FI56845C - Foerfarande foer framstaellning av nadh-peroxidas - Google Patents
Foerfarande foer framstaellning av nadh-peroxidas Download PDFInfo
- Publication number
- FI56845C FI56845C FI772186A FI772186A FI56845C FI 56845 C FI56845 C FI 56845C FI 772186 A FI772186 A FI 772186A FI 772186 A FI772186 A FI 772186A FI 56845 C FI56845 C FI 56845C
- Authority
- FI
- Finland
- Prior art keywords
- nadh
- enzyme
- determination
- oxidase
- reaction
- Prior art date
Links
- 150000002978 peroxides Chemical class 0.000 title 1
- 238000005057 refrigeration Methods 0.000 title 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 35
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 35
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 35
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 19
- 229930027945 nicotinamide-adenine dinucleotide Natural products 0.000 description 18
- HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N cholesterol Chemical compound C1C=C2C[C@@H](O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@H](C)CCCC(C)C)[C@@]1(C)CC2 HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N 0.000 description 17
- BOPGDPNILDQYTO-NNYOXOHSSA-N nicotinamide-adenine dinucleotide Chemical compound C1=CCC(C(=O)N)=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]2[C@H]([C@@H](O)[C@@H](O2)N2C3=NC=NC(N)=C3N=C2)O)O1 BOPGDPNILDQYTO-NNYOXOHSSA-N 0.000 description 15
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 14
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 14
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 13
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 12
- 238000000034 method Methods 0.000 description 11
- LRFVTYWOQMYALW-UHFFFAOYSA-N 9H-xanthine Chemical compound O=C1NC(=O)NC2=C1NC=N2 LRFVTYWOQMYALW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 108010084238 NAD+ peroxidase Proteins 0.000 description 10
- SCVFZCLFOSHCOH-UHFFFAOYSA-M potassium acetate Chemical compound [K+].CC([O-])=O SCVFZCLFOSHCOH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 10
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 102000004316 Oxidoreductases Human genes 0.000 description 9
- 108090000854 Oxidoreductases Proteins 0.000 description 9
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 8
- LEHOTFFKMJEONL-UHFFFAOYSA-N Uric Acid Chemical compound N1C(=O)NC(=O)C2=C1NC(=O)N2 LEHOTFFKMJEONL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- TVWHNULVHGKJHS-UHFFFAOYSA-N Uric acid Natural products N1C(=O)NC(=O)C2NC(=O)NC21 TVWHNULVHGKJHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 235000012000 cholesterol Nutrition 0.000 description 8
- 229940107161 cholesterol Drugs 0.000 description 8
- FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N hypoxanthine Chemical compound O=C1NC=NC2=C1NC=N2 FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 229940116269 uric acid Drugs 0.000 description 8
- 230000008033 biological extinction Effects 0.000 description 7
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 6
- PIEPQKCYPFFYMG-UHFFFAOYSA-N tris acetate Chemical compound CC(O)=O.OCC(N)(CO)CO PIEPQKCYPFFYMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 5
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 5
- 239000008351 acetate buffer Substances 0.000 description 5
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 5
- 235000011056 potassium acetate Nutrition 0.000 description 5
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 5
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 5
- 238000007430 reference method Methods 0.000 description 5
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 5
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 5
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 229940075420 xanthine Drugs 0.000 description 5
- 108010025188 Alcohol oxidase Proteins 0.000 description 4
- 108010089254 Cholesterol oxidase Proteins 0.000 description 4
- 102000004674 D-amino-acid oxidase Human genes 0.000 description 4
- 108010003989 D-amino-acid oxidase Proteins 0.000 description 4
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- UGQMRVRMYYASKQ-UHFFFAOYSA-N Hypoxanthine nucleoside Natural products OC1C(O)C(CO)OC1N1C(NC=NC2=O)=C2N=C1 UGQMRVRMYYASKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108010008292 L-Amino Acid Oxidase Proteins 0.000 description 4
- 102000007070 L-amino-acid oxidase Human genes 0.000 description 4
- 239000004395 L-leucine Substances 0.000 description 4
- 235000019454 L-leucine Nutrition 0.000 description 4
- GLUUGHFHXGJENI-UHFFFAOYSA-N Piperazine Chemical compound C1CNCCN1 GLUUGHFHXGJENI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229920002873 Polyethylenimine Polymers 0.000 description 4
- 108010092464 Urate Oxidase Proteins 0.000 description 4
- 150000001298 alcohols Chemical class 0.000 description 4
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 4
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 4
- 229960003136 leucine Drugs 0.000 description 4
- 229950006238 nadide Drugs 0.000 description 4
- LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K tripotassium phosphate Chemical compound [K+].[K+].[K+].[O-]P([O-])([O-])=O LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 4
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M Acetate Chemical compound CC([O-])=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000016938 Catalase Human genes 0.000 description 3
- 108010053835 Catalase Proteins 0.000 description 3
- QNAYBMKLOCPYGJ-UWTATZPHSA-N D-alanine Chemical compound C[C@@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-UWTATZPHSA-N 0.000 description 3
- QNAYBMKLOCPYGJ-UHFFFAOYSA-N D-alpha-Ala Natural products CC([NH3+])C([O-])=O QNAYBMKLOCPYGJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000194031 Enterococcus faecium Species 0.000 description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108010015776 Glucose oxidase Proteins 0.000 description 3
- 239000004366 Glucose oxidase Substances 0.000 description 3
- BAWFJGJZGIEFAR-NNYOXOHSSA-N NAD zwitterion Chemical compound NC(=O)C1=CC=C[N+]([C@H]2[C@@H]([C@H](O)[C@@H](COP([O-])(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]3[C@H]([C@@H](O)[C@@H](O3)N3C4=NC=NC(N)=C4N=C3)O)O2)O)=C1 BAWFJGJZGIEFAR-NNYOXOHSSA-N 0.000 description 3
- 108010007843 NADH oxidase Proteins 0.000 description 3
- XJLXINKUBYWONI-NNYOXOHSSA-N NADP zwitterion Chemical compound NC(=O)C1=CC=C[N+]([C@H]2[C@@H]([C@H](O)[C@@H](COP([O-])(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]3[C@H]([C@@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](O3)N3C4=NC=NC(N)=C4N=C3)O)O2)O)=C1 XJLXINKUBYWONI-NNYOXOHSSA-N 0.000 description 3
- 108010093894 Xanthine oxidase Proteins 0.000 description 3
- 102100033220 Xanthine oxidase Human genes 0.000 description 3
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 3
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 3
- 229940116332 glucose oxidase Drugs 0.000 description 3
- 235000019420 glucose oxidase Nutrition 0.000 description 3
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 3
- 102000005369 Aldehyde Dehydrogenase Human genes 0.000 description 2
- 108020002663 Aldehyde Dehydrogenase Proteins 0.000 description 2
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 2
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 2
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 2
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 2
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- POJWUDADGALRAB-UHFFFAOYSA-N allantoin Chemical compound NC(=O)NC1NC(=O)NC1=O POJWUDADGALRAB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000001166 ammonium sulphate Substances 0.000 description 2
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 2
- 150000001840 cholesterol esters Chemical class 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 2
- 150000002334 glycols Chemical class 0.000 description 2
- YMAWOPBAYDPSLA-UHFFFAOYSA-N glycylglycine Chemical compound [NH3+]CC(=O)NCC([O-])=O YMAWOPBAYDPSLA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 2
- 238000006395 oxidase reaction Methods 0.000 description 2
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 2
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 2
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 2
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 2
- 229910000160 potassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000011009 potassium phosphates Nutrition 0.000 description 2
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 2
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 2
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 2
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 2
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 2
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 2
- 239000007974 sodium acetate buffer Substances 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- RYCLIXPGLDDLTM-UHFFFAOYSA-J tetrapotassium;phosphonato phosphate Chemical compound [K+].[K+].[K+].[K+].[O-]P([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O RYCLIXPGLDDLTM-UHFFFAOYSA-J 0.000 description 2
- QGEACRIKUUTESN-UHFFFAOYSA-K tripotassium triacetate Chemical compound [K+].[K+].[K+].CC([O-])=O.CC([O-])=O.CC([O-])=O QGEACRIKUUTESN-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- JVIPLYCGEZUBIO-UHFFFAOYSA-N 2-(4-fluorophenyl)-1,3-dioxoisoindole-5-carboxylic acid Chemical compound O=C1C2=CC(C(=O)O)=CC=C2C(=O)N1C1=CC=C(F)C=C1 JVIPLYCGEZUBIO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LJCNDNBULVLKSG-UHFFFAOYSA-N 2-aminoacetic acid;butane Chemical compound CCCC.CCCC.NCC(O)=O LJCNDNBULVLKSG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BKAJNAXTPSGJCU-UHFFFAOYSA-N 4-methyl-2-oxopentanoic acid Chemical compound CC(C)CC(=O)C(O)=O BKAJNAXTPSGJCU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- POJWUDADGALRAB-PVQJCKRUSA-N Allantoin Natural products NC(=O)N[C@@H]1NC(=O)NC1=O POJWUDADGALRAB-PVQJCKRUSA-N 0.000 description 1
- 101000767281 Aspergillus flavus Uricase Proteins 0.000 description 1
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 description 1
- BTBUEUYNUDRHOZ-UHFFFAOYSA-N Borate Chemical compound [O-]B([O-])[O-] BTBUEUYNUDRHOZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920002134 Carboxymethyl cellulose Polymers 0.000 description 1
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K Citrate Chemical compound [O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 241000271533 Crotalus durissus terrificus Species 0.000 description 1
- 150000008574 D-amino acids Chemical class 0.000 description 1
- RGHNJXZEOKUKBD-SQOUGZDYSA-M D-gluconate Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)C([O-])=O RGHNJXZEOKUKBD-SQOUGZDYSA-M 0.000 description 1
- 229920001425 Diethylaminoethyl cellulose Polymers 0.000 description 1
- 241000194032 Enterococcus faecalis Species 0.000 description 1
- 102000003983 Flavoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108010057573 Flavoproteins Proteins 0.000 description 1
- 108010008488 Glycylglycine Proteins 0.000 description 1
- 150000008575 L-amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 102000003855 L-lactate dehydrogenase Human genes 0.000 description 1
- 108700023483 L-lactate dehydrogenases Proteins 0.000 description 1
- 244000199866 Lactobacillus casei Species 0.000 description 1
- 235000013958 Lactobacillus casei Nutrition 0.000 description 1
- LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-M Pyruvate Chemical compound CC(=O)C([O-])=O LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229910000831 Steel Inorganic materials 0.000 description 1
- 108010055297 Sterol Esterase Proteins 0.000 description 1
- 102000000019 Sterol Esterase Human genes 0.000 description 1
- 241000187747 Streptomyces Species 0.000 description 1
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 1
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 238000010306 acid treatment Methods 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 239000003463 adsorbent Substances 0.000 description 1
- 102000020006 aldose 1-epimerase Human genes 0.000 description 1
- 108091022872 aldose 1-epimerase Proteins 0.000 description 1
- 125000002877 alkyl aryl group Chemical group 0.000 description 1
- 229960000458 allantoin Drugs 0.000 description 1
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- MKKIWWXKPGIMGN-UHFFFAOYSA-N boric acid;2-hydroxypropane-1,2,3-tricarboxylic acid Chemical compound OB(O)O.OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O MKKIWWXKPGIMGN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 239000008366 buffered solution Substances 0.000 description 1
- 238000011088 calibration curve Methods 0.000 description 1
- 239000001768 carboxy methyl cellulose Substances 0.000 description 1
- 235000010948 carboxy methyl cellulose Nutrition 0.000 description 1
- 239000008112 carboxymethyl-cellulose Substances 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- GGCLNOIGPMGLDB-GYKMGIIDSA-N cholest-5-en-3-one Chemical compound C1C=C2CC(=O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@H](C)CCCC(C)C)[C@@]1(C)CC2 GGCLNOIGPMGLDB-GYKMGIIDSA-N 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 239000007979 citrate buffer Substances 0.000 description 1
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 description 1
- XPPKVPWEQAFLFU-UHFFFAOYSA-J diphosphate(4-) Chemical compound [O-]P([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O XPPKVPWEQAFLFU-UHFFFAOYSA-J 0.000 description 1
- 235000011180 diphosphates Nutrition 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 238000007824 enzymatic assay Methods 0.000 description 1
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 1
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 description 1
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 description 1
- 150000004665 fatty acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 1
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 229940050410 gluconate Drugs 0.000 description 1
- 229960001031 glucose Drugs 0.000 description 1
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 1
- 229940043257 glycylglycine Drugs 0.000 description 1
- 238000000227 grinding Methods 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 238000011221 initial treatment Methods 0.000 description 1
- 239000002198 insoluble material Substances 0.000 description 1
- 238000009413 insulation Methods 0.000 description 1
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 description 1
- 229920000831 ionic polymer Polymers 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 229940017800 lactobacillus casei Drugs 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 239000002808 molecular sieve Substances 0.000 description 1
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 1
- 238000005502 peroxidation Methods 0.000 description 1
- 239000008057 potassium phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- -1 propionate ions Chemical class 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 1
- 238000009938 salting Methods 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 238000007127 saponification reaction Methods 0.000 description 1
- DUIOPKIIICUYRZ-UHFFFAOYSA-N semicarbazide Chemical compound NNC(N)=O DUIOPKIIICUYRZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- URGAHOPLAPQHLN-UHFFFAOYSA-N sodium aluminosilicate Chemical compound [Na+].[Al+3].[O-][Si]([O-])=O.[O-][Si]([O-])=O URGAHOPLAPQHLN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012086 standard solution Substances 0.000 description 1
- 239000010959 steel Substances 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 238000009210 therapy by ultrasound Methods 0.000 description 1
- HHLJUSLZGFYWKW-UHFFFAOYSA-N triethanolamine hydrochloride Chemical compound Cl.OCCN(CCO)CCO HHLJUSLZGFYWKW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UPCXAARSWVHVLY-UHFFFAOYSA-N tris(2-hydroxyethyl)azanium;acetate Chemical compound CC(O)=O.OCCN(CCO)CCO UPCXAARSWVHVLY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N triton Chemical compound [3H+] GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N 0.000 description 1
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
- C12N9/0065—Oxidoreductases (1.) acting on hydrogen peroxide as acceptor (1.11)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/26—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase
- C12Q1/28—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase involving peroxidase
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Description
r_, /44, KU ULUTUSJULKAISU rcQAC
(11) UTLÄGGNINGSSKRIFT 56845 C (45) Patentti myönnetty 10 04 1930 Patent meddelat v v (51) Ky.Mc.*/tnt.ci.' C 07 G 7/028 G 01 N 33/16 G 01 N 3V14 £ Q |y| | _ FINLAND (21) P*t«nttlh»k«mus — Pat«nUn*ekning 772136 (22) Hakamitpiivi — Aruöknlngtdag 13.07.77 ^ ^ (23) Alku pilvi—Glttlghatsdag 13.07.77 (41) Tullut julkltakal — Bllvit offtntllg 28.01.78
Patentti· ja rekiitarihallitus Nihtivildpwon ]. kuul.iuilul.un pvm. -
Patent· och registerstyrelsen ' An tukan utlagd och utl.*krlft«n publicerad 31.12.79 (32)(33)(31) Pyyd«*y «tuolkaut —Begird prlorltet 27.07.76
Saksan Liittotasavalta-Förbundsrepubliken Tyskland(DE) P 2633728.0 (71) Boehringer Mannheim GmbH., Sandhofer Strasse 112-132, 6800 Mannheim-Waldhof, Saksein Liittoasavalta-Förbundsrepubliken Tyskland(DE) (72) Albert Röder, Seeshaupt, Hans Möllering, Tutzing, Wolfgang Gruber, Tutzing-Unterzeismering, Klaus Beaucamp, Tutzing, Hans Seidel, Tutzing, Peter Stahl, Bernried, Detlef von Hoerschelmann, Wielenbach,
Saksan Liittotasavalta-Förbundsrepubliken Tyskland(DE) (7*+) Berggren Oy Ab (5*0 Menetelmä NADH-peroksidaasin valmistamiseksi - Förfarande för fram-ställning av NADH-peroxidas
Keksintö koskee menetelmää Streptomyces faecium ATCC 8043:n tuottaman NADH-peroksidaasin valmistamiseksi, eristämiseksi ja puhdistamiseksi, joka entsyymi erilaisten ominaisuuksien osalta eroaa tunnetusta NADH-peroksidaasista.
Lukuisten tärkeiden aineiden kuten glukoosin, virtsahapon, koleste-riinin, aminohappojen, alkoholien ja näiden kaltaisten aineiden määritykset suoritetaan entsymaattisesti käyttämällä oksidaaseja, jotka muodostavat tässä reaktiossa H2^2:ta* Tämän määritys suoritetaan sen jälkeen erilaisin menetelmin, kuten hapettamalla kromogeenia, hapettamalla alkoholeja katalaaseilla (Hantz'in reaktio), aldehydidehyd-rogenaasilla jne. Kaikilla näillä tunnetuilla indikaattorireaktioil-la on varjopuolensa. Siten lääkeaineet häiritsevät kromogeenien pe-roksidointia, Hantz'in reaktiota käyttäen suoritettava osoittaminen vaatii hyvin pitkän reaktioajan, reaktion ohjaaminen vuorostaan alde-hydi-dehydrogenaasin avulla on monimutkaista ja entsyymi on hyvin epästabiili. Tämän vuoksi tarvitaan sellainen yksinkertainen menetelmä H2C>2:n osoittamiseksi, johon ei liittyisi näitä varjopuolia ja jota voitaisiin käyttää erityisesti nyös spesifisten oksidaasien yhteydessä.
Olisi ihanteellista, jos Η2θ2:η muodostumiseen johtava spesifinen ok-sidaasireaktio voitaisiin yhdistää entsymaattiseen määritykseen lä- 2 56845 hinnä käytettävään NADH-reaktioon (NADH = nikotiiniamidi-adeniini-dinukleotidi pelkistetyssä muodossa). Jo nyt on tiedossa eräs NADH-peroksidaasi, joka katalysoi reaktiota.
NADH + H+ + H202 —QP-) NAD+ + 2 HjO
ABB, 5j>, 415 (1955): JBC, 225, 557 (1957). Tämä entsyymi, jonka EC-numero on 1.11.1.1 läydettiin Streptococcus faecium 10 C I - ja Lactobacillus casei-liuoksista ja sille ovat ominaisia pH-optimi kohdalla 5,4 sekä Michaelis-vakiot KM H202:n osalta 2 x 10-4 ja NADH:n osalta 1,4 x 10 Useiden oksidaasien osalta ovat sopivia vain al-kaalisella alueella suoritetut reaktiot. Tunnettu NADH-peroksIdaasi on kuitenkin jo pH-arvossa 7,0 käytännöllisesti katsoen inaktiivinen (Arch. Biochem. Biophys. 111, 535 (1965)). Näin ollen ei entsyymi epäedulliset Michaelis-vakiot huomioonottaen sovellu käytännössä H202:n määrittämiseen spesifisen oksidaasin kanssa tapahtuvassa yh-teisreaktiossa.
Nyttemmin on löydettu uusi NADH-peroksIdaasi, jolla ei ole tunnetun NADH-peroksidaasin varjopuolia ja josta se erottuu selvästi, ja joka soveltuu erinomaisesti käytettäväksi entsymaattiseen H202-määrityk-seen, erityisesti spesifisen oksidaasin yhteydessä tapahtuvassa yh-teisreaktiossa. Keksinnön kohteena on sen vuoksi menetelmä NADH-pe-roksidaasin valmistamiseksi, joka H202:n kanssa hapettaa NADH:n NAD:ksi ja H20:ksi ja keksinnön mukainen menetelmä on tunnettu siitä, että Streptococcus faecium ATCC 8043;n tuottama entsyymi vapautetaan uuttamalla tai käsittelemällä pinta-aktiivisella aineella, saadun entsyymiliuoksen pH säädetään arvoon 4,2-4,8, liukenematon aines erotetaan, suodos fraktioidaan polyetyleeni-imiinillä ja entsyymi otetaan talteen, jonka entsyymin Michaelis-vakio KM H202:n suhteen on 2,8 x 10 5M ja NADH:n suhteen 1,7 x 10~^M, mitattuna 25°C:ssa 0,2-molaarisessa TRIS-(hydroksimetyyli)-aminometaani-puskurissa pH 6,0, joka sisältää 0,1-moolia kaliumasetaattia/1.
Alhaisesta KM~arvostaan johtuen uusi entsyymi soveltuu oleellisesti paremmin kuin tunnettu entsyymi H202:n määrittämiseen. Mitä suurempi KM-arvo nimittäin on, sitä suuremman on oltava määritystä suoritettaessa myös H202-konsentraation tasapainotilassa. Mitä suurempi H202“ konsentraatio on, sitä suurempi on kuitenkin myös katalaasin vaikutus, jota näytemateriaalissa säännöllisesti on. Katalaasin kilpaillessa H202:sta tulokset kuitenkin ovat harhaanjohtavia.
3 58345
Keksinnön mukainen uusi entsyymi on kuten tunnettu entsyymikin flavo-proteiini ja siten väriltään kellertävä. Entsyymi säilyy glyseriini/ vesiseoksessa 1:1 +4°C:ssa useita kuukausia. Nikotiiniamidi-adeniini-dinukleotidifosfaatti (NADPH) ei voi korvata NADH:ta, päinvastoin kuin tunnettu entsyymi, jonka reaktionopeus NADPH:n kanssa on noin 8 % reaktionopeudesta NADH:n kanssa.
Entsyymin pH-optimi on 6,0 TRIS-puskurissa asetaatti- tai propionaat-ti-ionien läsnäollessa; aktiviteetti natriumasetaatti-puskurissa pH-arvossa 5,4 siis tunnetun entsyymin optimiolosuhteissa on noin 20 % alhaisempi. pH-arvossa 9,0 on aktiviteetti vielä noin 20 % optimi-arvosta .
Keksinnön mukaisesti uutta entsyymiä saadaan Streptococcus faecium ATCC 8043:sta. Valmistus tapahtuu uuttamalla tai käsittelemällä mikro-organismia pinta-aktiivisella aineella, jolloin entsyymi vapautuu, ja voidaan eristää sen jälkeen liuoksesta. Sopiviaeristyanenetelmiä ovat esimerkiksi ultraäänikäsittely, jauhentaminen lasihelmillä tai käsittely suuria leikkausvoimia hyväksikäyttäen. Kaikki nämäeristysmenetel-mät ovat tunnettuja ja niitä käytetään yleisesti mikro-organismeja erotettaessa. Käsittely pinta-aktiivisella aineella tapahtuu lähinnä lämpötilassa välillä 25-60°C. Ensisijainen käsittely tapahtuu 45-55°C: ssa pH-arvon ollessa lievästi happamalla puolella välillä noin 4,5-6,0. Riittävä käsittelyaika on yleensä 15-30 minuuttia, joskin tätä käsit-teluaikaa voidaan haitatta pidentää huomattavasti. Siten saadaan jopa kolmen tunnin vaikutusajalla 55°C:ssa vielä erittäin hyviä saantoja. Käsittelyä pinta-aktiivisilla aineilla pidetään edullisimpana, koska liuokseen tulee tällöin vähemmän epäpuhtauksia kuin mekaanisia murs-kausmenetelmiä käytettäessä ja sen vuoksi saadaan jo alunperin puhtaampaa entsyymiä. Pinta-aktiivisista aineista suositeltavimpia ovat ioni-soitumattomat. Erityisen sopivia ovat polyetyleeniglykoliesterit, esim. alkyyliaryylipolyetyleeniglykoliesterit kuten Triton X-100. Tämän uuttomenetelmän erityisenä etuna on myös se, että häiritsevän NADH-oksidaasin pitoisuus on tällöin erityisen vähäinen.
Entsyymien talteenottamiseksi liuoksista poistetaan liukenemattomat aineet, esim. sentrifugoimalla, ja saadusta kirkkaasta päällä olevasta kerroksesta voidaan saostaa entsyymiä sisältävä proteiinifraktio.
GG845
Saostamiseen soveltuvat tähän tarkoitukseen biokemiassa yleisesti käytettävät keinot kuten suolaaminen, esim. ammoniumsulfaatilla, saostaminen orgaanisilla liuottimilla kuten asetonilla tai metano-lilla tai saostaminen polyioneilla kuten polyetyleeni-iminillä.
Raa'an entsyymipreparaatin lisäpuhdistus voi tapahtua esimerkiksi kromatografoimalla adsorptioaineella kuten karboksimetyyliselluloo-salla, verkkoutuneella dekstraanilla tai ionivaihtajalla.
Lisäksi on osoittautunut, että entsyymi voidaan vapauttaa seuralais-aineistaan myös käsittelemällä hapolla. Happokäsittely tapahtuu tar-koituksenmukaisimmin pH-arvossa 4,2 - 4,8 10-25 minuutin aikana.
Suositeltava puhdistusmenetelmä on tämän vuoksi entsyymin vesiliuoksen pH:n säätäminen välille 4,2 - 4,8, liukenemattoman aineksen erottaminen ja päällä olevassa kerroksessa olevan entsyymin fraktioiminen polyetyleeni-iminillä.
Kaikki talteenottomenetelmän vaiheet suoritetaan puskuroidussa liuoksessa. Erityisen sopivia puskureita ovat tällöin fosfaattipuskuri, TRIS-puskuri ja asetaattipuskuri, käyttökelpoisia ovat kuitenkin myös muut tavanomaiset puskurit kuten glysiinipuskuri ja boraatti-sitraat-ti-puskuri.
Keksinnön mukaista uutta NADH-peroksidaasia voidaan käyttää ^Ojsn määrittämiseen yksinkertaisessa reaktiossa tai yhteisreaktiossa spesifisen oksidaasin kanssa. Määritys tapahtuu tarkoituksenmukaisesti pH-arvossa 6,0 - 9,0. Tällä tavalla on mahdollista kytkeä spesifinen oksidaasireaktio NADH-NAD-reaktion mittaamiseen. Jälkimmäistä reaktiota voidaan tunnetusti seurata erityisen yksinkertaisella tavalla määrittämällä ekstinktiomuutos, joka on verrannollinen NADH-konsentraation muutokseen.
"Spesifisellä oksidaasilla" tarkoitetaan keksinnön puitteissa entsyymejä, jotka reagoivat määrättyjen substraattien ja 02:n kanssa muodostaen H202:ta.
Spesifisinä oksidaaseina käytetään keksinnön puitteissa lähinnä glu-koosioksidaasia, D-aminohappo-oksidaasia, L-aminohappo-oksidaasia, kolesteriinioksidaasia, alkoholioksidaasia, urikaasia ja 56845 ksantiinioksidaasia. Tämän mukaisesti yhteisreaktion yhteydessä voidaan määrittää glukoosi, D-aminohappoja kuten D-alaniini, L-aminohappo ja kuten L-leusiini, kolestriini ja kolestriiniestereitä, pienimolekyylisiä alkoholeja, virtsahappo, ksantiini ja hypoksantiini. Yksinkertaisessa reaktiossa voidaan määrittää 1^02 sellaisenaan eikä siis vain välituotteena, kuten oksidaasi-systeemin läsnäollessa.
Keksinnön mukaan valmistetun NADH-peroksidaasin määrittäminen voidaan suorittaa edullisesti seuraavan kokeen mukaisesti: 2,68 ml TRIS-kaliumasetaattipuskuri (0,2 moolia TRIS + 0,15 moolia kaliumasetaattia): 2,42 g TRIS-puskuria + 1,42 g kaliumase-„ taattia liuotetaan 70 ml:aan I^O:ta, pH säädetään 2n etik- kahapolla arvoon 6,0, ja tilavuus säädetään H20:lla 100 ml: ksi.
0,20 ml NADH (6 mmoolia) : 5 mg NADH: ta liuotetaan 1 ml:aan H20:ta.
0,02 ml Näyte NADH-POD.
Sekoitetaan, 365 nm:ssä, d = 1 cm, 25°C, rekisteröidään esi-jae ΔΕ/min. Tätä esijaetta (ekstinktion vähentyminen) käytetään "NADH-oksidaasin" laskemiseen.
Koe aloitetaan käyttämällä 0,10 ml H2°2 mmoolia (0,05 ml 30-prosenttista H2C>2:ta laimennetaan 10 ml:11a H20:ta)) sekoitetaan, määritetään ekstinktion muutos/min (ΔΕ/min).
Ennen NADH-POD-aktiivisuuden laskemistaΔE/min:sta vähennetään NADH-oksidaasi-esijae.
Ensisijaisesti käytetään TRIS-asetaatti-puskuria, vaikkakaan NADH-POD:n " käyttäminen ei rajoitu tähän puskurisysteemiin. H202:n määrittäminen NADH-POD:n kanssa voidaan suorittaa mm: käyttämällä puskurisysteeminä natriumasetaattia, piperatsiinia, kaliumfosfaattia, kaliumdifosfaat-tia, boraatti/sitraattia, glysyyli-glysiiniä, trietanoliamiini ' HCl:a tai HEPES'iä (N-2-hydroksietyylipiperatsiini-N-etaani-sulfonihappoa).
Vastaavalla tavalla voidaan suorittaa myös H202~määritys, jolloin NADH-POD:tä lisätään ylimäärin ja määrätään H202“määrä, joka vastaa ekstinktiomuutosta. Määritys voi tapahtua päätepistemenetelmällä tai kineettisesti, so. määrittämällä ekstinktioero määrätyn lyhyen aikavälin kuluessa. Oheinen piirros esittää H202~määrityksen tarkkuutta 6 *06845 ja siihen kulunutta aikaa pH:n ollessa 8,0 edellä selostetussa TRIS-kaliumasetaatti-puskurissa ja edellä mainituissa määritysolosuhteis-sa. Tässä esittävät:
Kuva 1 kalibrointikäyrää, jossa I^C^-määrä (abskissa) on esitetty ekstinktioeron (ordinaatta) funktiona,
Kuva 2 ekstinktion väheneminen ajan funktiona 25°C:ssa. Alussa lisättiin 0,4^umoolia H202:ta.
Piirroksen molemmista käyristä voidaan todeta keksinnön mukaan valmistetun entsyymin käyttökelpoisuus H202:n kvantitatiiviseen määritykseen. Seuraava esimerkki selventää keksintöä.
Esimerkki 1
Entsyymin valmistus ja puhdistus
Streptococcus faecalis ATCC 8043 biomassaa lämmitetään 1-prosentti-sen TRITON X 100-liuoksen kanssa 0,02-mol. kaliumfosfaattipuskurissa, pH = 5,0, 30 minuuttia 55°C:ssa. Sen jälkeen jäähdytetään 4°C:seen ja liukenematon osa erotetaan. Saadaan vesiliuosta, jonka aktiivisuus on 1,77 yks./ml ja spesifinen aktiivisuus 0,77 yks./mg.
Saatuun liuokseen lisätään ammoniumsulfaattia kunnes koko entsymaatti-nen aktiivisuus on sakassa. Sakka suodatetaan erilleen, liuotetaan fosfaattipuskuriin (pH = 5,0) ja suola poistetaan molekyyliseulaa käyttäen. Näin saatua entsyymiliuosta voidaan käyttää H202~kokee-seen suoraan tai konsentroimalla se ensin lyofilisoimalla ja liuottamalla 3,0-mol. ammoniumsulfaattiliuokseen, pH = noin 7.
Lähtöliuoksen lisäpuhdistus entsyymiä ensin eristämättä tapahtuu tarkoituksenmukaisesti saostamalla ammoniumsulfaatilla seuraavalla tavalla:
Liuoksen pH säädetään etikkahapolla arvoon 4,4 ja annetaan olla paikoillaan 20 minuuttia. Sen jälkeen liukenematon aines suodatetaan pois. Päällä olevaan osaan lisätään annoksittain polyetyleeni-imini-liuosta ja kulloinkin ilmaantuva liukenematon osa suodatetaan pois. Entsyymin sisältävä fraktio liuotetaan uudelleen puskuriin ja kroma-tografoidaan käyttämällä dietyyliaminoetyyliselluloosaa. Tämän jälkeen poistetaan suola käyttämällä verkkoutettua dekstraania. Näin saadaan valmistetta, jonka aktiivisuus on noin 45 yks./mg.
Gö845 NADH-POD :n aktiivisuuden riippuvuus kokeessa käytettävästä puskurista Määritykset suoritetaan 0,1-mol. puskureissa (1 mmooli ®'4 iranoolia NADH) .
Taulukko 1
Entsyymiaktiivisuudet, pH:n ollessa 7,5, prosentteina eri puskureissa, verrattuna aktiivisuuteen natriumasetaatti-puskurissa (= 100 %)
Puskuri %
Natriumasetaatti 100 TRIS-asetaatti 101
Trietanoliamiini-asetaatti 100 Piperatsiini. HC1 100 HEPES 89
Kaliumfosfaatti 63
Kaliumdifosfaatti 61
Boraatti/sitraatti . 25
Koesysteemin pH-arvon vaikutus NADH-POD:n aktiivisuuteen Määritykset suoritetaan 0,1-mol. TRIS-asetaattipuskurissa (1 mmooli 0,4 irano°lia NADH).
Taulukko 2
Entsyymiaktiivisuuden riippuvuus pH:sta prosentteina pH % 5.0 67 5.4 98 6.0 100 7.0 88 7.5 56 8.0 37 9.0 19 5GÖ45
Virtsahapon määritys urikaasilla Määritys tapahtuu seuraavan yhtälön mukaisesti: 2H20 + virtsahappo + 02 ur-ka^s-—> allantoiini + H202 + CO.
Urikaasi, keksinnön mukainen NADH-POD ja NADH liuotettiin 0,2-mol. TRIS-asetaatti-puskureihin, joiden pH-arvot olivat erilaiset ja joissa kussakin oli 0,15 moolia kaliumasetaattia. Lähtöliuokseen lisättiin sitten 0,2 ^umoolia virtsahappoa sisältävä vesiliuos. Saatiin seuraavat tulokset:
Taulukko 3 pH Kokeen entsyymimäärä Prosessin päättymi- Saanto, % suhteessa NADH-POD Urikaasi seen kulunut aika UV-kokeeseen = minuuteissa 100 % yks. yks.
6 0,1 1 16 95,5 7 0,1 1 10 99 8 0,1 1 5 100 9 0,1 1 16 96,5 9 0,1 2 10 96,5 10 0,2 0,2 10 98
Referenssimenetelmä: P. Scheibe, E. Bernt ja H.U. Bergmeyer/H.U. Berg-meyer - Methoden der enzymatischen Analyse, Bd. II, 3. painos, s.
1999, (1974).
Taulukko 4
Virtsahapon saanto prosentteina, 0,2 ^umoolia virtsahappoa/koe-erä (Koeolosuhteet: 0,2 moolia TRIS-asetaattia, 0,15 moolia kaliumasetaattia, 0,4 yumoolia NADH, 0,1 yks. NADH-POD, 1 yks. Aspergillus flavus-urikaasia, koetilavuus 3 ml, 25°C, 365 nm), reaktion päättymiseen kulunut aika oli 5 minuuttia, kun pH 8 = 100 %.
pH % 6.0 71 7.0 95 8.0 100 8,5 98 9,0 76 10,0 69 5 6 84 b
Glukoosin määritys glukoosioksidaasilla (GOD) Määritys tapahtuu seuraavan yhtälön mukaisesti: D-glukoosi + 1^0 + ^ glukonaatti + ^2^2' Määritys suoritettiin pH:n ollessa 7,0 käyttämällä 210 yks. GOD, 0,2 yks. NADH-POD ja 60 yks. mutarotaasia. Glukoosin määritys virtsasta antoi 100 % referenssimenetelmällä GOD-Perid R (DE-PS 1.648.840 ja H.U. Bergmeyer, ibid, s. 1257) saadusta arvosta.
D-alaniinin määritys D-aminohappo-oksidaasllla (D-AOD) Määritys tapahtuu seuraavan yhtälön mukaisesti: D-alaniini + O 2 + H2O D-~———> pyruvaatti + NH^ + HjOj.
Määritys suoritettiin pH:n ollessa 8,5 käyttämällä 0,25 yks. NADH-POD: tä, 20 yks. D-AOD, 5 yks. laktaattidehydrogenaasia 25°C:ssa. Inkubaatioajan ollessa 20 minuuttia 25°C:ssa saanto oli 100 %. Referenssimenetelmä: M. Grassl/H.U. Bergmeyer, ibid, s. 1731.
L-leusiinin määritys Crotalus terrificus:ista saadulla L-aminohappo-oksidaasilla (L-AOD) Määritys tapahtuu seuraavan yhtälön mukaisesti: L-leusiini + O2 ^ —) ketoisokapronihappo + ^02«
Suoritus tapahtui pH-arvossa 7,5 - 8,0 TRIS-asetaatti-puskurissa, 0,2 mol., jossa oli 0,15 moolia asetaattia. Lisättäessä kokeessa 0,2 yks. keksinnön mukaista NADH-POD ja 0,7 yks. L-AOD takaisinsaanto oli noin 100 %. L-leusiinin konsentraation ollessa 0,2^umoolia reaktioaika oli noin 20 minuuttia. Referenssimenetelmä: ei tiedossa.
Kolesteriiniesteri-määritys kolesterolioksidaasilla ja kolesteroll-esteraasilla Määritys tapahtuu seuraavien yhtälöiden mukaisesti: 1) Rolesteroliesteri + H2O kolester.es terääsi—^kolesteroli + rasva happo ... . . . . Λ Kolester .oksidaasi s. , „ ^ 2) Kolesteroli + O2--? kolesteroni + H2O2.
10 56845 Määrityksissä käytettiin standardi-kolesteroliliuoksia ja -seerumia. Saanto käytettäessä standardiliuosta, jossa oli 0,2^umoolia kolesterolia, oli 98-102 % pH-arvossa 6,0 - 9,0 9-12 minuutin aikana. Tällöin käytettiin 0,1 yks. NADH-POD, 2 yks. kolesterolioksidaasia 3 ml:n koetilavuudessa.
Seerumin kolesterolimääritys antoi saippuoitaessa esteröity koleste-roliosuus KOH:n etanoliliuoksella saantoarvoiksi 95-105 %. Referenssimenetelmä: P. Roeschlau, E. Bernt ja W. Gruber/H.U. Berg-meyer, ibid, s. 1938 (1974).
Alkoholien määritys metanoli-oksidaasilla (MOD) Määritys tapahtui seuraavan yhtälön mukaisesti:
Metanoli + 02 —> formaldehydi + HjC^.
Määritys suoritettiin pH-arvossa 9,0 - 9,5 glysiini-Na-pyrofosfaat-tipuskurissa lisäämällä semikarbatsidia. Käytetyt entsyymimäärät olivat 0,3 yks. NADH-POD ja 8 yks. MOD. Kun metanolia ja etanolia oli läsnä 0,2yumoolia, saanto oli noin 100 %. Määritys voitiin suorittaa myös käytettäessä isopropanolia.
Ksantiinin ja hypoksantiinin määritys ksantiinioksidaasilla (XOD) Määritys tapahtui seuraavien yhtälöiden mukaisesti:
Hypoksantiini + H20 + 02 —-—^ ksantiini + H2°2
Ksantiini + H20 + 02 virtsahappo + H202· Määritys tapahtui pH-arvossa 8,0 TRIS-puskuria käyttäen kuten edellä olevissa esimerkeissä on selostettu. Saanto oli 100 % ksantiinia tai hypoksantiinia.
Referenssimenetelmänä käytettiin menetelmää, jota on selostanut H.U. Bergmeyer, ibid, s. 1988.
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
DE2633728A DE2633728C3 (de) | 1976-07-27 | 1976-07-27 | NADH-Peroxidase, ihre Gewinnung und Verwendung |
DE2633728 | 1976-07-27 |
Publications (3)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
FI772186A FI772186A (fi) | 1978-01-28 |
FI56845B FI56845B (fi) | 1979-12-31 |
FI56845C true FI56845C (fi) | 1980-04-10 |
Family
ID=5984055
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
FI772186A FI56845C (fi) | 1976-07-27 | 1977-07-13 | Foerfarande foer framstaellning av nadh-peroxidas |
Country Status (9)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US4186052A (fi) |
JP (1) | JPS5814198B2 (fi) |
CH (1) | CH636904A5 (fi) |
DE (1) | DE2633728C3 (fi) |
FI (1) | FI56845C (fi) |
FR (1) | FR2359850A1 (fi) |
GB (1) | GB1528309A (fi) |
IT (1) | IT1081816B (fi) |
NL (1) | NL188045C (fi) |
Families Citing this family (13)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
DE2806371A1 (de) * | 1978-02-10 | 1979-08-23 | Guenther Kohlbecker | Verfahren zur enzymatischen bestimmung von oxalat mittels oxalat-oxidase |
GB2015532B (en) * | 1978-02-27 | 1982-06-16 | Yamasa Shoyu Kk | -lysine -oxidase |
EP0007176A3 (en) * | 1978-06-12 | 1980-02-20 | Cetus Corporation | Method for producing epoxides and glycols from alkenes |
US4341868A (en) | 1978-08-18 | 1982-07-27 | Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. | Method and test composition for the determination of the substrate for xanthine oxidase |
DE2965849D1 (en) * | 1978-08-18 | 1983-08-18 | Kyowa Hakko Kogyo Kk | Method and test composition for the determination of a substrate for xanthine-oxidase, including a novel xanthine-oxidase and method for the preparation thereof |
DE3477812D1 (en) * | 1983-01-12 | 1989-05-24 | Alcoholism & Drug Addiction | Rapid analysis of ethanol in body fluids |
DE3313178A1 (de) * | 1983-04-12 | 1984-10-18 | Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim | Verfahren zur enzymatischen bestimmung von sulfit |
JPS59205999A (ja) * | 1983-05-10 | 1984-11-21 | Wako Pure Chem Ind Ltd | 還元型補酵素の定量方法 |
JPS6131097A (ja) * | 1984-07-23 | 1986-02-13 | Toyo Jozo Co Ltd | 新規な高感度酵素的測定法 |
JPS62140999A (ja) * | 1985-12-16 | 1987-06-24 | 川鉄機材工業株式会社 | 重量物懸吊装置 |
DE3725851A1 (de) * | 1986-08-12 | 1988-02-18 | Takara Shuzo Co | Nad(p)h-oxidase, verfahren zu ihrer isolierung und anwendung |
US5385827A (en) * | 1989-09-20 | 1995-01-31 | Clark; John R. | Method of geochemical prospecting |
EP3212608B1 (en) * | 2014-10-31 | 2020-12-30 | Rohm and Haas Company | Oxidative esterification process for making methyl methacrylate |
Family Cites Families (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
IT986838B (it) * | 1972-05-12 | 1975-01-30 | Sclavo Inst Sieroterapeut | Complesso di reagenti per la deter minazione enzimatica del glucosio sistema glucosio ossidasi perossi dasi con metodo manuale e automati co con lettura a termine o in cinetica |
-
1976
- 1976-07-27 DE DE2633728A patent/DE2633728C3/de not_active Expired
-
1977
- 1977-06-07 IT IT24454/77A patent/IT1081816B/it active
- 1977-06-09 NL NLAANVRAGE7706337,A patent/NL188045C/xx not_active IP Right Cessation
- 1977-06-29 US US05/811,422 patent/US4186052A/en not_active Expired - Lifetime
- 1977-07-13 FI FI772186A patent/FI56845C/fi not_active IP Right Cessation
- 1977-07-22 CH CH913877A patent/CH636904A5/de not_active IP Right Cessation
- 1977-07-25 GB GB31143/77A patent/GB1528309A/en not_active Expired
- 1977-07-27 JP JP52090216A patent/JPS5814198B2/ja not_active Expired
- 1977-07-27 FR FR7723161A patent/FR2359850A1/fr active Granted
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CH636904A5 (de) | 1983-06-30 |
US4186052A (en) | 1980-01-29 |
FR2359850B1 (fi) | 1980-04-18 |
DE2633728C3 (de) | 1979-07-12 |
NL7706337A (nl) | 1978-01-31 |
NL188045C (nl) | 1992-03-16 |
JPS5814198B2 (ja) | 1983-03-17 |
DE2633728B2 (de) | 1978-10-05 |
NL188045B (nl) | 1991-10-16 |
FI56845B (fi) | 1979-12-31 |
GB1528309A (en) | 1978-10-11 |
FI772186A (fi) | 1978-01-28 |
JPS5315492A (en) | 1978-02-13 |
FR2359850A1 (fr) | 1978-02-24 |
IT1081816B (it) | 1985-05-21 |
DE2633728A1 (de) | 1978-02-02 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US4554249A (en) | Method for the quantitative determination of physiological components in biological fluids | |
Verduyn et al. | Colorimetric alcohol assays with alcohol oxidase | |
Sedewitz et al. | Purification and biochemical characterization of pyruvate oxidase from Lactobacillus plantarum | |
FI56845C (fi) | Foerfarande foer framstaellning av nadh-peroxidas | |
EP2380989B1 (en) | Method and reagent for determining mevalonic acid, 3-hydroxymethylglutaryl-coenzyme a and coenzyme a | |
US4273874A (en) | Acidic uricase and process for production thereof | |
Baich | The biosynthesis of proline in Escherichia coli phosphate-dependent glutamate γ-semialdehyde dehydrogenase (NADP), the second enzyme in the pathway | |
Poels et al. | NAD (P)+‐independent aldehyde dehydrogenase from Pseudomonas testosteroni: A novel type of molybdenum‐containing hydroxylase | |
Malavolti et al. | Determination of cholesterol with a microporous membrane chemiluminescence cell with cholesterol oxidase in solution | |
US4657856A (en) | Glutathione peroxidase, process for production thereof, method and composition for the quantitative determination of lipid peroxide | |
JPS6122952B2 (fi) | ||
CZ280350B6 (cs) | Způsob výroby pyruvátoxidázy | |
JPS63245672A (ja) | 新規なモノグリセリドリパ−ゼ、その製法およびそれを用いる分析法 | |
KR890004091B1 (ko) | 과산화 수소를 형성하는 살코신 산화효소 및 그 제법 | |
US4636464A (en) | Pyranose oxidase, method of making and method of use | |
JP2647684B2 (ja) | トリグリセリドの分析用試薬および分析方法 | |
US4229529A (en) | Process for determining formate and reagent therefor | |
US20210238562A1 (en) | Flavin-conjugated glucose dehydrogenase | |
JP2872983B2 (ja) | 1,5−アンヒドログルシトールの定量法及び定量用試薬 | |
US5082770A (en) | Method for quantitative determination of polyamines | |
JP3819094B2 (ja) | 1,5−アンヒドログルシトール脱水素酵素、その製造法及びこれを用いる1,5−アンヒドログルシトールの定量法 | |
JPH0661278B2 (ja) | ミオイノシトールの高感度定量法および定量用組成物 | |
CA1218586A (en) | Method for the quantitative determination of physiological components in biological fluids | |
JP3490184B2 (ja) | 新規N−アルキルグリシンオキシダーゼ、その製造方法、この酵素を用いたNε−カルボキシメチルリジンの定量用試薬及びその定量方法 | |
JP2886846B2 (ja) | 1,5−アンヒドログルシトール脱水素酵素及びその製造法 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
MM | Patent lapsed | ||
MM | Patent lapsed |
Owner name: BOEHRINGER MANNHEIM GMBH |