FI106202B - Menetelmä lääkeaineina käyttökelpoisten foetidiinien 1 ja 2 valmistamiseksi - Google Patents

Description

106202

Menetelmä lääkeaineina käyttökelpoisten foetidiinien 1 ja 2 valmistamiseksi Förfarande för framställning av som läkemedel användbara foetidin 1 och 2 5

Esillä oleva keksintö liittyy uusiin alkaloideihin Mappia foetida:sta, niiden terapeuttiseen käyttöön ja formulointeihin, jotka sisältävät niitä.

10

Esillä olevan keksinnön mukaisilla alkaloideilla on seuraava kaava (I):

R

15 /Π-f

12 1 II L

ηΙΙ^^λχ:οοη3 _ r «> HO *ΐ 0 ·%Α, *' I)

Il h ir H

··· · ny ^ ^ u* λ*' I O »' ]* • ;i' « Jr

HO

I.. foetidiini 1:R = H

• · · *· foetidiini 2:R = OCH3 :···; 30 Käsittelemällä hapoilla tai emäksillä, tai hydrolyyttisillä entsyymeillä, foetidiinit 1 ja • · : 2 vapauttavat kvanttitatiivisesti joko tunnettua kampotesiinialkaloidia, joka on • « • « · *. molekyyli, jota on laajasti testattu farmakologisesti ja kliinisesti, sellaisenaan tai 2 106202 johdannaistensa muodossa, ontologian alalla ja joidenkin virustautien hoidon yhteydessä tai vastaavasti 9-metoksi-kampotesiini-alkaloidia, jota voidaan käyttää samalla tavalla.

5 Kemialliselta rakenteeltaan läheisiä hyvän vesiliukoisuuden omaavia kampotesiinin johdannaisia on kuvattu suomalaisessa patenttijulkaisussa 89932, patenttihakemuksessa 924878 sekä julkaisussa Journal of Medicinal Chemistry 34(1991) : 1 s. 98 - 107. Näissä julkaisussa esitetyt yhdisteet, jotka poikkeavat kemialliselta rakenteeltaan huomattavasti keksinnön mukaisista yhdisteistä, valmistetaan käyttäen monivaiheisia 10 ja työläitä synteettisiä menetelmiä. Keksinnön mukaisessa menetelmässä valmistetaan rakenteeltaan toisenlaisia kampotesiinijohdannaisia yksinkertaisella uuttomenetelmällä uuttamalla luonnosta saatavaa materiaalia.

Kaavan (II) mukainen kampotesiini 15 9 7 5 ,0r n // I a II b | c n —4nea

N d \lLJ

20 12 1 // \ IA ?5\ E ? (II) "Oh * * ^ I o *:· W oh ··· • · « * · · * · · 25 eristettiin ensin, yhdessä muiden yhdisteiden kanssa Camptoteca acuminata:sta • · · (Nyssaceae) ja muista kasveista, mm. Mappia foetida (Olinaceae), vaikka viimeksi • · · mainittua on tutkittu kauan jatkunut kemiallinen seulonta löysi yllättäen uusia I · alkaloideja, jotka johtivat kampotesiiniin myös kasvin raakauutteiden käsittelyssä.

30 « « • · * • : Erityisen tärkeä sellainen yhdiste, jolla saadaan kampotesiinia on foetidiini 1, koska ’· sitä on niin runsaasti kasvissa. Sen rakenteen selvittäminen, spektroskopialla ja 3 106202 kemiallisella hajoamisella, johti yhdisteen tunnistamiseen, jolle on tunnusomaista kaksi spermidiiniyksikköä, jotka on esteröity avoimen kumariinihapon kanssa, joka puolestaan on esteröity avoimen kampotesiiniyksikön kanssa (katso kaava Ij.Tätä yhdistettä on kasvin kaikissa osissa, mutta varsinkin jyvissä ja juuressa, määrissä 5 0,1-0,5 %. Kampotesiiniin verrattuna sillä on se etu, että se liukenee helposti veteen lievästi happamassa pH:ssa; kun taas kampotesiini on täysin liukenematon veteen ja kaikkiin biologisesti hyväksyttäviin kantajiin, joten tämän haitan voittamiseksi tehtiin intensiivistä työtä puolisynteettisellä lähestymistavalla.

10 Foetidiinia 1 saadaan uuttamalla kasvin eri osia, joissa on matalan molekyylipainon alifaattisia alkoholeja tai ketoneja, yksinomaan tai sekoitettuna veteen huoneen lämmössä, edullisesti alle 25 °C ja vakuumissa; orgaaninen liuotin poistetaan ja vesipitoinen konsentraatti uutetaan klooratuilla liuottimilla lievästi emäksisten alkaloidien uuttamiseksi, mm. kampotesiini, 9-metoksikampotesiini ja mappisiinit; 15 sen jälkeen vesifaasi uutetaan n-butanolilla tai veteen sekoittumattomilla alkoholeilla, jotka sitten väkevöidään kuivaksi alhaisessa lämpötilassa vakuumissa. Butanoliuutteis-ta jäänyt jäännös puhdistetaan silikageelillä tai sentapaisilla adsorbenteilla, edullisesti metyleenikloridilla ja alifaattisilla alkoholeilla, edullisesti metanolilla tai etanolilla. Edullisesti käytetään seoksia 4:1 - 1:1. Ne fraktiot, jotka sisältävät keksinnön 20 mukaisia alkaloideja yhdistetään, väkevöidään kuivaksi ja jäännös edelleenpuhdiste- • « · taan preparatiivisella HPLC:llä, esimerkiksi, LiChroprep RP8 -kolonnilla ja eluoi- • · *. “· daan metanoli/vesi gradientilla, lähtien metanoli/vesi-suhteesta 1:1 puhtaaseen • · · • · · · : ·’ metanoliin. Alkaloidia sisältävät fraktiot väkevöidään alhaisessa lämpötilassa * · · ··** vakuumissa ja vesipitoinen konsentraatti jäädytyskuivataan. Puhtaat alkaloidit saadaan 25 kiteyttämällä.

• · · • · · ♦ · · ' Tuloksena saatuja yhdisteitä arvioitiin biologisesti ihmisen kasvainsolulinjoilla * ♦ ♦ (munasarja, rinta, paksusuolen osa, keuhko, sen kannalta olivatko ne vastustuskykyi- “ , < ‘ · · * siä muille kasvaimenvastaisille aineille ja vastaaville tai ei) ja joillakin viruskannoil- 30 la. Tosiasiassa kampotesiinilla, tai paremminkin sen johdannaisilla, tiedetään olevan • · i solumyrkky vaikutusta, joka liittyy DNA-topoisomeraasien I ja II inhibointiin.

4 106202

Solumyrkyllisyys, esimerkiksi paksusuolen osan syöpäsolulinjassa, on noin 25 nM. Foetidiinin 1 viruksenvastainen vaikutus, vaikkakin se liittyy kantojen erilaiseen vastustuskykyyn, esiintyy konsentraatioalueella 1—100 ng/ml. Foetidiini 2, joka eroaa foetidiinista 1 niin, että sillä on metoksyyli 9-asemassa, vaikuttaa samantapai-5 sesti. Herpes, sytomegalovirus ja HIV-virukset osoittautuivat olevan herkkiä keksinnön mukaisille alkaloideille.

Keksinnön mukaiset yhdisteet voidaan sisällyttää kaikenlaisiin farmaseuttisiin formulointeihin, mutta ennen kaikkea ne voidaan helposti annostella ruoansulatus-10 kanavan ulkopuolisella reitillä vesiliuoksissa pH-arvossa, joka sopii vereen, aiheuttamatta ongelmia, kuten saostumista tai yhteensopimattomuutta. Formuloinneissa voidaan käyttää kaikkia tavanomaisia farmaseuttisia täyteaineita. Näiden uusien alkaloidien annokset voivat olla alueella 0,5 mg - 200 mg per annos ja terapeuttinen kierto. Noin 50 mg/m^in annokset osoittautuivat olevan ensisijaisen tehokkaita.

15

Seuraavat esimerkit kuvaavat keksintöä lisää rajoitamatta sen piiriä.

Esimerkki 1 - Foetidiinin 1 valmistus Mappia foetida -jyvistä.

20 5 kg hienoksi jauhettuja Mappia foetida -jyviä uutetaan 50 1:11a asetonia kolme ‘ kertaa, sekoittaen huoneen lämmössä;yhdistetyt asetoniuutteet väkevöidään vakuumis- sa 10 l:aan;konsentraatti laimennetaan 10 1:11a 1 %:sta sitruunahappoliuos- : ·* ta;liukenemattomat aineet suodatetaan ja erotetaan, kun taas vesiasetonifaasi vastau- ·« · •••j utetaan metyleenikloridilla loppuun alkaloidilla uutettaviin aineisiin (kampotesiini, • · · « · · * 25 metoksikampotesiini, jne.); vesiasetonifaasi väkevöidään vedeksi ja konsentraatti ... uutetaan, neutralisoinnin jälkeen pH-arvossa 7,5, n-butanonilla loppuun asti foetidii- • # * • « · .. # neissä 1 ja 2. n-Butanoliliuos väkevöidään ja jäännös kuivataan, jolloin saadaan noin • · · 200 g butanolifraktiota, joka fraktioidaan seuraavalla tavalla: 30 g butanolifraktiota • * ’·*’ kromatografioidaan 500 g:lla silikageeliä, eluoidaan kolonni ensin metyleeniklori- 30 di/metanoli:n 4:1 seoksella, sen jälkeen samojen liuottimien 7:3 seoksella. Fraktiossa « « : oleva tuote, joka eluoitiin 7:3 seoksella, puhdistetaan LiChroprep RP8 kolonnilla, *\ *: eluoimalla metanoli/vesi gradientilla. Fraktiot, jotka sisältävät foetidiinejä 1 ja 2 5 106202 yhdistetään ja väkevöidään kuivaksi vakuumissa lämpötilassa alle 30 °C ja jäännös kiteytetään asetoni/heksaanista.5,1 g foetidiiniä 1 saadaan, jolla on seuraavat ominaisuudet: s.p. 157— °C; ad = -37,9 (c = 0,31, MeOH).

5 *H-NMR (300 MHz, DMSO d6) 8,60 (1H, s, H-7), 8,19 (1H, t, J = 5,2, H-10’), 8,15 (1H, d, J = 8,6, H-12), 8,05 (1H, d, J = 8,6, H-9), 8,04 (1H, t, J = 5,2, H- 19’), 7,80 (1H, t, J = 7,8, H-ll), 7,65 (1H, t, J = 7,8 H-10), 7,35 (2H, d, J = 8,6, H-3’+H-5’), 7,34 (2H, d, J = 8,6, H-24’+H-28’), 7,29 (1H, d, J = 15,8, H-7’), 7,28 (1H, d, J = 15,8, H-22’), 6,76 (4H, d, J = 8,6, H-2’+H-6’+H-25’+H-10 27’), 6,36 (1H, d, J = 15,8, H-8’), 6,35 (1H, d, J = 15,8, H-21’), 5,58, 5,41 (2H, system AB, J = 10,6, H-17), 5,18 (2H, s, H-5), 3,21 (2H, m, H-ll’), 3,13 (2H, m, H-18’), 2,84 (4H, bt, J = 7,2, H-13’+H-15’), 2,02 (1H, m, H-19A), 1,96 (3H, s, CH3CO), 1,90 (1H, m, H-19B), 1,74 (2H, m, H-12’), 1,55 (2H, m, H-16’), 1,46 (2H, m, H-17’), 0,84 (3H, t, J = 7,2, H-18) 15 13C-NMR (78,1 MHz, DMSO d6) δ: 175,23 (s, C-21), 170,81 (s, CH3CO), 166,27 (s, C-9’), 165,83 (s, C-20’), 161,43 (s, C-16a), 159,40 (s, C-l’), 159,14 (s, C-15), 153,50 (s, C-2), 148,36 (s, C-13), 143,56 (s, C-3), 139,37 (d, C-l), 139,06 (d, C-22’), 131,74 (d, C-l), 130,58 (d, C-ll), 130,33 (s, C-6), 129,63 (s, C-3’+C- 20 5’), 129,56 (d, C-24’ +C-28’), 129,40 (d, C-12), 128,83 (d, C-9), 128,23 (s, C-8), v : 127,78 (d, C-10), 126,23 (d, C-4’), 126,13 (s, C-23’), 123,42 (s, C-16), 119,01 (d, « « C-8’), 118,68 (d, C-21’), 116,18 (d, C-2’+C-6’+C-25’+C-27’), 100,68 (d, C-14), • · · · : f 80,28 (d, C-20), 59,87 (t, C-17), 50,45 (t, C-5), 47,23 (t, C-13’), 45,36 (t-C-15’), • · · 38,41 (t, C-18), 36,36 (t, C-ll’), 33,40 (t, C-19), 26,99 (t, C-12’), 26,87 (t, c- • · · 25 17’), 24,04 (t, C-16’), 21,22 (q, CH3CO), 9,29 (q, C-18).

• · · • « · • « · /;♦. Foetidiinin 1 emäliuosten kiteytyksestä puhdistamalla samassa kromatografisessa • · · « eluentissa käänteisfaasissa, saadaan foetidiiniä 2 (1,2 g), jolla on seuraavat ominai- « · ***. suudet:: 30 s.p. 172-174 °C, • * '·} [ ad-44,6 (c 0,35 , MeOH).

• · · ** * NMR-spektri vastaa foetidiinin 1 spektriä, paitsi aromaattisessa renkaassa olevan 6 106202 -OCH3 -ryhmän signaalin osalta kohdassa 3,2 ppm.

Esimerkki 2 - Jäädytyskuivattujen lääkepullojen valmistus, jotka sisältävät foetidiinia 1.

5 5 g foetidiinia 1 liotetaan 500 ml:aan tislattua vettä, jotka sisältävät 1,2 g sitruunahappoa, liuos suodatetaan, steriloidaan ja täytetään steriilissä huoneessa 100:aan lääkepulloon, jotka nopeasti jäädytetään ja jäädytyskuivataan.

I ( < e ' « ( c < t I « «

4 4 C

• · • · · • · · · • · • · • · · 9 ·«·· • 1 · • · 1 • · 1 • · · • · · I I · • · · • · ♦ • · · « a · · x « · • · ♦ · a · 1 « 9 9 ia· · a a a · 1 a aa a a

Claims (3)

7 106202

1. Menetelmä kaavan (I) mukaisten lääkeaineina käyttökelpoisten foetidiinien 1 tai 2 valmistamiseksi 5 R Il 7 'TiTT—f (I) M51 -ifä0 ίο v n ull^i^OCOCHs ie. "f 17 * f%r°^rsr H0 0 J l 15 *- n Il H tf H - ° i rY 2° ho^t • · ·· ♦ ·♦♦ ♦ • ♦ • · ··· ···· ♦ · · • · · 25 • · · • · · • · · ^ · • · · • · · • · · *· (kun R on vety, yhdiste on foetidiini 1 ja kun R on metoksi, yhdiste on foetidiini 2), • « ***·. tunnettu siitä, että menetelmä käsittää seuraavat vaiheet: 30 M ’· a) uutetaan Mappia foetida kasvin eri osia alifaattisilla, matalan molekyylipainon • · • · · · 1: omaavilla alkoholeilla tai ketoneilla, yksinomaan tai sekoitettunaveteen huoneenlämmössä; 8 106202 b) väkevöidään uutteet alle 25 °C lämpötilassa vakuumissa; c) uutetaan vesiasetonikonsentraatti, joka saadaan poistamalla orgaaninen liuotin osittain, klooratuilla liuottimilla heikosti emäksisten alkaloidien uuttamiseksi; 5 d) uutetaan vesifaasi n-butanolilla tai veteensekoittumattomilla alkoholeilla; e) puhdistetaan butanoliuutteet, jotka on saatu väkevöimällä alhaisessa lämpötilassa vakuumissa, kromatografisesti silikageelillä tai samanlaisilla adsorbenteilla käyttämäl- 10 lä kloorattujen liuottimien ja alifaattisten alkoholien seoksia liuottimina; f) väkevöidään kuiviksi fraktiot, jotka sisältävät alkaloideja ja puhdistetaan jäännös preparatiivisella HPLC:llä, eluoidaan metanoli/vesi gradientilla lähtien metanoli/vesi-suhteesta 1:1 puhtaaseen metanoliin; 15 g) jäädytyskuivataan tuloksena saatu vesiuute ja kiteytetään puhtaat alkaloidit.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että vaiheessa e) kloorattuina liuottimina käytetään metyleenikloridia ja metanolia tai etanolia .·<< 20 alifaattisina alkoholeina, 4:1 - 1:1 seoksina. « I « « « « < « • « « « ·

3. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että ·· · 75 » · · · • · * ! vaiheessa f) käytetään LiChroprep RP8 -kolonnia. • · · ♦ ♦ · · • · · • · · • · · 25 «·· • · · • · · • · · • · · • « · « • · · • « • · ♦ · • · • · · « # · • « · · 9 106202 ’ 1. Förfarande för framställning av som läkemedel användbara foetidin 1 eller foetidin 2 med den allmänna formeln (I) 5 R -f a, 1Q

12. I ukv**!'0C0CH3 "I 17 h° 1 Tl 5. j]* o"'“V £ iv i ir JT Jn* 20 27* « t < • · Il · ··« ♦ • * • · • I* • · · · • Il I · · 25 (da R avser väte, är föreningen foetidin 1 och da R avser metoxi, är föreningen ... foetidin 2), « · · * 1 1 kännetecknat därav, att förfarandet innefattar följande steg: • · · « » I · · ‘ · * · * a) extraktion av de olika delarna av Mappia foetida växten med alifatiska lägmoleky- 30 lära alkoholer eller ketoner, ensamma eller i blandning med vatten vid rumstempera- : tur; • « I · « « · · • · 10 106202 b) koncentration av extrakten vid en temperatur under 25 °C i vakuum; c) extraktion av hydroacetonkoncentratet, som erhällits genom att partiellt avlägsna det organiska lösningsmedlet, med klorerade lösningsmedel för att extrahera de svagt 5 basiska alkaloiderna; d) extraktion av vattenfasen med n-butanol eller med vatten icke-blandbara alkoholer; e) rening av butanolextrakten som erhällits genom koncentration vid lag temperatur 10 i vakuum, genom kromatografi pä silikagel eller liknande absorbenter, genom att använda sig av blandningar av klorerade lösningsmedel och alifatiska alkoholer som lösningsmedel; f) koncentration till torrhet av fraktionerna som innehäller alkaloiderna och rening av 15 resten genom preparativ HPLC, eluering med en metanol/vatten gradient utgäende frän ett 1:1 metanol/vatten förhällande till ren metanol; g) frystorkning av det resulterande vattenextraktet och kritallisation av de rena alkaloiderna. 20

2. Förfarande enligt patentkrav 1, kännetecknat därav, att i steg e) . används metylenklorid och metanol eller etanol som klorerade lösningsmedel M 1 * · « · ’· ·1 respektive alifatiska alkoholer i 4:1 - 1:1 blandningar. • · · ···« • · · • · · *·1 25

3. Förfarande enligt patentkrav 1 eller 2, kännetecknat därav, att i steg ... f) används en LiChroprep RP8 -kolonn. t · · • · · • > • · 1 • · · • · · « • # · «1 « · « · <«1 • » « • · · · « · · 11 « 1 · I » 1 « · · « ·