FI97603B

FI97603B - Menetelmä rokotteen valmistamiseksi streptokokki-infektioita vastaan

Info

Publication number: FI97603B
Application number: FI883876A
Authority: FI
Inventors: Edwin H Beachey; Thomas P Poirier; Michael A Kehoe
Original assignee: Edwin H Beachey; Thomas P Poirier; Michael A Kehoe
Priority date: 1987-08-24
Filing date: 1988-08-22
Publication date: 1996-10-15
Also published as: FI883876A0; NO174630B; NO174630C; ATE120487T1; HUT50048A; JPH02420A; DK472988D0; DE3853454D1; FI883876A; US5162226A; PT88329B; EP0305279B1; AU631524B2; NO883763L; EP0305279A1; CA1341255C; PT88329A; DK472988A; AU2145188A; DE3853454T2

Description

1 97603

Menetelmä rokotteen valmistamiseksi streptokokki-infektioita vastaan Tämä keksintö liittyy immunisaatioon streptokokki-5 infektioita vastaan, tarkemmin A-ryhmän streptokokki-infektioita vastaan. Keksinnön kohteena on menetelmä rokotteen valmistamiseksi nisäkkään immunisoimiseksi streptokokki-infektioita vastaan aikaansaamalla opsonisten vasta-aineiden muodostuksen streptokokki M-proteiiniantigeenia 10 vastaan saamatta aikaan vasta-aineita, jotka ovat ristiin reagoivia sydänkudoksen antigeenien kanssa.

Keksinnöllä on laajoja tärkeitä vaikutuksia. Keksijän tietämän mukaan nyt tarjotaan ensimmäisen kerran biologinen elävä kantaja, joka sisältää virulentin baktee-15 rin suojaavan antigeenin, joka pystyy immunisoimaan virulentin bakteerin aiheuttamia injektioita vastaan. Käsityksenä on, että tässä kuvattuja toteutustapoja voidaan soveltaa laajempaan käyttöön ja menetelmiin.

Yli kuusikymmentä vuotta on etsitty turvallista ja 20 tehokasta rokotetta niitä A-ryhmän streptokokkeja vastaan, jotka aiheuttavat reumaattista sydänvikaa. Lancefield, •»Current Knowledge of Type-Specific M Protein Antigens to Group A Streptococci··, J. Immunol, Vol. 89, pp 307-313 (1962). Tiedetään, että harvoja bakteerilajeja on tutkittu “ 25 intensiivisemmin tällä vuosisadalla kuin Streptococcus • · · *.*·* pyogenes tai A-ryhmän streptokokkia. Kun varmuus kasvoi, • · i että tämä organismi oli pääasiallinen ja sittemmin ainoa * « ϊ.ν akuutin reumakuumeen aiheuttaja, tutkijat yrittivät määrä- :V: tietoisesti selvittää bakteerin tuotetta, jonka myrkylli- 30 set tai antigeeniset komponentit aiheuttaisivat reumapro- . .*. sessin. Kattava tutkimus reumakuumeesta ja streptokokki- • · · infektioista on julkaisussa Stollerman, Rheumatic Fever and Streptococcal Infektion (New York Clinical Cardiological Monographs, Grune and Stratton, 1975). Stollerman ku-35 vaa M-proteiinin keskeistä roolia immuniteetissä A-ryhmän 2 97603 streptokokkeja vastaan. Viittaamme myös julkaisuun Beachey and Seyer, "Primary Structure and Immunochemistry of Group A Streptococcal M Proteins", Seminars in Infectious Disease, Vol 4 pp 401-410 (toim. J. B. Robbins, J. C. Hill ja 5 J. C. Sadoff, julk. Georg Thieme verlag, New York & Stuttgart 1982).

Suurin osa rokotteenkehitysyrityksistä johti vakaviin myrkyllisiin reaktioihin millä tahansa streptokokki-tuotteella, jota annettiin ihmiselle. Joidenkin näistä 10 tuotteista on osoitettu aiheuttavan vasta-aineita jotka reagoivat kantajan kudosten, erityisesti sydämen, kanssa. Kaplan ja Meyersian, "An Immunological Cross-Reaction Between Group A Streptococcal Cells and Human Heart Tissue", Lancet, Vol i, pp 706-710 (1962); Zabriskie ja Freimer, 15 "An Immunological Relationship Between the Group A Streptococcus and Mammlian Muscle", J. Exp. Med, Vol. 124, pp 661-678 (1966). Vaikka onkin kauan sitten todistettu, että M-proteiini A-ryhmän Streptococcuksen pinnalla sisältää näiden organismien suojaavat antigeenit, on pelätty, että 20 eristetty M-proteiini liittyisi potentiaalisesti haitallisiin kudosten ristiinreaktiivisiin antigeeneihin, jotka aiheuttavat eivätkä estä reumakuumetta. Tätä pelkoa on lisännyt havainto, että tietyt reumaa aiheuttavat streptokokit tuottavat M-proteiineja, jotka ovat läheisesti yh- *. . 25 teydessä sydämen ristiinreaktiiviseen antigeeniin. Kaplan, • · · "Immunologic Relation of Certain Strains of Group A Strep- : .* tococci Exhibiting an Immunologic Cross-Reaktioneith Human • · :.V Heart Tissue," J. Immunol. Vol. 90, p 595 (1963). On to- • · dellakin äskettäin todistettu, että yksi M-proteiinimole- 30 kyyleistä sisältää kovalenttirakenteessaan epitoopin, joka ; aiheuttaa suojaavan anti-streptokokkivasta-aineen esiin- • · · .·tyrnistä, joka myöskin ristiinreagoi ihmisen sydänkudoksen sarkolemmaproteiinin kanssa. Dale ja Beachey, "Protective Antigenic Determinant of Streptococcal M Protein Sharded 35 with Sarcolemmal Membrane Protein of Human Heart", J. Exp. Med., Vol. 156, pp 1165-1176 (1982).

3 97603 US-patentti nro 4 284 537, E. Beachey, myönnetty 18.8.1981, kuvasi kahden tyyppi 24 M-proteiinistä saadun peptidifragmentin aminohapposekvenssin. Siinä todettiin myös, että kumpikin näistä luonnon fragmenteista pystyi 5 kovalenttisesti sitoutuneena kantajaan kuten polylysiiniin aiheuttamaan tyyppispesifisiä opsonisia vastaaineita, jotka vaikuttivat Streptococcus pyogenesta vastaan. Kumpikin näistä fragmenteista oli luonnonuute ja kumpikin sisälsi 35 aminohappoa.

10 US-patentti nro 4 454 121, E. Beachey, myönnetty 12.6.1984, kuvasi synteettisen peptidin (S-CB7) ja siinä todettiin, että yksi suojaavista vaikuttajista sijaitsee tietyssä tyyppi 24 M-proteiinin S-CB7:n fragmentissa, joka sisältää ainoastaan 12 aminohappotähdettä [S-CB7 (18-29)]. 15 S-CB7, kuten on kuvattu, eroaa alkuperäisestä CB-7-frag-mentista siinä, että S-CB7:n COOH-terminaalinen tähde on metioniini homoseriinin sijasta. Patenttijulkaisussa kuvataan myöskin S-CB7:n kovalenttisesti kytkeytyneitä konju-gaatteja ja sopivia hapteenikantajia, luonnollisia kuten 20 BSA tai OVA tai synteettisiä kuten polylysiini. Lisää tämän työn yksityiskohtia on julkaistu Naturessa 30.7.1981, Beachey et ai., 292, sivut 457-459.

US-patentti nro 4 521 334, "Synthetic Polypeptide Fragments", Edwin H. Beachey, myönnetty 4.6.1985 kuvaa . 25 kolmen peptidifragmentin CB3, CB4 ja CB5 aminohapposek- • · · venssin sekä 35 ja 37 tyyppi 24 M aminohapposekvenssit, • · · : ·* jotka sisältävät antigeenisiä determinantteja jotka vas- • · :.V taavat CB3-CB7 sisältyviä antigeenisiä determinantteja.

• · US-patentti nro 4 597 967, "Synthetic Polypeptide Frag- 30 ments", Edwin H. Beachey, myönnetty 1.7.1986 kertoo, että : :*: nämä fragmentit sopivasti kytkettyinä kantajaan kuten po- • · · lylysiiniin pystyvät aiheuttamaan tyyppispesifisiä opsonisia antigeenejä, jotka vaikuttavat Streptococcus pyogenesta vastaan.

< 97603

Yllämainitut patentit kuvaavat pieniä peptidifrag-mentteja, jotka ovat iirununogeenisiä ja auttavat kehittämään turvallisen ja tehokkaan rokotteen niitä streptokokki-infektioita vastaan, jotka aiheuttavat kuumeita ja reu-5 maattista sydänvikaa. Lähestymistapa oli se, että hyvin pienet peptidit sallisivat jättää pois suuren osan M-pro- • teiinimolekyylistä ja siksi vähentäisivät vaaraa aiheuttaa immunologisia ristiinreaktioita kantajan kudoksia vastaan. Katso esim. yllämainittu US-patentti nro 4 454 121 kappa-10 leet 1 ja 2.

Lisäinformaation saamiseksi synteettisten Streptococcus pyogenes M-proteiinin peptidien aiheuttamasta tyyp-pispesifisestä suojäävästä immuniteetista katso Beachey et ai., "Type Specific Protective Immunity Evoked by Synthe-15 tic Peptide of Streptococcus pyrogenes M Protein Nature", Vol. 292, nro 5822, ss 457-459 (30.7.1981).

Lisäkirjallisuutta aiheesta: katso Hasty et ai., "Hybridomas Antibodies Againts Protective and Non-Protec-tive Antigenic Determinants of a Structurally Defined Po-20 lypeptide Fragment of Streptococcal M Protein", J. Exp. Med. Vol. 155, p 1010 (April 1982); and Hopp and Woods, "Prediction of Protein Antigenic Determinants from Amino Acid Aequences", Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 78, nro 6, pp 3824-28 (June 1981).

·. 'J 25 Näistä edistysaskelista huolimatta on vieläkin ole- • · · ***** massa täyttämätön tarve suun kautta annettavasta rokot- • · : .* teestä, jossa olisi näitä ei-ristiinreaktiivisia immuno- • « V.· geenisiä polypeptidejä. Tarjoamalla näitä peptidejä lie- • · vennetyn ei-virulentin rekombinantin bakteerin muodossa, 30 joka pystyy syntesoimaan niitä, tämä keksintö on uusi ; ;*. edistysaskel lääketieteessä erityisesti streptokokki-in- • · · fektioiden hallinnassa.

Tunnetaan useita M-proteiinien serotyyppejä, jotka on koodattu geeneihin, jotka ovat toistensa alleeleja. Ku-35 kin serotyyppi vastaa eri S. pyogenes-kantaa ja nämä sero-tyypit eroavat vain aminoterminaalisekvenssiensä osalta.

li 5 97603 Tämä keksintö liittyy yleisesti geeniteknologiseen lähestymistapaan streptokokki-M-proteiinin antigeenin tai antigeenifragmentin valmistamiseen, joka pystyy aiheuttamaan opsonisia vasta-aineita streptokokki-infektioita vas-5 taan.

Tarkemmin, keksintö tarjoaa menetelmän transformoidun ei-virulentin bakteerin valmistamiseksi, joka sisältää heterologisen nukleotidisekvenssin, johon nukleoti-disekvenssiin on koodattu streptokokki-M-proteiinin anti-10 geeni ja joka ekspressoi sitä. Keksinnön mukaiselle menetelmälle on tunnusomaista se, mitä patenttivaatimuksessa l esitetään.

Tässä esitetään myös transformoitu ei-virulentti kantaja, jossa ekspressoitu streptokokki-M-proteiinin an-15 tigeeni pystyy aiheuttamaan opsonisia antigeenejä strep tokokki-infektiota vastaan.

Eräs keksinnön tavoite on tarjota proteiiniantigee-ni, joka tehoaa ei-virulentin bakteerin virulentteihin muotoihin.

20 Keksinnön spesifinen tavoite on tarjota transfor moitu ei-virulentti Salmonella-suvun, erityisesti typhimu-rium-lajin bakteeri, joka sisältää plasmidin, johon on koodattu M-proteiinin geeni, tarkemmin tyyppi 5:n M-pro-teenin geeni.

'. . 25 Lisäksi keksinnön tavoite on tarjota streptokokki- • · · * *, M-proteiinin antigeeni, joka pystyy aiheuttamaan opsonisia ·' vasta-aineita, jotka tuottavat systeemisen immuniteetin *.'♦* streptokokki-infektioita vastaan.

• · V.· Eräs tämän keksinnön tavoite on tarjota multiva- 30 lentti streptokokki-M-proteiinin antigeeni, joka pystyy : aiheuttamaan opsonisia vasta-aineita useamman kuin yhden • · · serotyypin M-streptokokkikantaa vastaan.

Lisäksi keksinnön tavoite on tarjota streptokokki-M-proteiinin antigeeni, joka isännässä ilmetessään, eri-35 tyisesti ei-virulentissa heterologisessa mikrobikantajas- 97603 6 sa, johon streptokokki-M-proteiinin antigeenin geeni on kloonattu, on vaikuttava antigeeni, joka aiheuttaa immuniteettia eikä ole serologisesti ristiinreaktiivinen ihmisen kudosten, erityisesti sydämen, antigeenien kanssa.

5 Lisäksi tämän keksinnön tavoite on transformoitu isäntäbakteeri, erityisesti ei-virulentti enterobakteeri, joka huolimatta ei-virulenttisuudestaan aiheuttaa silti vasta-aineita. Tämän keksinnön tavoite on tarjota transformoitu ei-virulentti isäntäbakteeri, joka ei kolonisoidu 10 immunisoituvassa kohteessa vaan lisääntyy tarvittavassa rajoitetussa määrin vasta-aineiden aiheuttamiseksi.

Keksinnön eräs tavoite on Salmonella typhimuriumin transformaatio.

Lisäksi keksinnön tavoite on transformoitu ei-viru-15 lentti isäntäbakteeri, johon on kloonattu toisen bakteerin heterologinen nukleotidisekvenssi, joka koodaa ja joka tuottaa proteiiniantigeenin, joka pystyy aiheuttamaan op-sonisia vasta-aineita toista bakteeria vastaan.

Lisäksi keksinnön tärkeä tavoite on tarjota nuk-20 leotidisekvenssit geenille, joka koodaa ja joka ekspressoi toisen bakteerilajin antigeenit.

Lisäksi keksinnön tavoite on tarjota erilaisia muita geeniteknologiatuotteita, jotka johtavat transformoituun ei-virulenttiin kantajaan.

. 25 Lisäksi keksinnön tavoite on kloonata isäntäbaktee- * * · ** ·* riin nukleotidisekvenssit, joihin on koodattu immunogeeni- • · · • ·’ set polypeptidit, jotka pystyvät aiheuttamaan opsonisia *.V vasta-aineita streptokokki-infektioita, erityisesti strep- • · !.V tokokkiserotyyppejä 5, 6 ja 24, vastaan.

30 Lisäksi keksinnön tavoite on kloonata isäntäbaktee- ; riin nukleotidisenvenssit, joihin on koodattu E. colin * «· pinta-antigeeni, joka aiheuttaa adhesiivinvastaisia vasta-aineita .

Lisäksi keksinnön tavoitteena ovat geenitekniikan 35 vaiheet, jotka johtavat ei-virulentin bakteerin valmistamiseen .

7 97603

Lisäksi keksinnön tavoite on plasmidien ja muiden rakenteiden valmistus, joita tarvitaan kloonattaessa S. typhimurium-kantaan heterologinen nukleotidisekvenssi, joka tuottaa halutut streptokokki-M-proteiiniantigeenit.

5 Keksinnön tärkeä tavoite on tuottaa plasmideja, jotka sta-biilisti ekspressoituvat Aro" S. typhimurium SL3261:ssa.

Lisäksi esitetään nisäkkään, kuten ihmisen, immuni-saatiomenetelmä, jossa mainitulle nisäkkäälle annetaan riittävänä annoksena muodostamaan opsonisia vasta-aineita 10 ja aiheuttamaan systeeminen immuniteetti streptokokki-infektioita vastaan ylläkuvattua transformoitua ei-viru-lenttia bakteeria, joka sisältää heterologisen nukleotidi sekvenssin .

Keksinnön tärkeä aspekti on tarjota rokote, joka 15 antaa immuniteettia streptokokkityyppisiä suullisia infektioita vastaan.

Lisäksi keksinnön aspektina on tarjota ei-virulent-ti valmiste, jota kohde, jolle valmistetta annetaan, kestää hyvin.

20 Huomionarvoinen aspekti on se, että potilaan immu niteetti on systeeminen ja se syntyy suhteellisen nopeasti jopa suun kautta annettuna.

Muut keksinnön tavoitteet selviävät seuraavasta kuvauksesta. Muita ominaisuuksia ja etuja selviää seuraa- ‘4 , 25 vista esimerkeistä ja oheisesta piirroksesta jossa: kuvio 1 esittää Immunoblot-analyysiä tyyppi 5 M- * ♦ ♦ i ·* proteiinista, jota ekspressoi pMK 207-transformoitu Salmo- • 4 \V neliä typhimurium LB5000 (kaista 1) ja SL3261 (kaistat •V·· 2-6) .

30 Yllämainittujen patenttien ja muiden julkaisujen ; :’* lisäksi tämän keksinnön kuvauksessa huomioonotettu kirjal- ·*· ; lisuus sisältää muun muassa:

Beachey, et ai., "Repeating Covalent Structure and Protective Immunogenicity of Native and Synthetic Polypeptide 3 5 Fragments of Type 24 Streptococcal M Protein", J. Biol. Chem. Vol. 258, No 21 pp 13,250-13,257 (1983).

97603 8 van de Rijn, et ai., "Group A Streptococcal Antigens Cross-Reactive with Myocardium", J. Exp. Med., Vol. 146, pp 579-599 (1977).

van de Rijn, et al., "Immunochemical Analysis of Intact M 5 Protein Secreted From Cell Wall-Less Streptococci", Infect. Immun., Vol. 32, pp 86-91 (1981).

Edman and Begg, "A Protein Sequenator", European J. Bio-chem. Vol. 1, pp 80-91 (1967).

Phillips, et al., "Streptococcal M Protein: Helical Coiled 10 - Coil Structure and Arrangement on the Cell Surface",

Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 78, No 8 pp 4689-4693 (August 1981).

Laver, et al, "Antigenic Drift in Type A Influenza Virus: Peptide Mapping and Antigenic Analysis of A/PR/8/34(HON1) 15 Variants Selected with Monoclonal Antibodies", Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 76, No 3, pp 1425-1429 (March 1979). Atassi, "Antigenic Structure of Myoglobin: The Complete Immunochemical Anatomy of a Protein and Conclusions Relating to Antigenic Structures of Proteins", Immunochemist-20 ry, Vol. 12, pp 423-438 (1975). Rabat, Structural Concepts in Immunology and Immunochemistry, pp 89-100 (Holt, Rhine-hart & Winston, New York, (1968).

Nisonoff, Methods in Immunology and Immunochemistry, Vol.

1, pp 120-187 (1977).

i “ 25 Munoz, Methods in Immunology and Immunochemistry, Vol. 3, • · V.: pp 146-160 (1970) .

• · • Manjula and Fischetti, "Tropomyosin-like Seven Residue :V: Periodicity in Three Immunologically Distinct Streptococ- cal M Proteins and its Implications for the Antiphagocytic « t 30 Property of the Molecule", J. Exp. Med., Vol. 155, pp 695-708 (1980) .

Beachey and Stollerman, "Toxic Effects of Streptococcal M Protein on Platelets and Polymorphonuclear Leukocytes in Human Blood", J. Exp. Med. Vol. 134, pp 351-365 (1971).

35 Dale, et al., "Heterogenecity of Type-Specific and Cross- 9 97603

Reactive Antigenic Determinants Within a Single M Protein of Group A Streptococci”, J. Exp. Med. Vol. 155, pp 1026-1038 (1980).

Beachey, et al., "Purification and Properties of M Protein 5 Extracted from Group A Streptococci with Pepsin: Covalent Structure of the Amino Terminal Region of Type 24 M Antigen", J. Exp. Med. Vol. 145 pp 1469-1483 (1977).

Beachey, et al., "Primary Structure of Protective Antigens of Type 24 Streptococcal M Protein", J. Biol. Chem., Vol. 10 255, pp 6284-6289 (1980).

Beachey, et al., "Repeating Covalent Structure of Streptococcal M Protein", Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 75, pp 3163-3167 (1978).

Beachey, et al., "Human Immune Response to Immunization 15 with a Structurally Defined Polypeptide Fragment of Streptococcal M Protein", J. Exp. Med., Vol. 150, pp 862 (1979).

Brown, et al., "An Attenuated aroA Salmonella typhimurium Vaccine Elicits Humoral and Cellular Immunity to Cloned-20 Galactosidase in Mice", The Journal of Infectious Diseases, Vol. 155, No 1 (January 1987).

Tämä julkaisu käsittelee Salmonella typhimurium-kantaa SL3261 ja heikennettyä aroA rokotekantaa jota käytettiin kantajana plasmidi pXY411:lle.

’. . 25 Tämä Brownin et al julkaisu on tässä viitteenä.

• · · ;; Toinen kiinnostava julkaisu on Hoiseth and Stocker, "Aro- ·* matic-dependent Salmonella Typhimurium are Non-Virulent and Effective as Live Vaccines", Nature, Voi. 291 (May 21, • · V.· 1981); Smith, et al., "Aromatic-Dependent Salmonella Typ- 30 himurium are Non-Virulent and Effective as Live Vaccines", : Am. J. Vet. Res. Voi. 45, No 1 (January 1984) ; Smith et « · · al., "Vaccination of Calves Against Salmonella Dublin with Aromatic-Dependent Salmonella Typhimurium", Am. J. Vet. Res., Voi. 15, No 11 (November 1984); Maskell, et al., 35 "Attenuated Salmonella Typhimurium as Live Oral Vaccines 10 97603 and Carriers for Delivering Antigens to the Secretory Immune System", Vaccines 86 (Cold Spring Habor Laboratory 1986).

Yleisesti kiinnostavia patentteja geeniteknologian 5 alalla ovat muun muassa: US-patentti nro 4 428 941 otsikolla "Nucleotide Sequence Coding the Surface of the Hepatitis B Virus, Vector Containing Said Nucleotide Sequence, Process Allowing the Obtention Theoreof and Antigen Obtained Thereby", myön-10 netty Francis Galibertille, et al., 31.1.1984; US-patentti nro 4 518 584 otsikolla "Human Recombinant Interleukin-2 Muteins", myönnetty Markille, et ai., 21.5.1985; US-pa-tentti nro 4 588 585 otsikolla "Human Recombinant Cysteine Depleted Interferon-B Muteins", myönnetty Markille, et 15 ai., 13.5.1986; ja US-patentti nro 4 625 252 otsikolla "Recombinant Bacterial Plasmids Containing the Coding Sequences of Insulin Genes", myönnetty Rutterille, et al., 24.3.1987.

US-patentti nro 4 666 846 otsikolla "Novel Cloning 20 Vectors Containing Selectable Genetic Markers for Use in Streptomyces and Related Organisms", myönnetty Feyermanil-le, et al., 19.5.1987; ja US-patentti nro 4 666 847 otsikolla "Recombinant DNA Means and Methods", myönnetty Al-fordille, et al., 19.5.1987.

•# ^ 25 Keksinnön mukaisesti on edullista, että plasmidi * · · *·'·' johon on koodattu M-proteiinigeeni kloonataan ensin ja • · i V ekspressoidaan Escherichia colissa. Mitä tahansa kolifor- • · V.: miryhmän enterobakteeria voidaan käyttää, mutta E. coli on • » : yleensä edullisin. Sen jälkeen M-geenin sisältävä plasmidi 30 eristetään ja puhdistetaan ja sitten rakennetaan rakenne . haluttujen ei-virulenttien bakteereiden kuten aroA" S.

• · · ·. typhimurium (SL3261) transformoimiseksi. On huomattava että tässä mutanttikannassa on ravinteellinen merkkiaine PABA:lie ja 2,3-DHB:lle. Katso Brown et al., viite yllä. 35 On huomattava että toinen haluttu S. typhimurium-laji on 97603 11 recA" S. typhimurium, erityisesti kanta Ty21a. Katso Clements et ai., "Construction of a Potential Live Aro Vaccine for typhoid type fever and cholorea-E. coli-related diarrheas", Infect. Immun., 46:564-9 (1984). Katso myös 5 muut yllämainitussa Brown, et ai.-artikkelissa olevat viitteet, jotka myöskin sisällytetään tähän viitteinä.

On edullista ottaa M-proteiinigeeni virulentista S. pyogenes-kannasta. On kuitenkin mahdollista ottaa geeni heikennetystä ei-virulentista S. pyogenes-kannasta tai 10 jopa valmistaa nukleotidisekvenssi, johon on koodattu haluttu M-proteiini.

Tässä esitetyt rekombinantti-DNA-kloonausvektorit eivät rajoitu käytettäviksi yhteen Salmonella-lajiin tai -kantaan. Päinvastoin, vektorit ovat laajakäyttöisiä ja ne 15 voidaan transformoida muidenkin gram-negatiivisten bakteerien isäntäsoluissa, kuten Enterobacteriaceae-suvun (kuten Shigella ja Klebsiella, esim. Klebsiella pneumoniae, Ente-robacter kuten Enterobacter aerogenes). Salmonellae, kuten Salmonella arizona, ja Citrobacter voidaan käyttää jos ne 20 sopivasti tehdään ei-virulenteiksi tai heikennetään.

Yleisiä Salmonella-lajeja joita voidaan käyttää heikennettyinä ja ei-virulenteiksi saatettuina ovat mm seuraavat: S. paratyphi, S. schottmulleri, S. typhimurium, S. paratyphi C, S. choleraesuis, S. montevideo, S. new- • “ 25 port, S. typhi, S. enteritidis, S. galinarum, S. anatum.

Voidaan rekombinantti-DNA-vektorien isäntinä käyt- » · • V tää myös Streptococcus-suvun bakteereita jotka ovat ei- ♦ ♦ ::: virulentteja tai jotka on tehty ei-virulenteiksi tai hei- :Y: kennetty, mukaan lukien immunologisten ryhmien A-0 strep- • · 30 tokokit, mutta yleensä muiden kuin A:n. Sopivia Strepto- . .·. coccus-suvun bakteereita joita voidaan käyttää isäntäbak- • · · ,*·*. teereina ovat mm S. cremoris, S. faecalis, S. salivarisu, S. mitior, S. mitis, S. mutans, S. sanguis, viimeksimainitun ollessa nykyisin edullisin laji.

97603 12

Tunnetaan muitakin sopivia mikro-organismeja, joita voidaan heikentää ja transformoida. Katso Davis, et ai., Microbiology, (Harper & Row, Second edition, 1973) .

Yleisesti mikä tahansa enterobakteeri voi toimia 5 isäntäbakteerina. On edullista, että isäntäbakteeri säilyy hengissä kohteessa vain niin kauan, että se aiheuttaa op-sonisen reaktion, mutta yleensä voidaan käyttää mitä tahansa bakteerikantaa, joka on heikennetty niin, ettei se kolonisoidu mutta lisääntyy kuitenkin riittävästi aiheut-10 tamaan vasta-aineita vieraalle proteiinille. Keksinnön edullisessa toteutustavassa käytetään S. typhimurimin Aro_-kantaa, joka vaatii kahta metaboliittia, joita ei ole nisäkäskudoksissa, PABA ja 2,3-DHB. Sen seurauksena inoku-loidut bakteerit kuolevat useiden sukupolvien jälkeen näi-15 den metaboliittien puutteeseen. Katso yllämainittu Hoiseth ja Stocker.

Voidaan kuitenkin käyttää mitä tahansa mutatoitua mikrobia, jolla on ravintorajavuus sellaisten ravinteiden suhteen, joita ei myöskään ole immunisoitavan kohteen ku-20 doksissa, tai mikrobia, joka on tehty sellaiseksi geneettisellä manipuloinnilla.

On huomattava, että ei-virulentti aro”-Salmonella typhimurium SL3261, johon on transformoitu plasmidi, jossa on 5 M-proteiiniantigeenin koodaava rakenteellinen geeni, *. . 25 ekspressoi koko 5 M-proteiinimolekyylin, joka ekspressio • · · *·’·* rajoittuu melkein täysin S. typhimurium-soluplasmaosas- t » i ί ·* toon. On tämän keksinnön ainutlaatuinen ja odottamaton as- • · \V pekti, että immunogeeninen ja suojaava pinta-antigeeni, ♦ · kuten streptokokki-M-proteiiniantigeeni, ilmenee ei-viru-30 lentin isäntäbakteerin solulimassa.

: Niinpä voidaan nähdä, että haluttu nukleotidisek- venssi, johon on koodattu ja joka ekspressoi proteiinian-tigeenia, joka pystyy aiheuttamaan opsonisia vasta-aineita streptokokki-infektioita vastaan, erityisesti serotyyppiä 35 5 vastaan, voidaan kloonata eri isäntiin. Laajemmassa mie- 97603 13 lessä transformoidun kantajan, jossa nukleotidisekvenssi on replikaation jälkeen, ei tarvitse olla heterologinen nukleotidisekvenssin suhteen, eikä sekvenssin tarvitse olla heterologinen mikro-organismien suhteen.

5 Lämminverisen eläimen immunisaatiomenetelmän tietyn toteutustavan mukaisesti on osoitettu, että a) hiiret kestivät hyvin aina 1,65 x 109 peroraalisen annoksen mutanttia ei-virulenttia Salmonellaa joka sisälsi plasmidin pMK207, johon on koodattu serotyyppi 5 strepto- 10 kokki-M-proteiini; b) plasmidi pMK207 oli erittäin stabiili sekä in vitro että in vivo; c) hiiret jotka saivat suurimman annoksen (109) bakteereita pitivät mikro-organismia maksassaan jopa kolme viikkoa 15 ilman haittavaikutuksia; d) hiiret jotka immunisoitiin suun kautta ei-virulentilla transformoidulla Salmonellalla joka ekspressoi serotyyppi 5 streptokokki-M-proteiiniantigeenigeeniä kehittivät jo kolmen viikon kuluttua opsonisia seerumivasta-aineita se- 20 rotyyppi 5 streptokokkeja vastaan; ja e) immunisoidut hiiret olivat täysin suojattuja kolmen viikon kuluttua homologisen serotyyppi M 5 (muttei hetero- logisen serotyyppi M 24) streptokokin intraperitoneaalisia hyökkäyksiä vastaan. On huomionarvoista, että mitään ris- *. . 25 tiinreaktiivista immuniteettia ei havaita, kun keksinnön • · · ; mukaisesti valmistettua valmistetta annetaan suun kautta.

• ♦ · ·* M-proteiiniantigeenin ilmeneminen sytoplasmaan ei-virulen- :.V tissa bakteerissa on erityisen hyödyllistä tässä suun • · kautta annetussa käytössä. Antigeeni on suojassa ei-viru- 30 lentin bakteerin sytoplasmassa vatsan hapoilta ja muilta : vahingoittavilta aineilta kunnes ei-virulentti solu kuolee ··· ja vapauttaa antigeenin, tavallisesti ohutsuoleen, edullisimpaan paikkaan antigeenien vapauttamiselle.

Edellä esitettyä ei-virulenttia bakteeria voidaan 35 käyttää myös isäntänä rekombinantti-DNA-kloonausvektoreil- 14 97603 le, jotka sisältävät nukleotidisekvenssejä, joihin on koodattu ja jotka ekspressoivat iitmiunogeenisiä polypeptidejä, jotka spesifisesti aiheuttavat immuniteettiä streptokokki-infektioita vastaan ja jotka eivät ole ristiinreaktii-5 visia ihmisen kudosten, erityisesti sydänkudoksen, antigeenien kanssa.

Keksinnön mukaisesti valmistettavia immunogeenisia polypeptidejä ovat mm synteettiset oligopeptidit, jotka ovat kopioita M-proteiinimolekyylien alueista, joista 10 puuttuu autoimmuunit epitoopit, kuten on kuvattu US-paten-tissa nro 4 284 537, myönnetty E. Beacheylle 18.8.1981, US-patentissa nro 4 454 121, myönnetty E. Beacheylle 12.6. 1984, US-patentissa nro 4 521 334, myönnetty E. Beacheylle 4.6.1985 ja US-patentissa nro 4 597 967, myönnetty E.

15 Beacheylle 1.7.1986, jotka kaikki sisällytetään tähän viitteinä.

Serotyyppi M 24 polypeptidien kykyä toimia kantajana hyvin multivalentille rokotteelle testataan muilla serotyyppi M polypeptidifragmenteilla.

20 On lisäksi mahdollista kloonata isäntäorganismiin yhdessä M-proteiinia ekspressoivan plasmidin kanssa plas-midi, joka ekspressoi kolmannen bakteerilajin antigeeniä. Tarkemmin E. coli-kannasta CSH50 kloonattu pSH-2 plasmidi on kloonattu Sai. typhimuriumiin, mikä saa isännän eks-25 pressoimaan E. coli 29 kilodaltonin pinta-antigeenia, joka • · · ; ; aiheuttaa Fim H antiadhesiivisia vasta-aineita. Nämä vas- • t « : ·’ ta-aineet eivät vain vaikuta E. colia vastaan, vaan vai- • · :.V kuttavat myös muita gram-negatiivisia bakteereita vastaan.

• · V.· Muita keksinnölle tyypillisiä etuja selviää seuraa- 30 vista ei-rajoittavista esimerkeistä.

: Esimerkki 1 • · · .'I'; Ei-virulentin isäntäbakteerin transformaatio strep- tokokki-M-proteiinin ilmentämiseksi Stockerin ja Hoseithin (viite yllä) kehittämä Salmonella typhimurium SL3261 aro‘-35 kanta valittiin, koska tämä mikrobin mutanttimuoto kykenee

II

97603 15 invaasioon aiheuttamatta sairautta. Tässä mutanttikannassa on ravinteellinen merkki sekä p-aminobentsoehapon (PABA) että 2,3-dihydrobentsoehapon (DHB) suhteen. Katso Stocker ja Hoseith, viite yllä.

5 M 5-proteiiniantigeenin rakenteellinen geeni (smp 5) kloonattiin ja ekspressoitiin E. coli LE392:ssa, kuten on kuvattu seuraavissa julkaisuissa: Kehoe et ai, "Cloning and Genetic Analysis of Serotype 5M Protein Determinant of Group A Streptococci: Evidence for Multiple Copies of the 10 M5 Determinant in the Streptococcus pyogenes Genome", Infect. Immun., Vol. 48, pp 190-197 (1985) ja Poirer, et al., "Expression of Protective and Cardiac Tissue Cross-Reactive Epitopes of Type 5 Streptococcal M Protein in Escherichia coli", Infect. Immun., Vol. 48, pp 198-203 15 (1985), jotka molemmat sisällytetään tähän viitteinä.

Plasmidi pMK207 eristettiin, puhdistettiin ja transformoitiin ensin Sai. typhimurium rm+ kantaan LB5000, kuten kuvataan julkaisussa Bullas ja Ryo, "Salmonella typhimurium LT2 Strains which are rm+ for all Three Chromo-20 somally Located Systems of DNA Restriction and Modification", J. Bacteriol. , Vol. 156, pp 471-474 (1983) ja Le-derberg ja Cohen, "Transformation of Salmonella typhimurium by Plasmid Deoxyribonucleic Acid", J. Bacteriol., Vol. 119 pp 1072-1074 (1974), jotka molemmat sisällytetään : ’·* 25 tähän viitteinä. LB5000:sta eristettyä ja puhdistettua » * V,: plasmidia käytettiin sitten transformoimaan aro” Sai. typ- : \'· himurium SL3261 käyttäen samoja yllämainittuja menetelmiä :Y: jotka on kuvannut Lederberg ja Cohen sekä Bullas ja Ryo.

• » .*·*; Transformoitu LB5000 ja SL3261 ekspressoivat koko • · 30 M 5-proteiinimolekyylin, kuten on demonstroitu Western Blot-analyysillä kokosolulysaateista (kuva 1; kaistat 1 ja ♦ · · 2). Tyypillinen M 5-proteiinitripletti (katso Poirer et ai., ja Kehoe et ai., viite yllä) liikkui nauhoina Mr 59, 56 ja 54k. Esitutkimukset Sai. typhimurium SL3261:n eks-35 pressoiman M 5-proteiinin paikan tutkimiseksi osoittivat, 97603 16 että rekombinanttiproteiini rajoittui melkein täysin sy-toplasmaosaan. SL3261 ekspressoi M 5-proteiinia stabiilis-ti myös ilman antibioottista painetta, toisin sanoen eks-pressio oli selvä viiden päivän ajan suoritettujen jatko-5 viljelyjen jälkeen, mikä edustaa noin 35 sukupolven kasvua (kuva 1; kaistat 3-8).

Esimerkki 2

Hiirten transformoidun Sai. typhimurium SL3261:n kestävyys 10 Alustavissa tutkimuksissa BALB/c-hiirille annettiin kasvavia annoksia SL-3261-pMK207 sen määrittämiseksi kes-täisivätkö eläimet transformoituja organismeja. Mikään hiiristä, jotka saivat enintään 1,65 x 109 organismia/suun kautta annettu annos, ei sairastunut tai kuollut 1, 3, 5 15 ja 10 viikon kuluttua inokulaatiosta. Kaksi hiirtä kustakin annostusryhmästä tapettiin ja niiden maksat, pernat ja suolet viljeltiin SL3261-pMK207 varten McConkeyn agarilla, joka sisälsi 50 mg/ml kanamysiinisulfaattia ja 10 mg/ml PABA ja DHB. Laktoosia fermentoimattomia pesäkkeitä voi-20 tiin viikon kuluttua eristää vain hiiristä, jotka saivat 106 organismia tai yli, ja kolmen viikon kuluttua vain niistä, jotka saivat 109 organismia (taulukko 1) . Kolmen viikon kuluttua isolaatteja ei löytynyt. Kolmen viikon kuluttua eristetyt pesäkkeet ekspressoivat koskematonta . 25 M 5-proteiinia, mikä osoittaa, että smp5 oli stabiili in , · 4 ’·** vivo (kuva 1; kaista 9). 1, 3, 5, 9, 10, 15 ja 20 viikon • « i ' ·' seerumeissa suun kautta inokuloiduista hiiristä osoitet- » · '.V tiin olevan vasta-aineita tyyppi 5 M-proteiinille ja tyy- # · V.* pin 5 streptokokeille ELISA:11a ja opsonaatiokokeilla 30 (taulukko 2). Syljessä, joka oli otettu hiiristä 20 viik- : :'· koa immunisaation jälkeen, osoitettiin myös olevan anti- ·»* M5-proteiinivasta-aineita, ensisijaisesti IgA-luokkaa (taulukko 3).

17 97603

Taulukko 1

Salmonella typhimurium SL3261 jakautuminen BALB/c hiirten elimissä suun kautta immunisaation jälkeen Salmonellan jakautuminen elimiin2 5 Inokulaatioannos' Suoli Maksa-sappirakko Perna

Alku Tehoste 1 2 3 1 2 3 1 2 3 viikkoa viikkoa viikkoa 1,7x10® 1,1x10® 2,1x10* <50 <50 4x102 3x102 <50 4x102 <50 <50

1,7x10® 1,1x10® <200 <50 ND1 2 8x102 <50 ND 4x101 <50 ND

1,7x103 1,1x103 <200 <50 ND 1x102 <50 ND 1x102 <50 ND

10 1,7x10® 1,1x10® <100 ND ND <50 ND ND <50 ND ND

1,7x104 5 1,1 x 104 <100 ND ND <50 ND ND <50 ND ND

1,7x10* 1,1x10* <100 ND ND <50 ND ND <50 ND ND

1. Hiirille annettiin sarjana 10-kertaisesti laimennettuja 15 suun kautta annettavia annoksia S. typhimurium kantaa SL3261 alkaen annoksesta 1,7 x 109 pesäkkeitä muodostavaa yksikköä (cfu) päivänä 1 (alkuannos) ja suun kautta annettava tehosteannos 1,1 x 109 cfu päivänä 5. Kukin annos oli suspensoitu 25 μΙΐΆΆη fosfaattipuskuroitua suolaliuosta 20 (PBS, pH 7,2), joka sisälsi 5 μq ml-1 kanamysiinisulfaattia ja 1 μg ml-1 paraminobentsoehappoa (PABA) ja 2,3-dihydro-bentsoehappoa (DHB). Hiiret tapettiin 1, 2 ja 3 viikkoa alkuannoksen antamisen jälkeen.

^ 2. Suoli (mahaportista peräsuoleen), maksa-sappirakko ja • * % I* 25 perna poistettiin aseptisesti, pantiin PBS:ään, homogenoi- • « % \ ;* tiin Cellector™: illa (100 mesh; Bellco) ja pantiin MacCon- 4 « ·

cey-agarmaljoille, jotka sisälsivät 10 μq ml-1 PABA ja DHB

a · · _. e t ·*·' 3a 50 μq ml 1 kanamysiiniä tai ei lainkaan kanamysuniä.

Ei määritetty.

2 « 3 >·· 4 « 1 · 5 « · · 1β 97603

Taulukko 2 M tyyppi 5 S. pyogenesin opsonisaatio hiiren anti-M5-proteiiniseerumilla, joka oli saatu suun kautta S. typhimurium SL3261-pMK207:llä immunisoiduista 5 BALB/c-hiiristä, ja niiden anti-pepM proteiini ELI- SA-tiitterit

Testiseerumi ELISA-tiitteri1 Opsonisaatioprosentti2 __IgA_IgG_IgM_tyyppi 5 tyyppi 24

Pre-immune <50 50 50 0 2 10 1 viikkoa 100 200 <50 4 4 3 " 400 400 <50 36 0 5 ” 800 800 <50 52 2 9 ” 100 1600 200 90 2 10 ” 50 800 400 92 2 15 15 ” 100 800 400 52 0 15 "3 800 12800 800 82 0 20 " <50 400 200 10 2 20 "3 400 3200 200 80 2

Anti-pepM54 ND5 ND ND 96 2 2 0 Anti-pepM24_ND_ND_ND_0_98_ ELISA-tiitterit määritettiin käyttäen immobilisoitua pepM5, joka oli reagoinut BALB/c hiiren anti-SL207-seeru-mien kanssa, jota seurasi peroksidaasikonjugoitu vuohen 25 anti-hiiri -IgA, -IgG tai -IgM. Kaikki hiiren antiseeru- • · 2 mit, jotka reagoivat immobilisoidun pepM24 kanssa antoivat • V tiitterin <50.

: 2. Opsonisaatio määritettiin kokonaisneutrof iiliprosentti- :V: na assosioituneiden streptokokkien kanssa.

• · 3 30 3. Hiiret tehostettiin 48 tuntia ennen verenottoa 50 jug:-

. 11a pepM5 0,1 ml:ssa fosfaattipuskuroitua suolaliuosta pH

• · · • · · .... 7,2.

4

Sekä anti-pep-M5 että anti-pep-M24 valmistettiin kaneissa toimiakseen positiivisena (homologinen reaktio) ja 35 negatiivisena (heterologinen reaktio) kontrolleina.

5

Vasta-ainearvoja kanin anti-pep-M5:lie tai anti-pep-M24:lle ei määritetty.

19 97603

Taulukko 3

Syljen vasta-ainereaktio1 MS-proteiinia vastaan BALB/c-hiirissä, jotka oli immunisoitu suun kautta S. typhimurium SL3261-pMK207:llä 5 ELISA-tiitteri2 pepM5 vastaan

Testiseerumi IgA IgA+lgG+IgM

Ennen immunisointia <4 <4 20 viikkoa3 32 32 10 20 viikkoa + tehoste4 64 128 1. Sylkeä kerättiin hiiristä ja yhdistettiin (neljä/ryhmä) ja annettiin intraperitoneaalisesti lisäten 0,1 ml 2 % pi-lokarpiinia 15 2. ELISA-tiitterit määritettiin käyttäen immobilisoitua pepM5, joka oli reagoinut syljen kanssa (sarjassa laimennettu kaksinkertaiseksi), jota oli kerätty BALB/c-hiiril-tä, jotka oli immunisoitu SL3261-pMK207:llä, jota seurasi peroksidaasikonjugoitu vuohen anti-hiiri -IgA:11a tai an-20 ti-hiiri -IgA + -IgG + IgM-seoksella 3. Hiiret immunisoitiin 20 viikkoa ennen syljen keräämistä (katso taulukko 2) 4. Hiiriin injektoitiin tehosteannos, jossa oli 50 μg

pepM5 0,1 ml:ssa fosfaattipuskuroitua suolaliuosta, pH

SS' 25 7,2, 60 tuntia ennen syljen keräämistä.

» ♦ · I 1. Esimerkki 3 • · ·

Ryhmä hiiriä inokuloitiin suun kautta kahdella an- • · ♦ *·1·1 noksella SL3261-pMK207 ja altistettiin 22 vuorokauden ku- • · · *.1·1 luttua ensimmäisestä annoksesta tyyppi 5 ja 24 streptoko- 30 keille; tai virulentille alkuperäiselle Sai. typhimurium t.j.i 1344:lie (taulukko 3). Kuten tuloksista voidaan helposti havaita, M 5 ekspressoivaa Sai. typhimurium-mutanttia saaneilla hiirillä oli täydellinen suoja tyyppi 5 streptokokkien intraperitoneaalista hyökkäystä vastaan mutta ei 35 tyyppi 24 streptokokkia vastaan. Myös kontrollihiiret, joita altistettiin intraperitoneaalisesti virulentille SL1344 Sai. typhimuriumilie, olivat suojattuja. Tyyppi 5 20 97603 saaneilla hiirillä oli suoja annosta vastaan, joka ylitti LD50-arvon 100-kertaisesti (taulukko 4) . Tämä suojaus tyyppi 5 streptokokkien hyökkäystä vastaan osoittaa, että saatu immuniteetti on systeeminen.

5 Taulukko 4

Altistaminen M tyyppi 5 ja tyyppi 24 streptokokeille tai S. typhimurium SL1344:lle intraperitoneaali-sella injektiolla BALB/c-hiirissä, jotka on immunisoitu suun kautta1 elävillä tyyppi 5 M-proteiinia 10 ekspressoivalla pMK207 transformoidulla aro" S.

typhimurlumilla

Altistusorganismit1 Annos2 Eloon jääminen4,5 _Immunisoimaton Immunisoitu M5 Streptococci l,7xl03 2/4 4/5 15 (Smith-kanta) l,7xl04 0/4 5/5 1,7x10* 0/4 5/5 M24 Streptococci l,6xl05 1/3 1/3 (Vaughn-kanta) l,6xl06 0/3 0/3 1,6xl05 0/3 0/3 S. typhimurium 7,3x10' 0/3 3/3 (kanta SL1344) 7,3xl01 0/3 3/3 7,3xl02 0/3 3/3 20 1. Kukin immunisoitu hiiri sai 1,2 x 109 pMK207-transfor-moitua SL3261 S. typhimurium pesäkkeitä muodostavaa yksikköä (cfu) 22 vuorokauden kuluttua ja 1,6 x 109 cfu 17 vrk ennen altistusta. Kukin annos annettiin suun kautta sus- • · :.V 25 pensoituna 25 μΙΐΆΆη fosfaattipuskuroitua suolaliuosta, • · • V joka sisälsi 5 Mg/ml"' kanamysiinisulfaattia ja 1 jug/ml'1 • · paraminobentsoehappoa ja 2,3-dihydroksibentsoehappoa.

LD50 M5 ja M24-streptokokeille ja SL1344:lle BALB/c-hii- • · 2 rissä oli suunnilleen 2 x 103, 3 x 102 ja 1 x 10° cfu.

. 30 3. Annos määritettiin annettujen cfu: ien mukaan.

• · · .·;·. 4. Eloonjääminen määritettiin eloonjääneiden hiirten mää 3 ränä jaettuna altistettujen hiirten määrällä.

4

Kaikki kirjatut kuolemat tapahtuivat 3-6 vuorokautta 5 altistuksen jälkeen. Kaikki eloonjääneet hiiret vaikutti- 6 35 vat terveiltä vielä 30 vuorokautta altistuksen jälkeen.

97603 21

Ryhmälle BALB/c-hiiriä, jotka oli immunisoitu suun kautta SL3261-pMK207:llä annettiin intranasaalisesti tyyppi 5 tai 24 streptokokkeja tai virulenttia alkuperäistä Sai. typhi-murium 1344. Kuten taulukosta 5 voidaan helposti havaita, 5 vain ne hiiret, jotka oli immunisoitu suun kautta SL3261-pMK207:llä pystyivät selviytymään intranasaalisesta hyökkäyksestä annoksella homologisia organismeja, jotka muuten riittivät tappamaan kaikki immunisoidut eläimet. Lisäksi rekombinanttia M 5-proteiinia ekspressoivan Sai. typhimu-10 rium SL3251:n suoja on M-tyyppispesifistä, minkä osoittaa intranasaalisesti altistettujen hiirten kyvyttömyys kestää M-tyyppi 24 streptokokkeja. Se että hiiret olivat vastustuskykyisiä intranasaaliselle inokulaatille osoitti, että suun kautta immunisaatio M 5-proteiinia ekspressoivalla 15 Sai. typhimurium SL3251:llä riitti tuottamaan paikallisen immuniteetin.

Taulukko 5

Altistus intranasaalisella tyyppi 5 tai 24 streptokokki- tai Sai. typhimurium 1344-inokulaatiolla 20 BALB/c-hiirissä, jotka oli immunisoitu suun kautta1 elävällä tyyppi 5 M-proteiinia ekspressoivalla pMK207:lla transformoidulla aro" S. typhimurlumilla

Altistusorganismit2 Annos3_Eloon jääminen4·5_

Immunisoimaton Immunisoitu *.*. 25 M5 Streptococci 3,9xl07 0/4 6/6 ·*·’ (Smith-kanta) • · M24 Streptococci 3,5xl07 0/4 0/6 (Vaughn-kanta) » · · II S. typhimurium 4,3xl04 0/4 6/6 : : : 30 (kanta SL1344) • · * — * . 1. Kukin immunisoitu hiiri sai 1,2 x 109 pMK207-transfor- « · · III moitua SL3261 S. typhimurium pesäkkeitä muodostavaa yksikköä (cfu) päivänä 1 ja 1,6 x 109 cfu päivänä 5. Kukin annos 3 5 annettiin suun kautta suspensoituna 2 5 Ml:aan fosfaatti-puskuroitua suolaliuosta (PBS, pH 7,2), joka sisälsi 5 Mg/ ml-1 kanamysiinisulfaattia ja 1 /ig/ml-1 paraminobentsoehap-poa ja 2,3-dihydroksibentsoehappoa.

22 9 7 6 0 3 2. Altistusannos määritettiin annettuina cfurna, jotka oli annettu intranasaalisesti 20 Ml:ssa PBS (10 μΐ/sierain).

3. Hiiret altistetaan 13 viikkoa alkuperäisen immunisaation (eli päivän 1) jälkeen.

5 4. Eloonjääminen määritettiin eloonjääneiden hiirten mää ränä altistettujen hiirten määrää kohden.

5. Streptokokkikuolemat tapahtuivat 2-4 vuorokautta ja salmonellakuoleraat tapahtuivat 5-7 vuorokautta altistuksen jälkeen. Kaikki eloonjääneet hiiret vaikuttivat terveiltä 10 vielä 30 vuorokautta altistuksen jälkeen.

Ylläolevia esimerkkejä ei pidä ymmärtää rajoituksiksi, vaan ne ainoastaan kuvaavat keksintöä. Voidaan myös käyttää yhdistelmiä mistä tahansa määrästä minkä tahansa streptokokkiserotyyppi M-proteiiniantigeenin immunogeeni-15 siä polypeptidisekvenssejä kovalenttisesti kytkeytyneinä luonnolliseen tai synteettiseen kantajaan, jolloin muodostuu multivalentti rokote, joka on laajasti suojaava sero-tyyppi M Streptococcusta vastaan.

M-proteiinipolypeptidisekvenssiä voidaan myös käyt-20 tää kantajana, johon muut sekvenssit ovat kovalenttisesti kytkettyinä, mikä aiheuttaa opsonisen reaktion kaikille streptokokkiserotyypeille, joiden polypeptidejä on kytkeytyneinä kantajaan, samoin kuin streptokokkiserotyypille, jonka polypeptidi toimii kantajana.

*.*. 25 On myös mahdollista koodata sellaisen multivalentin • · ·.·. polypeptidin nukleotidisekvenssi S. pyogeneskromosomiin M-proteiinin strukturaalisen geenin alueelle, kloonata se > · · I plasmideihin ja transformoida plasmidit ei-virulenttiin • · · • * isäntäbakteeriin. Synteettiset nukleotidisekvenssit ovat 30 edullisia, mutta myös elävistä bakteerisoluista saatuja nukleotidisekvenssejä voidaan käyttää. Keksintö mahdol- • · · ’ : : listaa myös sellaisen geneettisen materiaalin, joka eks- pressoi immunogeenisia polypeptidejä, jotka aiheuttavat opsonisia reaktioita muille virulenteille bakteereille, 35 kloonaamisen ei-virulenttiin isäntäbakteeriin, joka on jo 23 97603 transformoitu ekspressoimaan immunogeenisia polypeptidejä, jotka aiheuttavat opsonisia reaktioita tyyppi M streptokokki-infektioita, ja molempien lajien polypeptidien kova-lenttisen kytkemisen. Syntyvä heikennetty ei-virulentti 5 isäntäorganismi voidaan antaa suun kautta laajaspektrisenä rokotteena, joka pystyy aiheuttamaan opsonisia reaktioita useampaa kuin yhtä bakteerilajia vastaan.

• · > • « 1 • » • · » · « • · « · • « « I I » • · • · • · · • · « • · • · · « · « · ·

Claims

97603 Patentt ivaat imukset 1. Menetelmä rokotteen valmistamiseksi nisäkkään immunisoimiseksi streptokokki-infektioita vastaan aikaan- 5 saamalla opsonisten vasta-aineiden muodostuksen streptokokki M-proteiiniantigeenia vastaan saamatta aikaan vasta-aineita, jotka ovat ristiin reagoivia sydänkudoksen antigeenien kanssa, tunnettu siitä, että transformoidaan elävä, ei-virulentti Salmonella-bakteeri, jossa on 10 mutaatiomuunnos, joka aiheuttaa ravintovajavuuden, plas-midilla pMK207, joka koodaa Streptococcus pyogenes-bak-teerin serotyyppi 5:stä peräisin olevan koko streptokokki M-proteiiniantigeenin, joka transformoitu bakteeri ilmentää mainitun antigeenin solunsisäisesti, jolloin annet-15 taessa se suun kautta nisäkkäälle, antigeeni vapautuu kuolevasta bakteerista ja saa aikaan opsonisten vasta-aineiden muodostuksen antigeeniä vastaan, jolloin syntyy immuniteettia mainituille opsonisille vasta-aineille herkkiä streptokokki-infektioita vastaan, jotka vasta-aineet eivät 20 ole ristiin reagoivia ihmisen sydänkudoksen antigeenien kanssa. 2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että transformoidaan aro' Salmonella typhimurium SL3261. • · • · t • · * • · • · » · « « · » · • · ' t · • * · • · • · « · ♦ • · · • · 0 0 0 0 • * · • · · ♦ ♦ * 25 97603

1. Förfarande för framställning av ett vaccin för immunisering mot streptokock-infektion, genom att framkal-5 la bildning av opsoniska antikroppar mot streptokock M-proteinantigen, utan att framkalla bildning av antikroppar som är korsreaktiva med hjärtvävnadsantigener, kanne-t e c k n a t därav, att man transformerar en levande, icke-virulent Salmonella-bakterie, som har en mutations-10 form som förorsakar en näringsdefekt, med en plasmid pMK207, som kodar hela streptokock-M-proteinantigenen som härstammar frän serotyp 5 av Streptococcus pyogenes, vil-ken transformerade bakterie uttrycker nämnda antigen in-tracellulärt, varvid antigenen frigörs ur den döende bak-15 terien och framkallar bildning av opsoniska antikroppar mot antigenen, dä man ger den via munnen lit ett däggdjur, varvid immunitet uppstär mot streptokock-infektioner som är sensitiva för nämnda opsoniska antikroppar, vilka inte korsreagerar med antigener i human hjärtvävnad. 20

2. Förfarande enligt patentkrav 1, känne- t e c k n a t därav, att man transformerar aro' Salmonella typhimurium SL3261. . # « > · a • « • · » » · p · t · · » · · » · • · 9 · · 9 9 9 0 0 0 9 9 0 9 0 0 909 990 * 9 9