[go: up one dir, main page]
More Web Proxy on the site http://driver.im/

FI56845C - Foerfarande foer framstaellning av nadh-peroxidas - Google Patents

Foerfarande foer framstaellning av nadh-peroxidas Download PDF

Info

Publication number
FI56845C
FI56845C FI772186A FI772186A FI56845C FI 56845 C FI56845 C FI 56845C FI 772186 A FI772186 A FI 772186A FI 772186 A FI772186 A FI 772186A FI 56845 C FI56845 C FI 56845C
Authority
FI
Finland
Prior art keywords
nadh
enzyme
determination
oxidase
reaction
Prior art date
Application number
FI772186A
Other languages
English (en)
Other versions
FI56845B (fi
FI772186A (fi
Inventor
Albert Roeder
Hans Moellering
Wolfgang Gruber
Klaus Beaucamp
Hans Seidel
Peter Stahl
Detlef Von Hoerschelmann
Original Assignee
Boehringer Mannheim Gmbh
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Boehringer Mannheim Gmbh filed Critical Boehringer Mannheim Gmbh
Publication of FI772186A publication Critical patent/FI772186A/fi
Publication of FI56845B publication Critical patent/FI56845B/fi
Application granted granted Critical
Publication of FI56845C publication Critical patent/FI56845C/fi

Links

Classifications

    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0065Oxidoreductases (1.) acting on hydrogen peroxide as acceptor (1.11)
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12QMEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/26Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase
    • C12Q1/28Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase involving peroxidase

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)

Description

r_, /44, KU ULUTUSJULKAISU rcQAC
(11) UTLÄGGNINGSSKRIFT 56845 C (45) Patentti myönnetty 10 04 1930 Patent meddelat v v (51) Ky.Mc.*/tnt.ci.' C 07 G 7/028 G 01 N 33/16 G 01 N 3V14 £ Q |y| | _ FINLAND (21) P*t«nttlh»k«mus — Pat«nUn*ekning 772136 (22) Hakamitpiivi — Aruöknlngtdag 13.07.77 ^ ^ (23) Alku pilvi—Glttlghatsdag 13.07.77 (41) Tullut julkltakal — Bllvit offtntllg 28.01.78
Patentti· ja rekiitarihallitus Nihtivildpwon ]. kuul.iuilul.un pvm. -
Patent· och registerstyrelsen ' An tukan utlagd och utl.*krlft«n publicerad 31.12.79 (32)(33)(31) Pyyd«*y «tuolkaut —Begird prlorltet 27.07.76
Saksan Liittotasavalta-Förbundsrepubliken Tyskland(DE) P 2633728.0 (71) Boehringer Mannheim GmbH., Sandhofer Strasse 112-132, 6800 Mannheim-Waldhof, Saksein Liittoasavalta-Förbundsrepubliken Tyskland(DE) (72) Albert Röder, Seeshaupt, Hans Möllering, Tutzing, Wolfgang Gruber, Tutzing-Unterzeismering, Klaus Beaucamp, Tutzing, Hans Seidel, Tutzing, Peter Stahl, Bernried, Detlef von Hoerschelmann, Wielenbach,
Saksan Liittotasavalta-Förbundsrepubliken Tyskland(DE) (7*+) Berggren Oy Ab (5*0 Menetelmä NADH-peroksidaasin valmistamiseksi - Förfarande för fram-ställning av NADH-peroxidas
Keksintö koskee menetelmää Streptomyces faecium ATCC 8043:n tuottaman NADH-peroksidaasin valmistamiseksi, eristämiseksi ja puhdistamiseksi, joka entsyymi erilaisten ominaisuuksien osalta eroaa tunnetusta NADH-peroksidaasista.
Lukuisten tärkeiden aineiden kuten glukoosin, virtsahapon, koleste-riinin, aminohappojen, alkoholien ja näiden kaltaisten aineiden määritykset suoritetaan entsymaattisesti käyttämällä oksidaaseja, jotka muodostavat tässä reaktiossa H2^2:ta* Tämän määritys suoritetaan sen jälkeen erilaisin menetelmin, kuten hapettamalla kromogeenia, hapettamalla alkoholeja katalaaseilla (Hantz'in reaktio), aldehydidehyd-rogenaasilla jne. Kaikilla näillä tunnetuilla indikaattorireaktioil-la on varjopuolensa. Siten lääkeaineet häiritsevät kromogeenien pe-roksidointia, Hantz'in reaktiota käyttäen suoritettava osoittaminen vaatii hyvin pitkän reaktioajan, reaktion ohjaaminen vuorostaan alde-hydi-dehydrogenaasin avulla on monimutkaista ja entsyymi on hyvin epästabiili. Tämän vuoksi tarvitaan sellainen yksinkertainen menetelmä H2C>2:n osoittamiseksi, johon ei liittyisi näitä varjopuolia ja jota voitaisiin käyttää erityisesti nyös spesifisten oksidaasien yhteydessä.
Olisi ihanteellista, jos Η2θ2:η muodostumiseen johtava spesifinen ok-sidaasireaktio voitaisiin yhdistää entsymaattiseen määritykseen lä- 2 56845 hinnä käytettävään NADH-reaktioon (NADH = nikotiiniamidi-adeniini-dinukleotidi pelkistetyssä muodossa). Jo nyt on tiedossa eräs NADH-peroksidaasi, joka katalysoi reaktiota.
NADH + H+ + H202 —QP-) NAD+ + 2 HjO
ABB, 5j>, 415 (1955): JBC, 225, 557 (1957). Tämä entsyymi, jonka EC-numero on 1.11.1.1 läydettiin Streptococcus faecium 10 C I - ja Lactobacillus casei-liuoksista ja sille ovat ominaisia pH-optimi kohdalla 5,4 sekä Michaelis-vakiot KM H202:n osalta 2 x 10-4 ja NADH:n osalta 1,4 x 10 Useiden oksidaasien osalta ovat sopivia vain al-kaalisella alueella suoritetut reaktiot. Tunnettu NADH-peroksIdaasi on kuitenkin jo pH-arvossa 7,0 käytännöllisesti katsoen inaktiivinen (Arch. Biochem. Biophys. 111, 535 (1965)). Näin ollen ei entsyymi epäedulliset Michaelis-vakiot huomioonottaen sovellu käytännössä H202:n määrittämiseen spesifisen oksidaasin kanssa tapahtuvassa yh-teisreaktiossa.
Nyttemmin on löydettu uusi NADH-peroksIdaasi, jolla ei ole tunnetun NADH-peroksidaasin varjopuolia ja josta se erottuu selvästi, ja joka soveltuu erinomaisesti käytettäväksi entsymaattiseen H202-määrityk-seen, erityisesti spesifisen oksidaasin yhteydessä tapahtuvassa yh-teisreaktiossa. Keksinnön kohteena on sen vuoksi menetelmä NADH-pe-roksidaasin valmistamiseksi, joka H202:n kanssa hapettaa NADH:n NAD:ksi ja H20:ksi ja keksinnön mukainen menetelmä on tunnettu siitä, että Streptococcus faecium ATCC 8043;n tuottama entsyymi vapautetaan uuttamalla tai käsittelemällä pinta-aktiivisella aineella, saadun entsyymiliuoksen pH säädetään arvoon 4,2-4,8, liukenematon aines erotetaan, suodos fraktioidaan polyetyleeni-imiinillä ja entsyymi otetaan talteen, jonka entsyymin Michaelis-vakio KM H202:n suhteen on 2,8 x 10 5M ja NADH:n suhteen 1,7 x 10~^M, mitattuna 25°C:ssa 0,2-molaarisessa TRIS-(hydroksimetyyli)-aminometaani-puskurissa pH 6,0, joka sisältää 0,1-moolia kaliumasetaattia/1.
Alhaisesta KM~arvostaan johtuen uusi entsyymi soveltuu oleellisesti paremmin kuin tunnettu entsyymi H202:n määrittämiseen. Mitä suurempi KM-arvo nimittäin on, sitä suuremman on oltava määritystä suoritettaessa myös H202-konsentraation tasapainotilassa. Mitä suurempi H202“ konsentraatio on, sitä suurempi on kuitenkin myös katalaasin vaikutus, jota näytemateriaalissa säännöllisesti on. Katalaasin kilpaillessa H202:sta tulokset kuitenkin ovat harhaanjohtavia.
3 58345
Keksinnön mukainen uusi entsyymi on kuten tunnettu entsyymikin flavo-proteiini ja siten väriltään kellertävä. Entsyymi säilyy glyseriini/ vesiseoksessa 1:1 +4°C:ssa useita kuukausia. Nikotiiniamidi-adeniini-dinukleotidifosfaatti (NADPH) ei voi korvata NADH:ta, päinvastoin kuin tunnettu entsyymi, jonka reaktionopeus NADPH:n kanssa on noin 8 % reaktionopeudesta NADH:n kanssa.
Entsyymin pH-optimi on 6,0 TRIS-puskurissa asetaatti- tai propionaat-ti-ionien läsnäollessa; aktiviteetti natriumasetaatti-puskurissa pH-arvossa 5,4 siis tunnetun entsyymin optimiolosuhteissa on noin 20 % alhaisempi. pH-arvossa 9,0 on aktiviteetti vielä noin 20 % optimi-arvosta .
Keksinnön mukaisesti uutta entsyymiä saadaan Streptococcus faecium ATCC 8043:sta. Valmistus tapahtuu uuttamalla tai käsittelemällä mikro-organismia pinta-aktiivisella aineella, jolloin entsyymi vapautuu, ja voidaan eristää sen jälkeen liuoksesta. Sopiviaeristyanenetelmiä ovat esimerkiksi ultraäänikäsittely, jauhentaminen lasihelmillä tai käsittely suuria leikkausvoimia hyväksikäyttäen. Kaikki nämäeristysmenetel-mät ovat tunnettuja ja niitä käytetään yleisesti mikro-organismeja erotettaessa. Käsittely pinta-aktiivisella aineella tapahtuu lähinnä lämpötilassa välillä 25-60°C. Ensisijainen käsittely tapahtuu 45-55°C: ssa pH-arvon ollessa lievästi happamalla puolella välillä noin 4,5-6,0. Riittävä käsittelyaika on yleensä 15-30 minuuttia, joskin tätä käsit-teluaikaa voidaan haitatta pidentää huomattavasti. Siten saadaan jopa kolmen tunnin vaikutusajalla 55°C:ssa vielä erittäin hyviä saantoja. Käsittelyä pinta-aktiivisilla aineilla pidetään edullisimpana, koska liuokseen tulee tällöin vähemmän epäpuhtauksia kuin mekaanisia murs-kausmenetelmiä käytettäessä ja sen vuoksi saadaan jo alunperin puhtaampaa entsyymiä. Pinta-aktiivisista aineista suositeltavimpia ovat ioni-soitumattomat. Erityisen sopivia ovat polyetyleeniglykoliesterit, esim. alkyyliaryylipolyetyleeniglykoliesterit kuten Triton X-100. Tämän uuttomenetelmän erityisenä etuna on myös se, että häiritsevän NADH-oksidaasin pitoisuus on tällöin erityisen vähäinen.
Entsyymien talteenottamiseksi liuoksista poistetaan liukenemattomat aineet, esim. sentrifugoimalla, ja saadusta kirkkaasta päällä olevasta kerroksesta voidaan saostaa entsyymiä sisältävä proteiinifraktio.
GG845
Saostamiseen soveltuvat tähän tarkoitukseen biokemiassa yleisesti käytettävät keinot kuten suolaaminen, esim. ammoniumsulfaatilla, saostaminen orgaanisilla liuottimilla kuten asetonilla tai metano-lilla tai saostaminen polyioneilla kuten polyetyleeni-iminillä.
Raa'an entsyymipreparaatin lisäpuhdistus voi tapahtua esimerkiksi kromatografoimalla adsorptioaineella kuten karboksimetyyliselluloo-salla, verkkoutuneella dekstraanilla tai ionivaihtajalla.
Lisäksi on osoittautunut, että entsyymi voidaan vapauttaa seuralais-aineistaan myös käsittelemällä hapolla. Happokäsittely tapahtuu tar-koituksenmukaisimmin pH-arvossa 4,2 - 4,8 10-25 minuutin aikana.
Suositeltava puhdistusmenetelmä on tämän vuoksi entsyymin vesiliuoksen pH:n säätäminen välille 4,2 - 4,8, liukenemattoman aineksen erottaminen ja päällä olevassa kerroksessa olevan entsyymin fraktioiminen polyetyleeni-iminillä.
Kaikki talteenottomenetelmän vaiheet suoritetaan puskuroidussa liuoksessa. Erityisen sopivia puskureita ovat tällöin fosfaattipuskuri, TRIS-puskuri ja asetaattipuskuri, käyttökelpoisia ovat kuitenkin myös muut tavanomaiset puskurit kuten glysiinipuskuri ja boraatti-sitraat-ti-puskuri.
Keksinnön mukaista uutta NADH-peroksidaasia voidaan käyttää ^Ojsn määrittämiseen yksinkertaisessa reaktiossa tai yhteisreaktiossa spesifisen oksidaasin kanssa. Määritys tapahtuu tarkoituksenmukaisesti pH-arvossa 6,0 - 9,0. Tällä tavalla on mahdollista kytkeä spesifinen oksidaasireaktio NADH-NAD-reaktion mittaamiseen. Jälkimmäistä reaktiota voidaan tunnetusti seurata erityisen yksinkertaisella tavalla määrittämällä ekstinktiomuutos, joka on verrannollinen NADH-konsentraation muutokseen.
"Spesifisellä oksidaasilla" tarkoitetaan keksinnön puitteissa entsyymejä, jotka reagoivat määrättyjen substraattien ja 02:n kanssa muodostaen H202:ta.
Spesifisinä oksidaaseina käytetään keksinnön puitteissa lähinnä glu-koosioksidaasia, D-aminohappo-oksidaasia, L-aminohappo-oksidaasia, kolesteriinioksidaasia, alkoholioksidaasia, urikaasia ja 56845 ksantiinioksidaasia. Tämän mukaisesti yhteisreaktion yhteydessä voidaan määrittää glukoosi, D-aminohappoja kuten D-alaniini, L-aminohappo ja kuten L-leusiini, kolestriini ja kolestriiniestereitä, pienimolekyylisiä alkoholeja, virtsahappo, ksantiini ja hypoksantiini. Yksinkertaisessa reaktiossa voidaan määrittää 1^02 sellaisenaan eikä siis vain välituotteena, kuten oksidaasi-systeemin läsnäollessa.
Keksinnön mukaan valmistetun NADH-peroksidaasin määrittäminen voidaan suorittaa edullisesti seuraavan kokeen mukaisesti: 2,68 ml TRIS-kaliumasetaattipuskuri (0,2 moolia TRIS + 0,15 moolia kaliumasetaattia): 2,42 g TRIS-puskuria + 1,42 g kaliumase-„ taattia liuotetaan 70 ml:aan I^O:ta, pH säädetään 2n etik- kahapolla arvoon 6,0, ja tilavuus säädetään H20:lla 100 ml: ksi.
0,20 ml NADH (6 mmoolia) : 5 mg NADH: ta liuotetaan 1 ml:aan H20:ta.
0,02 ml Näyte NADH-POD.
Sekoitetaan, 365 nm:ssä, d = 1 cm, 25°C, rekisteröidään esi-jae ΔΕ/min. Tätä esijaetta (ekstinktion vähentyminen) käytetään "NADH-oksidaasin" laskemiseen.
Koe aloitetaan käyttämällä 0,10 ml H2°2 mmoolia (0,05 ml 30-prosenttista H2C>2:ta laimennetaan 10 ml:11a H20:ta)) sekoitetaan, määritetään ekstinktion muutos/min (ΔΕ/min).
Ennen NADH-POD-aktiivisuuden laskemistaΔE/min:sta vähennetään NADH-oksidaasi-esijae.
Ensisijaisesti käytetään TRIS-asetaatti-puskuria, vaikkakaan NADH-POD:n " käyttäminen ei rajoitu tähän puskurisysteemiin. H202:n määrittäminen NADH-POD:n kanssa voidaan suorittaa mm: käyttämällä puskurisysteeminä natriumasetaattia, piperatsiinia, kaliumfosfaattia, kaliumdifosfaat-tia, boraatti/sitraattia, glysyyli-glysiiniä, trietanoliamiini ' HCl:a tai HEPES'iä (N-2-hydroksietyylipiperatsiini-N-etaani-sulfonihappoa).
Vastaavalla tavalla voidaan suorittaa myös H202~määritys, jolloin NADH-POD:tä lisätään ylimäärin ja määrätään H202“määrä, joka vastaa ekstinktiomuutosta. Määritys voi tapahtua päätepistemenetelmällä tai kineettisesti, so. määrittämällä ekstinktioero määrätyn lyhyen aikavälin kuluessa. Oheinen piirros esittää H202~määrityksen tarkkuutta 6 *06845 ja siihen kulunutta aikaa pH:n ollessa 8,0 edellä selostetussa TRIS-kaliumasetaatti-puskurissa ja edellä mainituissa määritysolosuhteis-sa. Tässä esittävät:
Kuva 1 kalibrointikäyrää, jossa I^C^-määrä (abskissa) on esitetty ekstinktioeron (ordinaatta) funktiona,
Kuva 2 ekstinktion väheneminen ajan funktiona 25°C:ssa. Alussa lisättiin 0,4^umoolia H202:ta.
Piirroksen molemmista käyristä voidaan todeta keksinnön mukaan valmistetun entsyymin käyttökelpoisuus H202:n kvantitatiiviseen määritykseen. Seuraava esimerkki selventää keksintöä.
Esimerkki 1
Entsyymin valmistus ja puhdistus
Streptococcus faecalis ATCC 8043 biomassaa lämmitetään 1-prosentti-sen TRITON X 100-liuoksen kanssa 0,02-mol. kaliumfosfaattipuskurissa, pH = 5,0, 30 minuuttia 55°C:ssa. Sen jälkeen jäähdytetään 4°C:seen ja liukenematon osa erotetaan. Saadaan vesiliuosta, jonka aktiivisuus on 1,77 yks./ml ja spesifinen aktiivisuus 0,77 yks./mg.
Saatuun liuokseen lisätään ammoniumsulfaattia kunnes koko entsymaatti-nen aktiivisuus on sakassa. Sakka suodatetaan erilleen, liuotetaan fosfaattipuskuriin (pH = 5,0) ja suola poistetaan molekyyliseulaa käyttäen. Näin saatua entsyymiliuosta voidaan käyttää H202~kokee-seen suoraan tai konsentroimalla se ensin lyofilisoimalla ja liuottamalla 3,0-mol. ammoniumsulfaattiliuokseen, pH = noin 7.
Lähtöliuoksen lisäpuhdistus entsyymiä ensin eristämättä tapahtuu tarkoituksenmukaisesti saostamalla ammoniumsulfaatilla seuraavalla tavalla:
Liuoksen pH säädetään etikkahapolla arvoon 4,4 ja annetaan olla paikoillaan 20 minuuttia. Sen jälkeen liukenematon aines suodatetaan pois. Päällä olevaan osaan lisätään annoksittain polyetyleeni-imini-liuosta ja kulloinkin ilmaantuva liukenematon osa suodatetaan pois. Entsyymin sisältävä fraktio liuotetaan uudelleen puskuriin ja kroma-tografoidaan käyttämällä dietyyliaminoetyyliselluloosaa. Tämän jälkeen poistetaan suola käyttämällä verkkoutettua dekstraania. Näin saadaan valmistetta, jonka aktiivisuus on noin 45 yks./mg.
Gö845 NADH-POD :n aktiivisuuden riippuvuus kokeessa käytettävästä puskurista Määritykset suoritetaan 0,1-mol. puskureissa (1 mmooli ®'4 iranoolia NADH) .
Taulukko 1
Entsyymiaktiivisuudet, pH:n ollessa 7,5, prosentteina eri puskureissa, verrattuna aktiivisuuteen natriumasetaatti-puskurissa (= 100 %)
Puskuri %
Natriumasetaatti 100 TRIS-asetaatti 101
Trietanoliamiini-asetaatti 100 Piperatsiini. HC1 100 HEPES 89
Kaliumfosfaatti 63
Kaliumdifosfaatti 61
Boraatti/sitraatti . 25
Koesysteemin pH-arvon vaikutus NADH-POD:n aktiivisuuteen Määritykset suoritetaan 0,1-mol. TRIS-asetaattipuskurissa (1 mmooli 0,4 irano°lia NADH).
Taulukko 2
Entsyymiaktiivisuuden riippuvuus pH:sta prosentteina pH % 5.0 67 5.4 98 6.0 100 7.0 88 7.5 56 8.0 37 9.0 19 5GÖ45
Virtsahapon määritys urikaasilla Määritys tapahtuu seuraavan yhtälön mukaisesti: 2H20 + virtsahappo + 02 ur-ka^s-—> allantoiini + H202 + CO.
Urikaasi, keksinnön mukainen NADH-POD ja NADH liuotettiin 0,2-mol. TRIS-asetaatti-puskureihin, joiden pH-arvot olivat erilaiset ja joissa kussakin oli 0,15 moolia kaliumasetaattia. Lähtöliuokseen lisättiin sitten 0,2 ^umoolia virtsahappoa sisältävä vesiliuos. Saatiin seuraavat tulokset:
Taulukko 3 pH Kokeen entsyymimäärä Prosessin päättymi- Saanto, % suhteessa NADH-POD Urikaasi seen kulunut aika UV-kokeeseen = minuuteissa 100 % yks. yks.
6 0,1 1 16 95,5 7 0,1 1 10 99 8 0,1 1 5 100 9 0,1 1 16 96,5 9 0,1 2 10 96,5 10 0,2 0,2 10 98
Referenssimenetelmä: P. Scheibe, E. Bernt ja H.U. Bergmeyer/H.U. Berg-meyer - Methoden der enzymatischen Analyse, Bd. II, 3. painos, s.
1999, (1974).
Taulukko 4
Virtsahapon saanto prosentteina, 0,2 ^umoolia virtsahappoa/koe-erä (Koeolosuhteet: 0,2 moolia TRIS-asetaattia, 0,15 moolia kaliumasetaattia, 0,4 yumoolia NADH, 0,1 yks. NADH-POD, 1 yks. Aspergillus flavus-urikaasia, koetilavuus 3 ml, 25°C, 365 nm), reaktion päättymiseen kulunut aika oli 5 minuuttia, kun pH 8 = 100 %.
pH % 6.0 71 7.0 95 8.0 100 8,5 98 9,0 76 10,0 69 5 6 84 b
Glukoosin määritys glukoosioksidaasilla (GOD) Määritys tapahtuu seuraavan yhtälön mukaisesti: D-glukoosi + 1^0 + ^ glukonaatti + ^2^2' Määritys suoritettiin pH:n ollessa 7,0 käyttämällä 210 yks. GOD, 0,2 yks. NADH-POD ja 60 yks. mutarotaasia. Glukoosin määritys virtsasta antoi 100 % referenssimenetelmällä GOD-Perid R (DE-PS 1.648.840 ja H.U. Bergmeyer, ibid, s. 1257) saadusta arvosta.
D-alaniinin määritys D-aminohappo-oksidaasllla (D-AOD) Määritys tapahtuu seuraavan yhtälön mukaisesti: D-alaniini + O 2 + H2O D-~———> pyruvaatti + NH^ + HjOj.
Määritys suoritettiin pH:n ollessa 8,5 käyttämällä 0,25 yks. NADH-POD: tä, 20 yks. D-AOD, 5 yks. laktaattidehydrogenaasia 25°C:ssa. Inkubaatioajan ollessa 20 minuuttia 25°C:ssa saanto oli 100 %. Referenssimenetelmä: M. Grassl/H.U. Bergmeyer, ibid, s. 1731.
L-leusiinin määritys Crotalus terrificus:ista saadulla L-aminohappo-oksidaasilla (L-AOD) Määritys tapahtuu seuraavan yhtälön mukaisesti: L-leusiini + O2 ^ —) ketoisokapronihappo + ^02«
Suoritus tapahtui pH-arvossa 7,5 - 8,0 TRIS-asetaatti-puskurissa, 0,2 mol., jossa oli 0,15 moolia asetaattia. Lisättäessä kokeessa 0,2 yks. keksinnön mukaista NADH-POD ja 0,7 yks. L-AOD takaisinsaanto oli noin 100 %. L-leusiinin konsentraation ollessa 0,2^umoolia reaktioaika oli noin 20 minuuttia. Referenssimenetelmä: ei tiedossa.
Kolesteriiniesteri-määritys kolesterolioksidaasilla ja kolesteroll-esteraasilla Määritys tapahtuu seuraavien yhtälöiden mukaisesti: 1) Rolesteroliesteri + H2O kolester.es terääsi—^kolesteroli + rasva happo ... . . . . Λ Kolester .oksidaasi s. , „ ^ 2) Kolesteroli + O2--? kolesteroni + H2O2.
10 56845 Määrityksissä käytettiin standardi-kolesteroliliuoksia ja -seerumia. Saanto käytettäessä standardiliuosta, jossa oli 0,2^umoolia kolesterolia, oli 98-102 % pH-arvossa 6,0 - 9,0 9-12 minuutin aikana. Tällöin käytettiin 0,1 yks. NADH-POD, 2 yks. kolesterolioksidaasia 3 ml:n koetilavuudessa.
Seerumin kolesterolimääritys antoi saippuoitaessa esteröity koleste-roliosuus KOH:n etanoliliuoksella saantoarvoiksi 95-105 %. Referenssimenetelmä: P. Roeschlau, E. Bernt ja W. Gruber/H.U. Berg-meyer, ibid, s. 1938 (1974).
Alkoholien määritys metanoli-oksidaasilla (MOD) Määritys tapahtui seuraavan yhtälön mukaisesti:
Metanoli + 02 —> formaldehydi + HjC^.
Määritys suoritettiin pH-arvossa 9,0 - 9,5 glysiini-Na-pyrofosfaat-tipuskurissa lisäämällä semikarbatsidia. Käytetyt entsyymimäärät olivat 0,3 yks. NADH-POD ja 8 yks. MOD. Kun metanolia ja etanolia oli läsnä 0,2yumoolia, saanto oli noin 100 %. Määritys voitiin suorittaa myös käytettäessä isopropanolia.
Ksantiinin ja hypoksantiinin määritys ksantiinioksidaasilla (XOD) Määritys tapahtui seuraavien yhtälöiden mukaisesti:
Hypoksantiini + H20 + 02 —-—^ ksantiini + H2°2
Ksantiini + H20 + 02 virtsahappo + H202· Määritys tapahtui pH-arvossa 8,0 TRIS-puskuria käyttäen kuten edellä olevissa esimerkeissä on selostettu. Saanto oli 100 % ksantiinia tai hypoksantiinia.
Referenssimenetelmänä käytettiin menetelmää, jota on selostanut H.U. Bergmeyer, ibid, s. 1988.
FI772186A 1976-07-27 1977-07-13 Foerfarande foer framstaellning av nadh-peroxidas FI56845C (fi)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE2633728A DE2633728C3 (de) 1976-07-27 1976-07-27 NADH-Peroxidase, ihre Gewinnung und Verwendung
DE2633728 1976-07-27

Publications (3)

Publication Number Publication Date
FI772186A FI772186A (fi) 1978-01-28
FI56845B FI56845B (fi) 1979-12-31
FI56845C true FI56845C (fi) 1980-04-10

Family

ID=5984055

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
FI772186A FI56845C (fi) 1976-07-27 1977-07-13 Foerfarande foer framstaellning av nadh-peroxidas

Country Status (9)

Country Link
US (1) US4186052A (fi)
JP (1) JPS5814198B2 (fi)
CH (1) CH636904A5 (fi)
DE (1) DE2633728C3 (fi)
FI (1) FI56845C (fi)
FR (1) FR2359850A1 (fi)
GB (1) GB1528309A (fi)
IT (1) IT1081816B (fi)
NL (1) NL188045C (fi)

Families Citing this family (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE2806371A1 (de) * 1978-02-10 1979-08-23 Guenther Kohlbecker Verfahren zur enzymatischen bestimmung von oxalat mittels oxalat-oxidase
GB2015532B (en) * 1978-02-27 1982-06-16 Yamasa Shoyu Kk -lysine -oxidase
EP0007176A3 (en) * 1978-06-12 1980-02-20 Cetus Corporation Method for producing epoxides and glycols from alkenes
US4341868A (en) 1978-08-18 1982-07-27 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Method and test composition for the determination of the substrate for xanthine oxidase
DE2965849D1 (en) * 1978-08-18 1983-08-18 Kyowa Hakko Kogyo Kk Method and test composition for the determination of a substrate for xanthine-oxidase, including a novel xanthine-oxidase and method for the preparation thereof
DE3477812D1 (en) * 1983-01-12 1989-05-24 Alcoholism & Drug Addiction Rapid analysis of ethanol in body fluids
DE3313178A1 (de) * 1983-04-12 1984-10-18 Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim Verfahren zur enzymatischen bestimmung von sulfit
JPS59205999A (ja) * 1983-05-10 1984-11-21 Wako Pure Chem Ind Ltd 還元型補酵素の定量方法
JPS6131097A (ja) * 1984-07-23 1986-02-13 Toyo Jozo Co Ltd 新規な高感度酵素的測定法
JPS62140999A (ja) * 1985-12-16 1987-06-24 川鉄機材工業株式会社 重量物懸吊装置
DE3725851A1 (de) * 1986-08-12 1988-02-18 Takara Shuzo Co Nad(p)h-oxidase, verfahren zu ihrer isolierung und anwendung
US5385827A (en) * 1989-09-20 1995-01-31 Clark; John R. Method of geochemical prospecting
EP3212608B1 (en) * 2014-10-31 2020-12-30 Rohm and Haas Company Oxidative esterification process for making methyl methacrylate

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
IT986838B (it) * 1972-05-12 1975-01-30 Sclavo Inst Sieroterapeut Complesso di reagenti per la deter minazione enzimatica del glucosio sistema glucosio ossidasi perossi dasi con metodo manuale e automati co con lettura a termine o in cinetica

Also Published As

Publication number Publication date
CH636904A5 (de) 1983-06-30
US4186052A (en) 1980-01-29
FR2359850B1 (fi) 1980-04-18
DE2633728C3 (de) 1979-07-12
NL7706337A (nl) 1978-01-31
NL188045C (nl) 1992-03-16
JPS5814198B2 (ja) 1983-03-17
DE2633728B2 (de) 1978-10-05
NL188045B (nl) 1991-10-16
FI56845B (fi) 1979-12-31
GB1528309A (en) 1978-10-11
FI772186A (fi) 1978-01-28
JPS5315492A (en) 1978-02-13
FR2359850A1 (fr) 1978-02-24
IT1081816B (it) 1985-05-21
DE2633728A1 (de) 1978-02-02

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US4554249A (en) Method for the quantitative determination of physiological components in biological fluids
Verduyn et al. Colorimetric alcohol assays with alcohol oxidase
Sedewitz et al. Purification and biochemical characterization of pyruvate oxidase from Lactobacillus plantarum
FI56845C (fi) Foerfarande foer framstaellning av nadh-peroxidas
EP2380989B1 (en) Method and reagent for determining mevalonic acid, 3-hydroxymethylglutaryl-coenzyme a and coenzyme a
US4273874A (en) Acidic uricase and process for production thereof
Baich The biosynthesis of proline in Escherichia coli phosphate-dependent glutamate γ-semialdehyde dehydrogenase (NADP), the second enzyme in the pathway
Poels et al. NAD (P)+‐independent aldehyde dehydrogenase from Pseudomonas testosteroni: A novel type of molybdenum‐containing hydroxylase
Malavolti et al. Determination of cholesterol with a microporous membrane chemiluminescence cell with cholesterol oxidase in solution
US4657856A (en) Glutathione peroxidase, process for production thereof, method and composition for the quantitative determination of lipid peroxide
JPS6122952B2 (fi)
CZ280350B6 (cs) Způsob výroby pyruvátoxidázy
JPS63245672A (ja) 新規なモノグリセリドリパ−ゼ、その製法およびそれを用いる分析法
KR890004091B1 (ko) 과산화 수소를 형성하는 살코신 산화효소 및 그 제법
US4636464A (en) Pyranose oxidase, method of making and method of use
JP2647684B2 (ja) トリグリセリドの分析用試薬および分析方法
US4229529A (en) Process for determining formate and reagent therefor
US20210238562A1 (en) Flavin-conjugated glucose dehydrogenase
JP2872983B2 (ja) 1,5−アンヒドログルシトールの定量法及び定量用試薬
US5082770A (en) Method for quantitative determination of polyamines
JP3819094B2 (ja) 1,5−アンヒドログルシトール脱水素酵素、その製造法及びこれを用いる1,5−アンヒドログルシトールの定量法
JPH0661278B2 (ja) ミオイノシトールの高感度定量法および定量用組成物
CA1218586A (en) Method for the quantitative determination of physiological components in biological fluids
JP3490184B2 (ja) 新規N−アルキルグリシンオキシダーゼ、その製造方法、この酵素を用いたNε−カルボキシメチルリジンの定量用試薬及びその定量方法
JP2886846B2 (ja) 1,5−アンヒドログルシトール脱水素酵素及びその製造法

Legal Events

Date Code Title Description
MM Patent lapsed
MM Patent lapsed

Owner name: BOEHRINGER MANNHEIM GMBH