FR2574553A1 - Methode pour l'evaluation de parametres cliniques par prelevement direct de substances biologiques et dispositif pour sa mise en oeuvre - Google Patents

Abstract

LA PRESENTE INVENTION CONCERNE UN DISPOSITIF DESTINE A L'EVALUATION DE PARAMETRES CLINIQUES PAR PRELEVEMENT DIRECT DE SUBSTANCES BIOLOGIQUES CONSTITUE D'UN SUPPORT SOLIDE 1 EN UN MATERIAU ET DE FORME ET TAILLE APPROPRIES, PORTANT FIXE SUR SA SURFACE UNE QUANTITE PREDETERMINEE D'UN ANTICORPS 3, DANS LE CAS OU LA SUBSTANCE A DETECTER EST UN ANTIGENE, ET D'UN ANTIGENE 4 DANS LE CAS OU LA SUBSTANCE A DETECTER EST UN ANTICORPS; AINSI QUE LA METHODE DE DIAGNOSTIC CORRESPONDANTE. LA SUBSTANCE BIOLOGIQUE, PRELEVEE COMME INDIQUE CI-DESSUS, FAIT ENSUITE L'OBJET D'UNE ANALYSE QUALITATIVE OU QUANTITATIVE SELON DES TECHNIQUES CLASSIQUES.

Description

Méthode pour l'évaluation de paramètres cliniques par prélèvement direct

de substances biologiques et dispositif pour sa mise en oeuvre La présente invention concerne une méthode de diagnostic, et un dispositif y afférant destinés à l'évaluation de paramètres cliniques, par

prélèvement direct de substances biologiques.

Le dispositif objet de l'invention est constitué d'un support solide (de nature, forme et taille appropriées) portant fixée sur sa surface, selon une technique adéquate, une quantité prédéterminée d'un antigène ou d'un anticorps ou, dans tous les cas, d'une substance capable d'interréaction

avec le composé à détecter dans lesdites substances biologiques.

La méthode de diagnostic objet de l'invention consiste à mettre en

contact ledit dispositif avec les tissus biologiques contenant les anti-

corps ou les antigènes à analyser. Le produit agglutiné, formé et fixé sur

le dispositif est ensuite marqué enzymatiquement par réaction avec un anti-

corps ou un antigène spécifique conjugé à une enzyme; après élimination des antigènes ou anticorps marqués non spécifiquement liés, par des lavages

(à l'eau par exemple), le dispositif est plongé dans une solution de détec-

tion appropriée contenant un substrat pour l'enzyme de marquage capable

de produire une réaction utile pour des mesures qualitatives et/ou quanti-

tatives.

La littérature existante énonce que l'évaluation de nombreux par-

mètres présentant un intérêt clinique, par l'analyse d'un liquide biologi-

que, nécessite le transfert d'une quantité mesurée avec précision dans un

récipient approprié dans lequel il sera soumis à incubation avec une quan-

tité prédéterminée de réactifs de façon à produire une réaction de détec-

tion.

Si les méthodes classiques ne comportent pas de difficulté parti-

culière lorsque les substances biologiques peuvent être prélevées facile-

ment, et existent en quantité relativement importante, ce qui est générale-

ment le cas pour l'urine et le sang, il n'en est pas de même lorsque les

déterminations analytiques doivent être effectuées sur des substances bio-

logiques disponibles en petite ou très petite quantité (exsudats, pus, mucosité, salive etc.) ou difficiles à prélever à partir de tissus comportant

des lésions histologiques et/ou de tissus situés dans des zones difficile-

ment accessibles, par exemple pustules, siphilomes, ulcérations etc. Le dispositif et la méthode objets de la présente invention pallient

aux inconvénients de la technique mentionnée ci-dessus, en permettant véri-

tablement le prélèvement direct de la substance biologique à examiner sans recourir à la mesure de l'échantillon. L'échantillon peut en fait, être pré-

levé directement sur le patient, ou ultérieurement sur l'échantillon de li-

quide ou de tissus biologiques prélevé selon l'une des techniques usuelles

de laboratoire.

D'autres objets de l'invention résident dans une méthode et un dis-

positif particulièrement adaptés à la mise en évidence de virus et à la

détection analytique de la progestérone dans des échantillons de lait.

Actuellement, les seules méthodes de détermination existantes pour la détection de virus dans des tissus biologiques (par exemple au cours d'infections virales ou pour évaluer le nombre d'éventuels porteurs en bonne santé dans une population) reposent sur des procédures de culture de cellules, qui exigent des appareils onéreux, un personnel expérimenté et

beaucoup de temps (3 jours ou plus) pour l'évaluation des résultats.

Ces raisons rendent difficile un diagnostic en temps voulu qui pourrait être utile pour la prévention de la propagation de maladies, les études épidémiologiques et-, de façon générale,un diagnostic précoce des

maladies virales.

Des exmples de virus dont la présence doit être fréquemment détectée, comprennent le virus de l'herpes (types 1 et 2), le virus d'Hepstein-Barr, le virus de la varicelle de Zoster, le virus du lymphome humain à cellules

T-type 3 (HTLV-3).

Il est donc très souhaitable de disposer d'une méthode de détection desdits-virus qui puisse être mise en oeuvre, même dans des centres non spécialisés, par du personnel sans expérience ni spécialisation particulières et sans équipements spécifiques tels que chambres stériles, etc. La méthode selon l'invention permet de pallier aux inconvénients des méthodes connues: elle est en fait particulièrement simple, peu onéreuse,

rapide, sure et précise.

Tous les virus peuvent être détectés suivant la méthode de la pré-

sente invention à condition de disposer d'un anticorps spécifique et d'anti-

corps spécifiques marqués enzymatiquement. L'anticorps agissant contre le virus à détecter est fixé sur le dispositif de la présente invention. Après

la réaction d'agglutination, le dispositif est mis en contact avec l'anti-

corps marqué avec l'enzyme, puis immergé dans la solution de détection cor-

respondante après élimination de l'anticorps marqué avec l'enzyme non lié spécifiquement.

Dans le cas du virus de l'herpès, par exemple, un anti HSV monoclo-

nal ou polyclonal est absorbé sur un dispositif ayant une forme adaptée à l'échantillonnage direct à partir de tissus (une ampoule cutanée par

exemple).

250 patients ont été soumis à cette méthode de diagnostic, compara-

tivement aux procédures de culture cellulaire connues. La méthode objet de l'invention s'est avérée être extrêmement fiable et en accord total avec les méthodes antérieures. Les résultats ont cependant été obtenus en une heure seulement alors que les méthodes de culture cellulaire nécessitent

au moins trois jours.

De façon analogue, un dispositif adapté à la détection du HTLV-3,

un virus responsable de la maladie connue sous le nom de syndrome d'immonu-

déficience acquise (SIDA), peut être préparé pour l'analyse de prélèvements

sanguins de sujets particulierset de sang de donneurs inconnus.

Un autre avantage important de la présente invention réside dans le fait qu'il est possible de détecter le virus même dans une phase inactive, non réplicative alors que les méthodes de culture de cellules supposent que les virus puissent se reproduire, faute de quoi une activation est

nécessaire (entraînant par conséquent d'autres difficultés opératoires).

Une méthode de détection de la progestérone dans des échantillons de lait constitue d'autres but et application préférés de l'invention. La progestérone est présente en proportion importante dans le lait de vache lors de la phase lutéale; après lutéolyse, la proportion de progestérone dans le lait diminue et se maintient à des niveaux faibles jusqu'au début

de l'ovulation.

Actuellement, ces analyses sont beaucoup utilisées par les éleveurs avant l'insémination artificielle, en association avec ou en substitution à un traitement utilisant des substances analogues à la prostaglandine

F20 pour la synchronisation de leur bétail. Dans de nombreux pays, la re-

cherche de la progestérone dans des échantillons de lait repose sur les méthodes RIA utilisant de la progestérone marquée radioactivement. Dans ce

cas également, la détermination de la présence de progestérone conformé-

ment à l'invention peut être réalisée par les éléveurs eux-mêmes sans faire appel à du personnel expérimenté, sans risque radioactif et sans équipements particuliers. Selon l'invention, le'dispositif est mis en contact avec la substance biologique à étudier, ledit dispositif étant constitué essentiellement d'un moyen de préhension et d'une extrémité destinée à venir en contact avec la substance biologique, portant fixées selon des techniques appropriées, des quantités prédéterminées d'anticorps (ou d'antigènes), spécifiques ou en

partie spécifiques pour les composés antigènes (anticorps) à détecter.

Les antigènes ou les anticorps, fixés sur l'extrémité du dispositif conformément à l'invention, vont par conséquent se lier, par une réaction

immunochimique, avec les anticorps ou les antigènes présents dans la subs-

tance étudi6e, proportionnellement à la quantité contenue dans la substance elle-meme. Selon un mode de réalisation préféré de la présente invention,

après lavage au moyen d'un solvant ou d'une solution appropriée afin d'éli-

miner les substances non fixées par une liaison spécifique à l'antigène ou

l'anticorps préalablement fixé sur le dispositif une détermination quantita-

tive et/ou qualitative directe du paramètre clinique étudié sera de préfé-

rence réalisée en faisant appel à des techniques déjà connues basées par exemplesur des réactions chimiques, immunochimiques, immunoenzymatiques enzymatiques, etc.

La forme et la taille du dispositif de cette invention et en par-

ticulier celles de l'extrémité revêtue d'anticorps ou d'antigènes, ne sont pas en elles-mêmes déterminantes pour la nature de cette invention et sont bien évidemment conditionnées par l'application envisagée et le type de

prélèvement nécessaire pour l'analyse.

Par exemple, si le prélèvement est fait par ponction cutanée, on

utilisera un dispositif approprié plus ou moins pointu, mais essentielle-

ment conique, comportant une extrémité revêtue d'anticorps ou d'antigènes.

Par contre, si le prélèvement ne nécessite qu'un simple contact avec un

tissu ou une plongée dans un liquide biologique, la surface revêtue d'anti-

corps ou d'antigènes peut présenter une forme cylindrique, sphérique, ovofdale, conique ou frustoconique, etc. Pour le prélèvement par ponction cutanée, un dispositif qui s'avère être particulièrement adapté, est constitué d'un noyau métallique, revêtu selon le cas d'une matière plastique, muni à son extrémité d'un organe revêtu d'anticorps et/ou d'antigènes, de taille et de forme appropriées

(par exemple un globule de 2-5 mm de diamètre) de laquelle une tête métal-

lique, adaptée pour l'injection, déborde de quelques millimètres (par exemple

0,5-2mm); en cours d'utilisation, la tête métallique va obliger le liqui-

de biologique à couler (une goutte de sang par exemple) et à imprégner l'or-

gane revêtu de l'anticorps et/ou de l'antigène, cet organe étant en contact

immédiat avec ledit liquide en raison de la faible distance qui les sépare.

Comme matériaux appropriés pour le support à revêtir, les matières plastiques capables de lier des anticorps ou des antigènes par adsorption

peuvent être utilisées conformément à la présente invention, à savoir poly-

éthylène, polypropylène, polystyrène, polyuréthanes,poly(chlorure de vinyle),

BUNA-N, nylon, polyacrylates, polyméthacrylates, résines de polytétrafluor.

éthylène (TEFLON(R)), résines phénoliques, polyacrylamides, DELRIN(R), LEXAN(R), dérivés de cellulose, dérivés de silicone etc.

Ces matériaux peuvent aussi revêtir le noyau métallique.

La liaison entre l'anticorps ou l'antigène et le dispositif de cette invention peut également être chimique si la matière plastique mise en oeuvre contient des groupes fonctionnels amino, hydroxy, carboxy, ou

isocyano aptes à fixer des composés protéiniques par liaison chimique.

La matière plastique appropriée, peut être activée, selon le cas, par im-

mersion dans une solution tampon d'aldéhyde glutarique à pH9, suivant une

technique déjà bien connue, ou selon d'autres méthodes similaires couram-

ment utilisées, par exemple dans le domaine de l'immobilisation des enzymes.

Des métériaux métalliques peuvent aussi être utilisés, lorsqu'ils sont préalablement soumis à un traitement propre à les rendre poreux ou capables dans tous les cas d'adsorber des anticorps et/ou des antigènes, par exemple par des techniques de galvanisation pour le dépôt d'or colloïdal

ou d'autres métaux sous forme colloïdale.

Des exemples d'enrobage de ces matériaux avec un anticorps ou un an-

tigène, selon ces méthodes, sont décrits dans le brevet américain n 4 003 988 et dans les documents suivants: a) IMMUNOASSAY USING ANTIGEN- ENZYME CONJUGATES B.K. Van Weemen and A.H.W. Schuurs Febs Letters - Vol. 15, Number 3 - June 1971 - P.232-5

b) SOLID PHASE ANTIBODY ASSAY BY MEANS OF ENZYME CONJUGATED TO ANTI-

IMMUNOGLOBULIN

P. Leinikki and Suvi Passila J. Clin. Path., 1976, 29 - P. 1116-20

C) ENZYME-LINKED IMMUNOSORBENT ASSAY WITH POLYVALENT GONOCOCCAL ANTIGEN

B.R. Brodeur, F.E. Ashton and B.B. Diena The Journal of Medical Microbiology - Vol.15, N 1_198T - P. 1-9 d) A MICROPLATE ENZYMEIMMUNOASSAY FOR TOXOPLASMA ANTIBODY J. Clin. Path., 1976, 29, P. 150-3

e) ENZYMOLOGY (Immobilized Enzymes, Antigens, Antibodies and Peptides -

Preparation and Characterization - Vol. - Ed. Howard H. Weetall - Marcel;

Dekker, Inc., New York (1975).

L'anticorps, ou les anticorps, utilisés conformément à l'invention pour revêtir le support, peuvent être du type polyclonal ou monoclonal, ou selon le cas, les deux, et peuvent être spécifiques à un ou plusieurs sites actifs de l'antigène à détecter; de plus, cette spécificité peut

être dirigée vers un ou plusieurs antigènes.

Les anticorps et les antigènes peuvent les uns et les autres être fixés sur le support en quantité non limitée; cependant, il faut choisir la quantité appropriée au type d'analyse envisagée, et située si possible

dans la plage d'un picogramme à un milligramme par centimètre carré.

Les exemples d'applications possibles du dispositif et de la méthode selon la présente invention, comprennent la détection directe de virus et/ou bactéries, la détection d'anticorps et/ou d'antigènes associés à un état pathologique particulier, la détermination du titre d'anticorps à la suite de traitements immunologiques, la détection de médicaments et de

leurs métabolites, la détection d'hormones, et la détermination de para-

mètres cliniques courants. Le support peut également être revêtu de façon

à permettre la détermination ou l'évaluation de différents paramètres -

cliniques n'ayant pas nécessairement de rapports entre eux, par exemple

détection de la gonadotropine chorionique et de la cocaine dans l'urine.

Habituellement, la réaction de détection s'effectue correctement au moyen d'un anticorps marqué avec une enzyme appropriée, spécifique pour le complexe antigène -anticorps fixé sur le support après prélèvement de

l'échantillon. A cet effet, le dispositif portant le complexe antigène -

anticorps fixé sur lui, subit un lavage à l'aide de solutions tampon appropriées et/ou d'eau destiné à éliminer l'antigène ou l'anticorps non lié spécifiquement et est ensuite plongé et soumis à incubation, pour une durée

convenable, dans une solution dudit anticorps conjugué à.une enzyme.

Ces solutions d'anticorps contiennent de préférence des agents à effet tampon et d'émulsion nonioniques, ioniques et amphotères avec une

concentration d'anticorps marqué enzymatiquement de 0,01 à 0,005 % en poids.

Le complexe anticorps-antigène-anticorps marqué enzymatiquement est ensuite fixé sur le support: après élimination d'un éventuel anticorps marqué non lié spécifiquement, par lavage au moyen de solutions tampon appropriées et/ou d'eau, l'immersion du support, traité comme précisé cidessus, dans une solution contenant un système chromogène approprié à base d'un substrat pour l'enzyme, permettra une détermination antigénique simple et directe

du produit de la réaction enzymatique, par le colorimétrie, la spectrophoto-

métrie ou diverses autres techniques.

La figure annexée présentée à titre d'exemple nullement limitatif,

représente de façon schématique le dispositif de l'invention.

La référence 1 indique le support de forme conique revêtu avec l'an-

ticorps ou l'antigène, destiné à venir en contact avec lasubstance biolo-

gique; la tige 2 sert de moyen de préhension, et ses forme et taille peu-

vent être telles que son utilisation en soit-facile et commode; les réfé-

rences 3, 4 et 5 indiquent respectivement l'anticorps, l'antigène et l'anti-

corps marqué enzymatiquement.

Le dispositif de l'invention, tout en évitant d'avoir à déterminer de façon précise la quantité de substance biologique à examiner, offre également l'avantage, dans les limites de sensibilité de la méthode,d'une

plus grande fiabilité et d'une plus grande précision grâce aussi à la minimi-

sation des erreurs expérimentales: en outre, l'analyse se fait plus rapide-

ment et au bon moment, sans nécessiter d'équipement onéreux, de sorte qu'une

utilisation directe à domicile de coffrets d'analyse peut être envisagée.

A cet effet,les dispositifs faisant l'objet de la présente invention, doivent être préparés dans des conditions de stérilité parfaite dans des locaux aseptiques appropriés et enfin placés dans des récipients stériles adaptés, par exemple des éprouvettes en verre fermées hermétiquement par

des bouchons stérilisés.

Les exemples suivants non limitatifs, illustrent certains applica-

tions possibles de la méthode et du dispositif de l'invention.

EXEMPLE 1

a) Préparation du dispositif adapté pour la détermination du Virus de l'Herpès (HSV) Des aiguilles en poly(chlorure de vinyle), pourvues d'une extrémité

conique, ont été utilisées comme phase solide.

L'extrémité desdites aiguilles a été soumise à incubation avec un antisérum anti-HSV-2, dilué à raison de 1:300 avec un tampon carbonate/ bicarbonate à pH 9,6 et de concentration 50 mM. En termes de procédure technique, l'antisérum a été fixé au support en plongeant l'extrémité conique des aiguilles dans les compartiments d'une microplaquette en poly(chlorure de vinyle) contenant 0,15 ml d'antisérum de telle façon que la totalité de la surface conique puisse être plongée dans la solution. La microplaquette a ensuite été soumise à incubation pendant 2 heures à 37 C dans une chambre

humide puis toute une nuit à 4 C.

A la fin de l'incubation, les aiguilles ont subi un lavage soigneux à l'aide d'un tampon phosphate salin (KH2P04 15 mM, Na2HPO4 85 mM, NaCl mM, KCl 25 mM) à pH 7,4, contenant 0,05 % de Tween, ont été introduites dans les compartiments d'une autre plaquette contenant le même tampon salin avec 0,3 % d'albumine de sérum bovin, et soumises à incubation pendant 1 heure à 37 C en chambre humide; Ce traitement a pour but de saturer tous

les sites libres du poly(chlorure de vinyle) qui, au cours des étapes sui-

vantes, pourraient être amenés à absorber les particules virales ou l'an-

tisérum conjugué.

Un dispositif pour la détection du virus d'hepstein-Barr, du virus

de la Varicelle de Zoster et du Virus du Lymphome Humain à cellules T-

type 3 (HTLV) est préparé de façon similaire.

b) Détermination "In Vitro" de HSV Après une phase identique, les aiguilles ont été mises en contact, pendant une courte période à température ambiante, avec une suspension du virus HSV diluée dans un rapport de 1:5 dans une solution saline (à 0,9 % de NaCl). Après lavage, on a introduit les aiguilles dans des éprouvettes en verre, contenant un antisérum anti HSV-2 conjugué à de la peroxydase,

diluée à 1:150 dans un tampon phosphate salin contenant 0,05 % de Tween 20.

Cette procédure a été suivie d'une incubation de 30-40 minutes à tempéra-

ture ambiante, et par un lavage dans un tampon phosphate salin, contenant 0,05 % de Tween 20, afin d'éviter d'éventuelles interférences analytiques

de l'antisérum conjugué non spécifiquement lié à l'antigène.

Après la dernière phase du traitement les aiguilles ont été introdui-

tes dans une solution chromogène composée de 3,4ng d'orthophénylènediamine dissous dans 10 ml de tampon, formée en parties égales d'acide citrique 0,1 M et de Na2HP04 0,2 M, additionnée, juste avant utilisation, de 50 mcl

d'une solution à 3 % de H202.

Les résultats enregistrés ont pu démontrer la bonne spécificité et sensibilité de cette technique: en fait les spécimens positifs montraient, par l'intermédiaire du système chraogène, une coloration intense nettement

distincte de celle pratiquement inexistante des spécimens négatifs.

c) Procédure explicative d'une détermination de HSV par prélèvement direct Les infectionsdues à l'herpès, Type 1, Type 2 ou Types 1 et 2, s'accompagnent généralement de la formation de vésicules de volumes variés

dans les zones génitales et/ou labiales; la formation de vésicules her-

pétiques dans d'autres organes est plus rare.

Dans le but de diagnostiquer une véritable infection virale d'ori-

gine herpétique, le dispositif, préparé conformément à la procédure exposée en (a), est mis en contact avec la vésicule par l'intermédiaire. de son

extrémité lancéolée, provoquant par conséquent la rupture de la vésicule.

Le dispositif se voit ensuite imposé un mouvement de rotation, et le liquide s'écoulant de la vésicule ouverte se trouve amené en contact

avec les anticorps anti HSV préalablement fixés sur l'aiguille.

Dès que le prélèvement de liquide est terminé, le dispositif est introduit dans une ampoule contenant 300 mcl d'une solution d'anti HSV

conjuguée à l'enzyme peroxydase, cette introduction étant suivie d'une dilu-

tion avec un tampon phosphate 30 mM contenant 0,05 % de Tween 20, et 1 % d'al-

bumine de sérum bovin.

Après une incubation de 15 minutes, le support est lavé à l'eau cou-

rante pendant environ 60 secondes, et transféré dans une ampoule contenant 300 mcl d'une solution à pH5 caractérisée par la composition suivante en pourcents (p/v): Tétraméthylbenzidine 0,02 Acide citrique 2, 10 Perborate de sodium 0,07 Phosphate de sodium, dibasique 3,00 Diméthylsulfoxyde 20,00 Eau distillée 75,00

Après une incubation de 15 minutes, la solution contenue dans l'am-

poule est observée. Elle peut être: a) incolore dans le cas d'un résultat négatif (absence de HSV dans la vésicule du patient) b) bleue dans le cas d'un résultat positif (présence de HSV dans la

vésicule du patient).

EXEMPLE 2

Détermination du titre en antistreptolysineO (ASO)

L'extrémité du support, préalablement revêtue de stréptholysine, sui-

vant la technique utilisée dans l'Exemple 1, est laissée pendant quelques secondes en contact avec le sérum étudié ou avec une goutte de sang entier prélevé directement sur le bout de l'index percé à l'aide d'un appareil d'auto-injection normal,par exemple un appareil Autoclick. L'extrémité du support est lavé à l'eau, et plongé dans une solution contenant un anticorps

anti- IgG marqué avec une enzyme (phosphatase alcaline de sérum ou peroxy-

dase). Le complexe antistréptolysine streptolysine - anti IgG marqué est

par conséquent présent sur la surface et, plongé dans une solution de subs-

trat (paranitrophénykphosphaste et azinobenzothiazoline-sulfonate), colorera celle-ci plus ou moins intensément selon le titre en anticorps du sérum ou

du sang.

EXEMPLE 3

Détection de morphine dans l'urine ou le sang

Le support solide mentionné précédemment revêtu d'un anticorps anti-

morphine suivant la technique précisée dans l'Exemple 1, est plongé dans l'urine à étudier ou dans un petit échantillon du sérum ou du sang à étudier; après une incubation d'environ 15 minutes, le support est plongé dans une solution de morphine conjugée à de la peroxydase dans un tampon phosphate à pH7 30mM. Après une période d'incubation de 10 minutes, le support est

soigneusement lavé et plongé dans une solution d'essai de tétraméthylben-

zidine et perborate préparée comme indiqué dans l'Exemple le).

L'intensité de la coloration développée est inversement proportion-

nelle à la concentration de morphine présente dans le liquide biologique étudié.

EXEMPLE 4

Détection de cocaúne et de gonadotropine chorionique humaine dans l'urine. Le support en poly(chlorure de vinyle) ou en polystyrène, de forme sphérique ou ogivale, est plongé dans un mélange de sérum antibanzoylecgonine

(le principal métabolite de la cocaúne chez l'homme) et de sérum antigonado-

tropine chorionique humain, afin d'en être enrobé.

Les antésérums utilisés peuvent être du type polyclonal (provenant du lapin et de la.chèvre) ou monoclonal (produits à la fois in vitro et in vivo) ou des mélanges des deux types. La proportion des deux antisérums dans le mélange est convenablement sélectionnée en fonction de la sensibilité

recherchée au cours de la détermination des deux paramètres.

Les dilutions concernées, réalisées dans un tampon carbonate- -

bicarbonate peuvent varier entre 1:50 et 1:50 000.

Le temps de formation du revêtement varie de 30 minutes à 72 heures

à une température de +4 à + 600C.-

Le support, dès qu'il est revêtu du mélange d'.antisérums est saturé par application d'un second revêtement par une solution d'immunoglobulines spécifiques ou de sérum de lapin normal (dans d'autres cas un sérum foetal

bovin peut également être utilisé), dans un tampon phosphate, d'une concen-

tration de 0,1 à 5 %, dans des conditions de temps et de température iden-

tiques à celles mise en oeuvre pour le dépôt du revêtement du mélange de sérums. Le support est ensuite lavé afin d'en éliminer un éventuel surplus d'anticorps ou de protéines non fixés au support, après lavage, le support est ainsi devenu prêt à l'emploi, c'est-à-dire à l'immersion dans l'urine

à étudier.

En présente de l'une ou des deux substance(s) concernée(s) par la détection, un complexe va se former entre la (les) substance(s) et son (leur)

anticorps correspondant(s), fixé physiquement sur le support solide.

Le support est ensuite lavé, et plongé dans un' mélange de sérum d'anti-

gonadotropine chorionique humaine conjuguée avec la peroxydase, et de ben-

zollecgonine conjuguée avec la béta-galactosidase; le rapport entre les

deux composés marqués est établi de façon à assurer une sensibilité de dé-

tection satisfaisante.

Après un laps de temps suffisant pour permettre la formation des complexes (5-60 minutes), le support est relavé, et plongé dans une solution

d'un substrat spécifique de la peroxydase (par exemple azinobenzothiazolino-

sulfate, phénol-4-amino-antipyrine, etc.), puis dans un second substrat spécifique de la béta-galactosidase (par ex. béta-galactoside-rouge de

chlorophénol).-La première solution se colore en présence de la gonadotro-

pine chorionique humaine; la coloration de la seconde solution est inver-

sement proportionnelle à la concentration en benzoylecgonine présente dans

le liquide biologique à étudier.

EXEMPLE 5

a) Préparation du dispositif adapté à la détection de progestérone dans des liquides biologiques: lait, urine, sérum et plasma Des supports en poly(chlorure de vinyle) présentant une extrémité

arrondie. sont utilisés comme phases solides. On laisse incuber ces supports avec une solution, dans un tampon phosphate

pH 7,5, à 2,5 % de glutaraldéhyde, pendant une période de temps

située dans la plage allant de 2 à 8 heures à 370C ou à température ambiante.

Puis, les supports sont soigneusement lavés à l'aide d'une solution

de tampon phosphate ou d'eau.

Les supports traités comme indiqué précédemment, sont soumis à incu-

* bation avec un anticorps antiprogestérone dans un tampon carbonate/bicarbonate pH 9,6, à un taux de dilution de 1:100 à 1:1000 pendant 2 heures à 37 C et

toute une nuit à 4 C.

A la:fin de l'incubation, les supports sont soigneusement lavés à l'aide d'un tampon phosphate salin pH 7,4 contenant 0,05 % de Tween 20,

soumis à incubation dans le même tampon salin pH 7,4 contenant 3 % d'albu-

mine de sérum bovin, et laissés au repos pendant 1 heure à 37 C.

Ce traitement est destiné à saturer les éventuels sites libres du support de poly(chlorure de vinyle),susceptibles, aux cours des étapes ultérieures, d'absorber l'aliquot de progestérone à analyser, contenu dans les liquides biologiques, ou encore l'aliquot de progestérone conjugué à

l'enzyme.

b) Détection de la progestérone dans le lait Le support en poly(chlorure de vinyle) est saisi à l'aide d'une poignée, et plongé dans l'échantillon de lait contenant la progestérone recherchée, pendant 5 à 15 minutes. A la fin de l'incubation, le support est transféré dans une éprouvette contenant une solution, dans un tampon

phosphate à pH 7, de progestérone marquée avec de la H-R-peroxidase, dilu-

tion de 1:1000 0 1:1000 000. Le support est soumis à inbubation pendant environ 10 minutes, puis soigneusement lavé à l'aide d'une solution de tampon phosphate ou d'eau, et plongé dans une solution d'essai de TMB et de perborate ou d'H202, comme précisé dans l'Exemple 1c). L'intensité de la coloration développée est inversement proportionnelle à la concentration de progestérone présente dans l'échantillon de lait; cette concentration peut être évaluée directement au moyen d'un instrument d'étalonnage. Il est bien évident que cette méthode peut être totalement étendue à la détection de progestérone dans d'autres liquides biologiques, tels qu'urine, sérum

et plasma.

Claims (10)

REVENDICATIONS

1. Dispositif pour la détermination de paramètres cliniques, par prélèvement direct de substances biologiques, constitué d'un support (1) sur lequel est fixée une quantité prédéterminée d'un anticorps (3) ou d'un antigène (4) spécifique au paramètre étudié, le paramètre pouvant être évalué ou déterminé consécutivement à /ou concurramment avec le prélèvement

à l'aide de réaction chimiques, enzymatiques, immunochimiques ou immonoenzy-

matiques.

2. Dispositif pour la détection de virus tels que le virus de l'her-

pès, le virus d'Hepstein-Barr, le virus de la Varicelle de Zoster, le virus de lymphome humain à cellules T (HTLV), par prélèvement direct de substances biologiques, constitué d'un support (1) revêtu d'une quantité prédéterminée

des anticorps (3) spécifiques correspondants.

3. Dispositif pour la détermination du titre en antistreptolysine 0 (ASO), par prélèvement direct de substances biologiques, comportant un

support (1) revêtu d'une quantité prédéterminée de streptolysine.

4. Dispositif pour la détection de la morphine, par prélèvement direct de substances biologiques, comportant un support (1) revêtu d'une

quantité prédéterminée d'anticorps (3) antimorphine.

5. Dispositif pour la détection de progestérone, par prélèvement direct de substances biologiques, comportant un support (1) revêtu d'une

quantité prédéterminée d'anticorps antiprogestérone.

6. Dispositif selon l'une des revendications précédentes, caracté-

risé en ce qu'il comporte une extrémité revêtue d'un anticorps ou d'un anti-

gène, en matière plastique préalablement traitée, selon le cas, à l'aide de glutaraldéhyde,en dérivés de la cellulose, en dérivés de la silicone, en métal revêtu de matière plastique ou en métaux galvanisés par dépôt d'or

ou d'autres métaux colloïdaux.

7. Dispositif selon l'une des revendications précédentes, caracté-

risé en ce qu'il comprend une extrémité, revêtue d'anticorps ou d'antigènes, de forme et de taille adaptées à un prélèvement direct sur les patients par

ponction ou contact.

8. Méthode pour la détermination de paramètres cliniques, comportant les étapes suivantes:

a) mise en contact du dispositif, conformément aux revendications

1 à 7, avec les substances biologiques dont on veut étudier les paramètres; b) lavage des anticorps ou des antigènes non spécifiquement liés avec la surface revêtue respectivement d'antigènes ou d'anticorps; c) détection de l'antigène ou de l'anticorps, fixé par une liaison spécifique, au moyen de réactions chimiques, enzynmtiques, imwnochimiques ou immunoenzymatiques.

9. Méthode selon la revendication 8, caractérisée en ce que la dé-

tection de l'antigène ou de l'anticorps fixé est réalisée par immersion des complexes anticorps-antigène ou antigène-anticorps, fixés sur le dispositif, dans une solution d'essai contenant des anticorps formés par un complexe

anti-anticorps-antigène ou des anticorps formés d'un complexe antiantigène-

anticorps conjugués avec des enzymes appropriées, capables de produire des réactions calorimétriques, telles que la peroxidase, la bétagalactosidase, la phosphatase alcaline de sérum, dès qu'il y a mise en contact avec les

systèmes chromogènes à base de substrats des enzymes eaux-mêmes.

10. Méthode selon la revendication 8 ou 9, pour la détection du virus

de l'herpès (HSV) dans des tissus biologiques, comportant les étapes sui-

vantes: a) mise en contact des substances biologiques avec le dispositif revêtu d'une quantité prédéterminée de sérum HSV; b) lavage par une solution saline du dispositif portant le complexe anticorps HSV-HSV;

c) immersion et incubation du dispositif portant le complexe anti-

corps HSV-HSV, dans des solutions salines tamponnées contenant l'antisérum

anti-HSV conjugué avec de la peroxydase.

d) lavage du dispositif portant le complexe marqué enzymatiquement;

e) immersion du dispositif portant le complexe marqué enzymatique-

ment, dans une solution d'essai composée d'ortho-phénylènediamine et de

H202, et éventuellement d'autres agents à effet tampon et de solvants.