FR2501199A1 - Nouveaux polypeptides, leur preparation et leur application comme medicaments - Google Patents

Abstract

L'INVENTION CONCERNE LES POLYPEPTIDES DE FORMULE: (CF DESSIN DANS BOPI) DANS LAQUELLE ACYL REPRESENTE LE RESTE ACYLE D'UN ACIDE MINERAL OU ORGANIQUE, A REPRESENTE L'HYDROGENE OU UN GROUPE ALKYLE, N-CH(Z)-CO- ET E REPRESENTE LES RESTES D'A-AMINO NATURELS OU DE (D)-AMINO-ACIDES CORRESPONDANTS, C REPRESENTE UN RESTE -TRP- OU -(D)TRP-, F REPRESENTE UN GROUPE TERMINAL ET Y ET Y REPRESENTENT CHACUN L'HYDROGENE OU FORMENT ENSEMBLE UNE LIAISON DIRECTE. CES COMPOSES PEUVENT ETRE UTILISES EN THERAPEUTIQUE COMME PRINCIPES ACTIFS DE MEDICAMENTS.

Description

La présente invention a pour objet de nouveaux

polypeptides, leur préparation et leur application en thé-

rapeutique, à titre de principes actifs de médicaments.

L'invention concerne plus particulièrement les polypeptides répondant à la formule I

A Z CH2-S-Y1 Y2-S-CH2

Ac l I (I Acyl-N-CH-CO-NH-CH-CO-B-C-D-E-NH-CH-F (

1 2 3 4 5 6 7

10. dans laquelle "Acyl" signifie le reste acyle d'un acide organique ou minéral, A signifie l'hydrogène ou un groupe alkyle en Cl-C3,

%N-CH(Z)-CO- représente a) un reste (L)- ou (D)-phénylala-

nine éventuellement substitués sur le noyau par de l'halogène, NO2, NH2, OH, alkyle en Cl-C3 et/ ou alcoxy en C1-C3, ou

b) le reste d'un a-amino-acide na-

turel autre que défini sous a),

ou d'un (D)-amino-acide corres-

pondant,

Z, dans la formule)N-CH.(Z)-CO-, signifiant la par-

tie restante du reste a) ou b), B signifie -Phe- éventuellement substitué sur le noyau par de l'halogène, NO2, NH2, OH, alkyle en Ci-C3 et/ou alcoxy en C -C,

C signifie -Trp- ou (D)-Trp, éventuellement "-N-mé-

thylé et éventuellement substitué sur le noyau ben-

zénique par de l'halogène, NO2, NH2, OH, alkyle en C1-C3 et/ou alcoxy en C -C3

D signifie -Lys- éventuellement a-N-méthylé et éven-

tuellement E-N-alkylé par un groupe alkyle en C 1-C3, E représente le reste d'un a-amino-acide naturel ou d'un (D)-amino-acide correspondant, ce reste pouvant être éventuellement a-N-méthyié, F signifie un reste de formule -COOR1, -CH20R2, o-/ 3%' -5 o -CO-N -O- X R4 o R1 signifie l'hydrogène ou un groupe alkyle

en C -C, -

R2 signifie l'hydrogène ou le reste d'un ester

physiologiquement hydrolysable et physiolo-

giquement acceptable,

R3 signifie l'hydrogène, un groupe alkyle en -

C1-C3, un groupe phényle ou un groupe phényl-

alkyle en C7-C1, R4 signifie l'hydrogène, un groupe alkyle en

C1-C3 ou bien, lorsque R3 signifie l'hydro-

gène ou un groupe méthyle, également un reste de formule -CH(R5)-X, R5 signifie l'hydrogène, un reste de formule

-(CH2) 2-OH ou -(CH2)3-OH ou la partie res-

tante d'un a-amino-acide naturel rattachée à l'atome de carbone a, et X représente un reste de formule -COOR1,-CH2OR2

R

ou -CO-N 6 o

\Rv1 -

R-7 R1 et R2 ont les significations déjà données, R6 signifie l'hydrogène ou un groupe alkyle en C 1-C3, et R7 signifie l'hydrogène, un groupe alkyle en

Cl-C3, un groupe phényle ou un groupe phé-

nylalkyle en C7-C10, le reste -CH(R5)-X ayant la configuration (D) ou (L), et Y1 et Y2 représentent l'hydrogène ou forment ensemble une liaison directe,

les restes en positions 2 et 7 ayant chacun, indé-

pendamment l'un de l'autre, la configuration (L) ou (D), avec lesconditions que:

i) les restes (L) et/ou (D)-cystéine soient situés uni-

quement aux positions 2 et 7, et ii) "Acyle" ne représente pas un reste \N-CH(Z)-C0- tel que défini ci-dessus, dans lequel. le groupe a-amino est non-substitué ou mono ou di-substitué par des groupes alkyle en Cl-C12,

ainsi que leurs sels et leurs complexes.

Par halogène on entend, dans la présente descrip-

tion, le fluor, le chlore et le brome. Selon la pratique

établie, les restes d'amino-acides désignés par les abré-

viations -Phe-, -Cys, etc...., ont la configuration (L),

sauf mention contraire.

Les restes acyle, représentés par "Acyl" dans la formule I, comprennent en particulier les restes acyle d'acides carboxyliques organiques, d'acides sulfoniques, d'acides sulfaminiques et de l'acide carbonique et ses dérivés. Les restes acyle appropriés sont par exemple les groupes

1. R CO- o R représente un groupe aliphatique, cyclo-

aliphatique, aromatique ou hétérocyclique, en

particulier un groupe alkyle en C1-C20, alcé-

nyle en C3-C20, alcynyle en C3-C20, phényle, naphtyle ou phénylalkyle en C7-C10; 2. RII S02- o RI signifie un groupe alkyle en C1-C, phényle ou phénylalkyle en C7-Cio; 3. RIII 0-CO- o RIII représente un groupe alkyle en Cl-Clo, ou un groupe phénylalkyle en C7-Clo; et

RIV RIV RIV

RT RT

4. N-CO-, N-C- ou N-S02-

y V R -Il VR

R R NH R

o IV ou RT Ysignifie l'hydrogène, un groupe alkyle en C1-C10o, phényle ou ph6nylalkyle en C7-Cloet RV signifie l'hydrogène ou un groupe alkyle

en C -C20.

i 2o0 Lorsque RI signifie un groupe aliphatique, celui-

ci peut être saturé ou insaturé, linéaire ou ramifié.

I. V

Lorsque les symboles R a R représentent des groupes alkyle, alcényle ou alcynyle, ceux-ci peuvent être linéaires ou ramifiés; il en est de même des restes alkyle des groupes

O10 phénylalkyle, lorsque RI à R signifient de tels groupes.

Les groupes mentionnés pour RI a Rê peuvent éventuellement porter d'autres substituants. Avantageusement, ces groupes

sont non substitués.

Dans les polypeptides de formule I, les signifi-

cations suivantes, prises isolément ou en combinaison, sont préférées: 5. "Acyl" représente un groupe RICO- ou RIISO2-, telsque définis sous 1. et 2. ci-dessus. "Acyle" représente

plus préférablement un groupe R CO-.

5.1. Lorsque "Acyl" représente un groupe RICO-, R signifie de préférence un groupe alkyle en Cl-C15, un groupe

phényle ou un groupe phénylalkyle en C7-C10, plus spé-

cialement un groupe alkyle en C1-C15.

5.2. Lorsque "Acyl" représente un groupe R SO2-, R signifie de préférence un groupe alkyle en Cl-C1o ou un groupe phényle éventuellement substitué par des groupes alkyle en C1-C3, en particulier un groupe phényle ou un groupe phényle mono ou disubstitué par

des groupes alkyle en C1-C3. RII signifie plus préfé-

rablement un groupe alkyle en Cl-Clo.

6. A signifie l'hydrogène ou un groupe méthyle, spéciale-

ment l'hydrogène.

7.1. Lorsque \N-CH(Z)-CO- a la signification donnée sous a),

il s'agit de préférence d'un reste (L) ou (D)-phényl-

alanine ou (L) ou (D)-tyrosine (Z signifiant un groupe benzyle ou p-OHbenzyle), plus préférablement un

reste (D)-phénylalanine.

7.2. Lorsque)N-CH(Z)-CO- a la signification donnée sous b),' le reste défini est de préférence lipophile. Les restes préférés b) sont en conséquence les restes dans lesquels Z signifie un groupe alkyle contenant 3,

de préférence 4, atomes de carbone ou plus, en parti-

culier un reste (L)- ou (D)- leucine ou (L)- ou (D)-

norleucine (Z signifiant respectivement un radical

isobutyle et n-butyle).

7.3. -N-CH(Z)-CO- a plus préférablement la signification

donnée sous a).

8. B signifie -Phe-.

9. C signifie -(D)Trp-

10. D signifie -Lys- ou -MeLys-, spécialement -Lys-.

11. E signifie le reste d'un a-amino-acide, spécialement -Thr-. 12. F signifie un reste 2, spécialement un

L _JJ1

\p

R 4

un reste -CO-N 3 \C(R5)-X (dans ce cas R3= H ou CH3). Dans le dernier cas, le reste -CH(R5)-X possède de préférence la configuration L.

12.1. R3 signifie de préférence l'hydrogène.

12.2. comme partie restante d'un amino-acide naturel fixée sur l'atome de carbone a, en l'occurence comme reste R5

appartenant à l'amino-acide de formule H2N-CH(R5)-

COOH, R5 signifie de préférence un groupe -CH20H, -CH(CH3)OH, isobutyle ou benzyle, ou bien un groupe -(CH2) 2-OH ou -(CH2)3-OH. Il signifie spécialement un groupe -CH2OH ou -CH(CH3)OH. R 12.3. X signifie de préférence un reste -CO-NX 6 ou -CH2-OR2, spécialement un reste -CH20R2 et R2 signifie de préférence l'hydrogène ou possède la signification : e1199 donnée ci-dessous sous 13. Plus préférablement, il

signifie l'hydrogène.

13. Comme reste d'un ester physiologiquement hydrolysable et physiologiquement acceptable, R2 est de préférence HCO, alkylcarbonyle en C2-C12, phénylalkylcarbonyle

en C8-C12 ou benzoyle.

14. Les restes situés aux positions 2 et 7 ont de pré-

férence la configuration L. 15. De préférence, Y1 et Y2 représentent ensemble une

liaison directe.

Un groupe particulièrement intéressant de poly-

peptides de formule I comprend ceux o "Acyl" représente un reste acyle comportant un fragment aliphatique (par exemple comme RI, RII, RIi ou RIV des groupes définis plus haut sous 1 à 4) ayant au moins 7 atomes de carbone, de préférence au moins 8 atomes de carbone, les composés de ce type, désignés par la suite polypeptides de type T, se signalant par une durée d'action plus prolongée lorsqu'ils sont administrés par voie souscutanée. Les polypeptides de type T préférés sont ceux dans lesquels "Acyl" signifie un groupe R -CO- ou R i-So2-, spécialement

I I2

un groupe RI-CO-, o R est un groupe alkyle en C7-C15, de préférence un groupe alkyle en C7-C10, spécialement un groupe alkyle en C8-C15, notamment un groupe alkyle

en C8-C10, et R I est un groupe alkyle en C7-C10, spéciale-

ment un groupe alkyle en C8-C10. Les polypeptides de

type T spécialement préférés sont ceux ayant les signifi-

cations mentionnées plus haut sous 6 à 15.

Les polypeptides de l'invention peuvent se pré-

senter sous forme de sels ou de complexes. Les sels d'addi-

tion d'acides peuvent être ceux dérivant par exemple d'acides organiques, d'acides polymères ou d'acides minéraux. De tels

sels d'addition d'acides comprennent par exemple les chor-

hydrates et les acétates. Par complexes, on entend des com-

posés de type connu, formés à partir des composés de formule I par addition de substances minérales, comme par exemple les sels minéraux ou les hydroxydes tels que les sels de calcium et de zinc, et/ou par addition de substances

organiques polymères.

5. L'invention comprend également un procédé de pré-

paration des composés de l'invention. Ces composés peuvent être préparés selon des méthodes généralement connues pour la préparation de composés de ce type. C'est ainsi par

exemple qu'on peut préparer les polypeptides de l'inven-

tion selon un procédé caractérisé en ce que a) on élimine le ou les groupes protecteurs présents dans un polypeptide protégé ayant la séquence indiquée dans la formule I, ou b) on relie ensemble,par une liaison amidedeux unités

peptidiques protégées ou non protégées contenant cha-

cune au moins un amino-acide ou un amino-alcool, les unités peptidiques se présentant de telle manière que l'on obtient un polypeptide protégé ou non protégé ayant la séquence indiquée dans la formule I et, si nécessaire, on effectue le procédé a), ou c) on transforme le groupe F d'un polypeptide protégé ou non protégé,ayant la séquence indiquée dans la formule I, en un autre groupe F et, si nécessaire, on effectue le procédé a), ou

dû on oxyde un polypeptide de formule I o Y1 et Y2 repré-

sentent l'hydrogène, ce qui donne un polypeptide de formule I o Y1 et Y2 forment ensemble une liaison directe, et -on.. récupère, sous forme libre ou sous forme de sel

ou de complexe, le polypeptide ainsi obtenu.

On opère selon les méthodes connues dans la chimie des polypeptides; on peut par exemple opérer de manière

analogue aux procédés décrits dans les exemples qui suivent.

Lorsque la préparation des produits de départ n'est pas spécialement décrite, ceux-ci sont connus ou peuvent être

préparés et purifiés selon des méthodes connues.

Les exemples suivants illustrent la présente invention sans aucunement en limiter la portée. Les

valeurs [a]20 sont indiquées non corrigées. Les abrévia-

D tions suivantes sont utilisées: AcOH - acide acétique AcOEt = acétate d'éthyie BOC = tert. -butoxycarbonyl BTFA = tris-trifluoroac tate de bcre DCCI = dicyclohexylcarbodiimide DMF = N,N-diméthylformamide HOBT = Nhydroxybenzotriazole Leu-ol = reste du leucinol MBzl Me MeOH NEt3 ONP Phe(pNO2) TFA THF Thr-ol z NH-

CH3-CH(CH3)-CH2-CH

3 CC3) 2

CH2OH = p-mthoxybenzyl = méthyl = méthanol = triéthylamine =- 4nitrophénoxy p-N02-phénylalanine - acide trifluoroacétique = tétrahydrofuranne = résidu du thréoninol NH-

CH3-CH(OH)-CH \

CH20H = benzyloxycarbonyl

Exemple 1

CH3- (CH2)8-CO-(D)Phe-Cys-Phe-(D)Trp-Lys-Thr-Cys-Thr-ol 3 C2) 8-C-<) PeCsPe

On dissout à O 7,1 g de CH3-(CH2)8-CO-(D)Phe-

Cys-(MBzl)-Phe-(D)Trp-Lys(Z)-Thr-Cys-(MBzl)-Thr-ol et 54 ml de thioanisol dans 120 ml de TFA. On refroidit la solution à -10 , on ajoute 92 ml d'environ 2 moles de BTFA dans le TFA et on agite la solution pendant 1 heure et demie entre -10 et -5 . Le mélange réactionnel obtenu est ensuite ajouté sous agitation à 400 ml de méthanol absolu refroidi à -70 . Apres 5 minutes, on agite avec un mélange de 20 ml d'acide chlorhydrique dans de l'éther

(environ 5N) dans 9 litres d'éther anhydre.

On filtre le précipité qui s'est formé, on le lave à l'éther et on le dissout immédiatement dans 16 litres d'un mélange 7:3 de dioxanne et d'eau. On ajoute, sous agitation, de l'ammoniaque 4N jusqu'à un pH de 7-7, 5 et on agite la solution dans un récipient ouvert jusqu'à preuvenégative des groupes SH (par exemple selon la méthode

de Ellmann).

On règle le pH à environ 3-4 par addition d'acide chlorhydrique dilué, on concentre la solution sous pression réduite et on la lyophilise. Le produit brut est purifié par chromatographie sur gel de silice en utilisant, comme éluant, un mélange de chloroforme, de méthanol,

d'acide acétique et d'eau. On combine les fractions conte-

nant le produit désiré, on dilue avec de l'eau, on concen-

tre sous pression réduite et on lyophilise. On obtient ainsi le composé du titre à l'état pur; [a]D = -43'7

(c = 0,92 dans AcOH à 95%).

Le produit de départ peut être préparé de la manière suivante: a) BOCCys(MBzl)-Thr-ol A une solution de 6,3 g de BOc-Cys(MBzl)-OH dans 50 ml

de THF, on ajoute sous agitation 2,1 ml de N-méthylmor-

pholine puis, goutte à goutte et à -15 , 2,4 ml de chloroformiate d'isobutyle. Après avoir agité pendant

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lO minutes à -15 , on ajoute une solution refroidie

au préalable à -10 et constituée de 3,3 g de chlor-

hydrate de H-Thr-ol et de 4,1 ml de N-méthylmorpholine dans 30 ml de DMF. On agite le mélange réactionnel pendant 2 heures à O' puis pendant 2 heures à la tempé- rature ambiante. On ajoute 50 ml d'une solution à 10% de bicarbonate de potassium et on concentre le tout sous pression réduite. Après avoir dilué avec AcOEt, on lave à trois reprises avec de l'acide citrique 2N, à trois reprises avec une solution de bicarbonate de potassium et une fois avec une solution de chlorure de sodium, on sèche la phase organique sur sulfate de sodium et on l'évapore sous pression réduite, ce qui donne le composé du titre. [a] -31 (c = 1,3 dans D

le DMF).

b) Trifluoroacétate de H-Cys(MBzl)-Thr-ol On dissout 7,1 g de BOCCys(MBzl)-Thr-ol et 5 ml de thioanisol dans 25 ml de chlorure de méthylène, on ajoute la solution à 50 ml de TFA et on laisse reposer pendant 20 minutes à la température ambiante. On dilue ensuite le mélange réactionnel avec environ 1,5 litre d'éther, on filtre le précipité qui s'est formé et on le sèche, ce qui donne le composé du titre. F = 1520;

[C]LO= 8,3 (c = 1,1 dans AcOH à 95%).

c) BOC-Thr-Cys(MBzl)-Thr--ol

A une solution refroidie au préalable à -25 et consti-

tuée de 9,7 g de BOC-Thr-OH et de 9,4 ml de N-méthyl-

morpholine dans 50 ml de THF, on ajoute goutte à goutte ,9 ml de chloroformiate d'isobutyle. On agite la solu-

tion pendant 5 minutes à -15' et on ajoute une solu-

tion refroidie au préalable à -10 et constituée de g de trifluoroacétate de H-Cys(MBzl)-Thr-ol et de 9,8 ml de N-méthylmorpholine dans 50 ml de THF. On agite le mélange réactionnel pendant 2 heures à 0 , puis pendant 2 heures à la température ambiante. On ajoute 20 ml d'une solution à l0%'de bicarbonate de

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l potassium et on concentre le mélange sous pression réduite. On dilue ensuite avec de l'acétate d'éthyle et on lave successivement avec de l'acide citrique 2N, une solution à 10% de bicarbonate de potassium et avec une solution à 30% de chlorure de sodium. On sèche la phase d'acétate d'éthyle sur sulfate de sodium, on l'évapore sous pression réduite et on recristallise le résidu d'évaporation dans un mélange de méthanol, d'acétate d'éthyle et d'hexane. On filtre le produit, on le lave à l'éther et on le sèche, ce qui donne le _ composé du titre. F = 117 ; [a]D 23 (c = 1 dans

le DMF).

d) Trifluoroacétate de H-Thr-Cys (MBzl)-Thr-ol

A une solution refroidie au préalable à 0 et consti-

tuée de 16 g de BOC-Thr-Cys(MBzl)-Thr-ol et de 17 ml de thioanisol dans 100 ml de chlorure de méthylène, on ajoute 150 ml de TFA. On laisse reposer le tout pendant 20 minutes à la température ambiante et on verse de l'éther en remuant. On filtre le précipité qui s'est formé, on le lave à l'éther et on le sèche, ce qui donne le composé du titre. F = 72 ; ["] D= +0,60 D

(c = 1 dans AcOH à 95%).

e) BOC-(D)Trp-Lys(Z)-OMe A 23,3 g de chlorhydrate de H-Lys(Z)-OMe dans 300 ml de DMF, on ajoute 9,8 ml de triéthylamine, 11,8 g de HOBT et 21,3 g de BOC-(D)Trp-OH et on refroidit la solution à -15 . On ajoute ensuite 15,6 g de DCCI dans 50 ml

de DMF et on agite le mélange réactionnel pendant en-

viron 16 heures à O puis pendant 2 heures à la tempé-

rature ambiante. On dilue le mélange réactionnel avec un mélange d'acétate d'éthyle et d'éther et on filtre la dicyclohexylurée. On lave le filtrat avec de l'acide citrique 2N, avec de l'eau, avec une solution à 10% de bicarbonate de potassium et avec une solution à 30% de chlorure de sodium. La phase organique est séchée sur sulfate de sodium et concentrée fortement sous pression réduite. On fait cristalliser le produit par addition d'un mélange d'éther et d'hexane. On filtre le précipité, on le lave avec un mélange d'éther et d'hexane et on le sèche, ce qui donne le composé du À 20 titre. F = 140 ; []D2 -12,6 (c = dans le DYF) f) Chlorhydrate de H-(D)TriLys (Z)-OMe On refroidit à 0 30 g de BOC(D)Tr-Lys(Z)-OMe dans ml de chlorure de méthylène et on ajoute 150 ml de

TFA. On agite le tout pendant 40 minutes à la tempéra-

ture ambiante et on ajoute ensuite 30 ml d'une solu-

tion d'acide chlorhydrique dans dé l'éther (environ 5N), dans 4 litres d'éther. Apres avoir bien remué, on filtre le précipité qui s'est formé, on le lave à l'éther et on le sèche, ce qui donne le composé du titre. F = 101 ;

[a] 20_ _44 (c = 1 dans AcOR à 95%).

g) BOC-Phe-(D)Trp-Lys(Z)-OMe A 35 g de chlorhydrate de H-(D)Trp-Lys(Z)OMe dans 350 ml de DMF, on ajoute 9,5 ml de triéthylamine, 13 g de HOBT et 17 g de BOC-Phe-OH. On refroidit la solution à -20

et on ajoute 14,5 g de DCCI dissous dans 50 ml de DMF.

On agite le mélange réactionnel pendant environ 18 heures à 0 , puis pendant 1 jour à la température ambiante. On filtre le précipité de dicyclohexylurée, on concentre le filtrat, on le dilue avec du méthanol

et on ajoute de l'eau jusqu'à ce que le produit préci-

pite. On filtre le produit, on le lave avec un mélange 4:1 de méthanol et d'eau et on le sèche. On obtient ainsi le composé du titre. F = 180o; [a] 20= +1,1 D

(c = 1 dans le DMF).

h) BOC-Phe-(D)Tri-Lys(Z)-OH A une suspension de 16 g de BOC-Phe-(D)TrpLys(Z)-OMe dans un mélange 8:2 de dioxanne et d'eau, on ajoute 26 ml de NaOH 1N et on agite le mélange réactionnel pendant 1 heure et demie à la température ambiante. La

solution obtenue est diluée à environ 500 ml par addi-

tion d'eau et concentrée ensuite sous pression réduite.

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On règle le pH à 1,5-2 par addition sous agitation d'acide chlorhydrique 1N, on filtre le précipité qui

s'est formé, on le lave avec de l'eau jusqu'à neutrali-

té et on le sèche. On obtient ainsi le composé du titre. Il se décompose à 85-90 ; [a] = +7,6 (c = DT t

1 dans le DMF).

i) BOC-Phe-(D)Tr-Lys(Z) -Thr-Cys(MBzl)Thr-ol 2,5 ml de triéthylamine, 11, 2 g de BOC-Phe-(D)Trp-Lys

(Z)-OH et 4 g de HOBT sont ajoutés à 9 g de trifluoro-

acétate de H-Thr-Cys(MBzl)-Thr-ol dans 100 ml de DMF.

A cette solution on ajoute à -20 3,7 g de DCCI dans ml de DMF et on agite le tout pendant environ 18

heures à 0 et pendant 2 heures à la température am-

biante. On filtre la dicyclohexylurée qui a précipité, on concentre le filtrat sous pression réduite, on le dilue avec du méthanol et on ajoute de l'eau jusqu'à ce que le produit précipite. On filtre le précipité, on le lave avec un mélange 4:1 de méthanol et d'eau et on le sèche, ce qui donne le composé du titre. F = 135 ;

20 14

[a20 _ 14 (c = 1 dans le DMF).

j) Chlorhydrate de H-Phe-(D)TrE-Lys(Z)-Thr-Cys (MBzl)-Thr-ol

On dissout à froid 13 g de EOC-Phe-(D)Trp-Lys(Z)-Thr-

Cys(MBzl)-Thr-ol dans 60 ml d'un mélange 15:1 de TFA et

d'eau et on laisse reposer la solution pendant 30 minu-

tes à la température ambiante. On agite le mélange réactionnel dans un mélange comprenant 3 litres d'éther et 20 ml d'acide chlorhydrique dans de l'éther (environ N), on filtre le précipité qui s'est formé, on le lave à l'éther et on le sèche. On obtient ainsi le composé du titre. Il se décompose à 110 ; [a]D20 30 =(c 1 D

dans le DMF).

k) BOC- (D)Phe-Cys (MBzl) g-OH A une solution de 4,83 g de H-Cys-(MBzl)OH dans 100 ml d'un mélange 7:3 de dioxanne et d'eau et 20 ml de NaOH 1N, on ajoute 7,73 g de BOC-(D)Phe-ONP et on agite le mélange réactionnel pendant 20 heures à la température

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ambiante. On dilue ensuite le mélange avec de l'eau et on élimine le dioxanne sous pression réduite. On lave la phase aqueuse avec de l'éther et on règle le pH à 2 par addition d'acide chlorhydrique. On extrait le produit qui a précipité avec un mélange d'acétate d'éthyle et d'éther, on lave la phase organique à l'eau, on la sèche sur sulfate de sodiur t on l'évapore sous pression réduite. On obtient ainsi le composé du

-16(=0,

titre sous forme d'une mousse La2 -17' (c = 0,9

dans le DMF).

1) Chlorhydrate de H-(D)Phe-Cvs (MBzl)'-OH On dissout 5 g de BOC-(D)PheCys(MBzl)-OH dans un mélange de 80 ml de TFA et de 10 ml d'eau et on laisse

reposer pendant 45 minutes à la température ambiante.

On dilue ensuite la solution avec de l'éther et on ajoute 20 ml d'acide chlorhydrique en solution dans de l'éther (environ 5N). On filtre le précipité qui s'est formé, on le lave à l'éther et on le sèche, ce qui donne le composé du titre. F = 189 [l20= -38,5

(c = 0,93 dans AcOH à 95%).

m) CH 3:(CH2) 8-CO-(D) Phe-Cys (MBzl)-OH A 10,0 g de chlorhydrate de H-(D) Phe- vs(MBzl)-OH dans ml de dioxanne, on ajoute 23,3 ml de NaOH iN. Tout en agitant, on ajoute ensuite goutte à goutte, à la température ambiante, 7 ml de chlorure de d6canoyle

sous addition simultanée de NaOH 1N de manière à main-

tenir le pH à 8 et on continue d'agiter pendant 20 heures à la température ambiante. On règle le pH du

mélange réactionnel à 2 par addition d'acide chlorhy-

drique 4N, on concentre sous pression réduite, on dilue

avec de l'eau et on extrait avec de l'acétate d'éthyle.

On lave la phase organique avec de l'eau, on la sèche sur sulfate de sodium et on l'évapore sous pression

réduite. On purifie le résidu d'évaporation par chroma-

tographie sur gel de silice en utilisant, comme éluant, un mélange de chlorure de méthylène et de méthanol, ce

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-93 qui donne le composé du titre. F = 124 ; [a]D D 19,3

(c = 2,6 dans le DMF).

n) CH3-(CH2)18-CO- (D)Pheys (Mzl) -Phe- (D)Tr.p-Lys(Z) -Thr-

Cys(MBz1) -Thr-ol 0,7 ml de N-méthylmorpholine est ajouté à une solu-

tion de 5,7 g de chlorhydrate H-Phe-(D)Trp-Lys(Z)-Thr-

Cys(MBzl)-Thr-ol, de 0,8 g de HOBT et de 2,7 g de -

CH3- (CH2) 8-CO-(D)Phe-Cys(MBzl)-OH dans 60 ml de DMF.

On refroidit la solution à -15 , on ajoute 1,20 g de

DCCI dans 10 ml de DMF et on agite le mélange réac-

tionnel pendant 70 heures entre O et 4 . On filtre la dicyclohexylurée qui a précipité, on dilue le filtrat avec du méthanol et on ajoute de l'eau sous agitation jusqu'à ce que le produit précipite. Après environ 2 heures on filtre, on lave le résidu avec un mélange 2:1 de méthanol et d'eau et on le sèche sous pression réduite, ce qui donne le composé du titre. [a]D= =20,5

(c = 0,8 dans le DMF).

Les composés suivants peuvent être prépares de manière analogue au procédé de l'exemple 1 (tous les composés sont sous forme d'acétate) (tableau voir page suivante) I1 ". Acyl- (D)-Phe-Cys-Phe- (D) -Trp-Lys- Thr-Cys-Thr-ol Exemple "Acyl" 20 dans AcOH à 95% _ _ 2 CHi3CO- 42,8 (c = 0,5) 3 CH3(CH2)4C0- -3518 (c = 0,53) 4 CH3(CH2)6CO- -34,0û (c = 0,40) CH3(CH2)7C0- -35,6 (c = 0,69) 6 CH3(CH2)10C0- -36,5 (c = 0,50) 7 CH3(CH2)12C0- -27,3 (c = 0,50) j 8 t. C4H9-CO- -24, 0 (c = 1, 0) 9 - 33, 0 (c = 1,0) CH3-\ 2- 14,3 (c = 1,O) l1 C2H5NH-CO- -32,2' (c = 0,46) 12 D(+)-Biotinyl -16,9 (c = 1,0) 13 CH3(CH2)9S02- 31,0 (c = 0,5)

*2501199!

I I-- -L- -C -

Acyl-A-Cys-B-(D)Trp-Lys-Th r-Cys-F -

Exemple 20

En procédant de manière analogue à celle décrite aux exemples 1 à 19, mais sans effectuer l'étape finale d'oxydation, on obtient les polypeptides linéaires

correspondant à chacun des polypeptides cycliques men-

tionnés, c'est-à-dire les polypeptides o les restes -Cys-

situés en position 2 et 7 ne sont pas liés entre eux. C'est ainsi qu'en procédant selon l'exemple 1 mais sans effectuer l'étape finale d'oxydation, on obtient le polypeptide linéaire de formule [acetate] CH3(CH2)8-Co-(D)Phe-Cys-Phe-(D)Trp-Lys-Thr-Cys-Thr-o

[cc] dans AcOH à 95% = -33,8 ( c = 0,42).

D Exempl ei "IAcyl" A B F 14 CH3(CH2)4CO- D)Phe(pN -Phe- -Thr-ol CH3(CH2)1oC0- -(D)Nle- -Phe- -Thr-ol 16 CH3(CH2)6C0- -(D)Phe- Phe(pNO2)Thr-ol 17 CH3(CH2)12CO- -(D)Phe- -Phe- -(D)Thr-NH2 18 CH3(CH2)12CO- -(D) Phe- -Phe- -Phe-OMe 19 CH3(CH2)12C0- -(D)Phe- -Phe- -Leu-ol

2501199 1

Les polypeptides de formule 1, ainsi que leurs sels et leurs complexes pharmaceutiquemient acceptables,

n'ont pas été décrits jusqu'à présent dans la littérature.

Dans les essais effectués sur les animaux de laboratoire, ils se signalent par d'intéressantes propriétés pharmaco- logiques et peuvent, par consequent, être utilisés comme médicaments. En particulier, les polypeptides de l'invention exercent une action inhibitrice sur la sécrétion de l'hormone somatotrope (hormone de croissance), comme cela a été mis en évidence, par exemple, par l'abaissement des taux sériques d'hormone somatotrope chez le rat. L'essai

est effectué avec des rats mâles sous narcose au nembutal.

On administre la substance â essayer par voie sous-cutanée à différentes doses variant de façon logarithmique, en

employant au moins 4 rats par dose. Une heure apres admi-

nistration de la substance à essayer, on décapite les animaux, on recueille le sang et on détermine le taux

sérique d'hormone somatotrope par dosage radio-immunologi-

que. Dans cet essai, les polypeptides de l'invention pro-

voquent une baisse du taux sérique d'hormone somato-

trope lorsqu'ils sont administrés par voie sous-cutanée

à une dose d'environ 0,1 à 1000 pg/kg.

On peut adapter l'essai ci-dessus pour déterminer l'efficacité descomposés de l'invention sur des périodes de temps prolongées, par exemple en décapitant les animaux 6 ou 18 heures après administration de la substance à

essayer. Les polypeptides de type T tels que définis ci-

dessus présentent un intérêt particulier du fait qu'ils sont actifs, dans l'essai décrit ci-dessus, sur une période de temps prolongée allant jusqu'à 18 heures après

administration aux doses indiquées.

Grâce à cette propriété, les polypeptides de l'invention, leurs sels et leurs complexes peuvent être utilisés en thérapeutique pour le traitement de troubles provenant d'un excès de sécrétion d'hormone somatotrope, ou associés à cet excès de sécrétion, par exemple pour le traitement du diabète sucré et de l'angiopathie ainsi

que de l'acromégalie.

Les polypeptides de l'invention, leurs sels et complexes inhibent également la sécrétion gastrique et pancréatique, comme cela a été mis en évidence dans des essais standard effectués sur des animaux de laboratoire, par exemple selon la méthode décrite par W. Doepfner et

coll. dans Triangle (1977), 16, (2) 105 et par S.J.

Konturek et coll. dans Scand. J. Gastroent. (1971) 6, 423

également à des doses comprises entre 0,1 et 1000 pg/kg.

Grâce à cette propriété, les composés de formule I, leurs sels et complexes peuvent être utilisés

en thérapeutique pour le traitement des troubles gastro-

intestinaux, comme par exemple l'ulcère gastrique, l'hémorragie gastrointestinale et la pancréatite aiguë Pour les indications citées, la dose quotidienne à administrer est comprise entre environ 0,01 mg et environ 100 mg de polypeptide, avantageusement administrée en doses fractionnées 2 à 4 fois par jour sous forme de doses unitaires, ou sous forme retard. Les doses unitaires appropriées contiennent entre environ 0,0025 mg et environ mg de polypeptide selon l'invention, ou une quantité équivalente de l'un de ses sels ou complexes acceptables du point de vue pharmaceutique, en association avec un

diluant ou excipient solide ou liquide.

L'invention concerne également 1) l'application en thérapeutique des polypeptides selon l'invention et de leurs sels et complexes acceptables du point de vue pharmaceutique comme médicaments (par exemple comme inhibiteurs de la sécrétion de l'hormone somatotrope pour le traitement de troubles dont l'étiologie comprend ou est associée à un excès de sécrétion de l'hormone somatotrope comme le diabète

sucré, l'angiopathie et l'acromégalie,ou comme inhibi-

teurs de la sécrétion gastrique ou pancréatique pour le traitement de troubles gastro-intestinaux tels que l'ulcère gastrique, l'hémorragie gastro-intestinale et la pancréatite aigué),

2) un médicament contenant, coame principe actif, un poly-

peptide selon l'invention ou l'un de ses sels ou complexes acceptables du point de vrue phemaceutique, et

3) les compositions pharmaceutiques comprenant un poly-

peptide selon l'invention ou l'un de ses sels ou com-.

plexes acceptables du point de vue pharmaceutique, en association avec un diluant ou un excipient acceptables

du point de vue pharmaceutique.

Claims (11)

REVENDICATIONS

1.- Les polypeptides répondant à la formule I

A Z CH2-S-Y1 Y2-S-CH2

Acyl-N-CH-CO-NH-CH-CO-B-C-D-E-NH-CH-F (I)

1 2 3 4 5 6 7

dans laquelle "Acyl" signifie le reste acyle d'un acide organique ou minéral, A signifie l'hydrogène ou un groupe alkyle en C1-C3,

N-CH(Z)-CO- représente a) un reste (L)- ou (D)-phénylala-

nine éventuellement substitués sur le noyau par de l'halogène, NO2, NH2, OH, alkyle en C 1-C3 et/ ou alcoxy en C1-C3, ou

b) le reste d'un a-amino-acide na-

turel autre que défini sous a),

ou d'un (D)-amino-acide corres-

pondant,

Z, dans la formule)N-CH(Z)-CO-, signifiant la par-

tie restante du reste a) ou b), B signifie -Phe- éventuellement substitué sur le noyau par de l'halogène, NO2, NH2, OH, alkyle en Cl-C3 et/ou alcoxy en C1-C3,

C signifie -Trp- ou (D)-Trp, éventuellement a-N-mé-

thylé et éventuellement substitué sur le noyau ben-

zénique par de l'halogène, NO2, NH2, OH, alkyle en C1-C3 et/ou alcoxy en C1-C3,

D signifie -Lys- éventuellement a-N-méthylé et éven-

tuellement -N-alkylé par un groupe alkyle en C1-C3, E représente le reste d'un a-amino-acide naturel ou d'un (D)-amino-acide correspondant, ce reste pouvant être éventuellement a--N-méthylé,

2501199 I-

F signifie un reste de formule -COOR1, -CH20R2, R3 / 3 -CO-N ou -CO-N X R4 o R1 signifie l'hydrogène ou un groupe alkyle en CI-C, R2 signifie l'hydrogène ou le reste d'un ester

physiologiquement hydrolysable et physiolo-

giquement acceptable, R3 signifie l'hydrogène, un groupe alkyle en

C1-C3, un groupe phényle ou un groupe phényl-

alkyle en C7-Clo, R signifie l'hydrogène, un groupe alkyle en

Ci-C3 ou bien, lorsque R3 signifie l'hydro-

gène ou un groupe méthyle, -.galement un reste de formule -CH(R5)-X, R5 signifie l'hydrogêne, un reste de formule

- (CH2) 2-OH ou - (CH2) 3-OH ou la partie res-

tante d'un a-amino-acide naturel rattachée i l'atome de carbone a, et X représente un reste de formule -COORl1,=CH2R2

21 R

ou -CO-N o6 R1 et R2 ont les significations déjà données, R6 signifie l'hydrogène ou un groupe alkyle en C1-C3, et R7 signifie l'hydrogène, un groupe alkyle en

C1-C3, un groupe phényle ou un groupe phé-

nylalkyle en C7-C10 le reste -CH(R5)-X ayant la configuration (D) ou (L), et Y1 et Y2 représentent l'hydrogène, ou forment ensemble une liaison directe,

les restes en positions 2 et 7 ayant chacun, indé-

pendamment l'un de l'autre, la configuration (L) ou (D), avec les conditions que:

i) les restes (L) et/ou (D)-cystéine soient situés uni-

quement aux positions 2 et 7, et ii) "Acyle" ne représente pas un reste \N-CH(Z)-C0- tel que défini ci-dessus, dans lequel le groupe a-amino est non-substitué ou mono ou di-substitué par des

groupes alkyle en C1-C12.

2.- Les polypeptides selon la revendication 1,

caractérisés en ce que "Acyl" signifie un groupe R ICo-

ou RII S02- dans lesquels R représente un groupe alipha-

tique, cycloaliphatique, aromatique ou hétérocyclique et RII représente un groupe alkyle en Cl-Cl, un groupe

phényle ou un groupe phénylalkyle en C7-C 1.

3.- Les polypeptides selon la revendication 2, caractérisés en ce que R1 représente un groupe alkyle en C1-C20, alcényle en C3-C20, alcynyle en C3C20,phényle,

naphtyle ou phénylalkyle en C7-C10.

4.- Les polypeptides selon les revendications 2

et 3, caractérisés en ce que RI représente un groupe alkyle

en C7-C15 et R un groupe alkyle en C7-Clo.

5.- Les polypeptides selon l'une quelconque des

revendications 2 à 4, caractérisés en ce que "Acyl"

signifie un groupe RCO-.

6.- Le polypeptide de formule

I. _. _

CH3 (CH2) 8-CO- (D) -Phe-Cys-Phe- (D) -Trp-Lys-Thr-Cys-Thr-ol 7.- Les polypeptides selon l'une quelconque des

revendications 1 à 6, caractérisés en ce qu'ils se pré-

sentent sous forme de sels ou de complexes.

8.- Un procédé de préparation des polypeptides

250'1199 '

spécifiés à la revendication 1, caractérisé en ce que a) on élimine le ou les groupes protecteurs présents dans un polypeptide protégé ayant la séquence indiquée dans la formule 1, ou b) on relie ensemblepar une. Ilaison amide rl" unités

peptidiques protégées ou non protégées contenant cha-

cune au moins un amino-acide ou un amino-alcool, Les unités peptidiques se présentant de telle manière que l'on obtient un polypeptide protégé ou non protégé ayant la séquence indiquée dans la formule I et, si nécessaire, on effectue le procédé a), ou c) on transforme le groupe F d'un polypeptide protégé ou non protégé,ayant la séquence indiquée dans la formule 1, en un autre groupe F et, si nécessaire, on effectue le procédé a), ou

d) on oxyde un polypeptide de formule I o Y1 et Y2 repré-

sentent l'hydrogène, ce qui donne un polypeptide de formule I o Y1 et Y2 forment ensemble une liaison directe, et on récupère, sous forme libre ou sous forme de sel

ou de complexe, le polypeptide ainsi obtenu.

9.- L'application en thérapeutique des polypep-

tides spécifiés à l'une quelconque des revendications 1

à 6, et de leurs sels et complexes acceptables du point de

vue pharmaceutique, comme médicaments.

10.- L'application des polypeptides et de leurs

sels et complexes acceptables du point de vue pharmaceu-

tique selon la revendication 8, pour le traitement des troubles dont l'étiologie comprend ou est associée à un excès de sécrétion de l'hormone somatotrope ou comme

inhibiteurs de la sécrétion gastrique ou pancréatique.

11.- Un médicament, caractérisé en ce qu'il contient,comme principe actif, un polypeptique spécifié

à l'une quelconque des revendications 1 à 6 ou un sel

ou un complexe acceptable du point de vue pharmaceutique

de-ce polypeptide.

12.- Une composition pharmaceutique, caractérisée en ce qu'elle contient un polypeptide spécifié à l'une

quelconque des revendications 1 à 6,ou un sel ou un -

complexe acceptable du point de vue pharmaceutique de ce polypeptide, en association avec des diluants ou

excipients acceptables du point de vue pharmaceutique.