FI92832C - Yleinen syöpään liittyvä SCM-tunnistustekijä, menetelmä sen valmistamiseksi ja sen käyttö - Google Patents
Yleinen syöpään liittyvä SCM-tunnistustekijä, menetelmä sen valmistamiseksi ja sen käyttö Download PDFInfo
- Publication number
- FI92832C FI92832C FI894220A FI894220A FI92832C FI 92832 C FI92832 C FI 92832C FI 894220 A FI894220 A FI 894220A FI 894220 A FI894220 A FI 894220A FI 92832 C FI92832 C FI 92832C
- Authority
- FI
- Finland
- Prior art keywords
- scm
- factor
- lymphocytes
- phe
- cancer
- Prior art date
Links
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 title claims description 189
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 title claims description 169
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 69
- 230000008569 process Effects 0.000 title claims description 5
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title description 18
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 claims description 193
- 230000004044 response Effects 0.000 claims description 76
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 64
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 64
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 60
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 48
- 230000007423 decrease Effects 0.000 claims description 40
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims description 35
- 230000003211 malignant effect Effects 0.000 claims description 31
- 238000002875 fluorescence polarization Methods 0.000 claims description 29
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 claims description 29
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 28
- 230000010287 polarization Effects 0.000 claims description 25
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims description 23
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 claims description 20
- 239000008280 blood Substances 0.000 claims description 20
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 claims description 19
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 claims description 19
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims description 19
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 claims description 19
- 239000000463 material Substances 0.000 claims description 19
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims description 18
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims description 18
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims description 18
- 238000010828 elution Methods 0.000 claims description 17
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 14
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 14
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 claims description 13
- 239000000725 suspension Substances 0.000 claims description 11
- 108010047620 Phytohemagglutinins Proteins 0.000 claims description 10
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 claims description 10
- 230000001885 phytohemagglutinin Effects 0.000 claims description 10
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 claims description 9
- 238000000926 separation method Methods 0.000 claims description 9
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 claims description 8
- 150000003863 ammonium salts Chemical class 0.000 claims description 8
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 claims description 8
- 239000002243 precursor Substances 0.000 claims description 8
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims description 7
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 claims description 7
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 claims description 7
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 claims description 7
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 claims description 7
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 claims description 6
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 claims description 6
- YCKRFDGAMUMZLT-UHFFFAOYSA-N Fluorine atom Chemical compound [F] YCKRFDGAMUMZLT-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 238000012937 correction Methods 0.000 claims description 5
- 239000011737 fluorine Substances 0.000 claims description 5
- 229910052731 fluorine Inorganic materials 0.000 claims description 5
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims description 5
- 238000012216 screening Methods 0.000 claims description 5
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 claims description 5
- 101100129088 Caenorhabditis elegans lys-2 gene Proteins 0.000 claims description 4
- 238000001914 filtration Methods 0.000 claims description 4
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 claims description 4
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 claims description 4
- JVIPLYCGEZUBIO-UHFFFAOYSA-N 2-(4-fluorophenyl)-1,3-dioxoisoindole-5-carboxylic acid Chemical compound O=C1C2=CC(C(=O)O)=CC=C2C(=O)N1C1=CC=C(F)C=C1 JVIPLYCGEZUBIO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 229920001425 Diethylaminoethyl cellulose Polymers 0.000 claims description 3
- 238000005349 anion exchange Methods 0.000 claims description 3
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 claims description 3
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 claims description 3
- 210000000066 myeloid cell Anatomy 0.000 claims description 3
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 claims description 3
- 238000010612 desalination reaction Methods 0.000 claims description 2
- 230000007071 enzymatic hydrolysis Effects 0.000 claims description 2
- 238000006047 enzymatic hydrolysis reaction Methods 0.000 claims description 2
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 claims description 2
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 claims description 2
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 claims 2
- 239000003226 mitogen Substances 0.000 claims 2
- 108010033737 Pokeweed Mitogens Proteins 0.000 claims 1
- 235000005911 diet Nutrition 0.000 claims 1
- 230000000378 dietary effect Effects 0.000 claims 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 47
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 45
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 36
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 description 30
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 description 29
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N Trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 26
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 24
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 21
- 208000031339 Split cord malformation Diseases 0.000 description 20
- 238000004007 reversed phase HPLC Methods 0.000 description 20
- 230000036210 malignancy Effects 0.000 description 19
- 206010058467 Lung neoplasm malignant Diseases 0.000 description 15
- 201000005202 lung cancer Diseases 0.000 description 15
- 208000020816 lung neoplasm Diseases 0.000 description 15
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 14
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 14
- CHADEQDQBURGHL-UHFFFAOYSA-N (6'-acetyloxy-3-oxospiro[2-benzofuran-1,9'-xanthene]-3'-yl) acetate Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC=C(OC(C)=O)C=C1OC1=CC(OC(=O)C)=CC=C21 CHADEQDQBURGHL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 13
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 13
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 13
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 12
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 12
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 11
- 210000000481 breast Anatomy 0.000 description 11
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 11
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 10
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 9
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 9
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 9
- 230000000394 mitotic effect Effects 0.000 description 9
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 9
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 9
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 9
- 206010009944 Colon cancer Diseases 0.000 description 8
- GUBGYTABKSRVRQ-WFVLMXAXSA-N DEAE-cellulose Chemical compound OC1C(O)C(O)C(CO)O[C@H]1O[C@@H]1C(CO)OC(O)C(O)C1O GUBGYTABKSRVRQ-WFVLMXAXSA-N 0.000 description 8
- 208000029742 colonic neoplasm Diseases 0.000 description 8
- GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N fluorescein Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 8
- 239000012501 chromatography medium Substances 0.000 description 7
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 7
- 201000001441 melanoma Diseases 0.000 description 7
- 238000004645 scanning capacitance microscopy Methods 0.000 description 7
- 238000013068 supply chain management Methods 0.000 description 7
- ATRRKUHOCOJYRX-UHFFFAOYSA-N Ammonium bicarbonate Chemical compound [NH4+].OC([O-])=O ATRRKUHOCOJYRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 229910000013 Ammonium bicarbonate Inorganic materials 0.000 description 6
- 235000012538 ammonium bicarbonate Nutrition 0.000 description 6
- 239000001099 ammonium carbonate Substances 0.000 description 6
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 6
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 6
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 6
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 6
- 206010008342 Cervix carcinoma Diseases 0.000 description 5
- 206010023825 Laryngeal cancer Diseases 0.000 description 5
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 5
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 5
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 5
- 208000006105 Uterine Cervical Neoplasms Diseases 0.000 description 5
- 239000002246 antineoplastic agent Substances 0.000 description 5
- 201000010881 cervical cancer Diseases 0.000 description 5
- 230000008859 change Effects 0.000 description 5
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 5
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 5
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 5
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 5
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 description 5
- 206010023841 laryngeal neoplasm Diseases 0.000 description 5
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 5
- XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N Iron Chemical compound [Fe] XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 4
- 230000009260 cross reactivity Effects 0.000 description 4
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 4
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 4
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 4
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 4
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 4
- 238000012552 review Methods 0.000 description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 4
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 4
- 238000010998 test method Methods 0.000 description 4
- CWERGRDVMFNCDR-UHFFFAOYSA-N thioglycolic acid Chemical compound OC(=O)CS CWERGRDVMFNCDR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 4
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 101100228200 Caenorhabditis elegans gly-5 gene Proteins 0.000 description 3
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 3
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 3
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 3
- 238000011033 desalting Methods 0.000 description 3
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 3
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 3
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 3
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 3
- WROMPOXWARCANT-UHFFFAOYSA-N tfa trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F.OC(=O)C(F)(F)F WROMPOXWARCANT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 3
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 3
- WFIYPADYPQQLNN-UHFFFAOYSA-N 2-[2-(4-bromopyrazol-1-yl)ethyl]isoindole-1,3-dione Chemical compound C1=C(Br)C=NN1CCN1C(=O)C2=CC=CC=C2C1=O WFIYPADYPQQLNN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000030507 AIDS Diseases 0.000 description 2
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- PUUPMDXIHCOPJU-HJGDQZAQSA-N Asn-Thr-Lys Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)N)N)O PUUPMDXIHCOPJU-HJGDQZAQSA-N 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010004146 Basal cell carcinoma Diseases 0.000 description 2
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 2
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 2
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 2
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 2
- 108010033276 Peptide Fragments Proteins 0.000 description 2
- 102000007079 Peptide Fragments Human genes 0.000 description 2
- 206010041067 Small cell lung cancer Diseases 0.000 description 2
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 230000000735 allogeneic effect Effects 0.000 description 2
- 230000001093 anti-cancer Effects 0.000 description 2
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 2
- 229910021538 borax Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000005907 cancer growth Effects 0.000 description 2
- 230000000711 cancerogenic effect Effects 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 238000004590 computer program Methods 0.000 description 2
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 2
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 2
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 2
- 239000000287 crude extract Substances 0.000 description 2
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 2
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 2
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 2
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 2
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 2
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 210000003470 mitochondria Anatomy 0.000 description 2
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 2
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 2
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 2
- 238000003127 radioimmunoassay Methods 0.000 description 2
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 208000020352 skin basal cell carcinoma Diseases 0.000 description 2
- 208000000587 small cell lung carcinoma Diseases 0.000 description 2
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 235000010339 sodium tetraborate Nutrition 0.000 description 2
- 230000003595 spectral effect Effects 0.000 description 2
- 239000008227 sterile water for injection Substances 0.000 description 2
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 2
- BSVBQGMMJUBVOD-UHFFFAOYSA-N trisodium borate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]B([O-])[O-] BSVBQGMMJUBVOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DEXFNLNNUZKHNO-UHFFFAOYSA-N 6-[3-[4-[2-(2,3-dihydro-1H-inden-2-ylamino)pyrimidin-5-yl]piperidin-1-yl]-3-oxopropyl]-3H-1,3-benzoxazol-2-one Chemical compound C1C(CC2=CC=CC=C12)NC1=NC=C(C=N1)C1CCN(CC1)C(CCC1=CC2=C(NC(O2)=O)C=C1)=O DEXFNLNNUZKHNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZKHQWZAMYRWXGA-KQYNXXCUSA-J ATP(4-) Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](COP([O-])(=O)OP([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O)[C@@H](O)[C@H]1O ZKHQWZAMYRWXGA-KQYNXXCUSA-J 0.000 description 1
- ZKHQWZAMYRWXGA-UHFFFAOYSA-N Adenosine triphosphate Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1OC(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)C(O)C1O ZKHQWZAMYRWXGA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010003011 Appendicitis Diseases 0.000 description 1
- 206010003445 Ascites Diseases 0.000 description 1
- 208000003174 Brain Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- UDMBCSSLTHHNCD-UHFFFAOYSA-N Coenzym Q(11) Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1OC(COP(O)(O)=O)C(O)C1O UDMBCSSLTHHNCD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010062580 Concanavalin A Proteins 0.000 description 1
- 239000012591 Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline Substances 0.000 description 1
- 229920001917 Ficoll Polymers 0.000 description 1
- KRHYYFGTRYWZRS-UHFFFAOYSA-M Fluoride anion Chemical compound [F-] KRHYYFGTRYWZRS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 206010060891 General symptom Diseases 0.000 description 1
- 101001094649 Homo sapiens Popeye domain-containing protein 3 Proteins 0.000 description 1
- 101000608234 Homo sapiens Pyrin domain-containing protein 5 Proteins 0.000 description 1
- 101000578693 Homo sapiens Target of rapamycin complex subunit LST8 Proteins 0.000 description 1
- 206010062016 Immunosuppression Diseases 0.000 description 1
- 208000007766 Kaposi sarcoma Diseases 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- 206010027476 Metastases Diseases 0.000 description 1
- 101100261242 Mus musculus Trdmt1 gene Proteins 0.000 description 1
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 1
- DTAFLBZLAZYRDX-UHFFFAOYSA-N OOOOOO Chemical compound OOOOOO DTAFLBZLAZYRDX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010033128 Ovarian cancer Diseases 0.000 description 1
- 206010061535 Ovarian neoplasm Diseases 0.000 description 1
- LUNBMBVWKORSGN-TYEKWLQESA-N P-factor Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@@H]1CCCN1C(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H]1N(C(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=2C=CC=CC=2)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC=2C3=CC=CC=C3NC=2)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=2C=CC=CC=2)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)[C@@H](N)[C@@H](C)O)[C@@H](C)O)C(C)C)CCC1 LUNBMBVWKORSGN-TYEKWLQESA-N 0.000 description 1
- 101800002502 P-factor Proteins 0.000 description 1
- 102100039889 Pyrin domain-containing protein 5 Human genes 0.000 description 1
- 101001009851 Rattus norvegicus Guanylate cyclase 2G Proteins 0.000 description 1
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 1
- SBMNPABNWKXNBJ-BQBZGAKWSA-N Ser-Lys Chemical compound NCCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CO SBMNPABNWKXNBJ-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000000453 Skin Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 208000034254 Squamous cell carcinoma of the cervix uteri Diseases 0.000 description 1
- 239000004809 Teflon Substances 0.000 description 1
- 229920006362 Teflon® Polymers 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 1
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 1
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 1
- 229960000583 acetic acid Drugs 0.000 description 1
- 208000009956 adenocarcinoma Diseases 0.000 description 1
- UDMBCSSLTHHNCD-KQYNXXCUSA-N adenosine 5'-monophosphate Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(O)=O)[C@@H](O)[C@H]1O UDMBCSSLTHHNCD-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 1
- 229950006790 adenosine phosphate Drugs 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 230000004075 alteration Effects 0.000 description 1
- 238000005571 anion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 208000021780 appendiceal neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 235000021028 berry Nutrition 0.000 description 1
- 239000013060 biological fluid Substances 0.000 description 1
- 238000001574 biopsy Methods 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 238000010241 blood sampling Methods 0.000 description 1
- 201000008274 breast adenocarcinoma Diseases 0.000 description 1
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 1
- 231100000357 carcinogen Toxicity 0.000 description 1
- 231100000315 carcinogenic Toxicity 0.000 description 1
- 239000003183 carcinogenic agent Substances 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 201000006612 cervical squamous cell carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 description 1
- 229940044683 chemotherapy drug Drugs 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 210000001072 colon Anatomy 0.000 description 1
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 description 1
- 230000008602 contraction Effects 0.000 description 1
- 239000013256 coordination polymer Substances 0.000 description 1
- 239000006071 cream Substances 0.000 description 1
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 1
- 208000035250 cutaneous malignant susceptibility to 1 melanoma Diseases 0.000 description 1
- 208000030381 cutaneous melanoma Diseases 0.000 description 1
- 125000004122 cyclic group Chemical group 0.000 description 1
- 210000003104 cytoplasmic structure Anatomy 0.000 description 1
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 1
- 229940127089 cytotoxic agent Drugs 0.000 description 1
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 238000000354 decomposition reaction Methods 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 230000007123 defense Effects 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 1
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 1
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 1
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000013213 extrapolation Methods 0.000 description 1
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 1
- 238000004334 fluoridation Methods 0.000 description 1
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 1
- 210000000232 gallbladder Anatomy 0.000 description 1
- 238000012812 general test Methods 0.000 description 1
- 239000012362 glacial acetic acid Substances 0.000 description 1
- 230000003301 hydrolyzing effect Effects 0.000 description 1
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 230000001506 immunosuppresive effect Effects 0.000 description 1
- 238000002513 implantation Methods 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 238000007689 inspection Methods 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 229910052742 iron Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 238000011005 laboratory method Methods 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 210000000207 lymphocyte subset Anatomy 0.000 description 1
- 239000008176 lyophilized powder Substances 0.000 description 1
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 1
- 210000001700 mitochondrial membrane Anatomy 0.000 description 1
- 108010081910 neoplasm-associated factor Proteins 0.000 description 1
- 238000004848 nephelometry Methods 0.000 description 1
- 150000002825 nitriles Chemical class 0.000 description 1
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000012299 nitrogen atmosphere Substances 0.000 description 1
- 238000011275 oncology therapy Methods 0.000 description 1
- 210000003463 organelle Anatomy 0.000 description 1
- 238000003359 percent control normalization Methods 0.000 description 1
- 210000001539 phagocyte Anatomy 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N phenylalanine group Chemical group N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)O COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- ZWLUXSQADUDCSB-UHFFFAOYSA-N phthalaldehyde Chemical compound O=CC1=CC=CC=C1C=O ZWLUXSQADUDCSB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 1
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 1
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 1
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 1
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 description 1
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 1
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 1
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 239000012266 salt solution Substances 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 238000004088 simulation Methods 0.000 description 1
- 201000000849 skin cancer Diseases 0.000 description 1
- 239000011877 solvent mixture Substances 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- LXMSZDCAJNLERA-ZHYRCANASA-N spironolactone Chemical compound C([C@@H]1[C@]2(C)CC[C@@H]3[C@@]4(C)CCC(=O)C=C4C[C@H]([C@@H]13)SC(=O)C)C[C@@]21CCC(=O)O1 LXMSZDCAJNLERA-ZHYRCANASA-N 0.000 description 1
- 238000003892 spreading Methods 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 1
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 208000011580 syndromic disease Diseases 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 1
- 150000003587 threonine derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 1
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 1
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000007817 turbidimetric assay Methods 0.000 description 1
- 208000000143 urethritis Diseases 0.000 description 1
- 239000008215 water for injection Substances 0.000 description 1
- -1 water molecules Chemical class 0.000 description 1
- 229910052724 xenon Inorganic materials 0.000 description 1
- FHNFHKCVQCLJFQ-UHFFFAOYSA-N xenon atom Chemical compound [Xe] FHNFHKCVQCLJFQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
- C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
- C07K7/08—Linear peptides containing only normal peptide links having 12 to 20 amino acids
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
- A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
- A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
- A61K47/6845—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a cytokine, e.g. growth factors, VEGF, TNF, a lymphokine or an interferon
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
- C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
- C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
- C07K14/4745—Cancer-associated SCM-recognition factor, CRISPP
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Immunology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Oncology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Description
92832
Yleinen syöpään liittyvä SCM-tunnistustekijä, menetelmä sen valmistamiseksi ja sen käyttö
Keksinnön tausta 5 Monet ihmisissä ja eläimissä esiintyvät sairaudet voidaan osoittaa erityisesti sairauteen tai vointiin liittyvien vieraiden aineiden esiintymisen perusteella, erityisesti jos ne esiintyvät veressä. Sellaisten tautien tuloksena syntyneisiin antigeeneihin tai muihin aineisiin 10 liittyvät testit ovat osoittautuneet lupaaviksi diagnostisiksi välineiksi taudin, jonka tuloksena antigeeni tai jokin muu aine syntyi, varhaiseksi osoittamiseksi. Sellaisten aineiden osoitusmenetelmien täytyy olla luotettavia, toistettavissa olevia ja herkkiä ollakseen käyttökel-15 poisia diagnostisia menetelmiä terveydenhuoltohenkilöstön käyttöön. Lisäksi kaikkien näiden menetelmien tulee olla sellaisia, että keskimääräinen laboratoriomenetelmiin perehtynyt alan ammattilainen voi ne nopeasti ja halvalla suorittaa.
20 Esimerkiksi erilaisten ihmisiä ja eläimiä vaivaa- vien pahanlaatuisten tautien, joihin viitataan yleisesti syöpänä, hoidossa on huomattu, että taudin aikainen havaitseminen on olennaisen tärkeätä taudin hoidossa erityisesti, koska useimmat terapeuttiset menetelmät tehoavat 25 paremmin ja ovat turvallisempia syövän sushteellisen varhaisessa vaiheessa kuin myöhemmin. Esimerkiksi monet kemo-terapeuttiset lääkkeet, jotka ovat myrkyllisiä pahanlaatuisille soluille, ovat myrkyllisiä myös normaaleille soluille ja näin ollen tarvitaan suurempia annoksia pidem-30 mälle edenneen syövän parantamiseen tai pysäyttämiseen, jolloin seurauksena voi olla epämiellyttäviä ja vakavia sivuoireita. Myös kirurginen hoito on useimmiten tehokasta vain ennen kuin tauti on levinnyt tai lähettänyt etäispesäkkeitä. Aivan liian moni syöpätapaus on havaittu te-35 hokkaan hoidon kannalta liian myöhään.
2 92832 Näin ollen on ollut ja tulee olemaan suuri tarve luotettavien testien, joilla voidaan diagnosoida syöpä sen varhaisessa vaiheessa, aikaansaamiseksi ja tällä alueella onkin tehty runsaasti tutkimustyötä. Tässä yhteydessä on 5 kehitteillä uusia testejä ja menetelmiä syövän varhaiseksi toteamiseksi.
Yksi sellaisen testin eniten halutuista ominaisuuksista on sen kyky joko osoittaa yleisesti kaikki syöpätyypit tai tietyt syövän tyypit käytetystä materiaalista 10 riippuen. Tällaisen testin ensin mainittu käyttömuoto on hyvin tärkeä suurien potilasryhmien massaseulonnoissa kuten rutiininomaisissa tarkastuksissa. Sellaisissa massa-seulonnoissa tietystä syöpätyypistä riippuvainen testi ei olisi toivottava, koska sananmukaisesti on olemassa sato-15 ja, jos ei tuhansia, syöpätyyppejä ja testillä, jolla voitaisiin osoittaa vain yksi tai muutama tautityyppi, jäisi havaitsematta monia syöpätyyppejä. Yleisesti ottaen näillä potilailla ei esiintyisi ollenkaan tai vain heikkoja yleisiä oireita, jotka voitaisiin helposti liittää tiettyyn 20 syöpätyyppiin ja näin ollen ei olisi perusteita epäillä jotakin tiettyä syöpätyyppiä eikä käyttää juuri tälle tyypille spesifistä testiä.
Sitä vastoin kun pahanlaatuisuus on voitu osoittaa tai sitä voidaan vahvasti epäillä, olisi edullista, jos 25 olisi olemassa testi, jolla voitaisiin osoittaa pahanlaatuisuuden tyyppi. Sellainen testi lisäisi huomattavasti hoidon tehokkuutta, koska monet tehokkaimmista syöpähoidoista, kuten kemoterapeuttiset aineet, ovat tehokkaita vain yhtä tai parhaimmillaan kapeata tyyppiryhmää vastaan " 30 ja vääränlaisesta kemoterapiasta voi olla enemmän haittaa kuin hyötyä.
Tämän tarpeen tyydyttämiseksi ja syövän diagnosoinnin ja varhaisen toteamisen parantamiseksi ihmis- ja eläin-ruumiissa on kehitetty testausmenetelmä, joka käsit-35 tää elävien lymfosyyttien sytoplasma-aineen (SCM) raken- 11 92832 3 teen muutosten mittaamisen, kun ne on altistettu joko fy-tohemagglutiinille tai syöpään liittyville antigeeneille. Tämä menetelmä on kuvattu L. Cercekin, B. Cercekin ja C.I.V. Franklinin julkaisussa "Biophysical Differentation 5 Between Lymphocytes from Healthy Donors, Patients with Malignant Diseases and Other Disorders", Brit J. Cancer 29, 345-352 (1974) ja L. Cercekin ja B. Cercekin julkaisussa "Application of the Phenomenon of Changes in the Structuredness of Cytoplasmic Matrix (SCM) in the 10 Diagnosis of Malignant Disorders: a Review", Europ. J.
Cancer 13, 903-915 (1977).
Tämän menetelmän mukaan potentiaalisesti SCM-vas-teeseen kykenevien lymfosyyttien alapopulaatio erotetaan testattavan potilaan verinäytteestä ja lymfosyyttejä in-15 kuboidaan yhdessä pahanlaatuisen kudoksen tai sen uutosten kanssa. Jos verinäytteen luovuttajalla on pahanlaatuinen tauti, tuloksena on tyypillinen SCM-vaste, joka voidaan erottaa sellaisten lymfosyyttien SCM-vasteesta, jotka on saatu luovuttajilta, joilla ei ole pahanlaatuista tautia. 20 SCM-vaste määritetään mittaamalla SCM-vasteen antavien lymfosyyttien solunsisäisen fluoreseiinin fluoresenssipolarisaation muutokset.
SCM-testissä havaittujen muutosten uskotaan kuvas-. tavan muutoksia lymfosyytin sisärakenteessa, kun lymfo- 25 syytti aktivoidaan synteesiä varten. Nämä muutokset havaitaan solujen fluoresenssipolarisaation laskuna, kun polarisoitua valoa käytetään läsnä olevan fluoreseiinin aktivoimiseen. Fluoresenssipolarisaatio mittaa solun sisäisen kiinteyden; mitä suurempi solun sisäinen liikkuvuus on 30 sitä vähemmän voidaan havaita fluoresenssipolarisaatiota. Fluoresenssipolarisaation havaitun vähenemisen uskotaan johtuvan muutoksista mitokondrioiden, solun energiaa tuottavien organellien, muodossa. Mitokondrion muutoksen uskotaan johtuvan kristojen tai mitokondriomembraanin sisäpoi-35 mujen kokoon vetäytymisestä. SCM kuvastaa makromolekyylien 4 92832 ja pienten molekyylien kuten vesimolekyylien, ionien, ade-nosiinitrifosfaatin ja syklisen adenosiinifosfaatin välisiä vuorovaikutussuhteita. Näiden vuorovaikutussuhteiden häiriöt johtavat muutoksiin SCM:ssa.
5 SCM-testi voi reagoida suhteellisen pieniin pahan laatuisten solujen määriin. Noin 109 solua 70 kg painavassa henkilössä on tarpeeksi aiheuttaakseen lymfosyyttien vasteen SCM-testissä pahanlaatuisuudelle ominaisella tavalla. Kun hiiriin siirretään vain 7,5 x 105 Ehrlichin vesivatsa 10 (kasvain) -soluja, vastemalli SCM-testissä muuttuu; syövälle tyypillisten antigeenien vaste indusoituu, kun taas fytohemagglutiinin normaalivaste käytännöllisesti katsoen eliminoituu (L. Cercek ja B. Cercek, "Changes in SCM-res-ponses of Lymphocytes in Mice After Implantation with Ehr-15 lich Ascites Cells", Europ. J. Cancer 17, 167-171 (1981).
SCM-testin avulla syöpä voidaan havaita jo varhaisessa vaiheessa, usein paljon nopeammin kuin mitä on mahdollista käytössä olevilla menetelmillä niin että potilaalle tuotetaan suhteellisen vähän epämukavuutta rajoit-20 tuen lähinnä vain verinäytteen ottamiseen liittyvään epämukavuuteen.
Kuitenkin tällä menetelmällä on haittapuolensa. Esimerkiksi se vaatii raakauutteiden valmistamista kasvain-kudoksista tai sen kaltaisista kudoksista tai kasvainku-25 doksen itsensä käyttämistä syöpään liittyvien antigeenien lähteenä. Pahanlaatuisen kudoksen tai sellaisen kudoksen uutteiden käyttöön SCM-testissä liittyy useita huomattavia ongelmia. Joskus on vaikeata saada vaadittua kudosmäärää. Myös kokonaisten kudosten tai kudosuutteiden käyttöön voi 30 liittyä häiritsevien ainesosien joutuminen testiin mukaan. Nämä häiritsevät ainesosat voivat vaikuttaa haitallisesti testin herkkyyteen tai itse testituloksiin. Näiden häiritsevien ainesosien läsnäolo tai puuttuminen voi vaihdella pahalaatuisen kudoksen erästä toiseen aiheuttaen epätoi-35 vottua muuntelua SCM-testissä. Lisäksi koska häiritsevät f) 92832 5 ainesosat ovat läsnä kokonaisessa kudoksessa tai raakauut-teissa, niitä on hyvin vaikeata identifioida tai mitata niiden määrää.
Näin ollen on hyvin toivottavaa identifioida, erot-5 taa ja puhdistaa tekijä tai tekijät, jotka aiheuttavat vasteen SCM-vasteeseen kykenevillä lymfosyyteillä. Sellaisen puhdistetun tekijän tai puhdistettujen tekijöiden käyttö parantaisi SCM-seulontatestiä, koska häiritseviä ainesosia ei olisi läsnä ja edesauttaisi syövän tutkimus-10 ta, sen syitä ja vaikutuksia ihmisen ja eläimen ruumiiseen.
Keksinnön tiivistelmä
Me olemme löytäneet syövän tunnistustekijöitä eläimen ja ihmisen ruumiinnesteistä, nimenomaan veriplasmasta 15 ja virtsasta, jotka, jos luovuttajaruumiissa on syöpä, antaa vasteen SCM-vasteeseen kykenevissä lymfosyyteissä, joka vaste on samanlainen kuin tällaisten lymfosyyttien vaste syöpään liittyviin uutteisiin ja/tai kasvainkudokseen SCM-testissä. Kuten tässä on kuvattu tekijät on ni-20 metty yksikkömuodossaan ja niihin viitataan "yleisenä syöpään liittyvänä SCM-tunnistustekijänä", "SCM-tunnistuste-kijänä" tai mieluiten "SCM-tekijänä".
SCM-tekijän uskotaan olevan peptidi tai peptidin kaltaista materiaalia ja käsittävän useita lähisukuisia 25 peptidejä. SCM-tekijän uskotaan sisältävän kolmentoista aminohapon fragmentin, jonka sekvenssi on R^Lys-Pro-Phe-R2-Phe-R3-Met-R4-R5-R6-R7, jossa R, on valikoitu ryhmästä, joka käsittää Asn:n ja Gln:n, R2, R3 ja R« jokainen erikseen on valikoitu ryhmästä, joka käsittää Val:n, Leu:n ja 30 Ile:n, R5 on valikoitu ryhmästä, joka käsittää Aspin ja Gluin ja Ra ja R7 on molemmat erikseen valikoitu ryhmästä, joka käsittää Asnin ja Ginin. Tämä sekvenssi ei sisällä SCM-tekijän aminopäätä.
Yleinen syöpään liittyvä SCM-tunnistustekijä käsit-35 tää olennaisena osanaan molekyylipainoltaan alhaisen pep- 6 92832 tidin, joka kykenee läpäisemään suodattimet, joiden nimellinen molekyylipainoraja on 1000 daltonia mutta ei suodattimia, joiden nimellinen molekyylipainoraja on 500 daltonia, ja joka aiheuttaa ainakin kymmenen prosentin vähene-5 misen SCM-vasteeseen kykenevien lymfosyyttien solunsisäi-sessä fluoresenssipolarisaatioarvossa tavanomaisessa SCM-testissä, jotka lymfosyytit on eristetty syöpää sairastavilta luovuttajilta. Edellä kuvatun menetelmän mukaisesti puhdistetun tekijän likimääräinen aminohappokoostumus on 10 Asx2, GlXj, Ser, His, Gly5, Thr, Arg, Ala3, Tyr, Met, Val3,
Phe3, Ile, Leu3, Lys2.
Perustuen SCM-tekijän tryptisten tekijöiden amino-happosekvenointiin yhden tekijävalmisteen kuudentoista aminohapon segmentin aminohapposekvenssi on seuraava: Phe-15 Asn-Lys-Pro-Phe-Val-Phe-Leu-Met-Ile-Asp-Gln-Asn-Phe-Ser-
Lys, johon sekvenssiin ei sisälly tekijän aminopäätä.
Vaihtoehtoisesti toisessa tekijävalmisteessa viidentoista aminohapon segmentti on seuraava: Phe-Asn-Lys-Pro-Phe-Val-Phe-Leu-Met-Ile-Asp-Gln-Asn-Thr-Lys, johon 20 segmenttiin ei myöskään kuulu tekijän aminopäätä.
Nämä kaksi tryptistä fragmenttia ovat täysin aktiivisia SCM-testissä. Uskotaan, että ensimmäiset kolmetoista aminohappoa, jotka ovat yhteisiä molemmille fragmenteille, . ovat tärkeimmät SCM-aktiivisuuden tuottajat. Näin ollen 25 tärkeä lisätekijä keksinnössä on SCM-tekijä, joka käsittää vain tarkkaan määritellyn sekvenssin peptidit, joilla on joko suoraan osoitettu olevan SCM-aktiivisuutta tai joilla uskotaan sellaista olevan. Laajimmin ilmaistuna sellainen tekijä käsittää olennaiselta osaltaan vain peptidit, johon 30 kuuluu ainakin kolmetoista aminohappotähdettä sisältäen sekvenssinPhe-R^Lys-Pro-Phe-Rj-Phe-Rj-Met-I^-Rj-I^-R,, jossa R, on valikoitu ryhmästä, joka käsittää Asn:n ja Gln:n, R2, R3 ja R<j ovat jokainen erikseen valikoitu ryhmästä, joka käsittää Val:n, Leu:n ja Ile:n, R5 on valikoitu ryhmästä, 35 joka käsittää Asp:n ja Glu:n ja R^ ja R7 ovat molemmat il 92832 7 erikseen valikoitu ryhmästä, joka käsittää Asn:n ja Gin:n. Mieluiten tämä tekijä sisältää olennaisena osanaan vain yhden peptidin.
Kun molempien tryptisten fragmenttien koko sekvens-5 si-informaatio käytetään, tuloksena on kaksi erillistä ja rinnakkaista SCM-tekijäluokkaa, joissa kummassakin on edellä määritelty kolmentoista aminohapon fragmentti.
Laajimmin ilmaistuna ensimmäinen luokka käsittää olennaiselta osaltaan vain peptidit, joissa on ainakin 10 viisitoista aminohappotähdettä sisältäen sekvenssin Phe-R,-Lys-Pro-Phe-R2-Phe-R3-Met-R4-R5-R6-R7-Rg-Lys, jossa R,-R7 on edellä määritelty ja Rg on valikoitu ryhmästä, joka käsittää Ser:n ja Thr:n. Mieluiten tämä tekijä sisältää olennaisena osanaan vain yhden peptidin.
15 Tässä luokassa tarkemmin määritelty tekijä käsittää olennaisena osanaan vain peptidit, jotka sisältävät sekvenssin Phe-Asn-Lys-Pro-Phe-Val-Phe-Leu-Met-Ile-Asp-Gln-Asn-Thr-Lys. Nämä peptidit voivat sisältää lisäksi reuna-sekvenssejä spesifioidun sekvenssin kummallakin sivulla. 20 Mieluiten tämä tekijä sisältää olennaisena osanaan vain yhden peptidin.
Tämän luokan tarkimmin määritelty tekijä käsittää olennaisena osanaan puhtaan peptidin, joka pääosaltaan . käsittää aminohapposekvenssin Phe-Asn-Lys-Pro-Phe-Val-Phe- 25 Leu-Met-Ile-Asp-Gln-Asn-Thr-Lys.
Laajimmin ilmaistuna toinen luokka käsittää olennaisena osanaan vain peptidit, joissa on ainakin kuusitoista aminohappotähdettä sisältäen sekvenssin Phe-Rj-Lys-Pro-Phe-R2-Phe-R3-Met-R4-R5-R6-R7-Phe-Rg-Lys, jossa R]-R7 on 30 määritelty edellä ja Rg on valikoitu ryhmästä, joka käsit tää Ser:n ja Thr:n. Mieluiten tämä tekijä sisältää olennaisena osanaan vain yhden peptidin.
Tässä luokassa tarkemmin määritelty tekijä käsittää olennaisena osanaan vain peptidit, jotka sisältävät sek-35 venssin Phe-Asn-Lys-Pro-Phe-Val-Phe-Leu-Met-Ile-Asp-Gln-
Asn-Phe-Thr-Lys. Nämä peptidit voivat sisältää lisäksi δ 92832 reunasekvenssejä spesifioidun sekvenssin jommalla kummalla sivulla. Mieluiten tämä tekijä sisältää olennaisena osanaan vain yhden peptidin.
Tämän luokan tarkimmin määritelty tekijä käsittää 5 pääosaltaan puhtaan peptidin, joka käsittää olennaisena osanaan aminohapposekvenssin Phe.-Asn-Lys-Pro-Phe-Val-Phe-Leu-Met-Ile-Asp-Gln-Asn-Phe-Thr-Lys. Edullisessa muodossaan tämän peptidin aktiivisuus SCM-testissä on sellainen, että 5 x 10'2 femtogrammaa peptidiä tuottaa ainakin 30 %:n 10 laskun polarisaatioarvossa kun käytetään syöpää sairastavilta luovuttajilta saatuja SCM-vasteeseen kykeneviä lymfosyyttejä.
SCM-tekijä voidaan tuottaa ultrasuodattamalla syöpää sairastavan luovuttajan ruumiinneste ruumiinnesteen 15 ensimmäisen fraktion, joka käsittää näennäiseltä molekyy-lipainoltaan yli 1000 daltonin molekyylit, erottamiseksi toisesta fraktiosta, joka käsittää näennäiseltä molekyyli-painoltaan alle 1000 daltonin molekyylit. Ruumiinneste on valikoitu ryhmästä, joka käsittää ääreisveren, virtsan ja 20 plasman. Edullisessa tapauksessa tekijä läpikäy ultrasuo-datuksen jälkeen vielä lisäpuhdistusprosessin, joka käsittää useita vaiheita niin että jokaisen vaiheen jälkeen tuloksena on edellistä puhtaampi tekijä.
. Tämän puhdistusprosessin ensimmäinen vaihe käsittää 25 eluoimisen geelisuodatinkolonnista, jonka fraktiointias-teikko ulottuu 0:sta noin 700 daltoniin ja joka kykenee erottelemaan suolat ultrasuodoksesta tekijän eluoituessa eluaatiotilavuudessa noin 0,3-0,5 kertaa kromatografia-alustan koko tilavuus.
30 Toinen vaihe käsittää eluoimisen geelisuodatusko- lonnista, jonka fraktiointiasteikko ulottuu noin 1500 dal-tonista noin 30 000 daltoniin tekijän eluoituessa kolonnista eluaatiotilavuudessa noin 0,4-0,6-kertaa kromatogra-fia-alustan koko tilavuus.
II
92832 9
Puhdistusprosessin seuraava vaihe käsittää eluoin-nin dietyyliaminoetyyliselluloosa-anioninvaihtokolonnista ammoniumbikarbonaatin noin 0,28-0,31 M:n pitoisuudessa.
Viimeinen vaihe käsittää tekijän puhdistamisen pää-5 osaltaan homogeeniseksi käänteisfaasi-korkeapaineneste- kromatografiällä.
Vaikka SCM-testissä on edullisinta käyttää puhtaimpia tekijävalmisteita, niin mistä tahansa puhdistusvai-heesta otettua tekijää, sisältäen myös ensimmäisen ultra-10 suodoksen, voidaan käyttää testissä.
SCM-tekijä antaa positiivisen vasteen potentiaalisesti SCM-vasteeseen kykenevissä lymfosyyteissä, jotka ovat peräisin luovuttajilta, jotka kärsivät monista erilaisista pahanlaatuisista taudeista, riippumatta luovut-15 tajan, josta SCM-tekijä on eristetty, sairastamasta syöpätyypistä; tästä johtuu termin "yleinen" käyttö. Tekijä ei aiheuta ollenkaan tai vain heikon SCM-vasteen lymfosyyteissä, jotka on eristetty luovuttajilta, joilla ei ole pahanlaatuista sairautta. Tämä kyky toimia yleisenä syö-20 pään liittyvänä antigeeninä, tekee tekijästä käyttökelpoi sen verinäytteiden seulontavälineen pahanlaatuisten sairauksien osoittamiseksi.
Tekijällä on muitakin mielenkiintoisia ominaisuuk-. siä. Yksi niistä on kyky muuttaa SCM-vasteeseen kykenevien 25 lymfosyyttien, jotka on saatu syöpää sairastamattomilta luovuttajilta, SCM-vastetta, kun tekijä saatetaan sellaisten lymfosyyttien yhteyteen, jolloin lymfosyytit reagoivat SCM-testissä syöpään liittyviin antigeeneihin mutta eivät reagoi mitoosia aiheuttaviin aineisiin kontaktin jälkeen.
30 Toinen ominaisuus on niiden kyky vähentää potentiaalisesti SCM-vasteeseen kykenevien lymfosyyttien spontaania in vitro -toksisuutta ihmisen myeloidisolulinjaa K 562 vastaan ainakin 90 %:lla mitattuna 5lCr:n vapautumisena.
Esillä olevan keksinnön toinen puoli kohdistuu me-35 netelmiin, joissa hyödynnetään yleistä syöpään liittyvää 10 92832 SCM-tekijää SCM-testissä. Yleisimmin tämä menetelmä käsittää nisäkäsluovuttajan lymfosyyttien testaamisen pahanlaatuisen sairauden toteamiseksi luovuttajassa (1) saattamalla lymfosyytit kosketuksiin yleisen syöpään liittyvän SCM-5 tunnistustekijän kanssa; ja (2) määrittämällä lymfosyyttien sytoplasma-aineen rakentuneisuuden lujuuden väheneminen, joka on seurausta lymfosyyttisuspension saattamisesta kosketuksiin SCM-tekijän kanssa.
Edullinen menetelmä rakentuneisuuden lujuuden vähe-10 nemisen määrän mittaamiseksi käsittää seuraavat vaiheet: (1) mittaamalla fluoresenssipolarisaatio, P8, lymfosyytti-määrästä, joka on ollut kosketuksissa yleisen syöpään liittyvän SCM-tunnistustekijän kanssa; (2) mittaamalla fluoresenssipolarisaatio, Pc, kontrollilymfosyyttimäärästä, 15 joka ei ole ollut kosketuksissa SCM-tekijän kanssa; ja (3) määrittämällä Ps:n suhde Pc:hen. Jos Ps:n suhde Pc:hen on pienempi kuin noin 0,9, se on osoituksena positiivisesta vasteesta SCM-tekijään ja pahanlaatuisesta sairaudesta lymfosyyttien luovuttajassa.
20 Vielä edullisempi menetelmä käsittää P5:n vertaami sen toisen lymfosyyttimäärän, joka on ollut kosketuksissa mitoosia aiheuttavan aineen, Pm, kanssa, fluoresenssipola-risaatioon SCM-vastesuhteen, RR^, määrittämiseksi, jossa: . R^scm = Pa/Pm· 25 Jos RRscm on vähemmän kuin 0,9, se on osoituksena siitä, että lymfosyyttien luovuttajalla on pahanlaatuinen sairaus.
Vaihtoehtoisesti menetelmä SCM-tekijän käyttämiseksi SCM-testissä voi käsittää seuraavat vaiheet: (1) poten-;; 30 tiaalisesti SCM-vasteeseen kykenevien lymfosyyttien erot tamisen verinäytteestä; (2) saattamalla erotetut lymfosyytit kosketuksiin yleisen syöpään liittyvän SCM-tunnistustekijän kanssa lymfosyyttien stimuloimiseksi; (3) saattamalla stimuloidut lymfosyytit kosketuksiin fluorogeenisen 35 tekijän prekursorin kanssa, määriteltynä ei-fluorogeeni- il 92832 11 seksi yhdisteeksi, joka voidaan hydrolysoida solunsisäi-sesti fluorogeeniseksi yhdisteeksi, jotta prekursori tunkeutuisi lymfosyyttien sisään, jotta tapahtuisi solunsi-säinen entsymaattinen hydrolyysi fluorogeenisen yhdisteen 5 aikaan saamiseksi, tällä tavalla synnyttäen stimuloituja fluoria sisältäviä lymfosyyttejä; (4) virittämällä stimuloidut fluoria sisältävät lymfosyyttejä polarisoidulla valolla saattaen ne tällä tavalla fluorisoimaan; (5) mittaamalla vertikaalisesti ja horisontaalisesti polarisoidut 10 fluoresenssiemissiot fluoresoivista lymfosyyteistä polari- saatioarvon määrittämiseksi fluoresoiville lymfosyyteille; ja (6) vertaamalla stimuloitujen fluoria sisältävien lymfosyyttien määritettyä polarisaatioarvoa saman luovuttajan kontrollilymfosyyttimäärän polarisaatioarvoon tällä taval-15 la osoittaen, onko lymfosyyttien luovuttajassa syöpä. Vaiheet (3) ja (4) voivat tapahtua samanaikaisesti.
Lymfosyytit voidaan virittää vertikaalisesti polarisoidulla valolla. Polarisaatioarvot käytettäessä vertikaalisesti polarisoitua valoa määritetään fluoresenssi-20 spektrofotometrillä seuraavan suhteen mukaan:
Iv - GIh P = _ : lv + GIh 25 jossa Iv ja IH ovat polarisoituja fluoresenssiarvoja vertikaalisessa ja horisontaalisessa tasossa, mainitussa järjestyksessä; ja G on korjauskerroin polarisoidun valon horisontaalisten ja vertikaalisten komponenttien spektro-30 fotometrin optisen systeemin epätasaisen läpäisyn huomioi- miseksi.
Lisäksi esillä oleva keksintö käsittää menetelmän syöpäsolujen paikallistamiseksi. Tämä menetelmä käsittää: (1) vasta-aineen liittämisen yleiseen syöpään liittyvään 35 SCM-tunnistustekijään yhdessä paikallistamisaineen kanssa; 92832 12 ja (2) liitetyn vasta-aineen käytön syöpäsolujen paikallistamiseen.
Esillä oleva keksintö käsittää vielä lisäksi menetelmän yleisen syöpään liittyvän SCM-tunnistustekijän ta-5 son määrittämisen ruumiinnesteessä käyttämällä vasta-ai netta yleiseen syöpään liittyvään tunnistustekijään immu-noanalyysissä. Immunoanalyysi voi olla radioimmunoanalyy-si, fluoresenssiimmunoanalyysi, entsyymisitoinen immuno-sorbenttianalyysi tai saostusimmunoanalyysi kuten nefelo-10 metrinen tai turbidimetrinen analyysi.
Nämä ja muut esillä olevan keksinnön ominaisuudet ja hyötypuolet tulevat paremmin ymmärretyiksi seuraavasta kuvauksesta ja liitteenä olevista patenttivaatimuksista.
Määritelmät 15 Seuraavassa kuvauksessa, esimerkeissä ja liitteenä olevissa patenttivaatimuksissa toistuvasti käytettyjen termien määritelmät on koottu yhteen mukavuussyistä seuraavassa .
"Yleinen”: Epäspesifinen joko ruumiinnesteen luo- 20 vuttajan, josta ruumiinnesteestä esillä olevan keksinnön mukainen SCM-tekijä on puhdistettu, tai lymfosyyttien, joita käytetään yhdessä tämän tekijän kanssa, luovuttajan sairastamaan syöpätyyppiin nähden.
"Fluoroaeenisen tekijän prekursori": Ei-fluorogee-25 ninen yhdiste, jonka lymfosyytit voivat ottaa sisäänsä ja muuttaa solunsisäisesti hydrolysoimalla fluorogeeniseksi yhdisteeksi, josta esimerkkinä tässä on käytetty fluore-seiinidiasetaattia tai FDA:ta.
"Standardi SCM-testi": SCM-testi, johon käytetään ;; 30 1.0 ml lymfosyyttisuspensiota tiheydellä 6 x 106 solua/ml ja 0.1 ml mitoosia aiheuttavaa ainetta tai antigeeniä yhdessä FDA:n kanssa, joka toimii fluorogeenisen tekijän prekursorina, ja jossa käytetään 470 nm:n viritysaallon-pituutta ja 510 nm:n emissioaallonpituutta fluoresenssi-35 polarisaatiomittauksissa.
92832 13 "Näennäinen molekyylipaino" ia Nimellinen molekvv-lipainoraia": Näiden molempien termien käyttö johtuu siitä, että molekyylien erottelu ultrasuodatuksella koon mukaan on likimääräistä sellaisille molekyyleille, joiden 5 kokoluokka vastaa SCM-tekijän kokoa ja riippuu sekä muodosta että koosta. Näin ollen ultrasuodatin, jonka nimellinen molekyylipainoraja on x daltonia, erottelee molekyylit, joiden näennäinen molekyylipaino on alle x daltonia, molekyyleistä, joiden näennäinen molekyylipaino on suurem-10 pi kuin x daltonia.
"Olennaiselta osaltaan puhdas yleinen syöpään liittyvä SCM-tunnistustekiiä": Materiaali, jolla on SCM-aktii-visuutta ja jonka puhtaus on sitä luokkaa, että ylivoimainen enemmistö muista molekyyleistä, joilla on spesifistä 15 biologista aktiivisuutta, käsittäen kaikki proteiinit ja suuremmat peptidit, puuttuvat materiaalista.
"Trvptinen peptidi": Peptidi, joka on katkaistu suuremmasta peptidistä proteolyyttisellä trypsiinientsyy-millä, joka katkaisee peptidiketjut lysiini-tai arginiini-20 tähteiden jälkeen.
Kuvaus edullisista toteutusmuodoista Tämä keksintö käsittää keksimämme ja pääosaltaan homogeeniseksi puhdistamamme peptidin, joka on yleinen .. syöpään liittyvä SCM-tunnistustekijä. Tekijä läpäisee suo- 25 dattimet, joiden nimellinen molekyylipainoraja on 1000 daltonia, mutta ei läpäise suodattimia, joiden nimellinen molekyylipainoraja on 500 daltonia. Tekijän likimääräinen aminohappokoostumus on seuraava: Asx2, Glx3, Ser, His, Gly5, Thr, Arg, Ala3, Tyr, Met, Val3, Phe3, Ile, Leu3, Lys2. Eri • 30 tekijävalmisteista on eristetty kaksi aktiivista tryptistä fragmenttia. Nämä fragmentit eivät sisällä alkuperäisen tekijämolekyylin aminopäitä. Näistä ensimmäisessä fragmentissa on viisitoista aminohappoa, jotka käsittävät sekvenssin Phe-Asn-Lys-Pro-Phe-Val-Phe-Leu-Met-Ile-Asp-Gln-35 Asn-Thr-Lys. Toisessa fragmentissa on kuusitoista amino- 14 92832 happoa, jotka käsittävät sekvenssin Phe-Asn-Lys-Pro-Phe-Val-Phe-Leu-Met-Ile-Asp-Gln-Asn-Phe-Ser-Lys.
Kuvauksen kohteena ovat tekijän eri ominaisuudet käsittäen tekijän kyvyn muuttaa lymfosyyttien, jotka ovat 5 peräisin pahanlaatuista tautia sairastamattomamilta luovuttajilta, SCM-vastetta ja kyvyn vähentää sellaisten lymfosyyttien in vitro sytotoksisuutta pahanlaatuisia soluja vastaan samoin kuin tekijän, joka on eristetty useita eri syöpätyyppejä sairastavilta luovuttajilta, ristiinreagoi-10 miskyvyn. Kuvauksen kohteena on myös menetelmä tämän tekijän pääpiirteissään homogeeninen puhdistaminen samoin kuin tämän tekijän käyttömenetelmät SCM-testissä. Kuvauksen kohteena ovat myös syöpäpotilaiden hoitomenetelmät vähentämällä tekijän in vivo -aktiivisuutta, menetelmä 15 syöpäsolujen paikallistamiseksi käyttämällä tekijän vasta-ainetta ja menetelmä anti-syöpäaineiden kohdistamiseksi syöpäsoluihin liittämällä vasta-aine tekijään yhdessä anti-syöpäaineiden kanssa.
SCM-tekijän ominaisuuksia 20 1. SCM-tekijän aminohappoanalyysi
Yleisen syöpään liittyvän SCM-tunnistustekijän, joka oli puhdistettu rintasyöpää sairastavien potilaiden plasmasta, määritettiin ja tulokset on esitetty Taulukossa , 1. RP-HPLC:lla puhdistetun tekijän lyofilisoidut näytteet 25 hydrolysoitiin 24 tunnin ajan 110 °C:ssa 6 N:ssa HCltssa, joka sisälsi 2 % tioglykolihappoa, umpeen sulatetuissa am pulleissa typpikehässä. Hydrolyysin jälkeen näytteet lyof ilisoitiin. Tähteet liuotettiin 2 %:sen natriumdodekyy-lisulfaatin kanssa 0,04 M:seen natriumboraattipuskuriin. 30 Aminohapot määritettiin o-ftaldialdehydijohdannaisina niiden fluoresenssin perusteella niiden HPLC-erottelun jälkeen kuten B. N. Jonesin, S. Paabon ja S. Steinin artikkelissa "Amino Acid Analysis and Enzymatic Sequence Determination of Peptides by an Improved o-Phthaldialdehyde 35 Precolumn Labeling Procedure", J. Liquid Chromat. 4, 565
If 92832 15 (1981) ja käsikirjassa "Amino Acid Analysis by HPLC", Al-tex Division, Beckman Instruments, Inc., Berkley, California 94710, on kuvattu.
5 TAULUKKO 1 SCM-tekijän suhteellinen molaarinen aminohappokoostumus 10 Aminohappo Suhteellinen molaarinen __koostumus_
Asx 2,10
Glx 3,20
Ser 1,27
His 0,55 15 Gly 4,60
Thr 1,11
Arg 0,86
Ala 2,60
Tyr 0,94 20 Met 1,58
Vai 3,22
Phe 3,07
Ile 0,86
Leu 2,87 25 _Ly s_ 1,86
Aminohappokoostumus määritettiin sen jälkeen, kun kuivattujen peptidien hydrolyysi 6 N:ssa HCl:ssa 2 %:sen : tioglykolihapon kanssa umpeen sulatetuissa lasiampulleissa 30 typpikehässä oli tapahtunut. Hydrolyysin jälkeen näytteet lyofilisoitiin ja tähde liuotettiin 2 %:isella SDS:lla 0.04 M:seen natriumboraattipuskuriin. Aminohapot määritettiin p-ftaalidialdehydijohdannaisina niiden fluoresenssin perusteella kuten käsikirjassa "Amino Acid Analysis by 16 92832 HPLC", Altex Division, Beckman Instruments, Inc. Berkeley, CA 94710, on kuvattu. Aminohappoja Cys ja Pro ei määritetty.
Taulukon 1 aminohappokoostumus osoittaa, että ak-5 tiivinen tekijä on peptidi. Tulokset ovat varsin yhteneväisiä peptidin kanssa, jonka likimääräinen aminohappo-koostumus on seuraava: Asx2, Glx3, Ser, His, Gly5, Thr, Arg, Ala3, Tyr, Met2, Val3, Phe3, Ile, Leu3, Lys2· 2. SCM-tekijän aminohapposekvenssi 10 SCM-tekijän kahdesta eri valmisteesta eristetyt aminohapposekvenssit määritettiin automatisoiduilla
Edman-hajoitusmenetelmillä käyttämällä Applied Biosystems 477A-proteiinisekvenaattoria, joka oli liitetty on-line -120A PTH-aminohappoanalysaattoriin. Kun koko SCM-tekijä, 15 joka oli eristetty useita eri syöpätyyppejä, kuten rinta-ja keuhkosyöpää, paksunsuolen, keuhkoputken tai kohdunkaulan syöpää, sairastavista potilaista, hajotettiin Edman-menetelmällä, ei syntynyt minkäänlaista reaktiota ja huomattiin, että SCM-tekijän aminopää oli suljettu. Sen 20 vuoksi molekyylien segmentin sekvenssin määrittämiseksi oli välttämätöntä saada aikaan fragmentti, jolla oli vapaa aminopään aminohappo. Sellaisia fragmentteja saatiin aikaan tekijän erotetuista puhdistetuista valmisteista tryp-tisen digestion avulla, jota seurasi tryptisten fragment-25 tien puhdistus käänteisfaasi-korkeapainenestekromatografi- alla kuten tarkemmin on kerrottu jäljempänä "Esimerkit" -osassa. Yksi näistä fragmenteista saatiin keuhkosyöpää sairastavien potilaitten plasmasta saadusta tekijävalmis-teesta, toinen rintasyöpää sairastavien potilaitten plas-·: 30 masta.
Jokaisessa tapauksessa kyseinen fragmentti, jolla myöhemmin osoitettiin olevan SCM-aktiivisuutta, eluoitui 30,4 tilavuusprosenttisena A-vaiheessa ja 69,6 tilavuusprosenttisena B-vaiheessa kokonaistilavuuden ollessa noin 35 30 μΐ. Sekventointia varten SCM-aktiivisuutta osoittavat ... tryptiset fragmentit vietiin sekvenaattorin levylle ja tl 92832 17 niille tehtiin tietokoneohjattu automatisoitu sekvenssi-analyysi peräkkäisinä Edman-hajoitussykleinä, joita seurasi tällä tavoin tuotettujen PTH-aminohappojen identifiointi mukaan liitetyssä on-line -PTH-aminohappoanalysaat-5 torissa.
Sekvenaattorin sekvenssin tunnistava tietokoneohjelma identifioi kuudentoista aminohapon sekvenssin SCM-tekijän, joka oli eristetty keuhkosyöpäpotilaiden plasmasta, fragmentin sekvenssin. Sekvenssi oli seuraavanlainen: 10 Phe-Asn-Lys-Pro-Phe-Val-Phe-Leu-Met-Ile-Asp-Gln-Asn-Phe-
Ser-Lys. Samalla tavalla tietokoneohjelma identifioi vii-dendentoista aminohapon sekvenssin tekijän fragmentille, joka oli eristetty rintasyöpäpotilaiden plasmasta. Sekvenssi oli seuraavanlainen: Phe-Asn-Lys-Pro-Phe-Val-Phe-15 Leu-Met-Ile-Asp-Gln-Asn-Thr-Lys.
Ensimmäiset kolmetoista aminohappoa näissä kahdessa tryptisessä fragmentissa ovat identtiset. Vaikka niiden karboksyylipäät ovat erilaiset, jos yksi puuttuva aminohappo, Phe, insertoidaan lyhyempään fragmenttiin, ainoa 20 ero sen jälkeen on Ser:n substituutio Thr:lla, joka on hyvin konservatiivinen substituutio, joka tuskin vaikuttaa peptidin toimintaan.
3. SCM-tekijän aktiivisuus SCM-testissä
Puhdistettu SCM-tekijä on täysin aktiivinen SCM-25 testissä, kun sitä käytetään lymfosyyttien, jotka on eris tetty useita eri pahanlaatuisia tauteja sairastavista potilaista, vastaisena tekijänä. Tämä aktiivisuus voidaan osoittaa analyysillä missä tahansa tekijän puhdistusvai-heessa. Tällaisten analyysien tulokset on kuvattu yksi-3 0 tyiskohtaisemmin jäljempänä •'Esimerkit" -osassa. Suurin aktiivisuus saavutetaan materiaalilla, joka on otettu viimeisen puhdistusvaiheen, käänteisfaasi-korkeapaineneste-kromatografiän, jälkeen. Yksi kymmenesosamillilitra tätä fraktiota, jonka likimääräinen proteiinisisältö on 40 pi-35 komoolia peptidiä, aiheuttaa solunsisäisessä fluoresenssi- 18 92832 polarisaatiossa jopa 44,6 %:n laskun, kun sitä käytetään SCM-vasteeseen kykeneviä lymfosyyttejä vastaan, jotka lymfosyytit on kerätty syöpäpotilailta, mutta ei aiheuta laskua solunsisäisessä fluoresenssipolarisaatiossa, kun sitä 5 käytetään samojen lymfosyyttien alapopulaatiota vastaan, joka on kerätty terveiltä luovuttajilta.
4. Tryptisten peptidien aktiivisuus SCM-testissä Sekä viidentoista aminohapon tryptinen peptidifrag-mentti, joka on katkaistu rintasyöpäpotilaiden (rintafrag-10 mentti) plasmasta eristetystä SCM-tekijästä että kuudentoista aminohapon tryptiset peptidifragmentit, jotka on katkaistu keuhkosyöpäpotilaiden (keuhkofragmentti) plasmasta eristetystä SCM-tekijästä, ovat täysin aktiivisia SCM-testissä. Noin 5 x 10'2 femtogrammaa keuhkofragmenttia 15 (toisin sanoen 5 x 10'17 grammaa tai noin 16 000 molekyyliä) oli täysin aktiivista SCM-testissä, kun sitä käytettiin lymfosyyttejä vastaan, jotka oli saatu syöpää sairastavilta luovuttajilta. Keuhkofragmentti reagoi samalla tavalla keuhkosyöpää sairastavien luovuttajien lymfosyytteihin 20 kuin rintasyöpää sairastavienkin, mutta ei antanut vastetta SCM-testissä, kun sitä käytettiin normaaliluovuttajilta saatuja lymfosyyttejä vastaan. Yksityiskohtaisempi kuvaus on annettu jäljempänä "Esimerkit" -osassa.
Koska sekä keuhko- että rintafragmentti ovat molem-25 mat yhtä aktiivisia SCM-testissä ja jakavat vain sekvens-sinsä ensimmäiset kolmetoista aminohappoa, uskotaan, että tämä yhteinen kolmentoista aminohapon sekvenssi on SCM-aktiivisuuden kannalta tärkein sekvenssi. Näin ollen vain näiden kolmentoista aminohapon sekvenssin, joka tässä on 30 nimetty "ytimeksi", Phe-Asn-Lys-Pro-Phe-Val-Phe-Leu-Met-
Ile-Asp-Gln-Asn, uskotaan myös omaavan SCM-aktiivisuutta. Tämä ei ole ainoa kolmentoista aminohapon sekvenssi, jonka uskotaan omaavan SCM-aktiivisuutta. Proteiini- ja pepti-dikemiassa hyvin tunnettu periaate on, että tiettyjä ami-35 nohapposubstituutioita, joita kutsutaan "konservatiivisik- 11 92832 19 si” aminohapposubstituutioiksi, voidaan usein tehdä peptidissä ilman, että sen paremmin peptidin muoto kuin sen toimintakaan muuttuu. Tällaiset ydinsekvenssissä oleviin aminohappoihin vaikuttavat muutokset käsittävät Ile:n ja 5 Leu:n korvaamisen Vai:11a ja päinvastoin, Asp:n korvaamisen Glu:lla ja päinvastoin ja Asn:n korvaamisen Gin:11a ja päin vastoin. Näin ollen uskotaan, että muutetut peptidi-molekyylit, joiden ydinrakenne on sellainen, että joku tai kaikki edellä kuvatut konservatiiviset aminohapposubsti-10 tuutiot on tehty, omaavat SCM-aktiivisuutta ja sen mukaisesti katsotaan osaksi tässä kuvattua keksintöä.
Keuhko- ja rintafragmentit on molemmat eristetty osana laajempaa yleistä syöpään liittyvää SCM-tunnistus-tekijää. Ilmeisesti sellaiset fragmentit voivat säilyttää 15 SCM-aktiivisuutensa, kun ne liitetään laajempaan molekyyliin. Sen vuoksi laajemman molekyylin, joka sisältää kolmentoista aminohapon sekvenssin, joka joko sisältää tai ei sisällä edellä kuvattuja konservatiivisia aminohapposubs-tituutioita, uskotaan myös omaavan SCM-aktiivisuutta.
20 Näiden kahden ydinsekvenssin muunnelman esiintymi nen tuo keksintöön mukanaan tärkeän lisänäkökohdan. Tämä on SCM-aktiivisuutta osoittava tekijä, joka käsittää vain tarkkaan määrätyn sekvenssin peptidit, joilla on joko suoraan osoitettu olevan SCM-aktiivisuutta tai niillä usko-25 taan sitä olevan. Laajimmin ilmaistuna sellainen tekijä käsittää olennaiselta osaltaan vain peptidit, joihon kuuluu ainakin kolmetoista aminohappotähdettä sisältäen sekvenssin Phe-R1-Lys-Pro-Phe-R2-Phe-R3-Met-R4-Rs-R6-R7, jossa R, on valikoitu ryhmästä, joka käsittää Asn:n ja Gin:n, R2, R3 30 ja R^ ovat jokainen erikseen valikoitu ryhmästä, joka käsittää Val:n, Leu:n ja Ile:n, R5 on valikoitu ryhmästä, joka käsittää Asp:n ja Glu:n ja R<5 ja R7 ovat molemmat erikseen valikoitu ryhmästä, joka käsittää Asn:n ja Gin:n. Mieluiten tämä tekijä sisältää olennaisena osanaan vain 35 yhden peptidin.
20 92832
Kun koko sekvenssi-informaatio keuhko- ja rinta-fragmenteista käytetään, lopputuloksena on kaksi erillistä ja rinnakkaista SCM-tekijäluokkaa, jotka kummatkin sisältävät ydinsekvenssin tai sekvenssin, joka on johdettu 5 ydinsekvenssistä konservatiivisin substituutioin. Näillä kummallakin pidemmällä peptidillä on lisämahdollisuus konservatiivisiin aminohapposubstituutioihin, nimittäin Ser:n korvaamiseen Thr:11a ja päinvastoin. Näiden kahden aminohapon samanarvoisuutta osoittaa se, että keuhkofragmentis-10 sa on Ser kun taas rintafragmentissa on Thr. Näiden kahden aminohapon paikat vastaavassa fragmentissa voidaan rinnastaa poistamalla Phe keuhkofragmentin kohdasta 14.
Näiden tekijöiden ensimmäinen luokka on johdettu rintafragmentin sekvenssistä Phe-Asn-Lys-Pro-Phe-Val-Phe-15 Leu-Met-Ile-Asp-Gln-Asn-Thr-Lys. Laajimmin ilmaistuna tämä luokka käsittää olennaisena osana vain peptidit, joissa on ainakin viisitoista aminohappotähdettä sisältäen sekvenssin Phe-R1-Lys-Pro-Phe-R2-Phe-R3-Met-R4-R5-R6-R7-R8-Lys, jossa R1-R7 on edellä määritelty ja R8 on valikoitu ryhmästä, joka 20 käsittää Ser:n ja Thr:n. Mieluiten tämä tekijä sisältää olennaisena osanaan vain yhden peptidin.
Tässä luokassa tarkemmin määritelty tekijä käsittää olennaisena osanaan vain peptidit, jotka sisältävät sek-. venssin Phe-Asn-Lys-Pro-Phe-Val-Phe-Leu-Met-Ile-Asp-Gln- 25 Asn-Thr-Lys. Tämä on rintafragmentin alkuperäinen sek venssi. Nämä peptidit voivat sisältää lisäksi reunasek-venssejä spesifioidun sekvenssin kummallakin sivulla ja nämä reunasekvenssit voivat olla pituudeltaan määrittelemättömiä. Mieluiten tämä tekijä sisältää olennaisena osa-;· 30 naan vain yhden peptidin.
Tämän luokan tarkimmin määritelty tekijä käsittää olennaisena osanaan puhtaan peptidin, joka pääosaltaan käsittää aminohapposekvenssin Phe-Asn-Lys-Pro-Phe-Val-Phe-Leu-Met-Ile-Asp-Gln-Asn-Thr-Lys. Tämä on rintafragmentin 35 tarkka sekvenssi ilman reunasekvenssejä.
il 21 92832 Näiden tekijöiden toinen luokka on johdettu keuhkofragmentin sekvenssistä Phe-Asn-Lys-Pro-Phe-Val-Phe-Leu-Met-Ile-Asp-Gln-Asn-Phe-Ser-Lys. Laajimmin ilmaistuna tämä luokka käsittää olennaisena osanaan vain peptidit, joissa 5 on ainakin kuusitoista aminohappotähdettä sisältäen sekvenssin Phe-R,-Lys-Pro-Phe-R2-Phe-R3-Met-R4-R5-R6-R7-Phe-R8-Lys. Tässä sekvenssissä R,-R7 on määritelty edellä ne heijastavat mahdollisia aminohapposubstituutioita ydinsek-venssissä, kun taas Rg on valikoitu ryhmästä, joka käsittää 10 Ser:n ja Thr:n. Mieluiten tämä tekijä sisältää olennaisena osanaan vain yhden peptidin.
Tässä luokassa tarkemmin määritelty tekijä käsittää olennaisena osanaan vain peptidit, jotka sisältävät sekvenssin Phe-Asn-Lys-Pro-Phe-Val-Phe-Leu-Met-Ile-Asp-Gln-15 Asn-Phe-Thr-Lys. Tämä on alkuperäinen keuhkofragmentin sekvenssi. Nämä peptidit voivat sisältää lisäksi reunasek-venssejä spesifioidun sekvenssin jommalla kummalla sivulla ja nämä reunasekvenssit voivat olla pituudeltaan määrittelemättömiä. Mieluiten tämä tekijä sisältää olennaisena 20 osanaan vain yhden peptidin. Tämän luokan tarkimmin määritetty tekijä käsittää pääosiltaan puhtaan peptidin, joka käsittää olennaisena osanaan aminohapposekvenssin Phe-Asn-Lys-Pro-Phe-Val-Phe-Leu-Met-Ile-Asp-Gln-Asn-Phe-Thr-Lys.
. Tämä on keuhkofragmentin tarkka sekvenssi ilman reunasek- 25 venssejä.
Kaikkien näiden fragmenttien oletetaan omaavan SCM-aktiivisuutta ja kuuluvat esillä olevan keksinnön piiriin.
5. SCM-tekijän ristiinreagoivuus
Tekijä on nimetty yleiseksi syöpään liittyväksi 30 SCM-tekijäksi, koska kaikkia syöpätyyppejä sairastavilta J luovuttajilta eristetyt lymfosyytit antavat tekijävasteen SCM-testissä. Lymfosyyttien luovuttajan sairastaman syöpätyypin ei tarvitse olla sama kuin ruumiinnesteen, josta SCM-tekijä on puhdistettu, luovuttajan sairastama syöpä-35 tyyppi. Kuten jäljempänä mainitaan tekijän puhdistaminen 22 92832 yhdeksäätoista eri syöpätyyppiä sairastavilta potilailta saadusta veriplasmasta johtaa aina tekijään, joka eluoituu samassa kohdassa käänteisfaasi-korkeapainenestekromato-grafiässä, viitaten voimakkaasti siihen, että sama tai 5 hyvin samanlainen molekyyli eristettiin kaikista näistä potilaista. Itse asiassa tryptisen fragmentin aminohap-posekvenointi SCM-tekijöistä, jotka on eristetty keuhko-ja rintasyöpää sairastavien potilaiden veriplasmasta osoittaa, että fragmenttien kolmetoista ensimmäistä aminohappoa 10 ovat samanlaiset. Näiden kahden sekvenssin ainoa ero on fenylalaniinitähteen deleetio keuhkofragmentin kohdassa 14 ja treoniinin konservatiivinen substituutio seriinillä seuraavassa kohdassa. SCM-tekijän ristiinreagoivuuden yksityiskohtainen kuvaus seuraa jäljempänä ’'Esimerkit” -15 osassa.
6. SCM-vasteen muuttaminen yleisellä syöpään liittyvällä SCM-tekijällä
Yleisellä syöpään liittyvällä SCM-tekijällä on kyky muuttaa potentiaalisesti SCM-vastetta omaavia lymfosyyt-20 tejä, jotka on saatu luovuttajilta, joilla ei ole pahanlaatuista sairautta, kun nänä lymfosyytit saatetaan kosketuksiin tekijän kanssa. Ennen kontaktia lymfosyytit reagoivat vain mitoosia aiheuttaville aineille SCM-testissä eivätkä reagoi syöpää aiheuttaviin antigeeneihin. Kuiten-25 kin pitkään kestäneen SCM-tekijän ja tällaisten lymfosyyt tien välisen kontaktin jälkeen lymfosyyttien vaste SCM-testissä muuttuu lymfosyyttien normaalista vasteesta, kun lymfosyytit ovat peräisin pahanlaatuista sairautta sairastama ttomattomil ta luovuttajilta verrattuna syöpää sairas-. 30 tavilta luovuttajilta peräisin olevien lymfosyyttien vas teeseen. Lymfosyyttien, jotka ovat peräisin pahanlaatuista tautia sairastamattomilta luovuttajilta, SCM-vasteen muutos on kuvattu yksityiskohtaisemmin jäljempänä "Esimerkit” -osassa.
• « 92832 23 7. Yleisen syöpään liittyvän SCM-tekijän vaikutus lymfosyyttien luonnolliseen sytotoksisuuteen SCM-tekijällä on kyky huomattavasti vähentää potentiaalisesti SCM-vasteeseen kykenevien lymfosyyttien spon-5 taania luonnollista in vitro -sytotoksisuutta. Tämän ominaisuuden perusteella uskotaan, että yleisen syöpään liittyvän SCM-tunnistustekijän molekyylit liittyvät syöpäsolujen puolustautumiseen tappajalymfosyyttejä vastaan ja tällä tavalla edesauttavat syöpäsolujen elossa pysymistä 10 ja rajoittamatonta kasvua. Immuunisysteemin normaalin toiminnan tärkeys syöpäsolujen kasvun kontrolloimisessa näkyy epätavallisten syövän muotojen tiheänä esiintymisenä potilaissa, jotka ovat immuunisuppressiohoidossa. Tärkeänä esimerkkinä tästä on Kaposin sarkooman, joka tavallisesti 15 on melko hitaasti leviävä syöpä, agressiivisten muotojen esiintyminen potilaissa, jotka kärsivät hankitusta immuunikato-syndroomasta (AIDS).
SCM-tekijän puhdistaminen
Ensimmäinen vaihe SCM-tekijän puhdistuksessa on 20 syöpää sairastavan luovuttajan ruumiinnesteestä suodatetun ultrasuodoksen valmistaminen. Ruumiinneste voi olla ääreis verta, veriplasmaa tai virtsaa; jos neste on ääreisverta, veri täytyy sentrifugoida punaisten verisolujen erottamiseksi plasmasta. Ruumiinnesteen, jota on käytetty SCM-te-25 kijän eristämiseen, luovuttaja voi olla joko autologinen tai allogeeninen suhteessa SCM-testissä käytettäviin lym-fosyytteihin.
Ultrasuodatusprosessissa erotetaan ensimmäinen ruu-miinnestefraktio, joka käsittää molekyylit, joiden näen-30 näinen molekyylipaino on yli 1000 daltonia toisesta fraktiosta, joka käsittää molekyylit, joiden näennäinen molekyylipaino on alle 1000 daltonia. Esillä olevan keksinnön mukainen yleinen syöpään liittyvä SCM-tekijä löytyy toisesta ultrasuodoksen fraktiosta. Termejä "näennäinen mo-35 lekyylipaino" ja "nimellinen molekyylipainoraja" käytetään 24 92832 tässä, koska ultrasuodatus on jossain määrin epätarkka menetelmä erottamaan molekyylejä, joiden molekyylipaino on tätä kokoluokkaa, ja tarkka molekyylipaino, jonka nimelliseltä molekyylipainorajaltaan 1000 daltonin suodatin suo-5 dattaa riippuu jossain määrin molekyylin muodosta. Molekyylit, jotka todelliselta molekyylipainoltaan ovat yli 1000 daltonia, itse asiassa voivat läpäistä suodattimen, jonka nimellinen molekyylipainoraja on 1000 daltonia, jos molekyylit esimerkiksi ovat suhteellisen pitkiä ja kapei-10 ta.
Edullisessa toteutusmuodossa toisen fraktion erottaminen ensimmäisestä fraktiosta tapahtuu suodattamalla ruumiinneste ultrasuodattimen läpi, jonka nimellinen molekyylipainora ja on 1000 daltonia.
15 Tällaisen tekijävalmisteen puhtautta ultrasuodatus- vaiheessa tai myöhemmin voidaan kuvata sen spesifisellä aktiivisuudella. Tässä yhteydessä termi "spesifinen aktiivisuus" määritellään vastaavana proteiinimääränä, joka tarvitaan aiheuttamaan tietynasteinen, kuten 20 %:nen, 20 lasku solunsisäisessä fluoresenssipolarisaatioarvossa, kun kyseistä fraktiota käytetään SCM-vasteeseen kykeneviin lymfosyytteihin SCM-testissä. SCM-tekijän puhdistamisella pyritään lisäämään SCM-tekijän spesifistä aktiivisuutta verrattuna raa'an ultrasuodoksen spesifiseen aktiivisuu-25 teen. Puhdistusprosessia voi sen vuoksi seurata puhdistettujen fraktioiden spesifisen aktiivisuuden määrittäminen. Koska proteiinipitoisuudet tässä kuvatuissa esimerkeissä on määritetty vain likiarvoina ultraviolettiabsorbanssina määritettynä, mieluiten 220 nm:ssä, ja tekijän annos-vas-30 tekäyrää ei vielä ole määritetty, tässä kuvatun SCM-teki- • jän puhdistuksen eri vaiheiden karakterisoiminen spesi fisenä aktiivisuutena on vain likimääräinen. Kuitenkin on selvää, että proteiinipitoisuus laskee merkittävästi tekijän siirtyessä eri puhdistusvaiheiden läpi samalla kun 35 aktiivisuus säilyy suhteellisen muuttumattomana tällä ta- li 92832 25 valla päätyen SCM-tekijän spesifisen aktiivisuuden lisääntymiseen. Siitä huolimatta ultrasuodoksen voidaan hyvin kuvata käsittävän olennaiselta osaltaan puhtaan yleisen syöpään liittyvän SCM-tunnistustekijän samalla tavalla 5 kuin ultrasuodatus nimelliseltä molekyylipainorajaltaan 1000 daltonin membraanin läpi voi poistaa biologisesta nesteestä ylivoimaisesti suurimman osan spesifisen biologisen aktiivisuuden omaavista molekyyleistä käsittäen kaikki suuremmat peptidit.
10 Seuraava yleisen syöpään liittyvän SCM-tekijän puh- distusvaihe on suolojen poisto, jossa ultrasuodatuksella saatu toinen fraktio viedään kromatografikolonniin, joka pystyy erottamaan siitä suolat. Kolonniin viety materiaali eluoidaan sen jälkeen kolonnista tislatulla vedellä ja se 15 osa, joka eluoituu eluointitilavuudeltaan noin 0,3-0,5 kertaa koko kromatografia-alustan tilavuus sisältäen SCM-tekijän, kerätään talteen. Edullisessa toteutusmuodossa tässä vaiheessa käytetty kolonni on geelisuodatuskolonni, jonka fraktiointiasteikko ulottuu 0:sta noin 700 dalto-2 0 niin, kuten Sephadex(tm) G-10.
Toinen puhdistusvaihe käsittää toisen suodatuksen, jossa erottelu myös tapahtuu koon mukaan. SCM:ia sisältävä materiaali, joka on saatu suolanpoistovaiheesta, toiseen . geelisuodatuskolonniin, jonka fraktiointiasteikko ulottuu 25 noin 1500 daltonista noin 30 000 daltoniin, kuten Sepha- dex(lm) G—50. Kolonniin viety materiaali eluoidaan sen jälkeen siitä laimealla ammoniumsuolan vesiliuoksella. Edullisessa toteutusmuodossa ammoniumsuola on ammoniumbikar-bonaatti, vielä edullisemmin 50 mM:nen ammoniumbikarbo-30 naatti. Se osa, joka eluoituu eluointitilavuudessa, joka on noin 0,4-0,6 kertaa koko kromatografia-alustan tilavuus, sisältää SCM-tekijän ja se kerätään.
Seuraava puhdistusvaihe on anioninvaihtokromatogra-fia, joka erottelee varauksen mukaan. SCM-tekijän sisäl-35 tävä materiaali edellisestä geelisuodatusvaiheesta viedään 26 92832 anioninvaihtokolonniin, mieluiten dietyyliaminoetyylisel-luloosaan (DEAE-selluloosa). Kolonniin viety materiaali eluoidaan kolonnista suurentuvilla ammoniumsuolapitoisuuk-silla. Mieluiten tämä ammoniumsuola on ammoniumbikarbo-5 naatti ja suureneva ammoniumsuolapitoisuus ulottuu 10 mM:sta 1,0 M:iin ammoniumbikarbonaattia. Fraktio, joka eluoituu kolonnista noin 0,28 M:n - 0,31 M:n ammoniumbi-karbonaattipitoisuudessa, sisältää SCM-tekijän ja se kerätään.
10 Viimeinen puhdistusvaihe käsittää käänteisfaasi- korkeapainenestekromatografiän (RP-HPLC), joka erottelee varauksen ja/tai hydrofobisuuden mukaan. Tyypillisesti SCM-tekijän sisältävä materiaali DEAE-selluloosakolonni-eluaatista viedään Aquapore RP-300 RP-HPLC-kolonniin, jon-15 ka koko on 220 mm x 2,1 mm. Eluaatio suoritetaan sitten kahden liuottimen seoksella niin, että ensin seos sisältää 90 tilavuusprosenttia 0,1- tilavuusprosenttista trifluoro-etikkahapon (TFA) vesiliuosta ja 10 tilavuusprosenttia 0,09-tilavuusprosenttista TFA:ssa 70-prosenttisessa aseto-20 nitriilin vesiliuoksessa, mitä seuraa gradientti, joka sisältää asetonitriiliä sisältävän seoksen nousevana pitoisuutena. SCM-tekijä kaikista lähtömateriaaleista eluoituu homogeenisena piikkinä liuotinseoksella, joka sisältää 26 tilavuusprosenttia 0,1-tilavuusprosenttista trif-25 luoroetikkahapon vesiliuosta ja 74 tilavuusprosenttia 0.09 tilavuusprosenttista trifluoroetikkahapon vesiliouosta 70 %:ssa asetonitriilissä.
Vaihtoehtoisesti RP-HPLC voidaan suorittaa Beckman Ultrasphere 0DS(tm) -käänteisfaasi-korkeapainenestekromato- • 30 grafiakolonnissa. Tässä kolonnissa eluaatio suoritetaan jossain määrin erilaisella liuosyhdistelmällä niin, että aluksi seos sisältää 70 tilavuusprosenttia 0,1 tilavuusprosenttista trifluoroetikkahapon vesiliuosta ja 30 tilavuusprosenttia 0,1 tilavuusprosenttista trifluoroetikka-35 hapon vesiliuosta 70 %:isessa asetonitriilin vesiliuokses- • «
II
92832 27 sa, mitä seuraa gradientti, joka käsittää nousevan aseto-nitriililiuotinpitoisuuden. SCM-tekijä eluoituu aina homogeenisenä piikkinä liuotinpitoisuudessa, joka käsittää 43,7 tilavuusprosenttia 0,1 %:ista trifluoroetikkahapon 5 vesiliuosta ja 56,3 tilavuusprosenttia 0,1 %:ista trifluoroetikkahapon nesteliuosta 70 %:isessa asetonitriilin vesiliuoksessa, kun käytetään tätä liuotinsysteemiä ja tätä liuotinta.
SCM-tekijän käyttö 10 1. Käyttö SCM-testissä SCM-tekijän aktiivisuus varmistetaan tutkimalla sen vaikutusta elinvoimaisiin potentiaalisesti SCM-vasteeseen kykeneviin lymfosyytteihin ylseisen testimenetelmän mukaan, joka on kuvattu L. Cercekin ja B. Cercekin julkai-15 sussa "Application of the Phenomenon of Changes in the Structuredness of Cytoplasmic Matrix (SCM) in the Diagnosis of Malignant Disorders: a Review", Europ. J.
Cancer 13, 903-915 (1977). Esillä olevan keksinnön mukainen SCM-tunnistustekijä tuottaa merkittävän laskun syöpää 20 sairastavien luovuttajien potentiaalisesti SCM-vasteeseen kykenevien lymfosyyttien solunsisäisessä fluoresenssipo-larisaatioarvossa kun sitä käytetään tällaisiin lymfosyytteihin SCM-testissä, joka toteutetaan kuten tuossa artikkelissa on kuvattu. Tällaisten lymfosyyttien solunsisäisen 25 fluoresenssipolarisaatioarvon lasku on varmasti ainakin 20 % jopa jos ultrasuodosta käytetään lymfosyytteihin, ja yli 50 %, jos puhtainta HPLC-fraktiota käytetään, a. SCM-testin suoritusmenetelmät
Kaksi aikaisemmin käyttöön otettua menetelmää ovat 30 tärkeitä tässä kuvatun SCM-testin onnistuneen suorituksen kannalta. Nämä menetelmät käsittävät potentiaalisesti SCM-vasteeseen kykenevien lymfosyyttien eristämisen ja itse fluoresenssipolarisaatioarvojen mittaamismenetelmän ja niiden muuttamisen SCM-testin kannalta mielekkäiksi nume-35 roiksi. Nämä menetelmät kuvataan jäljempänä.
28 92832 (1) Potentiaalisesti SCM-vasteeseen kykenevien lymfosyyttien eristäminen
Potentiaalisesti SCM-vasteeseen kykenevien lymfosyyttien eristäminen on kuvattu edellä mainitussa katsaus-5 julkaisussa European Journal of Cancer ja myös aikaisemmassa B. Cercekin & L. Cercekin patenttihakemuksessa 838 264, sarjanumero 838 264, joka on jätetty 10. maaliskuuta 1986 ja jonka nimi on "Automated Collection of Buoyant Density Specific Cells from Density Gradients", ja on lii-10 tetty tähän viittauksena. Näiden lymfosyyttien erottaminen yleisestä lymfosyyttipopulaatiosta on tärkeätä SCM-testin onnellisen suorittamisen kannalta, koska vain suhteellisen pieni osa lymfosyyteistä, noin 20-25 prosenttia, kykenee reagoimaan SCM-testissä. Sen vuoksi, jos tämä testi toteu-15 tetaan fraktioimattomilla lymfosyyteillä, lopputuloksena on paljon vähäisempi havaittu väheneminen solunsisäisessä polarisaatioarvossa vaikka SCM-testissä itse asiassa vasteeseen kykenevät lymfosyytit reagoisivatkin täydellisesti .
20 Potentiaalisesti SCM-vasteeseen kykenevien lymfo- syyttien eristämiseksi luovuttajalta otetaan ääreisveri- näyte ja se otetaan talteen heparinisoituun putkeen. Talteen oton jälkeen ääreisverta käsitellään rautajauheella tai karbonyyli-rautajauheella ja putket, jotka sisältävät 25 veri-rautajauheseosta asetetaan magneetille fagosyyttisten solujen erottamiseksi raudan mukana verinäytteestä. Osa verinäytteestä siirretään sitten Ficoll(tm)-Triosil(tm)-tiheys-gradienttiliuokseen ja sentrifugoidaan potentiaalisesti SCM-vasteeseen kykenevien lymfosyyttien erottamiseksi ti-.· 30 heyserojen perusteella. Tässä erotusmenetelmässä käytetään tiheysgradienttiliuosta, jonka tiheys on 1,081 g/cm3 25 °C:ssa ja osmolaliteetti 0,320 Osm/kg. Verinäyte sentrifugoidaan 550 x g 20 min. 25 °C:ssa. Potentiaalisesti SCM-vasteeseen kykenevät lymfosyytit kerätään Pasteur-pipetil-35 lä solukerroksen poistamiseksi, joka on erottunut tiheys- il 92832 29 gradienttimateriaalin päälle. Keräämisessä täytyy noudattaa äärimmäistä varovaisuutta tiheysgradienttimateriaalin keräämisen välttämiseksi, koska tämä materiaali sisältää erilaisia painavampia plasma- ja solukomponentteja, jotka 5 häiritsevät testituloksia. Kevyemmän plasmamateriaalin poistamista pitää myös välttää niin paljon kuin mahdollista kaikkien kontaminanttien tai ei-SCM-vasteeseen kykenevien solujen testinäytteisiin mukaan tulon estämiseksi.
Erottamisen jälkeen potentiaalisesti SCM-vasteeseen 10 kykenevät lymfosyytit pestään useita kertoja, ensiksi 0,9 %:ssa säilöntäaineita sisältämättömässä natriumkloridi-liuoksessa, sitten täydellisessä Dulbeccon fosfaatilla puskuroidussa saliinissa (PBS) ja pidetään 37 °C:ssa seu-raavaksi suoritettavaa SCM-testiä varten.
15 (2) SCM-arvojen mittaaminen SCM-vasteeseen kykenevien lymfosyyttien fluoresens-sipolarisaatioarvojen mittaamismenetelmä on kuvattu edellä mainitussa katsausartikkelissa julkaisussa European Journal of Cancer samoin kuin aaikaisemmassa B. Cercekin & 20 L. Cercekin patentthakemuksessa, sarjanumero 867 079, joka on jätetty 27. toukokuuta 1986 ja jonka nimi on "Method for Measuring Polarized Fluorescence Emissions", joka on tähän liitetty viittauksena. Kuten näissä viitteissä on mainittu testikohteen verestä aikaisemmin erotettuja lym-25 fosyyttejä inkuboidaan steriilissä lasiputkessa 37 °C:ssa, jossa on tunnettu pitoisuus joko mitoosia aiheuttavaa ainetta kuten fytohemagglutiinia tai syöpään liittyvää antigeeniä kuten yleistä syöpään liittyvää SCM-tunnistusteki-jää, joka on esillä olevan keksinnön kohde. Muitakin mi-30 toosia aiheuttavia aineita kuin fytohemagglutiinia (PHA) kuten konkanavaliini A:ta ja kermesmarjanitogeenia on käytetty, mutta PHA on edullisin SCM-testiin. Tämä inkubaatio aloitetaan lisäämällä 0,1 ml sopivasti laimennettua mitoosia aiheuttavaa ainetta tai antigeeniä 1 ml:aan solusus-35 pensiota, jonka tiheys on 6 x 1016 solua/ml. Inkubaation 30 92832 annetaan sitten jatkua 30-60 min.
Inkuboidut lymfosyytit sekoitetaan sen jälkeen suspensioon yhdessä sopivan ei-fluorogeenisen yhdisteen kanssa, joka voidaan hydrolysoida solunsisäisesti fluorogee-5 niseksi yhdisteeksi, jota tämän jälkeen kutsutaan fluoro-geenisen tekijän prekursoriksi, esimerkkinä fluoreseiini-diasetaatti (FDA). Fluoreseiinidiasetaattia käytetään lop-pupitoisuutena 2,5 mM täydellisessä PBSrssa pH:ssa 7 ja osmolaliteetissa 0,330 Osm/kg ja se laimennetaan väkevöi-10 dysta varastoiiuoksesta, joka on valmistettu asetoniin tai jääetikkahappoon. 0,2 ml:n määrät kontrollilymfosyyttisus-pensiota tai stimuloitua lymfosyyttisuspensiota injektoidaan hitaasti ruiskulla dekantteriin, joka sisältää 3 ml FDA-substraattiliuosta.
15 FDA:n annetaan vaikuttaa soluihin riittävä aika (noin 5 minuuttia), jotta FDA-substraattiliuos ehtii tunkeutua sisälle lymfosyytteihin. Solujen sisällä ei-fluoro-geeniset fluoreseiinidiasetaattimolekyylit muutetaan fluo-reseiinimolekyyleiksi entsymaattisella hydrolyysillä.
20 Fluoria sisältävät lymfosyytit ovat isotrooppisia reaktiossaan polarisoituun valoon, koska fluoresenssiemis-sion polarisaatio suhteessa soluihin tulevaan valoon ei riipu lymfosyytteihin kohdistetun tasopolarisoidun valon suuntautumisesta. Kuitenkin näihin mittauksiin käytetty 25 tavanomainen fluoresenssipolarisaatiota mittaava laite käyttää vertikaalisesti polarisoitua valoa lymfosyytteihin ja näin ollen mittausprosessi kuvataan vertikaalisesti polarisoituna valona.
Kun fluoreseiinimolekyyleihin kohdistetaan viritys-30 energiaa vertikaalisesti polarisoidun valon muodossa, ne * fluorisoivat. Vertikaalisesti ja horisontaalisesti pola risoidun emission suhde määritetään. Tämä voidaan tehdä mittaamalla polarisoitu fluoresenssivoimakkuus sekä vertikaalisessa että horisontaalisessa tasossa ja määrittä-35 mällä polarisaatioarvo (P-arvo) seuraavan suhteen mukaan:
II
92832 31 lv - GIh P = _ lv + GIh 5 jossa Iv ja IH ovat polarisoituja fluoresenssiarvoja vertikaalisessa ja horisontaalisessa tasossa, mainitussa järjestyksessä, ja G on korjauskerroin polarisoidun valon horisontaalisten ja vertikaalisten komponenttien kyseessä 10 olevan laitteen optisen järjestelmän epätasaisen läpäisyn huomioimiseksi. G-arvo on määritetty jakamalla horisontaalisesti polarisoidun valon voimakkuus vertikaalisesti polarisoidun valon voimakkuudella, joka on emittoitunut PBS:iin valmistetusta 10'7 M:sesta fluoreseiiniliuoksesta, 15 joka on viritetty horisontaalisesti polarisoidulla valolla, jonka aallonpituus on sama kuin on käytetty SCM-mit-tauksiin. Tässä kuvatuissa mittauksissa G = 0,42.
Stimuloitujen lymfosyyttien, jotka tarkoittavat lymfosyyttejä, jotka on altistettu esillä olevan keksinnön 20 mukaiselle yleiselle SCM:iin liittyvälle syövän tunnistus-tekijälle, P-arvoa verrataan samalta luovuttajalta peräisin olevien stimuloimattomien lymfosyyttien kontrollisus-pension P-arvoon, ja stimuloitujen lymfosyyttien P-arvon lasku prosentteina verrattuna kontrollilymfosyyttien P-25 arvoon indikoi SCM-vastetta syöpäantigeenille.
Vaikka SCM-vaste voidaankin havaita samoillakin viritys-ja emissioaallonpituuksilla kun FDAria käytetään fluoro-geenisenä tekijänä, selvästi edullisempaa on kuitenkin käyttää 470 nm:n viritysaalllonpituutta ja 510 nm:n emis-30 sioallonpituutta. Kaikki tässä mainitut tulokset on saatu käyttämällä näitä aallonpituuksia. Kuitenkin hyviä tuloksia on saatu käyttämällä stimulointiaallonpituutena 442 nm ja emissioaallonpituutena 527 nm.
Sprektofotometrin, jota käytetään SCM-fluoresens-35 simittauksiin, pitäisi olla hyvin herkkä ja stabiili ja 32 92832 sen pitäisi kompensoida viritysvalon intensiteetin vaihteluita, koska polarisoidun fluoresenssiemission voimakkuus mitataan ajan funktiona ja koska fluoreseiinin kokonaismäärä SCM-mittauksissa on vain 10"8-10'9 M:n luokkaa. Myös-5 kään leveitä nauhasuodatininstrumentteja ei voida käyttää SCM-mittauksiin, koska SCM-vasteet voidaan havaita vain kapealla aallonpituusalueella. Viritysmonokromaattorin spektriuurteen suurimman leveyden pitäisi olla 20 nm ja emissiomonokroraaattorin spektriuurteen suurimman leveyden 10 pitäisi olla 10 nm, kun stimulaatiomonokromaattori on asetettu 470 nm:iin ja emissiomonokromaattori 510 nm:iin. Spektrofotometrin pitäsi myös olla liitettynä termostaat-tisesti säädeltyyn kyvettipidikkeeseen, koska polarisoidut fluoresenssiemissiot ovat hyvin lämpötilaherkkiä. Spekt-15 rofotometrin pitäisi myös olla varustettu fluoresenssiemi-ssioiden sekä horisontaalisten että vertikaalisten polarisoitujen komponenttien mittausvälineillä.
Jäljempänä esitetyissä esimerkeissä me käytimme Perkin-Elmer MPF-4-spektrofotometriä, joka oli varustettu 20 termostaattisesti kontrolloidulla kyvettipidikkeellä.
Kaikki mittaukset tehtiin 27 °C:ssa. Valolähde oli ksenon-lamppu.
Fluoresenssipolarisaatiota mitattaessa vertikaali-. sen virittävän valonsäteen kanssa samansuuntaiset ja sitä 25 vastaan kohtisuorassa olevat emissiovoimakkuudet määrite tään vuorotellen automaattisella polarisaationmuuttajalla noin 6 minuutin ajan tai kunnes vertikaalisen viritysva-lonsäteen kanssa kohtisuorassa oleva emissiovoimakkuus saavuttaa 80-90 % tason laitteen koko asteikon taittumas-30 ta.
Näiden mittaustulosten korjaaminen on välttämätöntä kaikesta mahdollisesta fluoreseiinin solusta ulos vuotamisesta ja substraatin sisältämästä taustafluorisoinnista johtuvien virheiden eliminoimiseksi. Tämän korjauksen suo-35 rittamiseksi solut suodatetaan pois liuoksesta nitrosellu- ti 92832 33 loosasuodattimella, jonka huokoskoko on 0,22 μιη ja joka on asetettu sopivaan suodatinalustaan. Käyttämällä samaa fluoresenssipolarisaation mittauslaitetta saadaan määritettyä viritysvaloon nähden samansuuntaiset ja kohtisuo-5 rassa olevat fluoresenssivoimakkuudet. Korjatut fluo-resenssivoimakkuusarvot soluille saadaan sitten vähentämällä suodoksesta saadut arvot koko fluoresenssivoimakkuudesta ekstrapoloituna puolitettuun suodatusaikaan. Tämä ekstrapolointi on välttämätöntä, koska taustasäteily nou-10 see inkuboinnin aikana johtuen fluoreseiinin vuotamisesta ulos soluista ja FDA:n spontaanista hydrolyysistä.
Vaihtoehtoisesti voidaan käyttää taustafluoresens-sin kompensointimenetelmää, joka on kuvattu aikaisemmassa Cercekien patenttihakemuksessa, sarjanumero 867 079, joka 15 on jätetty 27 toukokuuta 1986 ja jonka nimi on "Method for Measuring Polarized Fluorescence Emissions" ja joka on liitetty tähän viitteenä. Lyhyesti sanottuna tässä menetelmässä eliminoidaan tarve suodattaa jokainen näyte mittaamalla horisontaalisesti ja vertikaalisesti polarisoitu 20 fluoresenssiemissio useammalla kuin yhdellä aallonpituudella ja laskemalla siitä solunsisäinen fluoresenssiemissio .
SCM-testiin, joka suoritetaan edellä kuvatun menetelmän mukaisesti ja jossa käytetään 1,0 ml tiheydeltään 6 25 x 106 solua/ml olevaa lymfosyyttisuspensiota ja 0,1 ml mitoosia aiheuttavaa ainetta tai antigeeniä yhdessä FDA:n kanssa, joka on fluorogeenisen tekijän prekursori, ja 470 nm:n viritysaallonpituutta ja 510 nm:n emissioaallonpi-tuutta, viitataan tässä "standardi SCM-testinä".
30 b. Yleisen syöpään liittyvän SCM-tekijän käyttö ‘ vaikuttavana tekijänä SCM-testissä
Yleistä syöpään liittyvää SCM-tekijää, jonka puhdistaminen on edellä kuvattu, voidaan käyttää vaikuttavana tekijänä SCM-testissä syövän havaitsemiseen. Näin ollen 35 solut, jotka on saatu luovuttajilta, jotka eivät sairasta 92832 34 syöpää, eivät anna merkittävää SCM-vastetta, kun niitä stimuloidaan syöpäantigeeneillä, joita käytetään vaikuttavina tekijöinä SCM-testissä, kun taas solut, jotka ovat peräisin syöpää sairastavilta luovuttajilta, aiheuttavat 5 merkittävän muutoksen SCM-vasteeseen. Tämä muutos näkyy P-arvon laskuna, kun syöpää sairastavilta luovuttajilta peräisin olevia soluja stimuloidaan syöpään liittyvillä antigeeneillä. Kuten on kuvattu SCM-tekijä on epäspesifinen suhteessa havaittuun syöpätyyppiin; lymfosyyttien, joita 10 on stimuloitu SCM-tekijällä SCM-testissä, ei tarvitse olla peräisin luovuttajalta, jolla on samanlainen syöpätyyppi kuin ruumiinnesteen, josta SCM-tekijä on peräisin, luovuttajalla.
Käytettäessä SCM-tekijää vaikuttavana tekijänä SCM-15 testissä se aiheuttaa ainakin kymmenen prosentin laskun ja jopa 44,6 %:n laskun P-arvossa. Jos P5 on P-arvo stimuloitujen lymfosyyttien määrälle ja Pc on P-arvo lymfosyyteille, joita ei ole stimuloitu SCM-teki jällä, P,:n ja Pc:n suhteen ollessa pienempi kuin noin 0,9 osoittaa se stimuloi-20 tujen lymfosyyttien luovuttajalla olevan pahanlaatuisen sairauden.
Edullinen SCM-tekijän käyttömenetelmä vaikuttavana aineena SCM-testissä käsittää Ps:n vertaamisen toisen mitoosia aiheuttavan aineen kanssa kosketuksissa olleiden 25 lymfosyyttien määrän fluoresenssipolarisaatioarvoon, Pm, SCM-vastesuhteen RR^ määrittämiseksi, jossa: RRscm = P./Pm·
Jos RR^-arvo on pienempi kuin 0.9, indikoi se lymfosyyttien luovuttajalla olevan pahanlaatuisen sairauden.
30 3. Muita SCM-tekijän vasta-aineiden käyttömuotoja SCM-tekijää vastaan tuotettujen vasta-aineiden li-säkäyttömuoto syövän hoidossa on vasta-aineen liittäminen aineeseen, joka on anti-syöpäaktiivinen anti-syöpäaktii-visen aineen johtamiseksi syöpäkohtaan ja sillä tavalla 35 nostaa anti-syöpäaineen tehoavaa pitoisuustasoa syövän 92832 35 esiintymiskohdassa. Tämä menetelmä on erityisen käyttökelpoinen, kun käytetään anti-syöpäainetta, joka aiheuttaa sivuvaikutuksia, kun sitä annetaan suurina annoksina.
Anti-SCM-vasta-ainetta voidaan myös käyttää SCM-5 tekijän pitoisuuksien määrittämiseen ääreisveressä tai muissa ruumiinnesteissä eri tekniikoilla kuten radioimmu-noanalyysillä, fluoresenssi-immunoanalyysillä tai entsyy-misitoisella immunosorbenttianalyysillä tai sakkautumis-analyysitekniikoilla kuten nefelometrisesti tai turbidi-10 metrisesti sillä oletuksella, että SCM-tekijä ei ole yksiarvoinen antigeeni. Olettaen että SCM-tekijä on jollakin tavalla fysikaalisesti liittynyt kasvainsoluihin paikal-listamisaineilla kuten fluorisoivilla väreillä tai radioaktiivisilla isotoopeilla voidaan myös paikallistaa solut 15 niin että ne voidaan havaita biopsioissa. Fluorisoivalla värillä leimattua vasta-ainetta voidaan myös käyttää syöpäsolujen automatisoituun osoittamiseen virtaussytomet-riassa.
Esimerkit 20 Seuraavat esimerkit kuvaavat SCM-tekijää, sen eris tystä ja puhdistusta ja käyttömenetelmää. Kuitenkin seu-raavien esimerkkien tarkoitus ei ole rajoittaa keksintöä vaan ainoastaan kuvata sitä.
Esimerkki 1 25 Yleisen syöpään liittyvän SCM-tekijän alkupuhdistus
Potilailta, joilla oli diagnosoitu aktiivisessa vaiheessa oleva syöpä kuten rinta- tai keuhkosyöpä, paksunsuolen syöpä, munasarjansyöpä, kohdunkaulan syöpä, koh-tusyöpä, kurkunpään syöpä tai ihosyöpä (tyvisolusyöpä ja 30 pahanlaatuinen melanooma), kerättiin verinäytteet hepari-nisoituihin astioihin kuten Vacutainer(tm)-putkiin. Kahdenkymmenen millilitran erät verinäytteistä sentrifugoitiin noin 1200 x g noin 40 minuutin ajan. Pohjalle laskeutuneiden solujen päällä oleva plasma kerättiin ja suodatettiin 35 paineella molekyylipainorajaltaan 1000 daltonin huokoisen 36 92832 kalvosuodattimen läpi kuten Amicon(tm) UM2- tai YM2-suodattimen läpi. Nämä ultrasuodokset lyofilisoitiin tai säilytettiin 4 °C:ssa seuraavaan puhdistusvaiheeseen.
Esimerkki 2 5 Yhden kerran puhdistetun SCM-tekijän testit
Ultrasuodoseriä jokaisesta Esimerkin 1 näytteestä inkuboitiin potentiaalisesti SCM-vasteeseen kykenevien lymfosyyttien kanssa, jotka oli saatu samoilta luovuttajilta ja lymfosyyttien kyky SCM-vasteeseen edellä kuvatun 10 SCM-testimenetelmän mukaisesti tarkistettiin. Jokaisessa tapauksessa ultrasuodos aiheutti SCM-vasteeseen kykenevissä lymfosyyteissä tyypillisen vasteen, joka käsitti P-ar-von laskun samalla tavalla kuin siinä tapauksessa että ne olisivat olleet kosketuksissa itse syöpäkudoksen tai syö-15 päkudosuutteiden kanssa (Taulukko 2).
TAULUKKO 2
Esimerkin 1 ultrasuodoston SCM-aktiivisuus 20
Lymfosyyttien SCM-tekijoiden SCM-vaste: luovuttajan luovuttajan P-arvo %:eina diagnoosi diagnoosi kontrollista k <
Pahanlaatuinen Pahanlaatuinen 75,7 25 melanooma melanooma
Pahanlaatuinen Tyvisolusyöpä - 82,0 melanooma ihossa t
Kurkunpääsyöpä Kurkunpääsyöpä 62,9
Rintasyöpä Rintasyöpä 76,0
Taulukon 2 tulokset osoittavat, että jopa raa'assa ultrasuodoksessa SCM-tekijä aiheutti ainakin yhtä suuren 30 il 37 92632 laskun syöpää sairastavilta luovuttajilta peräisin olevissa SCM-vasteeseen kykenevissä lymfosyyteissä kuin ne P-arvojen laskut, joita mitataan, kun lymfosyyttejä stimuloidaan syöpäkasvaimen raakauutteilla tai itse syöpäkudok-5 sella. P-arvon lasku ultrasuodosstimulaatiossa oli ainakin 10 %, joka on tällaisessa tapauksessa tyypillinen positiivinen SCM-vaste. Kuitenkaan, SCM-tekijä ei läpäissyt nimelliseltä molekyylipainorajaltaan 500 daltonin Arnicon(tm)-UM05-suodatinta. Tällaiset tulokset vahvistavat käsitystä 10 tekijän pienestä koosta kuitenkin niin, että aktiivinen tekijä on suurempi kuin pieni molekyyli kuten yksittäinen aminohappo.
Esimerkki 3 SCM-tekijän jatkopuhdistus 15 Lyofilisoitu jauhe Esimerkin 1 näytteistä liuotet tiin 2 ml:aan steriiliä säilöntäaineita sisältämätöntä vettä injektointia varten. Tässä vaiheessa valmisteiden SCM-aktiivisuus varmistettiin, ja aktiiviset näytteet luovuttajilta, joilla oli samantyyppinen ja samassa paikassa 20 sijaitseva syöpä, yhdistettiin. Yhdistetyistä näytteistä poistettiin suola 0,9 x 18 cm:n Sephadex(tm) G-10 -kolonnissa, jonka fraktiontiasteikko ulottuu 0:sta 700 daltoniin. Näytteen tilavuus kolonnin kromatografia-ajoa kohti ei ylittänyt 25 % kolonnin tilavuudesta. Eluointiin käytet-25 tiin kahdesti tislattua vettä lineaarisella eluutionopeu-della 8-9 cm/h. Suolojen poisto suoritettiin huoneenlämmössä (21-23 °C) . Yhden ml:n fraktiot, jotka eluoituivat vaiheessa, jossa 0,3-0,5 kertaa kromatografia-alustan kokonaistilavuudesta oli ajettu, kerättiin ja fraktioiden 30 optiset tiheydet määritettiin. SCM-aktiivisuuden havaittiin olevan ensimmäisessä eluutiopiikissä. SCM-aktiivisuuden sisältyminen tähän piikkiin varmistettiin SCM-testil-lä. Ensimmäisen eluutiopiikin määräerä, joka oli valmistettu ultrasuodoksesta, joka oli alunperin saatu rinta-35 syöpää sairastavan potilaan plasmasta, laski rintasyöpää 38 92832 sairastavan potilaan lymfosyyttien P-arvoa 86,3 % kontrol-liarvosta SCM-testissä osoittaen SCM-aktiivisuuden olemassaolon. Nämä fraktiot kerättiin talteen ja lyofilisoitiin.
Eluaatti puhdistettiin edelleen fraktioimalla 5 Sephadex(tm) G-50 -geelisuodatuskolonnissa, jonka fraktioin-tiasteikko ulottuu 1500-30 000 daltoniin. Lyofilisoidut suolattomat näytteet liuotettiin 50 mM:seen NH4HC03:iin, vietiin 0,9 x 18 cm:n Sephadex G-50 -kolonni, jonka lineaarinen eluutionopeus oli 3 cm/h alle 5 %:n määränä kolon-10 nin tilavuudesta. Eluutio suoritettiin huoneenlämmössä ja yhden millilitran fraktiot, jotka eluoituivat kolonnista vaiheessa, jossa 0,4-0,6 kertaa kromatografia-alustan kokonaistilavuus oli eluoitunut, kerättiin talteen. Näiden fraktioiden SCM-aktiivisuus määritettiin. Tämän testin 15 tulokset on esitetty Esimerkissä 4 jäljempänä. SCM-aktii-viset fraktiot saatiin ensimmäisestä eluutiopiikistä määritettynä yhden millilitran fraktioiden optisina tiheyksinä sen jälkeen, kun fraktiot oli testattu SCM-testillä.
Sen jälkeen kun fraktiot oli testattu SCM-aktiivi-20 suuden suhteen, aktiiviset fraktiot samasta syöpätyypistä yhdistettiin ja lyofilisoitiin.
Lyof ilisoitujen näytteiden edelleen puhdistamiseksi ne liuotettiin 10 mM:seen NH4HC03:iin ja vietiin 0,8 x 26 cm:n Whatman DE-52 mikrorae-DEAE-selluloosakolonniin alle 25 4 %:n määränä kolonnin tilavuudesta. Kolonni pestiin 10 ml: 11a 10 mM:sta NH4HC03-vesiliuosta lisäämällä NH4HC03:a 0,108 % minuutissa 10 mM:sta 1 M:iin. Yhden millilitran fraktiot kerättiin talteen ja optinen absorptio 220 nm:ssä määritettiin jokaista fraktiota kohti. Optisen absorbans- 30 sin perusteella aktiiviset fraktiot, jotka eluoituivat kolonnista vaiheessa, jossa 4,5-4,7 kertaa kromatografia-alustan kokonaistilavuus oli eluoitunut, yhdistettiin ja lyofilisoitiin testausta ja lisäpuhdistusta varten. Aktiivisten fraktioiden SCM-testaustulokset on esitetty esi-35 merkissä 4.
n 92832 39
Esimerkki 4
Edelleen puhdistettujen valmisteiden testit
Taulukossa 3 esitetään tulokset, kun esimerkin 3 Sephadex G-50 -fraktioiden määräeriä, jotka olivat alun-5 perin peräisin luovuttajilta, joilla oli erityyppisiä syöpämuotoja, käytettiin SCM-testissä stimuloimaan lymfosyyttejä, jotka oli saatu luovuttajilta, joilla myös oli erityyppisiä syöpämuotoja. Voidaan havaita, että potentiaalisesti SCM-vasteeseen kykenevät lymfosyytit antavat saman 10 tyypillisen vasteen G-50-fraktioille kuin ne antoivat aikaisemmin kuvatuille syöpään liittyville antigeeneille. Tämän suolattoman osittain puhdistetun proteiinimateriaa-lin vaste on yleisesti ottaen suurentuva verrattuna raakaan ultrasuodokseen, jota koskevat tulokset on esitetty 15 taulukossa 2. Tämä suurentunut SCM-vaste näkyy alentuneina P-arvoina.
40 92832 TAULUKKO 3
Esimerkin 3 sephadex G-50-fraktioiden SCM-aktiivisuus 5
Lymfosyyttien luo- SCM-tekijän luo- SCM-vaste: P- vuttajan diagnoosi vuttajan diagnoosi arvo %:eina ___kontrollista
Keuhkosyöpä Rintasyöpä 73,0 10 Keuhkosyöpä Kohdunkaulansyöpä 69,6
Keuhkosyöpä Keuhkoputkensyöpä 73,6
Kurkunpääsyöpä Keuhkoputkensyöpä 77,6
Rintasyöpä Keuhkoputkensyöpä 80,2
Paksunsuolensyöpä Rintasyöpä 63,5 15 Kurkunpäänsyöpä Rintasyöpä 63,0
Pahanlaatuinen Pahanlaatuinen 74,9 melanooma melanooma
Terve luovuttaja Pahanlaatuinen 99,3 melanooma
Terve luovuttaja Paksunsuolensyöpä 98,0 20 Paksunsuolen syöpä Paksunsuolensyöpä 98,9
Taulukosta 4 näkyvät tulokset, jotka saatiin, kun ’· käytettiin SCM-testissä SCM-tekijää sellaisilta luovutta- 25 jilta, joilla oli erityyppisisä pahanlaatuisia sairauksia, sen jälkeen, kun se oli puhdistettu DEAE-selluloosan läpi, lymfosyyttien stimuloimiseen, jotka oli saatu erityyppisiä pahanlaatuisia sairauksia sairastavilta luovuttajilta tai syöpää sairastamattomilta luovuttajilta. Kuten oli odotet-30 tavissa syöpäpotilaiden lymfosyytit antoivat vasteen SCM-tekijöille, jotka oli puhdistettu DEAE-selluloosakolon-neissa, huomattavana P-arvon laskuna, kun taas pahanlaatuista sairautta sairatamattomilta luovuttajilta saaduilla lymfosyyteillä ei sellaista P-arvon laskua esiintynyt.
t il 41 92832 TAULUKKO 4
Esimerkin 3 DEAE-selluloosafraktioiden SCM-aktiivisuus 5 Lymfosyyttien luo- SCM-tekijän luo- SCM-vaste: P- vuttajan diagnoosi vuttajan diagnoo- arvo %:eina __si__kontrollista
Rintasyöpä Rintasyöpä 69,2
Rintasyöpä Keuhkoputkensyöpä 69,5
Rintasyöpä Kohdunkaulansyöpä 69,0 10 Tyvisolusyöpä-ihossa Tyvisolusyöpä- 82,0 ihossa
Terve luovuttaja Paksunsuolensyöpä 98,6
Sappirakon tulehdus Pahanlaatuinen 100,0 melanooma
Virtsaputkentulehdus Kohdunkaulansyöpä 99,8
Umpilisäkkeen Paksunsuolensyöpä 98,0 15 tulehdus
Hyvälaatuinen rinnan Rintasyöpä 97,8 kasvu
Hyvänlaatuinen aivo- Aivosyöpä 100,00 lisäkkeenkasvain 20
Esimerkki 5 SCM-tekijän viimeinen puhdistusvaihe RP-HPLC:lla Esimerkin 4 yleiset syöpään liittyvät DE-52-SCM-aktiiviset fraktiot saatettiin uudestaan käyttövalmiiksi 25 ja puhdistettiin homogeenisiksi käänteisfaasi-korkeapaine-nestekromatografisesti (RP-HPLC) käyttämällä 2,1 x 22 cm:n HPLC-kolonnia. Kolonni pakattiin Aquapore 300(tml:llä (7 mikronia). RP-HPLC-puhdistusvaiheessa käytetyt liikkuvat ; faasit olivat seuraavat: 30 Faasi A: 0,1 tilavuusprosenttia trifluoroetikkaha- pon (TFA) vesiliuosta
Faasi B: 0,09 tilavuusprosenttia TFA:n vesiliuosta 70 %:isessa asetonitriilin vesiliuoksessa
Lyofilisoidut DE-52-SCM-aktiiviset fraktiot saatettiin 42 92832 uudestaan käyttövalmiiksi steriilillä vedellä injektointia varten (ilman säilöntäaineita) ja 250 pl:n määrät injektoitiin RP-HPLC-kolonniin. Liikkuvan faasin virtausnopeus oli 50 mikrolitraa minuutissa ja sen seosprofiili oli seu-5 raava: 10 minuuttia 90 tilavuusprosenttia Faasia A, 10 tilavuusprosenttia Faasia B, jota seurasi 30 minuutin ajan Faasin B lineaarinen lisäys tasolla 3 tilavuusprosenttia minuutissa. 220 nm: n optisessa absorbanssissa havaitut optiset tiheyspiikit kerättiin käsin "nanobore"-teflonput-10 kiston kautta 1,5 ml:n muovisiin kartiomaisiin Eppendorf-sentrifuugiputkiin ja liuotin haihdutettiin tyhjiösentri-fuugissa. Kaikissa tapauksissa yleinen syöpään liittyvä SCM-tunnistustekijä eluoitui kolonnista vaiheessa, jossa Faasia B oli eluoitunut 74 tilavuusprosenttia.
15 Esimerkki 6 SCM-tekijän vaihtoehtoinen RP-HPLC-puhdistus Vaihtoehtoisesti SCM-tekijä voidaan puhdistaa HPLC:lla käyttämällä 4,6 mm x 25 cm:n HPLC-kolonnia, joka on pakattu Ultrasphere 0DS(tm!: llä (5 mikronia), jota 20 Beckman Instruments, Inc. toimittaa, yhdessä Esimerkin 4 DEAE-52-SCM-fraktioiden kanssa. Tässä kolonnissa käytetyt liikkuvat faasit ovat seuraavat:
Faasi A: 0,1 tilavuusprosenttia trifluoroetikkaha-pon (TFA) vesiliuosta 25 Faasi B: 0,1 tilavuusprosenttia TFA:ia 70 %:isessa asetonitriilin vesiliuoksessa Tämän kolonnin kohdalla käytettiin samaa menettelytapaa kuin Aquapore-kolonninkin kohdalla paitsi että liikkuvan faasin virtausnopeus oli 1,00 ml minuutissa ja seosprofii-*: 30 li 5 minuuttia 70 tilavuusprosenttia Faasia A ja 30 tila vuusprosenttia Faasia B, mitä seurasi, 20 minuutin Faasin B lineaarinen lisääminen tasolla 3,5 tilavuusprosenttia minuutissa. Optiset tiheyspiikit määritettiin 22 nm:ssä ja ne kerättiin käsin silikonoituihin lasisiin koeputkiin ja 35 liuotin haihdutettiin tyhjiösentrifuugissa. Kun tätä HPLC- • · <
II
43 9 2 8 3 2 systeemiä käytettiin, kaikissa tapauksissa yleisen syöpään liittyvän SCM-tunnistustekijän yhdeksästätoista erilaisesta syöpätyypistä, käsittäen kohdunkaulan suomusolunsyövän, rinnan adenokarsinooman, keuhkoputken adenokarsinooman ja 5 pahanlaatuisen melanooman, puhdistamisen tuloksena oli yksi ainoa optisen tiheyden aktiivisuuspiikki, joka eluoi-tui vaiheessa, jossa 56,3 tilavuusprosenttia Faasia B oli eluoitunut.
Esimerkki 7 10 Esimerkin 6 puhdistettujen RP-HPLC-valmisteiden testit
Esimerkissä 6 RP-HPLC:lla Ultrasphere-kolonnissa eristettyjen peptidien SCM-aktiivisuuden testaamista varten peptidit saatettiin uudestaan käyttövalmiiksi sterii-15 Iillä vedellä ilman säilöntäaineita suoritettavaa injek-tointia varten. SCM-vasteeseen kykenevien lymfosyyttien SCM-aktiivisuus näytteiden kanssa inkuboinnin jälkeen on esitetty taulukossa 5. Tämä fraktio aiheuttaa suurimman laskun polarisaatioarvossa, kun sitä käytetään lymfosyyt-20 tien, jotka ovat peräisin syöpää sairastavilta luovuttajilta, stimuloimiseen. Kaksi kolmesta SCM-tekijävalmis-teesta aiheutti yli 40 %:n laskun polarisaatioarvossa, joka on suurempi lasku kuin millään muulla testatulla fraktiolla. Puhdistettu tekijä oli, kuten osattiin odot-25 taa, epäspesifinen suhteessa käytettyjen lymfosyyttien luovuttajan syöpätyyppiin. Samoin kuin osattiin odottaa puhdistettu tekijä ei antanut vastetta, kun stimulointiin käytettiin terveiden luovuttajien lymfosyyttejä.
44 92832 TAULUKKO 5
Esimerkin 6 RP-HPLC-fraktioiden SCM-aktiivisuus 5 Lymfosyyttien SCM-tekijän SCM-vaste: P- luovuttajan luovuttajan arvo %:eina diagnoosi diagnoosi kontrollista
Rintasyöpä Rintasyöpä 58,9
Rintasyöpä Keuhkosyöpä 57,3 10 Paksunsuolensyöpä Rintasyöpä 55,4
Rintasyöpä Keuhkoputkensyöpä 68,0
Terve luovuttaja Rintasyöpä 99,8
Terve luovuttaja Keuhkosyöpä 101,0 15 Esimerkki 8 SCM-aktiivisten tryptisten peptidien identifikaatio ja eristäminen SCM-tekijästä
Esimerkin 5 puhdistetusta SCM-tekijästä eristettiin kuudentoista aminohapon pituinen tryptinen fragmentti.
20 Tämän fragmentin osoitettiin omaavan laajemman peptidin . täyden aktiivisuuden ja se sekvenoitiin automaattisella
Edman-hajoitusmenetelmällä. Puhdistetun SCM-tekijän katkaisu trypsiinillä ja aktiivisen fragmentin puhdistaminen suoritettiin seuraavan menetelmän mukaisesti: 25 Peptidin adsorbtiomenetyksen estämiseksi lyofili- soinnin aikana SCM-tekijä pilkottiin trypsiinillä HPLC-·.: eluenttien läsnäollessa. Trypsiinidigestio suoritettiin 0,1 M:ssa Tris-HCl-puskurissa, pH:ssa 8,3 37 °C:ssa 24 tuntia käyttäen 10 painoprosentttia trypsiiniä. Pilkottu 30 osa laimennettiin nelinkertaiseksi 0,1 tilavuusprosentti sella trifluoroetikkahapon vesiliuoksella ja injektoitiin Applied Biosystems 130A mikrovirtauserotussysteemiin.
* * · 92832 45
Tryptiset fragmentit erotettiin käyttämällä Aquapore RP-300-kolonnia (200 mm x 2,1 mm). Fragmenttien eluoimiseen käytetyt liikkuvan faasin liuottimet olivat:
Faasi A: 0,1 tilavuusprosenttia trifluoroetikka- 5 happoa (TFA)
Faasi B: 0,09 tilavuusprosenttia TFA:oa 70 %:sessa asetonitriilin vesiliuoksessa
Liikkuvan faasin virtausnopeus oli 50 μΐ minuutissa ja seosprofiili käsitti 10 minuuttia 96 tilavuusprosenttia 10 Faasia A, 4 tilavuusprosenttia Faasia B, mitä seurasi lineaarinen eluaatiogradientti, joka käsitti 30 minuutin lineaarisen nousun Faasissa B tasolla 3 tilavuusprosenttia minuutissa. SCM-aktiivinen tryptinen fragmentti eluoitui vaiheessa, jossa 69,9 tilavuusprosenttia Faasista B oli 15 eluoitunut ja vaiheessa, jossa 30,4 tilavuusprosenttia
Faasista A oli eluoitunut 30 mikrolitran kokonaistilavuutena .
Esimerkki 9 SCM-tekijän käyttö stimuloivana tekijänä SCM-tes-20 tissä
Taulukossa 6 on koottuna tulokset, jotka on saatu käyttämällä yleisiä syöpään liittyviä SCM-tunnistusteki-jävalmisteita stimuloivana tekijänä SCM-testissä eri puh-, distusvaiheista esimerkeistä 1, 3 ja 6. Kun lymfosyyttejä, 25 jotka on saatu useita erilaisia pahanlaatuisia tauteja sairastavilta luovuttajilta, käytettiin yhdessä esillä olevan keksinnön mukaisen tekijän kanssa SCM-testissä, kaikissa tapauksissa havaittiin merkittävä vaste. Tämä vaste näkyy taulukossa 6 kontrollipolarisaatioarvosta, 30 joka on saatu käyttämällä samojen lymfosyyttien, joita ei oltu inkuboitu tekijän kanssa, SCM-mittausta. Mitä pienempi arvo sitä voimakkaampi vaste tekijää kohtaan SCM-testissä. Jopa testatun tekijän raa'in valmiste, ultrasuodos, aiheutti laskun polarisaatioarvossa 18,0 %:ista 37,1 %:iin 35 ja kaikista puhtain fraktio, joka oli puhdistettu RP- 92832 46 HPLCrlla, aiheutti jopa 44,6 %:n laskun polarisaatioarvos-sa. Tämän keksinnön mukainen tekijä on spesifinen ja aiheuttaa laskun polarisaatioarvossa vain, kun käytetään syöpää sairastavilta luovuttajilta saatuja lymfosyyttejä.
5 Ei edes RP-HPLC:lla puhdistettu fraktio aiheuttanut laskua polarisaatioarvossa, kun sitä käytettiin stimuloimaan terveiden luovuttajien lymfosyyttejä.
TAULUKKO 6 10
Esimerkkejä SCM-aktiivisuudesta eri puhdistusvaiheissa (Esimerkki 9)
Puhdistusvaihe P-arvon laskun prosentti- rajat, kun on käytetty syöpäpotilaiden lymfosyyttejä 15 Plasman ultrasuodos 18,0-37, 1 (1000 Daltonin painoraja)
Sephadex G-50-fraktio 19,8 - 37,0 DE-52-selluloosafraktio 18,0 - 31,0 RP-HPLC-fraktio 32,0 - 44,6 20
Yksikään fraktio ei osoittautunut aktiiviseksi testattaessa terveiden luovuttajien lymfosyyttejä vastaan tai ei-pahanlaatuista tautia sairastavien luovuttajien lymfosyyttejä vastaan.
25
Esimerkki 10
Esimerkin 8 SCM-aktiivisen tryptisen peptidin käyttö
Tryptinen peptidi, jonka puhdistus kuvattiin edellä 30 esimerkissä 8, on aktiivinen standardi SCM-testissä. Noin • 4 >
V
92832 47 5 x 10‘2 femtogrammaa tätä fragmenttia (toisin sanoen 5 x 10'17 grammaa tai noin 16 000 molekyyliä fragmenttia) oli täysin aktiivinen testissä. Kun fragmentti eristettiin keuhkosyöpää sairastavilta potilailta, se osoittautui ak-5 tiiviseksi SCM-testissä, kun sitä testattiin lymfosyyttejä vastaan, jotka oli eristetty potilailta, joilla oli pieni-solukeuhkosyöpä ja se ristiinreagoi täysin lymfosyyttien kanssa, jotka olivat peräisin potilaalta, jolla oli rinnan rauhaskudossyöpä, kuten taulukosta 7 näkyy. Kuitenkaan 10 mitään vastetta ei huomattu, kun käytettiin terveiden luovuttajien lymfosyyttejä.
TAULUKKO 7 15 Esimerkin 8 tryptisen fragmentin SCM-aktiivisuus keuhkosyövästä
Lymfosyyttien luovuttajan SCM-vaste: P-arvo prosent- diagnoosi teinä kontrollista 20 Pienisolukeuhkosyöpä 7,0; 68,0
Rintarauhassyöpä 67,5; 68,0
Terveet luovuttajat 102,0; 104,0
Esimerkki 11 25 SCM-tekijän ristiinreagoivuus
Seuraava esimerkki kuvaa SCM-tekijän kykyä aiheuttaa vaste SCM-testissä, kun stimuloimiseen käytetään lymfosyyttejä, jotka ovat peräisin luovuttajilta, jotka sairastavat erityyppisiä syövän muotoja. Tämän ristiireagoi- 30 vuuden osoittamiseksi joukosta syöpäpotilailta saatuja verinäytteitä otettiin kaksi millilitraa soluvapaata veriplasmaa. Verinäytteet oli alunperin kerätty heparinisoi-tuihin Vacutainer(tm)-putkiin. Näytteet ultrasuodatettiin 92832 48
Amicon UM2- tai YM2-suodattimien läpi, joiden nimellinen molekyylipainoraja on 1000 daltonia, ainakin 12 tuntia ja säilytettiin steriileissä olosuhteissa 4 °C:ssa. Potentiaalisesti SCM-vasteeseen kykenevät lymfosyytit eristettiin 5 heparinisoiduista verinäytteistä potilailta, joilla oli syöpä, terveiltä luovuttajilta ja ei-pahanlaatuisia tauteja sairastavilta luovuttajilta. Yleisen syöpään liittyvän SCM-tunnistustekijän sisältämien ultrasuodosten aktiivisuuden ja syöpäspesifisyyden testaamiseksi inkuboitiin 10 0,7 5 ml:n määräeriä potentiaalisesti SCM-vasteeseen ky keneviä lymfosyyttejä (5 x 106 solua/ml PBS:ssa) inkuboitiin 40 minuutin ajan 37 °C:ssa yhdessä ultrasuodosten kanssa. Jokaiseen analyysiin käytettiin 0,075 ml ultrasuo-dosta. SCM-testit suoritettiin kuten aikaisemmin on kuvat-15 tu L. Cercekin ja B. Cercekin artikkelissa "Application of the Phenomenon of Changes in the Structuredness of Cytoplasmic Matrix (SCM) in the Diagnosis of Malignant Disorders: a Review", Europ. J. Cancer 13, 903-915 (1977) ja aikaisemmassa B. Cercekin ja L. Cercekin patenttihakemuk-20 sessa, sarjanumero 867 079, joka on jätetty 27. toukokuuta 1986 ja otsikoitu "Method for Measuring Polarized Fluorescence Emissions". SCM-analyysissä solunsisäisen fluo-resenssipolarisaation arvon (P-arvo) ainakin 10 %:n laskua pidettiin stimuloivan ultrasuodoksen positiivisena vastee-25 na. 1 · 92832 O 4-> 49
P 3 G
G 0) H ·η •H 0) (0 CO >4->4->00(NCNMncS(N N (N N Cl N (N rH Ό O ^ d).p\\N\\\ \ I \ \ \ \ O 0)0)30000000 O O O O O O oo G &h > >
Dl
rt) I
•H O I
Ό >1 -H
g rt) g μ I co 3 oo en ^ co cm oi oi en en es es h 0) -h aa g \ i \ \\ \ i \ i \ \ \ en ω a p o o o o o o ooooo oo *
3 I
W rt) CC
3 a 3 a) »o
3 (0 CO H a CM H rH CMtHHrHtHHCOCMHCO H
> 4-> ϋ 0O\\ \ I \ I \
•H rt) 3 ^ CM rH *—I CM rH rH rH r—(iHOOOO O
0 4-> d· CO CO
D) 3
K) -P I
a) -H G aO , _ u x -p a γο<Ν(τ)(Ν(Ν<ΝγΗ(Νγη<ν^Η'-ιήή <n n G £ e =0 \\
•H 3 -H ΪΗ COCMCOCHCMCNiHCHrHCMOOOO OO
•H -P kg — P \
M -P
•h a) i ao „ p co o a oo o’ , , o’ X >aD \ i i i i i i i i ^ i i i i ^ ' G 3 -h >i en o) o Q) G < co Ό a 3 (0 l
3 -P O
CO X aö
•H -P JG a inNNNNNHN H N O) CO
> (0 3 ¢1 \ I I \ \ I I \ ^
00 Ή > Q) >i inNNNNNHN OO OO
•H -H «CO
0 -P 0
« X D) I
x G rt) G
01 G i G ao j Σ p g -n a OCJ e P O CM cm CO h h < W G .................1 > E-ι gsggcmcmcoh o
C G
G T-) Il
P G CC
G -P 3 G ao 0 -P Ό rH a Ό 3 .G GOCOCNCOCMLDCOHCO CM n h h cm 0 > o G \ I \ I \ \N I \ 3 o ««gcocmcocmidcohco cm ooo o CO 3
G ΓΗ II
P CO
P C 3 >1
H -H «G
3 -P p aO CM H rH CM rH VO H
>i-*3a0a0\\\\\l I \ I I I I \ I I I
H G K a Oj CM H rH CM H VO O
en en G o en ao h ή g i a
X EH 3 0 rH H rH H CM CM H I
P >ιΗ3>ι I \ \ \ \ \ \ \ 1 I I I I II
G J O CO G rH iH iH rH CM CM <H G
6 -H G
•H G 3 G l m > ό en 3 o -p
ω ao G £ 3 Ό > G
Or aOaO G G G Ό £ -H G ό
Ό aa g«rHX)GGG-HG
>i aO O aD 033GG>H G-P
G en a>i>i aoOH-PHH3C>-P
; G O G G aC0C3G-PGG3 en G >i G G OGGGP>aCCG>
ϋ G ao G G G G iHrH -H GC G -H «O
OG a«aOCHH GG««0-PH3 3
Ό τ~ί -H O -P a G 3 O aOE3J*.*30-PCH
O G G >i30oG 3 aö aO -P afl G G 3 G G
3 -p o Ga>iP«Gaa · gpsggg-p
G-PO OOGGCCaOCiHC-HG-PGrH^G
G 3 G Ji«GG33>i3C0rHGÄ3C«G
p>3) X:jO+JG,OGG«Ge-H-PGGaOaO>
P O G 33CCÄ«3PX:PaPH«>GP
H 3 H GGH30G33GGEH3G>i-HG
OHO ««Κ5:«ΛΜ«ΛΕΟ>Ε-<ΛΚΗΕ-· 92832 50
Kuten Taulukon 8 tulokset osoittavat yleiset syöpään liittyvät SCM-tunnistustekijät, jotka olivat peräisin yhdeksästä eri syöpätyypistä, aiheuttivat vasteen potentiaalisesti SCM-vasteeseen kykenevillä lymfosyyteillä, 5 jotka oli saatu potilailta, jotka edustivat kahdeksaa erilaista syöpätyyppiä. Vastakohtana terveiltä luovuttajilta ja muita kuin syöpäsairauksia sairastavilta luovuttajilta saadut plasman ultrasuodokset eivät antaneet mitään positiivisia SCM-vasteita. Myöskään terveiltä luovuttajilta ja 10 muita kuin syöpäsairauksia sairastavilta luovuttajilta saadut potentiaalisesti SCM-vasteeseen kykenevät lymfosyytit eivät reagoineet mihinkään ultrasuodokseen SCM-testis-sä.
Esimerkki 12 15 SCM-vasteen muuttaminen SCM-tekijällä
Hyvänlaatuisten lymfosyyttien SCM-vasteen muuttumisen osoittamiseksi inkuboimalla SCM-tekijän kanssa potentiaalisesti SCM-vasteeseen kykenevät lymfosyytit eristettiin terveiden luovuttajien verinäytteistä ja suspendoi-20 tiin täydelliseen Dulbeccon fosfaattipuskurisaliiniin (PBS) tiheydellä 5 x 105 solua/ml kuten edellä mainitussa European Journal of Cancerin artikkelissa on kuvattu samoin kuin aikaisemmassa B. Cercekin patenttihakemuksessa, sarjanumero 838 264, joka on jätetty 10. maaliskuuta 1986 25 ja jonka otsikko on "Automated Collection of Buoyant Density Specific Cells from Density Gradients". Näiden solujen määräeriä inkuboitiin 3 ml:ssa seuraavia aineita: (a) soluvapaata veriplasmaa syöpäpotilaista; (b) plasmaa, joka oli peräisin syöpäpotilailta ja jota oli ultrasuodatettu ; 30 12 tunnin ajan Amicon UM2-suodattimen läpi, jonka molekyy- lipainoraja on 1000 daltonia; (c) plasmaa, joka oli saatu syöpäpotilailta ja joka oli ultrasuodatettu 12 tuntia Amicon UM5-suodattimen läpi, jonka nimellinen molekyyli-painoraja on 500 daltonia; (d) yleista syöpään liittyvää 35 SCM-tekijää, joka oli puhdistettu suolat poistavan 92832 51
Sephadex G-10-kolonnin läpi; (e) tekijää, joka oli puhdistettu Sephadex G-50-kolonnin läpi; (f) tekijää, joka oli puhdistettu DEAE-selluloosakolonnin läpi; (g) tekijää, joka oli puhdistettu viimeisen RP-HPLC-vaiheen läpi; ja 5 (h) plasmaa, joka oli peräisin terveiltä luovuttajilta ja joka oli ultrasuodatettu Araicon UM2-suodattimen läpi, jonka nimellinen molekyylipainoraja on 1000 daltonia. Nämä inkubaatiot kestivät 2,5 tuntia.
SCM-tekijän kyky muuttaa terveiltä luovuttajilta 10 saatujen lymfosyyttien SCM-vastetta osoitettiin määrittämällä lymfosyyttien SCM-vastesuhde (RR^) jokaisen edellä mainitun fraktion kanssa suoritetun inkuboinnin jälkeen. Ennen kuin inkuboidut solut saatettiin kosketuksiin joko mitoosia aiheuttavan tekijän tai SCM-tekijän kanssa RR^in 15 määrittämiseksi, ne pestiin huolellisesti. Muuttumisen tapahtuminen tai sen puuttuminen määritettiin lymfosyyt-tisuspension, joka oli ollut lyhyen aikaa kosketuksissa SCM-tekijän sisältävän substraatin kanssa, polarisaatioar-von suhteena lymfosyyttisuspension, joka oli ollut lyhyen 20 aikaa kosketuksissa fytohemagglutiinin (PHA) kanssa, pola-risaatioarvoon. SCM-testimenetelmän mukaisesti alle 1,0:n RR^-arvo on positiivinen indikaatio luovuttajassa olevasta pahanlaatuisesta sairaudesta kun taas 1,1 ja sitä suurempi RR^-arvo indikoi pahanlaatuisen sairauden puuttumista.
52 92832 TAULUKKO 9
Terveiltä luovuttajilta peräisin olevien lymfosyyttien SCM-vasteiden muuttaminen SCM-tekijällä (esimerkki 12) 5 ___
Muuttamiseen käytetty Ennen muutta- ^scm: Muuttami-SCM-valmiste__mistä__sen jälkeen_
Soluvapaa syöpäveri- 1,38 0,80 plasma___ 10 Syöpäsoluveriplasman 1,35 0,78 ultrasuodos (1000 Daltonin raja)___
Sephadex G-10 (SCM- 1,40 0,80 aktiivinen)___ 15 Sephadex G-50 (SCM- 1,38 0,73 aktiivinen)__.__ DEAE-selluloosa (SCM- 1,39 0,70 aktiivinen)___ RP-HPLC (SCM-aktii- 1,40 0,65 2 0 vinen)___
Syöpäsoluveriplasman 1,38 1,38 ultrasuodos (500 Daltonin raja)___
Terveiden luovutte- 1,38 1,38 25 jien autologisen al- logeenisen veriplas- man ultrasuodos___
Taulukosta 9 näkyy SCM-tekijää sisältävien frakti-30 oiden kanssa tapahtuneen inkuboinnin vaikutus lymfosyyttien vasteeseen joko SCM-tekijään tai fytohemagglutiiniin RRscm-arvona. Lymfosyyttien, joita joko ei oltu esi-inku-boitu tai joita oli esi-inkuboitu terveiltä luovuttajilta ·* peräisin olevan ultrasuodoksen kanssa, joka oli suodatet- 35 tu nimelliseltä molekyylipainorajaltaan 1000 daltonin suodattimen läpi, tai joita oli esi-inkuboitu ultrasuodoksen kanssa, joka oli peräisin syöpää sairastavilta luovuttajilta ja joka oli suodatettu nimelliseltä painorajaltaan 500 daltonin suodattimen läpi, RR^-arvo oli
II
92832 53 1,35 tai suurempi kuten oli odotettukin. Sen sijaan kaikkien lymfosyyttien, joita oli esi-inkuboitu SCM-tekijää sisältävien fraktioiden kanssa, RR^-arvo oli laskenut 0,65-0,80:een, joka on tyypillinen lymfosyyteille, jotka 5 alunperin on eristetty pahanlaatuista tautia sairastavilta potilailta.
Esimerkki 13 SCM-tekijän vaikutus lymfosyyttien sytotoksisuu- teen 10 SCM-tekijän vaikutuksen potentiaalisesti SCM-vas- teeseen kykenevien lymfosyyttien sytotoksisuuteen pahanlaatuisia soluja vastaan osoittamiseksi näitä lymfosyyttejä, jotka oli saatu terveiltä luovuttajilta, inkuboi-tiin 2 1/2 tuntia 37 °C:ssa plasman kanssa, joka sisälsi 15 SCM-tekijää, joka oli eristetty kuten edellä on kuvattu syöpää sairastavien luovuttajien verinäytteistä. Näiden lymfosyyttien määräerät säilytettiin kontrolleina eikä niitä inkuboitu. Lisäksi potentiaalisesti SCM-vasteeseen kykenevät lymfosyytit saatiin luovuttajilta, joilla ei 20 ollut syöpää, ja niitä käsiteltiin samalla tavalla - muutamia määräeriä inkuboitiin SCM-tekijää sisältävän plasman kanssa ja muut säilytettiin kontrolleina eikä niitä inkuboitu.
Inkuboinnin jälkeen lymfosyyttien sytotoksisuus 25 testattiin menetelmällä, jonka M. R. Potter ja M. Moore ovat kuvanneet artikkelissaan "Natural Cytotoxic Reactivity of Human Lymphocyte Subpopulations", Immunology 37, 187-194 (1979). Tämän julkaistun menetelmän mukaisesti ihmisen myeloidisolulinjan K 562 soluja, jotka oli 3 0 leimattu 51Cr:lla, käytettiin analyysin kohdesoluina.
Kohdesolujen suhde vaikuttajasoluihin oli 1:20. 51Cr:n vapautuminen osoittaa, että vaikuttajasolut ovat toksisia kohdesoluille. Sytotoksisuus määritetään seuraavalla tavalla : 54 92832
Rs - Rc
Sytotoksisuusprosentti = -
Rt - Rc 5 jossa Rs on 51Cr:n vapautumisprosentti näytteessä, R,. on 51Cr:n vapautumisprosentti kontrollissa ja R, on 5lCr:n vapautumisprosentti detergentin, Triton X-100:n, läsnäollessa. Tulokset on esitetty taulukossa 10. Nämä tulokset 10 osoittavat, että terveiltä luovuttajilta saatujen potentiaalisesti SCM-vasteeseen kykenevien lymfosyyttien inku-bointi 2,5 tunnin ajan ultrasuodoksen kanssa, joka oli suodatettu nimelliseltä painorajaltaan 1000 daltonin suodattimen läpi, vähensi niiden sytotoksisuutta yli 90 15 %:lla. Kun inkubointi suoritettiin syöpäpotilailta saatujen potentiaalisesti SCM-vasteeseen kykenevien lymfosyyttien kanssa, sytotoksisuuden lasku oli pienempi, 40-90 %. Kuitenkin sellaisten syöpäpoilailta saatujen lymfosyyttien sytotoksisuustasot olivat matalampia ennen in-20 kubointia, ja ultrasuodoksen kanssa suoritetun inkuboin-nin jälkeen jäljelle jäänyt sytotoksisuustaso oli verrannollinen tasoon, joka oli jäljellä terveiltä luovuttajilta peräisin olevien lymfosyyttien inkuboinnin jälkeen. Syöpäpotilailta peräisin olevissa soluissa esiintyvä al-25 haisempi sytotoksisuustaso oli yhtenevä siihen sytotoksisuuden laskuun, jonka aiheutti solujen saattaminen kosketuksiin in vivo sellaisten tekijöiden kuin esillä olevan keksinnön mukaisten yleisten syöpään liittyvien SCM-tun-nistustekijoiden kanssa.
tl 92832 55
I I
3 0 3 U co a 1 P 3 3 si Λ H x co innporscninooin 0 O <0 P *«»***»*'*· to p p p H-S'coOcnorocjiHO'i
•H O P O'O'O'O'CriO'OCOO'CO
Ό P C C
•rt >1 0) O
o (Λ Ό to
(H
0)
tH I C
E co p
3 C
C 3 C
0) co p c vo n to p o <D es o c^- rs ro p r^ p m p rl to a tl g X 3 X espoesoesesvopro 2 O p x p
•H P P C aO
O P H TO C CO PC
0)p >1 Q)
Q) CO CO
P ·Η O
3 x c μ 3 Λ! o a CO U p I (0 PO p cp
CO E p p P
X Ή >1 C OOOOOO-'tfOCNvo O CO >1 Cp ---------- po co oo oopMPcor^oinav o — O CP h co p es h rs p rs es PC p C 3 o c e ω x O P (0 >1
X P (0 H
S p p
5 >i M
P >1 (0 P
5 W > CO
<0 too &h y-ι es co c o n vo co O C ao a0 a0 a0 a0 a0 >i in o -o di aa a a a a
P Ό P (0 O O a0 a0 aOOOOO
x, o x ‘M >i^aa a><>i>i>i c 3 o Ό C0C0OO o to to 10 10
OCO EP C C >1 >1 >iCCCC
0(0 CO I C (OOCOCfl «00(0(0
M ·η O Σ <0 p.*CCa0C.*.*HH
PC TDCJ-O 3 P aö aO a aO P P 3 3 HP OM® (03a0a0aDa033(0(0 pp 3 p .^aaa^aaa.*.* O C0CP COCCC0COOCC' C (0(03 3 .* 3 3 3 3 Λ.* 3 3 2 μ>> ΌΡΛίΛίΡΛίΡΡ'σ'Ό
o POO P3^i^0(s33PP
3 P P 3 0033P30000 h dop 0}
3 I
p i P p es o vj m
3 >1 >1 aö aO
,ii p ä >1 c 10(0(0(0(0 aa
p P CO (0 -I—> ·Γ-> -I—) -t—) -t—) ® O O
ίο coco-1-) (0(0(0(0(0 a >1 >1 : > OOPio ppppp o co co
co O E P PPPPP >iCC
c P CO >1 P 33333 C0(0O
a0 POP3 >>>>>afla0CP.* •n (oo >p oooooaatosp P (0PCOC0 33333OaD-i-)(03 X P to O 3 O ppppp >i ί* ί-ι Λ! a
0 P (0 P P O COCOtOCO
P C>> C OOOOOPPW3.*
1 O I O C O) >>>>>PP(0O.C
§psco(0 μμμμμο33Λ3 O O O p p OOOOOP3300 56 92832
Vaikka esillä oleva keksintö on kuvattu huomattavan yksityiskohtaisesti sen tiettyjen edullisten versioiden osalta, muutkin versiot ovat mahdollisia. Sen vuoksi liitteenä olevien patenttivaatimusten luonnetta ja piiriä 5 ei pidä rajoittaa koskemaan vain tässä esitettyjä edullisia versioita.
II
Claims (31)
1. Yleinen syöpään liittyvä SCM-tunnistustekijä, tunnettu siitä, että se käsittää alhaisen mole- 5 kyylipainon omaavan peptidin, joka läpäisee suodattimet, joiden nimellinen molekyylipainoraja on 1000 daltonia mutta ei suodattimia, joiden nimellinen molekyylipainora-ja on 500 daltonia, tekijän aiheuttaessa ainakin kymmenen prosentin laskun syöpää sairastavilta luovuttajilta pe-10 räisin olevien SCM-vasteeseen kykenevien lymfosyyttien solunsisäisessä fluoresenssipolarisaatioarvossa standardi SCM-testillä määritettynä.
2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen tekijä, tunnettu siitä, että se on puhdistettu homogeeniseksi.
3. Yleinen syöpään liittyvä SCM-tunnistustekijä, tunnettu siitä, että se käsittää peptidejä, jotka sisältävät vähintään kolmetoista aminohappotähdettä sisältäen sekvenssin Phe-R^Lys-Pro-Phe-R^Phe-Rj-Met-R^Rj-R<5-R7, jossa Rj on Asn tai Gin, R2, R3 ja R* ovat kukin it-20 senäisesti Vai, Leu tai Ile, R5 on Asp tai Glu ja R6 ja R7 ovat kumpikin itsenäisesti Asn tai Gin.
4. Patenttivaatimuksen 3 mukainen tekijä, tunnettu siitä, että se kykenee muuttamaan pahanlaatuista tautia sairastaroattomilta luovuttajilta peräisin 25 olevien SCM-vasteeseen kykenevien lymfosyyttien SCM-vas- tetta, kun tekijä saatetaan kosketuksiin tällaisten SCM-vasteeseen kykenevien lymfosyyttien kanssa, jolloin lymfosyytit reagoivat kontaktin jälkeen SCM-testissä syöpään liittyviin antigeeneihin mutta ei mitoosia aiheuttaviin 30 aineisiin.
5. Patenttivaatimuksen 3 mukainen tekijä, tunnettu siitä, että se kykenee vähentämään potentiaalisesti SCM-vasteeseen kykenevien lymfosyyttien spontaania in vitro -toksisuutta ihmisen myeloidisolulinjaa K 35 562 vastaan ainakin 90 %:lla 51Cr-vapautumisena mitattuna. 58 92832
6. Patenttivaatimuksen 3 mukainen tekijä, tunnettu siitä, että sen likimääräinen aminohappokoostumus on Asx2, G1x3, Ser, His, Gly5, Thr, Ala3, Tyr, Met, Val3, Phe3, Ile, Leu3, Lys2.
7. Patenttivaatimuksen 3 mukainen tekijä, tunnettu siitä, että tekijässä olevan kuusitoista aminohappoa käsittävän segmentin aminohapposekvenssi on Phe-Asn-Lys-Pro-Phe-Val-Phe-Leu-Met-Ile-Asp-Gln-Asn-Phe-Ser-Lys, joka sekvenssi ei sisällä tekijän aminopäätä, 10 tekijän aiheuttaessa ainakin kymmenen prosentin laskun syöpää sairastavilta luovuttajilta peräisin olevien SCM-vasteeseen kykenevien lymfosyyttien solunsisäisessä fluo-resenssipolarisaatioarvossa standardi-SCm-testillä määritettynä.
8. Patenttivaatimuksen 3 mukainen tekijä, tun nettu siitä, että tekijässä olevan viisitoista aminohappoa käsittävän segmentin aminohapposekvenssi on Phe-Asn-Lys-Pro-Phe-Val-Phe-Leu-Met-Ile-Asp-Gln-Asn-Thr-Lys, joka sekvenssi ei sisällä tekijän aminopäätä, tekijän ai-20 heuttaessa ainakin kymmenen prosentin laskun syöpää sairastavilta luovuttajilta peräisin olevien SCM-vasteeseen kykenevien lymfosyyttien solunsisäisessä fluoresenssipo-larisaatioarvossa standardi-SCm-testillä määritettynä.
9. Patenttivaatimuksen 3 mukainen tekijä, t u n -25 n e t t u siitä, että se käsittää 15 aminohappoa sisältävän peptidin, jonka aminohapposekvenssi on Phe-Asn-Lys-Pro-Phe-Val-Phe-Leu-Met-Ile-Asp-Gln-Asn-Thr-Lys, tekijän aiheuttaessa ainakin kymmenen prosentin laskun syöpää sairastavilta luovuttajilta peräisin olevien SCM-vastee- 30 seen kykenevien lymfosyyttien solunsisäisessä fluoresens-sipolarisaatioarvossa standardi-SCm-testillä määritettynä .
10 P = (Iv - GIh)/(Iv + GIh) , jossa Iv ja IH ovat polarisoituja fluoresenssivoimakkuus-arvoja vertikaalisissa ja horisontaalisissa tasoissa, vastaavasti, ja G on korjauskerroin polarisoidun valon 15 horisontaalisten ja vertikaalisten komponenttien spektro- fotometrin optisen systeemin epätasaisen läpäisyn huomioimiseksi .
10. Patenttivaatimuksen 3 mukainen tekijä, tunnettu siitä, että se käsittää 16 aminohappoa sisäl- 35 tävän peptidin, jonka aminohapposekvenssi on Phe-Asn-Lys- tl 59 92832 Pro-Phe-Val-Phe-Leu-Met-Ile-Asp-Gln-Asn-Phe-Ser-Lys, tekijän aiheuttaessa ainakin kymmenen prosentin laskun syöpää sairastavilta luovuttajilta peräisin olevien SCM-vas-teeseen kykenevien lymfosyyttien solunsisäisessä fluo-5 resenssipolarisaatioarvossa standardi-SCm-testillä määri tettynä .
11. Patenttivaatimuksen 10 mukainen tekijä, tunnettu siitä, että 5 x 10'2 femtogrammaa peptidiä aiheuttaa ainakin 30 prosentin polarisaatioarvon las- 10 kun, kun sitä käytetään syöpää sairastavilta luovuttajilta saatujen SCM-vasteeseen kykenevien lymfosyyttien sti-muloimiseen.
12. Menetelmä lymfosyyttien testaamiseen, tunnettu siitä, että nisäkäsluovuttajasta saatuja lym- 15 fosyyttejä käytetään luovuttajassa mahdollisesti olevan syövän osoittamiseen ja menetelmä käsittää seuraavat vaiheet : (a) saatetaan lymfosyyttisuspensio kosketukseen patenttivaatimuksen 1 tai 3 mukaisen yleisen syöpään 20 liittyvän SCM-tunnistustekijän kanssa, ja (b) määritetään lymfosyyttien sytoplasmisen aineksen rakentuneisuuden väheneminen, joka on seurausta lym-fosyyttisuspension ja tekijän välisestä kontaktista.
13. Patenttivaatimuksen 12 mukainen menetelmä, 25 tunnettu siitä, että tekijä käsittää peptidejä, joissa on vähintään kolmetoista aminohappotähdettä sisältäen sekvenssin Phe-R1-Lys-Pro-Phe-R2-Phe-R3-Met-R4-Rs-R6-R7, jossa R, on Asn tai Gin, R2, R3 ja R4 ovat kukin itsenäisesti Vai, Leu tai Ile, R5 on Asp tai Glu ja R$ ja R7 30 ovat kumpikin itsenäisesti Asn tai Gin.
14. Patenttivaatimuksen 13 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että tekijä käsittää peptidin, jonka aminohapposekvenssi on Phe-Asn-Lys-Pro-Phe-Val-Phe-Leu-Met-Ile-Asp-Gln-Asn-Thr-Lys. 60 92832
15. Patenttivaatimuksen 13 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että tekijä käsittää peptidin, jonka aminohapposekvenssi on Phe-Asn-Lys-Pro-Phe-Val-Phe-Leu-Met-Ile-Asp-Gln-Asn-Phe-Ser-Lys.
16. Patenttivaatimuksen 12 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että tekijän sisältämän kuudentoista aminohapon segmentin aminohapposekvenssi on Phe-Asn-Lys-Pro-Phe-Val-Phe-Leu-Met-Ile-Asp-Gln-Asn-Phe-Ser-Lys segmentin sisältämättä tekijän aminopäätä.
17. Patenttivaatimuksen 12 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että tekijän sisältämän viidentoista aminohapon segmentin aminohapposekvenssi on Phe-Asn-Lys-Pro-Phe-Val-Phe-Leu-Met-Ile-Asp-Gln-Asn-Thr-Lys segmentin sisältämättä tekijän aminopäätä.
18. Patenttivaatimuksen 12 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että sytoplasmisen aineksen ra-kentuneisuuden vähenemisen määrittäminen käsittää seuraa-vat vaiheet: (a) mitataan fluoresenssipolarisaatio, Ps, lymfo- 20 syyttierälle, joka on saatettu kosketukseen tekijän kanssa, (b) mitataan fluoresenssipolarisaatio, Pc, toiselle lymfosyyttierälle, jota ei ole saatettu kosketukseen , tekijän kanssa, ja 25 (c) määritetään Ps:n suhde Pc:hen, jolloin kun Ps:n suhde Pc:hen on alle noin 0,9, se indikoi pahanlaatuista sairautta lymfosyyttien luovuttajassa.
19. Patenttivaatimuksen 12 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että sytoplasmisen aineksen ra- . 30 kentuneisuuden vähenemisen määrittäminen käsittää seuraa- < vat vaiheet: (a) mitataan fluoresenssipolarisaatio, Ps, lymfosyyttierälle, joka on saatettu kosketukseen tekijän kanssa; 35 (b) mitataan fluoresenssipolarisaatio, PM, toisel- II 92832 61 le lymfosyyttierälle, joka on saatettu kosketukseen mitoosia aiheuttavan aineen kanssa, joka on fytohemagglu-tiniini, konkanavaliini A tai kermesmarjasta saatu mitoosin aiheuttajan, ja 5 (c) määritetään SCM-vastesuhde, RRSCM Ps:n ja PM:n välisenä suhteena, jolloin noin alle 0,9:n RRSCM-arvo indikoi pahanlaatuista sairautta lymfosyyttien luovuttajassa .
20. Verinäytteen seulontamenetelmä verinäytteen 10 luovuttajassa mahdollisesti olevan pahanlaatuisen sairauden osoittamiseksi, tunnettu siitä, että se käsittää seuraavat vaiheet: (a) potentiaalisesti SCM-vasteeseen kykenevät lymfosyytit erotetaan verinäytteestä, 15 (b) saatetaan erotetut lymfosyytit kosketukseen patenttivaatimuksen 1 tai 3 mukaisen tekijän kanssa tällä tavalla stimuloiden lymfosyyttejä, (c) saatetaan stimuloidut lymfosyytit kosketukseen fluorogeenisen tekijän prekursorin kanssa riittävän pit-20 käksi aikaa, jotta prekursori ehtii tunkeutua lymfosyyt- teihin solunsisäisen entsymaattisen hydrolyysin avulla tapahtuvaa fluorogeenisen yhdisteen syntymistä varten tällä tavoin stimuloiden fluoria sisältäviä lymfosyyttejä; 25 (d) viritetään stimuloidut fluoria sisältävät lym fosyytit polarisoidulla valolla saattaen lymfosyytit tällä tavoin fluorisoimaan, (e) mitataan fluorisoivien lymfosyyttien vertikaalisesti ja horisontaalisesti polarisoivat fluoresenssi- 30 emissiot fluorisoivien lymfosyyttien polarisaatioarvon * määrittämiseksi, ja (f) verrataan stimuloiduille fluoria sisältäville lymfosyyteille määritettyä polarisaatioarvoa lymfosyyttien kontrollierän polarisaatioarvoon, joka lymfosyytti- 35 erä on peräisin samalta luovuttajalta ja on käynyt läpi 92832 62 vaiheet (a), (c), (d) ja (e) mutta ei vaihetta (b) tällä tavoin indikoiden syövän olemassaoloa tai sen puuttumista lymfosyyttien luovuttajan ruumiissa.
21. Patenttivaatimuksen 20 mukainen menetelmä, 5 tunnettu siitä, että lymfosyytit viritetään vertikaalisesti polarisoidulla valolla ja polarisaatioarvot määritetään fluoresenssispektrofotometrillä seuraavan kaavan mukaisesti:
22. Patenttivaatimuksen 20 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että vaiheet (b) ja (c) tapahtu- 20 vat samanaikaisesti.
23. Menetelmä yleisen syöpään liittyvän SCM-tun-nistustekijän tason määrittämiseksi ruumiinnesteessä, tunnettu siitä, että käytetään patenttivaatimuksen 1 tai 3 mukaisen yleisen syöpään liittyvän SCM-tun- 25 nistustekijän vasta-ainetta in vitro-immunoanalyysissä.
24. Menetelmä yleisen syöpään liittyvän SCM-tun-nistustekijän tuottamiseksi, tunnettu siitä, että se käsittää seuraavat vaiheet: (a) otetaan ruumiinnestettä syöpää sairastavalta . 30 luovuttajalta, (b) erotetaan ruumiinnesteen ensimmäisen fraktion, joka käsittää näennäiseltä molekyylipainoltaan yli 1000 daltonin molekyylit, toisesta fraktiosta, joka käsittää näennäiseltä molekyylipainoltaan alle 1000 daltonin mole- 35 kyylit, ja 92832 63 (c) puhdistetaan toinen fraktio yleisen syöpään liittyvän SCM-tunnistustekijän aikaansaamiseksi, joka tekijä aiheuttaa ainakin kymmenen prosentin laskun syöpää sairastavilta luovuttajilta peräisin olevien SCM-vastee-5 seen kykenevien lymfosyyttien solunsisäisessä fluoresens-sipolarisaatioarvossa standardi-SCM-testillä määritettynä .
25. Patenttivaatimuksen 29 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että ruumiinneste on ääreisverta, 10 virtsaa ja plasmaa.
26. Patenttivaatimuksen 24 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että toinen fraktio erotetaan ensimmäisestä fraktiosta suodattamalla ruumiinneste nimelliseltä molekyylipainorajaltaan 1000 daltonin suodattimen 15 läpi.
27. Patenttivaatimuksen 24 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että se käsittää lisäksi toisen fraktion suolan poiston viemällä toinen fraktio geelisuo-datuskolonniin, jonka fraktiointialue ulottuu 0:sta 700 20 daltoniin ja joka kykenee poistamaan suolat siitä, eluoi- malla lisätty materiaali kolonnista tislatulla vedellä ja talteenkeräämällä se osa, joka eluoituu eluutiotilavuute-na, joka on noin 0,3 - 0,5 kertaa koko kromatografia-alustan tilavuus, tällä tavalla lisäten yleisen syöpään 25 liittyvän SCM-tunnistustekijän spesifistä aktiivisuutta kerätyssä suolattomassa osassa suhteessa patenttivaati muksen 24 toisen fraktion spesifiseen aktiivisuuteen.
28. Patenttivaatimuksen 27 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että se lisäksi käsittää seuraa- 30 vat vaiheet: ’ (a) talteen kerätty suolaton osa viedään geelisuo- datuskolonniin, jonka fraktiointialue on noin 1500 -30 000 daltonia, (b) vaiheessa (a) kolonniin lisätty materiaali 35 eluoidaan kolonnista laimealla ammoniumsuolan vesiliuok- 92832 64 sella, ja (c) kerätään talteen se osa, joka eluoituu eluaa-tiotilavuutena noin 0,4-0,6 kertaa koko kromatografia-alustan tilavuus, tällä tavoin lisäten yleisen syöpään 5 liittyvän SCM-tunnistustekijän spesifistä aktiivisuutta kerätyssä eluaatissa suhteessa kerätyn patenttivaatimuksen 27 mukaisen suolattoman osan spesifiseen aktiivisuuteen.
29. Patenttivaatimuksen 28 mukainen menetelmä, 10 tunnettu siitä, että se lisäksi käsittää seuraa-vat vaiheet: (a) viedään talteen kerätty eluaatti dietyyliami-noetyyliselluloosa-anioninvaihtokolonniin, (b) vaiheessa (a) kolonniin lisätty materiaali 15 eluoidaan kolonnista ammoniumsuolan nousevalla pitoisuudella, ja (c) kerätään talteen se osa, joka eluoituu kolonnista ammoniumsuolan noin 0,28 - 0,31 M:n pitoisuudessa tällä tavoin lisäten yleisen syöpään liittyvän SCM-tun- 20 nistustekijän spesifistä aktiivisuutta kerätyssä eluaa tissa suhteessa kerätyn patenttivaatimuksen 28 mukaisen eluaatin spesifiseen aktiivisuuteen.
30. Patenttivaatimuksen 29 mukainen menetelmä, . tunnettu siitä, että se lisäksi käsittää yleisen 25 syöpään liittyvän SCM-tunnistustekijän puhdistuksen kerätystä patenttivaatimuksen 29 mukaisesta eluaatista pääosaltaan homogeeniseksi käänteisfaasi-korkeapaineneste-kromatograf isesti.
31. Yleinen syöpään liittyvä SCM-tunnistustekijä, 30 tunnettu siitä, että se on tuotettu patenttivaatimuksen 24, 27, 28, 29 tai 30 mukaisella menetelmällä. 65 92832
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US2275987A | 1987-03-06 | 1987-03-06 | |
| US2275987 | 1987-03-06 | ||
| US8800568 | 1988-03-04 | ||
| PCT/US1988/000568 WO1988006595A1 (en) | 1987-03-06 | 1988-03-04 | General cancer-associated scm-recognition factor, preparation and method of use |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| FI894220A0 FI894220A0 (fi) | 1989-09-06 |
| FI92832B FI92832B (fi) | 1994-09-30 |
| FI92832C true FI92832C (fi) | 1995-01-10 |
Family
ID=21811282
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| FI894220A FI92832C (fi) | 1987-03-06 | 1989-09-06 | Yleinen syöpään liittyvä SCM-tunnistustekijä, menetelmä sen valmistamiseksi ja sen käyttö |
Country Status (10)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0357637B1 (fi) |
| KR (1) | KR890700605A (fi) |
| AU (1) | AU624071B2 (fi) |
| CA (1) | CA1336404C (fi) |
| DE (1) | DE3872235T2 (fi) |
| DK (1) | DK616188D0 (fi) |
| FI (1) | FI92832C (fi) |
| IL (1) | IL85645A0 (fi) |
| NO (1) | NO177596C (fi) |
| WO (1) | WO1988006595A1 (fi) |
Families Citing this family (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5580561A (en) * | 1987-03-06 | 1996-12-03 | Cercek; Boris | Methods and pharmaceutical compositions for blocking suppression of immune defense mechanisms using an antibody, a factor, or an antisense peptide |
| US5270171A (en) * | 1987-03-06 | 1993-12-14 | Boris Cercek | Cancer-associated SCM-recognition factor, preparation and method of use |
| US5516643A (en) * | 1987-03-06 | 1996-05-14 | Cercek; Boris | Immunochemical assays for cancer-associated SCM-recognition factor |
| JPH03503763A (ja) * | 1988-03-11 | 1991-08-22 | サーセク・ボリス | 一般的な癌‐関連ｓｃｍ‐認識因子、調製品及び使用方法 |
-
1988
- 1988-03-04 WO PCT/US1988/000568 patent/WO1988006595A1/en active IP Right Grant
- 1988-03-04 KR KR1019880701410A patent/KR890700605A/ko not_active Ceased
- 1988-03-04 EP EP88903494A patent/EP0357637B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1988-03-04 DE DE8888903494T patent/DE3872235T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1988-03-04 CA CA000560590A patent/CA1336404C/en not_active Expired - Fee Related
- 1988-03-04 AU AU15951/88A patent/AU624071B2/en not_active Ceased
- 1988-03-06 IL IL85645A patent/IL85645A0/xx not_active IP Right Cessation
- 1988-11-04 NO NO884919A patent/NO177596C/no unknown
- 1988-11-04 DK DK616188A patent/DK616188D0/da not_active Application Discontinuation
-
1989
- 1989-09-06 FI FI894220A patent/FI92832C/fi not_active IP Right Cessation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| NO884919L (no) | 1989-01-05 |
| KR890700605A (ko) | 1989-04-26 |
| IL85645A0 (en) | 1988-08-31 |
| DE3872235T2 (de) | 1992-12-03 |
| AU1595188A (en) | 1988-09-26 |
| CA1336404C (en) | 1995-07-25 |
| DE3872235D1 (de) | 1992-07-23 |
| DK616188A (da) | 1988-11-04 |
| NO884919D0 (no) | 1988-11-04 |
| WO1988006595A1 (en) | 1988-09-07 |
| NO177596C (no) | 1995-10-18 |
| DK616188D0 (da) | 1988-11-04 |
| FI92832B (fi) | 1994-09-30 |
| EP0357637A1 (en) | 1990-03-14 |
| FI894220A0 (fi) | 1989-09-06 |
| NO177596B (no) | 1995-07-10 |
| EP0357637B1 (en) | 1992-06-17 |
| AU624071B2 (en) | 1992-06-04 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| EP0537276B1 (en) | Cancer-associated scm-recognition factor, preparation and method of use | |
| US4826680A (en) | Pharmaceutical composition containing thymus extract fractions | |
| Kibler et al. | Isolation and properties of an encephalitogenic protein from bovine, rabbit, and human central nervous system tissue | |
| Havel et al. | Isoelectric heterogeneity of the cofactor protein for lipoprotein lipase in human blood plasma | |
| WO1998022499A9 (en) | Arretin, a neurite outgrowth modulator, antibodies thereto and uses thereof | |
| WO1998022499A2 (en) | Arretin, a neurite outgrowth modulator, antibodies thereto and uses thereof | |
| US4196186A (en) | Method for diagnosing malignant gliol brain tumors | |
| Bocchini | The nerve growth factor: amino acid composition and physicochemical properties | |
| FI92832C (fi) | Yleinen syöpään liittyvä SCM-tunnistustekijä, menetelmä sen valmistamiseksi ja sen käyttö | |
| McPherson et al. | Rotational diffusion of the erythrocyte integral membrane protein, band 3: effect of hemichrome binding | |
| Thiele et al. | Photoaffinity labeling of central cholecystokinin receptors with high efficiency | |
| Mahieu | Biochemical structure of glomerular basement membrane in chronic glomerulonephritis. I. Lobular and membrano-proliferative glomerulonephritis | |
| Mathew et al. | Calcimedins: purification and characterization from chicken gizzard and rat and bovine livers | |
| Curran et al. | Purification and characterization of Alt a-29 from Alternaria alternata | |
| Dale et al. | Similarities between stratum corneum basic protein and histidine-rich protein II from newborn rat epidermis | |
| Burston et al. | The perchloric acid soluble basic and acidic proteins of the cytoplasm: variation in cancer | |
| CN107703109A (zh) | 二维硫化钼多肽复合材料及其在靶向cd47癌症标记中的应用 | |
| CN101724029B (zh) | 一种抗肿瘤蛋白及其制备方法和应用 | |
| Chao et al. | Isolation and preliminary characterization of tear prealbumin from human ocular mucus | |
| DE60031963T2 (de) | Verfahren zum Nachweis von Multipler Sklerose oder einer Prädisposition für die Entwicklung von Multipler Sklerose in einer biologischen Probe | |
| EP0407451A1 (en) | General cancer-associated scm-recognition factor, preparation and method of use | |
| EP0213595A2 (en) | New transferrins and use thereof | |
| EP0402415B1 (en) | Synthetic scm-active cancer recognition peptides | |
| US5231002A (en) | Synthetic SCM-active cancer recognition peptides | |
| EP3930836A1 (en) | Carbamoyl phosphate synthatase-1 for the treatment and prevention of internal tissue injury |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| BB | Publication of examined application | ||
| MM | Patent lapsed | ||
| MM | Patent lapsed |
Owner name: CERCEK, BORIS |