FI105097B - Menetelmä terapeuttisesti käyttökelpoisen 4-amino-2-(4,4-dimetyyli-imidatsolidin-2-on-1-yyli)pyrimidiini-5-karboksyylihappo-[N-metyyli-N-(3-trifluorimetyylifenyyli)amidin] hydrokloridisuolan valmistamiseksi - Google Patents

Description

1 105097

Menetelmä terapeuttisesti käyttökelpoisen 4-amino-2-(4,4-dime tyyli-imi datsolidin-2-on-l-yyli) pyramidiini-5-karbok-syylihappo- [N-metyyli-N- (3-trif luorimetyylifenyyli) amidin] hydrokloridisuolan valmistamiseksi 5

Keksintö koskee menetelmää terapeuttisesti käyttökelpoisen 4-amino-2-(4,4-dimetyyli-imidatsolidin-2-on-l-yyli)pyrimidiini-5-karboksyylihappo-[N-metyyli-N-(3-tri-fluorimetyylifenyyli)amidin] hydrokloridisuolan valmistalo miseksi. Erityisesti keksintö koskee edellä kuvatun pyri-midiinijohdannaisen monohydrokloridisuolan valmistusta.

Vast'ikään on kuvattu 4-amino-2-ureidopyrimidiini-5-karboksyylihappo-(N-fenyyliamidin) käyttöä liikalihavuuden ja lipidiaineenvaihduntahäiriöiden hoitamiseksi 15 (vrt. EP-patenttijulkaisu B-0 012 361 (US-patenttijulkaisu nro 4 285 946). Lisäksi on kuvattu erään - rakenteeltaan erityisen - ryhmän näitä yhdisteitä, nimittäin vastaavien N-(3-trifluorimetyylifenyyli)amidien, käyttöä veritulppien ehkäisemiseksi ja hoitamiseksi (vrt. EP-patenttijulkaisu 20 B-0 206 297 (US-patenttijulkaisu nro 4 705 792).

Tietyllä tavalla kielteisesti vaikuttaa näitä yhdisteitä lääkkeinä käytettäessä niiden huono liukoisuus veteen sekä fysiologisesti hyväksyttäviin liuottimiin tai liuotinseoksiin, mukaan lukien tällaisten liuottimien ja 25 veden seokset. Tämä huono puoli on havaittu erityisesti edullisten, lipidiaineenvaihduntaan hyvin myönteisesti vaikuttavien EP-patenttijulkaisun B-0 012 361 mukaisten yhdisteiden sekä voimakkaasti veritulppien muodostumista vastustavasti vaikuttavien yhdisteiden (vrt. EP-B-30 0 206 297) yhteydessä.

Nyt on yllättäen havaittu, että kaavan I mukaisen 4 - amino-2-(4,4-dimetyyli-imidatsolidin-2-on-l-yyli)pyri-midiini-5-karboksyylihappo-[N-metyyli-N-(3-trifluorimetyylifenyyli) amidin 2 105097 cf3 Λ e νΟ Tl n I i "-'ΛΛ H x o 10 hydrokloridisuola on veteen helposti liukoinen tai liukoinen.

Veteen helposti liukoisilla suoloilla tarkoitetaan määritelmän kirjassa "Deutsches Arzneibuch" (9. painos, Amtliche Ausgabe, Deutscher Apotheker-Verlag, Stuttgart, 15 1986, s. 19) mukaan sellaisia suoloja, joiden kohdalla yksi paino-osa kyseistä yhdisteen I suolaa liukenee 1-10 paino-osaan (= tilavuusosaan) vettä. Liukoisilla suoloilla tarkoitetaan edellä mainitun DAB-määritelmän mukaan niitä suoloja, joiden kohdalla yksi paino-osa kyseistä yhdisteen 20 I suolaa liukenee 10 - 30 paino-osaan vettä.

Kaavan I mukaisen yhdisteen hydrokloridisuola valmistetaan siten, että yhdiste, jonka kaava on IV: 25 s o I NC^ /C (IV)

H . C-J-. N H C

.. “ Y

0 tai tämän yhdisteen suola tai suolaseos syklisoidaan lämpötilassa 0 - 240 °C käyttäen tai käyttämättä liuotin- 35 lisäystä yhdisteeksi, jonka kaava on I, ja saatu kaavan I mukainen yhdiste muutetaan hydrokloridisuolakseen.

• 105097 3

Kaavan I mukaisen yhdisteen hydrokloridisuolan hyvä liukoisuus veteen on todella yllättävä, koska rakenteeltaan analogisten yhdisteiden, jotka eivät käsitä metyyliryhmää amidityppiatomissa, sekä suolat että vapaat ' 5 emäkset ovat veteen todellakin huonosti liukoisia. Täten esimerkiksi 4-amino-2-(4,4-dimetyyli-imidatsolidin-2-on-l-yyli)pyrimidiini-5-karboksyylihappo-[N-(3-trifluorime-tyylifenyyli)amidin] hydrokloridista voidaan valmistaa veteen 23 °C:ssa vain 0,93 · 10'3 M liuos, mikä merkitsee, 10 että 1 paino-osa tätä yhdistettä liukenee 2 500 osaan vettä. Yhdiste I on vapaan emäksen muodossa kuten myös 4-amino-2 -(4,4-dimetyyli -imidatsolidin-2-on-1-yyli)pyri -midiini-5-karboksyylihappo-[N-(3-trifluorimetyylifenyyli)-amidi] vapaan emäksen muodossa samoin veteen todella huo-15 nosti liukoinen.

Näiden ominaisuuksien perusteella sekä yleisesti EP-patenttijulkaisussa 0 012 361 kuvattujen yhdisteiden kohdalla todetun sekä vapaiden yhdisteiden että suolojen huonon liukoisuuden veteen perusteella ei mitenkään voitu 20 odottaa, että N-metyyliyhdisteen I suolat olisivat veteen liukoisia tai helposti liukoisia.

Yhdisteen I suolojen liukoisuuden veteen epätodennäköinen paraneminen on myös siinä mielessä yllättävää, että yhdisteen I rakenteellinen erikoisuus, nimittäin ve-25 tyatomin amidityppiatomissa korvaaminen metyyliryhmällä, johtaa vetyyn nähden lipofiilisemmän tähteen liittämiseen. Tällä vaihdolla - vety metyyliksi - rakenteesta katoaa mahdollisuus vetysiltasidokseen. Yhdisteen I rakenteesta tulisi tästä seurauksena tulla vähemmän polaarinen, minkä 30 puolestaan ei missään tapauksessa tulisi johtaa suolojen parantuneeseen liukoisuuteen veteen. Tunnetusti sekundaa- • « riset amidiryhmät (joissa on rakenneyksikkö HN-CO) osoittavat suurta taipumusta muodostaa vetysiltasidoksia, jotka yleensä johtavat polaarisiin ja tästä seurauksena taipu-35 mukeiltaan hydrofiilisempiin aineisiin. Yhdisteen I kohdalla ilmenee vastoin analogisia yhdisteitä, joissa on : sekundaarinen amidiryhmä, yllättäen päinvastainen vaiku- 105097 tus, jolloin tässä tertiaarisen amidiryhmän sisältävän yhdisteen I kohdalla syntyy suolanmuodostuksessa korostetun hydrofiilisiä aineita.

Yhdisteen I suolojen hyvä vesiliukoisuus suo rauuta-5 mia merkittäviä etuja yhdisteelle I sitä lääkkeenä käytettäessä. Yhdisteen I veteen helposti liukoiset suolat vaikuttavat tämän ominaisuuden ansiosta edullisesti tämän vaikuttavan aineen imeytymiseen hoidettavan yksilön elimistössä. Tästä seuraa myös edullinen vaikutus vaikuttavan 10 aineen biosaatavuuteen kyseisessä elimistössä.

Etuja hyvä vesiliukoisuus tuo erityisesti myös tämän vaikuttavan aineen galeenisille valmisteille. Tunnetusti vaikuttavat aineet, jotka muodostavat helposti veteen liukoisia suoloja, ovat galeenisesti yksinkertaisem-15 pia ja varmempia käsitellä tai työstää kuin vaikeasti liukenevat tai veteen lähes liukenemattomat yhdisteet. Kaiken kaikkiaan katsottuna yksinkertaistuvat monet ongelmat, jotka liittyvät yhdisteen I valmistukseen lääkkeeksi sekä sen käyttöön lääkkeenä. Lisäksi vesiliukoinen 20 lääke, kuten yhdisteen I hyvin veteen liukoiset suolat, on esimerkiksi myös annosteluun nähden helpompi ja varmempi käyttää.

Seuraavassa taulukossa 1 esitetään vertailun vuoksi liukoisuuksia veteen samankaltaisten, amidityppiatomissa 25 ei-metyloitujen yhdisteiden suoloille. Kuten ilmenee tau lukosta 1, esitettyjen, erilaisia substituutiokuvioita käsittävien N-desmetyyliyhdisteiden (nrot 1-11) kohdalla mukaan lukien veteen hieman liukeneva yhdiste nro 6 kyseessä ovat kauttaaltaan huonosti ja hyvin huonosti veteen 30 liukoiset suolat.

.. Taulukossa 2 esitetään veteen sitä vastoin kaavan I

mukaisen yhdisteen hydrokloridisuolan liukoisuus.

5 105097

μ ιΟ · «O

JLS 9 «I tj RSns mms

n m > SwO^nK'f’OOtVlfiS

T, β) -H <U C

+> s (0 it (d H ^ (¾ 3 ιβ

Cm h to

•H 2 HlH O

2 3 .-- a » •H rt \ m O \ <

jj Λ «> ) ~t M

^3 ^ //^A , 3 ^OO^tDOtMOOnnOHD

ö ·Η w -(( ))- K 3 <* OOr^rnrr-T-nO

V H \V___,/ ” o O O O O O T- o o o o' o •o _ ( o c

3 c \ μ -H

ij φ \ ‘H ITj +J ·(-> \ (¾ Oi 10 O z i-- j § / . i « __,, * noS’-nSwmo'ico fs °-0 g * rocfir-roo^.OJinooinn

Sm \ (o ra m o ö co o> cd SR cd cd cd oo cd

(N (0 \_ ι-l o I

i-( ~ 0 3 0 lO fl) / \ Σ « h O Dl * -(\ / *--

NO V V

_ H z-( , o o (Q \ /, i o o c\j ·«-_ c\i 1— tn c\j_ c\j Γ'- co n, C *—</ 'S .. «n cd to id in -d" ·<* d" rt in in

.JS, <j> ~ ^ j? .h u C\JC\JC\JC\JC\IC\IC\JC\JC\JC\J<M

H E “ V^*1 ^ _

" H A

^ c 5“ fH *%********* S o o <U 3 0 -H w CO-- * £

"f, CC I I u. I ö x o X ö X I

3 O

M -t-·

•r| 10 *H

x m jl % 3 S cc XIXUXOXÖXXX3 •ro 3 O Ή H Ό 3 μ O) m C (0 n " 2+S cc XIXXXXXXIlX0^;

(0 O

a ·>-> 1 ---- rl b ‘ Ό [|] G ^ ^ ^ -rl ., . 3 o η o o n n n _Γ~ —Τ' ^ u ·· 3 -e Tr X X X X X X X ΧΧΧχ o 0§h OUOOOUOOOO 3

Ή tl O

2 S -μ U

3 9«--—1— ·ο H +» -H _£ 3 3 Ό _ £ 33Λ ^ rCy|DiiintDS(D(n°^ Il H S >1 ^ * 6 105097 Φ Φ β Φ Μ 2 * -μ

H 4J

® η ° Φ κ η cn η ^ - cm O g Η S « β Η 2 Φ Φ ° Φ Λ +ι Φ Η > m cn 3 η 3 -- 3 3 3 7 η 3 jp wo

•rl 01 , O CD -H i—I

0 ·Η λ - OM

M OS n - 3 X

3 +> .j o m

•rl -rl «< rH O

h e. g, o >

** E M

H ^ β +> Φ =0 _

Φ Di f) O CD

P So n :φ - m

•rl hl CN CN

Ό

A

>1 Φ •m β Φ

H

O

3 m •rl .. Ό rl

M

O ni H Ή

Λ! O

O 3

M CG

Ό "H — >i m Ti cn A -h =co CM Mg H (D 0 Φ

CN O i—I (U

.. β jj λ; 4J m .. O Φ CD O cn rö M Φ Φ -HM Ή Dj

M -P -P Ti T5 Ti CO

3 m n A A > H -H H Sh K SH ^ 3 Ό Ό

Φ A A

H >< χ < m m 105097

Kaavan I mukaisen yhdisteen hydrokloridisuolan valmistuksessa käytettävä kaavan IV mukainen guanidiinijohdannainen on uusi yhdiste ja se voi esiintyä molempien mahdollisten stereoisomeerien, E- ja Z-muodon, muodossa, 5 sekä sen happoadditiosuolana.

Kaavan IV mukainen yhdiste tai sen suola voidaan valmistaa siten, että yhdiste, jonka kaava on II: CH j

10 I NH

K>c~r-A //

H Kv M - C

Y

0 15 tai tämän yhdisteen suola saatetaan reagoimaan yh disteen kanssa, jonka kaava on III:

. X

"γ\Λ^ αιι) R6 25 jossa R6 on C^-alkyyli, orgaanisen liuottimen tai laimentimen läsnä ollessa, jolloin muodostuu kaavan IV mukainen yhdiste tai tämän yhdisteen suola, minkä jälkeen 30 saatu kaavan IV mukainen yhdiste muutetaan mahdollisesti suolaksi tai saatu suola muutetaan mahdollisesti kaavan IV mukaiseksi yhdisteeksi.

Yhdiste IV esiintyy yleensä stereoisomeeriseoksena (E ja Z) . Se voidaan kuitenkin muodostaa myös puhtaana 35 stereoisomeerinä (E- tai Z-muoto). Yhdiste IV tai sen « 105097 suolat toimivat lähtöaineina yhdisteen I tai sen liukoisten sekä veteen helposti liukoisten suolojen valmistamiseksi. Yhdiste IV muodostaa yksiemäksisenä emäksenä hap-poadditiosuoloja. Näiden muodostamiseksi sopivat periaat-5 teessä kaikki protonihapot; edullisesti suolanmuodostuk-seen käytetään voimakkaista keskimääräisen voimakkaisiin happoja. Esimerkkeinä mainittakoon seuraavat: kloori-, bromi- tai jodivetyhappo, rikki-, fosfori-, typpi- tai perkloorihappo, C^-alkaanifosfonihapot, sulfonihapot kuten 10 metaani-, bentseeni-, tolueeni- tai trifluorimetaanisul-fonihappo, sulfamiinihappo, metyylirikkihappo, etikka-, kloorietikka-, dikloorietikka-, trikloorietikka- tai tri-fluorietikkahappo, muurahais-, propioni-, oksaali-, malo-ni-, maleiini-, meripihka-, glutaari-, omena-, viini-, 15 sitruuna-, fumaari-, maito-, glykoli- tai palorypälehappo, bentsoehappo tai fenyylitähteessä substituoidut bentsoe-hapot kuten toluyylihappo tai p-nitrobentsoehappo tai salisyylihappo, furaanikarboksyyli- ja/tai mantelihappo.

Lähtöaineeksi yhdisteen IV valmistamiseksi tarvit-20 tava yhdiste II on tunnettu. Kaavan III mukaiset yhdisteet voidaan valmistaa tälle enolieetterityypille tunnettujen menetelmien mukaan lähtien tunnetusta 3-metyyliamino-bentsotrifluoridista (Angew.Chemie supp!. 1982 1213) .

Siinä tapauksessa, että yhdistettä II käytetään 25 suolan muodossa, käytetään lisäksi jotain, edullisesti ekvimolaarista, määrää emäksistä yhdistettä reaktiossa kaavan III mukaisen yhdisteen kanssa.

Yhdisteen II suolalla tarkoitetaan sekä epäorgaanisten että orgaanisten happojen kanssa saatavia happoad-30 ditiosuoloja. Yhdisteen II edullisia suoloja ovat hydro- .. bromidi, hydrokloridi tai sulfaatti. Erityisen sopivia • « keksinnön mukaiseen menetelmään ovat hydrobromidi ja/tai -kloridi.

Kaavan II mukaisen amidinoimidatsolidinonin reaktio 35 kaavan III mukaisen yhdisteen kanssa voidaan suorittaa 9 105097 mitä erilaisimmissa olosuhteissa. Tämä koskee sekä reak-tiolämpötilaa että mahdollisesti lisänä käytettyjä liuottimia tai laimentimia. Siten yhdisteen II keksinnön mukainen reaktio yhdisteen III kanssa voidaan suorittaa lämpö-5 tilassa -100 - +200 °C lisäten tai lisäämättä liuotinta tai laimenninta. Tarkoituksenmukaista on suorittaa tämä reaktio -30 °C:n, edullisesti +10 °C:n, - +100 °C:n, edullisesti +35 °C:n, lämpötilassa liuottimien tai laimentimien läsnä ollessa.

10 Liuottimina tai laimentimina voidaan käyttää pe riaatteessa kaikkia yhdisteiden II ja III suhteen (pitkälti) inerttejä liuottimia, mukaan lukien vettä. Edullisesti käytetään C^-alkoholeja, tetrahydrofuraania, dioksaania, alempia alifaattisia eettereitä, kuten dietyyli-, metyyli-15 t-butyyli- sekä di-isopropyylieetteriä, asetonitriiliä, N,N-dimetyyliformamidia, Ν,Ν-dimetyyliasetamidia, alempia glykoli- ja diglykolidi- ja -monoeettereitä, kuten 1,2-di-metoksietaania, metyyliglykolia, etyyliglykolia, diglyko-lidimetyyli- ja -monometyylieetteriä, etyyliasetaattia, 20 metyyliasetaattia, tolueenia, pyridiiniä, asetonia, kloro formia ja/tai dikloorimetaania liuottimena tai laimentime-na.

Edullisia liuottimia tai laimentimia ovat (^-alkoholit, tetrahydrofuraani, dioksaani, 1,2-dimetoksietaa-25 ni, metyyli-t-butyylieetteri ja/tai asetonitriili. Voidaan käyttää myös esitettyjen liuottimien seoksia, sekä myös esitettyjen ja muiden liuottimien seoksia.

Yhdisteen II reaktiossa yhdisteen III kanssa (stoi-kiometriset) määräsuhteet, joissa näitä yhdisteitä käyte-30 tään, voivat vaihdella laajoissa rajoissa. II ja III voidaan saattaa reagoimaan keskenään ekvivalenttisissa tai ei-ekvivalenttisissa määrissä. Viimemainittu tarkoittaa, että toista näistä kahdesta yhdisteestä voidaan käyttää stoikiometrisenä ylimääränä.· Edullisesti .yhdiste II 35 saatetaan emäksenä reagoimaan III:n kanssa ekviva- 10 105097 lenttisina määrinä tai suhteessa, jossa yhdistettä III on stoikiometrinen ylimäärä. Jos yhdistettä II käytetään hap-poadditiosuolana, voidaan myös sitä käyttää III:een nähden stoikiometrisenä ylimääränä.

5 Tarvittavat reaktioajat ovat riippuvaisia lämpöti lasta, jossa reaktio suoritetaan. Ne voivat vaihdella laajoissa rajoissa. Yleensä käytettäessä lämpötiloja +10 -+ 60 °C reaktioajat ovat 0,3 - 10 tuntia, jolloin reak tioajat ovat - kuten tunnettua - lämpötilaan kääntäen 10 verrannollisia.

Jos yhdistettä II käytetään suolan muodossa, reaktioon lisätään - tarkoituksenmukaisesti ekvimolaarisena määränä - emäksistä yhdistettä tai emäksinen yhdiste II vapautetaan ennen kuin yhdisteen III lisäys tapahtuu 15 emäksisellä yhdisteellä suolastaan osittain tai kokonaan.

Edullisesti tässä tarkoituksessa lisänä käytetyn emäksisen yhdisteen annetaan vaikuttaa ennen kaavan III mukaisen yhdisteen lisäämistä amidinoimidatsolidinonin II käytettyyn suolaan. Reaktio voidaan siten myös tässä 20 suoritusmuodossa suorittaa "pakettireaktiona". Emäksisinä lisinä voidaan käyttää epäorgaanisia ja/tai orgaanisia emäksisiä yhdisteitä. Esimerkkeinä mainittakoon: alempien alkoholien alkali- tai maa-alkalialkoholaatit, alkali- tai maa-alkalihydroksidit tai -hydridit, puhtaasti orgaanisis-25 ta emäksistä tertiaariset amiinit kuten alemmat tri- alkyyliamiinit ja/tai N,N-dimetyylianiliini, diatsabisyk-loundeseeni (DBU) sekä analogiset sykliset (trisub-stituoidut) amidiinit, tetra-alkyyliammoniumhydroksidi, 2-tai 4-dialkyyliaminopyridiini ja/tai diatsabisyklo-30 [2.2.2]-oktaani (Dabco).

.. Edullisesti käytetään C^-alkanolien alkalialkoho- • · laatteja, natriumhydridiä, DBU:ta ja DBU-analogisia ami-diineja tai tetrametyyliammoniumhydroksidia emäksisinä lisinä, jolloin erityisen sopivia ovat natrium- tai ka-35 liummetylaatti ja/tai -etylaatti.

105097 11

Edullisen suoritusmuodon mukaan täten kaavan II mukainen yhdiste saatetaan liuotetussa muodossa 10 -35 °C:n lämpötilassa reagoimaan kaavan III mukaisen yhdisteen kanssa, jossa R6 määritellään kuten edellä, jolloin 5 R6 on edullisesti metyyli tai etyyli. 0,3 - 4 tunnin reak-tioajan jälkeen muodostunut, yleensä vaikeasti liukoisena kiteisenä aineena erottunut kaavan IV mukainen yhdiste eristetään suodattamalla eroon ja kuivataan 10 - 35 °C:n lämpötilassa - tarkoituksenmukaisesti tyhjössä.

10 Oltaessa perillä siitä mitä aiemmin mainituista EP-patenttijulkaisuista tiedetään, oli yllättävää, että saatettaessa yhdiste II reagoimaan yhdisteen III kanssa yhdiste IV voidaan eristää kiteisenä kiinteänä aineena, jonka saannot ovat korkeat ja jonka puhtausaste on korkea. 15 EP-patenttijulkaisussa 0 012 361 kuvattujen yhdis teiden valmistuksessa ei havaita yhdisteen IV tyyppisiä yhdisteitä. Erityisesti yhdisteen IV stabiilisuus on yllättävä, ja se mahdollistaa menetelmässä lähtöaineena tarvittavan yhdisteen kätevän eristyksen, josta saannot ovat 20 hyviä.

Kaavan IV mukaisen yhdisteen eristys on helposti mahdollista tämän yhdisteen yleisen niukkaliukoisuuden johdosta, erityisesti keksinnön mukaisen menetelmään sopiviin orgaanisiin liuottimiin.

25 Koska yhdiste IV muutetaan esillä olevan keksinnön puitteissa yhdisteen I helposti liukoiseksi hydrokloridi-suolaksi, yhdisteen IV tai suolojen eristys puhtaassa muodossa ei ole aivan välttämätöntä. Pikemminkin syk-lisointi voidaan suorittaa reaktio-olosuhteita muuttamalla 30 pakettireaktion luonteisesti.

• Yhdisteen IV syklisointi emäksenä voi tapahtua li- 4 · säten tai lisäämättä liuotinta tai laimenninta. Syklisointi liuottimien tai laimentimien läsnä ollessa suoritetaan lämpötilassa 0 °C, edullisesti 40 °C - 130 °C, edullisesti 35 95 °C. Syklisointi liuotin- tai laimenninlisäystä käyttä- 105097 12 mättä suoritetaan lämpötilassa 60 °C, edullisesti 160 °C -240 °C, edullisesti 200 °C.

Jos yhdiste IV syklisoidaan emäksenä siten, että muodostuu yhdistettä I, tällöin muodostuvan suoritusmuodon 5 mukaan tarkoituksenmukaisesti kuivaa kaavan IV mukaista yhdistettä kuumennetaan lämpötilassa 160 - 200 °C 3 - 27 minuutin, edullisesti 10 - 20 minuutin, ajan, minkä jälkeen jäähdytetään välittömästi huoneenlämpötilaan. Sitten IV:stä lämpösyklisoinnissa muodostunut yhdiste I eriste-10 tään. Tähän sisältyy yleensä kahden todettavissa määrissä ohessa syntyneen sivutuotteen, 3-metyyliaminobentsotri-fluoridin (kaava V reaktiokaaviossa I) ja kaavan VI mukaisen yhdisteen (vrt. kaavio I), eristys. Yhdiste VI voidaan erottaa helposti liukoisuutensa laimeisiin alkalien 15 vesiliuoksiin perusteella ja kaavan V mukainen yhdiste valtaosin suuremman haihtuvuutensa perusteella tislaamalla yhdisteestä I. Yhdisteen V täydellinen erottaminen yhdisteestä I on mahdollista yksinkertaisesti uudelleenkiteyt-tämällä ja/tai pesemällä kiteinen yhdiste I sellaisilla 20 liuottimilla, jotka liuottavat yhdistettä I vaikeasti ja yhdistettä V helposti.

Yhdisteen IV syklisointi happoadditiosuolan muodossa suoritetaan edullisesti käyttäen mukana liuottimia tai laimentimia lämpötilassa 0 °C, edullisesti 45 °C - 25 150 °C, edullisesti 95 °C. Tämä yhdisteen IV suolan sykli- • sointi voidaan kuitenkin suorittaa myös lisäämättä liuotinta tai laimenninta lämpötilassa 60 °C, edullisesti 160 °C - 240 °C, edullisesti 200 °C.

Yhdisteen IV tämän kaltaiseen syklisointiin käyt-30 täen tai käyttämättä liuotinlisäystä voidaan käyttää määrättyjä, erityisesti yhdisteestä IV valmistettuja happoad- • · ditiosuoloja sekä myös seoksia, jotka koostuvat yhdisteestä IV ja yhdestä tai useammasta haposta. Tällaisiin seoksiin voidaan käyttää kaikkia koostumuksia, alkaen hyvin 35 pienistä määristä happoekvivalentteja, esim. alle 10‘4 ek- • 13 105097 vivalenttia, aina 2 happoekvivalenttiin tai suurempiin määriin; edullisesti käytetään 0,8 - 1,6 happoekvivalent-tia. Äärimmäistapauksessa yhdisteen IV syklisointi voidaan suorittaa hapossa, joka toimii samanaikaisesti liuottimena 5 tai laimentimena. Tämä suoritusmuoto on edullinen, jos happoina ja laimentimina käytetään muurahais-, etikka-ja/tai propionihappoa. Yhdisteen IV happoadditiosuolojen syklisoinnissa siten, että muodostuu yhdistettä I, määrättyjen, erikseen valmistettujen suolojen käyttö ei siten 10 ole aivan välttämätöntä.

Yhdisteen IV syklisointi lisäten yhtä tai useampaa happoa liuottimien tai laimentimien läsnä ollessa on keksinnön mukaisen menetelmän hyvin sopiva suoritusmuoto.

Yhdisteen IV suolojen syklisoinnin tai yhdisteen IV 15 syklisoinnin lisäten yhtä tai useampaa happoa edullisen suoritusmuodon mukaan yhdistettä IV lämmitetään lisäten 0,2 - 2,5 happoekvivalenttia tai useampia happoekvivalent-teja - edullisesti 1-1,5 happoekvivalenttia - liuottimen tai laimentimen läsnä ollessa lämpötilassa 25 °C, 20 edullisesti 45 °C - 120 °C, edullisesti 95 °C. Reaktioajat ovat tällöin lämpötilasta riippuen 0,5 - 9 tuntia. Sitten voidaan lisäämällä sopivia liuottimia, joihin muodostuneen yhdisteen I vastaava suola on vaikeasti liukoinen, eristää tämä kiteisessä muodossa. Tällä tavalla onnistuu muodostu-25 neen yhdisteen I yksinkertainen ja tehokas erotus ohessa syntyneistä sivutuotteista (vrt. lisäksi reaktiokaavio I).

Edellä kuvattuun yhdisteen IV syklisoinnin suoritukseen sopivat käytettäviksi periaatteessa kaikki proto-nihapot. Esimerkkeinä mainittakoon seuraavat: kloori-, 30 bromi-, fluori- tai jodivetyhappo, rikki-, fosfori-, po- . lyfosfori-, typpi- tai perkloorihappo, C1.4-alkaanifosfo- nihapot, sulfonihapot kuten metaani-, bentseeni-, toluee-ni- tai trifluorimetaanisulfonihappo, sulfamiinihappo, metyylirikkihappo, etikka-, syaanietikka-, kloorietikka-, 35 dikloorietikka-, trikloorietikka- tai trifluorietikkahap- 9 14 105097 po, muurahais-, propioni-, oksaali-, maloni-, maleiini-, meripihka-, glutaari-, omena-, viini-, sitruuna-, fumaa-ri-, maito-, glykoli- tai palorypälehappo, bentsoehappo tai fenyylitähteessä substituoidut bentsoehapot, kuten to-5 luyylihappo tai p-nitrobentsoehappo tai salisyylihappo, furaanikarboksyyli- ja/tai mantelihappo.

Edullisesti käytetään etikka-, oksaali-, viini-, muurahais-, sitruuna-, omena-, fumaari-, dikloorietikka-, trikloorietikka- ja/tai propionihappoa.

10 Erityisen sopivia ovat etikka-, oksaali-, viini-, muurahais- ja/tai sitruunahappo.

Liuottimiksi tai laimentimiksi tähän yhdisteen IV syklisoinnin suoritukseen suolojen tai suolaseosten muodossa sopivat periaatteessa kaikki yhdisteen IV suhteen 15 inertit orgaaniset liuottimet ja/tai vesi. Edullisesti käytetään C^-alkoholeja, tetrahydrofuraania, dioksaania, metyyli-t-butyylieetteriä, asetonitriiliä, N,N-dimetyyli-formamidia ja/tai -asetamidia, alempia glykolidi- ja -mo-noeettereitä, kuten 1,2-dimetoksietaania, metyyli- ja/tai 20 etyyliglykolia, ja/tai metyyliasetaattia, etyyliasetaattia, asetonia, kloroformia, dikloorimetaania, muurahaishappoa ja/tai etikkahappoa.

Keksinnön mukaisen menetelmän edullisen suoritusmuodon mukaan yhdistettä IV lämmitetään jääetikan ja/tai 25 muurahaishapon läsnä ollessa lisäten tai lisäämättä yhtä tai useampaa keskimääräisen voimakkaasta voimakkaaseen happoa 0,3-5 tunnin ajan lämpötilassa 25 °C, edullisesti 45 oC - 120 °C, edullisesti 95 °C. Jääetikka ja/tai muurahaishappo toimivat tällöin samalla liuottimina ja niitä 30 käytetään yhdisteeseen IV nähden stoikiometrisenä ylimää- . ränä. Mahdollisesti ohessa käytetyistä keskimääräisen voi- « * makkaista voimakkaisiin hapoista mainittakoon esimerkkeinä oksaali-, sitrakoni-, viini-, sitruuna-, trifluorietikka-, syaanietikka-, kloorietikka-, dikloorietikka-.ja/tai tri-35 kloorietikkahappo ja/tai polyfosforihappo.

« 105097 15

Tarvittaessa yhdiste I vapautetaan eristetystä suolasta tällaisiin emäsmuodostuksiin yleisesti tunnetulla tavalla ja muutetaan veteen liukoiseksi tai helposti liukoiseksi hydrokloridisuolaksi.

5 Yhdisteen I suolanmuodostuksen yhteydessä mainitut "happoekvivalentit" viittaavat yhdisteeseen I yksiemäksi-senä emäksenä.

Menetelmää yhdisteen I valmistamiseksi havainnollistetaan seuraavalla kaaviolla.

10 Kaavio 1

v X ^ JO

15 „ Λ NH C ?

* ΓΛ r H

HN N - C .C CH3 , y

Y H

I H

0 r -ν'

k c AJ i » JO AJ

"•ST-? CB> ».t /-« so >,ΛΛ, i Λ1

H 0 CHS HJC H^O

o (v) (VI) 1C 105097 1.6

Yhdisteen IV syklisoinnissa sivutuotteena muodostunut 3-metyyliaminobentsotrifluoridi V voidaan eristää ja palauttaa III:n valmistusprosessiin.

Kaavan I mukaisella yhdisteellä ja sen veteen 5 helposti liukoisella hydrokloridisuolalla on arvokkaita farmakologisia ominaisuuksia, minkä vuoksi niitä voidaan käyttää lääkkeinä. Niille ovat ominaisia esimerkiksi veren lipidipitoisuutta alentavat ominaisuudet.

Yllättäen todettiin, että kaavan I mukainen yhdiste 10 ja tämän yhdisteen veteen helposti liukoinen hydroklori- disuola kohottavat LDL-reseptoritasoa. Yhdiste I ja sen veteen helposti liukoinen hydrokloridisuola sopivat siksi sellaisten lipidiaineenvaihduntahäiriöiden hoitoon, joihin voidaan vaikuttaa edullisesti stimuloimalla maksan LDL-15 reseptoria.

Vaikutus perustuu LDL-reseptorin (apoB/E-resepto-rin) nopeaan suoraan stimulaatioon maksassa. Stimuloimalla luonnollista kolesterolikataboliatietä yhdiste I ja sen veteen helposti liukoinen hydrokloridisuola laskevat val-2 0 timoiden LDL:ää ja VLDL:ää. HMG-CoA-reduktaasi- inhibiitto rit tai ioninvaihtohartsit sitä vastoin stimuloivat laskemalla solunsisäistä kolesterolipeiliä tai nostamalla kolesterolitarvetta sappihappojen biosynteesiin epäsuorasti LDL-reseptorien ilmennystä maksasoluilla. Tällöin 25 sivuvaikutuksia, joita havaitaan statiineilla johtuen nii den voimakkaasta HMG-CoA-reduktaasin inhibitiosta muissakin elimissä kuin maksassa (esim. vaikutus ubikinoni-muodostukseen), ei ole odotettavissa. Tällaisia sivuvaikutuksia ei toistaiseksi ole myöskään havaittu. 30 Hoitomyönteisyysongelmia kuten ioninvaihtohartseilla, joi ta käytettäessä näitä ilmenee tarvittavan korkeilla • · päiväannoksilla 15 - 30 g, ei tarvitse pelätä.

Erityisen vaarallisia rasvakerrostumien muodostumisessa valtimon seinämään ovat määrätyt kolesterolia 35 kuljettavat lipoproteiinifraktiot kuten pienihiukkasiset 17 105097 LDL-fraktiot. Valtaosan (75 %) LDL:stä katabolia tapahtuu LDL-reseptorin välityksellä maksassa. Maksasoluissa kolesteroli metaboloidaan silloin osittain sappihapoiksi ja eritetään sapen muodossa, osittain tapahtuu myös koleste-5 rolin suora eritys sapen välityksellä. Täten periaatteessa jo tunnustetaan ja terapeuttisesti epäsuorasti vaikuttavilla aineilla (kuten statiineilla) on jo osoitettu, että LDL-reseptori on ihanteellinen vaikutuskohta veren lipidi-pitoisuutta alentavasti vaikuttavalle, valtimoiden kovet-10 tumista rasvakerrostumien kerääntymisen niiden seinämään johdosta vastustavalle lääkkeelle ihmisellä.

Yhdiste I ja sen veteen helposti liukoiset suolat kohottavat LDL-reseptoritasoa. Kohonnut LDL- (IDL-, rasva-pisara j äännös- ) otto maksasoluihin, jonka aiheuttaa näin - 15 kohonnut LDL-reseptoritaso solupinnalla, johtaa sitten LDL-kolesterolin voimistuneeseen hajoamiseen maksassa. Vaikutusta HDL-peiliin ei ole.

Kaavan I mukainen yhdiste ja veteen helposti liukoinen hydrokloridisuola edustavat siten ihanteellista 20 valtimoiden kovettumista niiden seinämiin kerrostuneen rasvan johdosta vastustavasti vaikuttavaa periaatetta. Seuraavat löydökset vahvistavat löydetyn vaikutusmekanismin, joka saa kuvatut yhdisteet näyttämään erityisen sopivilta tällaisten lipidien lisääntyneen määrän veressä .. 25 esiintymisten hoitamiseksi, jotka johtuvat vähentyneestä LDL-reseptoriaktiivisuudesta: 1. Ihmisen hepatotsytoomasolulinjassa HepG2 sekä rotanmaksoissa LDL-reseptori-mRNA-peilit kohoavat muutamassa tunnissa yhdisteen I hydrokloridin käytön jälkeen 30 2 - 2,5-kertaisesti (kuvio 1). LDL-reseptori-mRNA-stimu laatio on riippumaton kolesterolin "varustustasosta", mikä voitiin osoittaa inkuboimalla solulinjaa täysseerumissa ja seerumissa, josta puuttui lipoproteiini (LDL-vajaa seerumi) (kuvio 2) . Nämä havainnot tehtiin suorittamalla seu-35 raavat testit: mRNA:n valmistus suoritettiin Chomczynskin, P., ja Sacchin, N., julkaisussa Anal.Biochem. 162 (1987) 156 ku- is 105097 vaarnan menetelmän mukaan. Elimien (kuten esim. maksa) kohdalla syväjäädytetty kudos homogenisoitiin ensin kui-vajäässä huhmaressa, minkä jälkeen mRNA:ta rikastettiin edelleen käyttäen oligo-dT:tä ja vakiomenetelmiä (vrt.

5 Sambrook, J., Fritsch, E.F., ja Maniatis, T., "Molecular

Cloning", 2. painos, Cold Spring Harbor, 1989; tästä menetelmä kokoelmasta löytyvät myös kuvaukset kaikista muista tässä käytetyistä oleellisista molekyylibiologisista vakiomenetelmistä) . 5 - 20 p näin saatua liukoista 10 mRNA:ta denaturoitiin vakiomenetelmillä ja erotettiin l-%:isissä vaakasuorissa agaroosigeeleissä. mRNA siirrettiin käyttäen blot-kapillaarisiirtoa Hybond N -membraa-neille (Amersham). Spesifisenä hybridisaatiokoettimena toimi osa-LDL-reseptori-cDNA-klooni ja sisäisenä standar-15 dina plasmidi, joka sisälsi β-aktiinigeenin. Kummatkin plasmidit leimattiin käyttäen Amershamin satunnaispohjus-tuspakkausta 5 x 109 tuikkeen/min/^g spesifiseen aktiivisuuteen. Suodattimien esihybridisaatio, hybridisaatio ja pesu suoritettiin vakiomenetelmien mukaan. Sitten suodat-20 timia valotettiin Cronex 4 -filmeille (Dupont) yli yöstä 14 päivään vahvistinkalvon läsnä ollessa -70 °C:ssa ja hybridisaatiosignaalit kvantitoitiin filmin mustumisin-tensiteetistä käyttäen kaupallista laserdensitometriä. Sitten määritettiin LDL-reseptorinauhojen ja aktiininau-25 hojen sisäisenä standardina intensiteettien suhde saanto-vaihteluiden korjaamiseksi.

Kuviossa 1 esitetään LDL-reseptori-mRNA-ilmennyksen stimulointi in vivo rotan maksoissa käytön jälkeisen ajan funktiona. Annettiin kerran suun kautta 30 mg/kg yhdisteen 30 I hydrokloridia, minkä jälkeen ilmoitettuina ajankohtina otettiin maksakudosta, joka pikajäädytettiin nestetypessä. Sitten mRNA preparoitiin kuten kuvattiin edellä ja suhteellinen LDL-reseptori-mRNA-taso määritettiin Northern blot -tekniikalla. 6 tunnin jälkeen LDL-reseptori-mRNA-35 taso on kohonnut noin 2,5-kertaisesti.

Kuviossa 2 esitetään LDL-reseptori-mRNA-ilmennyksen stimulointi HepG2-soluissa täysseerumissa sekä lipopro- 105097 teiinivajaassa seerumissa. HepG2-soluja inkuboitiin etukäteen 16 tunnin ajan MEM-vakiokasvulaustassa, joka sisälsi 10 % vasikansikiöseerumia sekä sisälsi tai ei sisältänyt yhdisteen I hydrokloridia (10'6 M) . Huolimatta esistimu-5 loinnista kasvualustassa, josta lipidit puuttuivat, kuvattu yhdiste yli-indusoi LDL-reseptori-mRNA:n edelleen samalla tekijällä kuin havaittiin stimuloinnissa täysseeru-missa. Tällöin lipoproteiinivajaa seerumi (LPDS) valmistettiin ultrasentrifugointia käyttäen vakiomenetelmän mu-10 kaan (Goldstein, J.L., Basu, S.K., ja Brown, M.S., Methods Enzvmol. 98 (1983) 241) . mRNA:n seerumissa valmistus ta pahtui analogisesti edellä kuvattuun menetelmään nähden.

2. Kohonnut mRNA-synteesi johtaa myös funktionaalisen LDL-reseptoripeilin vastaavaan kohoamiseen HepG2-so-15 luissa. 125I-leimatun homologisen LDL:n otto kohoaa aina 2,5-kertaiseen (kuvio 3).

Tässä testissä homologinen, vakiomenetelmien mukaan puhdistettu LDL leimattiin jodimonokloridimenetelmällä 125I:llä. Tällöin käytettiin kirjallisuudesta tuttua 20 Bilheimerin menetelmää, joka edustaa modifikaatiota alunperin McFarlainen kehittämästä jodaustekniikasta (vrt. Bilheimer, D.W., Eisenberg, S., ja Levy, R.L., Biochem.-Biophvs.Acta 260 (1972) 212).

125I-LDL-oton määrittämiseksi HepG2-soluja esi-in-25 kuboitiin 36 tunnin ajan käyttäen ja käyttämättä yhdisteen I hydrokloridia, minkä jälkeen inkuboitiin 3 tunnin ajan jodileimatulla LDL:llä 37 °C:ssa inkubaattorissa. Sitten solut pestiin 2 %:n nautaseerumialbumiinia läsnä ollessa, soluissa aikaansaatiin lyysi lisäämällä 1 ml 0,1 N 30 NaOH-liuosta ja mitattiin mukaan sisältynyt radioaktiivisuus. Käyttämällä proteiinimääritystä Lowryn menetelmän mukaan laskettiin sitten kuten yleisesti tavanomaista spesifinen radioaktiivisuusotto (kokonaisradioaktiivisuus-otto miinus ei-spesifinen radioaktiivisuusotto) kohden mg 35 proteiinia ja verrokkiseerumin otettu radioaktiivisuus asetettiin 100 %:ksi.

20 1 0 5 0 9 7 3. HMG-CoA-reduktaasimäärityksessä in vitro osittain puhdistetulla HMG-CoA-reduktaasilla rotanmaksasta (vrt. Avigan, J., Bathena, S.J., ja Schreiner, M.E., J. -Lipid Res. 16 (1975) 151, ja Philippi, B.W., ja Shapiro, 5 D.J., J. Lipid Res. 20 (1979) 588) yhdisteen I hydrokloridi lisättäessä sitä 10'5 M ei vaikuta entsyymiaktiivisuuteen verrokki-inkubointeihin verrattuna (hajonta 10 %) , lova-statiini-Na:11a (jossa laktonirengas on avattu) on tässä kokeessa IC50 pitoisuudessa 3 x 10'9 M.

10 4. In vivo kohonnut LDL-reseptoriaktiivisuus hei jastuu koe-eläimillä LDL-reseptorin (apoB/E-reseptorin) välityksellä metaboloituvien lipoproteiinifraktioiden laskuna, eli havaitaan LDL- ja VLDL-peilin lasku. Suoritettiin seuraavat testit: 15 4.1. Vaikutus urospuolisten rottien, joiden veressä esiintyy normaalisti rasvaa, seerumilipoproteiineihin sub-kroonisessa kokeessa

Ryhmät, joissa on kussakin 10 kannan HOE:WISKf (SPF 71) urospuolista rottaa, joiden lähtöpaino on yli 20 180 g, saivat päivittäin kerran (aamuisin) koevalmistetta tai verrokkivalmistetta TyloseR MH 300 -valmisteen l%:isessa vesiliuoksessa mahaletkulla (0,5 ml/100 g ruumiinpainoa) , jolloin kulloinenkin verrokkiryhmä sai vain nestemäistä kantajaa. Viimeinen (7.) anto tapahtui 24 25 tuntia ennen verenottoa ja uhraamista. Ravintoa ja vettä oli vapaasti saatavana kokeen aikana. 24 tuntia ennen verenottoa ravinto otettiin pois.

Seerumilipoproteiinien analysoimiseksi kaikkien yhden ryhmän 10 rotan seerumi yhdistettiin pooliksi. See-30 rumilipoproteiinit erotettiin preparatiivisesti ultrasent-rifugoimalla (Kontron TGA 65, roottori Beckman 50.4 Ti).

• ·

Seuraavia olosuhteita Kogan, S., Horwitzin, D.L., ja Scanun, A.M., J.Lipid Res. 10 (1969) 577, ja Havelin, R.J., Ederin, H.A., ja Bragdonin, H.H., J.Clin.Invest. 34 21 105097 (1955) 1345, mukaan käytettiin VLDL:n, LDL:n ja HDL: n erottamiseksi: 1. VLDL: tiheys < 1,006, 16 tuntia 40 000 kierr./min 2. LDL: tiheys 1,006 - 1,04, 16 tuntia 40 000 kierr./min 5 3. HDL: tiheys 1,04 - 1,21, 18 tuntia 40 000 kierr./min

Kolesterolin ja triglyseridien erotetuissa lipo-proteiinifraktioissa entsymaattiseksi määrittämiseksi käytettiin testiyhdistelmiä valmistajalta Boehringer/-Mannheim (vrt. Siedel, J., Schlumberger, H., Klose, S., 10 Ziegenhorn, J., ja Wahlefeld, A.W., J.Clin.Chem.Clin.-Biochem. 19 (1981) 838, ja Wahlefeld, A.W., kirjassa: H.O. Bergmeier: "Methoden der enzymatischen Analyse", 2. pai nos, osa II, Verlag Chemie, 1974, s. 1878). Proteiinit määritettiin Lowryn mukaan (Lowry, O.H., Roseborough, 15 N.J., Farr, A.L., ja R.J. Randell, J.Biol.Chem. 193 (1951) 265) .

Tuloksista esitetään yhteenveto taulukossa 3. Ver-rokkivalmisteena käytettiin valmistetta Clofibrat. Taulukko 3 20 Urospuolisten Wistar-rottien valtimoiden kovettu mista niiden seinämiin kerrostumalla aiheuttavien seerumi 1 ipopr ote iinien väheneminen 7 päivän käsittelyn suun kautta jälkeen

Muutos-% verrokkiin nähden 25 Annos Kokonais- Proteiini Triglyseridit mg/kg/päivä kolesteroli

Yhdiste LDL VLDL LDL VLDL

Yhdiste I* 30 -64 -59 -52 -79 30 Yhdiste I* 10 -49 -52 -41 -62

Yhdiste I* 3 -32 -24 -25 -25

Yhdiste I* 1 -17 +4 -15 +8

Clofibrat 100 -31 -30 -32 -34 35 "Hydrokloridina 105097 22 4.2 Vaikutus kolesterolin liialliseen määrään veressä urospuolisissa rotissa

Ryhmät, joista kussakin oli 10 kannan HOE:WISKf (SPF 71) rottaa, jotka painoivat noin 200 g, saivat 5 päivittäin aamuisin koktailin, joka sisälsi yhdistetysti ruokavaliollis-hormonaalisen kolesterolin liiallisen määrän esiintymisen veressä synnyttämiseksi tarvittavia aineita sekä kulloinkin kolesterolin liiallisen määrän veressä esiintymisen estämiseksi tutkittavaa valmistetta 10 vastaavana annostuksena. Koktail koostui seoksesta, jossa oli 100 g kolesterolia, 30 g propyylitiourasiilia ja 100 g koolihappoa 1 litrassa maapähkinäöljyä. Mahaletkuannosta kohden sitä annettiin 1 ml/100 g ruumiinpainoa. Tutkittavat valmisteet luetettiin tähän koktailiin sellaiseksi 15 pitoisuudeksi, että seuraamalla edellä mainittua määrää saatiin taulukossa 4 ilmoitettu päiväannos. Käsittelymenettely muutoin sekä yksittäisten parametrien analyysit suoritettiin kohdassa 4.1 ilmoitettujen tietojen mukaan.

Verrokkivalmisteena oli Clofibrat-valmiste. Tulok-20 sista esitetään taulukossa 4 yhteenveto, jolloin kohdassa a) ilmoitetaan absoluuttiset arvot ja kohdassa b) prosentuaaliset muutokset.

« · 105097 23 tv 8 . o 8 £ S ° 3vj d 2 ίο £ £ * 33- «n g - -^"-- > 3 ä § S s § C v». F -t in K n 8 s--

M * -H , O CM (O

äe r-t G —f T- Tj- Γ0 I ^ S 3 8 § 2 3 lV) VJ-- - op, S ° £ tn t- cm 5J , Λ Q o co co co ® H rJ T— O) T- o

01 JJ > r— r— C\1 CO

•H O---

H *H

h £ j (O

5 rt H Q in to 1- CO

•H H r-i j- O Q CT) rj- •h ** o t~ f- u?) tn to

i Ή N

r-| CO) - 11

•H *J

C jj S λ 9? $S 2t

•H JJ »h TT O) Ö) CD CO

H o O O CD O CO Μη tj m —i n ^ in U a M__

tt o H

01 art.

M h C -J CO CO 'rt'

0) J 2 Q ID CO lO N

m -¾ -« CM o <o O) h g > r- P) rt· m O ----

X

I ''Τ'

- e <u -J

SO) i? . · o to CM CO

SS s» £ S * ®. “>

S JC CPhSOt-CMCVID

” H rj Tt C O

H 2 VJ -rj C O,

rH *C0 H VJ

iH -·-> <u m---- a) >0

* L . m N CO CO

2a H «Sons

X Z I O M- *- CM

2 tn VJ ϋ • - X ·Ί rt • c « jj h;-- 0) ö c tn g5

•H S O 4) E

4JS ΐ ^ h- CO CD O

Tj3 O o x ro in CO 00 gte * ·* r in S 00 v ji ---- H O) ™ d) ro V 4J V-

0) L ^ n n O

S S s “ 8 2° 3 M g < «e C D) O w λ < E rt

+» c --;—i -S

3 g :2 -g s

tj Λ ? VJ VJ

3 Ή Ή * * vj ti O

id « Λ >> M M rt ro ^ ^ CU rt rt οι o; -h 5 o VJ 4J 4J VJ *tr Vj in n tn 4-i Λ: Ό •H -H -H rt O >» Ό Ό U rt ^ £ £ £ £ -hm >j >j ϊη q λ: * 24 105097 E S « r-H 4-> ^ · ' +

Cn -H •h Ό

H -H

H M

. £ rl 'i- h» n·

Q -1- N N

X Λ 1 * n ω .H g O (O ®

tn 2 Q (O ·*- T

® -h -i · 1 + £ S--

'2 o -J

'2 h n oi ® n

a e, “j Tf , (O

e > >1

f—\ - I ·ι ‘ I

0) -P >rj - Ä ti ^ -j O σ> o H .¾ in x λ + · + e * 5 * -a n C ω__ s ® M 2 o g w o i ä V LJ fTi t— <u .¾ tn Zj · « + - Ge -S--

« ·§ § K

* o N r5 •5 O , Oi CO y o * > · · + n H --- <u > g1 E s <e 8 s ·3.ϋ φ T + ! '0 3

Σ HP

.· « I

H Q) /—k

(ti 4-> T- rt S

C tn CO CM CNJ

O <U -Ή ' +

M >—I >—I 0 0 0 X X U

g j? «a o 2 \ > o o g e σ> ;2 ” ^ T- .. < E a, - (¾ •4 e

•P

T3 t ·Η

* * P

HM O

«H

ai o a) *i M

4J +J 4J ro O

tn tn tn p M

n ·-< " Ό Ό T3 x) TS >.

.C JS .C Ο Λ

>H >1 >· O

X. W * X) I1 -— — . - I » 2 5 105097 4.3 Vaikutus hiilihydraatti-indusoituun triglyse-ridien liialliseen määrään veressä

Ryhmät, joissa kussakin oli 10 urospuolista Sprague-Dawley-rottaa (Zuechter Mollegard, paino 250 5 280 g) , saivat 4 peräkkäisenä päivänä kulloinkin yhden annoksen PEG 400 -valmisteeseen liuotettua yhdistettä ma-haletkulla. Lisäksi 3. annoksen jälkeen sekä 8 ja 24 tuntia myöhemmin ne saivat 2,5 g fruktoosia/kg samoin maha-letkulla. Tämän lisäksi niille tarjottiin 3. valmistean-10 noksen jälkeen 50-%:ista fruktoosiliuosta juomavedeksi vapaasti, minkä lisäksi ravinto otettiin pois. 3 tunnin kuluttua viimeisestä valmiste/fruktoosiannoksesta suoritettiin verenotto silmäkuopan takaisesti ja verestä otettiin talteen seerumi triglyseridimääritykseen tai VLDL-15 valmistukseen ultrasentrifugissa (flotaatio, kun d = 1,006). Alkaen ajankohdasta 1 viikko ennen 1. annosta aina 3. annoksen ajankohtaan eläimet saivat ruokavalion mukaista ravintoa, jossa oli 40 % kaseiinia ravintojauhossa.

Tämän käsittelyn johdosta eläimille kehittyy tri-20 glyseridien liiallisen määrän veressä esiintyminen, joka vastaa suunnilleen ihmisen Fredrickson-fenotyyppiä IV. Normaalien eläinten seerumitriglyseridit kohosivat 0,54:stä arvoon 1,1 mmol/litra tai VLDL-triglyseridit 0,67:stä arvoon 1,81. Kuten esitetään taulukossa 5, yhdis-.. 25 teen I hydrokloridi kykeni estämään VLDL-triglyseridien nousun vielä annoksella 1 mg/kg/päivä lähes puolella. Clofihrat 100 kertaa korkeampana annoksena johtaa vain vähäisempään estovaikutukseen.

Tuloksista esitetään yhteenveto taulukossa 5.

26 105097

£ I I , I I

> p

Tj wc *0 o a)

Q< O

p Λ

Ai Itt) 2 c o o cg m k 0 £ c m cd co tr ro

Ii *H «tili

TI <*° *H

01 I X

V os m x W 0 0

MB W PM

m O ZS U

w P 3 0> 01 P E > (U λ;

Li <0----- 8 p > Vo Λ -,-ι 1 T- σι n σι o in c a p CO 00 T- CO CO Ο T- M0 fcj g o' T-‘ o' o' o" T-" T-' M a< c

MO

M0 -------- s

C ~ P

(u π) wc m u 0 at .*? P Ο Ό * P P Λ H P M 1(0

H \ 3 C rt CO T- CD ID

« P «tie N CD ID Π CM

Ή c I I I I I I

ρ i dP p H — I λ;

W M

e -u 0 O

r, p p μ

5 Ό 3 P

•H p 3 Φ Ό μ £ > p a) H ”------- » P <0

S. .? S O >“ (D N (J) CD CD

Η μ p W -- Ο Ο Ο t-_ v ©»g H e o o ooooo r* a) u M Q) 0) P 5 o

p W

§p f r- ro m g· »- n V-) x m T- cm n in s to Ό o’ T-' o' o' o’ o* o' •H (0 0 P _______

01 P

3 3 .3

Ό (0 w en > no O

C X 0 X p ^ ^ n r- o .3 G '3 CD >- ,- i ft C Cn ft H § * ^______„ P 3 g P 01 p p <0 Id Ό m ίο β I > ^ p ·. M -VO) I * 00¾ 0 Ό Η ω 3 p p p .. 5 s, «1 p μ O wp 13 p 3 ? P w Ρ·Ρ0Λ! ai ti= -¾

3 *5 +: p waioACP OR

3 -HP g CPBPO w tt ,¾

HH-H ρ <0 w p X μ P O'S

3 ·Η oi m ε o «o 3 μ 'O p (β·Η*ίτΐ c> pop μα) x! ^ E-ι ® Λ MPa)fti>>-1 * 105097 27

Kaavan I mukaisen yhdisteen veteen helposti liukoinen hydrokloridisuola on edelleen vähentyneen esto-vaikutuksensa solulisääntymiseen johdosta yhdisteen I NH-analogia, 4-amino-2-(4,4-dimetyyli-imidatsolidin-2-on-l-5 yyli)pyrimidiini-5-karboksyylihappo-[N-(3-trifluorime-tyylifenyyli)amidia] (HOE 402, Imanixil), tai tämän yhdisteen hydrokloridia selvästi parempia, kuten seuraavaksi kuvattu testi ja testitulokset osoittavat: Vähentynyttä estovaikutusta solulisääntymiseen 10 tutkittiin eksponentiaalisessa kasvuvaiheessa olevilla eläin- tai ihmiskasvainsoluilla (hiirileukemiasolut, L 1210 tai vastaavasti keuhkoputkisyöpäsolut, A 549; pak-susuolisyöpäsolut, HT 29). Tällöin kasvainsoluja inkuboi-tiin RPMI-vakiokasvualustassa 72 tunnin ajan testiaineiden 15 eri pitoisuuksilla. Verrokkeina käytettiin soluinkuboin- teja pelkässä tuoreessa kasvualustassa. Käytettiin nelinkertaisia inkubointeja. 65 tunnin kuluttua lisättiin MTT:tä (3-(4,5-dimetyyli-2-tiatsolyyli)-2,5-difenyyli-2H-tetratsoliumbromidi), jonka ehyet solut pelkistävät pu-20 naiseksi ei-liukoiseksi formatsaaniväriaineeksi. Edelleen 7-24 tunnin inkuboinnin jälkeen solusupernatantti poistettiin varovaisesti ja formatsaaniväriaine soluissa tehtiin liukoiseksi lisäämällä DMSO:ta ja mitattiin fotomet-risesti kvantitatiivisesti 492 nm:ssä. Arvioitiin ainein-25 kubointien ekstinktioiden suhde verrokki-inkubointiin.

Kunkin inkubointisarjän variaatiokerroin oli alle 15 %. Seuraavassa taulukossa 6 esitetään IC50-arvot (IC50 (μg/ml) on testiaineen se pitoisuus millilitraa kohden, joka tarvitaan 50 %:n estoon) näistä tutkimuksista. Niistä voidaan 30 nähdä, että yhdistettä I hydrokloridina on annettava oleellisesti korkeampi annos, jotta sillä olisi sama li- • · sääntymistä estävä vaikutus (ICS0) kuin Imanixil-hydroklo-ridilla.

105097

Taulukko 6 MTT-määritys IC50 (pg/ml)

Aine L 1210 HT 29 A 549 5 Imanixil-hydrokloridi 0,7 4,3 3,4

Yhdiste I hydrokloridina 13,4 > 100 > 100

Yhdisteellä I tai sen veteen helposti liukoisella hydrokloridisuolalla on aineeseen HOE 402 tai HOE 402 10 -hydrokloridiin verrattuna selvästi vähentynyt lisääntymisen esto, mikä parantaa selvästi varmuusväliä massiivisessa hoidosta johtuvassa yliannostuksessa, johon liittyy mahdollista reversiibeliä valkosolujen vähenemistä .

15 Kaavan I mukaisella yhdisteen hydrokloridi voi olla käyttöä lääkkeenä farmaseuttisten ominaisuuksiensa johdosta, jolloin se annetaan joko yksinään tai sekoitettuna sopiviin kantoaineisiin ja/tai hyväksyttäviin laimentimiin ja edelleen mahdollisesti myös muihin lisäaineisiin.

20 Farmaseuttiset valmisteet sisältävät ei myrkyl listen, inerttien farmaseuttisesti sopivien kantoaineiden ohella kaavan I mukaisen yhdisteen hydrokloridisuolaa tai koostuvat mainitusta hydrokloridisuolasta.

Ei myrkyllisillä, inerteillä, farmaseuttisilla so-25 pivilla kantoaineilla tarkoitetaan kaiken tyyppisiä farmaseuttisesti vaarattomia, kiinteitä, puolikiinteitä tai nestemäisiä laimentimia, täyteaineita ja koostamisapuai-neita, jotka sekoituksen vaikuttavaan aineeseen jälkeen saattavat tämän antoon sopivaan muotoon.

30 Yhdisteen I hydrokloridisuolan sopivina käyttömuo- " töinä tulevat kyseeseen esimerkiksi tabletit, rakeet, jauhe, kapselit, pillerit, vesiliuokset, -suspensiot ja -emulsiot, mahdollisesti steriilit ruiskeena annettavat liuokset, ei-vesiemulsiot, -suspensiot ja '-liuokset, 29 105097 suihkeet sekä valmistemuodot, joista vaikuttava aine vapautuu hitaasti.

Terapeuttisesti tehokasta yhdistettä tulee olla edellä esitetyissä farmaseuttisissa valmisteissa tarkoi-5 tuksenmukaisesti pitoisuus noin 0,1, edullisesti 0,5 - 99,0, edullisesti 70,0 paino-% kokonaisseoksesta.

Liuosten sekä aerosolien suihkeen muodossa käyttö-pitoisuudet ovat yleensä 0,1 - 20, edullisesti 0,5 5 paino-%.

10 Edellä esitetyt farmaseuttiset valmisteet voivat mainitun vaikuttavan aineen lisäksi sisältää myös muita farmaseuttisia vaikuttavia aineita.

Edellä esitettyjen farmaseuttisten valmisteiden valmistus tapahtuu tavanomaiseen tapaan tuttujen menetel-15 mien mukaan, esim. sekoittamalla vaikuttava aine tai vaikuttavat aineet kantoaineeseen tai -aineisiin. Esimerkeissä 24 ja 25 kuvataan sopivia tablettikoostumuksia.

Vaikuttavaa ainetta tai farmaseuttisia valmisteita voidaan käyttää suun kautta, ruoansulatuskanavan ulkopuo-20 lisesti, vatsaontelon sisäisesti ja/tai peräsuolen kautta.

Esim. veren lipidipitoisuutta alentavana käyttökelpoista hydrokloridisuolaa voidaan käyttää farmaseuttisten valmisteiden valmistamiseksi, jotka sisältävät tehokkaan määrän aktiivista ainetta yhdessä kantoaineiden kanssa ja 25 jotka sopivat annettaviksi ruoansulatuskanavan kautta tai sen ulkopuolisesta. Edullisesti käytetään tabletteja tai kapseleita (gelatiinikapseleita), jotka sisältävät vaikuttavan aineen yhdessä laimentimien tai kantoaineiden kanssa, joita ovat esim. laktoosi, dekstroosi, ruokosokeri, 30 mannitoli, sorbitoli, selluloosa, erilaiset tärkkelyslaa- * dut ja/tai glysiini, ja liukastusaineet kuten piimää, talkki, steariinihappo tai sen suolat, kuten magnesium-tai kalsiumstearaatti, ja/tai polyetyleeniglykoli. Tabletit sisältävät tarkoituksenmukaisesti samoin sideaineita 35 kuten magnesiumkarbonaattia, magnesiumaluminiumsilikaat- 30 1 0 5 0 9 7 tia, tärkkelystä, gelatiinia, traganttikumia, metyylisel-luloosaa, natriumkarboksimetyyliselluloosaa ja/tai polyvi-nyylipyrrolidonia ja tarvittaessa väriaineita, makuaineita ja makeutusaineita. Ruiskeena annettavat liuokset ovat 5 edullisesti isotoonisia vesiliuoksia tai -suspensioita, jotka voidaan steriloida, ja ne voivat sisältää apuaineita kuten säilytys-, stabiloimis-, kostutusaineita ja/tai emulgaattoreita, liukoisuutta edistäviä aineita, suoloja osmoottisen paineen säätämiseksi ja/tai puskuriaineita.

10 Keksinnön mukaiset farmaseuttiset valmisteet, jotka voivat mahdollisesti sisältää muita farmakologisesti tehokkaita aineita, valmistetaan esim. käyttäen tavanomaista sekoitus-, granulointi- ja rakeistusmenetelmää ja ne sisältävät 0,1 % - edullisesti noin 80 %, edullisesti noin 0,5 % -15 noin 65 %, vaikuttavaa ainetta.

Käyttö suun kautta tapahtuu farmaseuttisesti tavanomaisina valmisteina, esimerkiksi tablettien, rakeiden tai kapselien muodossa, jotka sisältävät esim. kohden päiväannosta 5:stä, edullisesti 20:sta, 1 000 mg:aan, 20 edullisesti 200 mg:aan, vaikuttavaa ainetta sekoitettuna tavanomaiseen kantoaineeseen ja/tai ainesosiin, jolloin voidaan antaa 5 - 200 mg:n yksittäisannoksia, edullisesti 1-3 kertaa päivässä.

Kuitenkin voidaan joutua poikkeamaan mainituista 25 annostuksista, jolloin tämä tapahtuu nimenomaan riippuen hoidettavan kohteen lajista ja ruumiinpainosta, sairauden laadusta ja vakavuudesta, valmisteen laadusta ja lääkkeen käytöstä sekä aikavälistä, jona anto tapahtuu. Siten voi joissakin tapauksissa olla riittävää käyttää vähemmän kuin 30 edellä mainittu määrä vaikuttavaa ainetta, kun taas toi-** sissa tapauksissa edellä mainitut vaikuttavan aineen määrät joudutaan ylittämään. Vaikuttavan aineen kulloinkin tarvittavan optimaalisen annostuksen ja käyttötavan voi kukin alan ammattilainen helposti päättää ammattitietou-35 tensa nojalla.

105097 31

Seuraavien esimerkkien tarkoitus on keksinnön lähempi havainnollistaminen sitä esimerkeissä kuvattuihin tuotteisiin ja suoritusmuotoihin rajoittamatta.

Seuraavissa esimerkeissä ilmoitetut sulamis- tai 5 hajoamispisteet ovat korjaamattomia.

Ohutlevykromatografia-ajot suoritettiin DC-valmis-levyillä, Kieselgel 60, F-254 valmistajalta Riedel-de Haen AG käyttäen esimerkeissä kulloinkin ilmoitettuja ajoliuoksia.

10 Esimerkki 1

Lietteeseen, jossa oli 6,25 g (40 mmol) 1-amidino- 4,4-dimetyyli-2-oksoimidatsolidiinia 120 mlrssa vedetöntä 1,2-dimetoksietaania, lisättiin samalla sekoittaen 20 °C:ssa 11,93 g (40 mmol) 2-syaani-3-etoksiakryylihappo-15 [N-metyyli-N-(3-trifluorimetyylifenyyli)amidia] (yhdiste III). Noin 5 minuutin sekoituksen jälkeen oli muodostunut liuos, josta saostui alkaen noin 12 minuutin kuluttua kiteinen aine. Sekoitettiin edelleen 2 tunnin ajan 20 - 24 °C:ssa, minkä jälkeen kiinteä aine suodatettiin imulla 20 eroon ja pestiin eetterillä. Suodos haihdutettiin tyhjössä < 26 °C:ssa kuiviin. Kiteinen jäännös (8,1 g) lietettiin 25 ml:aan eetteriä ja kiinteä aine suodatettiin 20 minuutin kuluttua eroon imulla. Molemmat saadut kiteiset osuudet lietettiin yhdessä noin 200 mitään vettä, sekoitettiin .. 25 40 minuutin ajan huoneenlämpötilassa, suodatettiin eroon imulla, pestiin pienellä määrällä vettä ja kuivattiin 48 tunnin ajan 20 - 25 °C:ssa tyhjössä P205:llä. Tällä tavalla saatiin 14,02 g (= 85,8 %:n saanto) 1-syaani-l-[N-metyyli-N-(3-trifluorimetyylifenyyli)karbamoyyli]-2-[(imino-(4,4-30 dimetyyli-2-oksoimidatsolidin-l-yyli)metyyli)amino]eteeniä (yhdiste IV), sulamis- tai hajoamispiste: 186 - 189 °C.

» 4 Tämän yhdisteen IR-spektrissä esiintyy karakteristinen CN-nauha kohdassa 2212 cm'1. Saatu tuote on DC: n (CH2Cl2/C2H5OH; 10:1) mukaan lähes puhdas (Rf =’0,44 '+/- 32 1 0 5 0 9 7 0,01). 1H-nmr-spektrin mukaan läsnä on yhtenäisesti yksi stereoisomeeri (E tai Z).

C18H19F3N602:lle (408,40) laskettu: C, 52,94; H, 4,69; F, 13,96; N, 20,58; todettu: C, 52,70; H, 4,65; F, 13,20; 5 N, 20,30 %.

Esimerkki 2 4,69 g (30 mmol) l-amidino-4,4-dimetyyli-2-okso-imidatsolidiinia liuotettiin 70 °C:ssa seokseen, jossa oli 38 ml 1,2-dimetoksietaania ja 45 ml isopropanolia. Tämä 10 liuos jäähdytettiin 20 °C:seen ja siihen lisättiin 20 °C:ssa 9,0 g (30,2 mmol) 2-syaani-3-etoksiakryylihappo-[N-metyyli-N-(3-trifluorimetyylifenyyli)amidia]. Seosta sekoitettiin 1 tunnin ajan 20 - 24 °C:ssa, muodostunut kiteinen sakka suodatettiin eroon imulla ja pestiin eette-15 rillä. Suodosta työstettiin kuten kuvattiin esimerkissä 1.

Tällöin saadaan vielä 0,74 g kiteistä tuotetta. Tämä ja edellä suoraan eristetty pääosa yhdistettiin, sekoitettiin veteen kuten kuvattiin esimerkissä 1, suodatettiin jälleen imulla eroon ja kuivattiin. Saatiin 10,76 g (= 87,8 %:n 20 saanto) tuotetta, joka DC:n mukaan edustaa lähes puhdasta yhdistettä IV.

Esimerkki 3

Liuokseen, jossa oli 3,12 g (20 mmol) 1-amidino- 4,4-dimetyyli-2-oksoimidatsolidiinia 20 ml:n tetrahydro-25 furaania ja 10 ml:n metanolia seoksessa, lisättiin 18 - 20 °C:ssa 5,97 g (20 mmol) 2-syaani-3-etoksiakryylihappo-[N-metyyli-N-(3-trifluorimetyylifenyyli)amidia] ja sekoitettiin 1,5 tunnin ajan 20 °C:ssa. Sitten saostunut kiinteä aine suodatettiin eroon imulla. Tätä ja saatua suodosta 30 jatkotyöstettiin analogisesti esimerkkiin 1 nähden. Saa-tiin 6,67 g (= 81,7 %:n saanto) tuotetta, joka DC:n mukaan edustaa lähes puhdasta yhdistettä IV.

Esimerkki 4

Seokseen, jossa oli 70· ml 1-propanolia ja 5,5 ml 35 natriummetylaatin 30-%:ista liuosta metanolissa (= 33 105097 30 mmol), lisättiin huoneenlämpötilassa 7,12 g (30 mmol) l-amidino-4,4-dimetyyli-2-oksoimidatsolidiini-hydrobromi-dia ja sekoitettiin 20 minuutin ajan huoneenlämpötilassa. Sitten lisättiin 20 °C:ssa 8,95 g (30 mmol) 2-syaani-3-5 etoksiakryylihappo-[N-metyyli-N-(3-trifluorimetyylifenyy- li)amidia] ja sekoitettiin 30 minuutin ajan 20 °C:ssa ja 1,5 tunnin ajan 20 - 25 °C:ssa. Sitten saostunut kiinteä aine suodatettiin eroon imulla, pestiin 1-propanolilla ja vedellä ja kuivattiin kuten kuvattiin esimerkissä 1. Alku-10 peräistä suodosta jatkotyöstettiin kuten esimerkissä 1.

Saatiin 6,82 g (= 55,7 %:n saanto) DC:n mukaan lähes puhdasta yhdistettä IV.

Esimerkki 5 4,74 g (20 mmol) l-amidino-4,4-dimetyyli-2-ok-15 soimidatsoiidiini-hydrobromidia liuotettiin 47 ml:aan kiehuvaa 1-propanolia ja liuokseen lisättiin 88 - 90 °C:ssa 3,60 g (= 3,67 ml, 20 mmol) natriummetylaatin 30-%:ista liuosta metanolissa. Saatu liete jäähdytettiin 45 °C:seen, sitä sekoitettiin 45 °C:ssa 30 minuutin ajan, se jäähdytet-20 tiin sitten 20 °C:seen, siihen lisättiin 20 °C:ssa 5,97 g (20 mmol) 2-syaani-3-etoksiakryylihappo-[N-metyyli-N-(3-trifluorimetyylifenyyli)amidia] ja sitä sekoitettiin 1,8 tunnin ajan huoneenlämpötilassa. Puuromaista massaa laimennettiin lisäämällä 50 ml eetteriä, minkä jälkeen saos-25 tunut kiinteä aine suodatettiin eroon imulla ja pestiin eetterillä. Tätä tuotetta (primaarikiteet) ja alkuperäisen suodoksen (emäneste) jäännöstä jatkotyöstettiin kuten kuvattiin esimerkissä 1 ja kuivattiin. Saatiin 6,23 g (= 76,3 %:n saanto) DC:n mukaan lähes puhdasta yhdistettä IV.

3 0 Esimerkki 6

Liuokseen, jossa oli 4,74 g (20 mmol) 1-amidino- 4,4-dimetyyli-2-oksoimidatsolidiini-hydrobromidia 47 ml:ssa metanolia, lisättiin huoneenlämpötilassa 3,60 g (= 3,67 ml, 20 mmol) 30-%:ista NaOCH3/CH3OH-liuosta ja se-35 koitettiin 30 minuutin ajan 45 °C:ssa. Sitten liuos jäähdy- 34 105097 tettiin 20 °C:seen, siihen lisättiin 20 °C:ssa 5,97 g (20 mmol) 2-syaani-3-etoksiakryylihappo-[N-metyyli-N-(3 -trifluorimetyylifenyyli)amidia] ja sekoitettiin 20 minuutin ajan 20 °C:ssa, 1,5 tunnin ajan huoneenlämpötilassa ja 5 30 minuutin ajan jäähauteessa jäähdyttäen. Saostunut kiin teä aine suodatettiin eroon imulla, pestiin eetterillä ja jatkotyöstettiin edelleen kuten kuvattiin esimerkissä 1. Samoin suodos- (emäneste-) jäännöstä jatkotyöstettiin edelleen kuten kuvattiin esimerkissä 1 ja se kuivattiin.

10 Saatiin 6,35 g (= 77,7 %:n saanto) DC:n (CH2C12/C2H50H; 10:1) mukaan lähes puhdasta yhdistettä IV.

Analogisesti voidaan tässä käytetyn hydrobromidin asemesta käyttää l-amidino-4,4-dimetyyli-2-oksoimidatso-lidiinin hydrokloridia (20 mmol = 3,85 g).

15 Esimerkki 7

Lietteeseen, jossa oli 8,17 g (20 mmol) 1-syaani-l-[N-metyyli-N- (3-trifluorimetyylifenyyli)karbamoyyli]-2-[(imino-(4,4-dimetyyli-2-oksoimidatsoiidin-1-yyli)metyyli) amino] eteeniä (yhdiste IV) 48 ml:ssa etanolia, lisät-20 tiin tipoittain huoneenlämpötilassa 3,1 ml HC1:n 6,6 M liuosta eetterissä ja sekoitettiin 1 tunnin ajan 1 3 °C:ssa. Sitten kiinteä aine suodatettiin eroon imulla, se pestiin eetterillä ja sitä kuivattiin 20 tunnin ajan huoneenlämpötilassa tyhjössä (4-6 mbar). Saatiin 8,34 g 25 (= 90,7 %:n saanto) puhdasta 1-syaani-l-[N-metyyli-N-(3- trifluorimetyylifenyyli)karbamoyyli]-2-[imino-(4,4-dime-tyyli-2-oksoimidatsolidin-l-yyli)metyyli)amino]eteeni-hyd-rokloridia, sulamispiste 180 - 181 °C (muutospiste; aine kiinteytyy uudelleen).

30 C18H20ClF3N6O2: lie (444,86) laskettu: C, 48,60; H, 4,53; Cl, 7,97; F, 12,81; N, 18,89; todettu: C, 48,20; H, 4,35; Cl, 8,0; F, 12,75; N, 18,60 %.

Esimerkki 8

Lietteeseen, jossa oli 1,00 g (2,45 mmol) yhdis-35 tettä IV 6 ml:ssa etyyliasetaattia, lisättiin huoneenläm- 105097 35

Potilassa 5 ml ΗΝ03:η 0,5 M liuosta etyyliasetaatissa ja sekoitettiin 3 tunnin ajan jäähauteessa jäähdyttäen. Sitten kiinteä aine suodatettiin eroon imulla, se pestiin etyyliasetaatilla ja eetterillä ja sitä kuivattiin huo-5 neenlämpötilassa tyhjössä (4-7 mbar) 24 tunnin ajan.

Saatiin 1,11 g ( = 94 %:n saanto) yhdisteen IV puhdasta nitraattia, sulamispiste 142 - 143 °C.

C18H20F3N705: lie (471,41) laskettu: C, 45,86; H, 4,28; F, 12,09; N, 20,80; todettu: C, 46,3; H, 4,6; F, 12,0; N, 10 21,1%.

Esimerkki 9

Liuosta, jossa oli 1,634 g (4 mmol) 1-syaani-1-[N-metyyli-N-(3-1rifluorimetyylifenyyli)karbamoyyli]-2-[(imino-(4,4-dimetyyli-2-oksoimidatsolidin-l-yyli)metyy-15 li) amino] eteeniä (yhdiste IV) 3 ml :ssa muurahaishappoa (98 -100-%:inen), lämmitettiin 2 tunnin ajan 50 °C:ssa. Sitten muurahaishappo haihdutettiin tyhjössä pois, jäännös lietettiin dikloorimetaaniin, lietteeseen lisättiin 20 ml vettä ja pH säädettiin laimeaa natriumhydroksidiliuosta 20 lisäämällä arvoon 9 - 10. Orgaaninen faasi erotettiin.

Vesifaasia ravistettiin vielä kahdesti dikloorimetaanin kanssa. Yhdistetyt dikloorimetaaniuutteet pestiin peräkkäin 2 ml :11a 0,5 N NaOH-liuosta ja kahdesti vedellä, kuivattiin MgS04:llä ja haihdutettiin tyhjössä kuiviin. Jäl-25 jelle jäänyt kiinteä jäännös sekoitettiin eetteri/heptaa-niin, 1:1, ja suodatettiin eroon imulla. Kuivaamalla (vrt. esimerkki 13) saatiin 0,93 g (= 56,9 %:n saanto) puhdasta 4-amino-2-(4,4-dimetyyli-2-oksoimidatsolidin-l-yyli)pyramidiini - 5 -karboksyylihappo- [N-metyyli-N-(3-trifluorime-30 tyylifenyyli)amidia], sulamispiste 210 - 211 °C; " DC CH2Cl2/C2H5OH: ssa, 10:1.

Ci8Hi9F3N602 : lie (4 08,40) (yhdiste I) laskettu: C, 52,94; H, 4,69; F, 13,96; N, 20,58; todettu: C, 52,8; H, 5,0; F, 13,4; N, 20,4 %.

36 105097

Esimerkki 10 3 tunnin ajan 40 °C:ssa lämmitettyä liuosta, jossa oli 3,268 g (8 mmol) yhdistettä IV 6 ml.-ssa muurahaishappoa, jatkotyöstettiin kuten kuvattiin esimerkissä 9. Täl-5 löin saatiin 2,03 g (= 62,1 %:n saanto) yhdistettä I, sulamispiste 210 - 211 °C.

Esimerkki 11

Lietettä, jossa oli 1,634 g (4 mmol) yhdistettä IV 3 ml:ssa jääetikkaa, sekoitettiin 50 °C:ssa. 1,5 tunnin 10 kuluttua oli muodostunut liuos, jota sekoitettiin edelleen 1 tunnin ajan 50 °C:ssa, minkä jälkeen sitä laimennettiin huoneenlämpötilassa lisäämällä 25 ml vettä, ja pH säädettiin lisäämällä 5,5 ml 32-%:ista NaOH-liuosta 9:ksi. Saatua seosta uutettiin useaan kertaan etyyliasetaatilla. 15 Yhdistetyt etyyliasetaattiuutteet pestiin kahdesti pienellä määrällä vettä, kuivattiin Na2S04:llä, suodatettiin ja haihdutettiin tyhjössä kuiviin. Jäännös liuotettiin 100 mitään CH2Cl2:ta. Tätä liuosta ravistettiin peräkkäin neljästi kulloinkin 10 ml tn 0,5 N NaOH-liuosta kanssa ja 20 kahdesti kulloinkin 4 ml t n vettä kanssa, se kuivattiin Na2S04:llä, suodatettiin ja haihdutettiin tyhjössä kuiviin. Jäännös sekoitettiin noin 10 mitään eetteriä 2-5 °Ctssa ja suodatettiin eroon imulla. Kuivaamalla (kuten esimerkissä 13) saatiin 1,26 g (= 77,1 %tn saanto) puhdasta yh-25 distettä I, sulamispiste 210,5 - 211,5 °C.

Esimerkki 12

Seosta, jossa oli 2,45 g (6 mmol) yhdistettä IV, 24 ml tetrahydrofuraania (THF) ja 2,70 g (45 mmol) jääetikkaa, keitettiin palautusjäähdyttäen ja samalla se-30 koittaen, jolloin noin 10 minuutin kuluttua muodostui liuos, jota keitettiin palautusjäähdyttäen 3,8 tunnin ajan • · ja joka sitten haihdutettiin tyhjössä kuiviin. Saatuun jäännökseen lisättiin 8 ml vettä ja pH säädettiin l:ksi lisäämällä 2 N kloorivetyhappoa. Tällöin saostunut kiinteä 35 aine suodatettiin eroon imulla, pestiin eetterillä ja kui- 105097 37 vattiin. Tämän kiinteän aineen (0,68 g) kohdalla kyseessä oli sivutuotteena muodostunut yhdiste VI. Happaman vesipitoisen suodoksen pH säädettiin laimeaa NaOH-liuosta lisäämällä arvoon 9 - 10, jolloin erottui öljymäinen tuote, 5 joka lisättäessä muutama ml eetteriä kiteytyi. 1 tunnin jäähdytyksen 2-4 °C:ssa jälkeen kiteinen aine suodatettiin eroon imulla, pestiin pienellä määrällä eetteriä ja kuivattiin kuten kuvattiin esimerkissä 13. Saatiin 1,19 g (= 48,6 %:n saanto) puhdasta yhdistettä I, sulamispiste 10 210 - 211 °C.

Esimerkki 13

Liuosta, jossa oli 2,45 g (6 mmol) yhdistettä IV ja 0,66 g (7,33 mmol) vedetöntä oksaalihappoa 36 ml:ssa absoluuttista THFtää, keitettiin palautusjäähdyttäen 8 tunnin 15 ajan, minkä jälkeen siihen lisättiin noin 30 °C:ssa 34,5 ml CH2Cl2:ta ja se jätettiin 17 tunniksi huoneenlämpötilaan. Saostunut kiteinen aine suodatettiin eroon imulla, pestiin pienellä määrällä CH2Cl2:ta ja kuivattiin 100 °C:ssa tyhjössä (3 - 7 mbar) . Tällöin saatiin 1,36 g tuotetta, joka 20 edustaa yhdisteen I vetyoksalaattia, jossa on epäpuhtautena oksaalihappoa. Tämä tuote liuotettiin 5 ml:aan vettä, liuokseen lisättiin 2,3 ml 2 N NaOH-liuosta ja sekoitettiin 1 tunnin ajan jäissä jäähdyttäen. Tällöin muodostunut kiteinen sakka suodatettiin eroon imulla, se pestiin ve-25 della ja eetterillä ja sitä kuivattiin 17 tunnin ajan 100 °C-.ssa tyhjössä (180 mbar). Saatiin 0,98 g (= 40 %:n saanto) yhdistettä I, sulamispiste 209 - 210 °C.

Esimerkki 14

Seokseen, jossa oli 20 ml metanolia ja 0,392 g 30 (noin 4 mmol) konsentroitua rikkihappoa, lisättiin huoneenlämpötilassa 1,634 g (4 mmol) yhdistettä IV, ja saatua liuosta keitettiin 9,5 tunnin ajan palautusjäähdyttäen, minkä jälkeen se haihdutettiin tyhjössä kuiviin. Saatuun jäännökseen lisättiin noin 10· ml vettä· ja pH säädettiin 35 9:ksi lisäämällä laimeaa NaOH-liuosta. Seosta uutettiin 38 105097 useaan kertaan eetterillä. Keskenään yhdistetyt eette-riuutteet pestiin pienellä määrällä vettä, ne kuivattiin Na2S04:llä, suodatettiin ja haihdutettiin tyhjössä kuiviin. Saatua jäännöstä trituroitiin heptaani/eetterissä, 1:1.

5 Muodostunut kiteinen aine suodatettiin eroon imulla ja kuivattiin kuten kuvattiin esimerkissä 13. Saatiin 0,22 g (= 13,5 %:n saanto) puhdasta yhdistettä I, sulamispiste 210 - 211 °C.

Esimerkki 15 10 Seosta, jossa oli 2,45 g (6 mmol) yhdistettä IV, 180 mg (2 mmol) oksaalihappoa ja 5 ml jääetikkaa, lämmitettiin samalla sekoittaen 50 °C:ssa, jolloin 30 minuutin kuluttua oli muodostunut liuos. Sekoitettiin edelleen 2,5 tunnin ajan 50 °C:ssa, minkä jälkeen jääetikka haihdutet-15 tiin pois tyhjössä. Jäännökseen lisättiin 30 ml CH2Cl2:ta ja 20 ml vettä, vesifaasin pH säädettiin laimeaa NaOH-liuosta lisäämällä arvoon 9-10, erotettiin faasit ja uutettiin vesifaasia vielä kolmasti CH2Cl2:lla. Yhdistetyt CH2Cl2-uutteet pestiin vedellä, kuivattiin MgS04:llä, 20 suodatettiin ja haihdutettiin tyhjössä kuiviin. Saatu jäännös sekoitettiin eetteri/heptaaniin, 1:1. Kiteinen aine suodatettiin eroon, pestiin eetteri/heptaanilla, 3:1, ja kuivattiin tyhjössä {4-6 mbar). Saatiin 1,83 g (= 74,7 %:n saanto) käytännöllisesti katsoen puhdasta yh-25 distettä I, sulamispiste 209 - 210 °C.

Esimerkki 16

Lietettä, jossa oli 2,45 g (6 mmol) yhdistettä IV

4,60 ml:n jääetikkaa ja 0,40 ml:n vettä seoksessa, sekoitettiin 50 °C:ssa. 30 minuutin kuluttua oli muodostunut 30 liuos, jota sekoitettiin edelleen 2,5 tunnin ajan 50 °C:ssa, minkä jälkeen se haihdutettiin tyhjössä kuiviin.

• > Jäännökseen lisättiin noin 10 ml vettä, pH säädettiin laimeaa NaOH-liuosta lisäämällä arvoon 9 - 10 ja tätä seosta uutettiin useaan kertaan CH2Cl2:lla. CH2Cl2-uute 35 pestiin kahdesti pienellä määrällä vettä, kuivattiin * 105097 39

Na2S04:llä, suodatettiin ja haihdutettiin tyhjössä kuiviin. Kiteistä jäännöstä sekoitettiin noin 10 ml:ssa eetteriä. 1 tunnin jäähdytyksen jäähauteessa jälkeen kiinteä aine suodatettiin eroon, se pestiin eetterillä ja kuivattiin esi-5 merkin 13 mukaan, jolloin saatiin 1,74 g (= 71 %:n saanto) puhdasta yhdistettä I, sulamispiste 210 - 211 °C.

Esimerkki 17

Seosta, jossa oli 2,45 g (6 mmol) yhdistettä IV, 820 mg (5 mmol) trikloorietikkahappoa ja 4,25 ml jääetik-10 kaa, sekoitettiin 2 tunnin ajan 70 °C:ssa, minkä jälkeen se haihdutettiin kuiviin tyhjössä. Jäljelle jäänyt jäännös lietettiin 100 mlraan etyyliasetaattia ja sitä ravistettiin peräkkäin kulloinkin kahdesti kulloinkin 20 ml:n 2 N NaOH-liuosta kanssa ja kulloinkin 10 ml:n vettä kanssa.

15 Kuivauksen MgS04:llä jälkeen liuos suodatettiin ja haihdutettiin tyhjössä kuiviin. Jäännös liuotettiin 25 ml:aan eetteriä, josta saostui kiteinen aine. Sekoitettiin vielä 30 minuutin ajan huoneenlämpötilassa, minkä jälkeen seos haihdutettiin tyhjössä kuiviin. Kiteinen 20 jäännös lietettiin di-isopropyylieetteriin, suodatettiin eroon imulla ja kuivattiin 15 tunnin ajan 100 °C:ssa tyhjössä. Saatiin 1,36 g (= 55,5 %:n saanto) puhdasta 4-amino- 2 - (4,4-dimetyyli-2-oksoimidatsolidin-l-yyli)pyrimidii-ni-5-karboksyylihappo-[N-metyyli-N-(3-trifluorimetyylife-25 nyyli)amidia], sulamispiste 209 - 210 °C.

Esimerkki 18

Lietettä, jossa oli 1,78 g (4 mmol) 1-syaani-l-[N-metyyli-N- [3-trifluorimetyylifenyyli)karbamoyyli] -2-[(imino-(4,4-dimetyyli-2-oksoimidatsolidin-l-yyli)metyy-30 li)amino]eteeni-hydrokloridia 20 ml:ssa vettä, sekoitettiin 80 °C:ssa. 1,5 tunnin kuluttua oli muodostunut kirkas vesifaasi, josta oli erottunut paakkuina liimainen massa. Sekoitettiin vielä 5,9 tunnin ajan 80 °C:ssa, minkä jälkeen pH säädettiin l:ksi lisäämällä laimeaa kloorivetyhappoa ja 35 suodatettiin. Suodoksen pH säädettiin NaOH:ta lisäämällä 40 105097 arvoon 9-10, jolloin saostui kiteinen sakka. Sekoitettiin vielä 1 tunnin ajan jäissä jäähdyttäen, minkä jälkeen kiinteä aine suodatettiin eroon imulla, pestiin vedellä ja eetterillä ja kuivattiin esimerkin 13 mukaan. Saatiin 5 0,47 g (= 28,8 %:n saanto) yhdistettä I, sulamispiste 209 - 210 °C.

Esimerkki 19 10,74 g (26,3 mmol) 1-syaani-1- [N-metyyli-N-(3-tri-fluorimetyylifenyyli)karbamoyyli]-2-[(imino-(4,4-dimetyy-10 li-2-oksoimidatsolidin-l-yyli)metyyli)amino]eteeniä (yh diste IV) mitattiin 190 °C.-seen esikuumennettuun kolviin, joka suljettiin tislauslaitteella. Samalla magneettise-koittajalla sekoittaen aineen annettiin olla 5 minuutin ajan 190 °C:ssa ja 6 minuutin ajan 190 - 192 °C:ssa. Sitten 15 laitteistoon muodostettiin tyhjö ja sivutuotteena muodos

tunut 3-metyyliaminobentsotrifluoridi poistettiin valtaosin tyhjössä 10 minuutin kuluessa 189 - 175 °C:n hau-delämpötilassa tislaamalla. Muodostunut ruskea, sulanut massa lietettiin 100 ml .-aan CH2Cl2:ta ja tätä liuosta ra-20 vistettiin peräkkäin kolmasti kulloinkin 35 ml:n 0,5 N

NaOH-liuosta kanssa, kahdesti kulloinkin 20 ml:n vettä kanssa ja neljästi kulloinkin 25 ml:n 1 N kloorivetyhappoa kanssa. Yhdistetyt kloorivetyhappopitoiset vesiuutteet kirkastettiin aktiivihiilellä, suodatettiin ja niiden pH 25 säädettiin lisäämällä NaOH-liuosta 9:ksi. Tällöin muodostunut sakka lietettiin CH2Cl2:een ja vesifaasia uutettiin kerran CH2Cl2:lla. Yhdistetyt CH2C12-uutteet pestiin vedellä, kuivattiin MgS04:llä, suodatettiin ja haihdutettiin tyhjössä kuiviin. Jäljelle jäänyt, amorfinen jäännös liuo-30 tettiin eetteriin, josta saostui muutamassa minuutissa kiteinen aine. Tämä suodatettiin muutaman tunnin kuluttua eroon imulla ja sitä kuivattiin 100 °C:ssa 15 tunnin ajan tyhjössä (180 mbar). Tällä tavalla saatiin 3,83 g (= 35,7 %:n saanto) DC:n mukaan puhdasta 4-amino-2-(4,4-dime-35 tyyli-2-oksoimidatsoiidin-1-yyli)pyramidiini-5-karboksyy- 105097 lihappo-[N-metyyli-N-(3-trifluorimetyylifenyyli) amidia] (yhdiste I), sulamispiste 209 - 210 °C.

C18H19F3N602:lle (408,40) laskettu: C, 52,94; H, 4,69; F, 13,96; N, 20,58; todettu: C, 52,8; H, 5,0; F, 13,35; N, 5 20,4 %.

DC CH2Cl2/C2H5OH:Ssa, 10:1.

Jatkotyöstössä saadussa alkalisessa vesiuutteessa on sivutuotteena muodostunut yhdiste VI. Yhdisteen I hyd-rokloridin hyvä vesiliukoisuus mahdollistaa kuvatun kallo täisen työstön, joka muodostaa sivutuotteiden kätevän ja tehokkaan erotuksen yhdistettä I valmistettaessa.

Esimerkki 20 2,67 g (6 mmol) 1-syaani-l-[N-metyyli-N-(3-trifluorimetyylif enyyli)karbamoyyli]-2-[(imino-(4,4-dimetyyli-2-15 oksoimidatsolidin-l-yyli)metyyli)amino]eteeni-hydroklori- dia lämmitetään tyhjössä (4-6 mbar) 190 °C:seen esikuu-mennetussa hauteessa 10 minuutissa 187 - 189 °C:seen.

Jäähdytyksen jälkeen jähmettynyt sulate sekoitettiin 5 ml:aan 2 N NaOH-liuosta ja lisättiin 12 ml dietyylieet-20 teri/di-isopropyylieetteriä, 5:1. Sekoitettaessa muodostui ensin 2 kirkasta faasia, joista saostui kiteinen aine. Sekoitettiin 1 tunnin ajan jäissä jäähdyttäen, minkä jälkeen kiteinen aine suodatettiin eroon imulla, pestiin vedellä ja lietettiin 50 ml:aan CH2Cl2:ta. Muodostunutta 25 liuosta ravistettiin peräkkäin kolmasti kulloinkin 5 ml:n 0,5 N NaOH-liuosta kanssa ja kahdesti kulloinkin 5 ml:n vettä kanssa, se kuivattiin Na2S04:llä, suodatettiin ja haihdutettiin kuiviin. Jäännöstä trituroitiin di-isopro-pyylieetterissä, se suodatettiin eroon imulla ja kuivat-30 tiin esimerkin 13 mukaan. Saatiin 0,82 g (= 32,6 %:n saanto) yhdistettä I, sulamispiste 209 - 210 °C.

I ·

Esimerkki 21

Lietteeseen, jossa oli 45,5 g (111,4 mmol) 4-amino-2 -(4,4-dimetyyli -2-oksoimidatsoiidin-1-yyli)pyramidiini-5 -35 karboksyylihappo-[N-metyyli-N-(3-trifluorimetyylifenyy- 9 42 105097 li)amidia] (yhdiste I) 810 ml:ssa 1,2-dimetoksietaania, lisättiin samalla sekoittaen tipoittain huoneenlämpötilassa 4 N kloorivetyhappoa, kunnes pH-arvo pysyi 3,0:ssa. Tähän tarvittiin 28,4 ml 4 N kloorivetyhappoa. Muodostui 5 liuos, jota sekoitettiin vielä 30 minuutin ajan (huoneenlämpötilassa) , minkä jälkeen se haihdutettiin tyhjössä kuiviin. Jäljelle jäänyt, sitkeänöljyinen jäännös liuotettiin 150 ml:aan kiehuvaa asetonia, jossa alkoi heti muodostua kiteistä sakkaa. 30 minuutin jäähdytyksen jäähau-10 teessä jälkeen kiteinen aine suodatettiin eroon imulla, se pestiin asetonilla ja eetterillä ja sitä kuivattiin 17 tunnin ajan 100 °C:ssa tyhjössä (180 mbar). Saatiin 46,7 g (= 94,2 %:n saanto) puhdasta 4-amino-2-(4,4-dimetyyli-2-oksoimidatsoiidin-1-yyli)pyrimidiini- 5-karboksyylihappo-15 (N-metyyli-N-(3-trifluorimetyylifenyyli)amidi]-hydro-kloridia, sulamispiste 210 - 211 °C.

C18H20ClF3N6O2:lle (444,86) laskettu: C, 48,60; H, 4,53; Cl, 7,97; F, 12,81; N, 18,89; todettu C, 48,4; H, 4,4; Cl, 7,8; F, 12,0; N, 18,8 %.

20 Yhdisteen I tämän hydrokloridin liukoisuus veteen esitetään taulukossa 2 (nro 1).

Esimerkki 22

Liuokseen, jossa on 3,68 g (9 mmol) 4-amino-2-(4,4 -dimetyyli-2-oksoimidatsolidin-l-yyli)pyrimidiini-5-karbok-25 syylihappo-[N-metyyli-N-(3-trifluorimetyylifenyyli)amidia] 20 mlrssa asetonia, lisättiin tipoittain huoneenlämpötilassa 1,5 ml HCl:n 6,6 M liuosta eetterissä ja muodostunutta lietettä sekoitettiin 30 minuutin ajan jäähauteessa jäähdyttäen, minkä jälkeen kiteinen kiinteä aine suodatet-30 tiin eroon imulla. Tämä kuivattiin kuten kuvattiin esimer- " kissä 13. Saatiin 3,75 g (93,7 %:n saanto) puhdasta 4-ami- • * no-2-(4,4-dimetyyli-2-oksoimidatsolidin-l-yyli)pyrimidii-ni-5-karboksyylihappo-[N-metyyli-N-(3-trifluorimetyylifenyyli ) amidi] -hydrokloridia , sulamispiste' 210 -· 211 °C.

. _ 105097 43

Esimerkki 23

Analogisesti esimerkissä 22 kuvattuun nähden liuokseen, jossa oli 8 mmol yhdistettä I 25 ml:ssa etyyliasetaattia ja 5 ml:ssa metanolia, lisättiin 1,35 ml 5 HCl:n 6,6 M liuosta eetterissä, minkä jälkeen seos haihdutettiin kuiviin tyhjössä. Sitkeänöljyinen jäännös liuotettiin 20 ml:aan kiehuvaa asetonia, jolloin muutaman minuutin kuluttua saostui kiteinen sakka. 30 minuutin sekoituksen jäähauteessa jäähdyttäen jälkeen kiinteä aine 10 suodatettiin eroon imulla, se pestiin asetonilla ja eetterillä ja kuivattiin kuten kuvattiin esimerkissä 13. Saatiin 3,28 g (92,3 %:n saanto) puhdasta 4-amino-2-(4,4 -dimetyyli - 2-oksoimidatsolidin-1-yyli)pyrimidiini- 5-kar-boksyylihappo-[N-metyyli-N-(3-trifluorimetyylifenyyli)-15 amidi]-hydrokloridia, sulamispiste 210 - 211 °C.

Esimerkki 24

Kalvotabletin valmistus seuraavassa ilmoitetun koostumuksen mukaan

Ainesosa (tablettia kohden) Paino (mg) 20 1. 4-amino-2-(4,4-dimetyyli-2-okso- 100 imidatsolidin-l-yyli)pyrimidiini- 5-karboksyylihappo-[N-metyyli-N-(3-trifluorimetyylifenyyli)amidi]-hydrokloridi 25 2. Laktoosi 35 3. Maissitärkkelys 20 4. Mikrokiteinen selluloosa 10 5. Natrium-tärkkelysglykolaatti 8 6. Piidioksidi 5 30 7. Magnesiumstearaatti 2 8. Kalvolakka 10

Kokonaispaino 190 a) Aineet 1-4 sekoitetaan, tiivistetään ja käytetään Frewitt-seulan (silmäkoko 1,0 mm) läpi.

105097 44 b) Granulaatti kohdasta a) peitetään aineilla 5-7 ja puristetaan.

c) Tabletit kohdasta b) lakataan vesipitoisella kalvolakalla.

5 Esimerkki 25

Kalvotabletin valmistus seuraavassa ilmoitetun koostumuksen mukaan

Ainesosa (tablettia kohden) Paino (mg) 1. 4-amino-2-(4,4-dimetyyli-2-okso- 100 10 imidatsolidin-l-yyli)pyrimidiini- 5-karboksyylihappo-[N-metyyli-N-(3-trifluorimetyylifenyyli)amidi]-hydrokloridi 2. Laktoosi 11 15 3. Hydroksipropyylimetyyliselluloosa 60 4. Mikrokiteinen selluloosa 7 5. Magnesiumstearaatti 2 6. Kalvolakka 10

Kokonaispaino 190 20 a) Aineet 1-4 sekoitetaan, tiivistetään ja käy tetään Frewitt-seulan (silmäkoko 1,0 mm) läpi.

b) Granulaatti kohdasta a) peitetään aineella 5 ja puristetaan.

c) Tabletit kohdasta b) lakataan vesipitoisella .. 25 kalvolakalla.

Tämä tablettilaji edustaa valmistetta, josta vaikuttava aine vapautuu hitaasti.

Claims (2)

105097 45 Patenttivaatimus Menetelmä terapeuttisesti käyttökelpoisen kaavan I mukaisen yhdisteen 10. y . I (I) H xo 15 hydrokloridisuolan valmistamiseksi, tunnettu siitä, että yhdiste, jonka kaava on IV: / ” ··. s O ^ x \ / (IV) HjC / \ ^NH a ; HN N—C c CHj • « ir o tai tämän yhdisteen suola tai suolaseos syklisoidaan lämpötilassa 0 - 240 °C käyttäen tai käyttämättä liuotin- 30 lisäystä yhdisteeksi, jonka kaava on I, ja saatu kaavan I mukainen yhdiste muutetaan hydrokloridisuolakseen. 105097 46 Förfarande för framställning av ett terapeutiskt godtagbart hydrokloridsalt av en förening med formeln I 10 ly " xo 15 kännetecknat därav, att en förening med formeln IV: 20 c"! ° I Nc ^ uv) H . C J-. N H C N l| I HN\/N~C·^ C CH, I Ϊ ^

25. H 0 eller ett sait eller saltblandning av denna förening cyk-liseras vid en temperatur av 0 - 240 °C under tillsättning eller utan tillsättning av lösningsmedel tili en förening 30 med formeln I, och den erhällna föreningen med formeln I omvandlas tili ett hydrokloridsalt därav.