FI75363B - Foerfarande foer framstaellning av en monoklonal antikropp mot maenniskans hjaelpar-t-celler, medelst en ny hybridcellinje. - Google Patents

Description

T7I5^7| KUULUTUSJULKAISU

·$§Γί! B] (11) UTLÄGGN,NGSSKR,FT 75 36 3 • C Fa :::..11: i jsyöi.:·;*. Ity (45) Patoni nieiCeiat CO CC 1000 (51) Kw.ik.Vmt.CI.4 C 12 N 5/00, 15/00, C 12 P 1/00 A 61 K 39/395

SUOMI-FINLAND

(Fl) (21) Patenttihakemus - Patentansökning 8013A3 (22) Hakemispäivä - Ansökningsdeg 25.0A.80

Patentti-ja rekisterihallitus (23) Alkupäivä-Giltighetsdag 25.04.80

Patant-och registeretyralsen (41) Tu)lutjulklseksi_Bl,vitoffentiig 27.10.80 (44) Nähtäväksipanon ja kuul.julkaisun pvm. - 29 02 88

Ansdkan utlagd och utl.skriften publicerad ^ ' (86) Kv. hakemus-Int. ansökan (32)(33)(31) Pyydetty etuoikeus - Begärd prioritet 26.0 A. 79 USA(US) Ο33639 Toteennäytetty-Styrkt (71) Ortho Pharmaceutical Corporation, U.S. Route 202, Raritan, New Jersey, USA(US) (72) Patrick Chung-Shu Kung, Bridgewater, New Jersey,

Gideon Goldstein, Short Hills, New Jersey, USA(US) (7A) Oy Kolster Ab (5A) Menetelmä monoklonaa1isen vasta-aineen valmistamiseksi ihmisen auttaja--T-soluille uuden hybridisol uiinjan avulla - Förfarande för framställ-ning av en monoklonal antikropp mot människans hjälpar-T-celler, medelst en ny hybridee 11inje

Keksintö kohdistuu menetelmään monoklonaalisen, ihmisen kaikkien normaalien auttaja-T-solujen pinnalta löydetylle antigeenille spesifisen vasta-aineen valmistamiseksi uuden hybridisolulinjän avulla. Vasta-ainetta voidaan käyttää terapeuttisiin tarkoituksiin.

Kohler ja Milstein yhdistivät vuonna 1975 hiiren myeloomasoluja immunisoitujen hiirien pernasoluihin (Nature 256 (1975) 495-497), jolloin ensimmäisen kerran havaittiin, että oli mahdollista valmistaa jatkuva solulinja homogeenisen (ns. "monoklonaalisen") vasta-aineen tuottamiseksi. Tämän jälkeen erilaisten hybridisolujen (ns. hybrido-mien) valmistamista on yritetty monin tavoin ja näiden hybridomien tuottamaa vasta-ainetta yritetty soveltaa tieteelliseen käyttöön. Katso esimerkiksi: Current Topics in Microbiology and Immunology, volyymi 81 - "Lymphocyte Hybridomas", toimittajat F. Melchers, M. Potter 2 75363 ja N. Warner, Springer-Verlag 1978 ja julkaisun sisältämät kirjallisuusviitteet: C.J. Barnstable et ai., Cell 14 (toukokuuta 1978) 9-20; P. Parham ja W.F. Bodmer, Nature 276 (1978) 397-399; Handbook of Experimental Immunology, 3. painos, volyymi 2, toimittaja D.M. Wier, Blackwell 1978, kappale 25; ja Chemical and Engineering News, tammikuu 1 (1979) 15-17.

Näissä viitteissä on esitetty saavutetut tulokset ja esiintyneet vaikeudet yritettäessä valmistaa hybridomeista monoklonaalista vasta-ainetta. Vaikka valmistusmenetelmä periaatteessa tunnetaan hyvin, vaikeuksia esiintyy paljon ja jokainen tapaus on erilainen. Ei voida etukäteen taata, että yritettäessä valmistaa haluttua hybrido-maa siinä onnistutaan ja että tässä onnistuttaessa hybridoma tuottaa vasta-ainetta tai että näin muodostuneella vasta-aineella on haluttu spesifisyys. Onnistuminen riippuu pääasiassa käytetystä antigeenila-jista ja halutun hybridoman eristämisessä käytetystä selektioteknii-kasta.

Monoklonaalista ihmisen lymfosyyttien pinta-antigeeneille spesifistä vasta-ainetta on yritetty valmistaa vain harvoissa tapauksissa. Katso esimerkiksi: Current Topics in Microbiology and Immunology, volyymi, 81, 66-69 ja 164-169. Näissä kokeissa käytetyt antigeenit olivat viljeltyjä ihmisen lymfoblastoidileukemiasolulinjoja ja kroonisen lymfosyyttileukemian solulinjoja. Monet näin valmistetut hybrido-mat tuottivat vasta-ainetta, joka vaikutti kaikkien ihmisen solujen erilaisiin pinta-antigeeneihin. Mikään näistä hybridomeista ei tuottanut tietylle ihmisen lymfosyyttilajille spesifistä vasta-ainetta.

Ihmisen ja eläinten elimistön immunologisiin toimintoihin osallistuu kaksi lymfosyyttien pääryhmää. Näistä toinen (kateenkorvasta peräisin oleva solu eli T-solu) erilaistuu kateenkorvassa hemopoieet-tisista kantasoluista. Kateenkorvassa olevia erilaistuvia soluja nimitetään "tymosyyteiksi". Kypsät T-solut irtoavat kateenkorvasta ja joutuvat sen jälkeen verenkiertoon, kudoksiin ja imukudokseen. Nämä T-solut muodostavat suuren osan elimistössä kiertävistä pienistä lymfosyyteistä. Ne ovat immunologisesti spesifisiä ja osallistuvat efek-torisoluina suoraan solujen välityksellä tapahtuviin immunologisiin reaktioihin (esimerkiksi elinsiirtojen yhteydessä esiintyvä hylkiminen) . Vaikka T-solut eivät eritä vasta-aineita elimistön nesteisiin, toinen myöhemmin käsiteltävä lymfosyyttiryhmä tarvitsee eräissä tali 3 75363 pauksissa T-soluja pystyäkseen itse erittämään vasta-aineita. Eräät T-solulajit toimivat toisissa immunologissa toiminnoissa säätelevästä Tämän solujen yhteistoimintamuodon mekanismia ei vielä täysin tunneta.

Toiseen lymfosyyttiryhmään (luuytimestä peräisin oleviin soluihin eli B-soluihin) kuuluvat ne, jotka erittävät vasta-aineita.

Ne kehittyvät myös hemopoieettisista kantasoluista, mutta kateenkorva ei säätele niiden erilaistumista. Linnuilla ne erilaistuvat kateen-korvalle analogisessa elimessä, joka on nimeltään "Bursa on Fabricius". Imettäväisistä ei kuitenkaan ole löydetty vastaavaa elintä, ja täten B-solujen arvelleen erilaistuvan luuytimessä.

T-solut jakaantuvat ainakin kolmeen alalajiin, joita nimitetään "auttaja-, "heikentäjä"- ja "tappaja"-T-soluiksi, nämä suhteellisesti ottaen joko nopeuttavat tai hidastavat reaktiota tai tappavat (liuottavat) vieraita soluja. Nämä alaluokat ovat hyvin tunnettuja hiirien elimistössä, mutta vasta äskettäin niiden toimintaa on kuvattu ihmiselimistössä. Katso esimerkiksi: R.L. Evans et ai., Journal of Experi-metanl Medicine 145 (1977) 221-232, ja L. Chess ja S.F. Schlossman -"Functional Analysis of Distinct Human T-cell Subsets Bearing Unique Diffefentiation Antigens", teoksessa "Contemporary Topics in Immunobiology", toimittaja 0. Stutman, Plenum Press 1977, volyymi 7, 363-379.

Eri T-solulajien tai -alalajien identifiointi tai niiden heikentäminen on tärkeää erilaisten immunoregulatooristen häiriöiden diagnoosissa ja hoidossa.

Esimerkiksi tiettyjen leukemia- ja imukudoskasvainmuotojen prognoosi on erilainen sen mukaan, ovatko ne lähtöisin B- tai T-soluista. Täten taudinprognoosia arvioitaessa on tärkeää, että nämä kaksi lym-fosyyttiryhmää pystytään erottamaan toisistaan. Katso esimerkiksi: A.C. Aisenberg ja J.C. Long, The American Journal of Medicine 58 (1975) 300? D. Belpomme et ai., teoksessa "Immunological Diagnosis of Leukemias and Lymphomas", toimittajat S. Thierfelder et al., Springer, Heidelberg 1977, 33-45; ja D. Belpomme et al., British Journal of Haematology 38 (1978) 85.

Tietyissä tautitiloissa (esim. nuorten nivelreumassa, tietyissä leukemiamuodoissa ja agammaglobulinemiassa) T-solujen alaryhmät ovat joutuneet epätasapainoon. On mahdollista, että autoimmuunisissa sai- 4 75363 raukeissa yleensä "auttaja"-T-soluja esintyy ylimäärin ja tietyistä "heikentäjä"-T-soluista on puutetta, kun taas agammaglobulinemiassa tiettyjä "heikentäjä"-T-soluja esiintyy ylimäärin tai "auttaja"-T-soluista on puutetta. Pahanlaatuisissa tautitiloissa yleensä "heikentä jä"-T-solu ja esiintyy ylimäärin.

Tietyissä leukemiamuodoissa muodostuu ylimäärin pysähtyneessä kehitysvaiheessa olevia T-soluja. Diagnoosin onnistuminen voi täten riippua siitä, pystytäänkö tämä epätasapaino tai ylimäärä havaitsemaan. Katso esimerkiksi: J. Kersey et ai., "Surface Markers Define Human Lymphoid Malignancies with Differing Prognoses", teoksessa "Haematology and Blood Transfusion", volyymi 20, Springer-Verlag 1977, 17-24 ja julkaisun sisältämät viitteet.

Agammaglobulinemiaan, tautitilaan, jossa immunoglobuliinia ei muodostu lainkaan, kuuluu ainakin kaksi erilaista tautimuotoa. Muodossa I ylimäärin esiintyvät "heikentäjä"-T-solut estävät immunoglobu-liinin muodostumisen, kun taas muodossa I sama häiriötila aiheutuu siitä, että "auttaja"-T-soluista on puutetta. Molemmissa tautimuodoissa potilaan B-solut eli lymfosyytit, jotka vastaavat vasta-aineen varsinaisesta erityksestä, ovat täysin normaaleja eikä niistä esiinny puutetta; B-solujen toiminta on kuitenkin heikentynyt tai "sitä ei auteta", minkä vuoksi immunoglobuliinituotanto vähenee huomattavasti tai loppuu kokonaan. Potilaan agammaglobulinemiatyyppi voidaan täten saada selville kokeilla, joissa määritetään, onko heikentäjä-T-soluja ylimäärin vai onko auttaja-T-soluista puutetta.

Terapeuttisella puolella on havaittu viitteitä siitä, että annettaessa ylimäärin esiintyvälle T-solujen alaryhmälle spesifisiä vasta-aineita autoimmuunisia tai pahanlaatuisia sairauksia poteville potilaille nämä vaikuttavat sairauden kehitykseen edullisesti. Esimerkiksi auttaja-T-solusyöpää (tiettyjä ihoimukudoskasvaimia ja tiettyjä T-solujen akuutteja lymfoblastileukemiamuotoja) voidaan hoitaa autta-ja-T-solujen antigeenisille spesifisellä vasta-aineella. Autoimmuuni-sia sairauksia, jotka ovat aiheutuneet ylimäärin esiintyvistä T-so-luista, voidaan myös hoitaa samalla tavalla.

Antiseerumit, jotka vaikuttavat ihmisen kaikkiin T-soluihin (ns. ihmisen vastainen tymosyyttiglobuliini eli ATG), on osoittautunut terapeuttisesti käyttökelpoiseksi hoidettaessa potilaita, joille on suoritettu elintensiirtoja. Koska T-solut vaikuttavat solujen vä- il 5 75363 lityksellä tapahtuviin immunologisiin reaktioihin (siirrettyjen elinten hylkimismekanismi), T-soluille spesifisen vasta-aineen saaminen estää tai hidastaa tätä hylkimisprosessia. Katso esimerkiksi: Cosimi et ai., "Randomized Clinical Trial of ATG in Cadaver Renal Allgraft Recipients: Importance of T Cell Monitoring" Surgeery 40 (1976) 155-163, ja julkaisun sisältämät viitteet.

Ihmisen T-solulajien ja -alalajien identifiointiin ja heikentämiseen on tähän asti käytetty spontaaneja autovasta-aineita tai ihmisen T-soluille selektiivisiä antiseerumeja, jotka on valmistettu im-munoimalla eläimiä ihmisen T-soluilla, poistamalla eläimistä veri seerumin saamiseksi ja adsorboimalla antiseerumi esimerkiksi autolo-gisilla ei-allogeenisilla B-soluilla vasta-aineiden poistamiseksi, joilla on ei-haluttu reaktiivisuus. Näiden antiseerumien valmistus on erittäin vaikeaa erikoisesti adsorptio- ja puhdistusvaiheissa. Adsorboidut ja puhdistetut antiseerumitkin sisältävät halutun vasta-aineen lisäksi useista syistä monia epäpuhtauksia. Eräs syy on se, että seerumi sisältää miljoonia vasta-ainemolekyylejä jo ennen immunointia T-soluilla. Toiseksi inununointi aiheuttaa vasta-aineiden muodostumisen useita antigeenilajeja vastaan, joita on löydetty kaikista injektoiduista ihmisen T-soluista. Ei pystytä selektiivisesti tuottamaan tietylle antigeenille spesifistä vasta-ainetta. Kolmanneksi näillä menetelmillä valmistetun spesifisen vasta-aineen tiitteri on tavallisesti melko alhainen (esim. laimennusten ollessa suurempia kuin 1:100 vasta-aine on inaktiivinen) ja spesifisen ja ei-spesifisen vasta-aineen suhde on pienempi kuin 1/10^.

Katso esimerkiksi Chessin ja Schlossmanin edellä mainittua artikkelia (sivulta 365 eteenpäin) sekä edellä mainittua artikkelia "the Chemical and Engineering News"-lehdessä, näissä on kuvattu tähän asti käytettyjen antiseerumien puutteellisuuksia ja monoklonaalisen vasta-aineen etuja.

Nyt on keksitty uusi hybridoma (nimeltään OKT4), joka pystyy tuottamaan uutta monoklonaalista vasta-ainetta, joka on spesifinen käytännöllisesti katsoen kaikista ihmisen normaaleista perifeerisistä auttaja-T-soluista (noin 55 % ihmisen terveistä perifeerisistä T-so-luista) löydetylle pinta-antigeenille. Näin muodostunut vasta-aine on monospesifinen yhdelle ainoalle ihmisen normaaleiden T-solujen pinta-antigeenideterminantille, eikä se sisällä käytännöllisesti katsoen 6 75363 lainkaan muita ihmisen vastaisia immunoglobuliineja, päinvastoin kuin tähän asti tunnetut antiseerumit (jotka sisältävät luonnostaan epäpuhtauksina vasta-aineita, jotka reagoivat hyvin monien ihmisen antigeenien kanssa) ja tähän asti tunnetut monoklonaaliset vasta-aineet (jotka eivät ole monospesifisiä yhdelle ainoalle ihmisen T-solun antigeenille) . Lisäksi tätä hybridomaa voidaan viljellä vasta-aineen tuottamiseksi, jolloin eläinten käyttö vasta-aineen tuottamiseen ei ole välttämätöntä eikä myöskään tarvita monimutkaisia adsorptio- ja puhdistusvaiheita, jotka tähän astisissa epäpuhtaidenkin antiseerumien valmistusmenetelmässä ovat olleet välttämättömiä.

Sekä esillä olevasta hybridomasta että sen tuottamasta vasta-aineesta käytetään tässä yhteydessä nimitystä "0KT4", asianyhteydestä ilmenee, kumpaa kulloinkin tarkoitetaan. Esillä oleva hybridoma on tallennettu 26.4.1979 laitokseen "the American Type Culture Collection", 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, ja sille on annettu ATCC-talletusnumero CRL 8002.

Vasta-aineelle OKT4 on tunnusomaista, että se a) reagoi käytännöllisesti katsoen kaikkien ihmisen normaalien perifeeristen auttaja-T-solujen kanssa, joita on noin 55 % kaikista ihmisen normaaleista perifeerisistä T-soluista, mutta ei reagoi ihmisen normaalien perifeeristen B-solujen, nollasolujen eikä makrofagien kanssa, b) reagoi noin 80 %:n kanssa ihmisen normaaleja tymosyyttejä, c) ei reagoi T-solujen kroonista lymfoblastileukemiaa, B-solujen kroonista lymfoblastileukemiaa, T-solujen akuuttia lymfoblastileukemiaa tai nollasolujen akuuttia lymfoblastileukemiaa sairastavien ihmisten leukemiasolujen kanssa, d) reagoi ihmisen T-solulinjan CEM kanssa, mutta ei reagoi ihmisen T-solulinjojen HJD-1, Laz 191 eikä HM1 kanssa, e) ei reagoi Epstein-Barr-viruksella transformoitujen ihmisen B-solulinjojen Laz 007, Laz 156, Laz 256 eikä SB kanssa.

f) reagoi noin 55 %:n kanssa Rhesus-apinan perifeerisiä T-soluja, g) sitoo komplementin, ja h) määrittelee T-solupopulaation (OKT4+), joka ei reagoi anti-TF^-seerumin kanssa ja jonka solumyrkyllisyys on erittäin vähäinen.

Vasta-aineen OKT4 valmistus uuden hybridisolulinjan ATCC CRL 8002 avulla on kuvattu patenttivaatimuksissa 1 ja 2.

Il 7 75363

Hybridoma valmistettiin pääpiirteittäin Milsteinen ja Kohlerin esittämällä menetelmällä. Tässä immunisoitiin ensin hiiriä normaaleilla E-rosettipositiivisilla ihmisen T-soluilla, ja sen jälkeen immunisoitujen hiirien pernasolut yhdistettiin hiiren myeloomasolulinjän soluihin, ja viljelmän pintanesteestä erotettiin ne hybridomat, jotka tuottivat ihmisen normaaleihin E-rosettipositiivisiin T-soluihin selektiivisesti sitoutuvaa vasta-ainetta. Halutut hybridomat kloonattiin ja karakterisoitiin. Tulokseksi saatiin hybridoma, joka tuottaa käytännöllisesti katsoen kaikista normaaleista ihmisen auttaja-T-so-luista löydetylle pinta-antigeenille spesifistä vasta-ainetta (nimitys 0KT4). Tämä vasta-aine reagoi käytännöllisesti katsoen kaikkien ihmisen normaalien perifeeristen auttaja-T-solujen kanssa, mutta se ei reagoi muiden normaalien perifeeristen veren lymfasolujen kanssa, mukaan luettuna ei-auttaja-T-solut. Lisäksi tämän vasta-aineen tunnistama solun pinta-antigeeni on löydetty noin 80 %:lta ihmisen normaaleja tymosyyttejä. OKT4-vasta-aineella todettiin potilaista tyyppiä II olevat agammaglobulinemia suorittamalla sokea koe. Kyseinen vasta-aine reagoi myös noin 55-%:isesti Rhesus-apinan perifeeristen T-so-lujen kanssa.

Otettaessa huomioon tähän asti esiintyneet vaikeudet ja huonot tulokset käytettäessä pahanlaatuisten tautien solulinjoja antigeeninä on yllättävää, että esillä olevalla menetelmällä saatiin aikaan haluttu hybridoma. On korostettava, että hybridomasolujen valmistuksessa esiintyvien arvaamattomien tekijöiden vuoksi ei pystytä tietyllä an-tigeeni-solu-yhdistelmällä saatujen tulosten perusteella ennustamaan jonkin muun antigeeni-solu-yhdistelmän käyttäytymistä. On nimittäin havaittu, että käytettäessä pahanlaatuisen taudin T-solulinjoja antigeeninä muodostui hybridomeja, jotka eivät tuottaneet haluttua vasta-ainetta. Käytettäessä solujen pinnalta eristettyjä puhdistettuja antigeenejä ei myöskään saatu positiivisia tuloksia.

Hybridoman ja sen tuottaman vasta-aineen valmistus ja karakterisointi on tarkemmin selostettu keksinnön kuvauksessa ja esimerkeissä.

Hybridoman valmistusmenetelmä koostuu pääpiirteittäin seuraa-vista vaiheista: A. Hiiriä immunisoidaan E-rosettipositiivisilla puhdistetuilla normaaleilla ihmisen T-soluilla. Yleensä naaraspuoliset CAF^-hiiret on havaittu tähän parhaiten soveltuviksi, mutta myös muiden hiirikan- 75363 tojen käyttöä voidaan ajatella. Immunisointiaikataulun ja T-solupi-toisuuden pitäisi olla sellainen, että saadaan käyttökelpoiset määrät sopivasti esikäsiteltyjä splenosyyttejä. Kolme immunisointia 2 x 10^ solulla/hiiri/ruiske 0,2 mlrssa fosfaatilla puskuroitua suolaliuosta neljäntoista päivän välein on havaittu tehokkaaksi.

B. Pernat poistetaan immunisoiduista hiiristä, ja valmistetaan pernasolususpensio sopivaan väliaineeseen. Sopiva väliainemäärä on yksi millilitra yhtä pernaa kohti. Nämä koemenetelmät ovat sinänsä tunnettuja.

C. Suspendoidut pernasolut yhdistetään sopivasta solulinjasta saatuihin hiiren myeloomasoluihin sopivan katalysaattorin avulla. Edullinen suhde on noin viisi pernasolua yhtä myeloomasolua kohti.

Q

Noin 10 splenosyytille sopiva yhdistämiseen käytetyn väliaineen kokonaistilavuus on noin 0,5-1,0 ml. Monet hiiren myeloomasolulinjät ovat tunnettuja ja saatavissa yleensä akateemisista tuktimuslaitoksis-ta tai erilaisista talletuspankeista, esimerkkinä mainittakoon the Salk Institute Cell Distribution Center, La Jolla, Ca. Käytetyn solu-linjan pitäisi edullisesti kuulua ns. lääkeaineille vastustuskykyiseen lajiin, jotta myeloomasolut eivät eläisi selektiivisessä väliaineessa, jossa hybridisolut puolestaan elävät. Yleisimpään lajiin kuuluvat 8-atsaguaniinille vastustusykyiset solulinjat, joista puuttuu hypoksantiiniguaniinifosforibosyyli-transferaasientsyymi, ja täten tämä laji ei kasva HAT-väliaineessa (sisältää hypoksantiinia, amino-pteriiniä ja tymidiiniä). On myös yleensä edullista, että käytetty myeloomasolulinja kuuluisi ns. "ei-erittävään" lajiin, jolloin se ei itse tuota mitään vasta-ainetta, mutta myös vasta-aineita tuottavia lajeja voidaan käyttää. Kuitenkin eräissä tapauksissa vasta-aineita tuottavat myeloomasolulinjät voivat olla edullisia. Edullinen solujen yhdistämiseen käytettävä katalysaattori on polyetyleeniglykoli, jonka keskimääräinen molekyylipaino on 1000-4000 (kaupallisesti saatavissa nimikkeellä PEG 100 jne.), mutta myös muita sinänsä tunnettuja yhdis-tämiskatalysaattoreita voidaan käyttää.

D. Vapaiden pernasolujen, vapaiden myeloomasolujen ja yhdistettyjen solujen seos laimennetaan, ja laimennuksia viljellään erillisillä alustoilla selektiivisessä väliaineessa, jossa vapaat myeloomasolut kuolevat noin yhdessä viikossa. Laimennus voi olla ns. rajattu laimennus, jossa laimennukseen käytetyn nesteen tilavuus on tilastol-

II

75363 lisesti laskettu niin, että pystytään eristämään haluttu määrä soluja kullekin erilliselle alustalle (esim. mikrotitrauslevyn kuhunkin syvennykseen) . Väliaineena käytetään esim. HAT-väliainetta, jossa lääkeaineille (esim. 8-atsaguaniinille) vastustuskykyinen vapaa myeloo-masolulinja ei kasva. Koska vapaat pernasolut eivät ole pahanlaatuisia, niiden lisääntymiskyky on rajattu. Täten tietyn ajan kuluttua (noin yhdessä viikossa) vapaiden pernasolujen lisääntyminen lakkaa. Yhdistetyt solut sen sijaan lisääntyvät jatkuvasti, koska ne ovat toisaalta peräisin myeloomasoluista, jotka on eristetty pahanlaatuisesta kasvaimesta ja toisaalta pernasoluista, jotka pystyvät elämään selektiivisessä väliaineessa.

E. Tarkastetaan, löytyykö eri kasvatusalustojen pintanesteestä, joka sisältää hybridoman, E-rosettipositiivisille puhdistetuille ihmisen T-soluille spesifistä vasta-ainetta.

F. Valitaan (esim. rajaavalla laimennuksella) ja kloonataan hybridomat, jotka tuottavat haluttua vasta-ainetta.

Kun haluttu hybridoma on valittu ja kloonattu, muodostuvaa vasta-ainetta voidaan tuottaa eri tavoin. Puhtainta monoklonaalista vasta-ainetta saadaan viljelemällä haluttua hybridomaa in vitro sopivassa väliaineessa sopivan pituisen ajan, minkä jälkeen haluttu vasta-aine otetaan talteen pintanesteestä. Sopiva väliaine ja viljelyajan pituus ovat tunnettuja tai ne voidaan helposti määrittää. Tämä in vitro-menetelmä tuottaa käytännöllisesti katsoen monospesifistä monoklonaalista vasta-ainetta, joka ei sisällä käytännöllisesti katsoen lainkaan muita ihmisen vastaisia spesifisiä immunoglobuliineja. Muita immunoglobuliineja on mukana pieni määrä, koska väliaine sisältää ksenogeenistä seerumia (esim. vasikan sikiöseerumia). Tällä in vitro-menetelmällä ei kuitenkaan saada tiettyihin tarkoituksiin riittävää vasta-ainemäärää tai riittävän suurta vasta-ainepitoisuutta, koska monokloonisen vasta-aineen pitoisuus on vain noin 50 yug/ml.

Haluttaessa valmistaa paljon suurempia pitoisuuksia hieman epä-puhtaampaa monoklonaalista vasta-ainetta haluttu hybridoma voidaan ruiskuttaa hiiriin, edullisesti syngeenisiin tai semisyngeenisiin hiiriin. Hybridoma aiheuttaa vasta-ainetta tuottavien kasvainten muodostumisen hiiriin sopivan inkubaatioajän kuluttua, mikä johtaa halutun vasta-aineen pitoisuuden kohoamiseen hiiren veressä (noin 5-20 mg/1) ja peritoneaalisessa tulehdusnesteessä (vesivatsa). Vaikka näiden 10 75363 hiirten veressä ja vesivatsassa on myös tavallisia vasta-aineita, näiden pitoisuus on vain noin 5 % monoklonaalisen vasta-aineen pitoisuudesta. Koska sitä paitsi nämä tavalliset vasta-aineet eivät ole ihmisen vastaisia spesifisyydeltään, eristetyistä vesivatsoista ja seerumista saatu monoklonaalinen vasta-aine ei sisällä käytännöllisesti katsoen lainkaan kontaminoivia ihmisen vastaisia immunoglo-buliineja. Tämän monokloonisen vasta-aineen tiitteri on korkea (aktiivinen laimennuksissa 1:50000 ja myös suuremmissa laimennuksissa), ja sen spesifisen ja ei-spesifisen immunoglobuliinin suhde on korkea (noin 1/20). Sellaiset muodostuneetimmunoglobuliinit, joiden rakenteessa on kevyitä K-myeloomaketjuja, ovat ei-spesifisiä, ei-vaikut-tavia peptidejä, jotka pelkästään laimentavat monokloonista vasta-ainetta vaikuttamatta haitallisesti sen spesifisyyteen.

Esimerkki 1

Monoklonaalisten vasta-aineiden valmistus A. Immunisointi ja somaattinen solujen hybridisointi

Naaraspuolisia CAF^-hiiriä (Jackson Laboratories, hiirien ikä n 6-8 viikkoa) immunoitiin intraperitoneaalisesti 2 x 10 E-positiivi-sella puhdistetulla T-solulla 0,2 ml:ssa fosfaatilla puskuroitua suolaliuosta 14 päivän välein. Neljän päivän kuluttua kolmannesta immu-nisointikerrasta hiiristä poistettiin pernat, ja näistä valmistettiin yhtä solulaatua sisältävä suspensio puristamalla kudos ruostumattomasta teräksestä valmistetun seulan lävitse.

Solujen yhdistäminen suoritettiin Kohlerin ja Milsteinen ke-

O

hittamällä menetelmällä. 1 x 10 splenosyyttia yhdistettiin 0,5 ml:ssa yhdistämisväliainetta, joka koostui 35 %:sta polyetyleeniglykolia (PEG 1000) ja 2 %:sta dimetyylisulfoksidia RPMI-1640-väliaineessa n (Gibco, Grand Island, NY), 2 x 10 P3X63Ag8Ul-myeloomasoluun, jotka toimitti tohtori M. Scharff, Albert Einstein College of Medinice, Bronx, NY. Nämä myeloomasolut erittävät IgG^in K-kevyitä ketjuja.

B. Hybridoman valinta ja kasvatus

Kun solut oli yhdistetty, niitä viljeltiin HAT-väliaineessa (sisälsi hypoksantiinia, aminipteriiniä ja tymidiiniä) 37°C:ssa 5 % hiilidioksidia sisältävässä kosteassa atmosfäärissä. Useita viikkoja myöhemmin 40-100 ^il viljelmien hybridomapitoista pintaliuosta siirrettiin alustalle, joka sisälsi 10^ perifeeristä lymfosyyttiä, jotka oli jaettu E-rosettipositiivisiin (E+) ja E-rosettinegatiivisiin

II

75363 (E-)-populaatioihin, nämä oli valmistettu terveiden luovuttajien verestä Mendesin kuvaamalla menetelmällä (J. Immunol. Ill (1973) 860). Näihin soluihin sitoutuneet hiiren hybridoman tuottamat vasta-aineet todettiin radioimmunomäärityksellä ja/tai epäsuoralla immuno-fluoresenssimenetelmällä. Ensimmäisessä menetelmässä solujen annettiin ensin reagoida 100/ul:n kanssa af f initeettikromatograf isesti puhdistettua vuohessa valmistettua 1251 anti-hiiri-IgG-immunoglobulii-nia (10° cpm/yug, 500 yug/^il) . /Jodin liittämisen immunoglobuliiniin ovat yksityiskohtaisesti kuvanneet Kung et ai., J. Biol. Chem. 251 (1976) 23997· Vaihtoehtoisesti viljelmien pintaliuoksilla inkuboidut solut värjättiin fluoresiinilla käsitellyllä vuohessa valmistetulla anti-hiiri-IgG:llä (G/M FITC) (Meloy Laboratories, Springfield, VA, F/p = 2,5) ja fluoresoivat vasta-aineella värjätyt solut analysoitiin sen jälkeen solufluorograafilia FC200/4800A (Ortho Instruments, Westwood, MA) esimerkissä 3 kuvatulla tavalla. Hybridomaviljelmät, jotka sisälsivät spesifisesti E+-lymfosyyttien (T-solujen) kanssa reagoivia vasta-aineita, valittiin ja kloonattiin. Sen jälkeen kloonit siirrettiin intraperitoneaalisesti ruiskuttamalla 1 x 107 tietyn kloonin solua (0,2 ml:n tilavuudessa) CAF^-hiiriin, jotka oli esi-käsitelty 2,6,10,14-tetrametyylipentadekaanilla, jota toimittaa Aldrich Chemical Company kauppanimellä "Pristine". Näiden hiirien pahanlaatuisia vesivatsoja käytettiin sen jälkeen lymfosyyttien ka-rakterisoimiseen esimerkissä 2 esitetyllä tavalla. Hybridivasta-ai-neen OKT4 todettiin standardimenetelmillä kuuluvan IgG2~alaluokkaan ja sitovan komplementin.

Esimerkki 2 OKT4-vasta-aineen reaktiivisuuden karakterisointi A. Lymfosyyttipopulaatioiden eristäminen

Normaalien vapaaehtoisten verenluovuttajien (ikä 15-40 vuotta) verestä erotettiin perifeeriset yksitumaiset verisolut Ficoll-Hypaque-tiheysgradientti-sentrifugointimenetelmällä (Pharmacia Fine Chemicals, Piscataway, NH) Boyuminesittämällä tavalla, Scand. J. Clin. Lab. Invest. 21 (suppl. 97) (1968) 77. Fraktioimattomat yksitumaiset solut erotettiin pinta-Ig+ (B)“ ja pinta-Ig" (T- ja nollasolu)-populaatioiksi käyttämällä Sephadex G-200 anti-F(ab*)2“pylväskromatografiaa menetelmällä, jonka ovat aikaisemmin kuvanneet Ches et ai., J. Immunol.

113 (1974) 1113. T-solut otettiin talteen E-rosetoimalla Ig” -popu- 12 75363 laatio 5 %:lla lampaan punasoluja (Microbiological Associates, Bethesda, MD). Rosetoitu seos sentrifugoitiin Ficoll-Hypaque-sentri-fugissa ja talteenotettu E+-pelletti käsiteltiin 0,115-m NH^Clrlla (10 ml 10® solua kohti). Näin saatu T-solupopulaatio oli 2-%risesti EAC-rosettipositiivinen ja > 95-%risesti E-rosettipositiivinen standardimenetelmillä määritettynä. Lisäksi rosetteja muodostumaton Ig“ (nollasolu)-populaatio erotettiin Ficoll-rajapinnalta. Tämä jälkimmäinen populaatio oli < 5-%:isesti E-positiivinen ja < 2-%:isesti Ig-positiivinen. Pinta-Ig+ (B)-populaatio erotettiin Sephadex-G-200-pylväästä eluoimalla normaalilla ihmisen gammaglobuliinilla, kuten aikaisemmin on kuvattu. Tämä populaatio oli 95-%risesti pinta Ig-positiivinen ja < 5-%risesti E-positiivinen.

Normaalit ihmisen makrofagit erotettiin yksitumaisesta populaatiosta kiinnittämällä ne polystyreeniin. Tällöin yksitumaiset solut suspendoitiin uudelleen lopulliseen viljelyväliaineeseen (RPMI 1640, 2,5 mM HEPES £”( 4- (2-hydroksietyyli)-1-piperatsiinipropaanisulfonihap-po7puskuria, 200 mM L-glutamiinia ja penisilliinistreptomysiiniä sekä 20 % kuumentamalla inaktivoitua ihmisen AB-seerumia) solujen määrän ollessa 2 x 10® solua, ja niitä inkuboitiin muovisissa petrimaljoissa (100 x 20 mm), (Falcon Tissue Culture Dish, Falcon, Exnard, CA) 37°Crssa yön yli. Petrimaljät pestiin huolellisesti kiinnittymättö-mien solujen poistamiseksi, ja muoviin kiinnittynyt populaatio irrotettiin pesemällä voimakkaasti kylmällä 2,5 mM EDTArta sisältävällä liuoksella, jossa ei ollut seerumia, ja silloin tällöin raapimalla petrimaljaa kertakäyttöisen injektioruiskun kumikärjellä. Yli 85 % solukannasta pystyi käyttämään ravinnokseen lateksihiukkasia, ja Wright-Giemsa-värjäyksellä niillä havaittiin morfologisesti olevan monosyyttien tunnusmerkit.

B. Normaali kateenkorva

Normaali ihmisen kateenkorvarauhanen saatiin potilailta, joille oli tehty korjaavia sydänleikkauksia ja joiden ikä vaihteli kahdesta kuukaudesta 14 vuoteen. Kateenkorvarauhanen paloiteltiin, ja palaset asetettiin heti 199(Gibco)-väliaineeseen, jossa oli 5 % vasikan si-kiöseerumia, ne hienonnettiin huolellisesti pihdeillä ja saksilla, ja sen jälkeen muodostettiin yhtä solulajia sisältävä suspensio puristamalla seos terässeulan läpi. Seuraavaksi solut sentrifugoitiin Gicoll-Hypaque-sentrifugissa ja pestiin kohdassa A kuvatulla tavalla.

Il 75363 13 Näin saadut tymosyytit olivat > 95-%:isesti elinkykyisiä ja >90-%:isesti E-rosettipositiviisia.

C. Solulinjat

Neljästä terveestä yksiköstä saatuja Epstein-Barr-viruksella (EBV) transformoituja B-solulinjoja (Laz 007, Laz 156, Laz 256 ja SB) valmistettiin aikaisemmin kuvatulla tavalla ja T-solulinjat CEM, HJD-1 Laz 191 ja HMl, jotka oli saatu leukemiapotilaista, toimitti tohtori H. Lazarus, Sidney Farber Canser Institute, Boston, MA.

D. T-solujen akuutin lymfoblastileukemian (T-ALL) solut ja T-solujen kroonisen lymfaattisen leukemian (T-CLL) solut

Leukemiasolut saatiin kahdeltatoista akuuttia lymfoblastileu- kemiaa sairastavalta potilaalta. Näiden yksilöiden solujen oli aikaisempien kokeiden perusteella todettu olevan T-soluja, koska ne muodostivat spontaanisti rosetteja lampaan punasolujen kanssa (20 % E+) ja koska ne reagoivat T-soluille spesifisten heteroantiseerumien, anti-HTL (anti-B.K.)- ja A99-antiseerumin kanssa, kuten Schlossman et ai. ovat aikaisemmin kuvanneet, Proc. Nat. Acad. Sei. 73 (1976) 1288. Kolmen yksilön kasvainsolut reagoivat aktiivisesti (TH2+) kaniinin ja/tai hevosen anti-TH2:n kanssa, mutta yhdeksän muun yksilön solut eivät näiden kanssa reagoineet. Käytettiin myös kahdesta TH2--T-CLL-leukemiaa sairastavasta potilaasta saatuja leukemiasoluja. Sekä akuutin että kroonisen T-solujen leukemian soluja kylmäsäilytettiin -196°C:ssa nestemäisen typen höyryfaasissa 10-%:isessa dimetyylisulf-oksidissa ja 20-%:isessa ihmisen AB-seerumissa, kunnes ne karakterisoitiin pinnaltaan. Analysoidut kasvainpopulaatiot olivat 90-%risesti blasteja Wright-Giemsa-morfologialtaan kaikissa tapauksissa.

Esimerkki 3

Solufluorograafinen analyysi ja solujen erotus

Kaikkien solupopulaatioiden solufluorograafinen analyysi suoritettiin epäsuoralla immunofluoresenssimenetelmällä, jossa solut värjättiin fluoresiiniin liitetyllä vuohessa valmistetulla anti-hiiri-IgGrllä (G/M FIFC) (Meloy Laboratories), analyysiin käytettiin solu-fluorografia FC200/4800A (Ortho Instruments). Tällöin 1-2 x 10^ solua käsiteltiin 0,15 ml :11a vasta-ainetta OKT4 laimennuksen ollessa 1:1000, soluja inkuboitiin 4°C:ssa 30 minuutin ajan ja pestiin kahdesti. Solujen annettiin sen jälkeen reagoida 0,15 mlrn kanssa G/M FITC (laimennus 1:40) 4°C:ssa 30 minuutin ajan, reaktiotuote sentrifugoi- 14 75363 tiin ja pestiin kolme kertaa. Nämä solut analysoitiin sen jälkeen solufluorograafilla, jossa kunkin solun aiheuttama fluoresenssi-intensiteetti rekisteröitiin pulssikorkeusanalysaattorilla. Reaktiivisuus oli samanlainen laimennuksella 1:50000, mutta suuremmilla laimennuksilla reaktiota ei tapahtunut. Taustavärjäyksen intensiteetti määritettiin 0,15 ml:11a suhteessa 1:1000 laimennettua vesivatsanes-tettä, joka oli saatu intraperitoneaalisesti ei-tuottavalla hybridi-kloonilla immunisoidusta Balb/cJ-hiirestä.

Kokeissa, joiden tarkoituksena oli erottaa OKT4+- ja OKT4”-solut toisistaan, 100 x 10** fraktioimatonta yksitumaista solua tai tymosyyt-tiä merkittiin 4 ml:11a suhteessa 1:1000 laimennettua vasta-ainetta 0KT4 ja kehitettiin G/M FIFC:llä. Samanlaista värjäysmenetelmää käytettiin ihmisen T-solujen preparoinnissa, jotka oli eristetty esimerkissä 2A kuvatulla tavalla. Käyttämällä fluoresenssiaktivointiin perustuvaa solulajittelijaa (FACS-1) (Becton-Dickinson, Mountain View, CA) lymfosyytit erotettiin OKT4+- ja OKT4”-populaatioksi ja/tai T-solut fraktioitiin heikosti reagoiviksi OKTl+-T-soluiksi (fluoresenssi alle 20 %) ja voimakkaasti reagoiviksi OKTl~-T-soluiksi (fluoresenssi yli 20 %). Lajien elinkykyisyys oli >95 % Trypan-sinisellä määritettynä kaikissa tapauksissa. Kaikkien erotettujen populaatioiden puhtausaste oli £ 95 %.

Esimerkki 4 FACS:lla fraktioitujen OKT4+- ja OKT4--jakeiden analysoimalla hevosen anti-Tt^lla OKT4+- ja 0KT4“-solut erotettiin toisistaan FACS:lla, ja niitä viljeltiin väliaineessa RPMI 1640 (Grand Island Biological Company), joka sisälsi 20 % ihmisen AB-seerumia, 1 % penisilliinistreptomysii-niä, 200 mM L-glutamiinia, 25 mM HEPES-puskuria (Microbiological Associates) ja 0,5 % natriumbikarbonaattia, solujen pitoisuus viljelmässä oli 2 x 10** solua/ml. 24 tunnin kuluttua 1-2 x 10® solua kustakin populaatiosta saatettiin reagoimaan hevosen anti-TH2:n kanssa 37°C:ssa kosteassa atmosfäärissä, jonka hiilidioksidipitoisuus oli 5 %, ja solut värjättiin fluoresiiniin liitetyllä kaniinissa valmistetulla anti-hevonen-IgG:llä (Cappel Laboratories, Downington, PA) Reinherzin ja Schlossmanin kuvaamalla menetelmällä, J. Immunol. 122 (1979) 1335-1341. Taustavärjäys suoritettiin korvaamalla spesifinen vasta-aine normaalilla hevosen IgG:llä, joka käsiteltiin edellä kuvatulla tavalla.

Il 15

Esimerkki 5 7 5 3 6 3

Solujen toiminnan tutkiminen A. Proliferatiiviset tutkimukset

Fraktioimattomien ja FACS:illa fraktioitujen lymfasolujen jakaantuma sky ky ä tutkittiin mikroviljelmässä optimaalisilla ja sub-optimaalisilla annoksilla Concanavalin A: ta (Con A) (Calbiochem, La Jolla, CA) ja fytohemaglutiinia (PHA) (Burroughs-Wellscome Company, Greenville, NC). Alloantigeeninen proliferatiivinen vaste määritettiin samanaikaisesti näille samoille populaatioille käyttäen stimu-laattina mitomysiini c:llä käsiteltyä Laz 156:a, EBVrllä transformoitua ihmisen B-lymfablastoidisolulinjaa. Proliferaatio tetanustok-soidin läsnäollessa (Massachusetts Department of Public Health Biological Laboratories, Boston, MA) testattiin käyttämällä loppukon-sentraatiota 10 yug/ml. Hepes-Zoster-antigeenin toimitti ystävällisesti tohtori John Zaia (Harvard Medical School, Boston, MA), ja sitä käytettiin laimennuksena 1:6. 5 % edellä kuvatulla menetelmällä saatuja makrofageja lisättiin kaikkiin populaatioihin aloitettaessa kasvattaa in vitro-viljelmiä. Mitogeenilla stimuloituja viljelmiä käsi- *3 teltiin neljän päivän kuluttua 0,2 yuCi:lla JH-tymidiinia (3H-TdR) (ominaisaktiivisuus 1,9 Ci/mM) (Schwarts-Mann Division of Becton-Dickinson, Orangeburg, NY) ja tuotteet erotettiin 18 tunnin kuluttua MASH II-laitteistolla (Microbiological Associates, Bethesda, MD), ^h-tymidiiniyhdisteen aktiivisuus mitattiin Packard-tuikelaskurilla (Packard Instrument Company, Downer's Grove, IL). Taustan ^H-tymidii-niyhdisteen aktiivisuus mitattiin korvaamalla mitogeeni väliaineella. Liukoisella antigeenillä ja alloantigeenilla stimuloidut viljelmät käsiteltiin viiden päivän kuluttua 3H-tymidiinillä 18 tunnin ajan, tuotteet erotettiin, ja aktiivisuus mitattiin edellä kuvatulla tavalla.

B. Solumyrkyllisyyttä koskevat tutkimukset

Soluvälitteiselle lymfolyysille herkistetyt viljelyt suoritettiin lisäämällä mikrotitrauslevyn syvennyksiin fraktioimattomia T-soluja, FACS:illa fraktoituja OKT4+- ja OKT4--T-solujakeita tai uudelleen yhdistettyjä OKT4+- ja OKT4“-T-soluja eri suhteissa sekä mito-mysiinillä käsiteltyjä stimulaattorisoluja eri solulajien pitoisuuden ollessa 2 x 10® solua/ml. Viiden päivän kuluttua ei-elinkykyiset solut poistettiin Ficoll-Hypaque-sentrifugoinnilla. Fraktioimattomat ja C 1 fraktioidut T-solupopulaatiot lisättiin sitten Na2 Cr04:llä merkit- 16 75363 tyihin kohdesoluihin, ja soluja inkuboitiin kuuden tunnin ajan, minkä jälkeen vapautunut kromi määritettiin. Muissa kokeissa fraktioimat-tomat T-solut herkistettiin mitomysiinillä käsitellyillä stimulaat-torisoluilla edellä kuvatulla tavalla, ja soluja inkuboitiin viisi päivää MLC:ssä, minkä jälkeen ne fraktioitiin FACS:llä 0KT4+- ja 0KT4--jakeiksi ja vapautunut kromi määritettiin. Solumyrkyllisyys prosentteina laskettiin seuraavan kaavan avulla: kokeessa vapautunut ^*Cr - spontaanisti vapautunut ^Cr_ kylmäkäsittelyssä vapautunut ^Cr - spontaanisti vapautunut ~^cr x 100 Määritykset suoritettiin kolmesta rinnakkaisnäytteestä, ja tulokset ilmoitettiin näiden keskiarvona. Spontaanisti vapautunut ^*-Cr:n määrä oli kaikissa tapauksissa vähemmän kuin 20 % suurimmasta kokeissa havaitusta vapautuneen kromin määrästä.

Kuviossa 1 on esitetty solufluorograafista saatu fluoresenssi-spektri ihmisen normaaleille perifeerisille T-soluille, joiden on annettu reagoida OKT4:n (laimennus 1:1000) ja G/M FITC:n kanssa.

Vertailun vuoksi kuvioissa 1-5 on esitetty samanlaisissa olosuhteissa monoklonaalisille vasta-aineille OKT1 ja OKT3 saadut tulokset .

Kuviossa 2 on esitetty solufluorograafista saatu fluoresenssi-spektri ihmisen tymosyyteille, joiden on annettu reagoida OKT4:n ja G/M FITC:n kanssa.

Kuviossa 3 on esitetty solufluorograafista saatu fluoresenssi-spektri B-solujen kroonista lymfoblastileukemiaa sairastavista potilaista saaduille leukemiasoluille, joiden on annettu reagoida OKT4:n ja G/M FITC:n kanssa.

Kuviossa 4 on esitetty solufluorograafista saatu fluoresenssi-spektri ihmisen T-solulinjalle HJD-1, jonka on annettu reagoida 0KT4:n ja G/M FITC:n kanssa.

Kuviossa 5 on esitetty solufluorograafista saatu fluoresenssi-spektri ihmisen T-solulinjalle CEM, jonka on annettu reagoida 0KT4:n ja G/M FITC:n kanssa.

Kuviossa 6 on esitetty tulokset, jotka on saatu annettaessa T-solupopulaatioiden reagoida hevosen anti-TI^-seerumin kanssa.

Kuviosta 7 ilmenee fraktioimattomien T-solujen ja fraktioitujen T-solujakeiden teho solumyrkkynä. Koordinaattia kuvaa solujen prosenttista spesifistä hajoamista ja abskissa efektori/kohde (EIT)-suhdetta.

Il 75363 17

Hybridoma ja sen tuottama monoklonaalinen vasta-aine valmistettiin ja karakterisoitiin edellä esitettyjen esimerkkien mukaan. Vaikka suuri määrä kyseistä vasta-ainetta valmistettiin ruiskuttamalla kyseistä hybridomaa intraperitoneaalisesti hiiriin ja erottamalla eläimistä pahanlaatuiset vesivatsat, on selvästi mahdollista, että hybridomaa voidaan viljellä myös alalla hyvin tunnetuilla in vitro-menetelmillä, jolloin vasta-aine eristetään viljelmien pintanesteestä.

Kuten kuviosta 1 ilmenee, noin 45 % normaalin ihmisen perifeerisistä T-vesisoluista reagoi 0KT4:n kanssa, mutta samasta yksilöstä eristetyt B-solut, nollasolut ja makrofagit eivät reagoi lainkaan OKT4:n kanssa. Samanlaiset tulokset saatiin viidestätoista muusta normaalista ihmisestä eristetyille lymfosyyttipopulaatioille. Mono-klonaaliselle vasta-aineelle on siten tunnusomaista, että se reagoi antigeenin kanssa, joka on löydetty 55 %:lta ihmisen terveitä perifeerisiä T-soluja, mutta se ei reagoi kolmen muun mainitun solutyypin minkään pinta-antigeenin kanssa. Kuten myöhemmin mainitaan, 0KT4-po-sitiivinen osa ihmisen perifeerisistä T-soluista kuuluu auttaja-T-soluihin. Tätä reaktiivisuuseroa voidaan käyttää kyseisen vasta-aineen 0KT4 toteamiseen ja erottamaan se muista vasta-aineista.

Kuviosta 2 ilmenee, että noin 80 % kuuden kuukauden ikäisen lapsen normaaleista tymosyyteistä reagoi 0KT4:n kanssa. Samanlaisia tuloksia (80 % aktiivisuus) saatiin käytettäessä kuutta muuta kateen-korvanäytettä, jotka oli saatu normaaleista ihmisistä, joiden ikä vaihteli kahdesta kuukaudesta 19 vuoteen. Kuvion 2 reaktiivisuuskaa-van avulla on myös mahdollista todeta kyseinen vasta-aine OKT4 ja erottaa se muista vasta-aineista.

Kuviosta 3 ilmenee, että B-solujen kroonista lymfoblastileuke-miaa sairastavien potilaiden leukemiasolut eivät reagoi käsillä olevan vasta-aineen kanssa.

Esillä olevaa vasta-ainetta OKT4 voidaan edelleen karakterisoida sen perusteella, miten se reagoi erilaisten ihmisen T-solulinjojen kanssa, tätä on havainnollistettu kuvioissa 4 ja 5. Kuviosta nähdään, että kyseisen antigeenin reaktiivisuus ihmisen T-solulinjojen kanssa vaihteli, solulinja CEM kanssa reaktio oli voimakas, mutta solulinjan HJD-1 kanssa reaktiota ei tapahtunut lainkaan. OKT4 ei reagoinut myöskään solulinjojen Laz 191 ja HM1 kanssa. Tämän erilaisen reaktiivisuuden avulla on myös mahdollista karatkerisoida OKT4.

18 75363

Kuviossa 6 on esitetty, miten 0KT4:llä fraktioidut jakeet reagoivat anti-TH2:n kanssa. Noin 25 % fraktioimattomasta T-solupopulaa-tiosta reagoi anti-TI^sn kanssa. Sitä vastoin 0KT4+-populaatio ei sisällä lainkaan anti-TH2:n kanssa reagoivia soluja, kun taas suurin osa 0KT4“-populaatiosta on Tl^-positiivinen ja kaikki fraktioimatto-man T-solupopulaation TH2+-solut kuuluvat OKT--populaatioon. Tämä osoitti, että 0KT4+-jakeeseen ei kuulu TH2+-soluja eikä TH2+-jakeeseen 0KT4+-solua ja nämä jakeet ovat siten täysin erillisiä.

Kuviossa 7 on esitetty fraktioimattomien T-solujen, 0KT4+-T-solujen ja 0KT4~-T-solujen teho solumyrkkyinä. 0KT4+-populaatio toimii hyvin vähäisessä määrin solumyrkkynä, kun taas 0KT4~-populaation soluja tuhoava vaikutus on suurempi kuin fraktiomattoman T-solupopulaation. Kuvioissa 6 ja 7 esitettyjen 0KT4+- ja 0KT4“-solupopulaatioi-den erilaisten reaktiivisuuksien avulla on myös mahdollista karakterisoida käsillä oleva vasta-aine.

Kuvioiden 1-5 esittämät tulokset on koottu taulukkoon 1, jossa on myös muutamia lisätietoja. Taulukossa on verrattu 0KT1-, 0KT3- ja 0KT4-hybridomien tuottamia monoklonaalisia vasta-aineita (näistä viimeinen on kuvattu esillä olevassa hakemuksessa). Kuvioissa 1-5 esitettyjen tulosten lisäksi taulukosta I havaitaan myös, että 0KT4 ei reagoi ihmisen normaalien perifeeristen T-solujen, nollasolujen eikä makrofagien kanssa eikä myöskään T-solujen ja nollasolujen akuuttia lymfoblastileukemiaa sairastavien potilaiden leukemiasolujen eikä EBV:llä transformoitujen B-solulinjojen kanssa. Päinvastoin kuin 0KT1, 0KT4 ei reagoi T-solujen kroonista lymfoblastileukemiaa sairastavien potilaiden leukemiasolujen kanssa.

Solujen toimintaa koskevat tutkimukset suoritettiin imusolupo-pulaatioilla, jotka oli fraktioitu fluoresenssiaktivointiin perustuvalla solulajittelijalla (FACS). Näiden tutkimusten tulokset on esitetty taulukoissa II, III ja IV, ja tulokset tukevat edelleen käsillä olevan monoklonaalisen vasta-aineen edellä esitettyjä karakterisoin-tituloksia.

Näissä tutkimuksissa fraktioimaton T-solupopulaatio käsiteltiin 0KT4:llä (laimennus 1:1000) ja G/M FITCrllä ja fraktioitiin FACS:illa OKT4+- ja OKT4--jakeiksi. Näihin fraktioituihin populaatioihin lisättiin 5 % makrofageja (populaatioiden puhtausaste, joka oli yhtä suuri tai suurempi kuin 95 %, otettiin huomioon) ennen in vitro-viljelyä.

19 7 5 3 6 3

Fraktioimattomaan T-solupopulaatioon ja eristettyihin 0KT4+- ja 0KT4“-alajakeisiin lisättiin stimulaattoriksi PHA:ta, Con A:ta, liukoisia antigeenejä ja alloantigeenejä populaatioiden proliferatii-visten vasteiden määrittämiseksi in vitro-olosuhteissa.

Fraktioimattomien T-solupopulaatioiden proliferatiivinen vaste PHA:n ja Con A:n läsnäollessa ilmenee taulukosta II. Fraktioimatto-man T-solupopulaation proliferatiivinen vaste on maksimaalinen käytettäessä 1 yug PHA:ta 106 solua kohti, käytettäessä 0,5 yug tai 0,1 yug PHA:ta 10^ solua kohti vaste pieneni. Käsiteltäessä fraktioimattomia T-soluja OKT4:llä ja vuohi-hiiri-FITC:llä proliferatiivinen vaste pysyi samana. Eristetyt OKT4+- ja OKT4~-T-alajakeet käyttäytyivät sen sijaan PHA:n läsnäollessa eri tavalla. OKT4+-solupopulaatio käyttäytyi kaikilla käytetyillä PHA:n annoksilla samalla tavalla kuin fraktioimaton T-solupopulaatio. OKT4”-solujen proliferatiivinen vaste oli sen sijaan huomattavasti pienempi kaikilla tutkituilla PHA:n annoksilla. Lisäksi havaittiin, että PHA:n annoksen ollessa 0,1 μq ΙΟ** solua kohti OKT4“-T-solut eivät lisääntyneet lainkaan, kun taas OKT4+-T-solujae ja fraktioimattomat solut vielä lisääntyivät. Toisaalta näiden jakeiden proliferatiivinen vaste Con A:n läsnäollessa oli samanlainen, joten tällöin näitä kahta solujaetta ei pystytty erottamaan toisistaan tai fraktioimattomasta T-solupopulaatiosta.

Seuraavaksi tutkittiin proliferatiivista vastetta alloantigee-nin läsnäollessa MLC:ssä sekä liukoisten antigeenien läsnäollessa. Taulukosta III ilmenee, että Laz 156:n läsnäollessa MLC:ssä fraktioi-mattoman T-solupopulaation, OKT4:llä ja G/M FITC:llä käsitellyn frak-tioimattoman T-solupopulaation ja sekä OKT4+- että OKT4”-T-soluala-jakeiden vaste oli samanlainen. On kuitenkin huomattava, että tutki- _ “3 tuista kuudesta yksilöstä kahden OKT4 -solut sitoivat vähemmän H-TdR-yhdistettä kuin vastaava OKT4+-jae (tuloksia ei ole esitetty), vaikka ne lisääntyvät runsaasti MLC:ssä. Nämä kaksi solujaetta erosivat kuitenkin selvemmin toisistaan tutkittaessa niiden proliferatiivista vastetta liukoisten antigeenien läsnäollessa. Kaikissa tutkituissa tapauksissa OKT+-T-solujae lisääntyi runsaasti liukoisten antigeenien, tetanus-toksoidin ja Herpes-Zosterin läsnäollessa, kun taas OKT-- T-solujae ei lisääntynyt käytännöllisesti katsoen lainkaan.

Taulukosta IV ilmenee, että OKT4“-T-solujae ei aiheuta juuri lainkaan solujen hajoamista, kun se herkistetään sellaisenaan MLC:ssä.

20 75363

Vaikka OKT4“-T-soluista tuli tällöin solumyrkkyjä/efektoreita frak-tiomattomassa alloherkistetyssä T-solupopulaatiossa, ne eivät sellaisenaan pystyneet toimimaan välittäjänä CML:ssä. Kun 0KT4+-popu-laatio herkistettiin MLC:ssä ilman OKT4”-T-soluja, ne aiheuttivat kohtalaista, mutta kuitenkin huomattavaa solujen hajoamista MLC:ssä. 0KT4+- ja 0KT4~-T-solujen uudelleen yhdistetty seos sen sijaan aiheutti kaikkein eniten solujen hajoamista, kuten myös fraktioimaton T-solupopulaatio. Nämä havainnot osoittavat, että OKT4“-alajae ei sellaisenaan toimi tehokkaimmalla mahdollisella tavalla solumyrkkynä, vaan tähän vaaditaan myös OKT4+-populaatiota. Tämä T-T-vuorovaikutus on analoginen sen T-T-vuorovaikutuksen kanssa, jota esiintyy TH2~-T-solujakeen ja TH2+-T-solujakeen välillä näiden toimiessa tehokkaimmalla mahdollisella tavalla solumyrkkynä.

Kyseisen vasta-aineen OKT4 havaittiin kuuluvan IgG2~alaluokkaan, joka on yksi hiiren IgG:n neljästä alaluokasta. Nämä immunogolbuliini G:n alaluokat eroavat toisistaan ns. "kiinteiltä" alueiltaan, vaikkakin tietylle antigeenille spesifisen vasta-aineen rakenteessa on ns. "vaihtuva" alue, joka on toiminnallisesti samanlainen riippumatta siitä, mihin immunoglobuliini G:n alaluokkaan se kuuluu. Toisin sanoen monoklonaalinen vasta-aine, jolla on edellä kuvatut tunnusmerkit voi kuulua alaluokkiin IgGj, IgG2&» IgG2b tai IgG^ tai luokkiin IgM tai IgA tai muihin Ig-luokkiin. Näiden luokkien tai alaluokkien erot eivät vaikuta vasta-aineen reaktiivisuuden selektiivisyyteen, mutta ne voivat vaikuttaa siihen, miten vasta-aine reagoi myöhemmin muiden aineiden, esimerkiksi komplementin tai anti-hiiri-vasta-aineiden kanssa .

Jos perifeeristen T-solujen kokonaispopulaatiosta vähemmän kuin 55 % reagoi OKT4:n kanssa, auttaja-T-soluja esiintyy ylimäärin tai niistä on puutetta. Tätä koetta voidaan käyttää myös yleisesti autta-ja-T-solujen puutteen tai ylimäärän toteamiseen. Auttaja-T-solusyöpää voidaan hoitaa antamalla potilaalle terapeuttisesti vaikuttava määrä 0KT4-vasta-ainetta. Käytettäessä sopivaa määrää OKT4-vasta-ainetta se reagoi selektiivisesti auttaja-T-solujen antigeenin kanssa, jolloin auttaja-T-solujen ylimäärä saadaan vähenemään ja auttaja-T-soluista aiheutuva pahanlaatuinen tautitila paranemaan. Myös auttaja-T-solujen ylimäärästä aiheutuvia autoimmuunisia sairauksia voidaan hoitaa anta- tl 21 75363 maila potilaalle terapeuttisesti vaikuttava määrä 0KT4-vasta-ainetta. Vasta-ainetta 0KT4 voidaan sisällyttää terapeuttisiin koostumuksiin, jotka sisältävät terapeuttisesti vaikuttavia määriä 0KT4-vasta-ainet-ta sekoitettuna farmaseuttisesti hyväksyttäviin kantaja-aineisiin.

22 7 5 3 6 3

Taulukko I

Monoklonaalisten vasta-aineiden reaktiivisuus ja ominaisuudet

Reaktiivisuus prosentteina 0KT1 0KT3 0KT4 seuraavien solutyyppien kanssa:

Perifeeriset T-solut (10 näytettä) 95 % 95 % 55 %

Perifeeriset B-solut (10 näytettä) 2 % 2 % 2 %

Perifeeriset nollasolut (10 näytettä) 2 % 2 % 2 %

Tymosyytit 1 (8 näytettä) 5-10 % 5-10 % 80 %

Reaktiivisuus seuraavien solujen ja solulinjojen kanssa: T-solujen krooninen lymfaattinen leukemia (3 tapausta) + +(l);-(2) - T-solujen akuutti lymfaattinen leukemia (8 tapausta) - - -

Nollasolujen akuutti lymfaattinen leukemia (15 tapausta) - - - B-solujen krooninen lymfaattinen leukemia (6 tapausta) +(4);-(2) - - B-solulinjat+ (4) - - - T-solulinjat+ HJD-1 + (+) CEM + +

Laz 191 + - - MH1 + - -

IgG-alaluokka IgG^ XgG2 I9G2

Komplementin sitomiskyky - + +

II

Saatu potilailta, joiden ikä vaihteli 2 kuukaudesta 18 vuoteen. +Saatu tohtori H. Lazarukselta, Sidney Farber Cancer Center.

B-solulinjät Laz 256, 156, 007 ja SB saatu transformoimalla Epstein-Barr-viruksella ihmisen perifeeristä B-soluja, ja T-solulinjät HJD-1, CEM, Laz 191 ja HM1 saatu leukemiaa sairastuvista potilaista.

23 75 36 3 o (N -h 'S' £ 2 ~ in m ι-n -P 00 TT r-( r- ^ O VO «5 O ™ f ♦ . +i - +' +' +l +l C V ^ m ot £ £ £ £

rt 1 -T 00 r~ S ^ S

2 I 5 - S S “ 0 ^

•H

-p « -p m ^ r~ 2 £ 2 “ P d rr O r" ^2, lp rH O VO VO IJD o « s ^

rH | rH

EH ,, il Xl -M

0) I +1 +t +1 +l +l 1 +fi;sä£ s s s £ iO fjtjiXifNcr» ino^ s ° g s - SK? W rH 1-1 rt > :rt fÖ rH -—* 3 «d tn 00 2 ^ ^ rt -H rH ΓΗ CN S “ ® M tn UO vo vo vn fNr- H ·Η EH W __ in ΓΗ-* H I »n <N ^ O -P Cu En ^ rt il 4-1 +1 + ' X rt g -P +1+1+1 rt C \ Cp nn n r~ r-

l-HO Ο Η ° 2 2 ΙΠ m rH LO

rt rH rH 00 ™ £ 2 lO m rt4<i H-rt r- +r n 1-1 E+ O -P ΓΗ(Ν<Ν a * -h <^2 2 ^ in O ti) En tn σ> rH 2 g -P « :rt tn O ^ rt rt - •n > a r- rH 00 r. in ΓΗ «g s s S ® s s

Ti c mm 2 O 0) rt rt + +. +. +' +l +l +l

En O -P ,n 0 ιο m m

-P rt StNt-MO

β·ΗΗ ίηΟ<Ν m Γ' vo

0) g O CJ0 o CN

•rl tn __ m o o g c I 22 £ o un O rt H σ> rH _|

-P 'Ö -P -H

rt rt i \ \ § ·* O en cr ^ ^ •H rt -h 2-n \ \ 5. ei en P rt

O-m+j-H o \ 2i ~ a rt C

•HiJrt-P |rt o rt un —, ~ > <u -P <-i rt -P 1:1 rt ^Srtrtort rt .* o pc 2 ,n rt , 3 ^-PnHdmdrtc

rt tn (1) to -1 d rH . .(θ'— Ή ·~-τ r—I C -H

P I UH H J r-, · rH ' 0 rt O O -H rt h h 3 "" rt ~ O 2 tn rftn < tn < tn rt d

rHE^dW HH

O Ή r-4 CVO QO CVO rH -H

P -P <0 <2. 5 o oo oo 0 o :rt rt ftt0 g“ £2 £2 uh uh uh >-p 75363 24 co cn cn n n n m co

ΓΗ VO ΓΗ —H O CN CN

CN '—) l"~

-P

3 in ^

rH

O +1 +1 -*' 4l 41 +1 +l *)

C W

m I r" vo oo vo n id cn -h H Eh CO —H CD O co O id cn

Cg I o in >-h •-π ίγμγ-ι

0) OJ I

•m (n 3 tn Eh cr> cd +J -H « π

•H 4J O

° c

+)5 Jj ID 00 CD O I-H H O I—I

^cj 3 rn^ro<-H iDr-no^r 3,_l rH n n vo rncrico ΰΠ3 S TTOJC ^ i0 ' ^ r-( 1—1 I +1 -M +1 -H -11 +' 41 41 rH rH 4- φϊΠ rr ,-n o in o in cn -h co 0.¾ Eh id vo oo cn rH γη in σ\

C(- o O r* CN VD CN Cc CN

(0 $ ° nenin f" £

I Si, r- H in σ> Ή CN

<0 -H -4 4J 4j :<0

W r* rH

£ * ^ -¾ H * jjj £ S e -s· m in £ £ £ £ H -Hm HI nrHOcn

0).,-1 PhEh cd (N n rHVDO

O -H S4J Γ- en H· <N VD rH Ή M rt .3 OH M *' 4' 4' 4, 4, *, 4, 4, 2 2 cH -t-m ΊΙΟ r~ -r o Jh cn r- σν 3 O m +^jf:Srrnco^ ω w CO 00 3 ° ϋ ^^%οο^Γ~Ηω n in co cn

H oS ^-(0 q cn ^ ° 5 CO 00 <N

a £ o3 S ^ ^ «VD-Hni

0 — H

e c

3 C

ή -h e> \D rH oo in voenr-m m-rj VO I"· O <N VDnr-H·

£ cn CN CN T o ID

^ (0 VO en n rH n Ο 4-1 +1 +1 4| 41 J-l +1 +1 •H +J tj· vd cn vo inncnr-

HH _H ο Η1 Ή VD VDiniNVD

β o ^ n O n< -H (N CO vo rH

.2 04 “ O CO r- r-vocn

g C H in-nnr vo-ccN

0 (1) H

4J Ό Λ -H H

+) H g τι τι

<ΰ <L) rn I *H *H

§•*30 0 u O U

•η Φ rH -H 3 V “ 01

5 e* H 4-> -H 4J ' 4J

τί ^ o (0 4-· ° m 2W

V :3 3 4J Vo V°oi r^OciHt: e'eo^, e 1 n £ 23“ φ<0 voE in i 2 cd m i ^

P ·:3 4H rH indtn^ in 3 W

f4 H h 3 Scal'd -HCD^ HE « a * 3 a 0-H njJIh'H N J-> U □ n -P miuailj 3 <u e> £ o<in jEh3C’^ jE-iac> 25 7 5 3 6 3

Tl I °1 'T. S. up in rH omM'vD {5

^ SS

(N ·Η d Ai » 3 ,_i en m ^4 44 Ϊ O m m o co h Tl 00 S « w M « e

UI d -H

dj ui d +J :d

01 +* -H

O Ρ P

Ό >i d 0 ^ 3 1 .. I m -h 7s “ B in ·—i ^ 4_> :n3 e h p

Q) -H P

Ό D >Ί δ * 1 -s 01 .4. d (0 •H ^ .. o m o 00 d S is - - ~ -* o. -h u Q i ί>Ί · d e to oi d -h i—I (0 Di 0 O) -n

> 01 Ό -H

H P (0 rH

C3 01 O

O Q) UI 01

^ III I -H -H «H

44 -H Eh UI P

d H \ A! P Ή rH d w d d d to d oi rt d ε d ui oi

H -rl d 0 UI

01 -P P Q) λ; DO)

(0 d ui P

ε oi -h ^ 01 ε 3 P :d -H d ui 0) rH ,*0 UI rH -H -n >1

44 .. d d P

d — Ai p p p u 0) d eh + <#> d · p

Ai h + ai d ui

rl * (p -P O -r-> 01 -H

d pp d <n d w Ό

> ddS rH · rH -H P

O rH rH \ O d d O O >1

p OOO ui -HrHOl-H

0 :<0 03 UI I d rH I P

doi 11+ Eh Ai-HEndi > ui EH EH I 0) d 1 ·· I ·Η P d rH Eh

El P P P En P *3· D P 0) d « iS dd«dPEn 8D-hdo ehu ε ε o ή d « ωωεο OO'-'OrHO d I :0 D d 03 PP UlO QIEhP -n rH>, p p 1 uid -H\Pd rH +1 o ddPEn I -n DW:dui + .. P-H ggrHIEH E I» ^

ε O p -H -H 01 I I · d :d -H EH

lOPd OOPI ++ 0SrH+Jd« mold ·η ·η ·η "+ h* ττ . rH 01 +> o ιΗΉΉ P P 01 Eh Eh Eh CO ·Η -H -h

Aid Ai Ai :d * * Ai Ai Ai II

r- p D ddAiOOO Il -h p P

d o) o p p dO)d + ►D P D h h +AJKP +

Claims (2)

75363 26

1. Menetelmä monoklonaalisen vasta-aineen valmistamiseksi, joka vasta-aine a) reagoi käytännöllisesti katsoen kaikkien ihmisen normaalien perifeeristen auttaja-T-solujen kanssa, joita on noin 55 % kaikista ihmisen normaaleista perifeerisistä T-soluista, mutta ei reagoi ihmisen normaalien perifeeristen B-solujen, nollasolujen eikä makrofagien kanssa, b) reagoi noin 80 %:n kanssa ihmisen normaaleja tymosyyt- te jä, c) ei reagoi T-solujen kroonista lymfoblastileukemiaa, B-solujen kroonista lymfoblastileukemiaa, T-solujen akuuttia lymfoblastileukemiaa tai nollasolujen akuuttia lymfoblastileukemiaa sairastavien ihmisten leukemiasolujen kanssa, d) reagoi ihmisen T-solulinjan CEM kanssa, mutta ei reagoi ihmisen T-solulinjojen HJD-1, Laz 191 eikä HMl kanssa, e) ei reagoi Epstein-Barr-viruksella transformoitujen ihmisen B-solulinjojen Laz 007, Laz 156, Laz 256 eikä SB kanssa, f) reagoi noin 55 %:n kanssa Rhesus-apinan perifeerisiä T-soluja, g) sitoo komplementin, ja h) määrittelee T-solupopulaation (OKT4+), joka ei reagoi anti-TI^-seerumin kanssa ja jonka solumyrkyllisyys on erittäin vähäinen, tunnettu siitä, että menetelmään kuuluu seuraavat vaiheet: A) valmistetaan hybridooma ATCC CRL 8002 i) immunisoimalla hiiriä puhdistetuilla E-rosettipositii-visilla ihmisen T-soluilla, ii) poistamalla pernat immunisoiduista hiiristä ja valmistamalla pernasolususpensio, iii) yhdistämällä mainitut pernasolut hiiren myeloomaso-luihin yhdistämiskatalysaattorin läsnäollessa, iv) laimentamalla ja viljelemällä yhdistettyjä soluja erillisissä syvennyksissä väliaineessa, jossa vapaat myeloomasolut eivät kasva, v) arvioimalla eri syvennysten hybridoomapitoinen pintanes--te sen suhteen, sisältääkö se E-rosettipositiivisille puhdistetuille T-soluille spesifisiä vasta-aineita, 11 27 75 36 3 vi) valikoimalla ja kloonaamalla hybridcoma ATCC CRL 8002, joka tuottaa vasta-ainetta, joka reagoi käytännöllisesti katsoen kaikkien ihmisen normaalien perifeeristen auttaja-T-solujen kanssa, mutta ei ihmisen normaalien perifeeristen B-solujen, nollaso-lujen eikä makrofagien kanssa, ja B) valmistetaan monoklonaalinen vasta-aine vii) viljelemällä hybridomaa ATCC CRL 8002 sopivassa väliaineessa, ja viii) ottamalla vasta-aine talteen mainitun hybridooman pin-tanesteestä.

2. Menetelmä monoklonaalisen vasta-aineen valmistamiseksi, joka vasta-aine a) reagoi käytännöllisesti katsoen kaikkien ihmisen normaalien perifeeristen auttaja-T-solujen kanssa, joita on noin 55 % kaikista ihmisen normaaleista perifeerisistä T-soluista, mutta ei reagoi ihmisen normaalien perifeeristen B-solujen, nollasolujen eikä makrofagien kanssa, b) reagoi noin 80 %:n kanssa ihmisen normaaleja tymosyyt- tejä, c) ei reagoi T-solujen kroonista lymfoblastileukemiaa, B-solujen kroonista lymfoblastileukemiaa, T-solujen akuuttia lymfoblastileukemiaa tai nollasolujen akuuttia lymfoblastileukemiaa sairastavien ihmisten leukemiasolujen kanssa, d) reagoi ihmisen T-solulinjan CEM kanssa, mutta ei reagoi ihmisen T-solulinjojen HJD-1, Laz 191 eikä HM1 kanssa, e) ei reagoi Epstein-Barr-viruksella transformoitujen ihmisen B-solulinjojen Laz 007, Laz 156, Laz 256 eikä SB kanssa, f) reagoi noin 55 %:n kanssa Rhesus-apinan perifeerisiä T-soluja, g) sitoo komplementin, ja h) määrittelee T-solupopulaation (0KT4+), joka ei reagoi anti-TI^-seerumin kanssa ja jonka solumyrkyllisyys on erittäin vähäinen, tunnettu siitä, että menetelmään kuuluu seuraavat vaiheet: A) valmistetaan hybridooma ATCC CRL 8002 i) immunisoimalla hiiriä puhdistetuilla E-rosettipositii-visilla ihmisen T-soluilla, ii) poistamalla pernat immunisoiduista hiiristä ja valmistamalla pernasolususpensio, 28 7 5 3 6 3 iii) yhdistämällä mainitut pernasolut hiiren myeloomaso-luihin yhdistämiskatalysaattorin läsnäollessa, iv) laimentamalla ja viljelemällä yhdistettyjä soluja erillisissä syvennyksissä väliaineessa, jossa vapaat myeloomasolut eivät kasva, v) arvioimalla eri syvennysten hybridoomapitoinen pintanes-te sen suhteen, sisältääkö se E-rosettipositiivisille puhdistetuille T-soluille spesifisiä vasta-aineita, vi) valikoimalla ja kloonaamalla hybridoona ATCC CRL 8002, joka tuottaa vasta-ainetta, joka reagoi käytännöllisesti katsoen kaikkien ihmisen normaalien perifeeristen auttaja-T-solujen kanssa, mutta ei ihmisen normaalien perifeeristen B-solujen, nollaso-lujen eikä makrofagien kanssa, ja B) valmistetaan monoklonaalinen vasta-aine vii) siirtämällä' hybridooma ATCC CRL 8002 intraperitoneaa-lisesti hiiriin, ja viii) ottamalla vasta-aine talteen hiirien pahanlaatuisesta vesivatsasta tai seerumista. Il 29 Patentkrav 7 5 3 6 3