FI84065C - Foerfarande foer framstaellning av isosilybinfri silibinin. - Google Patents

Description

84065

Menetelmä valmistaa isosilybiinivapaata silibiniiniä. Förfarande för framställning av isosilybinfri silibinin.

Keksinnön kohteena on menetelmä valmistaa isosilybiinivapaata silibiniiniä.

Marianohdake - Silybum marianum (L.) Gaertn. (Carduus marianus L.) - on jo muinaisista ajoista asti tunnettu lääkekasvi. R. MUnster, vrt. Dissertation R. MUnster, MUnchen, 1966, eristi tämän kasvin hedelmissä esiintyvistä flavolignaaneista erään komponentin, silybiinin. A. Pelter ja R. Hänsel ovat selvittäneet tämän yhdisteen kemiallisen rakenteen Tetrahedron Letters, Lontoo, nide 25, sivut 2911-2916 (1968).

Silybiini, josta aikaisemmin on käytetty myös nimitystä silymariini I, tiedetään olevan arvokas maksaterapeuttinen aine, vrt. DE-AS 17 67 666. Esimerkiksi patenttijulkaisussa DE-AS 19 23 082 on kuvattu tekninen menetelmä silybiinin (silymariini 1) valmistamiseksi.

Jo 1974 otaksuivat H.Wagner, P.Diesel ja M.Seitz, Arzneimittelforschung, nide 24 (4), sivut 466-471, silybiinillä olevan kaksi paikkaisomeeriä, nimittäin silybiniini ja isosily-biini. A. Arnone, L. Merlini ja A. Zanarotti, Journal Chemical Society Chem.comm., 1979, nide 16, sivut 696/97, ovat tämän olettamuksen täsmentäneet ja vahvistaneet kokeellisesti. Sen mukaisesti tunnettu silybiini muodostuu kahdesta eri yhdisteestä, nimittäin yhdisteistä, joilla on seuraavat rakennekaavat A ja B: 84065 2

2 O H

OH O - °B

(A) Silibiniini M 3

B° 'ΊΘΐ^'ινν^<^εΒ 5 0H

OH O

(I)) 1 r.o-J i 1 y b ι i ni Näistä rakennekaavoista voidaan havaita, että näillä yhdisteillä on kysymys paikkaisomeereistä. Kaavan (A) mukaisen yhdisteen INN-nimi on nykyään silibiniini. Tätä nimitystä käytetään kaavan (A) mukaisesta yhdisteestä myös esillä olevassa hakemuksessa.

3 84065

Kumpaakin edellä mainittua yhdistettä A ja B on tähän mennessä erotettu ja valmistettu vain analyyttisinä määrinä, eikä yksittäisten isomeerien farmakologisista vaikutuksista tiedetä mitään.

Keksinnön tavoitteena on siten tuoda esiin isosilybiinittömän silibiniinin valmistusmenetelmä sekä silibiniinipitoiset farmaseuttiset aineet.

Keksinnön kohteena on siten menetelmä valmistaa isosilybiiniva-paata silibiniiniä, jonka kaava on ÖH 0 jossa menetelmässä Silybum marianum L. Gaertn. kasvin kuivatuista hedelmistä poistetaan pääosa rasvaöljyistä siten, että hedelmien solut räjäytetään korkean mekaanisen paineen avulla, minkä jälkeen puristus jäännös, jonka jäännösöljypitoisuus on vielä 5 - 10 %, uutetaan tyhjiin etyyliasetaatilla, etyyliasetaatti haihdutetaan, minkä jälkeen saatua kuivajäännöstä liuotetaan 2 paino-% ternäärisen liuotinseoksen, jossa on 95 paino-osaa metanolia, 5 paino-osaa vettä ja 100 paino-osaa petroli-eetteriä (kp. 40 - 60°C), metanolista ja vedestä muodostuvaan alafaasiin, hiutalemaiset kiintoaineshiukkaset poistetaan kir-kassentrifugoimalla ja kuivajäännökselle suoritetaan tässä liuotinsysteemissä moninkertainen, yhdenmuotoinen vastavirta-uutto, jolloin yläfaasi/alafaasin kokonaisvirtauksen tilavuus-suhde pidetään yhtä suurena kuin 1:1, ja sen jälkeen ulos-virtaavasta alafaasista eristetään tyhjössä kuiviinhaihdutta- 4 84065 maila 70 - 80 prosenttinen polyhydroksifenyylikromanoniseos (silymariini I-IV = silymariini I-IV-ryhmä) ruskehtavana jauheena, jolle menetelmälle on tunnusomaista se, että saatu ruskehtava jauhe suspendoidaan 3-5 kertaiseen painomäärään metanolia, saatua suspensiota kiehutetaan sekoittaen, sen jälkeen poistetaan metanolista alipaineessa noin 1/3 - 2/3, konsentraatin annetaan seistä huoneenlämpötilassa, tällöin saostuva tuote erotetaan suodattamalla, pestään 1-3 kertaa mahdollisimman pienellä määrällä kylmää metanolia, kuivataan, liuotetaan kuumentamalla 40 - 60 kertaiseen painomäärään etik-kahappoesteriä, käsitellään aktiivihiilellä palautusjäähdytyksen olosuhteissa, aktiivihiili erotetaan suodattamalla, suodos haihdutetaan alipaineessa noin 1/10:an alkuperäisestä tlavuu-desta, konsentraattiin lisätään voimakkaasti sekoittaen metanolia noin 1/10 konsentraatin tilavuudesta, annetaan seistä muutama tunti huoneenlämpötilassa, sekoitetaan tehosekoittimella ennen saostuneen tuotteen suodattamista, imun avulla suodatettu tuote pestään 1-3 kertaa pienellä määrällä etikkahappoesteriä ja kuivataan tyhjössä.

Isosilybiinivapaan silibiniinin havaittiin sopivan erittäin hyvin farmaseuttisiin tarkoituksiin. Yllättäen havaittiin, että sillä on oleellisia etuja verrattuna Silybummarianum-uutteiden muihin tunnettuihin ainesosiin. Se sopii erityisen hyvin maksakirroosin ja toksis-metabolisten maksavaurioiden hoitoon. Sitä voidaan käyttää myös ehkäisevästi siten, että kuvattuja vaurioita ei lainkaan esiinny.

Esimerkki 1

Isosilybiinittömän silibiniinin valmistaminen: 500 g polyhydroksifenyylikromanoniseosta (silymariini I - IV = silymariini I - IV-ryhmä; pitoisuus noin 70 %), joka saatiin patenttijulkaisun DE-AS 19 23 082 palstan 8, 5 84065 rivit 14 - 19 mukaisesti, mikä tässä esitetään viitteenä, suspendoidaan 2 kg:aan metanolia = 2,53 1 ja kuumennetaan kiehuttaen 15 minuuttia samalla sekoittaen. Näin saadusta liuoksesta voi tämän ajan jälkeen jo saostua hieman silibiniiniä. Tämän jälkeen metanolista poistetaan tyhjössä 0,75 - 1,25 kg eli = 0,96 - 1,58 1 ja annetaan jäännöksen seistä 10 - 28 päivää huoneenlämpötilassa. Saostunut sili-biniini suodatetaan ja pestään kaksi kertaa kummallakin kerralla 50 ml:11a kylmää metanolia. Kuivataan tyhjössä 40°C:ssa, minkä jälkeen eristetty raakasilibiniini puhdistetaan edelleen seuraavasti: 60 g raakasilibiniiniä liuotetaan 3 litraan teknillistä etik-kahappoesteriä kuumentaen; tämän jälkeen lisätään 20 g aktiivihiiltä ja sekoitetaan vielä 2 tuntia refluksoin-nin olosuhteissa. Tämän jälkeen suodatetaan kirkkaaksi ja liuos haihdutetaan 50°C:ssa alipaineessa noin 250 ml:ksi. Konsentraattia sekoitetaan 15 minuuttia käyttämällä Ultra-Turrax-laitetta ja lisätään sekoittaen 25 ml metanolia. Tämän jälkeen seoksen annetaan seistä yön yli huoneenlämpötilassa. Ennen tällöin eronneen silybiinin suodattamista sekoitetaan vielä kerran 5 minuuttia jälkeen Ultra-Turrax-laitteen avulla. Suodatettu sakka pestään kaksi kertaa 50 ml:11a etikkahappoesteriä ja kuivataan tyhjökuivauskaapissa yön yli 40°C:ssa. Tämän jälkeen tuote jauhetaan ja jälkikuivataan samoissa olosuhteissa 48 tunnin aikana.

Kliiniset kokeet silibiniinillä

Toksiset maksavauriot ovat viimeisinä vuosikymmeninä lisääntyneet erittäin voimakkaasti. Vaurioiden aiheuttaja on useimmiten, kuten aikaisemminkin, alkoholi.

. 84065

Kontrolloitujen tutkimusten avulla voitiin osoittaa silibinii-nin paremmuus verrattuna näennäishoitoon (Placebo) tai muihin vertailuhoitoihin. Kaksoistutkimuksessa tutkittiin 66 potilaalla, joilla oli alkoholitoksiset maksavauriot, silibiniini (n = 31) Placebota (n = 35) vastaan tilastollisella tavalla.

Tilastollisesti arvioidut tulokset osoittivat, että silibiniini on merkittävästi parempi kuin Placebo. Silmiinpistävää oli tällöin oleellisesti lyhyemmät parantumisajät Placebo'n verrattuna. Toisessa kaksoissokkotutkimuksessa, jossa oli 76 potilasta, joista 39 sai silibiniiniä ja 37 kontrollihoitoa, erot olivat erittäin merkittäviä silibiniinin eduksi.

Vatsaelinten leikkausten yhteydessä voitiin narkoosin maksatoksisia vaikutuksia tutkittaessa osoittaa, että leikkausta edeltävä silibiniinin antaminen alensi merkittävästi maksaentsyymien leikkauksen jälkeistä kasvua veressä. Silibiniinin avulla voidaan tehokkaasti estää myös nykyään yhä useammin esiintyviä, määrättyjen lääkeaineiden aiheuttamia maksavaurioita. Tämä voitiin osoittaa esimerkiksi fenyylihydantoiinin aiheuttaman hepa-toosin yhteydessä, jossa huolimatta täysin välttämättömien, kouristuksia estävien lääkkeiden määräämisestä, silibiniinin samanaikainen antaminen normalisoi lyhyen ajan sisällä kaikki laboratorioarvot.

Sairailla, joilla oli skitsofreniaa ja klooribromatsiinin määräämisestä johtuvia vaikeita maksavaurioita, suoritetut jatkotutkimukset osoittivat myös silibiniinin positiviisen vaikutuksen. Muiden kokeiden kohteena oli esimerkiksi klorokiinin tai asparaginaasin maksaa vaurioittavien vaikutusten estäminen. Kaikilla hoidetuilla potilailla voitiin ammatista aiheutuneiden maksavaurioiden ollessa kyseessä oleellisesti parantaa patologisesti kohonneita laboratorioarvoja riippumatta kulloinkin kyseessä olevasta syystä tai mahdollisista lisäsairauksista.

7 84065

Lisäksi on riittävästi osoituksia, että silibiniini saa aikaan oleellisia parannuksia myös kroonisissa maksan tulehdussairauksissa ja maksakirroosissa. Esimerkiksi potilaita, joilla oli maksakirroosi, hoidettiin pitkäaikaistutkimuksena tilastollisessa kaksoissokkokokeessa, jossa tutkittiin silibiniiniä placebo'n verrattuna. Terapeuttisen vaikutuksen arvioinnin kriteerinä käytettiin ennen kaikkea eloonjääntiaikaa. Silibiniini osoittautui tällöin selvästi paremmaksi placebo-hoitoon verrattuna.

Silibiniinin ja isosilybiinin ja silybiinin (silibiniinin ja isosilybiinin seos) vaikutuksen vertailu palloidi- ja praseo-dymiinitoksisuusmallissa hiirellä intravenöösin antamisen jälkeen.

Silibiniinin, isosilybiinin ja silybiinin maksatoksisuuden vastainen vaikutus tutkittiin N-metyyliglukamiinisuoloina nanok-silla 50 ja 100 mg kg_x laskettuna silibiniinistä intravenöösin applikoinnin jälkeen hiirillä palloidiini- ja praseodyymimyrky-tysmallissa. Tutkittava aine applikoitiin yksi tunti ennen fal-loidiinia tai 1 tunti ennen ja 6 tuntia, 24 tuntia ja 48 tuntia praseodyymin jälkeen. Falloidiinimyrkytyksessä arvioitiin eloonjääntimäärä ja praoseodyymimyrkytyksessä erilaiset seerumi- ja maksaparametrit 72 tuntia myrkytyksen jälkeen.

Falloidiini-myrkytyksessä eloonjääntimäärä silibiniinin jälkeen oli kummallakin annoksella 100 %, muilla aineilla ei ylitetty käsittelemättömien, vaurioituneiden kontrollien 40 % eloonjään-timäärää.

i

Praseodyymi-myrkytyksessä isosilybiini osoittautui ei-siedettä-väksi, joten 100 mg kg-3· annos täytyi jakaa kahteen applikoin-tiin.

Claims (1)

1. 8 ' 84065 ' EflkeiitUvaafcijjms Menetelmä valmistaa isosilybiinivapaata silibiniiniä, jonka kaava on ÖB O jossa menetelmässä Silybum marianum L. Gaertn. kasvin kuivatuista hedelmistä poistetaan pääosa rasvaöljyistä siten, että hedelmien solut räjäytetään korkean mekaanisen paineen avulla, minkä jälkeen puristusjäännös, jonka jäännösöljypitoisuus on vielä 5 - 10 %, uutetaan tyhjiin etyyliasetaatilla, etyyliasetaatti haihdutetaan, minkä jälkeen saatua kuivajäännöstä liuotetaan 2 paino-% ternäärisen liuotinseoksen, jossa on 95 paino-osaa metanolia, 5 paino-osaa vettä ja 100 paino-osaa petrolieetteriä (kp. 40 - 60°C), metanolista ja vedestä muodostuvaan alafaasiin, hiutalemaiset kiintoaineshiukkaset poistetaan t kirkassentrifugoimalla ja kuivajäännökselle suoritetaan tässä liuotinsysteemissä moninkertainen, yhdenmuotoinen vastavirta-uutto, jolloin ylä£aasi/alafaasin kokonaisvirtauksen tilavuus-suhde pidetään yhtä suurena kuin 1:1, ja sen jälkeen ulos-virtaavasta alafaasista eristetään tyhjössä kuiviinhaihdutta-malla 70 - 80 prosenttinen polyhydroksifenyylikromanoniseos (silymariini I-IV = silymariini I-IV-ryhmä) ruskehtavana jauheena, tunnettu siitä, että saatu ruskehtava jauhe suspendoidaan 3-5 kertaiseen painomäärään metanolia, saatua suspensiota kiehutetaan sekoittaen, sen jälkeen poistetaan metanolista alipaineessa noin 1/3 - 2/3, 9 84065 konsentraatin annetaan seistä huoneenlämpötilassa, tällöin saostuva tuote erotetaan suodattamalla, pestään 1-3 kertaa mahdollisimman pienellä määrällä kylmää metanolia, kuivataan, liuotetaan kuumentamalla 40 - 60 kertaiseen painomäärään etikkahappoesteriä, käsitellään aktiivihiilellä palautusjäähdytyksen olosuhteissa, aktiivihiili erotetaan suodattamalla, suodos haihdutetaan alipaineessa noin l/lO:an alkuperäisestä tilavuudesta, konsentraattiin lisätään voimakkaasti sekoittaen metanolia noin 1/10 konsentraatin tilavuudesta, annetaan seistä muutama tunti huoneenlämpötilassa, sekoitetaan tehosekoittimella ennen saostuneen tuotteen suodattamista, imun avulla suodatettu tuote pestään 1-3 kertaa pienellä määrällä etikkahappoesteriä ja kuivataan tyhjössä. 84065. Förfarande för framstälining av isosilybinfritt silibinin med formeln oi o i vilket förfarande frän Silybum marianum L. Gaertn. växtens torkade frukter avlägsnas huvudparten av den feta oijän genom att spränga frukternas celler med tillhjälp av högt mekaniskt tryck, varefter pressäterstoden, vars restoljehalt ännu är 5 - 10 %, extraheras fullständigt med etylacetat, etylacetatet avdunstas, varefter den er hei Iina torresten i en mängd av 2 viktprocent upplöses i den av metanol och vatten bestäende under fasen av en ternär lösningsmedelsblandning av 95 viktdelar metanol, 5 viktdelar vatten och 100 viktdelar petroleter (kp. 40 - 60°C), lösningen klarcentrifugeras för att avlägsna flockiga partiklar av fasta ämnen och i detta lösningsmedelssystem underkastas torresten en flerfaldig, likformig motströmsextraktion, varvid den totala strömningens volymförhällande överfas/underfas hälles lika med 1:1, och därefter frän den utrinnande underfasen isoleras genom indunstning i vakuum tili torka en 70-80 procenting polyhydro-xifenylkromanonblandning (silymarin I-IV - silymarin I-IV-grupp) som ett brunaktigt pulver, kännetecknat därav, att det erhällna brunaktiga pulveret suspenderas i en 3-5 faldig viktmängd metanol, den erhällna suspensionen upp-kokas under omröring, därefter avlägsnas ca 1/3 - 2/3 av meta-nolen under reducerat tryck, koncentratet fär stä vid rumstem-peratur, den därvid utfallande produkten avfiltreras, tvättas 1-3 gänger med minsta möjliga mängd kali metanol, torkas, 84065 upplöses under uppvärmning i en 40-60 faldig viktmängd ättiksy-raester, behandlas med aktivkol under äterloppsbetingelser, aktivkolet avfilteras, filtratet indunstas vid undertryck tili ca 1/10 av den ursprunliga volymen, metanol tillsätts filtratet under kraftig omröring i en mängd av ca 1/10 av koncentratets volym, tilläts stä nägra timmar vid rumstemperatur, omröres med en snabbmixer före filtering av den utfallna produkten, den avsugna produkten tvättas 1-3 gänger med en liten mängd ättiksyraester och torkas i vakuum.