FI60216C - Biologiskt aktivt vid affinitetsreaktioner anvaendbart adsorptionsmedel - Google Patents

Description

ΓΒΊ m|KUULUTUSJULKAISU ,noi, J®a lBJ (11)utlAggningsskrift 6021 6 C ¢45} P.rteniti my'inn :· tty 10 1C 19-31 Patent meddelat (51) K».ik?/i«.a.3 c 07 G 7/00, C 12 N 11/08, G 01 N 33/48 SUOMI—FINLAND <») Patenttihakemus — Patentana5knln| 751299 (22) Hakemlspllv· — AmMutlngtdag 30. OU. 75 (23) AlkupUvi—Giltlghutsdtg 30.0^.75 (41) Tulkit lulkisektl — Bllvit offmtllg 07.11.75 _ _ . . . , (44) NlhUvllulpanon ja kuuL|ulkalsun pvm. — „ „

Patent-och registerstyrelsen v ' Ansdkan utlagd och uti^kriften pubtkerad 31.08.8l (32)(33)(31) Pyydetty etuoikeus—Begird prlorltet 06.05.71*

Saksan Liittotasavalta-Förbundsrepubliken lyskland(DE) P 21*21709.8 (71) Behring-wsrke Aktiengesellschaft, Marburg/Lahn, Saksan Liittotasavalta-Förbundsrepubliken Tyskland(DE) (72) Rudolf Schmidtberger, Marburg-Marbach, Heinrich Huemer, Schwalbach/

Taunus, Saksan Liittotasavalta-Förbundsrepubliken Tyskland(DE) (7U) Oy Kolster Ab (5U) Biologisesti aktiivinen, affiniteettireaktioissa käytettävä adsorptio-aine - Biologiskt aktivt, vid affinitetsreaktioner användbart adsorb- tionsmedel

Keksinnön kohteena on biologisesti a kti ivinen?a f finitee11ireäk-tioissa käytettävä adsorptioaine, joka koostuu veteen liukenemattomasta kantajasta ja siihen kemiallisesti sidotusta biologisesti aktiivisesta aineesta.

Viime vuosina biokemiallisten työskentelymenetelmien piirissä yhä enemmän ja enemmän on noussut esiin uusi tekniikka, jonka ensisijaisena tunnusmerkkinä on kantajiin sidottujen, biologisesti aktiivisten aineiden affiniteetin hyväksikäyttö selektiivisesti suoritettavissa olevissa reaktioissa.

Käyttämällä hyväksi kantajaan sidotun aineen ja toisen seoksessa olevan aineen spesifistä komp1eksinmuodostus ky kyä voidaan kysymyksessä oleva aine poistaa seoksesta ja eristää haluttaessa sen jälkeen desorption avulla.

Kantajaan sidottujen entsyymien ansiosta saavutetaan se etu, että aineiden muuttamiset voidaan suorittaa preparatiivisina, jatkuvina prosesseina ja reaktiotuotteet saadaan talteen entsyymittöminä.

Biokemiallisessa, entsymaattisessa analytiikassa reagensseina on 6021 6 käytettävissä veteen liukenemattomia entsyymejä, joita voidaan käyttää useaan kertaan. Koska entsyymien ominaisuutena on, että ne omaavat affiniteettia ei ainoastaan substraattien suhteen vaan myös spesifisten inhibiittorien suhteen, entsyymi-inhibiittorien valmistus on osoittautunut erityisen edulliseksi a f finitee11ikromatogra fia n avulla kantajaan sidottujen entsyymien yhteydessä. Toisaalta inhibiittorien sitoutuminen veteen liukenemattomiin matriiseihin mahdollistaa vastaavien entsyymien preparatiivisen valmistuksen.

Antigeenit tai vasta-aineet sitoutuvat niin sanottuina immuno-adsorbentteina veteen liukenemattomiin matriiseihin ja mahdollistavat siten vastaavien vasta-aineiden tai antigeenien eristämisen.

Edellä esitetyn selostuksen mukaisesti biologisesti aktiivisilla aineilla tarkoitetaan in vivo ja in vitro vaikuttavia luonnosta saatavia ja keinotekoisesti valmistettuja aineita, joista avarimmas-sa mielessä voidaan käyttää nimityksiä kuten entsyymit, antigeenit tai vasta-aineet.

Useimmat tähän asti selostetut kantajaan sidotut biologisesti aktiiviset aineet ovat oleellisesti paremmin säilyviä kuin vastaavat aineet l iuoksessa.

Kantaja-aineina, niin sanottuina matriiseina, on edullista käyttää sellaisia aineita, joiden ominaisuuksiin sisältyy vesipitoisiin systeemeihin liukenemattomuuden ohella mahdollisimman alhainen epäspesifinen adsorptiokyky. Lisäksi matriisin ja biologisesti aktiivisen aineen reaktiokumppanin välistä hydrofobista, hydrofi il ista ja ionista vuorovaikutusta ei saisi esiintyä, eikä missään tapauksessa saisi muodostua sidoksia sellaisten aineiden kanssa, jotka eivät ole biologisesti aktiivisen aineen reaktiokumppaneita.

Biologisesti aktiivisten aineiden kantajina tähän saakka käytetyt matriisit ovat mm. sellaisia, jotka sitovat aktiiviaineen fysikaalisen adsorption välityksellä; näitä ovat aktiivihiili ja lasihel-met. Toisen ryhmän kantajaaineita muodostavat ne aineet, joihin a k -tiiviaine sitoutuu kovalenttisidoksen välityksellä. Näihin viimemainittuihin kuuluvat vinyyl ipolymeerit, esim. po l ya k ryy l ihapot,polyakryyli happoam i d i t ja amino-, karboksi- tai su I fonyy1 isub stituentin sisältävä polystyreeni, edelleen selluloosa ja sen johdannaiset ja lopuksi luonnosta saatavat ja synteettiset polypeptidit ja proteiinit. Matriisien ja biologisesti aktiivisten aineiden välisen tasaisen vuorovaikutuksen vuoksi hiilihydraattien, etenkin se 1 1u1oosan , dekstraanin, tärkkelyksen, agarin tai näiden johdannaisten käyttö matriiseina vesipitoisissa sys- 3 6021 6 teemeissä on saavuttanut laajimman levinneisyyden, joskin näiden luonnosta saatavien aineiden usein sisältämien karboksyyliry hmien on epäspesifisestä reaktiostaan johtuen todettu vaikuttavan häiritsevästi. Tämän ohella näiden aineiden terminen ja kemiallinen stab i1i suus on melko alhainen.

Nyt on keksitty, että haitat, joita matriiseina käytettävillä hiilihydraateilla affiniteetistä riippuvien reaktioiden yhteydessä esiintyy, voidaan torjua, jos matriiseina käytetään polyhydroksime-t y 1 e e n i ä .

Keksinnön mukaiselle adsorptioainee 1 1 e on tunnusomaista, että veteen liukenematon kantaja on polyhydroksimetyleeni, ja biologisesti aktiivinen aine on aminoryhmän tai aminoryhmiä sisältävä aine, kuten entsyymi, antigeeni tai vasta-aine tai muu plasmaproteiini, ja että biologisesti aktiivinen aine on sidottu kantajaan mahdollisesti po1yf un ktionaa1isen orgaanisen yhdisteen välityksellä.

Polyhydroksimetyleeni on synteettinen polymeeri, jossa on yhtenäinen hiiliketju. Kussakin hiiliatomissa on vetyatomi ja hydroksyyli-ryhmä. Sen valmistusta ja ominaisuuksia on selitetty m.m. julkaisuissa N.D. Field ja J.R. Schaefgen, J. Polymer Sei., Voi. 58, 533 - 5^3 (1962), ja G. Smets ja K. Hayashi, J. Polymer Sei., Voi. 29, 257 -27^ (1958). Sitä voidaan valmistaa emäs- tai happohydrolyysin avulla po1yviny1 eenikarbonaatista. Po 1yhydroksimety1eeniä voidaan pitää poly-vinyleenikarbonaatin johdannaisena. Biologisesti aktiivisen aineen sitoutuminen po1yhydroksimety1eeniin voidaan aikaansaada toisaalta toimenpitein, jotka tunnetulla tavalla liittävät biologisesti aktiivisen aineen kantajan hyd ro k sy y 1 i r y hnä än kova 1 en 11 i s i doks i n , toisaalta antamalla po1yviny 1eenikarbonaatin reagoida, niin ikään tunnetulla tavalla, po1yviny1 ee nikarbonaatin syk1 okarbonaa11irenkaan amino 1yy11isen reaktion välityksellä, primäärisen amiinin, esimerkiksi heksamety1eenidi-amidin kanssa, jolloin tuloksena on uretaanisidoksen välityksellä spacer' i1 la tai biologisesti aktiivisella aineella substituoitu polyvinyl eenikarbonaa11i , jonka jälkeen jäljellä olevat syk 1 okarbonaa11i-ryhmät saippuoidaan hydroksyyliryhmiksi: <. 6021 6 r _ I- I I + r-nh2 III» 0-.0 Λ 0 0 OH 0 ...

x\ / j saippuointi » -> g f-° -►

0 n 0 HH

J i _ - polyvinyleenikarbonaatti ---~CH — CHl—CH CH-----

I I I I

OH OH OH 0 , C = o

n-1 I

J NH

R

Tuotteiden käytön kannalta on erityisen edullista, että biologisesti aktiivisten aineiden ei anneta reagoida suoraan po1yhydroksi-metyleenin kanssa, vaan niiden annetaan sitoutua matriisiin kovalenssi-sidoksin niin sanotun spacer1i n välityksellä.

Spacer-aineet ovat useimmiten hii1ivetyrunkoisia ja niiden pituus on 1 - 2 nm. Kahden reaktiokykyisen pääteryhmän ansiosta spacer voi reagoida sekä matriisin että myös biologisesti aktiivisen aineen kanssa, jolloin matriisin kanssa tapahtuvassa reaktiossa voidaan käyttää sopivissa olesuhteissa sekä po1yhydro k simety1eeniä että myös po-lyvi nyleeni karbonaatt ia.

Biologisesti aktiivisten aineiden liittämiseksi kova 1enssisidok-sin kantajaan löytyy useita yleisesti tunnettuja reaktioita:

Erityisen yksinkertainen menetelmä perustuu polyhydroksimetylee-nin hydroksyy1 iryhmien aktivointiin syaaniha 1ogenidien avulla, lähinnä bromisyaani11 a, ja aminoryhmiä sisältävien biologisesti aktiivisten aineiden reaktioon näiden aktivoitujen ryhmien välityksellä.

Toinen menetelmä perustuu siihen, etää po1yhydroksimety1eenin, kuten esimerkiksi polysakkaridin, annetaan reagoida atsidimenete 1män (Curtius) muunnelmaa käyttäen ha 1ogeenikarbonihapon kuten kloorietik-kahapon kanssa alkalisessa ympäristössä, vastaava happo esteröidään alkoholin kanssa, sen jälkeen esteri muutetaan hydratsidiksi, ja lopuksi näin muodostunut, aminoryhmän sisältävä atsidi liitetään poly- 5 6021 6 hydroksimetyleenimatri ΐ s Ϊin.

Biologisesti aktiivinen aine voidaan myös liittää polyhydrok-simety1eenimatri isi in siten, että hydroksyy 1 iryhmät ensin asyloidaan bromia setyy1ibromidi1I a, minkä jälkeen biologisesti aktiivisen aineen aminoryhmä alkyloidaan.

Vas taavan 1 aisia reaktioita saadaan tapahtumaan esimerkiksi antamalla kantajan hydroksyy1 iry hmien reagoida reaktiokykyis ten tri-atsiinien kanssa, jolloin osa triatsiinin reaktiokykyisistä ryhmistä reagoi poIyhydroksimety1eeniyhdis teen kanssa, osa biologisesti aktiivisen aineen aminoryhmän kanssa.

Diatsotoitavissa olevat aromaattiset amiinit, jotka toisaalta voivat muun reaktiokykyisen ryhmän välityksellä sitoutua kantajan hydroksyy1iryhmiin, mahdollistavat toisaalta sidoksen muodostumisen esimerkiksi siihen kykenevien, aktivoitujen proteiinien tyrosiini-tai histidiinitähteiden kanssa.

Aryy1 iamino ryhmiä sisältävät vinyy 1 isu1 fonijohdannais et ja β-hydroksietyy1isu1 fonien rikkihappopuo1 ies terit voidaan saada reagoimaan kantajan hydroksyy1iryhmien kanssa. Ne mahdollistavat biologisesti aktiivisen aineen sitoutumisen edellä selostetun diatsotoin-ti reaktion jälkeen.

Erityisen luja eetterisidos muodostuu annettaessa polyhydrok-simetyleenin hydroksyy1iryhmien reagoida ioneja muodostamattomien epoksidien kanssa, joissa on vähintään 2 reaktiokykyistä ryhmää, kuten epiha 1ogeenihydri inien tai poIyepoksidien, esimerkiksi epikloori-hydriinin tai bisepoksidin kanssa.

Löytyy muitakin menetelmiä kova 1enttisidoksen muodostamiseksi po 1 yhydroksimety1eenin hydroksyy1iryhmien ja biologisesti aktiivisen aineen aminoryhmien vä1 i11 e, kuten tunnettu reaktio komplekseja muodostavien meta11iyhdisteiden, esim. titaaniyhdis teiden välityksellä.

Mainitun kemiallisen ja termisen s tabi1 isuuden lisäksi poly-hydroksimety1eeni11ä on muita erinomaisia ominaisuuksia. Niinpä se voidaan helposti muokata kuitu-, lanka-, kalvo- tai raemuotoon, joten muoto voidaan valita käyttötarkoitukseen sopivaksi. Myös polyhydrok-simetyleenin pinta-ala on helposti säädettävissä.

Vastaavien reaktiomekanismien mukaisesti, joita on selitetty edellä biologisen aineen liittämisen yhteydessä, myöskin spacer voidaan liittää matriisiin, jos siinä yhtenä reaktiokykyisenä ryhmänä on aminoryhmä. Specerin liittäminen tarjoaa mahdollisuuden liittää biologisesti aktiivinen aine muullakin tavalla: esimerkiksi siinä ta- 6 6021 6 pauksessa , että matri isi in sitoutuneessa spacer1 issa on vapaa k a r b o k -syy] i ryhmä, tämä karboksyyliryhmä on aktivoitavissa esimerkiksi kar-bodi-imidiyhdis tei 1 1ä , joka sitten voi muodostaa amidisidoksen biologisesti aktiivisen aineen kanssa. Karboksyy1iryhmät suovat edelleen mahdollisuuden amidisidosten muodostamiseen Woodward'in esittämien isoksatsoliumsuolojen avulla.

Jos matriisiin sidotussa spacerissa on käytettävissä oleva vapaa aminoryhmä, spacerin pidentämiseen aryy1iaminoryhmin voidaan käyttää aryy1 iaminoryhmiä sisältäviä vinyy1 isu 1 fonijohdannaisia tai /fl-hydroksietyy1 isulfonien rikkihappoes tereitä, jotka sen jälkeen d i -atsotoidaan tunnetuin menetelmin ja sidotaan biologisesti aktiivisen yhdisteen vastaaviin reaktiokykyisiin ryhmiin, esimerkiksi -f—,—^-1—-1-

OH 0 OH

„ l •Λ n r //\ /r-\ 0 NH- (CH2) 6-NH-CH2-CH2-sojO-NH2

Kantajiin sidotuilla, biologisesti aktiivisilla aineilla on niiden spesifististen adsorptio-ominaisuuksien ansiosta laajaa käyttöä a f finiteettikromatogra fia ssa. Kantajiin sidottujen luonnossa esiinty-. vien tai synteettisten entsyymi-inhibiittorien avulla voidaan valmistaa erittäin puhtaita entsyymituotteita, ja kantajiin sidottujen entsyymien on puolestaan todettu soveltuvan huomattavan hyvin erityisesti luonnon e ntsyymi-in hibi ittorie n tai teenottam i seen ra a kauu11eista . Kantajiin sidottuja veteen liukenemattomia antigeenejä käytetään asianomaisten vasta - aineide n eristämiseen, jotka saadaan tällä tavalla vapaina muista seerumiosa sista ja vapaina muista antigeeneistä. Affi-niteettikromatograafisesti voidaan eristää myös saostumattomia vasta-aineita samoin kuin aineita, joita ei saada saostumaan, koska niiden konsentraatio seerumissa on vähäinen, ja määritys voidaan tehdä myös kvantitati ivisesti .

Keksinnön selventämiseksi seuraavassa esitetyissä esimerkeissä on osoitettu, että po1yhydroksimety1eeni-kantaja soveltuu mitä erilaisempien biologisesti aktiivisten aineiden sitomiseen, ja että polyhyd-roksimety1eeni voidaan sopivasti substituoima 11 a tehdä käytännöllisesti katsoen jokaisen halutun biologisesti aktiivisen aineen sitomiseen sove1t uvaks i.

Esimerkin muodossa osoitetaan edelleen, mihin matriisiin sidot- 7 60216 tuja biologisesti aktiivisia aineita voidaan käyttää.

Esimerkki 1. Po 1yhydroksimety1eeni-1etanustoksoidi-yhdiste Matriisin valmistus (CO -amino-n-heksyyl i)- s u b s t ituoidusta poly-hydroksimetyleenistä:

Seokseen, jossa on 20 g po1yhydroksimety1eeniä suspendoituna 900 ml:aan vettä, lisätään liuos, jossa on 20 g BrCN:a 50 ml:ssa dimetyy1iformamidia ja pH pidetään sekoittaen ja sisälämpötilan ollessa 15°C 6 minuutin ajan arvossa 11,5 tiputtamalla hitaasti 2-n natron-lipeää. Sen jälkeen suodatetaan heti, pestään hyvin jäävedellä ja puristetaan kakuksi. Näin aktivoitu, vielä veden kostuttama polyhydrok-simetyleeni lisätään hyvin sekoitettuun, huoneen lämpötilassa pidettyyn, väkevällä HC1 : 1 la pH-arvoon 8,5 säädettyyn liuokseen^ jossa on 20 g he ksamety1eenidiami inia 500 ml :ssa H20:ta, kokonaistilavuus säädetään vettä lisäämällä 1 litraksi, pH-arvo pidetään jatkuvasti välillä 8,5 “ 9,0 ja sekoittamista jatketaan vielä 5 tuntia huoneen lämpötilassa. Sen jälkeen suodatetaan ja pestään hyvin vedellä, (ö^-amino-n-he k syy 1 i)-ryhmin substituoidun po1yhydroksimety1eenin kuivatun näytteen typpipitoisuus oli 1,9 %. Lisäämällä primääristen vapaiden amino-ryhmien osoittamiseksi Sanger'in reagenssia saadaan intensiivisen keltaiseksi värjäytyneitä tuotteita.

Tetanus-ant i geen i n sitominen kantajaan 10 g esimerkin 1 kantajaa suspendoi taan 200 ml:aan 0,5~m n atriumfosfaa11i1 iuosta, jonka pH on 10. Suspensiota lämmitetään sekoittaen 50°C:ssa ja lisätään 5 g 1-aminobentseeni-k-/3"hydroksie tyyli sul foni r i kki happopuol iester iä. Sen jälkeen kun pH-arvo on säädetty 1 0 : k s i 2-m Na0H:lla, erää sekoitetaan tunnin ajan 50°C:ssa. Sen jälkeen suodatetaan imu suoda11imen läpi ja pestään käyttämällä 2 1 vettä, 2 1 asetonia ja 2 1 0,2-m HCI:a. Po 1yhydroksimety1eeniin sidottujen aryyli- amiiniryhmien diatsotoimiseksi suodatinjäännös suspentoidaan 200 m 1 :a a n 0,2-m HC1:a, jäähdytetään 2°C:een ja sekoittaen lisätään 1-m NaNO^-liuosta, kunnes KJ-tärkkelyspaperilla on todettavissa, että nitriittiä onhieman ylimäärin. 10 minuutin kuluttua suodatetaan imusuodatti-men läpi ja suodatinjäännös pestään 1 litralla 2°C-asteista , 0,01-m amidosulfonihapon vesiliuosta ja sen jälkeen 200 m 1 :11 a 0,2-m natrium-fosfaattia, jonka pH on 7,5 ja lämpötila 2°C. Kytke ntäreaktiota varten diatsoniumryhmiä sisältävä tuote suspentoidaan 150 ml:aan liuosta, jossa on 2 g tetanus-toksoidia (1260 Lf/mg N) 0,2-molaarisessa natrium-fosfaatissa, jonka pH on 7,5 ja lämpötila 2°C, ja sekoitetaan 20 tuntia 5°C:ssa. Toksoidin sitoutumattomat osat pestään pois imusuodatti-me1 1 a 1 litralla 1-moolista NaC1 - 1 iuosta.

8 60216

Polyhydroksimetyleeni-tetanustoksoidi-yhdi steen käyttö tetanus-antitoksi inin valmistuksessa 10 g esimerkin 1 tuotetta suspentoidaan 150 ml:aan 0,15-moolis-ta NaC 1 - 1 iuosta , johon on lisätty 1/15-mo1 aarista n atriumfosfa a11ia , ("PBS") pH 7,2, ja siirretään pylvääseen, jonka läpimitta on 3 cm ja korkeus 10 cm. Pylvääseen pannaan 20 ml teta nus - hevos seerumia, 1650 KY (kansainvälistä yksikköä) teta nus - a ntitok si inia/m 1 , joka pylväs pestään sen jälkeen 500 m 1 : 11 a PBS:ää, jonka pH on 7,2. Vasta-aineen e 1u-ointi tapahtuu 0,5-m glysi ini/HCl-puskurilla, jonka pH on 2,5. Eluaa-tissa on 2 - m N a 0 H : 1 la suoritetun neutraloinnin ja sitä seuranneen sent-rifugoinnin jälkeen kaikkiaan 2^0 mg proteiinia ja 12 300 KY tetanus-antitoksiinia, jonka määritys tapahtuu hiirille suoritettavan suoja-kokeen avu 1 la.

Esimerkki 2.Po1yhydroksimetyleeni-aminobentsamidi ini-yhdiste Matriisin valmistus (^-karboksi-n - pentyy1 i)-substituoidusta polyhydroksimetyleeni stä 20 g po1yhydroksimety1eeniä lisätään esimerkin 1 mukaisesti B r C N : 1 1 a suoritetun aktivoinnin jälkeen vesiliuokseen, jossa on 25 g Q -aminokapronihappoa ja jonka pH on säädetty laimealla natron1ipeä11ä arvoon 8,5 ja kokonaisti1avuus 1 litraksi. Sekoittamista jatketaan vielä 5 tuntia huoneen lämpötilassa pH:n ollessa 8,5 ja suodatetaan sekä pestään hyvin vedellä. (Co - karboksi-n-pentyy 1 i)-ry hmin substitu-oidusta polyhydroksimetyleenistä otetun kuivatun näytteen typpipitoisuus oli 0,86 %.

Aminobentsamidiinin sitominen kantajaan 2 g esimerkin 2 mukaisesti valmistettua polyhydroksimetyleeni-johdannaista suspentoidaan 25 m 1 :a a n 0,1-m morfoliinietaanisulfonihap-poa ja lisätään 1 g 1 - etyy1 i-3“(3-dimetyy1 iaminop ropyy1 i)-karbodi-imidi-hydrok1 oridia. Lisätään 2-m H C1 : a kunnes pH-arvo on ^,8. Erään lisätään sekoittaen 1g m-aminobents amidi inia . Suspensiota sekoitetaan pH:ta säätäen tunnin ajan ja adsorbentti siirretään sitten kromato-graf i apy1vääseen , jonka läpimitta on 1 cm. Adsorbentti huuhdotaan 200 m 1 : 11 a 0,05-m tris-hydroksimetyy1 iaminometaani -HC1-puskuria (pH 8,0), johon on lisätty 0,5 mol/1 KCl:a (Tris-KCl).

Polyhydroksimetyleeni-aminobentsamidi ini-yhdisteen käyttö trombiinin valmistuksessa 100 g naudasta saatua puhdistamatonta trombiinia liuotetaan 5 ml:aan 0,05-m tris/0,5-m KCl-liuosta, jonka pH on 8,0, ja pannaan edellä esitetyllä tavalla esi käsiteltyyn pylvääseen. Sen jälkeen pylväs huuhdellaan 20 0 m 1:1 1 a tris - KC1 -puskuria. Liukenemattomaksi tehtyyn 9 60216 m-aminobentsamidi iniin sidottu trombiini lohkaistaan tästä 100 m 1 :1 1 a liuosta, jossa on 0,05 moolia m-aminobents amidi inia tris-KC1-pusku-rissa.

Proteiinia sisältävät fraktiot yhdistetään ja juoksutetaan tris-KCl-puskurissa Sephadex G-25-pylvään (1 x 30 cm) läpi. Ensimmäisen, proteiinia sisältävän pylväseluaatin osa todettiin Chase'n ja Shaw'n, Biochem. 8, 1969, sivu 2212 mukaisesti suoritetun a ktiivisuusmäärityk-sen perusteella sisältävän 78 % lähtöaineen aktiivisuudesta.

Esimerkki 3· Polyhydroksi'metyleeni-pepsiini-valmiste

Matriisin valmistaminen ( Ci)-am i no-n - he ksyy 1 i ) - s u b s t i t uo i d u s t a polyhydroksimetyleenistä 8,0 g dimetyy1iformamidi/metano 1 i-seokse s ta uudelleen seostettua po1yviny 1eenikarbonaa11ia (va1 mistus: ks.N.D. Field ja J.R. Schaefgen, J. Polymer Sei., Voi. 58 ( 1 962) 534)s uspendoidaan huoneen lämpötilassa liuokseen, jossa on 7,5 g heksametyleenidiamiinia 18 0 m 1 :s s a meta-nolia ja sekoitetaan 48 tuntia huoneen lämpötilassa, suodatetaan, pestään metanolilla ja pidetään 4 vuorokautta huoneen lämpötilassa sus-pendoituna liuokseen, jossa on 10 g natriummety1 aa11ia 300 ml:ssa 96-¾ metanolia, pestään metanolilla ja sen jälkeen hyvin tehokkaasti vedellä. Kuusi CF^-ryhmää sisältävän spacerin välityksellä primäärisin ami-noryhmin substituoidun, kuivatun po1yhydroksimety1eeni-ad sorben11i-näytteen typpipitoisuus oli 5,7 I.

Pepsi inin sitominen kantajaan 20 g ( Co-am i no-n-heksyy 1 i )-subs t i tuo i tua po 1 y hy d roks i me ty 1 een i ä , joka on valmistettu esimerkin 3 mukaisesti, suspendoidaan 400 ml :aan 0,2-m natriumfosfaattia (pH 10). Suspensioon lisätään sekoittaen 40 ml 25-¾ glutaarialdehydi-liuosta. Kaksi tuntia kestäneen, huoneen lämpötilassa tapahtuneen sekoittamisen jälkeen suodatetaan imusuodatti-men läpi ja suodatin jäännös pestään 4 litralla 0,2-m natr i umasetaatt i-puskuria (pH 4,0). Sen jälkeen reaktiotuote lisätään 500 m 1 :a a n liuosta, jossa on 5 g pepsiiniä, kaikkiaan 500 000 KY, määritetty Anson1 in mukaisesti, 0,2-m natriumasetaatissa (pH 4,0), ja sekoitetaan 15 tuntia 6°C:ssa. Tämän jälkeen tuote pestään i musuodatt imellä 5 litralla 0,1-m natriumasetaatti/etikkahappoliuosta, pH 4,0, johon on lisätty 1 mol/1 NaC1:a.

Polyhydroksimetyleeni-pepsi ini-yhdisteen käyttö immunog1obu1iinien proteolyytti seen lohkaisuun

Edellä esitetyn esimerkin mukaisesti saatu adsorbent t i suspendoidaan 0,1-m asetaattipuskuriin (pH 4,0) ja tästä suoritetaan Anson'in mukainen a kti ivisuusmääritys. Suspensiossa on kaikkiaan 2 1 0 00 KY pep- 10 6 0 21 6 siiniä sidotussa ja tällä kokeella osoitettavissa olevassa muodossa. Ihmisen immunog1obu1iini G:n proteo1yyttistä lohkaisua varten pepsii-ni-adsorbentti suodatetaan erilleen ja jäännös suspentoidaan 2,5-¾ liuokseen, jossa on 30 g ihmisen immunoglobuliini G:tä ( I g G) fysiologisessa NaC 1 - 1 i uokses sa (pH k, 1 ) . Lohkaisuerää sekoitetaan 2** tuntia 37° C:ssa. Kantajaan sidotun pepsiinin erilleen suodattamisen jälkeen suodokseen lisätään 1250 ml kyllästettyä ammoniumsulfaattiliuosta. Tällöin muodostuva sakka sentrifugoidaan erilleen; se sisältää immunoglobuliini n F ( a b) ^“osa n vasta-aine-aktiivisuuksineen. Suodos heitetään pois.

Esimerkki k. Po 1yhydroksimety1eeni-aksami1 nihappo-yhdis teen valmi s t u s 10 g po1yhydroksimety1eeniä aktivoidaan esimerkissä 1 selostetulla tavalla BrCN:lla ja sen annetaan reagoida 5 g : n kanssa tyramii-nia, joka on liuotettu 150 ml:aan 0,1-m natriumvetykarbonaa11ia , 5°C:ssa 60 minuutin ajan sekoittaen. Sitoutumaton tyraminiinin osa suodatetaan erilleen imu suoda11ime 1 1 a ja suodatinjäännös pestään 1 litralla 0,1-m natriumfosfaatti-puskuria, jonka pH on 7,0 ja lämpötila 5°C. Suodatinjäännös suspendoidaan 150 ml:aan 5°C:een jäähdytettyä liuosta, jossa on 1 g diatsotoitua p-aminofenyy1iaksami inihappoa ja sekoitetaan 15 tuntia 5°C:ssa. Adsorbentti pestään imusuodattimella 1 litralla 0,05-m natriumas etaa11i-etikkahappo-puskuria, pH 5,5, johon on lisätty 2 mmoolia CaCl^a ja 0,2 mmoolia EDTA:ta.

Polyhydroksimetyleeni-oksami inihappo-yhdisteen käyttö neuraminidaasin valmistuksessa

Esimerkin k mukaisesti saatu adsorbentti suspendoidaan uudelleen mainittuun asetaa11ipuskuri in ja siirretään kromatogra fi apy1vääseen , jonka läpimitta on 2 cm. Tämän pylvään läpi johdetaan 1 litra Vibrio cho1 erae-vi 1je 1mäsuodosta, jossa on 800 KY neuraminidaa sia/m 1 , ja jonka pH on ensin säädetty 2-m etikkahapo1 1 a 5,5:k s i ja johon on lisätty CaCl^^a ja EDTA:ta, kunnes näiden pitoisuudet ovat 2 mmoolia ja 0,2 mmoolia. Sitoutumattomat proteiinit pestään pois 500 m 1 :11 a asetaatti-puskuria.

Kantajaan sitoutuneeseen inhibiittoriin adsorboituneen neuraminidaasin eluointi tapahtuu pesemällä pylväs 0,1-m natriumvetykarbon a a11i -liuoksella ja keräämällä yhteen neuraminida a sia sisältävät fraktiot.

Ne sisältävät 86 % käytetystä aktiivisuudesta.

Esimerkki 5 a) Polyhydroksimetyleenin reaktio epik 1oorihydri inin kanssa 50 g po1yhydroksimety1eeniä suspendoidaan 1 litraan 2-n NaOH:a, 1 1 6021 6 lisätään 250 ml epik 1oorihydri iniä ja sekoitetaan 2 tuntia 55 - 60° C:ssa. Suspension pH-arvo laskee lyhyessä ajassa välille 10 ja 11.

Tämä pH-arvo säilytetään vielä tunnin ajan lisäämällä N a 0 H: a. 2 tunnin reaktioajan jälkeen kiinteä aine suodatetaan erilleen, pestään vedellä, asetonilla ja lopuksi jälleen vedellä.

b) 50 g heksamety1eenidiamiinia liuotetaan 1,5 litraan vettä ja lisätään HCl:a, kunnes pH on 10. Liuokseen lisätään kohdan a) mukaisesti aktivoitu po1yhydroksimety1eeni ja sekoitetaan 6 tuntia 50 -55°C:ssa. Sen jälkeen tuote suodatetaan erilleen ja pestään heksamety-1 eenidiami inittomaksi vedellä.

c) Kohdassa 5b) saatua tuotetta sekoitetaan tunnin ajan 50 g:n kanssa 1-aminobentseeni-4-/3-hydroksietyylisulfonirikkihappoeste-riä 55°C:ssa ja pH:n ollessa 10. Senjälkeen kiinteä aine suodatetaan erilleen, pestään vedellä, asetonilla ja uudelleen vedellä.

d) 10 g kohdan 5c) mukaisesti saatua tuotetta pestään imusuo-dattimella 200 ml:lla 0,1-n HCl:a ja suspendoidaan sen jälkeen 300 ml :aan 0,5-n HCl:a. Suspensioon lisätään sekoittaen 0 - 4°C:ssa 0,1-n NaNC^- 1 iuosta, kunnes KJ-tärkke1yspaperi11 a on todettavissa vähäisen nitriitti-y1imäärän läsnäolo. 10 minuutin kuluttua suodatetaan imusuo-datinta käyttäen, ja jäännös pestään jäävedellä ja sen jälkeen 0,15~m natriumfo s f a a11ipuskuri11 a (pH 7,5) lämpötilassa 0 - 4°C.

e) 0,75 g albimiinia liuotetaan 250 ml:aan fosfaattipuskuria, jonka pH on 7,5, ja jäähdytetään 4°C:een ja lisätään kohdassa 5d) valmistettu tuote. Suspensiota sekoitetaan 20 tuntia 4°C:ssä, sen jälkeen suodatetaan ja kiinteä aine pestään 1-m N a C1 : 11 a ja fosfaatilla puskuroidulla keittosuolaliuoksella (PBS , 0,9-¾ NaCl:n vesiliuos, jossa on 1/15 moolia Na^HPO^-KH PO^-puskuria. jonka pH on 7,2).

Suodoksesta ja pesuvedestä määritetään albumiinipitoisuus radi-aali“immuno diffusio-menetelmällä. 1 g:aan näin valmistettua kantajaa sitoutuu 75 mg albumiinia.

f) 2,4 g I g M : ä ä liuotetaan 250 m 1:a a n fosfaattipuskuria, jonka pH on 7,5 ja jäähdytetään 4°C:een. Lisätään 10 g kohdan 5d) mukaisesti diatsotoitua tuotetta, ja suspensiota sekoitetaan 20 tuntia 4°C:ssa. Suodattamisen jälkeen kiinteä aine pestään 1-moolisella NaC1 - 1iuokse11 a ja em. PBS-1iuokse11 a.

1 g kohdan 5f) mukaisesti valmistettua kantajaa sitoo 240 mg

IgM:ää.

Esimerkki 6 a) 10 g po1yhydroksimety1eeniä aktivoidaan epik 1oorihydri ini1 1ä , annetaan reagoida heksamety1eenidiamiίnin kanssa ja jatkokäsite 11 ään '2 6021 6 esimerkissä 5 kohdissa a) b) selostetulla tavalla.

b) 10 g näin valmistettua kantajaan sukkinoyloidaan 4 tuntia 10°C:ssa ja pH:n ollessa 6 käyttäen 5 g meripihkahappoanhydridiä , joka on suspendoitu 200 mitään vettä. pH-arvoa säädellään 2-n NaOHtlla. Kun kiinteä aine on pesty vedellä, tuotetta sekoitetaan 30 minuuttia, pHtssa 5 ja lämpötilassa 5°C, 2,5 g:n kanssa N-sy k 1 ohe ksy y l i - N 1 - ( - (Nimet yy 1 imorfol i i no)-e tyy1 i)-karbodi-imidi-p-tolueeni-sulfonaattia, suodatetaan erilleen ja pestään nopeasti jäävedellä.

c) 1 g 1 g G:t ä liuotetaan 250 mitään fosfaatti-puskuria, jonka pH on 7,5 ja sekoitetaan kohdan 5f) mukaisesti valmistetun kantajan kanssa 24 tuntia 4°C:ssa. Tuote pestään suodattamisen jälkeen 1-m keittosuolaliuoksella ja PBS - 1 iuok s e 11 a (ks. esimerkki 5).

1 gtaan kantajaa sitoutuu (kovalenttisidoksin) 85 mg IgGttä.

Esimerkki 7 a) 20 g kohdassa 5a) valmistettua tuotetta sekoitetaan 20 g:n kanssa aminokapronihappoa 6 tuntia 50-55°C:ssa ja pH:n ollessa 10.

Sen jälkeen suodatetaan ja pestään vedellä.

b) 10 g:aan kohdan 7a) mukaisesti valmistettua tuotetta lisä tään 2,5 g N-syk 1oheksyy1 i-N 1 -((N 1 metyy1 imorfo 1 i ino)-etyy1 i)-karbodi-imidi-p-to 1ueeni-su1 fonaatia ja tähän lisätään 5 minuutin kuluttua, pH:n ollessa 5, 2 g N-hydroksisukkinimidiä. Kun seosta on sekoitettu 5 tuntia 24°C:ssa, kiinteä aine suodatetaan erilleen ja pestään vedel-1 ä .

c) 0,5 g albumiinia liuotetaan 200 ml:aan fosfaattipuskuria ja sekoitetaan 24 tuntia 4°C:ssa kohdan 7b) mukaisesti valmistetun aktivoidun kantajan kanssa. Suodattamisen jälkeen tuote pestään 1-m keittosuolaliuoksella ja PBS-1 iuokse11 a (ks. esimerkki 5)· 1 g:aan kantajaa sitoutuu (kovalenttisidoksin) 50 mg albumiinia.

Esimerkki 8 10 g po1yhydroksimety1eeniä aktivoidaan epik 1oorihydriini11ä , annetaan reagoida heksamety1eenidiamiinin kanssa ja jatkokäsite 11 ään esimerkin 5 kohdissa a) b) selitetyllä tavalla.

a) 10 g näin valmistettua kantajaa suspendoidaan 100 ml:aan vettä ja annetaan reagoida 500 ml:n kanssa 25-¾ g 1utaaria 1dehydiä. Kiinteä aine suodatetaan erilleen noin tunnin sekoittamisen jälkeen ja pestään vedellä tai PBS-1iuokse1 1 a(ks. esimerkki 5).

b) 0,5 g albumiinia liuotetaan 200 ml:aan fosfaattipuskuria ja sekoitetaan 20 tuntia 4°C:ssa kohdan 8a) mukaisesti valmistetun kantajan kanssa. Suodattamisen jälkeen tuote pestään 1-m keittosuola- 6021 6 1 3 liuoksella ja PBS-1iuokse11 a (ks. esimerkki 5).

Esimerkki 9

Suora reaktio epik 1oorihydriini11ä aktivoidun po1yhydroksimety-leenin kanssa.

a) 10 g po1yhydroksimety1eeniä aktivoidaan esimerkissä 5a) selostetulla tavalla 50 m 1:1 la epikloorihydriiniä. Suodattamisen jälkeen tuote pestään nopeasti vedellä, asetonilla, vedellä ja lopuksi PBS-liuoksella (ks. esimerkki 5)· b) 0,5 g albumiinia liuotetaan 200 ml:aan PBS-liuosta (ks. esimerkki 5) ja sekoitetaan 60 tuntia k°C:ssa kohdan 9a) mukaisesti valmistetun tuotteen kanssa. Suodattamisen jälkeen kantajaan sidottu proteiini pestään 1-m keittosuolaliuoksella ja PBS-1 iuokse1 1 a (ks. esimerkki 5) .

1 g kantajaa sitoo ^5 mg albumiinia.

Esimerkki 10 10 g veteen liukenematonta po1yhydroksimety1eeniä sekoitetaan pH-arvossa 9,5 (0,15-m Na-bikarbonaa11i/NaOH-puskuria ) 3 päivää 25°C:ssa 30 g:n kanssa diety1eenig 1yko1 idig 1ysidyy1 iee11eriä, tuote imusuodate-taan, pestään hyvin ja lisätään 0,5 g:aan ihmisa1 bumi inia 200 ml:ssa 0,15-m fosfaattipuskuria (pH * 8) ja sekoitetaan 60 tuntia 10°C:ssa. Suodattamisen jälkeen pestään kantajaan sidottu proteiini 1-m keitto-suolaliuoksella ja PBS-1 iuokse11 a (ks. esimerkki 5).

1 g kantajaa sitoo 35 mg a 1bumiinia .

Esimerkki 11 10 g po1yhydroksimety1eeniä saatetaan reagoimaan esimerkissä 10 kuvatulla tavalla 30 g:n kanssa g 1ysidyy1itris-(g 1ysidyy1iee11eriä) , seos kaadetaan 0,5 g:aan immunog1obu1 i inia G ( I g G) 200 ml:ssa 0,15-m fosfaattipuskuria (pH = 7) ja sekoitetaan 60 tuntia 4°C:ssa. Suodattamisen jälkeen pestään tuote 1-m keittosuolaliuoksella ja PBS-1 iuokse1-la (ks. esimerkki 5) · 1 g kantajaa sitoo 50 mg I g G:t ä.