes actifs nécessaires à une telle étape d'amplification sont contenus dans (E5).

Après addition des dits principes actifs, l'échantillon est amené dans (E7) où il est soumis de manière cyclique aux différentes températures permettant de réaliser la PCR. De 15 à 40 cycles d'amplification par PCR sont généralement suffisants pour obtenir une sensibilité importante du test de diagnostic. Cependant, pour la détection de certains pathogènes comme les virus VIH (type 1 et 2) et le virus de l'hépatite C (Garson et col., 1990) il est nécessaire d'effectuer une seconde PCR en utilisant des amorces oligonucléotidiques internes à la séquence spécifiquement amplifiée. Cette approche permet d'atteindre une sensibilité importante même lorsque le nombre initial de pathogènes est proche de l'unité.

Selon d'autres versions du procédé décrit dans la présente invention, L'étape d'amplification peut utiliser l'activité d'une ADN polymérase, ou d'une ARN polymérase, responsable de la synthèse des séquences amplifiées, et dans laquelle deux familles d'enzymes peuvent être distinguées. La première famille est composée d'enzymes qui nécessitent la présence d'une séquence amorce d'ADN ou d'ARN. De telles enzymes utilisent en effet comme substrat un duplex moléculaire constitué par l'hybridation entre une séquence cible, ou séquence matrice, et une séquence amorce portant une extrémité 3' hydroxyl (OH) libre. L'enzyme étend alors la séquence amorce à partir de son extrémité 3' en incorporant, pour une position donnée sur la séquence cible, le nucléotide complémentaire en utilisant des nucléotides triphosphates libres présents dans le milieu. II en résulte la synthèse d'une séquence complémentaire à la séquence cible. La seconde famille est constituée d'enzymes qui nécessitent la présence d'une séquence promotrice parfaitement définie qu'elles reconnaissent et à partir de laquelle elle synthétise la séquence complémentaire à la séquence située immédiatement en 3' de la dite séquence promotrice en utilisant des nucléotides triphosphates libres présents dans le milieu. Les ARN polymérase des bactériophages T7 et SP6 sont des enzymes qui se comportent de cette dernière manière (Stoflet et col., 1988).

De manière avantageuse, il peut être utilisé une molécule signal autre que la fluorescéine pour modifier l'amorce oligonucléotidique servant au cours de l'étape d'amplification de procédé décrit dans la présente invention. En effet, il existe deux familles principales de molécules signal. La première famille est composée de molécules qui, dans des conditions physico-chimiques précises1 peuvent émettre un signal de nature particulaire pouvant être une émission radioactive, de fluorescence, de luminescence, de bio-luminescence et de phosphorescence. La deuxième famille est composée de molécules dont au moins un de leurs paramètres est facilement mesurable. II peut s'agir du produit soluble ou précipitable issu de la dégradation d'un substrat en particulier par une enzyme comme la phosphatase alcaline ou la péroxydase.La présence du produit de dégradation soluble peut être détectée par colorimétrie. II existe des produits de dégradation de substrats appartenant à la première famille de molécules signal précitée du fait de la nature de leur émission.

Selon d'autres versions encore du procédé décrit dans la présente invention, au moins une amorce oligonucléotidique utilisée au cours de l'étape d'amplification peut être modifiée de différentes façons, autre que celle aboutissant à l'accrochage d'une molécule signal. En effet, une séquence d'acide nucléique peut être modifiée par addition d'un isotope radioactif (32P, 355, 3H), d'un groupement chimique, d'un haptène, d'une molécule de poids moléculaire supérieur à 300 daltons ou d'une enzyme.

Le procédé qui se déroule dans la barrette représentée dans la figure 1 comporte de préférence une étape finale d'analyse des séquences spécifiquement amplifiées. Pour ce faire, I'échantillon ayant subi l'amplification est mis en contact avec une sonde d'ADN supportée, au moins partiellement complémentaire de la séquence cible amplifiée, puis la présence de la dite séquence cible amplifiée, spécifiquement retenue sur le dit support, est évaluée à l'aide de moyens permettant de détecter de manière quantitative la fluorescéine émettrice d'un signal portée par les séquences amplifiées. La séquence sonde est de préférence un oligonucléotide de 20 à 35 nucléotides covalemment lié à un support solide constitué de silice.

L'étape finale d'analyse précitée consiste, d'abord en au moins un passage de l'échantillon à une température précise dans une colonne incluse dans (E8) et contenant un support solide sur lequel est immobilisé au moins une séquence sonde précitée, puis en un décrochage et une remise en solution à une température d'élution d'au moins une séquence cible amplifiée à l'aide d'un tampon d'élution stocké dans (E3), suivi d'une détection dans l'éluat de la molécule signal. La dite température d'élution est calculée en fonction de la température de fusion (Tm) du duplex moléculaire formé par l'hybridation de la séquence sonde supportée avec au moins une séquence cible amplifiée.Du fait de la variabilité génétique de certaines séquences cibles et donc de la connaissance approximative de la séquence cible réellement contenue dans les échantillons, plusieurs températures d'élution pourront successivement être avantageusement utilisées dans le sens des températures croissantes. Au moins un éluat peut alors être soumis à la détection de la molécule signal portée par la séquence cible amplifiée à l'aide d'un détecteur extérieur à la barrette.

Selon une version simplifiée du procédé décrit dans la présente invention, L'étape d'amplification représente la fin du dit procédé. D'autre variantes encore du procédé décrit dans la présente invention peuvent être utilisées selon la nature d'une étape supplémentaire. La dite étape supplémentaire peut se situer avant ou après l'étape d'amplification, et utiliser au moins une séquence sonde d'ADN ou d'ARN, modifiée ou non, qui dans des conditions physico-chimiques précises s'hybride spécifiquement par complémentarité entre les bases avec au moins une séquence cible. La séquence sonde précitée peut être présente dans l'échantillon sous forme libre ou supportée.La finalité d'une telle étape supplémentaire est d'aboutir en fin de traitement à une analyse qualitative, semi-quantitative ou quantitative de la présence d'au moins une séquence cible dans l'échantillon initial et donc de disposer d'un test complet de diagnostic réalisé automatiquement et dans les conditions d'isolement préalablement définies.

Au cours de la dite étape supplémentaire, la séquence sonde peut avantageusement être ajoutée avant l'étape d'amplification et servir d'inhibiteur spécifique lors de l'amplification. En effet, une ADN polymérase ou une ARN polymérase est arrêtée ou fortement ralentie si en cours de sa progression relative sur la séquence matrice, et alors qu'elle synthétise la séquence complémentaire, elle se heurte à l'extrémité 5' d'une séquence d'ADN ou d'ARN, dite bloquante, hybridée à la dite séquence matrice. Une séquence sonde, complémentaire d'au moins une séquence cible à amplifier, ajoutée avant l'étape d'amplification se comporte comme une séquence bloquante et a donc un effet inhibiteur sur l'amplification spécifique d'au moins une séquence cible.Pour un échantillon donné, si l'étape d'amplification est appliquée indépendamment, d'une part sur le dit échantillon contenant une séquence sonde ou séquence bloquante, d'autre part sur le dit échantillon ne contenant pas de séquence sonde, la comparaison des analyses des séquences amplifiées dans ces deux cas permet de diagnostiquer avec certitude la présence ou l'absence de la séquence cible dans l'échantillon initial. Pour être efficace une telle séquence sonde peut être modifiée à son extrémité 3', de préférence par incorporation d'un didésoxynucléotide, pour ne pas pouvoir être utilisée comme amorce par l'ADN ou l'ARN polymérase au cours de l'amplification.

Au cours de la dite étape supplémentaire, la séquence sonde peut de préférence être ajoutée après l'étape d'amplification et s'hybrider spécifiquement à au moins une séquence cible amplifiée. Selon cette approche, de très nombreux modèles d'hybridation différents peuvent être utilisés suivant que la séquence cible est immobilisée sur un support solide ou libre, suivant que la séquence sonde est immobilisée sur un support solide ou libre, suivant le nombre de séquences sondes différentes utilisées et suivant le type de modification éventuelle d'au moins une séquence cible ou d'au moins une séquence sonde. Le modèle d'hybridation utilisé conditionne les étapes suivantes du traitement de l'échantillon dont l'étape finale est une analyse des séquences amplifiées.

De manière avantageuse, lorsque le modèle d'hybridation précité et l'analyse finale ont pour objet de différencier au moins une séquence cible amplifiée de l'ensemble des autres séquences présentes dans l'échantillon, il est nécessaire d'utiliser, soit des moyens permettant de différencier ces molécules en fonction d'un au moins de leurs paramètres physico-chimiques, soit un complexe d'hybridation entre la dite séquence cible amplifiée et au moins une séquence sonde complémentaire. Le paramètre physico-chimique le plus utilisé est le poids moléculaire d'une séquence d'ADN ou d'ARN, ou sa longueur en nombre de nucléotides, mais son évaluation nécessite l'emploi d'une technique séparative comme l'électrophorèse ou la gel-filtration.

De manière préférentielle, le procédé décrit dans cette invention peut permettre d'effectuer un test complet de diagnostic, la dernière étape étant alors une analyse qualitative, semi-quantitative ou quantitative de la présence d'une molécule signal précise permettant d'estimer la présence d'au moins une séquence cible amplifiée spécifiquement et étant donné qu'il existe une corrélation, dépendant de la nature de l'analyse, entre la présence de la séquence cible amplifiée et la présence de tout ou partie de cette séquence cible dans l'échantillon initial. La molécule signal précitée peut être portée soit par une séquence cible amplifiée ou une partie de celle ci, soit par une séquence sonde ou une partie de celle ci.

La molécule signal est caractérisée par le fait que sa présence peut être directement mesurée à l'aide d'un appareil détecteur.

Pour le bon déroulement du procédé mis en oeuvre dans la barrette de la figure 1, certaines enceintes (figure 1) seront avantageusement munies de moyens extérieurs de chauffage et de refroidissement. Ainsi, (E7) est équipé de trois éléments de chauffage indépendants qui permettent, d'une part de soumettre l'échantillon à une température constante comprise entre 37"C et 700C au cours du traitement protéolytique par la protéinase K, d'autre part de soumettre successivement l'échantillon aux trois températures associées à un cycle d'amplification par PCR et permettant de réaliser la dénaturation de I'ADN double brin, I'hybridation des amorces et l'extension par une ADN polymérase. (E8) est également équipée d'un élément chauffant qui permet au cours de l'étape d'analyse précédemment décrite de décrocher une séquence cible amplifiée.La pluralité des étapes composant le traitement global de l'échantillon nécessite une dynamique du système.

Cette dynamique consiste en un déplacement de l'échantillon entre différentes enceintes et en un déplacement vers l'échantillon d'un principe actif nécessaire au traitement. La dynamique en question est assurée par le fonctionnement d'une pompe péristaltique agissant sur la paroi souple de (E7).

Selon d'autres versions encore du dispositif pour la mise en oeuvre du procédé décrit dans la présente invention, la vitesse de déplacement de l'échantillon ou du principe actif peut être continue ou discontinue. La force motrice nécessaire à de tels déplacements peut être de différente nature: fluide sous pression, déplacement d'un système magnétique, capillarité passive, gradient thermique, pompe péristaltique agissant sur la paroi d'un capillaire souple, différence de pression entre le fluide (gaz par exemple) en amont de l'échantillon et le fluide en aval de l'échantillon (cette différence de pression étant créée par un système mécanique agissant localement), ou une combinaison des différentes possibilités précédentes.

Certains des capillaires (figure 5) de la barrette en question (figure 1) sont équipés de moyens destinés à permettre ou à empêcher le passage d'un fluide d'une enceinte à l'autre. Ces moyens sont destinés à permettre ou à empêcher le passage de l'échantillon, d'au moins un gaz ou d'au moins un principe actif à un instant donné dans au moins un capillaire précis afin d'assurer le bon fonctionnement du traitement. Pour ce faire (figure 2 à 4), la plaque (2) peut avantageusement être souple et porter des sillons (7) sur l'une de ses faces (figure 2). Le tracé des sillons a été établi pour satisfaire à un schéma fonctionnel précis. Le contact intime, par thermosoudage ou par collage (figure 3), des plaques (1) et (2) permet de délimiter des capillaires issus des sillons (7).La structure souple de la plaque (2) permet à un jeu de cames (9) extérieur à la barrette de venir écraser par intermittence les protubérances (6) des sillons (7). Ceci a pour fonction d'empêcher le passage d'un fluide dans le capillaire concerné ). Le jeu de trois cames (9) solidaire d'un support unique (8) montré sur la figure 3, permet d'écraser, !es trois capillaires simultanément, et donc d'empêcher la circulation d'un fluide dans la zone d'écrasement. L'ensemble des plaques (1) et (2) forme un réseau de capillaires bien défini, sur lequel sont connectés les enceintes (El), (E2), (E3), (E4), (E5), (E6) et (E7), et le tuyau souple (4).Les connexions (figure 4) avec les éléments enceintes (E) sont assurées par une perforation (10) dans la plaque (1), sur laquelle vient s'emboiter un manchon (11) portant un tuyau (12). La connexion avec le tuyau souple (4) est assurée par un système parfaitement semblable. Une vanne (X) (figure 5), correspondant à une came extérieure du type de celles précitées, peut être, soit en position ouverte (X=1) et permettre la libre circulation d'un fluide à son niveau, soit en position fermée (X=0) et empêcher la circulation d'un fluide à son niveau.

L'échantillon biologique brut, sous forme liquide, est introduit dans l'enceinte (E4) où il est mélangé à des principes actifs qui permettront de rendre accessible I'ADN viral. Après mélange, les concentrations sont les suivantes: 25 mM acétate de sodium pH 6,5 ; 2,5 mM EDTA ; 0,5 % SDS; 2,5 mg/ml protéinase K. L'ensemble des vannes (figure 5) étant dans la configuration [X1=0, X2=0, X3=1, X4=0, X5=0, X6=0] (figure 6),
I'échantillon se déplace vers (E7) en traversant les connexions (a16) et (a18). A l'intérieur de l'enceinte (E7), l'échantillon est porté à 700C pendant 15 minutes. L'ensemble des vannes étant dans la configuration [Xi =0, X2=0, X3=1, X4=0, X5=0, X6=0], l'échantillon retourne en (E6) en passant par (au8) et (a16).L'ensemble des vannes étant dans la configuration [X1=0, X2=0, X3=1, X4=0, X5=0, X6=0], I'échantillon circule de (E6) vers (E2) en passant par (a15) et (a5). En (E2), l'échantillon traverse une colonne échangeuse d'ions qui retient spécifiquement les acides nucléiques. L'éluat non retenu sur la colonne circule de (E2) à (E4) en passant par (a3) et (a9). Du fait de la configuration spatiale des connexions (a9) et (a10), lléluat est bloqué dans (E4). L'ensemble des vannes étant dans la configuration [X1=1, X2=1, X3=0, X4=0, X5=1, X6=0] (figure 7), le tampon d'élution contenu dans (El) est amené dans (E2) où il traverse la colonne échangeuse d'ions et décroche les acides nucléiques.L'échantillon liquide ainsi formé par cette élution est dilué puis il se déplace de (E2) vers (E5) en passant par (a4) et (a12). Du fait de la configuration spatiale des connexions (ail) et (a12), I'échantillon est bloqué dans (E5) où il est mélangé avec les principes actifs nécessaires à la réaction d'amplification par PCR.Après mélange les concentrations sont les suivantes: 200ru désoxyadénosine5'triphosphate; 200M désoxythymidine- S'triphosphate; 200,ut désoxyguanosine-5'triphosphate; 200C1M désoxycytidine- 5'triphosphate; 250 nM de chaque amorce oligonucléotidique; 10mM Tris-HCI ,pH 8,4; 1,5mM chlorure de magnésium; 100,ug/ml gélatine et lunité pour 50ffi1 dtADN polymérase thermorésistante (Taq polymérase par exemple).

L'ensemble des vannes étant dans la configuration [X1=0, X2=0, X3=0,
X4=0, X5=1, X6=1] (figure 8), I'échantillon circule de (E5) vers (E7), en passant par (a14) et (a18), où il subit le traitement thermique nécessaire à l'étape d'amplification par PCR. Des moyens de chauffage et de refroidissement extérieurs à la barrette permettent de soumettre l'échantillon contenu dans (E7) à 30 cycles thermiques successifs définis comme suit: 1 cycle = 1 minute à 95"C, puis 1 minute à 50 "C, puis 1 minute à 72 "C. L'ensemble des vannes étant dans la configuration [X1=0, X2=0, X3=0, X4=0, X5=1, X6=1], I'échantillon se déplace de (E7) vers (E8) en passant par (a19) et (a21).A l'intérieur de l'enceinte (E8) équipée de moyens de chauffage extérieurs, I'échantillon est mis en contact avec une sonde oligonucléotidique fixée sur un support solide et les séquences spécifiques amplifiées sont sélectivement retenues en soumettant (E8) à 60 "C. L'éluat contenant des séquences non spécifiques poursuit sa migration vers (E4), en passant par (a20), (a17) et (a10), où il est bloqué du fait de la configuration spatiale des connexions (a10) et (ail). L'ensemble des vannes étant dans la configuration [X1=0,
X2=0, X3=0, X4=1, X5=0, X6=I] (figure 9), le tampon contenu dans (E3) est amené dans (E8) où il est mis en contact avec le support retenant les séquences spécifiques d'ADN à détecter.L'enceinte (E8) est alors soumise à une température autorisant la déhybridation entre la séquence sonde supportée et la séquence amplifiée à détecter. Cette dernière est donc remise en solution et sa présence directement détectée à l'intérieur de (E8) grâce à un détecteur centré sur l'axe de la fenêtre (3). Dans une configuration des vannes identique à celle précédemment citée et après son analyse par le détecteur, I'échantillon poursuit sa migration vers (E4) où il est bloqué du fait de la configuration de (a10) et de (a8). (E4) est une enceinte piège destinée à accumuler les produits extraits à partir de l'échantillon et les principes actifs déjà utilisés. (E4) possède 4 connexions, (a8), (a9), (a10) et (ail), permettant la libre circulation d'un gaz entre deux quelconques de ces connexions. Sa structure compartimentée permet cependant de récolter l'échantillon amplifié et analysé dans un élément non souillé par d'autres liquides issus du traitement. L'échantillon amplifié peut donc être utilisé ultérieurement par simple prélèvement dans (E4).

Plusieurs barrettes peuvent être regroupées pour former une cartouche (figure 10) qui est structurée en 4 parties distinctes : (C1), (C2), (C3) et (C4). La partie (Cl) contient les enceintes (ex), (E2), (E3), (E4), (ES) et (E6). La partie (C2) est une structure de jonction souple entre (C1) et (C3). La partie (C3) contient l'enceinte (E7) et la partie (C4) contient l'enceinte (E8).

REFERENCES CITEES

Claims (10)

REVENDICATIONS

1/ Procédé pour amplifier le nombre d'au moins une séquence définie d'acide nucléique ou de sa séquence complémentaire, ci-après nommées séquences cibles, dans un échantillon biologique, caractérisé par le fait, d'une part qu'il comporte un apport de principes actifs sur le dit échantillon et au moins une étape préliminaire, destinée à augmenter l'accessibilité des acides nucléiques présents dans l'échantillon, suivie d'une étape d'amplification, d'autre part que le dit échantillon ainsi que les principes actifs se trouvent confinés à l'intérieur d'un espace hermétiquement clos durant toute la durée de réalisation du procédé.

2/ Procédé selon la revendication 1, caractérisé par le fait que l'échantillonnage se fait directement dans le dit espace hermétiquement clos.

3/ Procédé selon l'une des revendications 1 et 2, caractérisé par le fait qu'il permet d'effectuer un test complet de diagnostic biologique comprenant, d'une part une étape préliminaire permettant d'augmenter l'accessibilité de l'ADN et de l'ARN à des molécules contenues dans l'échantillon initial et à au moins un principe actif, comme des enzymes de polymérisation de l'ADN et de L'ART et des séquences d'ADN et d'ARN partiellement ou totalement complémentaires, d'autre part au moins une étape supplémentaire subséquente à l'étape d'amplification destinée à mettre en évidence la présence éventuelle dans l'échantillon de tout ou partie d'au moins une séquence cible d'acide désoxyribonucléique (ADN) ou d'acide ribonucléique (ARN) dont le nombre s'est accru au cours de l'étape d'amplification.

4/ Procédé selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé par le fait que l'étape d'amplification utilise, d'une part l'activité d'une ADN polymérase ou d'une ARN polymérase responsable de la synthèse des séquences d'ADN ou d'ARN amplifiées, d'autre part, soit au moins une séquence d'ADN ou d'A RN reconnue comme amorce par l'enzyme précitée et partiellement ou totalement complémentaire d'une partie de séquence cible à amplifier spécifiquement, soit une séquence promotrice parfaitement définie reconnue par l'enzyme et appartenant à la séquence cible à amplifier.

5/ Procédé selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisé par le fait qu'au moins une étape supplémentaire, située avant ou après l'étape d'amplification, utilise au moins une séquence sonde d'ADN ou d'ARN, modifiée ou non, qui dans des conditions physico-chimiques précises s'hybride spécifiquement par complémentarité entre les bases avec au moins une séquence cible, et qui est présente dans l'échantillon sous forme libre ou supportée.

6/ Procédé selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisé par le fait, d'une part que l'étape d'amplification utilise la technique de réaction en chaine de la polymérase (PCR) pour augmenter spécifiquement le nombre de molécules d'une séquence cible définie avec une amorce oligonucléotidique modifiée qui porte une molécule pouvant émettre un signal mesurable, d'autre part que après l'amplification l'échantillon soit mis en contact avec une sonde d'ADN supportée au moins partiellement complémentaire de la séquence cible amplifiée et que la présence de la dite séquence cible amplifiée spécifiquement retenue sur le dit support est évaluée à l'aide de moyens extérieurs à la barrette permettant de détecter de manière quantitative la molécule émettrice d'un signal portée par les séquences amplifiées.

7/ Dispositif pour la mise en oeuvre du procédé selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisé par le fait qu'il comporte, d'une part au moins une enceinte renfermant des principes actifs nécessaires pour l'étape préliminaire destinée à augmenter l'accessibilité des acides nucléiques, d'autre part au moins une enceinte renfermant les principes actifs nécessaires pour l'étape d'amplification, et que les enceintes sont reliées hermétiquement l'une à l'autre de manière à constituer un ensemble, ci-après nommé barrette, délimitant un espace clos, des moyens étant prévus pour faire circuler et pour réguler thermiquement l'échantillon et les principes actifs.

8/ Dispositif selon la revendication 7, caractérisé par le fait que l'ensemble défini par l'espace hermétiquement clos et les principes actifs qu'il contient est à usage unique, c'est à dire jetable après le traitement d'un seul échantillon biologique.

9/ Dispositif selon l'une des revendications 7 et 8, caractérisé par le fait, d'une part que les moyens assurant partiellement ou totalement le déplacement de l'échantillon et des principes actifs dans la barrette sont constitués d'une pompe péristaltique agissant sur la paroi souple d'un capillaire appartenant à la barrette, d'autre part que les liaisons entre les différentes enceintes sont des capillaires équipés de moyens destinés à permettre ou à empêcher le passage d'un fluide à un instant donné dans au moins un capillaire précis afin d'assurer le bon déroulement du traitement et que les dits moyens sont constitués d'un élément rigide possédant au moins deux positions dans l'espace, tel que une position dite fermée permette de comprimer le capillaire souple en cet endroit afin d'empêcher la circulation d'un fluide, et tel que l'autre position dite ouverte n'ait pas cet effet de compression et autorise le passage d'un fluide en cet endroit du capillaire.

10/ Dispositif selon l'une des revendications 7 à 9, caractérisé par le fait que plusieurs barrettes sont regroupées pour former une cartouche permettant de traiter simultanément plusieurs échantillons avec des moyens communs pour assurer la régulation thermique, le déplacement et la circulation sélective des échantillons et des principes actifs.