FI78732C - Foerfarande foer framstaellning av antibiotika uk-58852, cp-70228 och cp-70828. - Google Patents

Description

x 78732

Menetelmä antibioottien UK-58852, CP-70228 ja CP-70828 valmistamiseksi Tämä keksintö koskee menetelmää happamien polysyklisten eetteriantibioottien ryhmän uusien yhdisteiden valmistamiseksi; tämän ryhmän yhdisteille on biologisesti 5 tunnusomaista niiden kyky kationin siirtoon mitokondriois-sa. Tähän antibioottien ryhmään kuuluu sellaisia hyvin tunnettuja aineita kuin monensiini, nigerisiini, grisorik-siini, dianemysiini, salinomysiin, mutalomysiini, iono-mysiin ja leuseramysiin. Kyseistä ainetta on käsitellyt 10 Westley julkaisussa "Polyether Antibiotics", Adv. Appi.

Microbiol., 22, 177, 1977.

Edellä luetellut polysykliset eetteriantibiootit ovat aktiivisia gram-positiivisia bakteereita, sieniä ja alkueläimiä vastaan. Erityisesti nämä antibiootit osoitta-15 vat anti-kokkidiaalista aktiviteettia. Niitä on tämän vuoksi käytetty vaihtelevalla menestyksellä erilaisten eläin-infektioiden hoidossa.

Hyvin tunnettu alkueläinten aiheuttama sairaus, kok-kidioosi, on yhä edelleen vakava probleema ja sen valvon-20 nalla on taloudellista merkitystä eläinlääketieteelle, erityisesti siipikarjataloudelle. Kokkidioosi on seurauksena yhden tai useamman Eimeria- tai Isospora-lajin tartunnasta (yhteenvedon saamiseksi asiasta katso Lund'in ja Farr'in kirjoitusta teoksessa "Diseases of Poultry", 5. painos, 25 Biester and Schwarte, Eds., Iowa State University Press,

Ames, Ia., 1965, s 1065-1096). On olemassa kuutta coccidia-lajia, jotka aiheuttavat helposti havaittavissa olevan tautisuuden vastaanottavaisissa kananpojissa. Eimeria tenella. E.necatrix, E.brunetti, E.acervulina, E.maxima ja E.mivati 30 aiheuttavat vahinkoa joko suoraan turmelemalla ruuansulatuskanavan epiteelisoluja tai epäsuorasti toksiineja muo-dostaen. Kolme muuta alkueläinten lajia, jotka kuuluvat samaan sukuun, katsotaan suhteellisen vaarattomiksi; kuitenkin E.mitis, E.hagani ja E.praecox kykenevät pienentä- 2 78732 mään painon lisäystä, alentamaan rehun hyötykäyttöä ja vaikuttamaan haitallisesti munien tuotantoon.

Suurten taloudellisten menetysten vuoksi, jotka johtuvat kokkidioosista ja nykyisin olemassaolevien anti-5 kokkidiaalisten aineiden tunnetuista haitoista tutkimukset parempien antikokkidiaalisten aineiden löytämiseksi jatkuvat.

Suolitulehdus (enteritis) on eräs toinen sairaus, joka voi aiheuttaa raskaita taloudellisia menetyksiä kar-10 jankasvattajille. Suolitulehdusta esiintyy kananpojilla, sioilla, nautakarjalla ja lampailla ja se johtuu pääasiallisesti anaerobisista bakteereista, erityisesti Clostridium perfringens-bakteerista, ja viruksista. Suolisyntyi-nen myrkytys (enterotoxemia) märehtijöillä, josta eräänä 15 esimerkkinä on "ylensyöntitauti" lampailla, on C.perfrin-gens-tartunnan aiheuttama tila.

Sikojen punatauti on eräs yleisimmistä Yhdysvalloissa määritetyistä sikojen sairauksista. Tämä sairaus on yleinen myös monissa muissa maissa ja vuosittain se aiheut-20 taa huomattavia menetyksiä karjan ja sikojen kasvattajille ympäri maailmaa. Äskettäin on todettu, että eräs suuri spirokeetta on tämän sairauden aiheuttava organismi. Tämä organismi, Treponema hyodysenteriae, on nyt eristetty ja se on osoitettu kykeneväksi aiheuttamaan sairauden (Harris, 25 D.L. et ai. "Swine Dysentery-1, Inoculation of Pigs with Treponema hyodysenteriae (New Species) and Reproducktion of the Disease", Vet. Med/SAC, 67, 61-64, 1972) . Jäljempänä esitetty koeaineisto koskee tällä organismilla suoritettuja kokeita. On huomattava, että ei tunneta onko T.hyodys-30 enteriae ainoa sian punataudin aiheuttava organismi. Saatavissa olevista tuloksista voidaan kuitenkin päätellä, että se on ensisijainen tartunnan lähde.

Saavutusten parantaminen (suurentunut kasvunopeus ja/tai suurentunut rehun hyötykäyttöteho) märehtijöillä, 35 kuten nautakarjalla, ja 1-mahaisilla eläimillä, kuten sioil- 3 78732 la, on eräs toinen taloudellisesti toivottava eläinlääketieteen tutkimuskohde. Erittäin kiinnostavaa on parantunut aikaansaannos, joka saavutetaan suurentamalla rehun hyö-tykäyttötehoa. Märehtijöiden rehun tärkeimmän ravinto-5 osuuden hyväksikäytön mekanismi on hyvin tunnettu. Eläimen pötsissä olevat mikro-organismit hajottavat hiilihydraatit muodostaen monosakkarideja ja sen jälkeen ne muuttavat nämä monosakkaridit pyruvaattiyhdisteiksi. Pyruvaa-tit muuttuvat mikrobiologisten prosessien johdosta muodos-10 taen asetaatteja, butyraatteja tai propionaatteja, jotka kollektiivisesti tunnetaan haihtuvina rasvahappoina. Tätä aihetta on yksityiskohtaisemmin käsitellyt Leng teoksessa "Physiology of Digestion and Metabolism in the Ruminant", Phillipson et ai., Eds., Oriel Press, Newcastle-upon-Tyne, 15 Englanti, 1970, s 408-410.

Haihtuvien rasvahappojen hyötykäytön suhteellista tehokkuutta käsittelee McCulough julkaisussa "Feedstuffs", kesäkuu 19, 1971, sivu 19; Eskeland et ai. julkaisussa J. Ann. Sei., 33, 282, 1971; ja Church et ai. julkaisussa 20 "Digestive Physiology and Nutrition of Ruminants", Voi. 2, 1971, s 622 ja 625. Joskin asetaatteja ja butyraatteja käytetään hyväksi, käytetään propionaatteja hyväksi tehokkaammin. Sitäpaitsi jos propionaattia on käytettävissä liian vähän, voivat eläimet saada asetonitaudin (ketosis). Hyödyl-25 linen yhdiste stimuloi sen vuoksi eläimiä tuottamaan suurempia propionaattiosuuksia hiilihydraateista parantaen siten hiilihydraattien hyötykäytön tehoa ja pienentäen siten sairastuvuutta asetonitautiin.

Vielä erään sairauden, joka aiheuttaa taloudellisia 30 menetyksiä karjan kasvattajille, aiheuttaa alkueläimiin kuuluva loinen Theileria parva. Tämä sairaus, theileriosis, tunnetaan myös nimellä "itärannikon kuume" (East Coast Fever), "rantakuume" ("Coastal Fever") tai "Rhodesian punk-kikuume" ("Rhodesian tick fefer"). Theileria-loinen tunkeu-35 tuu punaisiin verisoluihin, mutta ei tuhoa niitä, mikä ai- 4 78732 heuttaa akuuttisia tai kroonisia kuumetartuntoja. Nautakarjassa sairaudelle on tunnusomaista korkea kuume, imusolmukkeiden turpoaminen, riutuminen ja korkea kuolleisuus. Tämä sairaus on hyvin vakava probleema itä- ja keski-Afri-5 kassa. Katso lisäksi julkaisua "The Merck Veterinary Manual", Siegmund et ai., Eds., Merck & Co., Rahway, N.J. 5. painos, Tämä keksintö koskee menetelmää uuden happamen polysyklisen eetteriantibiootin valmistamiseksi, josta käytetään merkintää UK-58 852, kasvattamalla submerssi-10 viljelmänä aerobisesti vesipitoisessa kasvatusalustassa mikro-organismia Actinomadura roseofura Huang sp. nov.

ATCC 39697, joka on eristetty Japanissa löydetystä maa-näytteestä. Antibiootti ja sen kationiset suolat ovat aktiivisia useita mikro-organismeja vastaan ja tehokkaita 15 kontrolloimaan kokkidioosia, suolitulehdusta, sian punatautia ja theileriosis'ta samoin kuin ne ovat tehokkaita edistämään kasvua ja suurentamaan rehun hyväksikäyttöte-hoa sioilla ja märehtijöillä. Keksinnön mukaisella menetelmällä saadaan käymistuotteina myös kaksi lähisukuista 20 vähäisempää komponenttia, joista käytetään merkintöjä CP-7Q 228 ja CP-70 828 ja jotka ovat myös antibiootteja ja tehokkaita kontrolloimaan kokkidioosia. CP-70 228 on myös käyttökelpoinen edistämään kasvua ja suurentamaan re-: hun hyötykäyttötehoa sioilla ja märehtijöillä.

25 Mikro-organismi, josta tässä käytetään merkintää

Actinomadura roseorufa Huang sp., nov. ATCC 39697 ja joka on käyttökelpoinen antibioottien UK-58 852, CP-70 228 ja CP-70 828 valmistukseen, eristettiin maaperänäytteestä, joka oli koottu Izumo'n kaupungissa, Shimane'n prefektuu-30 rissa, Japanissa. Se tunnistettiin Actinomadura-lajiksi sen johdosta, että sillä oli hypha-säikeiden kapeat ulottuvuudet, se muodosti ilmahuovaston, itiöt olivat kannatettuina ketjuissa ja maduroosia oli läsnä koko-soluhydroly-saateissa.

35 Sen viljelmä, josta tässä käytetään merkintää s 78732 N596-33,istutettiin vinopintaviljelmästä ATCC nro 172-liemeen ja kasvatettiin 4 päivää 28°C:ssa ravistuslait-teessa. Sen jälkeen sitä sentrifugoitiin 20 minuuttia, pestiin 3 kertaa steriilillä tislatulla vedellä ja istutet-5 tiin kasvatusalustaan, jota yleisesti käytetään Actino-mycetales-lahkon jäsenten identifioimiseen, kuten jäljempänä on selostettu.

Viljelmää inkuboitiin 28°C:ssa ja tulokset luettiin eri aikoina, mutta yleisimmin ne otettiin 14 päivän ku-10 luttua. Värit kuvataan yleisessä termonologiassa, mutta tarkat värit määritetään vertaamalla väriliuskoihin, jotka on esitetty käsikirjassa: Colour Harmony Manual, neljäs painos. Koko-soluaminohappo- ja sokerianalyysien menetelmät ovat sellaiset kuin on esitetty artikkeleissa Becker 15 et ai., Appi.Microbiol., 12, 421-423, 1964; ja Lechevalier, J.Lab.Clin.Med., 71, 934-944, 1968.

Viljelmän karakterisointiin käytetyt identifioi-misalustat ja tiedot niiden koostumuksesta tai valmistajasta on esitetty seuraavassa: 20 1· Hiivauutos-mallasuutos agar - (ISP-alusta nro 2,

Difco).

2. Kaurajauho agar - (ISP-alusta nro 3, Difco).

3. Epäorgaaniset suolat-tärkkelys agar - (ISP-alusta nro 4, (Difco).

25 4. Glyseroli-asparagiini agar - (ISP-alusta nro 5,

Difco).

5. Czapek-sakkaroosi agar - S.A. Waksman, The Actimomyce-tes, Voi. 2, alusta nro 1, s. 328, 1961.

6. Glukoosi-asparagiini agar - Ibid, alusta nro 2, s. .

30 328.

7. Bennett*in agar - Ibid, alusta nro 30, s. 331.

8. Emerson*in agar - Ibid, alusta nro 28, s. 331.

9. Ravinto agar - Ibid, alusta nro 14, s. 330.

10. Gordon'in ja Smith'in tyrosiini agar - R.E. Gordon 35 and M.M. Smith, J.Bact., 69, 147-150, 1955.

6 78732 11. Kaseiini agar - Ibid.

12. Kalsiuiranalaatti agar - S.A. Waksman, Bact.Rev. 21, 1-29, 1957.

13. Gelatiini agar - R.E. Gordon and J.M. Mihm, J.Bact., 5 73, 15-27, 1957.

14. Tärkkelys agar - Ibid.

15. Peruna porkkana agar - M.P. Lechevalier, J.Lab. and Clinical Med., 71, 934-944, 1968, mutta käytetään vain 30 g perunaa, 2,5 g porkkanaa ja 20 g agaria.

10 16. 2 % vesijohtovesi agar.

17. Gauze'n mineraalialusta nro 1 - G.F. Gauze et ai.,

Problems in the Classification of antagonistic Actinomy-cetes. Englanninkielinen painos, s 13, 1957.

18. Gauze'n orgaaninen alusta nro 2 - Ibid.

15 19. Peruna dekstroosi agar - Kuoritaan, paloitellaan ja höyrystetään 100 g perunoita 500 ml:ssa vettä, suodatetaan juustoliinan läpi, lisätään 10 g glukoosia, 50 ml kookos-pähkinämaitoa, 20 g agaria ja kylliksi vettä lopputilavuu-den saamiseksi yhdeksi litraksi.

20 20. Tryptoni-hiivauutosliemi - (ISP-alusta nro 1,

Difco).

21. Peptoni-hiivauutos rauta agar - (ISP-alusta nro 6, Difco).

22. Orgaaninen nitraattiliemi - R.E. Gordon ja J.M. Michm, 25 J. Bact., 73, 15-27, 1957.

23. Dekstroosi nitraattiliemi - S.A. Waksman, The Actino-mycetes, Voi. 2, alusta nro 1, s. 328, 1961, käyttämällä 3 g dekstroosia korvaamaan 30 g sakkaroosia ja jättämällä agar pois.

30 24. Kuorittu maito - Difco.

25. Selluloosan hyötykäyttö - a) H.L. Jensen, Proc. Linn. Soc. NSW., 231-248, 1930.

b) M. Levine ja H.W. Schoenlein, A Compilation of Culture Media, alusta nro 2511, 1930.

35 26. Hiilihydraatit - ISP-alusta nro 9, Difco, C-2-alus- 7 78732 ta - H. Nonomura ja Y. Ohara, J. Ferment. Technol., 49 (11), 887-894, 1971.

27. Lämpötila-alue - ATCC-alusta 172 julkaisussa ATCC Culture Collection Catalogue, 15. painos s. 608, 1982.

5 Organismien kasvua ja ulkonäköä koskevat havain not ovat seuraavanlaiset:

Hiivauutos-mallasuutos agar - kasvu hyvä, valkoinen, värisävy ruusunpuna-punaiseen (6ga, 6 1/2 ea, 6 1/2 ia), koholla oleva, kurttuinen, ilmahuovasto valkoinen; vastakkainen 10 puoli vaaleankellertävästä ruusunpunaiseen (2ea, 6ga); ei liukoista pigmenttiä.

Kaurajauho agar - kasvu kohtalainen, kermanvärinen (1 l/2ca), hiukan koholla, sileä; ilmahuovasto puuttuva tai niukka, valkoinen; vastakkainen puoli värittömästä kermanväriseen 15 (1 1/2 ca); ei liukoista pigmenttiä.

Epäorgaaniset suolat - tärkkelys agar - kasvu huono, värittömästä vaaleankermanväriseen (lähellä 1 1/2 ca), ohut, sileä; ilmahuovasto puuttuu tai on niukka, valkoinen; vastakkainen puoli värittömästä vaaleankermanväriseen 20 (lähellä 1 1/2 ca); ei liukoista pigmenttiä.

Glyseroli-asparagiini agar - kasvu huono tai kohtalainen, väritön, mutta lähellä reunaa vaaleanruusunpunainen (5ca), ohut mutta kohtalaisesti koholla lähellä reunaa, sileä; ilmahuovasto puuttuu tai on niukkaa, valkoinen; vastakkai-25 nen puoli värittömästä vaaleanruusunpunaiseen (5ca); ei liukoista pigmenttiä.

Czapek-sakkaroosi agar - kasvu kohtalainen, vaaleanruusunpunainen, harmahtavankeltaisesta punaiseen (5ca, 2gc, 6 1/2 ia), hiukan koholla, sileä; ilmahuovasto puuttuu tai on 30 niukka, nähtävissä vain mikroskoopilla; vastakkainen puoli samanlainen kuin pinta; ei liukoista pigmenttiä. Glukoosi-asparagiini agar - kasvu kohtalainen tai hyvä, harmahtavan keltainen, kellertävänruskeasta punaiseen (2ic, 3nc, 7 1/2 ia, 7 1/2 la) kohtalaisesti koholla, sileä, muu-35 tamia pieniä muhkuroita; ilmahuovasto puuttuu tai on niukka, 8 78732 valkoinen; vastakkainen puoli samanlainen kuin pinta; liukoinen pigmentti kermanvärinen (2ca).

Bennett'in agar - kasvu hyvä, harmahtavankeltainen (2gc, 2ie) reunalta vaaleanruusunpunainen (5ca), koholla, kurt-5 tuinen, halkeamia paikkapaikoin; ilmahuovasto puuttuu tai on niukka, valkoinen; vastakkainen puoli samanlainen kuin pinta; liukoinen pigmentti harmahtavankeltainen (2ic). Emerson'in agar - kasvu hyvä, vaaleankellertävä, harmaasta tummanruskeaan (2gc, lähellä harmaan sarjaa 3fe, 31i, 10 3ni), koholla, kurttuinen; ilmahuovasto lyhyt, valkoinen; vastakkainen puoli ruskeasta kellertävään (31i, 41i, 2gc); liukoinen pigmentti kellertävä (21c).

Ravinto agar - kasvu kohtalainen, oranssinvärinen (5ea, 5ga), ohut tai hiukan koholla, sileä; ilmahuovasto puuttuu 15 tai on niukka, valkoinen; vastakkainen puoli oranssinvärinen (5ga); ei liukoista pigmenttiä.

Gordon'in ja Smith'in tyrosiini agar - kasvu kohtalainen tai hyvä, ruskeasta tummanruskeaan (3le, 31g, 3ni), kohtalaisesti koholla, sileä tai hiukan raemainen, halkeama 20 yhdessä suonessa; ilmahuovasto puuttuu tai on niukka, valkoinen; vastakkainen puoli samanlainen kuin pinta; liukoinen pigmentti kellertävänruskea (31c).

Kaseiini agar - kasvu kohtalainen tai hyvä, vaaleanruusunpunainen (5ca, 5ea), hiukan koholla, sileä tai kurttuinen; 25 ilmahuovasto puuttuu tai on niukka lähellä reunaa, valkoinen; vastakkainen puoli vaaleankellertävästä vaaleanruusun-punaiseen (2ca, 2ea, 5ca); liukoinen pigmentti kellertävänruskea (31c) .

Kalsiummalaatti agar - kasvu kohtalainen, kermanvärisestä 30 (2ca) valkoiseen, esiintyy erillisinä kolonioina, koholla, sileä, ilmahuovasto valkoinen; vastakkainen puoli kermanvärinen (2ea, 2ca); ei liukoista pigmenttiä.

Gelatiini agar - kasvu kohtalainen, kermanvärisestä tumman-kellertävään (2ea, 2ic), hiukan koholla, sileä tai hiukan 35 raemainen; ilmahuovasto puuttuu tai on niukka, valkoinen; 9 78732 vastakkainen puoli vaaleankellertävä (2ea); ei liukoista pigmenttiä.

Tärkkelys agar - kasvu kohtalainen tai hyvä, kermanvärinen (2ca, 2ea), kohtalaisesti koholla, sileä tai hiukan rae-5 mainen; ilmahuovasto puuttuu tai on niukka, valkoinen; vastakkainen puoli kermanvärinen (2ca, 2ea); ei liukoista pigmenttiä.

Peruna porkkana agar - kasvu kohtalainen, kermanvärinen (2ca), hiukan koholla, sileä; ilmahuovasto puuttuu tai on 10 niukka, valkoinen; vastakkainen puoli kermanvärinen (2ca); ei liukoista pigmenttiä.

Vesijohtovesi agar - kasvu huono, värittömästä vaalean-kermanväriseen (1 1/2 ca), ohut, sileä, ei ilmahuovastoa; vastakkainen puoli väritön; ei liukoista pigmenttiä.

15 Gauze'n mineraali alusta 1 - kasvu kohtalainen, kerman värinen, kellertävänvihreästä ruusunpunaiseen-punaiseen (2ca, 1 1/2 gc, 1 1/2 ie, 5ca, 6ia, 6ga, 61a), ohut, sileä, muutamia valkoisen ilmahuovaston kohtia; vastakkainen puoli samanlainen kuin pinta; ei liukoista pigmenttiä.

20 Gauze'n orgaaninen alusta 2 - kasvu kohtalainen tai hyvä, ruusunpunaisenoranssi (4ae), kohtalaisesti koholla, sileä mutta hiukan kurttuinen lähellä reunaa; ilmahuovasto lyhyt, valkoinen; vastakkainen puoli samanlainen kuin pinta; ei liukoista pigmenttiä.

25 Peruna dekstroosi agar - kasvu hyvä, tummankellertävä, ruusunpunaisesta punaiseen (2ic, 6ea, 6 1/2 ne), koholla, kurttuinen, ilmahuovasto valkoisesta ruusunpunaiseen (6ea), vastakkainen puoli tummankellertävä, punaisesta tummanpunaiseen (2ic, 6 1/2 ne, 6 1/2 ni); liukoinen pigmentti 30 vaaleankellertävä (2ea).

Morfologiset ominaisuudet - Seuraavat morfologiset ominaisuudet todettiin alustassa, joka käsitti epäorgaanisia suoloja, tärkkelystä ja agaria, 21 inkubointipäivän jälkeen; itiömassa valkoisen värin sarjassa; sporoforit monopodiaa-35 lisesti haarautuneita; itiöketjut mutkittelevia tai aalto- 10 78732 maisia, paikoitellen koukistettuja, epäsäännöllisesti kaarevia tai hyvin löyhästi kiertyneinä aina 3 kierrokseen asti, 10-30 itiötä itiöketjua kohti; itiöt soikeasta elliptisiin, harvoin pallonmuotoisia, halkaisijaltaan 1,1-5 1,6 x 0,7-1,O^um tai 0,7-l,0yUm; nystyräisiä, mikä kävi ilmi pyyhkäisyelektronimikroskopian avulla.

Biokemiallisia ominaisuuksia - Melaniinia ei muodostunut tryptonihiivauutosliemessä; rikkivetyä ei muodostunut pep-toni-hiivauutosrauta-agarissa; gelatiini nesteytyi; tärk-10 kelys ei hydrolysoitunut; nitraatti pelkistyi nitriitiksi sekä orgaanisessa nitraattiliemessä että dekstroosi-nit-raattiliemessä; ei kasvua eikä hajoamista kummassakaan selluloosa-alustassa; kirkastuminen eikä mitään koagu-loitumista maidossa; kaseiinin hajoaminen positiivinen; 15 kalsiummalaatin hajoaminen positiivinen; tyrosiinin hajoaminen heikosti positiivinen. Hiilihydraatin hyötykäyttö oli sama ISP-alustassa nro 9 ja Nonomura'n ja Ohara'n C-2-alustassa. Glukoosi ja ramnoosi tulivat käytetyksi hyödyksi; sakkaroosi tuli heikosti käytetyksi hyödyksi; 20 fruktoosi tuli kyseenalaisesti käytetyksi hyödyksi, arabi-noosi, inositoli, mannitoli, raffinoosi ja ksyloosl eivät tulleet käytetyksi hyväksi.

Koko-solu-analyysi - Koko-soluhydrolysaatit sisältävät mesodiaminopimeliinihappoa, maduroosia, galaktoosia, glu-25 koosia, ramnoosia ja riboosia.

Suhtautumiset lämpötilaan - Lämpötilan suhde kasvunopeuteen todettiin seuraavanlaiseksi:

21°C_28°C_37°C_45°C

hyvä hyvä kohtalainen tai ei 30 kasvu kasvu hyvä kasvu kasvua

Mikro-organismia karakterisoi sen kyvyttömyys valmistaa melaniinia, kiemuraiset tai aaltomaiset itiöketjut, joissa on nystyräisiä itiöitä, sekä meso-diaminopimeliini-35 hapon ja maduroosin läsnäolo koko-solu-komponentteina.

11 78732

Ilmahuovasto, mikäli sellaista muodostuu, on surkastunut ja jossakin alustassa on nähtävissä vain mikroskoopin avulla. Ilmahuovaston väri on valkoinen, mutta voi olla ruusunpunainen peruna-dekstroosi-agar-alustassa. Kasvu-5 huovasto on selvästi erottuva ja siinä näkyy jonkin verran punaista vivahdetta hiivauutos-mallasuutos-agarissa, Czapek-sakkaroosi-agarissa, glukoosi-asparagiini-agarissa, Gauze'n orgaanisessa alustassa nro 1 ja peruna-dekstroo-si-agarissa. Viljelmä ei kykene tuottamaan itiöitä useim-20 missä käytetyissä alustoissa. Epäorgaaniset suolat-tärk-kelys-agar-alustassa, kaurajauho-agarissa ja Gauze'n mi-neraalialustassa nro 1 niitä muodostuu harvojen, pienten, koholla olevien valkoisten läiskien muodossa.

Morfologisten ja biokemiallisten ominaisuuksien 15 mukaan mikro-organismi sijoittuu Actinomadura-sukuun. Organismi eroaa kuitenkin kaikista samansukuisista lajeista ja edustaa suvun uutta lajia. Siitä käytetään tässä nimitystä Actinomadura roseorufa Huang sp. nov. Spesifinen epiteetti viittaa viljelmän ruusunpunaiseen, ruusunpuna-20 punaiseen tai punaiseen substraattihuovastoon. Sen viljelmä, N596-33, on talletettu American Type Culture Collec-tion-nimiseen laitokseen; 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, USA Budapestissä 24. toukokuuta 1984 tehdyn sopimuksen sopimusehdoilla vastaanottonumerolla ATCC 25 39697.

Actinomadura roseorufa Huang sp. nov. ATCC 39697-lajin viljely ja antibioottien UK-58 852, CP-70 228 ja CP-70 828 eristäminen voidaan suorittaa olosuhteissa, jotka ovat samanlaiset kuin ne, joita käytettiin aikaisem-30 missä käymisissä, joiden tuloksena oli polyeetterianti-biootteja. Katso esimerkiksi US-patenttia nro 4 361 649. Viljely tapahtuu edullisesti vesipitoisessa ravintoalustassa upoksissa aerobisissa olosuhteissa samalla kun alustaa hämmennetään lämpötilassa välillä 24 - 36°C. Vilje-35 lyyn käyttökelpoinen ravintoalusta sisältää assimiloi- i2 78732 tuvan hiilen lähdettä, kuten sokereita, tärkkelyksiä ja glyserolia; orgaanisen typen lähdettä, kuten kaseiinia, kaseiinin entsymaattista hajoamistuotetta, soijapapu-jauhoa, puuvillansiemenjauhoa, maapähkinäjauhoa, vehnän 5 gluteenia, soijajauhoa, lihajauhoa ja kalajauhoa. Kasvu-aineiden lähdettä, kuten viljan liukoisia aineita, kala-jauhoa, puuvillansiemenjauhoa ja hiivauutosta samoin kuin mineraalisuoloja, kuten natriumkloridia ja kalsiumkarbo-naattia sekä hivenalkuaineita, kuten rautaa, magnesiumia, 10 kuparia, sinkkiä, kobolttia ja mangaania voidaan myös käyttää hyväksi edullisin tuloksin. Jos käymisen aikana esiintyy liiallista vaahtomaista, voidaan käymisliemeen lisätä vaahdonestoaineita, kuten kasviöljyjä tai siliko-neja. Alustan ilmastusta altaissa upoksissa suoritettua 15 kasvatusta varten ylläpidetään nopeudella, joka on noin 1/2 - 2 tilavuutta steriiliä normaalipaineista ilmaa tilavuutta kohti käymislientä minuutissa johdettuna liemeen suutinlaitteen kautta. Hämmentämistä voidaan ylläpitää hämmennyslaitteiden avulla, jotka ovat yleisesti tunnettuja 20 käymisalan asiantuntijoille. Hämmennysnopeus riippuu käytetystä hämmennyslaitteen tyypistä. Ravistuspulloa ravistellaan yleensä jaksoluvulla 150-200 jaksoa minuutissa, kun taas käymisastiaa hämmennetään tavallisesti nopeudella 300-1700 kierrosta minuutissa. Aseptisia olosuhteita täy-25 tyy luonnollisestikin ylläpitää organismin siirron ja koko sen kasvun ajan.

Ymppiä tämän keksinnön mukaisten antibioottien valmistamiseksi voidaan saada käyttämällä kasvutulosta, joka on saatu kaltevasta putkiviljelmästä tai viljelmällä ympä-30 tyistä Roux' in pulloista. Jähmeä kasvatusalusta, joka on sopi vaa organismin alkukasvulle kaltevissa putkissa ja Roux'in pulloissa, on ATCC-alusta nro 172. Kasvutulosta voidaan käyttää joko ravistuspullojen tai ymppäysaltaiden ymppää-miseen tai ymppäysaltaat voidaan siementää ravistuspul-35 loista otetulla ympillä. Kasvu ravistuspulloissa saavut- 13 78732 taa yleensä maksiminsa 4-5 päivässä, kun taas uppoviljely-altaissa ymppi on yleensä suotuisimmassa vaiheessa 5-6 päivän kuluessa.

Antibiootin valmistumisen edistymistä käymisen 5 aikana ja käymisliemen bioaktiviteettia voidaan valvoa liemelle suoritetun biologisen kokeen avulla käyttämällä Staphylococcus aureus- tai Bacillus subtilis-lajin herkkää kantaa. B.subtilis ATCC 6633 on tähän tarkoitukseen sopiva kanta. Käytetään standardilevykoemenetelmää, jossa lie-10 mellä kyllästettyä suodatinpaperikiekkoa ympäröivää ehkäi-syvyöhykettä käytetään antibioottisen tehon mittana. Myös piihappogeeliä käyttävä ohutkerroskroroatografia on käyttökelpoinen keino käymisliemessä tuotettujen antibioottien toteamiseksi ja käymisliemistä uutettujen epäpuhtaan 15 ja puhdistettujen materiaalien koostumuksen analysoimiseksi. Kromatogrammit kehitetään etyyliasetaatilla ja antibioottiset yhdisteet tehdään silminnähtäviksi suihkuttamalla vanilliinireagenssia ja kuumentamalla TLC-levyä 80°C:ssa. Kehitetty levy voidaan myös peittää agarilla.

20 jolle on siirrostettu joko S.aureus- tai B.subtilis- lajia ja inkuboida 37°C:ssa 16 tuntia antibioottien tekemiseksi silminnähtäviksi.

Actinomadura roseorufa Huang sp. nov., ATCC 39697-lajin käymisen avulla valmistettu antibiootti UK-58 852 25 voidaan erottaa ja ottaa talteen uuttamalla koko suodatta-maton käymis liemi orgaanisella liuottimena, kuten kloroformilla, etyyliasetaatilla, metyyli-isobutyyliketonil-la tai butanolilla siinä luonnostaan vallitsevassa pH-ar-vossa. Vaihtoehtoisesti voidaan huovasto erottaa sen jäl-30 keen kun kasvu on tapahtunut täydellisesti ja huovasto on uutettu orgaanisella liuottimena. Liuotinuutos voidaan sen jälkeen väkevöidä ohueksi siirapiksi ja puhdas antibiootti saadaan kromatografian avulla.

Vähäisemmät komponentit CP-70 228 ja CP-70 828 ote-35 taan talteen suorittamalla emäliuoksille uudelleen kroma-grafia.

« 78732 Tämän keksinnön mukainen antibioottiyhdisteen tyypillinen erotus- ja talteenottomenetelmä on seuraavanlainen:

Actinomadura roseorufa Huang sp. nov. , ATCC 39697-5 lajin käymisestä saatu koko liemi uutettiin metyyli-iso-butyyliketonilla. Liuotinuutoksesta saatiin liuottimen tyhjössä suoritetun haihdutuksen jälkeen tummaa öljyä, öljy liuotettiin heksaaniin ja kaadettiin piihappogeeli-kerrokseen. Piihappogeelikerros pestiin toistuvasti hek-10 saanilla ja sen jälkeen eluoitiin kloroformilla, kloro- formi/etyyliasetaattiseoksella ja etyyliasetaatilla. Elu-aatit tutkittiin ohutkerroskromatografian avulla. Ne fraktiot, jotka sisälsivät antibioottia UK-58 852, yhdistettiin ja haihdutettiin kuiviin. Tuotefraktiota voidaan halut-15 taessa puhdistaa edelleen kiteyttämällä tai pylväskromato-grafian avulla. Sykloseriiniä muodostuu yhdessä antibiootti UK-58 852:n kanssa, mutta sen huonon liuotinliukoi-suuden johdosta se ei vaikuta haitallisesti antibiootti UK-58 852:n talteenottoon.

20 Vähäisemmät komponentit CP-70 228 ja CP-70 828 ote taan talteen eluoimalla pylvästä edelleen käyttämällä po-laarisempaa liuotinjärjestelmää. Raa’at tuotteet voidaan puhdistaa tarvittaessa suorittamalla uudelleen kromato-grafia. Antibioottia CP-70 228 muodostuu lisäksi silloin 25 kun UK-58 852:n vapaan happomuodon annetaan seistä metano-liliuoksessa.

Tämän keksinnön mukaisesti valmistetut antibioottiyh-disteet ovat happamia ja ne muodostavat kationisia suoloja reagoidessaan emäksisten aineiden kanssa. Kaikki tällaiset 30 suolat kuuluvat tämän keksinnön piiriin. Näitä suoloja valmistetaan menetelmillä, jotka ovat tavanomaisia polyeette-ri-(ionofori)-antibiooteille. Eräässä menetelmässä pestään antibiootin liuos haihtuvassa, veden kanssa sekoittumatto-massa orgaanisessa liuottimessa vesiliuoksella, joka sisäl-35 tää vähintään stökiometrisen ekvivalentin ja edullisesti 15 78732 suuren ylimäärän sopivaa emäksistä ainetta. Orgaanisen liuotinliuoksen kuivauksen jälkeen se haihdutetaan tyhjössä, jolloin saadaan toivottu kationinen suola. Tyypillisiä emäksisiä aineita, joita voidaan käyttää tähän tar-5 koitukseen, ovat alkalimetallihydroksidit, kuten natrium-hydroksidi ja kaliumhydroksidi, maa-alkalimetallihydrok-sidit, kuten kalsiumhydroksidi ja bariumhydroksidi, sekä ammoniumhydroksidi.

Antibiootti UK-58 852:n hopeasuolan röntgensäde-10 analyysi ja CP-70 228:lie ja CP-70 828:lie saadut analyyttiset ja spektritulokset osoittavat, että yhdisteillä on seuraava kaava: A., pr

f °CH3 f °CH

“Χ” : :η^° H h h or1 COOH 3 CH3 CH3 25

UK-58 852: R - H, R1 » H

CP-70 228: R - H, R1 - CH3 CPZ70_828: R - CH3, R1 - CH^ 30

Antibiootti UK-58 852:11a on ehkäisevä vaikutus lukuisten gram-positiivisten mikro-organismien kasvua vastaan . Jäi jempänä olevassa taulukossa I on esitetty yhteenvetona in vitro suoritettujen kokeiden tulokset. Tätä 35 koetta varten jokaista organismia ympättiin sarjaan koe- ie 78732 putkia, jotka sisälsivät kasvatusalustaa ja vaihtelevia konsentraatioita antibioottia UK-58 852 yhdisteen sen mini-mikonsentraation määrittämiseksi yksikkönä ug/ml, joka ehkäisee organismin kasvun 24 tunnin kuluessa (MIC).

5

Taulukko I

Antibakteriaalinen aktiviteetti Organismi Kanta nro MIC, yg/ml antibioottia UK-58 -852 (natriumsuola) 10 _:_

Staphylococcus aureus 01A005 3,12 01A052 3,12 01A110 3,12 01A400 6,25

Streptococcus faecalis 02A006 > 50

Streptococcus pyogenes 020303 0,05

Actinomyces pyogenes 14D011 < 0,08

Actinobacillus pleuropneumoniae 44B004 > 25

Pasteurella multocida 59A006 >200

Clostridium perfringens 10A009 0,79

Bacteroides fragilis 78C024 0,10

Fusobacterlum 20 necrophorum 84C004 > 25

Treponema hyodysenteriae 94A007 0,39

Grara-negatiivisia bakteereita, kuten bakteereita Escherischia coli, Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella 25 pneumoniae, Serratia marcescens ja Enterobacteriaceae aerogenes, vastaan olivat MIC-arvot >50 jokaisessa tapauksessa.

Antibiootti UK-58 852 ja sen kationiset suolat osoittavat oivallista aktiviteettia kokkidiaalisia tar- 30 tuntoja vastaan siipikarjassa. Sisällytettäessä niitä kananpoikien ruokavalioon 25-150 miljoonasosaa nämä yhdisteet ovat tehokkaita mikro-organismien Eimeria tenella, E.acervulina, E.maxima, E.brunetti ja E.necatrix aiheuttamien tartuntojen valvontaan.

35 Antibioottisen yhdisteen UK-58 852 ja sen suolojen 17 78732 tehokkuustulokset kokkidiaalisia tartuntoja vastaan kananpojissa saatiin seuraavalla tavalla. 3-5 eläimen ryhmälle 10 päivää vanhoja patogeeni-vapaita valkoisia leghorn-rotuun kuuluvia kukonpoikia syötettiin sosemaista ruokaa, 5 joka sisälsi antibioottia UK-58 852 tai sen natrium- ja/tai kaliumsuolaa tasaisesti ruokaan dispergoituna. 24 tuntia tämän annoksen antamisen jälkeen jokaiseen kukkoon ympättiin suun kautta koestettavan erityisen Eimeria-lajin itiörakkuloita. Toisille 3-5 eläimen ryhmille 10 päivää 10 vanhoja kukonpoikia syötettiin samanlaista sosemaista ruokaa ilman antibioottia UK-58 852 tai sen suoloja. Myös niille annettiin tartunta 24 tunnin kuluttua ja ne toimivat tartutettuina vertailukohteina. Vielä yhdelle 3-5 eläimen ryhmälle 10 päivän vanhoja kukonpoikia syötettiin samaa sose-15 maista ruokaa, joka ei sisältänyt antibioottia UK-58 852, mutta näille ei annettu coccidia-tartuntaa. Nämä toimivat normaaleina vertailukohteina. Käsittelytuloksia arvosteltiin 5 päivän kuluttua kysymyksen ollessa E.acervulina'sta ja 6 päivän kuluttua muiden koestettujen mikro-organismien 20 osalta.

Käytetyt kriteerit antikokkidiaalisen aktiviteetin mittaamiseksi käsitti vammapisteet välillä 0-4 kysymyksen ollessa E.tenella’sta, katso artikkelia J.E. Lynch "A New Method for the Primary Evaluation of Anticoccidial Activi-25 ty", Am.J.Vet.Res., 22, 324-326, 1961; sekä 0-3 muille lajeille, mikä järjestelmä pohjautui sen arvostelujärjestelmän muunnokseen, jonka J.Johnson ja W.H. Reid ovat esittäneet artikkelissa "Anticoccidial Drugs. Lesion Scoring Techniques in Battery and Floor Pen Experiments in Chicks", 3Q Exp. Parasit., 28, 30-36, 1970. Vakio suhde todettiin jakamalla jokaisen käsitellyn ryhmän vammapistemäärä tartutetun vertailukohteen vammapistemäärällä.

Taulukossa II on esitetty saadut tulokset yhteenvetona .

18 78732

Taulukko II

Antikokkidiaalinen aktiviteetti in vivo

Tartuntalaji Annos (miljöö- Keskimääräinen Paincnlisäys nasosia rehussa) tartunta-aste (%) 5 ...............

Elmeriä tenella 150 0,0 0 125 0,0 4 100 0,0 8 75 0,0 28 50 0,0 45 25 0,0 93 10 Elmeriä acervulina 150 0,0 0 125 0,0 0 100 0,0 23 75 0,0 0 50 0,0 62 25 0,0 98 15 ~

Eläinten rehujen arvo on yleensä määritetty suoraan syöttämällä eläimelle. Brittiläinen patenttijulkaisu nro 1 197 826 esittää yksityiskohtaisesti in vitro suoritetun pötsimenetelmän, jonka avulla mikro-organismien 20 aiheuttamat, rehuissa tapahtuvat muutokset mitataan helpommin ja suuremmalla tarkkuudella eläinten rehujen arvostelussa. Tämä menetelmä käsittää kojeen käyttämisen, jossa eläinten ruuansulatusprosessit suoritetaan ja tutkitaan in vitro. Eläinten rehut, pötsistä otettu ymppi ja eri-25 laisia kasvua edistäviä aineita lisätään laboratorioyksikköön ja poistetaan siitä huolellisesti valvotuissa olosuhteissa ja tapahtuneita muutoksia tutkitaan kriittisesti ja progressiivisesti mikro-organismien aiheuttaman rehun kulutuksen aikana. Pötsinesteen propionihappopitoi-30 suudessa tapahtuva suureneminen osoittaa, että rehukoostu-muksessa oleva kasvua edistävä aine on aikaansaanut toivotun tuloksen märehtijän kokonaishyötysuhteessä. Muutos propionihappopitoisuudessa ilmaistaan %:na vertailuna olevassa pötsinesteessä löydetystä propionihappopitoisuudesta. 35 Pitkäaikaisia in vivo suoritettuja syöttötutkimuksia käy- i9 78732 tetään luotettavan suhteen osoittamiseksi pötsinesteessä tapahtuvan propionihapon lisäyksen ja eläimen parantuneen hyötysuhteen välillä.

Pötsinestettä kootaan lehmälle tehdystä avanteesta, 5 jolle lehmälle on syötetty kaupallista lihotusrehua ja heiniä. Pötsineste suodatetaan välittömästi juustoliinan läpi ja 10 ml sitä lisätään 50 ml:n vetoiseen kartiomaiseen pulloon, joka sisältää 400 mg standardisubstraattia (68 S maissitärkkelystä +17 % selluloosaa, +15 % uutettua soijalo papujauhoa), 10 ml pH 6,8-puskuria ja koeyhdistettä. Pulloja kaasutetaan happivapaalla typellä noin 2 minuuttia ja inkuboidaan tärytetyssä vesikylvyssä 39°C:ssa noin 16 tuntia. Kaikki kokeet suoritetaan kolminkertaisina.

Haudonnan jälkeen sekoitetaan 5 ml näytettä 1 ml:n 15 kanssa 25 %:sta metafosforihappoa. 10 minuutin kuluttua lisätään 0,25 ml muurahaishappoa ja seosta sentrifugoidaan 1Q minuuttia nopeudella 1500 kierrosta minuutissa. Näytteet analysoidaan sen jälkeen kaasu-nestekromatografiän avulla D.W. Kellog'in menetelmällä (J.Dairy Science, 52, 20 1690, 1969). Maksimiarvot etikka-, propioni- ja voihapolle määritetään näytteistä, jotka on saatu käsittelemättömistä ja käsitellyistä inkubointipulloista.

Koestettuna tämän in vitro-menetelmän avulla antibiootti UK-58 852, käytettäessä sitä 10 mikrogrammaa ml 25 kohti, aiheutti noin 93 %:n suurenemisen propionihapon muodostuksessa verrattuna siihen määrään mikä muodostui vertailuliuoksessa, johon ei oltu lisätty antibioottia UK-58 852. Verrattaessa kaupasta saatavaa yhdistettä, salinomysiiniä (eräs polysyklinen eetteriantibiootti) käyt-30 tämällä sitä 10 pg/ml tapahtui noin 88 %:n suuruinen propionihapon lisäys vertailukohteeseen verrattuna. Vastaavalla tavalla erillisessä kokeessa suoritettuna aiheutti antibiootti CP-7Q.228, käytettäessä sitä 10 pg/ml, noin 30 %:n suuruisen propionihapon muodostumisen lisäyksen ver-35 rattuna noin 40 %:n lisäykseen, joka saavutettiin salinomy-siinillä käyttäen sitä 10 pg/ml.

20 7 8 7 3 2 Nämä tulokset osoittavat, että antibiootit UK-58 852 ja CP-70 228 parantavat rehun hyötykäyttöä märehtijöillä, kuten nautakarjalla ja lampailla. Yhdisteillä on myös samanlainen vaikutus yksimahaisilla eläimillä, 5 kuten sioilla ja kaniineilla. Antibiootteja UK-58 852 ja CP-70 228 voidaan sisällyttää rehukoostumuksiin vapaana happona, natriumsuolana, kaliumsuolana tai näiden seoksina. Antibioottien UK-58 852 tai CP-70 228 epäpuhtaita muotoja tai antibiootteja sisältävää kuivattua käymislientä 10 voidaan myös sisällyttää rehukoostumuksiin toivotuissa tehokkaissa konsentraatioissa.

Vähäisempien antibioottikomponenttien CP-70 228 ja CP-7Q 828 in vitro määritetty antibakteriaalinen aktiviteetti on esitetty yhteenvetona taulukossa III: 15

Taulukko m

Antibakteriaalinen aktiviteetti MIC, pg/ml

Organismi Kanta nro CP-70 228 CP-70 828 natriumsuola natriumsuola 2Q -—-

Staphylococcus aureus 01A005 3,12 25 01A052 3,12 25 01Α11Θ 3,12 25 01A400 6,25 25

Streptococcus faecalis 02A006 50 >50

Streptococcus pyogenes 020203 0,10 3.12 25 Actinomyces pyogenes 14D011 0,34

Actinobacillus pleuropneumoniae 54B004 >100

Pasteurella multoeida 59A006 >100

Clostridium perfringens 10A009 lf58

Bacteroides fragilis 78C024 12,5

Fusobacterium -Q necrophorum 84C004 >100

Treponema hyodysenteriae 94A007 1,58

Sellaisia gram-negatiivisia bakteereita, kuten Escherischia coli, Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella 35 pneumoniae, Serratia marcescens ja Enterobacteriaceae 21 78732 aerogenes, vastaan olivat MIC-arvot >50 kussakin tapauksessa.

Antibioottisen yhdisteen CP-70 228 vaikutustulok-set kokkidiaalisia tartuntoja vastaan kananpojissa nou-5 dattamalla edellä esitettyjä menetelmiä on esitetty yhteenvetona taulukossa IV:

Taulukko IV

Antikokkidiaalinen aktiviteetti in vivo CP-70 228 10 Tartuntalaji Annos (miljoonas- Keskimääräinen Paincnlisäys osia rehussa) tartunta-aste (prosenttia)

Elmeriä tenella 100 0r0 95 75 0,3 63 50 1,3 103 T5 25 2,7 80

Elmeriä acervulina 100 0,0 100 75 0,0 100 50 0,0 70 25 1,2 40 20 Keksintöä valaistaan lähemmin seuraavien esimerk kien avulla.

Esimerkki 1 1. Ympin valmistus

Valmistettiin steriilivesipitoinen kasvualusta, 25 joka sisälsi seuraavia aineosia:

Aineosa_Grammaa/litra

Glukoosia 20 soijajauhoa 10 NZ Amine YTT ^ 5 30 natriumsulfaattia 0,5 kobolttikloridia 0,002 kalsiumkarbonaattia 2 100 ml kasvualustaa jaettiin 300 ml:n ravistelu-35 pulloihin ja steriloitiin 120°C:ssa ja 103 kPa (15 psi) paineessa 30 minuuttia. Jäähdytyksen jälkeen kasvatusalus 22 78732 ta ympättiin kasvusolususpensiolla, joka oli saatu Actinomadura sp. ATCC 39697 (N596-33):n kaltevasta putki-viljelmästä.

Pulloja ravisteltiin 28°C:ssa pyörivässä ravistus-5 laitteessa, jonka iskunpituus oli 3,81-6,35 cm (1 1/2 - 2 1/2 tuumaa) ja jaksoluku 150-200 jaksoa minuutissa, 3-5 päivän ajan.

Seuraavaa kasvualustaa käytettiin myös samanlaisin tuloksin.

10 Aineosa Grammaa/litra “TO--

Cerelose^ 10 maissitärkkelystä 5 maissinliotuslientä 5 NZ Amine YTT 5 15 kobolttikloridia 0,002 kalsiumkarbonaattia 3 *)

Rekisteröity tavaramerkki kaseiinin entsymaattiselle hajoamistuotteelle. Humko Sheffield Chemical Co Inc.

2. Käyminen ja UK-58 852:n eristäminen 2^ Kasvuviljelmää sisältävää ravistuspulloa käytettiin 5 litran vetoisen käymisastian ymppäämiseen, joka sisälsi 3 1 koostumukseltaan seuraavanlaista steriiliä kasvatusalustaa, johon oli lisätty Imi silikonia vaahdonestoaineeksi:

Aineosa_Gr ammaa/li tr a 25 Cerelose^ 10,0 maissitärkkelystä 20,0 NZ Amine YTT 5,0 vehnänalkiöita 5,0 kalsiumkarbonaattia 4,0 30 vettä lopputilavuuden saamiseksi 1 litraksi pH 6,9-7,0 Käyminen suoritettiin 30°C:ssa samalla hämmentäen nopeudella 1700 kierrosta minuutissa ja ilmastaen käyttäen yhtä ilmatilavuutta liemen tilavuutta kohti minuutissa 35 siksi kunnes havaittiin oleellista aktiviteettia (mikä 23 78732 perustut antibiootin levykokeeseen mikro-organismia B.subtilis ATCC 6633 vastaan), mikä yleensä tapahtui 4-6 päivän kuluttua. Liemen ja sen jälkeen talteenottovirto-jen bioaktiviteettia seurattiin käyttämällä mikro-organis-5 min Bacillus subtilis ATCC 6633 tai Staphylococcus aureus ATCC 6538 herkkää kantaa. Antibioottikomponentti liemessä ja talteenottovirroissa tehtiin silminnähtäviksi käyttämällä etyyliasetaatilla kehitettyjä piihappogeelilevyjä. Levyjä suihkutettiin vanilliinireagentilla (3 g vanilliinia 10 seoksessa, jossa oli 75 ml etanolia ja 25 ml 85-%:sta fos-forihappoa) ja kuumennettiin 80°C:ssa. Antibiootti UK-58 852 näkyy läiskänä, jonka väri on oranssin ja punaisen välillä. Vaihtoehtoisesti levy päällystettiin agarilla, joka oli siemennetty joko mikro-organismilla S.aureus tai 15 B.subtilis, ja johon oli lisätty 1,0 ml 2,3,5-trifenyyli-2H-tetratsoliumkloridin l-%:sta liuosta, ja haudottiin 37°C:ssa 16 tuntia antibiootin tekemiseksi silminnähtäväksi valkoisena alueena ruusunpunaista taustaa vastaan.

Tämän ajan kuluttua koko liemi uutettiin metyyli-20 isobutyyliketonilla, liuotin erotettiin ja väkevöitiin, jolloin saatiin 35 g:n suuruinen jäännös. Jäännös suspen-doitiin heksaaniin ja käsiteltiin yhtenä eränä piihappo-geelin kanssa suodatinsuppilossa. Adsorbentti pestiin hek-saanilla, sen jälkeen eluoitiin kloroformilla, etyyliase-25 taatilla ja asetonilla. Aktiviteetti oli etyyliasetaatti-fraktiossa (20 g). Tämä konsentroitiin, jäännös kromato-grafoitiin uudelleen käyttäen piihappoa ja tuote kiteytettiin heptaanista, jolloin saatiin antibioottia UK-58 852 valkoisena kiinteänä aineena (saanto 80 mg).

30 Esimerkki 2

Noudatettiin esimerkin 1 menetelmää, mutta käyttämällä seuraavaa kasvatusalustaa käymiseen: 24 78732

Aineosa_Grammaa/litra

Cere lose® 10 maissitärkkelystä 5 maissinliotuslientä 5 5 kobolttikloridia 0,002 NZ Amine YTT 5 kalsiumkarbonaattia 3

Actinomadura sp. ATCC 39697-lajin 10 käymisviljely-purkin koko liemimäärä (tilavuus kaikenkaikkiaan noin 25 10 litraa) uutettiin 1/3-tilavuudella metyyli-isobutyyli-ketonia. Uutos väkevöitiin tyhjössä ruskeaksi öljyksi (35 g). Tämä aine kromatografoitiin käyttämällä 5 x 100 cm suuruista pylvästä, joka oli täytetty pylväs-laatua olevalla piihappogeeli G:llä (70-230 mesh'iä, Woelm) kloro-15 formi/asetoni-(3il)-seoksessa. Pylväs kehitettiin kloro- formi/asetoni-(3:1)-seoksella virtausnopeudella 10 ml/mi-nuutti. Fraktiot otettiin kukin 10 ml:n suuruisena.

Fraktiot tutkittiin ohutkerroskromatografian avulla TM

käyttämällä Analtech siliga gel GF-levyjä, jotka kehitet-20 tiin etyyliasetaatissa. Levyjä suihkutettiin liuoksella, joka sisälsi 3 % vanilliinia seoksessa, jossa oli etanolia ja 85-%:sta fosforihappoa suhteessa 3:1, ja kuumennettiin 80°C:seen. Toivottu antibiootti UK-58 852 näkyy punaisena läiskänä näissä olosuhteissa.

25 Ne fraktiot, jotka sisälsivät antibioottia UK- 58 852, yhdistettiin (tilavuus l^ikkiaan noin 350 ml) ja hämmennettiin 2 g:n kanssa Darco G60-hiiltä 5 minuuttia. Seos suodatettiin ja haihdutettiin tyhjössä. Haihdutuksen jälkeen jäljelle jäänyt keltainen öljy liuotettiin 100 ml: 30 aan kloroformia ja liuosta hämmennettiin yhtä suuren vesi-tilavuuden kanssa ja pH säädettiin arvoon 4,0 fosforiha-polla. Faasit erotettiin toisistaan ja kloroformifaasia hämmennettiin yhtä suuren tilavuuden kanssa 5-%:sta nat-riumfosfaatin 2-emäksistä puskuria ja pH säädettiin ar-35 voon 9,0 käyttämällä 1-N natriumhydroksidi-liuosta. Faa- 25 7 8 7 3 2 sit erotettiin ja kloroformi kuivattiin kidevedettömän natriumsulfaatin avulla ja sen jälkeen haihdutettiin tyhjössä. Haihdutuksen jälkeen jäljelle jäänyt keltainen viskoosi öljy liuotettiin pieneen tilavuuteen heptaania, 5 jonka jälkeen tapahtui kiteytyminen. Kiteet koottiin suodattamalla ja kuivattiin tyhjössä, jolloin saatiin 3,5 g antibioottia UK-58 852 natriumsuolana; sp. 182-183°C.

Saadut arvot: C 60,90, H 8,32, C52H87°18 edellyttää arvoja C 61,06, H 8,51. Ultraviolettispektri osoitti vain pääte-10 absorptiota. Optinen kiertyminen ~ +10° (c = 0,5, metanoli).

Infrapunaspektri (KBr) cm 34,23, 2966, 2928, 2869, 2821, 1613, 1453, 1407, 1377, 1361, 1312, 1257, 1238, 1206, 1175, 1160, 1116, 1093, 1064, 1030, 983, 969, 938, 919, 886.

15 Antibiootin UK-58 852 vapaan hapon muotoa valmis tettiin hämmentämällä UK-58 852:n natriumsuolan klorofor-miliuosta yhtä suuren tilavuuden kanssa vettä ja alentamalla pH arvoon 3,0 fosforihapolla. Sen jälkeen faasit erotettiin ja kloroformi haihdutettiin tyhjössä, jolloin saa-20 tiin antibiootti UK-58 852 vapaana happona, sp. 123-126°C. Ultraviolettispektri osoitti vain pääteabsorptiota. Optinen kiertyminen = +40° (c = 0,5, kloroformi).

Esimerkki 3

Noin 7700 litran (1700 gallonan) vetoinen käymisastia, 25 joka sisälsi n. 4550 litraa (1000 gallonaa) koostumukseltaan seuraavanlaista steriiliä kasvatuslaustaa, ympättiin litralla Actinomadura sp. ATCC 39697:n ymppiä, joka oli valmistettu esimerkissä 1 esitetyllä tavalla.

Kasvatusalusta 3Q Aineosa _Grammaa/litra

Cerelose W- 10 maissitärkkelystä 5 maissinliotuslientä 5 kobolttikloridia 0,002 35 NZ Amine YTT 5 kalsiumkarbonaattia 3 26 7 8 7 3 2 Käymisastia pidettiin 28°C:ssa samalla ilmastaen sitä ja hämmennettiin nopeudella 1700 kierr./min. 296 tunnin kuluttua koko liemi uutettiin n. 1360 litralla (300 gallonalla) metyyli-isobutyyliketonia ja sen jälkeen n. 910 lit-5 ralla (200 gallonalla) samaa ainetta. Liuotinuutokset erotettiin, yhdistettiin ja väkevöitiin tyhjössä 10 litraksi ruskeaa öljyä. Uutosta jauhettiin samalla hämmentäen metano-lin kanssa 5 minuuttia. Metanolifaasi erotettiin ja öljyä hämmennettiin 6 litran lisämäärän kanssa metanolia.

1q Metanoliuutokset yhdistettiin ja haihdutettiin tyhjössä (4 litraa). 1 litra tätä metanolikonsentraattia otettiin 2 litraan heksaania ja kaadettiin kerrokseen, joka käsitti 3 kg pylväslaatua olevaa piihappogeeliä Lapp'in suo-dattimessa. Piihappogeeli pestiin peräkkäisesti heksaanilla 15 (11 litraa), kloroformilla (7,5 litraa) ja lopuksi etyyli asetaatilla (7,5 litraa). Fraktiot tutkittiin ohutkerros-kromatografiän avulla. Tuotteen todettiin olevan kloroformi- ja etyyliasetaattifraktioissa. Kloroformi- ja etyyli-asetaattifraktiot pestiin molemmat vedellä, joka sisälsi 20 fosforihappoa, pH-arvoon 4 ja sen jälkeen 5 %:lla natrium-fosfaatin 2-emäksisellä puskurilla (säädetty pH-arvoon 9,5 1-N natriumhydroksidiliuoksella). Liuotinfraktiot kuivattiin sen jälkeen kidevedettömän natriumsulfaatin avulla ja haihdutettiin tyhjössä. Haihdutuksen jälkeen jäljelle 25 jäänyt öljymäinen jäännös otettiin pieneen määrään heksaania, jonka jälkeen tapahtui kiteytyminen. Kiteet koottiin suodattamalla. Jäljelle jäänyttä 3 litran suuruista metanolikonsentraattia käsiteltiin edellä kuvatulla tavalla ja kaikista neljästä ajosta saadut kiteet yhdistettiin, 3Q jolloin saatiin 300 g antibioottia UK-58 852 natriumsuo-lana.

Esimerkki 4 CP-7Q 228;n eristäminen käymisen emäljuoksesta 25 g UK-58 852:n kiteytyksestä saatua emäliuosta 35 kromatografoitiin käyttämällä 50 mm x 1 m suuruista pyi- 27 78732 västä, joka oli pakattu pylväslaatua olevalla piihappo-geelillä seoksessa, joka sisälsi kloroformia ja asetonia (4:1). Pylväs eluoitiin nopeudella 10 ml/minuutti samalla liuottimena ottamalla 10 ml:n suuruiset fraktiot. Kroma-5 tografian edistymistä valvottiin ohutkerroskromatografiän avulla. UK-58 852 sisältyi fraktioihin 95-230. 300 fraktion jälkeen lisättiin järjestelmään 25 % metanolia ja elu-ointia jatkettiin vielä 2 litralla. CP-70 228 sisältyi näihin fraktioihin, jotka haihdutettiin ja tällöin saatiin 10 4,5 g keltaista öljyä. Tämä aine kromatografoitiin edelleen 25 mm x 50 cm:n suuruisella Sephadex LH-20:n pylväällä metanolissa. Virtausnopeus oli 1 ml/minuutti ja fraktiot otettiin joka 5 minuutti. Ne fraktiot, jotka osoittivat ohutkerroskromatografiän perusteella sisältävän CP-70,228, 15 haihdutettiin, jolloin saatiin 1,3 g keltaista öljyä. Tämä konsentraatti kromatografoitiin uudelleen käyttämällä 25 mm x 50 cm:n suuruista pylvästä, joka oli pakattu pylväs laatuluokkaa olevalla piihappogeeIillä kloroformissa, joka sisälsi 2,5 % metanolia. Pylvästä ajettiin nopeudel-2Q la 5 ml/minuutti ja fraktioita otettiin aina 2 minuutin kuluttua. Ne fraktiot, jotka ohutkerroskromatografiän perusteella näyttivät sisältävän CP-70 228, yhdistettiin ja haihdutettiin, jolloin saatiin 100 mg valkoista kiinteätä CP-70,228 sp. 113-123°C. Saadut arvot: C 62,63, 25 H 8,82. C53H9q°i8 edellyttää arvoja C 62,70, H 8,94 %. Ultraviolettispektri: ei absorptiota. Optinen kiertyminen: EP^j^ ~ +21,8° (c = 0,5 metanoli) . Infrapunaspektri (KBr) cm"1: 3439, 2970, 2933, 2877, 1716, 1636, 1457, 1380, 1318, 1293, 1240, 1218, 1165, 1117, 1097, 1069, 30 1032, 989, 975, 940, 912, 897, 859.

Esimerkki 5 UK-58 852:n muuttaminen CP-70 228 natriumsuolaksi 11 g vapaana happona olevaa UK-58 852 liuotettiin 200 ml:aan metanolia ja liuoksen annettiin seistä huoneen 35 lämpötilassa. Liuoksen ohutkerroskromatografia osoitti 1 28 78732 tunnin kuluttua UK-58 852:n täydellistä muuttumista CP-70 228:ksi. Metanoli haihdutettiin tyhjössä ja konsent-raatti liuotettiin 200 ml:aan kloroformia. Kloroformiliuosta hämmennettiin 200 ml:n kanssa 5-%:sta natriumfosfaa-5 tin 2-emäksistä puskuria ja pH säädettiin arvoon 10,5 6-n natriumhydroksidilla. Faasit erotettiin ja kloroformiliuos kuivattiin kidevedettömän natriumsulfaatin avulla, suodatettiin ja haihdutettiin tyhjössä öljyksi. 200 ml heptaa-nia lisättiin ja liuos haihdutettiin jälleen tyhjössä, 10 jonka jälkeen CP-7Q 228 kiteytyi natriumsuolana. Suolaa kuivattiin korkeassa tyhjössä 60°C:ssa 5 tuntia, saanto 11 g. Spektritulokset ja kromatografia osoittavat, että tämä aine on identtistä käymisestä saadun CP-70 228:n kanssa, sp. 150-155°C. Saadut arvot: C 60,49, H 8,75.

15 ^53^89^181^ edellyttää arvoja C 61,37, H 8,65 %. Ultra- violettispektri: ei absorptiota. Optinen kiertyminen = +13,6° (c = 0,5 metanoli). Infrapunaspektri (KBr) cm"1. 3429, 2973, 2935, 2878, 1594, 1455, 1399, 1379, 1319, 1291, 1268, 1242, 1215, 1189, 1165, 1117, 1096, 1068, 1030, 20 "0/ 975' 943' 891, 860, 833.

Esimerkki 6 CP-70 828:n eristäminen käymisen emäliuoksesta Vähäisempi komponentti CP-70 828 eristettiin käymisen emäliuosten toistetun pylväskromatografiän avulla.

25 CP-70 828 todettiin vanilliinisuihkutuksen avulla samalla tavalla kuin CP-70 228. TLC:n avulla erillisestä täplästä saatu CP-70 828-materiaali kiteytettiin heptaanista, saanto 20 mg, sp 133-136°C. Saadut arvot: C 62,66, H 8,85. C54H92°18 edeHyttää arvoja C 63,01, H 9,01 %. Ultravio-3Q lettispektri : ei absorptiota.

Infrapunaspektri (KBr) cm 1: 3416, 3259 (br), 2968, 2926, 2871, 1614, 1455, 1377, 1363, 1315, 1260, 1238, 1206, 1175, 1160, 1116, 1092, 1063, 1030, 986, 970, 939, 921, 887, 857, 827, 799, 661.

Claims (4)

29 78732

1. Menetelmä antibioottien UK-58852, CP-70228 ja CP-70828 valmistamiseksi, joilla on kaava (I) A°CH3 CH Π.....°CH3 f OCHj^ 0 CH CH3 U) 15 ja niiden farmaseuttisesti hyväksyttävien kationisten suolojen valmistamiseksi, jossa kaavassa R ja R* ovat kumpikin vety; R on vety ja R^ on metyyli; tai R ja R* ovat kumpikin metyyli; tunnettu siitä, että viljellään 20 mikro-organismia Actinomadura roseorufa Huang sp. nov. ATCC 39697, jolla on kyky tuottaa kaavan (I) mukaista antibioottia, vesipitoisessa kasvatusalustassa, joka sisältää assimiloituvaa hiilen, typen ja epäorgaanisten suolojen lähdettä, submerssiviljelmänä aerobisissa fermentointi- 25 olosuhteissa, kunnes on saatu talteenotettavissa oleva mää rä mainittua antibioottia, ja kaavan (I) mukainen antibiootti otetaan talteen.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että antibiootti erotetaan kasva-30 tusalustasta.

3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että antibiootti otetaan talteen huovastovalmisteena tai suihkukuivaamalla koko kasvatus-alusta.

4. Patenttivaatimuksen 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että antibiootti muutetaan sen natrium- tai kaliumsuolaksi.