FR2488909A1 - Production de polysaccharides microbiens - Google Patents

Abstract

L'INVENTION A TRAIT A LA PRODUCTION DE POLYSACCHARIDES MICROBIENS. ELLE A POUR OBJET UN PROCEDE POUR LA PRODUCTION D'UN POLYSACCHARIDE SELON LEQUEL UNE ESPECE DE MICRO-ORGANISME QUI PRODUIT UN POLYSACCHARIDE (DE PREFERENCE DANS LA PHASE STATIONNAIRE DU CYCLE DE DEVELOPPEMENT) EST DEPOSEE SUR UN SUPPORT INERTE POREUX EN PARTICULES, LA GROSSEUR DES PORES ETANT SUPERIEURE A 0,5MM, DE MANIERE A FORMER UN SYSTEME A CELLULES IMMOBILISEES, ON FAIT PASSER UN MILIEU NUTRITIF AQUEUX A TRAVERS LE SYSTEME IMMOBILISE ET LE MILIEU CONTENANT DU POLYSACCHARIDE EST EVACUE DU SYSTEME. UTILISATION DU POLYSACCHARIDE DANS LE DEPLACEMENT D'UN FLUIDE A PARTIR DE FORMATIONS SOUTERRAINES.

Description

-1- La présente invention concerne l'utilisation de cellules microbiennes

dans un système immobilisé, et en particulier la production d'un polysaccharide à partir

de micro-organismes immobilisés.

L'utilisation de techniques d'immobilisation est dévenue bien établie dans les transformations biochimiques utilisant des enzymes, et plus récemment cette technique

a été appliquée aussi à l'ensemble des cellules micro-

biennes. Toutefois, jusqu'à présent, cette technologie à cellules immobilisées a été appliquée principalement à la production de molécules organiques de poids moléculaire

relativement faible, comme d'acide aspartique, de trypto-

phane et d'acide aminopénicillanique, et n'a pas été appliquée à la production de matières de poids moléculaire plus élevé comme les polysaccharides élaborés par divers micro-organismes formateurs de produits visqueux. On aurait pu s'attendre à ce que les dimensions moléculaires et les

caractéristiques de viscosité de ces produits aient ten-

dance à réduire l'efficacité d'un système immobilisé et en fait on n'a obtenu aucun succès dans des tentatives en vue de produire un système immobilisé par emprisonnement des cellules dans un gel. Toutefois, d'une manière surprenante, on a trouvé que des polysaccharides peuvent être produits à partir de cellules immobilisées sur un support poreux en particules, du moment que les particules de support ont

une grosseur définie des pores.

La présente invention concerne donc un procédé pour la production d'un polysaccharide selon lequel une espèce de micro-organisme qui produit un polysaccharide est déposée sur un support inerte poreux en particules, la grosseur des

pores étant supérieure à 0,5 pm, de façon à former un sys-

tème à cellules immobilisées, on fait passer un milieu nutritif aqueux à travers le système immobilisé, et le

milieu contenant le polysaccharide est évacué du système.

Ce procédé est applicable d'une manière générale

à divers micro-organismes qui produisent des polysaccharides.

-2- Il peut être appliqué aux micro-organismes pour lesquels

la production de polysaccharide est associée au dévelop-

pement et à la multiplication, comme l'organisme Xanthomonas campestris producteur de xanthane, mais dans ces cas le développement de l'organisme entraîne la libé- ration de cellules libres à partir du support dans le

milieu, et ainsi on perd certains des avantages de l'in-

vention. Le procédé est particulièrement utile avec des micro-organismes qui produisent des polysaccharides dans la phase stationnaire du cycle de développement (c'est-à-dire que la production n'est pas associée au développement). Des exemples de tels micro-organismes sont certaines espèces formatrices de produits visqueux des genres Pseudomonas, Rhizobium, Alcaligenes et Agrobacterium, spécialement Pseudomonas spp. NCIB 11592 et 11264, Rhizobium meliloti, Alcaligenes faecalis var. myxogenes, Agrobacterium radiobacter, Agrobacterium tumefaciens et Agrobacterium rhizogenes. Tous ces organismes particuliers élaborent un polysaccharide particulier contenant du glucose et, pour 7 moles de glucose, de 0,9 à 1,2 mole de galactose et de 0,65 à 1,1 mole de pyruvate en même temps que 0 à 2 moles de succinate et d'acétate, dont les caractéristiques et l'utilisation dans la récupération du pétrole sont décrites

en détail dans la demande de brevet britannique N0 80 16 832.

Cette demande de brevet décrit aussi les caractéristiques détaillées de la nouvelle souche NClB 11592 de Pseudomonas sp.

La matière de support doit naturellement être chimi-

quement et biologiquement inerte dans les conditions d'uti-

lisation, et des matières utilisables sont des oxydes inor-

ganiques comme la silice, l'alumine, la zircone, la magnésie et leurs mélanges. On a trouvé que la rétention efficace de cellules microbiennes sur le support dépend du choix de la grosseur des pores dans les particules de support et, comme

indiqué ci-dessus, elle doit être supérieure à 0,5 pm.

Généralement, on obtient les meilleurs résultats quand la -3- grosseur des pores est d'au moins 1 pm, et les grosseurs préférées de pores sont comprises entre 2 pm et 30 pm. La grosseur des particules de support est moins critique que la grosseur des pores pour une opération acceptable, et dans la pratique est déterminée partiellement par les

conditions opératoires dans lesquelles le système immo-

bilisé sera utilisé, c'est-à-dire suivant qu'ils sera retenu dans un lit fixe ou utilisé sous la forme d'une bouillie. En général, la grosseur des particules doit être inférieure à 1 mm, et pour une opération dans un réacteur à bouillie on a trouvé que l'on obtient normalement les meilleurs résultats quand on utilise des particules ayant des grosseurs comprises entre 100 et 600 pm, et de

préférence entre 150 et 300 Pm.

La mise en place des cellules sur le support peut être effectuée par diverses techniques, mais on a trouvé

que deux modes opératoires sont généralement utilisables.

Dans une technique, les cellules microbiennes sont cul-

tivées par des méthodes bien connues dans un fermenteur de manière à donner une pâte des cellules désirées qui est mélangée avec les particules de support. On met ensuite le mélange sous vide et on détruit le vide de manière que

la pression atmosphérique refoule la pâte dans les pores.

Les particules revêtues sont ensuite mises à vieillir pendant une courte période (plusieurs heures), après quoi les cellules en excès sont éliminées par lavage. Une autre technique, qui est préférée, est celle du développement in situ, dans laquelle le support en particules est mis en suspension dans un milieu de croissance approprié, qui est

ensuite inoculé de l'organisme désiré. Le milieu de crois-

sance contenant le support et inoculé est mis ensuite à incuber dans des conditions appropriées de façon à assurer le développement de l'organisme, et après un laps de temps approprié les cellules libres sont éliminées par lavage

pour laisser le système immobilisé contenant les cellules.

Selon une variante de cette technique, du milieu de -4-

croissance frais contenant une source assimilable de car-

bone et d'azote est introduit de manière continue dans le réacteur durant l'immobilisation de façon à fournir des conditions appropriées pour fixation. Quand on applique la technique de développement in situ, on trouve souvent que des charges en cellules plus importantes et plus stables sont obtenues par l'utilisation de fortes proportions de

substance nutritive dans le milieu de croissance.

Le milieu nutritif aqueux doit fournir un substrat

pour la production de polysaccharide par le micro-organisme.

Dans le cas des micro-organismes qui produisent un poly-

saccharide dans la phase stationnaire de leur cycle de développement, le milieu nutritif est de préférence un milieu qui, tout en fournissant le substrat nécessaire, ne fournit pas de conditions conduisant au développement et à la multiplication du micro-organisme. De telles conditions ne produisant pas de développement peuvent être maintenues par l'utilisation d'un milieu déficient en un ou plusieurs

des constituants essentiels pour le développement des cel-

lules, par exemple en sulfate, phosphate, ou de préférence en azote, ou par d'autres moyens bien connus. Le milieu

nutritif aqueux contiendra normalement une source assimi-

lable de carbone en même temps que d'assez petites quantités d'ions inorganiques. La source de carbone est d'une manière appropriée un hydrate de carbone, commodément du glucose, et on l'utilise de préférence à une concentration comprise entre 0,1 et 10 % en poids, normalement de 1 à 2 % en poids/ volume. La température et le pH auxquels le polysaccharide est produit le plus efficacement varieront naturellement selon l'organisme, et dans le cas de Pseudomonas-sp. NCIB 11592, la température est comprise de préférence entre 20'C

et 350C et le pH est compris de préférence entre 6 et 9.

Durant la production de polysaccharide, le milieu nutritif aqueux sera normalement introduit dans le système immobilisé à un débit égal à celui auquel le milieu de sortie contenant le polysaccharide est évacué du système; ce milieu de -5- sortie peut être utilisé tel quel ou peut être traité

selon les techniques connues pour en extraire le poly-

saccharide.

Un des principaux avantages de la technique d'immo-

bilisation selon la présente invention est qu'elle facilite la séparation du polysaccharide désiré des cellules, car ces dernières se trouvent sur les particules de support qui sont facilement retenues dans le récipient à fermentation par des dispositifs bien connus tels que des tamis filtrants ou des déversoirs. De plus, la technique d'immobilisation

offre la possibilité de prolonger la durée de vie produc-

tive des cellules, c'est-à-dire la période durant laquelle elles continueront à élaborer le polysaccharide sans aucun

développement important, mais cette durée de vie est inévi-

tablement finie et elle n'est pas dans tous les cas sensi-

blement plus longue que celle d'un système à cellules libres. Toutefois, quand la productivité des cellules supportées tombe au-dessous d'un niveau acceptable, on peut la rétablir facilement et quasi-complètement en répétant la phase de développement (c'est-à-dire en réintroduisant

un milieu de croissance complet contenant toutes les subs-

tances nutritives nécessaires) pendant une période ap-

propriée, commodément dans des conditions de lavage qui éliminent toutes cellules libres libérées du support, et en revenant ensuite de nouveau à l'introduction d'un milieu

nutritif déficient en azote par exemple.

Une utilisation importante des polysaccharides produits par la présente invention est une récupération améliorée du pétrole (comme décrit plus en détail dans la demande de brevet britannique N0 80 16 832) et l'invention

comprend donc aussi un procédé selon lequel le milieu con-

tenant du polysaccharide, après tout réglage nécessaire de

la concentration et/ou incorporation de composés supplémen-

taires, est injecté dans une formation souterraine perméable

contenant un fluide. Dans cette application, il est parti-

culièrement important que la solution de polysaccharide soit -6- exempte de corps de cellules, et un avantage du procédé selon la présente invention est qu'il simplifie la production d'une solution de polysaccharide exempte de cellules. En utilisant des

procédés classiques, il est nécessaire de séparer les cel-

lules microbiennes de la solution visqueuse de polysaccha- ride, mais dans le procédé selon la présente invention les cellules sont immobilisées sur le support et en conséquence la solution de- polysaccharide résultante est sensiblement exempte de telles cellules., L'invention est illustrée dans les exemples suivants.

Exemple I

A. Préparation d'un système immobilisé 1) Charge sous vide On cultive de manière continue Pseudomonas sp. NCIB 11592 dans un récipient à fermentation Chemap LF-7 ayant un volume de liquide de 4 litres. La température de culture est maintenue*à 280C et le pH est maintenu à 6,8 par l'addition automatique de solution 2N d'alcali (lN NaOH + lN KOH). On fait barboter de l'air dans le fermenteur à raison de 0,5 litre par minute et on agite la culture au moyen d'un rotor de turbine tournant à 1000 tpm. Du milieu stérile frais en deux courants est refoulé dans le fermenteur de manière continue et on évacue le bouillon de culture par un déversoir de manière à maintenir un volume de travail constant dans le réacteur. Les débits et la composition des courants sont les suivants: -7- 3 -1 Courant 1. Débit: 300 cm.h1 Milieu de sels minéraux tel que défini ci-après contenant -1l

aussi 20 gl de glucose et lO1M H3PO4.

Courant 2. Débit 3: 60-120 cm3.h1 :60-120 cm.h (NH4)2SO4 21,14 g11 Une pâte des cellules préparée à partir du bouillon par centrifugation et contenant 100 g de cellules (en poids à sec) par litre est mélangée avec les particules de support choisies. Le mélange est ensuite mis sous vide au moyen

d'une pompe à eau et on détruit le vide après 3-5 minutes.

On répète ce mode opératoire 4 à 5 fois et on fait vieillir le mélange à 4 C pendant 2 heures ou 12 heures avant lavage répété avec une solution tampon de phosphate de manière à éliminer les cellules en excès. La charge en cellules obtenue est estimée soit par des études de respiration en utilisant une électrode à oxygène, soit en mesurant la concentration de protéine en utilisant la méthode de Concentration Constituant gl -1 M MgSO4.7H20 0.493 2.0 CaCl2,.2E20 0.147 1.0 FeSOh.7H 2 0 55.6 x 10 200-3

4.7H ê 5-100

MnSO4.71120 4.46 x 10-3 20 ZnSOh.4-7H20 5.74 x lo3 20 CuS04.5H20 4.99 x 10-3 20 CoC12. 6H0 2.37 x 10-3 10 3303 B20.61 x 10-3 0 Na2Mo04.2H20 2.41 x 10-3 13 KI 1.66 x 10-3 0 -8- Lowrey et autres, et on l'exprime en mg en poids à sec de cellules par gramme de matière de-support. On effectue ces essais avec diverses matières de support. Les résultats

de tous ces essais sont résumés dans le Tableau 1 ci-

dessous. o.Xaz 8'01 6, l I6l 101. O.Iaz 0'9 '8 99'o1 1/ Qi 9a,/TtS 1'o0 (4 coddns ap B /oes I SpTod u@ Bu) s@iniDo Ue aB.6-eM Z'[ aI Zl li al ai ai a Zl a a ai ai ai -STiiTaTA ap S&IS3j 1ft9 V.N

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uo,4.J0N st ia - 10- 2) Charge par développement in situ On cultive Pseudomonas sp. NCIB 11592 dans un fermenteur Biotec ayant un volume de travail de 2,5 litres en présence de 5-10 % en poids/volume de particules d'alumine (Norton 06519) en utilisant un débit de gaz de 400 cm3 /min d'air ou de 200 cm 3/min d'oxygène et une vitesse d'agitateur de 200 tpm, donnant une tension de l'oxygène dissous supérieure à 60 % de la saturation en air. La température est de 3f00C, le pH est maintenu à 7,0 par l'addition automatique de solution 2N d'alcali et le milieu de développement comprend le milieu de sels minéraux tel que défini cidessus, contenant aussi 20 g/l de glucose, 2,11 g/l de (NH4)2SO4, 0,680 g/i de KH2PO4 et 0,709 g/l de Na2HPO4 Immédiatement avant la fin du développement du lot (environ 20 heures), on change les conditions dans le réacteur en portant le débit de gaz à 600 cm 3/min d'air (ou 300 cm3/min d'oxygène) et on conduit la culture en continu

utilisant le milieu indiqué à un débit de plus de 1 1/h.

A cette grande vitesse de dilution, les cellules déjà fixées sur le support sont retenues et se développent encore dans le support, tandis que les cellules libres,

ou peu solidement fixées, sont enlevées par lavage. On cul-

tive les cellules de cette manière jusqu'à ce qu'on n'ob-

serve plus d'accroissement de la charge en cellules (48.

heures) et on détermine la charge en cellules comme en A(1).

Les résultats sont présentés dans le Tableau 2 ci-dessous.

Tableau 2

Temps à partir du début Charge (mg.g 1 de la culture en continu (h) Essai 1 -Essai 2 Conc. du support Oonc. du support 72 gl 260 gl

0 4,0 3,5

20 10,5 12,0

17,4 n.d.

17,2 20

- 20

-11- B. Production de biopolymère 1) Immobilisation sous vide et production discontinue Des cellules de Pseudomonas sp. NCIB 11592, de Pseudomonas sp. NCIB 11264 et d'Agrobacterium radiobacter NCIB 9042 sont immobilisées sur de l'alumine (Norton 06519) comme décrit précédemment. On place 10 g de chaque biocatalyseur, après lavage, dans des flacons à secousses contenant 100 cm3 de tampon phosphate 10 mM au pH 7,4 et 10 g de glucose. On secoue les flacons à 200 tpm et à C avec les résultats suivants:

Tableau 3

Souche ChargeI Concentration du (mg/g) polymère après 140 h (g/l) Pseudomonas sp. NCIB 11592 9,6 4,0 Pseudomonas s. NCIB 11264 11,0 4,5 Agrobacterium radiobacter

NCIB 9042 8,5 2,0

Nota:l1 Nota 1mg de cellules (poids à sec)/g de support 2) Immobilisation sous vide et production continue Des cellules de Pseudomonas sp. NCIB 11592 sont immobilisées sur de l'alumine (Norton 06519) comme décrit précédemment, pour donner 9,7 mg de cellules (en poids à sec) par gramme de support. On place 180 g du biocatalyseur

dans un récipient à fermentation Biotec de 4 litres con-

tenant 2,8 litres de milieu comprenant le milieu de sels minéraux décrit précédemment et aussi 20 g/l de glucose et mM H3PO4. La température est maintenue à 30 C et le pH est maintenu à 7,0 par l'addition automatique de solution 2N d'alcali. On fait barboter de l'air dans le réacteur à 400 cm3/min et on agite la suspension au moyen d'un rotor tournant à 200 tpm. On refoule du milieu frais dans le

réacteur à raison de 225 cm3/h et la solution de polysac-

charide est évacuée par un déversoir, comprenant un -12- décanteur, de manière à maintenir un volume de travail constant et une quantité constante de biocatalyseur dans le réacteur. La concentration de polysaccharide dans le courant de sortie (comme mesuré par réaction avec l'anthrone est indiquée dans le tableau suivant

Tableau 4

Durée de l'essai (heures) Concentration du poly-

saccharide (g/l)

0,15

42 0,13

63 0,18

114 0,20

139 0,21

3) Immobilisation par développement in situ et production continue On immobilise Pseudomonas sp. NCIB 11592 sur 180 g d'alumine (Norton 06519), selon les modes opératoires de l'exemple A2. Après l'immobilisation, du milieu de sels frais (exempt d'azote) contenant aussi 20 g/l de glucose et 10 mM H3PO4 est refoulé dans le réacteur à raison de 225 cm /h et la solution de polysaccharide est évacuée

comme dans l'exemple B2. Après une perte initiale de cel-

lules, la charge en cellules sur le support durant la synthèse du polymère se stabilise à 10 mg (en poids à sec) par gramme. La concentration de polysaccharide dans le courant de sortie est indiquée dans le tableau suivant

Tableau 5

Durée de l'essai (heures) Concentration du poly-

(après l'immobilisation) saccharide (g/l)

26 0,73

42 0,51

63 0,45

86 0,45

-13-

4) Développement in situ avec des quantités diffé-

rentes de substances nutritives et production continue On immobilise Pseudomonas sp. NCIB 11592 sur de l'alumine (Norton 06519) selon les modes opératoires de l'exemple A2, à ceci près que le milieu de développement contient les concentrations suivantes de sels minéraux: Constituant Concentration mg/1 Na2HPO4 3000

2 4 3000

KH2PO4 3000

MgSO4.7H20 200 FeC13. 6H20 33,4 CaC12.2H20 16,0 ZnSO4.7H 20 0,36 CuSO4. 5H20 0,32 MnSO4.4H20 0,30 CoC12. 6H20 0,36

H3BO3 0,20

Na2MoO4. 2H20 0,60

en même temps que (NH4)2SO4 et du glucose à des concen-

trations soit de 0,3 g/1 et de 10 g/1 (I), soit de 3,0 g/1 et de 20 g/l (II), respectivement. La durée du développement

de charge est de 90 heures pour I et de 70 heures pour II.

Le système de cellules immobilisées résultant est ensuite alimenté en un milieu nutritif qui diffère du milieu de

développement seulement par l'omission du sulfate d'am-

monium (cette modification étant indiquée en parlant d'un

milieu exempt d'azote), on évacue la solution de polysaccha-

ride et on détermine le quotient de produit (g de polymère/

g de cellules fixées/h) et la productivité (en mg de poly-

saccharide/g de support portant les cellules/h). Les résultats sont présentés dans le Tableau 6 ci-dessous,

d'après lequel il est évident que les plus fortes pro-

portions de substances nutritives conduisent à des amélio-

rations importantes dans les charges en cellules et dans les

paramètres de production.

-14-

TABLEAU 6

Quotient de produit I o. 007 0.051 0.0 o65 o. 0o48 0.0o40 0.021 0.028 0. 015 0.012 0.030 II 0.002 0.022 0.045 -o.o65 0.039 0.034 0.034

0. 029

0. 034

0. 019

Productivité I o.074 o.449 o.483 0.268 0.178 o.o86 0.113 0.059 o.065 0. 092 II 0.107 o0. 570 0.593 0.728 0.467 0.330 0.360 0.251 0.301

0G.174

Charge en cellules (mg/g) II 53.2 26.1 13.2 11.2 11.97 9.64 Temps (h) o0 16.4 17.5 40.5 53.1 65.0 78.1 89.3 99.9 113.2 126.5 136.5 137.3 161.0 161. 6 183.9 185.4 242.2 246.3 I 11.04 8.77 7.4 5.55 4.45 4.13 4.11 3.98 5.64 3.12 8..96 9.4 I -15- Exemple II Régénération de la productivité en polysaccharide On immobilise Pseudomonas sp. NCIB 11592 sur de l'alumine (Norton 06519) selon le mode opératoire de l'exemple B4, avec les proportions plus fortes de subs- tances nutritives et un temps de charge de 76 heures. Ce système à cellules immobilisées est alimenté ensuite à une vitesse de dilution de 0,08 h-1 (c'est le débit du milieu divisé par le volume de liquide dans le réacteur) avec un milieu exempt d'azote (mais par ailleurs similaire) pour amorcer une phase de production de polysaccharide, qui est conduite pendant 208 heures. A ce moment, le quotient de produit polysaccharide est tombé à un bas niveau, et le milieu exempt d'azote est remplacé par le milieu de développement complet, contenant de l'azote, à une vitesse de dilution de 0,4 h-1 pendant une période de 96 heures de manière à régénérer l'activité productrice de

polysaccharide des cellules. Après cette phase de régéné-

ration, la phase de production est reprise par réintro-

duction du milieu exempt d'azote à une vitesse de dilution -1 de 0,08 h. On détermine durant toute cette expérience les

charges en cellules et le quotient de produit polysaccha-

ride et les résultats sont présentés dans le Tableau 7,

d'après lequel il est évident que l'opération de régéné-

ration rétablit efficacement la productivité en polysac-

charide du système immobilisé.

-16- Charge en cellules (mg/g) 35.0 20.4 14.0 9.17 9.19 8.6 8.9 6.98 6.8 6.8 21.7 38.2 36.9 35.7 35.0 22.1 16.97 14.5 15.3 12.64 13.9

TABLEAU 7

Quot de p :ient roduit 0.001 0.010 0.034 0.030 0.016 0.02 0.011 0.007 0. 005 O.010 Phase de régénération 0.007 0.021 0o46 0.063 0.043 o.o49 0.039 Temps (h) i6.25 39.43 74.34 96.2 iil 331/0 16.7 41.8 77.4 100.8 114.8 -17-

Exemple III

Pour montrer les résultats obtenus avec un organisme exigeant un développement pour la production de polymère, une pate de Xanthomonas campestris ATCC 13951 est chargée par développement in situ sur trois supports différents. Chaque système (10 g) est ensuite placé dans 100 cm3 d'un tampon 100 mM tris au pH 7,4 contenant 1 % de glucose et on détermine la production de polymère en utilisant des modes opératoires similaires à ceux de B(1) ci-dessus. Les

résultats sont présentés dans le tableau ci-dessous.

Tableau 8

Matière de support Charge en Concentration du polymère cellules après 140 heures (mg/g) (g/1) Alumine Norton, lot 06519 6,8 1,4 Silice/alumine Norton, lot 06482 7,2 0,3 Fractosil 25000 (Merck, Darmstadt) 8,8 0,7 On voit que du polymère est produit, mais à une vitesse moindre que celle obtenue avec Pseudomonas sp

NCIB 11592.

Exemple comparatif

Autres techniques d'immobilisation.

Les exemples suivants montrent que les techniques

d'immobilisation selon la présente invention sont néces-

saires pour une production efficace de polysaccharide,

car les autres techniques classiques sont inutilisables.

1) Immobilisation par fixation par covalence.

Des supports appropriés sont activés par les réactifs de couplage suivants: l-éthyl-3-(3'-diméthylaminopropyl)

carbodiimide, glutaraldéhyde, quinone et N-hydroxy succini-

mide. Les supports activés sont mélangés avec une pàte de cellules de Pseudomonas sp. NCIB 11592 pendant plusieurs heures pour effectuer une immobilisation. Dans tous les cas, il n'y a pas de fixation importante de cellules, ou alors les cellules qui se fixent perdent leur activité pour la -18-

synthèse de polysaccharides.

2) Immobilisation par emprisonnement dans un gel Des techniques pour l'immobilisation de cellules dans des gels sont bien décrites dans la documentation technique publiée. Des cellules de Pseudomonas sp. NCIB 11592 ont été immobilisées par emprisonnement dans les

gels suivants: gélose, polyacrylamide, alginate de calcium.

Dans tous les cas, les cellules ont été immobilisées effi-

cacement et ont conservé la capacité de respirer en présence d'une solution de glucose. Toutefois, il n'y a pas eu du tout de polymère libéré dans la solution. On pense que les pores dans les gels sont trop petits pour permettre que le

polymère sorte des particules.

-19-

Claims (10)

REVENDICATIONS

1. Procédé pour la production d'un polysaccharide, selon lequel une espèce de micro-organisme qui produit un polysaccharide est déposée sur un support inerte poreux en particules, la grosseur des pores étant supérieure à 0,5 pm, de façon à former un système à cellules immobilisées, on fait passer un milieu nutritif aqueux à travers le système immobilisé et le milieu contenant le polysaccharide est

évacué du système.

2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le microorganisme est une espèce qui produit le polysaccharide dans la phase stationnaire du cycle de développement.

3. Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que le micro-organisme est une espèce formatrice de matière visqueuse des genres Pseudomonas, Rhizobium,

Alcaligenes ou Agrobacterium.

4. Procédé selon l'une des revendications précé-

dentes, caractérisé en ce que le support est un oxyde inorganique.

5. Procédé selon l'une des revendications précé-

dentes, caractérisé en ce que la grosseur des pores est

comprise entre 2 et 30 pm.

6. Procédé selon l'une des revendications précé-

dentes, caractérisé en ce que le diamètre moyen des parti-

cules est compris entre 100 et 600 pm.

7. Procédé selon l'une des revendications précé-

dentes, caractérisé en ce que la mise en place des micro-

organismes sur le support est effectuée par développement des microorganismes en présence du support et d'un milieu de développement contenant une source assimilable tant de carbone que d'azote en même temps que des substances

minérales essentielles.

8. Procédé selon l'une des revendications précé-

dentes, caractérisé en ce que le milieu nutritif aqueux -20- contient une quantité d'azote insuffisante pour provoquer un développement actif, et que le stade de production de polysaccharide est suivi d'un stade de développement régénérateur dans lequel le système à cellules immobilisées est alimenté en un milieu de développement complet contenant des sources assimilables de carbone et d'azote, après quoi le milieu de développement est remplacé par le milieu

nutritif limité en azote pour retour au stade de production.

9. Procédé selon l'une des revendications précé-

dentes, caractérisé en ce que le milieu contenant le poly-

saccharide, après tout ajustement nécessaire de concen-

tration et/ou incorporation de composés supplémentaires, est injecté dans une formation souterraine perméable

contenant un fluide.

10. Système à cellules immobilisées utilisable dans

le procédé selon l'une des revendications précédentes,

caractérisé en ce qu'il comprend un micro-organisme pro-

ducteur de polysaccharide déposé sur un support inerte poreux en particules ayant une grosseur de pores supérieure

à 0,5 pm.