ES2931316T3 - Forma salina para la inhibición de EZH2 - Google Patents

Abstract

En este documento se proporciona el uso de N-((4,6-dimetil-2-oxo-1,2-dihidropiridin-3-il)metil)-5-(etil(tetrahidro-2H-piran-4-il)amino) -4-metil-4'-(morfolinometil)-[1,1'-bifenil]-3-carboxamida hidrobromuro para tratar trastornos de proliferación celular. También se proporcionan los intermedios utilizados para fabricar este compuesto. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Forma salina para la inhibición de EZH2

Antecedentes de la invención

Se estima que más de 1.6 millones de personas serán diagnosticadas con cáncer en 2012. Por ejemplo, el tipo de cáncer más común en las mujeres es el cáncer de mama, y esta enfermedad es responsable de una de las tasas de mortalidad más altas de todos los cánceres que afectan a las mujeres. El tratamiento actual del cáncer de mama se limita a la mastectomía total o parcial, la radioterapia o la quimioterapia. Casi 230,000 de los casos de cáncer en 2012 serán cáncer de mama, lo que provocará unas 40,000 muertes. Véase, Siegel et al., Ca Cancer J Clin 2012; 62:10-29.

Varias muertes por cáncer son causadas por cánceres de la sangre, como leucemias, mielomas y linfomas. En 2012, casi 80,000 de los casos de cáncer serán linfomas, lo que provocará unas 20,000 muertes.

La radioterapia, la quimioterapia y la cirugía son los principales métodos de tratamiento del cáncer. Sin embargo, estas terapias son más exitosas solo cuando el cáncer se detecta en una etapa temprana. Una vez que el cáncer alcanza las etapas invasivas/metastásicas, las líneas de células invasoras o las células metastásicas pueden escapar a la detección, dando como resultado recaídas, lo que requiere el uso de una terapia que es altamente tóxica. En este punto, tanto las células cancerosas como las células no afectadas del paciente quedan expuestas a la terapia tóxica, lo que resulta, entre otras complicaciones, en un debilitamiento del sistema inmunitario.

Como tal, sigue existiendo la necesidad en la técnica de nuevos métodos para tratar el cáncer, tal como el cáncer de mama o los linfomas, en un paciente.

Sumario de la invención

La presente invención está definida por las reivindicaciones. En particular, la presente invención está dirigida a bromhidrato de N-((4,6-dimetil-2-oxo-1,2-dihidropiridin-3-il)metil)-5-(etil(tetrahidro-2H-piran-4-ilo)amino)-4-metil-4'-(morfolinometil)-[1,1'-bifenil]-3-carboxamida para su uso en el tratamiento de un trastorno de proliferación celular. El bromhidrato de N-((4,6-dimetil-2-oxo-1,2-dihidropiridin-3-il)metil)-5-(etil (tetrahidro-2H-piran-4-il)amino)-4-metil-4'-(morfolinometil)-[1,1'-bifenil]-3-carboxamida es:

También se divulga en el presente documento una forma polimórfica particular de bromhidrato de N-((4,6-dimetil-2-oxo-1,2-dihidropiridin-3-il)metil)-5-(etil(tetrahidro-2H-piran-4-ilo)amino)-4-metil-4'-(morfolinometil)-[1,1'-bifenil]-3-carboxamida ("Polimorfo A" o "Polimorfo A de bromhidrato de N-((4,6-dimetil-2-oxo-1,2-dihidropiridin-3-il)metil)-5-(etil (tetrahidro-2H-piran-4-il)amino)-4-metil-4'-(morfolinometil)-[1,1'-bifenil]-3-carboxamida"). Como se describe en este documento, la sal de bromhidrato divulgada en este documento, así como el Polimorfo A, exhiben propiedades físicas que se pueden explotar para obtener nuevas propiedades farmacológicas, y que se pueden utilizar en el desarrollo de sustancias farmacológicas y productos farmacológicos.

En una realización, el bromhidrato es cristalino. En otra realización, el bromhidrato está sustancialmente libre de impurezas. En otra realización, el bromhidrato es un sólido cristalino sustancialmente libre de bromhidrato de N-((4,6-dimetil-2-oxo-1,2-dihidropiridin-3-il)metil)-5-(etil(tetrahidro-2H-piran-4-il)amino)-4-metil-4'-(morfolinometil)-[1,1'-bifenil]-3-carboxamida.

En otro aspecto, se proporciona en el presente documento una composición farmacéutica que comprende el bromhidrato descrito anteriormente y un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable para su uso en el tratamiento de un trastorno de proliferación celular.

El bromhidrato descrito anteriormente puede prepararse usando un método que comprende combinar N-((4,6-dimetil-2-oxo-1,2-dihidropiridin-3-il)metil)-5-(etil(tetrahidro-2H-piran-4-il)amino)-4-metil-4'-(morfolinometil)-[1,1'-bifenil]-3-carboxamida con ácido bromhídrico.

El Polimorfo A de N-((4,6-dimetil-2-oxo-1,2-dihidropiridin-3-il)metil)-5-(etil(tetrahidro-2H-piran-4-il)amino)-4- metil-4'-(morfolinometil)-[1,1'-bifenil]-3-carboxamida se puede definir de acuerdo con su patrón de difracción de rayos X en polvo. En consecuencia, en una realización, el polimorfo exhibe un patrón de difracción de rayos X en polvo que comprende uno o más picos seleccionados de picos característicos expresados en grados 2-theta a 3.9 /- 0.3 grados, 17.5 /- 0.3 grados y 22.0 /- 0.3 grados 2-theta. En otra realización, el polimorfo exhibe un patrón de difracción de rayos X en polvo que comprende picos característicos expresados en grados 2-theta a 3.9 /- 0.3 grados, 17.5 /- 0.3 grados y 22.0 /- 0.3 grados 2-theta. En otra realización más, el polimorfo exhibe un patrón de difracción de rayos X en polvo que comprende picos característicos expresados en grados 2-theta a 3.9 /- 0.3 grados, 10.1 /- 0.3 grados, 14.3 /- 0.3 grados, 17.5 /- 0.3 grados, 18.7 /- 0.3 grados, 20.6 /- 0.3 grados, 20.9 /- 0.3 grados, 21.8 /- 0.3 grados, 22.0 /- 0.3 grados, 23.3 /- 0.3 grados y 23.6 /- 0.3 grados 2 theta. En aún otra realización, el polimorfo exhibe un patrón de difracción de rayos X en polvo sustancialmente de acuerdo con la Figura 1. En otra realización, el polimorfo exhibe un patrón de difracción de rayos X en polvo sustancialmente de acuerdo con la Tabla 1.

El Polimorfo A también se puede definir de acuerdo con su termograma de calorimetría diferencial de barrido. En una realización, el polimorfo exhibe un termograma de calorimetría diferencial de barrido que tiene un pico característico expresado en unidades de °C a una temperatura de 255 /- 5 °C. En una realización, el polimorfo exhibe un termograma de calorimetría diferencial de barrido sustancialmente de acuerdo con la Figura 3.

El Polimorfo A puede prepararse usando un método que comprende combinar N-((4,6-dimetil-2-oxo-1,2-dihidropiridin-3-il)metil)-5-(etil(tetrahidro-2H-piran-4-il)amino)-4-metil-4'-(morfolinometil)-[1,1'-bifenil]-3-carboxamida con ácido bromhídrico.

Por ejemplo, un método para recristalizar el Polimorfo A puede comprender las siguientes etapas: (a) disolver el Polimorfo A en un primer disolvente, y (b) agregar un segundo disolvente, de manera que dicho polimorfo se recristalice. Por ejemplo, el primer disolvente es etanol y el segundo disolvente es MTBE. Por ejemplo, el método comprende (a) disolver el Polimorfo A en etanol, (b) calentar la mezcla, (c) agregar MTBE a la mezcla, formar un precipitado que comprende dicho polimorfo y filtrar el precipitado de manera que dicho polimorfo se recristalice.

En otro aspecto más, se proporciona en el presente documento una composición farmacéutica que comprende Polimorfo A y un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable para su uso en el tratamiento de un trastorno de proliferación celular.

También se describe en el presente documento un método para tratar el cáncer que comprende administrar a un sujeto que lo necesite una cantidad terapéuticamente eficaz del compuesto de bromhidrato descrito anteriormente, Polimorfo A, o una composición farmacéutica que comprende cualquiera de estos compuestos. Se puede tratar una variedad de cánceres, incluido el linfoma no Hodgkin o el cáncer de mama.

En el presente documento se describe un método para inhibir la actividad de la histona metiltransferasa de EZH2 en un sujeto que lo necesita, que comprende administrar al sujeto una cantidad eficaz del compuesto de bromhidrato descrito anteriormente, Polimorfo A, o una composición farmacéutica que comprende cualquiera de estos compuestos.

En el presente documento se describe un método para inhibir la actividad de la histona metiltransferasa de EZH2 in vitro que comprende administrar el compuesto de bromhidrato descrito anteriormente, o Polimorfo A.

También se describe en el presente documento el uso del compuesto de bromhidrato descrito anteriormente, Polimorfo A, o una composición farmacéutica que comprende cualquiera de estos compuestos, para la preparación de un medicamento para el tratamiento del cáncer en un sujeto que lo necesite.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 representa el patrón de difracción de rayos X en polvo del Polimorfo A (monobromhidrato).

La Figura 2 representa el patrón de difracción de rayos X en polvo del dibromhidrato del Compuesto I (no de acuerdo con la invención).

La Figura 3 representa el termograma de calorimetría diferencial de barrido del Polimorfo A.

La Figura 4 representa la sorción dinámica de vapor del Polimorfo A, lo que demuestra la baja higroscopicidad de este compuesto.

La Figura 5 representa el análisis por HPLC del Polimorfo A durante tres días a una temperatura elevada. El Polimorfo A produjo impurezas mínimas durante este tiempo.

La Figura 6 representa la sorción dinámica de vapor de la sal de sodio del Compuesto I (no de acuerdo con la invención), lo que demuestra la higroscopicidad significativa de este compuesto.

La Figura 7 representa la sorción dinámica de vapor de la sal de hemisulfato del Compuesto I (no de acuerdo con la invención), lo que demuestra que este compuesto tiene una higroscopicidad moderadamente alta.

La Figura 8 muestra datos de calorimetría diferencial de barrido de la sal de monoclorhidrato del Compuesto I (no de acuerdo con la invención), lo que indica que este compuesto es poco cristalino.

La Figura 9 representa el patrón de difracción de rayos X en polvo del producto intermedio sintético 5 (no de acuerdo con la invención).

La Figura 10 representa el patrón de difracción de rayos X en polvo del Polimorfo B (no de acuerdo con la invención). La Figura 11 representa la estructura cristalina de rayos X del monobromhidrato del Compuesto I.

Las Figuras 12-14 muestran los resultados de estudios in vivo del bromhidrato del Compuesto I en una línea celular de linfoma humano.

Las Figuras 15-16 muestran el efecto anticancerígeno del bromhidrato del Compuesto I en un modelo de xenoinjerto de linfoma de ratón.

La Figura 17 representa el patrón de difracción de rayos X en polvo del producto intermedio sintético 2 (no de acuerdo con la invención).

Las Figuras 18A y B representan (A) el patrón de difracción de rayos X en polvo de la sal triclorhidrato del Compuesto I (no de acuerdo con la invención) y (B) la sorción dinámica de vapor de la sal monoclorhidrato del Compuesto I (no de acuerdo con la invención), lo que demuestra la higroscopicidad significativa de este compuesto.

Descripción detallada de la invención

Forma de la sal HBr y forma polimórfica A

El bromhidrato de N-((4,6-dimetil-2-oxo-1,2-dihidropiridin-3-il)metil)-5-(etil(tetrahidro-2H-piran-4-il)amino)-4-metil-4'-(morfolinometil)-[1,1'-bifenil]-3-carboxamida es:

Como se usa en el presente documento, "Compuesto I" se refiere a N-((4,6-dimetil-2-oxo-1,2-dihidropiridin-3-il)metil)-5-(etil(tetrahidro-2H-piran-4-il)amino)-4-metil-4'-(morfolinometil)-[1,1'-bifenil]-3-carboxamida. El bromhidrato del Compuesto I se puede usar para inhibir la actividad de la histona metiltransferasa de EZH2, ya sea en un sujeto o in vitro. El bromhidrato del Compuesto I también se puede usar para tratar el cáncer en un sujeto que lo necesite. El Compuesto I se puede protonar en uno o más de sus sitios básicos, tal como las fracciones de morfolina, anilina disustituida y/o piridona. Por consiguiente, en el presente documento se describe el monobromhidrato, dibromhidrato o tribromhidrato del Compuesto I. Cuando el compuesto es el monobromhidrato, el compuesto puede protonarse en cualquier sitio básico. En una realización no limitante, el Compuesto I se protona en el nitrógeno del sustituyente morfolino, proporcionando un monobromhidrato del Compuesto I que tiene la siguiente estructura:

Este monobromhidrato en particular puede denominarse bromuro de "4-((3'-(((4,6-dimetil-2-oxo-1,2-dihidropiridin-3-il)metil)carbamoil)-5'-(etil(tetrahidro-2H-piran-4-il)amino)-4'-metil-[1,1'-bifenil]-4-il)metil)morfolin-4-io". La Figura 11 representa la estructura cristalina de rayos X de esta forma de sal en particular.

El bromhidrato del Compuesto I tiene una serie de propiedades físicas ventajosas sobre su forma de base libre, así como otras sales de la base libre. En particular, el bromhidrato del Compuesto I tiene baja higroscopicidad en comparación con otras formas de sal del Compuesto I. Para que un compuesto sea efectivo en la terapia, generalmente se requiere que el compuesto sea mínimamente higroscópico. Las formas del fármaco que son altamente higroscópicas pueden ser inestables, ya que la velocidad de disolución de la forma del fármaco puede cambiar a medida que se almacena en entornos con humedad variable. Además, la higroscopicidad puede afectar la manipulación y fabricación a gran escala de un compuesto, ya que puede ser difícil determinar el peso real de un agente activo higroscópico cuando se prepara una composición farmacéutica que comprende ese agente. El bromhidrato del Compuesto I tiene una baja higroscopicidad en comparación con otras formas de sal del Compuesto I. Como tal, puede almacenarse durante períodos apreciables y no sufrir cambios perjudiciales, por ejemplo, en la solubilidad, la densidad o incluso en la composición química.

Además de las ventajas anteriores, el bromhidrato del Compuesto I se puede producir en una forma altamente cristalina, lo cual es útil en la preparación de formulaciones farmacéuticas y mejorará el manejo, la manipulación y el almacenamiento generales del compuesto farmacológico. En una realización preferida, la forma cristalina del bromhidrato del Compuesto I está en una forma denominada "Polimorfo A".

La capacidad de una sustancia de existir en más de una forma cristalina se define como polimorfismo; las diferentes formas cristalinas de una sustancia en particular se denominan "polimorfos". En general, el polimorfismo se ve afectado por la capacidad de una molécula de una sustancia para cambiar su conformación o formar diferentes interacciones intermoleculares o intramoleculares, particularmente enlaces de hidrógeno, lo que se refleja en diferentes arreglos de átomos en las redes cristalinas de diferentes polimorfos. Por el contrario, la forma externa general de una sustancia se conoce como "morfología", que se refiere a la forma externa del cristal y los planos presentes, sin referencia a la estructura interna. Los cristales pueden mostrar una morfología diferente de acuerdo con las diferentes condiciones, como, por ejemplo, la velocidad de crecimiento, la agitación y la presencia de impurezas.

Los distintos polimorfos de una sustancia pueden poseer distintas energías de la red cristalina y, por lo tanto, en estado sólido pueden mostrar distintas propiedades físicas como forma, densidad, punto de fusión, color, estabilidad, solubilidad, velocidad de disolución, etc., que pueden, a su vez, afectar la estabilidad, velocidad de disolución y/o biodisponibilidad de un polimorfo dado y su idoneidad para su uso como producto farmacéutico y en composiciones farmacéuticas.

El Polimorfo A es altamente cristalino y exhibe baja higroscopicidad. Además, este polimorfo se puede obtener de forma reproducible y los ligeros cambios en las condiciones de cristalización no dan como resultado diferentes formas de cristal.

El acceso a diferentes polimorfos del bromhidrato del Compuesto I es deseable por varias razones. Una de esas razones es que los polimorfos individuales pueden incorporar diferentes impurezas, o residuos químicos, tras la cristalización. Por ejemplo, las impurezas se pueden eliminar durante el proceso de conversión del Compuesto I en el Polimorfo A.

Sin querer limitarse a la teoría, las formas polimorfas que muestran formas cristalinas compactas poseen ventajas en términos de facilidad de filtración y facilidad de flujo. El Polimorfo A exhibe una forma cristalina compacta que por lo tanto posee estas ventajas.

En ciertas realizaciones, el Polimorfo A es identificable sobre la base de picos característicos en un análisis de difracción de rayos X en polvo. La difracción de rayos X en polvo, también conocida como XRPD, es una técnica científica que utiliza difracción de rayos X, neutrones o electrones en polvo, microcristalinos u otros materiales sólidos para la caracterización estructural de los materiales. En una realización, el Polimorfo A exhibe un patrón de difracción de rayos X en polvo que comprende uno o más picos seleccionados de picos característicos expresados en grados 2-theta a 3.9 /- 0.3 grados, 17.5 /- 0.3 grados y 22.0 /- 0.3 grados 2-theta. En otra realización, el polimorfo exhibe un patrón de difracción de rayos X en polvo que comprende picos característicos expresados en grados 2-theta a 3.9 /-0.3 grados, 17.5 /- 0.3 grados y 22.0 /- 0.3 grados 2-theta.

En una realización, el Polimorfo A exhibe un patrón de difracción de rayos X en polvo que comprende al menos 5 picos seleccionados de picos característicos expresados en grados 2-theta a 3.9 /- 0.3 grados, 10.1 /- 0.3 grados, 14.3 /- 0.3 grados, 17.5 /- 0.3 grados, 18.7 /- 0.3 grados, 20.6 /- 0.3 grados, 20.9 /- 0.3 grados, 21.8 /- 0.3 grados, 22.0 /- 0.3 grados, 23.3 /- 0.3 grados y 23.6 /- 0.3 grados 2-theta. En otra realización, el Polimorfo A exhibe un patrón de difracción de rayos X en polvo que comprende al menos 6 picos seleccionados de picos característicos expresados en grados 2-theta a 3.9 /- 0.3 grados, 10.1 /- 0.3 grados, 14.3 /- 0.3 grados, 17.5 /- 0.3 grados, 18.7 /- 0.3 grados, 20.6 /- 0.3 grados, 20.9 /- 0.3 grados, 21.8 /- 0.3 grados, 22.0 /- 0.3 grados, 23.3 /- 0.3 grados y 23.6 /- 0.3 grados 2-theta. En otra realización más, el Polimorfo A exhibe un patrón de difracción de rayos X en polvo que comprende al menos 7 picos seleccionados de picos característicos expresados en grados 2-theta a 3.9 /- 0.3 grados, 10.1 /- 0.3 grados, 14.3 /- 0.3 grados, 17.5 /- 0.3 grados, 18.7 /- 0.3 grados, 20.6 /- 0.3 grados, 20.9 /-0.3 grados, 21.8 /- 0.3 grados, 22.0 /- 0.3 grados, 23.3 /- 0.3 grados y 23.6 /- 0.3 grados 2-theta. En otra realización, el Polimorfo A exhibe un patrón de difracción de rayos X en polvo que comprende al menos 8 picos seleccionados de picos característicos expresados en grados 2-theta a 3.9 /- 0.3 grados, 10.1 /- 0.3 grados, 14.3 /- 0.3 grados, 17.5 /- 0.3 grados, 18.7 /- 0.3 grados, 20.6 /- 0.3 grados, 20.9 /- 0.3 grados, 21.8 /- 0.3 grados, 22.0 /- 0.3 grados, 23.3 /- 0.3 grados y 23.6 /- 0.3 grados 2-theta. En otra realización más, el Polimorfo A exhibe un patrón de difracción de rayos X en polvo que comprende al menos 9 picos seleccionados de picos característicos expresados en grados 2-theta a 3.9 /- 0.3 grados, 10.1 /- 0.3 grados, 14.3 /- 0.3 grados, 17.5 /- 0.3 grados, 18.7 /- grados, 20.6 /- 0.3 grados, 20.9 /- 0.3 grados, 21.8 /- 0.3 grados, 22.0 /- 0.3 grados, 23.3 /- 0.3 grados y 23.6 /- 0.3 grados 2-theta. En otra realización más, el polimorfo exhibe un patrón de difracción de rayos X en polvo que comprende al menos 10 picos seleccionados de picos característicos expresados en grados 2-theta a 3.9 /- 0.3 grados, 10.1 /- 0.3 grados, 14.3 /- 0.3 grados, 17.5 /- 0.3 grados, 18.7 /- 0.3 grados, 20.6 /- 0.3 grados, 20.9 /-0.3 grados, 21.8 /- 0.3 grados, 22.0 /- 0.3 grados, 23.3 /- 0.3 grados y 23.6 /- 0.3 grados 2-theta.

En otra realización más, el polimorfo exhibe un patrón de difracción de rayos X en polvo que comprende picos característicos expresados en grados 2-theta a 3.9 /- 0.3 grados, 14.3 /- 0.3 grados, 18.7 /- 0.3 grados, 23.3 /-0.3 grados y 23.6 /- 0.3 grados 2-theta.

En otra realización más, el polimorfo exhibe un patrón de difracción de rayos X en polvo que comprende picos característicos expresados en grados 2-theta a 3.9 /- 0.3 grados, 10.1 /- 0.3 grados, 14.3 /- 0.3 grados, 17.5 /-0.3 grados, 18.7 /- 0.3 grados, 20.6 /- 0.3 grados, 20.9 /- 0.3 grados, 21.8 /- 0.3 grados, 22.0 /- 0.3 grados, 23.3 /- 0.3 grados y 23.6 /- 0.3 grados 2-theta. En otra realización más, el polimorfo exhibe un patrón de difracción de rayos X en polvo sustancialmente de acuerdo con la Figura 1. En otra realización, el polimorfo exhibe un patrón de difracción de rayos X en polvo sustancialmente de acuerdo con los valores 2-theta enumerados en la Tabla 1.

Como se usa en el presente documento, el término "aproximadamente", cuando se usa en referencia a un valor de grado 2-theta, se refiere al valor establecido /- 0.3 grados 2-theta.

Las composiciones farmacéuticas que comprenden Polimorfo A pueden identificarse mediante la comparación de los patrones de difracción de rayos X en polvo de las composiciones con un patrón de difracción de rayos X en polvo del Polimorfo A. Se apreciará que las composiciones farmacéuticas que comprenden Polimorfo A pueden exhibir patrones de difracción de rayos X en polvo no idénticos en comparación con un patrón de difracción de rayos X en polvo del Polimorfo A puro.

En ciertas realizaciones, el Polimorfo A es identificable sobre la base de un pico característico observado en un termograma de calorimetría diferencial de barrido. La calorimetría diferencial de barrido, o DSC, es una técnica termoanalítica en la que la diferencia en la cantidad de calor necesaria para aumentar la temperatura de una muestra y una referencia se mide en función de la temperatura. En una realización, el Polimorfo A exhibe un termograma de calorimetría diferencial de barrido que tiene un pico característico expresado en unidades de °C a una temperatura de aproximadamente 255 /- 5 °C. En otra realización, el Polimorfo A exhibe un termograma de calorimetría diferencial de barrido que tiene un único pico endotérmico observado en el intervalo de temperatura de 250 - 255 °C. En otra realización, el Polimorfo A exhibe un termograma de calorimetría diferencial de barrido sustancialmente de acuerdo con la Figura 3.

En ciertas realizaciones, el Polimorfo A puede contener impurezas. Los ejemplos no limitativos de impurezas incluyen formas polimórficas no deseadas o moléculas orgánicas e inorgánicas residuales tales como disolventes, agua o sales. En una realización, el Polimorfo A está libre de impurezas. En otra realización, el Polimorfo A contiene menos del 10 % en peso de impurezas totales. En otra realización, el Polimorfo A contiene menos del 5 % en peso de impurezas totales. En otra realización, el Polimorfo A contiene menos del 1 % en peso de impurezas totales. En otra realización más, el Polimorfo A contiene menos del 0.1% en peso de impurezas totales.

En ciertas realizaciones, el Polimorfo A es un sólido cristalino sustancialmente libre de bromhidrato del Compuesto I amorfo. Como se usa en el presente documento, el término "sustancialmente libre de bromhidrato del Compuesto I amorfo" significa que el compuesto no contiene una cantidad significativa de bromhidrato del Compuesto I amorfo. En ciertas realizaciones, está presente al menos aproximadamente el 95 % en peso del Polimorfo A cristalino. En aún otras realizaciones de la invención, está presente al menos aproximadamente el 99 % en peso del Polimorfo A cristalino.

En otra realización, el Polimorfo A está sustancialmente libre de Polimorfo B.

La sal de la invención, y su forma cristalina del Polimorfo A, se pueden encontrar junto con otras sustancias o se pueden aislar. En algunas realizaciones, la sal de la invención, o su forma cristalina, se aísla sustancialmente. Por "sustancialmente aislada" se entiende que la sal o su forma cristalina está al menos parcial o sustancialmente separada del entorno en el que se formó o detectó. La separación parcial puede incluir, por ejemplo, una composición enriquecida en la sal de la invención. La separación sustancial puede incluir composiciones que contienen al menos aproximadamente 50 %, al menos aproximadamente 60 %, al menos aproximadamente 70 %, al menos aproximadamente 80 %, al menos aproximadamente 90 %, al menos aproximadamente 95 %, al menos aproximadamente 97 %, o al menos aproximadamente el 99 % en peso del bromhidrato del Compuesto I y el Polimorfo A. Los métodos para aislar compuestos y sus sales son rutinarios en la técnica.

Tanto el bromhidrato del Compuesto I como del Polimorfo A pueden presentarse como cualquier tautómero razonable o una mezcla de tautómeros razonables. Como se usa en el presente documento, "tautómero" se refiere a uno de dos 0 más isómeros estructurales que existen en equilibrio y se convierten fácilmente de una forma isomérica a otra. Los ejemplos incluyen tautómeros de ceto-enol, tales como acetona/propen-2-ol y similares. El bromhidrato del Compuesto 1 y el Polimorfo A puede tener uno o más tautómeros y, por lo tanto, incluir varios isómeros, es decir, piridin-2(1H)-ona y el correspondiente piridin-2-ol. Todas estas formas isoméricas de estos compuestos están expresamente incluidas en la presente invención.

Preparación de la forma de la sal HBr y forma polimórfica A

El bromhidrato del Compuesto I, así como el Polimorfo A, se pueden preparar usando técnicas conocidas. Convencionalmente, una forma de sal se prepara combinando en solución el compuesto de base libre y un ácido que contiene el anión de la forma de sal deseada, y luego aislando el producto de sal sólida de la solución de la reacción (por ejemplo, por cristalización, precipitación, evaporación, etc.). Se pueden emplear otras técnicas de formación de sal.

El Esquema 1 a continuación describe una realización particular para la producción de la base libre del Compuesto I, así como el bromhidrato del Compuesto I. Brevemente, se hace reaccionar 3-amino-5-bromo-2-metilbenzoato de metilo (1) con dihidro-2H-piran-4(3H)-ona en condiciones de aminación reductora para formar 5-bromo-2-metil-3-((tetrahidro-2H-piran-4-il)amino)benzoato de metilo (2) en la etapa 1. En la etapa 2, se vuelve a utilizar la aminación reductora para formar 5-bromo-3-(etil(tetrahidro-2H-piran-4-il)amino)-2-metilbenzoato (3). Este compuesto luego se hace reaccionar bajo condiciones de acoplamiento de Suzuki en la etapa 3 para formar 5-(etil(tetrahidro-2H-piran-4-il)amino)-4-metil-4'-(morfolinometil)-[1,1'-bifenil]-3-carboxilato de metilo (4), que se hidroliza al ácido correspondiente (5) en la etapa 4. En la etapa 5, el ácido (5) se hace reaccionar en condiciones de reacción de acoplamiento de amida con clorhidrato de 3-(aminometil)-4,6-dimetil-dihidro-piridin-2(1H)-ona para formar el Compuesto I.

Como se muestra, el Compuesto I se puede hacer reaccionar con HBr acuoso para formar el bromhidrato del Compuesto I.

La síntesis descrita anteriormente tiene una serie de ventajas. Por ejemplo, utiliza una serie de productos intermedios que se pueden preparar en formas cristalinas que se pueden aislar. Mediante el uso de productos intermedios cristalinos, son necesarias técnicas mínimas de purificación (por ejemplo, cromatografía), lo que lleva a un rendimiento general mejorado del Compuesto I final.

Por consiguiente, en la presente invención se proporciona el compuesto intermedio 1 en forma cristalina. En otra realización, se proporciona en el presente documento el compuesto intermedio 2 en forma cristalina. La Figura 17 muestra un patrón de difracción de rayos X en polvo del compuesto cristalino 2. En aún otra realización, el compuesto intermedio 5 es cristalino. La Figura 9 muestra un patrón de difracción de rayos X en polvo del compuesto cristalino 5. En otras realizaciones, los compuestos 2 y/o 5 se producen en forma sustancialmente pura sin el uso de cromatografía. El experto en la materia apreciará que la cristalización de los productos intermedios no procede necesariamente sin esfuerzo o de manera eficiente.

También se proporciona en este documento un método para preparar N-((4,6-dimetil-2-oxo-1,2-dihidropiridin-3-il)metil)-5-(etil(tetrahidro-2H-piran-4-il)amino)-4-metil-4'-(morfolinometil)-[1,1'-bifenil]-3-carboxamida que comprende la reacción del ácido 5-(etil(tetrahidro-2H-piran-4-il)amino)-4-metil-4'-(morfolinometil)-[1,1'-bifenil]-3-carboxílico (5) con una sal de 3-(aminometil)-4,6-dimetil-dihidro-piridin-2(1H)-ona. En una realización de este método, (5) está en forma cristalina.

El compuesto I se puede hacer reaccionar con HBr acuoso en presencia de un disolvente apropiado para formar el Polimorfo A, una forma cristalina particular del bromhidrato. En una realización, el Compuesto I se hace reaccionar con HBr acuoso en presencia de etanol y acetato de etilo para formar el Polimorfo A.

Una vez que se prepara el polimorfo, se puede recristalizar usando el mismo disolvente (o disolventes) que se usaron para preparar el polimorfo, o un disolvente (o disolventes) diferente, para producir una composición que tiene una mayor cristalinidad. En general, el Polimorfo A puede recristalizarse disolviendo el polimorfo en uno o más disolventes, opcionalmente calentándolo, seguido de una etapa opcional de enfriamiento y luego aislando la estructura cristalina, a través de, por ejemplo, una etapa de filtrado. Después de que el polimorfo se disuelva inicialmente en el primer disolvente (o combinación de disolventes), se puede agregar un disolvente diferente adicional en cualquier punto del proceso (antes o después del calentamiento, antes o después del enfriamiento, etc.) para producir la estructura cristalina deseada. Por ejemplo, se puede usar un primer disolvente para disolver el compuesto polimorfo, y luego se puede agregar un segundo disolvente (por ejemplo, un antidisolvente) para hacer que el polimorfo se precipite de la solución. En una realización, se añade agua al primer disolvente para ayudar a disolver el polimorfo.

Ejemplos no limitativos de disolventes que se pueden utilizar para la recristalización del Polimorfo A son los siguientes: metanol, etanol, acetato de etilo, metil tert-butil éter, agua, alcohol isopropílico, tetrahidrofurano, acetona, acetonitrilo y 2-metiltetrahidrofurano, así como combinaciones de los mismos. Los ejemplos no limitativos de combinaciones de disolventes que son útiles para la recristalización del Polimorfo A son (disolvente y antidisolvente, en los que se puede añadir agua al primer disolvente para ayudar a disolver el polimorfo): metanol/agua y acetato de etilo, alcohol isopropílico/agua y acetato de etilo, tetrahidrofurano/agua y acetato de etilo, acetona y acetato de etilo, acetonitrilo/agua y acetato de etilo, etanol/agua y metil terc-butil éter, alcohol isopropílico/agua y metil terc-butil éter, etanol/agua y tetrahidrofurano, alcohol isopropílico/agua y acetona, y etanol/agua y acetato de etilo. En realizaciones particulares, las combinaciones de disolventes son metanol/agua y acetato de etilo, alcohol isopropílico/agua y acetato de etilo, etanol/agua y 2-metiltetrahidrofurano y metanol/2-metiltetrahidrofurano.

El Polimorfo A puede prepararse usando un método que comprende combinar N-((4,6-dimetil-2-oxo-1,2-dihidropiridin-3-il)metil)-5-(etil(tetrahidro-2H-piran-4-il)amino)-4-metil-4'-(morfolinometil)-[1,1'-bifenil]-3-carboxamida con ácido bromhídrico.

En el presente documento se describe un método para recristalizar el Polimorfo A, que comprende las siguientes etapas: (a) disolver el Polimorfo A en un primer disolvente, y (b) agregar un segundo disolvente, de manera que dicho polimorfo se recristalice. Por ejemplo, el primer disolvente es etanol y el segundo disolvente es MTBE. Por ejemplo, el método comprende (a) disolver el Polimorfo A en etanol, (b) calentar la mezcla, (c) agregar MTBE a la mezcla, formar un precipitado que comprende dicho polimorfo y filtrar el precipitado de manera que dicho polimorfo se recristalice.

Composiciones farmacéuticas

En otro aspecto, se proporciona en el presente documento una composición farmacéutica que comprende el bromhidrato del Compuesto I y un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable para su uso en el tratamiento de un trastorno de proliferación celular. También se proporciona en el presente documento una composición farmacéutica que comprende el Polimorfo A y un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable para su uso en el tratamiento de un trastorno de proliferación celular.

El término "composición farmacéutica" incluye preparaciones adecuadas para la administración a mamíferos, por ejemplo, seres humanos. Cuando los compuestos descritos en el presente documento se administran como productos farmacéuticos a mamíferos, por ejemplo, a humanos, pueden administrarse por sí mismos o como una composición farmacéutica que contiene, por ejemplo, 0.1 % a 99.9 % (más preferiblemente, 0.5 al 90 %) de ingrediente activo en combinación con un vehículo farmacéuticamente aceptable.

Los compuestos descritos en este documento (es decir, el bromhidrato del Compuesto I y el Polimorfo A) se pueden combinar con un vehículo farmacéuticamente aceptable de acuerdo con las técnicas convencionales de preparación de compuestos farmacéuticos. Como se usa en el presente documento, "vehículo farmacéuticamente aceptable" puede incluir todos y cada uno de los disolventes, diluyentes u otros vehículos líquidos, auxiliares de dispersión o suspensión, agentes activos de superficie, agentes isotónicos, agentes espesantes o emulsionantes, conservantes, aglutinantes sólidos, lubricantes y similares según sea adecuado para la forma de dosificación particular deseada. Remington's Pharmaceutical Sciences, Sixteenth Edition, E. W. Martin (Mack Publishing Co., Easton, Pa., 1980) divulga varios vehículos utilizados en la formulación de composiciones farmacéuticas y técnicas conocidas para la preparación de las mismas. Excepto en la medida en que cualquier medio de transporte convencional sea incompatible con los compuestos, por ejemplo, al producir algún efecto biológico indeseable o al interactuar de manera nociva con cualquier otro componente o componentes de la composición farmacéutica, se contempla que su uso esté dentro del alcance de este invención. Algunos ejemplos de materiales que pueden servir como vehículos farmacéuticamente aceptables incluyen, entre otros, azúcares tales como lactosa, glucosa y sacarosa; almidones tales como almidón de maíz y almidón de patata; celulosa y sus derivados tales como carboximetilcelulosa sódica, etilcelulosa y acetato de celulosa; tragacanto en polvo; malta; gelatina; talco; excipientes tales como manteca de cacao y ceras para supositorios; aceites tales como aceite de maní, aceite de semilla de algodón; aceite de cártamo, aceite de sésamo; aceite de oliva; aceite de maíz y aceite de soja; glicoles; tales como propilenglicol; ésteres tales como oleato de etilo y laurato de etilo; agar; agentes tamponantes tales como hidróxido de magnesio e hidróxido de aluminio; ácido algínico; agua libre de pirógenos; solución salina isotónica; solución de Ringer; alcohol etílico y soluciones tampón de fosfato, así como otros lubricantes compatibles no tóxicos tales como el laurilsulfato de sodio y el estearato de magnesio, así como agentes colorantes, agentes de liberación, agentes de recubrimiento, edulcorantes, aromatizantes y agentes perfumantes, conservantes y antioxidantes también pueden estar presentes en la composición, a juicio del formulador.

Además, el vehículo puede tomar una amplia variedad de formas dependiendo de la forma de preparación deseada para la administración, por ejemplo, oral, nasal, rectal, vaginal, parenteral (incluyendo inyecciones o infusiones intravenosas). En la preparación de composiciones para la forma de dosificación oral, se puede emplear cualquiera de los medios farmacéuticos habituales. Los medios farmacéuticos habituales incluyen, por ejemplo, agua, glicoles, aceites, alcoholes, agentes saborizantes, conservantes, agentes colorantes y similares en el caso de preparaciones líquidas orales (tales como, por ejemplo, suspensiones, soluciones, emulsiones y elixires); aerosoles; o vehículos tales como almidones, azúcares, celulosa microcristalina, diluyentes, agentes de granulación, lubricantes, aglutinantes, agentes desintegrantes y similares, en el caso de preparaciones sólidas orales (tales como, por ejemplo, polvos, cápsulas y comprimidos).

Agentes humectantes, emulsionantes y lubricantes, tales como lauril sulfato de sodio y estearato de magnesio, así como agentes colorantes, agentes de liberación, agentes de recubrimiento, agentes edulcorantes, saborizantes y perfumantes, conservantes y antioxidantes también pueden estar presentes en las composiciones.

Los ejemplos de antioxidantes farmacéuticamente aceptables incluyen: antioxidantes solubles en agua, tales como ácido ascórbico, clorhidrato de cisteína, bisulfato de sodio, metabisulfito de sodio, sulfito de sodio y similares; antioxidantes solubles en aceite, tales como palmitato de ascorbilo, hidroxianisol butilado (BHA), hidroxitolueno butilado (BHT), lecitina, galato de propilo, tocoferoles y similares; y agentes quelantes de metales, tales como ácido cítrico, ácido etilendiaminotetraacético (EDTA), sorbitol, ácido tartárico, ácido fosfórico y similares.

Las composiciones farmacéuticas que comprenden los compuestos pueden formularse para tener cualquier concentración deseada. En algunas realizaciones, la composición se formula de manera que comprenda al menos una cantidad terapéuticamente eficaz. En algunas realizaciones, la composición se formula de modo que comprenda una cantidad que no cause uno o más efectos secundarios no deseados.

Debido a que la forma cristalina del bromhidrato del Compuesto I se mantiene más fácilmente durante su preparación, las formas de dosificación sólidas son una forma preferida para la composición farmacéutica descrita en este documento. Se prefieren particularmente formas de dosificación sólidas para administración oral, tales como cápsulas, comprimidos, píldoras, polvos y gránulos. Si se desea, los comprimidos se pueden recubrir mediante técnicas conocidas por los expertos en la materia.

Las composiciones farmacéuticas incluyen las adecuadas para la administración oral, sublingual, nasal, rectal, vaginal, tópica, bucal y parenteral (incluidas las subcutáneas, intramusculares e intravenosas), aunque la vía más adecuada dependerá de la naturaleza y gravedad de la afección que se esté tratando. Las composiciones pueden presentarse convenientemente en forma de dosificación unitaria y prepararse mediante cualquiera de los métodos bien conocidos en la técnica farmacéutica. En ciertas realizaciones, la composición farmacéutica se formula para administración oral en forma de píldora, cápsula, pastilla o comprimido. En otras realizaciones, la composición farmacéutica se encuentra en forma de suspensión.

Los compuestos proporcionados en el presente documento son adecuados como agente activo en composiciones farmacéuticas que son eficaces particularmente para tratar trastornos asociados con EZH2, especialmente el cáncer. La composición farmacéutica en diversas realizaciones tiene una cantidad farmacéuticamente eficaz del bromhidrato del Compuesto I o Polimorfo A, junto con otros excipientes, vehículos, rellenos, diluyentes y similares farmacéuticamente aceptables.

Una "cantidad eficaz" terapéutica o farmacéuticamente es una cantidad de un compuesto (el bromhidrato del Compuesto I o Polimorfo A) que, cuando se administra a un paciente, mejora un síntoma de una enfermedad o afección, por ejemplo, previene los diversos síntomas morfológicos y somáticos de cáncer. En un ejemplo, una cantidad eficaz del bromhidrato del Compuesto I o del Polimorfo A es la cantidad suficiente para tratar el cáncer en un sujeto. La cantidad puede variar dependiendo de factores tales como el tamaño y el peso del sujeto, el tipo de enfermedad o el compuesto particular de la invención. La cantidad de bromhidrato del Compuesto I o Polimorfo A que constituye una “cantidad eficaz” variará dependiendo del compuesto, el estado de la enfermedad y su gravedad, la edad del paciente a tratar y similares. La cantidad eficaz puede ser determinada de forma rutinaria por un experto en la técnica teniendo en cuenta su conocimiento y esta divulgación.

El régimen de administración puede afectar lo que constituye una cantidad farmacéuticamente eficaz. El bromhidrato del Compuesto I o el Polimorfo A, y las composiciones que comprenden cualquiera de estos compuestos, pueden administrarse al sujeto antes o después del inicio de una enfermedad. Además, pueden administrarse diariamente o secuencialmente varias dosis divididas, así como dosis escalonadas, o la dosis puede infundirse de forma continua, o puede ser una inyección en bolo. Además, las dosis pueden aumentarse o disminuirse proporcionalmente de acuerdo con lo indiquen las exigencias de la situación terapéutica o profiláctica.

Métodos de tratamiento

El bromhidrato del Compuesto I, así como el Polimorfo A inhiben la actividad de la histona metiltransferasa de EZH2 o un mutante del mismo y, en consecuencia, en un aspecto de la invención, estos compuestos divulgados en el presente documento son candidatos para tratar o prevenir ciertas afecciones y enfermedades. La presente invención proporciona estos compuestos para tratar afecciones y enfermedades cuyo curso puede verse afectado por la modulación del estado de metilación de las histonas u otras proteínas, en el que dicho estado de metilación está mediado al menos en parte por la actividad de EZH2. La modulación del estado de metilación de las histonas puede, a su vez, influir en el nivel de expresión de los genes diana activados por la metilación y/o los genes diana suprimidos por la metilación. El uso puede incluir la administración a un sujeto que necesite dicho tratamiento, una cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto descrito en el presente documento.

El trastorno en el que interviene la metilación de proteínas mediada por EZH2 puede ser cáncer o una afección precancerosa. La presente invención proporciona además el uso del bromhidrato del Compuesto I, así como del Polimorfo A en el tratamiento del cáncer o precáncer, cuyo curso puede verse influenciado por la modulación de la metilación de la proteína mediada por EZH2, o para la preparación de un medicamento útil para el tratamiento de dicho cáncer o precáncer. Los ejemplos de cánceres que pueden tratarse incluyen linfomas, que incluyen linfoma no Hodgkin, linfoma folicular (FL) y linfoma difuso de células B grandes (DLBCL); melanoma; y leucemia, incluyendo CML. Un ejemplo de condición precancerosa incluye el síndrome mielodisplásico (MDS; anteriormente conocido como preleucemia).

En aún otra realización, se proporcionan en el presente documento estos compuestos para su uso en el tratamiento de un linfoma que comprende administrar al sujeto que lo necesita una cantidad eficaz del bromhidrato del Compuesto I.

En otra realización más, se proporcionan en el presente documento estos compuestos para su uso en el tratamiento de un linfoma que comprende administrar a un sujeto que lo necesite una cantidad efectiva de Polimorfo A.

En el presente documento se describen métodos para proteger contra un trastorno en el que la metilación de proteínas mediada por EZH2 desempeña un papel en un sujeto que lo necesita mediante la administración de una cantidad terapéuticamente eficaz del compuesto (es decir, el bromhidrato del Compuesto I, así como el Polimorfo A) a un sujeto que necesite dicho tratamiento. El trastorno puede ser cáncer, por ejemplo, cáncer en el que juega un papel la metilación de proteínas mediada por EZH2. En el presente documento se describe el uso del compuesto (es decir, el bromhidrato del Compuesto I, así como el Polimorfo A) para la preparación de un medicamento útil para la prevención de un trastorno de proliferación celular asociado, al menos en parte, con la metilación de proteínas mediada por EZH2.

Los compuestos descritos en el presente documento se pueden usar para modular la metilación de proteínas (por ejemplo, histona), por ejemplo, para modular la actividad de la enzima histona metiltransferasa o histona desmetilasa. Al menos algunos de los compuestos descritos en el presente documento pueden usarse in vivo o in vitro para modular la metilación de proteínas. Se ha informado que la metilación de histonas está involucrada en la expresión aberrante de ciertos genes en cánceres y en el silenciamiento de genes neuronales en células no neuronales. Al menos algunos compuestos descritos en el presente documento son candidatos adecuados para tratar estas enfermedades, es decir, para disminuir la metilación o restaurar la metilación aproximadamente a su nivel en las células normales equivalentes.

Los compuestos que son moduladores de la metilación pueden usarse para modular la proliferación celular. Por ejemplo, en algunos casos, la proliferación excesiva puede reducirse con agentes que disminuyen la metilación, mientras que la proliferación insuficiente puede estimularse con agentes que aumentan la metilación. Por consiguiente, las enfermedades que pueden tratarse con los compuestos de la invención pueden incluir enfermedades hiperproliferativas, tales como el crecimiento de células benignas y el crecimiento de células malignas.

Como se usa en el presente documento, un "sujeto que lo necesita" es un sujeto que tiene un trastorno en el que la metilación de proteínas mediada por EZH2 juega un papel, o un sujeto que tiene un mayor riesgo de desarrollar tal trastorno en relación con la población en general. Un sujeto que lo necesite puede tener un estado precanceroso. Preferiblemente, un sujeto que lo necesite tiene cáncer. Un "sujeto" incluye un mamífero. El mamífero puede ser, por ejemplo, un mamífero humano o no humano apropiado, tal como un primate, un ratón, una rata, un perro, un gato, una vaca, un caballo, una cabra, un camello, una oveja o un cerdo. El sujeto también puede ser un pájaro o un ave de corral. En una realización, el mamífero es un ser humano.

Como se usa en el presente documento, el término "trastorno proliferativo celular" se refiere a afecciones en las que el crecimiento no regulado o anormal, o ambos, de las células puede conducir al desarrollo de una condición o enfermedad no deseada, que puede ser cancerosa o no. Los ejemplos de trastornos de proliferación celular que pueden tratarse con los compuestos descritos en el presente documento abarcan una variedad de afecciones en las que la división celular está desregulada. Los ejemplos de trastornos de proliferación celular incluyen, pero no se limitan a, neoplasias, tumores benignos, tumores malignos, afecciones precancerosas, tumores in situ, tumores encapsulados, tumores metastásicos, tumores líquidos, tumores sólidos, tumores inmunológicos, tumores hematológicos, cánceres, carcinomas, leucemias, linfomas, sarcomas y células de división rápida. El término "célula que se divide rápidamente", como se usa en el presente documento, se define como cualquier célula que se divide a una velocidad que excede o es mayor que la esperada u observada entre células vecinas o yuxtapuestas dentro del mismo tejido. Un trastorno de proliferación celular incluye un precáncer o una condición precancerosa. Un trastorno de proliferación celular incluye el cáncer. Los métodos descritos en este documento se utilizan para tratar o aliviar un síntoma de cáncer o para identificar candidatos adecuados para tales fines. El término "cáncer" incluye tumores sólidos, así como tumores hematológicos y/o malignidades. Una "célula de precáncer" o "célula precancerosa" es una célula que manifiesta un trastorno proliferativo celular que es un precáncer o una condición precancerosa. Una “célula de cancer” o “célula cancerosa” es una célula que manifiesta un trastorno proliferativo celular que es un cáncer. Puede usarse cualquier medio reproducible de medición para identificar células cancerosas o células precancerosas. Las células cancerosas o las células precancerosas pueden identificarse mediante tipificación histológica o clasificación de una muestra de tejido (por ejemplo, una muestra de biopsia). Las células de cáncer o las células precancerosas se pueden identificar mediante el uso de marcadores moleculares apropiados.

Los ejemplos de afecciones o trastornos no cancerosos que pueden tratarse utilizando uno o más compuestos descritos en el presente documento incluyen, entre otros, artritis reumatoide; inflamación; enfermedad autoinmune; afecciones linfoproliferativas; acromegalia; espondilitis reumatoide; osteoartritis; gota, otras afecciones artríticas; septicemia; choque séptico; choque endotóxico; sepsis por bacteria gramnegativas; síndrome de choque tóxico; asma; síndrome de dificultad respiratoria del adulto; afección pulmonar obstructiva crónica; inflamación pulmonar crónica; enfermedad inflamatoria intestinal; enfermedad de Crohn; soriasis; eczema; colitis ulcerosa; fibrosis pancreática; fibrosis hepática; enfermedad renal aguda y crónica; síndrome del intestino irritable; piresis; reestenosis; paludismo cerebral; accidente cerebrovascular y lesión isquémica; trauma neural; enfermedad de Alzheimer; enfermedad de Huntington; enfermedad de Parkinson; dolor agudo y crónico; rinitis alérgica; conjuntivitis alérgica; insuficiencia cardíaca crónica; síndrome coronario agudo; caquexia; malaria; lepra; leishmaniasis; enfermedad de Lyme; síndrome de Reiter; sinovitis aguda; degeneración muscular, bursitis; tendinitis; tenosinovitis; síndrome del disco intervertebral herniado, roto o prolapsado; osteopetrosis; trombosis; restenosis; silicosis; sarcosis pulmonar; enfermedades de reabsorción ósea, tales como osteoporosis; reacción de injerto contra huésped; esclerosis múltiple; lupus; fibromialgia; SIDA y otras enfermedades virales tales como herpes Zoster, herpes simple I o II, virus de influenza y citomegalovirus; y diabetes mellitus.

Los ejemplos de cánceres que se pueden tratar usando uno o más compuestos descritos en el presente documento incluyen, pero no se limitan a, carcinoma adrenocortical, cánceres relacionados con el SIDA, linfoma relacionado con el SIDA, cáncer anal, cáncer anorrectal, cáncer del canal anal, cáncer de apéndice, astrocitoma cerebeloso infantil, astrocitoma cerebral infantil, carcinoma de células basales, cáncer de piel (no melanoma), cáncer biliar, cáncer de las vías biliares extrahepáticas, cáncer de las vías biliares intrahepáticas, cáncer de vejiga, cáncer de vejiga urinaria, cáncer de huesos y articulaciones, osteosarcoma e histiocitoma fibroso maligno, cáncer cerebral, tumor cerebral, glioma del tronco encefálico, astrocitoma cerebeloso, astrocitoma cerebral/glioma maligno, ependimoma, meduloblastoma, tumores neuroectodérmicos primitivos supratentoriales, glioma hipotalámico y de la vía visual, cáncer de mama, adenomas bronquiales/carcinoides, tumor carcinoide, gastrointestinal, cáncer del sistema nervioso, linfoma del sistema nervioso, cáncer del sistema nervioso central, linfoma del sistema nervioso central, cáncer de cuello uterino, cánceres infantiles, leucemia linfocítica crónica, leucemia mielógena crónica, trastornos mieloproliferativos crónicos, cáncer de colon, cáncer colorrectal, linfoma cutáneo de células T, neoplasia linfoide, micosis fungoide, síndrome de Seziary, cáncer de endometrio, cáncer de esófago, tumor extracraneal de células germinales, tumor extragonadal de células germinales, cáncer de las vías biliares extrahepáticas, cáncer de ojo, melanoma intraocular, retinoblastoma, cáncer de vesícula biliar, cáncer gástrico (de estómago), tumor carcinoide gastrointestinal, tumor del estroma gastrointestinal (GIST), tumor de células germinales, tumor de células germinales de ovario, glioma tumoral trofoblástico gestacional, cáncer de cabeza y cuello, cáncer hepatocelular (hígado), linfoma de Hodgkin, cáncer de hipofaringe, melanoma intraocular, cáncer ocular, tumores de células de los islotes (páncreas endocrino), sarcoma de Kaposi, cáncer de riñón, cáncer renal, cáncer de riñón, cáncer de laringe, leucemia linfoblástica aguda, leucemia mieloide aguda, leucemia linfocítica crónica, leucemia mielógena crónica, leucemia de células pilosas, cáncer de labio y cavidad oral, cáncer de hígado, cáncer de pulmón, cáncer de pulmón de células no pequeñas, cáncer de pulmón de células pequeñas, linfoma relacionado con el SIDA, linfoma no Hodgkin, linfoma primario del sistema nervioso central, macroglobulinemia de Waldenstrom, meduloblastoma, melanoma, melanoma intraocular (ojo), carcinoma de células de Merkel, mesotelioma maligno, mesotelioma, cáncer de cuello escamoso metastásico, cáncer de boca, cáncer de lengua, síndrome de neoplasia endocrina múltiple, micosis fungoide, síndromes mielodisplásicos, enfermedades mielodisplásicas/mieloproliferativas, leucemia mielógena crónica, leucemia mieloide aguda, mieloma múltiple, trastornos mieloproliferativos crónicos, cáncer nasofaríngeo, neuroblastoma, cáncer oral, cáncer de cavidad oral, cáncer orofaríngeo, cáncer de ovario, cáncer epitelial de ovario, tumor de ovario de bajo potencial maligno, cáncer de páncreas, cáncer de páncreas de células de los islotes, cáncer de seno paranasal y de cavidad nasal, cáncer de paratiroides, cáncer de pene, cáncer de faringe, feocromocitoma, pineoblastoma y tumores neuroectodérmicos primitivos supratentoriales, tumor hipofisario, neoplasia de células plasmáticas/mieloma múltiple, blastoma pleuropulmonar, cáncer de próstata, cáncer de recto, pelvis renal y uréter, cáncer de células de transición, retinoblastoma, rabdomiosarcoma, cáncer de glándulas salivales, familia de tumores del sarcoma de Ewing, sarcoma de Kaposi, sarcoma de tejido blando, cáncer uterino, sarcoma uterino, cáncer de piel (no melanoma), cáncer de piel (melanoma), carcinoma de piel de células de Merkel, cáncer de intestino delgado, sarcoma de tejido blando, carcinoma de células escamosas, cáncer de estómago (gástrico), tumores neuroectodérmicos primitivos supratentoriales, cáncer testicular, cáncer de garganta, timoma, timoma y carcinoma tímico, cáncer de tiroides, cáncer de células de transición de la pelvis renal y uréter y otros órganos urinarios, tumor trofoblástico gestacional, cáncer de uretra, cáncer endometrial uterino, sarcoma uterino, cáncer del cuerpo uterino, cáncer de vagina, cáncer de vulva y tumor de Wilm.

Un "trastorno de proliferación celular del sistema hematológico" es un trastorno de proliferación celular que afecta a células del sistema hematológico. Un trastorno de proliferación celular del sistema hematológico puede incluir linfoma, leucemia, neoplasias mieloides, neoplasias de mastocitos, mielodisplasia, gammapatía monoclonal benigna, granulomatosis linfomatoide, papulosis linfomatoide, policitemia vera, leucemia mielocítica crónica, metaplasia mieloide agnogénica y trombocitemia esencial. Un trastorno de proliferación celular del sistema hematológico puede incluir hiperplasia, displasia y metaplasia de células del sistema hematológico. En un aspecto, las composiciones descritas en el presente documento se pueden usar para tratar un cáncer seleccionado del grupo que consiste en un cáncer hematológico o un trastorno proliferativo de células hematológicas, o se pueden usar para identificar candidatos adecuados para dichos fines. Un cáncer hematológico puede incluir mieloma múltiple, linfoma (incluyendo linfoma de Hodgkin, linfoma no Hodgkin, linfomas infantiles y linfomas de origen linfocítico y cutáneo), leucemia (incluyendo leucemia infantil, leucemia de células pilosas, leucemia linfocítica aguda, leucemia mielocítica aguda, leucemia linfocítica crónica, leucemia mielocítica crónica, leucemia mielógena crónica y leucemia de mastocitos), neoplasias mieloides y neoplasias de mastocitos.

Un “trastorno de proliferación celular del pulmón” es un trastorno de proliferación celular que afecta a las células del pulmón. Los trastornos proliferativos celulares del pulmón pueden incluir todas las formas de trastornos proliferativos celulares que afectan a las células pulmonares. Los trastornos de proliferación celular del pulmón pueden incluir cáncer de pulmón, un precáncer o una condición precancerosa del pulmón, crecimientos o lesiones benignos del pulmón y crecimientos o lesiones malignos del pulmón, y lesiones metastásicas en tejidos y órganos del cuerpo diferentes al pulmón. En un aspecto, las composiciones descritas en el presente documento se pueden usar para tratar el cáncer de pulmón o los trastornos de proliferación celular del pulmón, o se pueden usar para identificar candidatos adecuados para dichos fines. El cáncer de pulmón puede incluir todas las formas de cáncer de pulmón. El cáncer de pulmón puede incluir neoplasias pulmonares malignas, carcinoma in situ, tumores carcinoides típicos y tumores carcinoides atípicos. El cáncer de pulmón puede incluir cáncer de pulmón de células pequeñas ("SCLC"), cáncer de pulmón de células no pequeñas ("NSCLC"), carcinoma de células escamosas, adenocarcinoma, carcinoma de células pequeñas, carcinoma de células grandes, carcinoma de células adenoescamosas y mesotelioma. El cáncer de pulmón puede incluir "carcinoma cicatricial", carcinoma broncoalveolar, carcinoma de células gigantes, carcinoma de células fusiformes y carcinoma neuroendocrino de células grandes. El cáncer de pulmón puede incluir neoplasias pulmonares que tienen heterogeneidad histológica y ultraestructural (por ejemplo, tipos celulares mixtos).

Los trastornos proliferativos celulares del pulmón pueden incluir todas las formas de trastornos proliferativos celulares que afectan a las células pulmonares. Los trastornos de proliferación celular del pulmón pueden incluir cáncer de pulmón, condiciones precancerosas del pulmón. Los trastornos de proliferación celular del pulmón pueden incluir hiperplasia, metaplasia y displasia del pulmón. Los trastornos de proliferación celular del pulmón pueden incluir hiperplasia inducida por asbesto, metaplasia escamosa y metaplasia mesotelial reactiva benigna. Los trastornos de proliferación celular del pulmón pueden incluir el reemplazo del epitelio cilíndrico por epitelio escamoso estratificado y displasia de la mucosa. Los individuos expuestos a agentes ambientales nocivos inhalados, tales como el humo del cigarrillo y los asbestos, pueden tener un mayor riesgo de desarrollar trastornos de proliferación celular del pulmón. Las enfermedades pulmonares previas que pueden predisponer a los individuos al desarrollo de trastornos de proliferación celular del pulmón pueden incluir enfermedad pulmonar intersticial crónica, enfermedad pulmonar necrosante, esclerodermia, enfermedad reumatoide, sarcoidosis, neumonitis intersticial, tuberculosis, neumonías repetidas, fibrosis pulmonar idiopática, granulomas, asbestosis, alveolitis fibrosante y enfermedad de Hodgkin.

Un “trastorno proliferativo celular del colon” es un trastorno proliferativo celular que afecta a las células del colon. Preferiblemente, el trastorno de proliferación celular del colon es el cáncer de colon. En un aspecto, las composiciones descritas en el presente documento se pueden usar para tratar el cáncer de colon o los trastornos de proliferación celular del colon, o se pueden usar para identificar candidatos adecuados para tales fines. El cáncer de colon puede incluir todas las formas de cáncer de colon. El cáncer de colon puede incluir cánceres de colon esporádicos y hereditarios. El cáncer de colon puede incluir neoplasias malignas de colon, carcinoma in situ, tumores carcinoides típicos y tumores carcinoides atípicos. El cáncer de colon puede incluir adenocarcinoma, carcinoma de células escamosas y carcinoma de células adenoescamosas. El cáncer de colon puede estar asociado con un síndrome hereditario seleccionado del grupo que consiste en cáncer colorrectal hereditario sin poliposis, poliposis adenomatosa familiar, síndrome de Gardner, síndrome de Peutz-Jeghers, síndrome de Turcot y poliposis juvenil. El cáncer de colon puede ser causado por un síndrome hereditario seleccionado del grupo que consiste en cáncer colorrectal hereditario sin poliposis, poliposis adenomatosa familiar, síndrome de Gardner, síndrome de Peutz-Jeghers, síndrome de Turcot y poliposis juvenil.

Los trastornos proliferativos celulares del colon pueden incluir todas las formas de trastornos proliferativos celulares que afectan a las células del colon. Los trastornos de proliferación celular del colon pueden incluir cáncer de colon, estados precancerosos del colon, pólipos adenomatosos del colon y lesiones metacrónicas del colon. Un trastorno de proliferación celular del colon puede incluir adenoma. Los trastornos de proliferación celular del colon se pueden caracterizar por hiperplasia, metaplasia y displasia del colon. Las enfermedades de colon anteriores que pueden predisponer a los individuos al desarrollo de trastornos proliferativos celulares del colon pueden incluir cáncer de colon previo. Las enfermedades actuales que pueden predisponer a los individuos al desarrollo de trastornos proliferativos celulares del colon pueden incluir la enfermedad de Crohn y la colitis ulcerosa. Un trastorno de proliferación celular del colon puede estar asociado con una mutación en un gen seleccionado del grupo que consiste en p53, ras, FAP y DCC. Un individuo puede tener un riesgo elevado de desarrollar un trastorno proliferativo celular del colon debido a la presencia de una mutación en un gen seleccionado del grupo que consiste en p53, ras, FAP y DCC.

Un "trastorno de proliferación celular del páncreas" es un trastorno de proliferación celular que afecta a las células del páncreas. Los trastornos de proliferación celular del páncreas pueden incluir todas las formas de trastornos de proliferación celular que afectan a las células pancreáticas. Los trastornos de proliferación celular del páncreas pueden incluir cáncer de páncreas, precáncer o condición precancerosa del páncreas, hiperplasia del páncreas y displasia del páncreas, crecimientos o lesiones benignos del páncreas y crecimientos o lesiones malignos del páncreas y lesiones metastásicas en tejidos y órganos del cuerpo distintos del páncreas. El cáncer de páncreas incluye todas las formas de cáncer de páncreas. El cáncer de páncreas puede incluir adenocarcinoma ductal, carcinoma adenoescamoso, carcinoma pleomórfico de células gigantes, adenocarcinoma mucinoso, carcinoma de células gigantes similar a osteoclastos, cistoadenocarcinoma mucinoso, carcinoma acinar, carcinoma de células grandes no clasificado, carcinoma de células pequeñas, pancreatoblastoma, neoplasia papilar, cistoadenoma mucinoso, neoplasia quística papilar y cistoadenoma seroso. El cáncer de páncreas también puede incluir neoplasias pancreáticas que tienen heterogeneidad histológica y ultraestructural (por ejemplo, tipos de células mixtas).

Un "trastorno proliferativo celular de la próstata" es un trastorno proliferativo celular que afecta a las células de la próstata. Los trastornos proliferativos celulares de la próstata pueden incluir todas las formas de trastornos proliferativos celulares que afectan a las células de la próstata. Los trastornos proliferativos de células de la próstata pueden incluir cáncer de próstata, un precáncer o una afección precancerosa de la próstata, tumores o lesiones benignos de la próstata y tumores o lesiones malignos de la próstata, y lesiones metastásicas en tejidos y órganos del cuerpo que no sean la próstata. Los trastornos de proliferación celular de la próstata pueden incluir hiperplasia, metaplasia y displasia de la próstata.

Un "trastorno de proliferación celular de la piel" es un trastorno de proliferación celular que afecta a las células de la piel. Los trastornos de proliferación celular de la piel pueden incluir todas las formas de trastornos de proliferación celular que afectan a las células de la piel. Los trastornos de proliferación celular de la piel pueden incluir un afección de precáncer o precanceroso de la piel, crecimientos o lesiones benignos de la piel, melanoma, melanoma maligno y otros crecimientos o lesiones malignos de la piel, y lesiones metastásicas en tejidos y órganos del cuerpo, diferentes a la piel. Los trastornos de proliferación celular de la piel pueden incluir hiperplasia, metaplasia y displasia de la piel.

Un "trastorno de proliferación celular del ovario" es un trastorno de proliferación celular que afecta a las células del ovario. Los trastornos de proliferación celular del ovario pueden incluir todas las formas de trastornos de proliferación celular que afectan a las células del ovario. Los trastornos de proliferación celular del ovario pueden incluir un precáncer o una condición precancerosa del ovario, tumores o lesiones benignos del ovario, cáncer de ovario, tumores malignos o lesiones del ovario y lesiones metastásicas en tejidos y órganos del cuerpo distintos del ovario. Los trastornos de proliferación celular de la piel pueden incluir hiperplasia, metaplasia y displasia de las células del ovario.

Un "trastorno de proliferación celular de la mama" es un trastorno de proliferación celular que afecta a las células de la mama. Los trastornos proliferativos celulares de la mama pueden incluir todas las formas de trastornos proliferativos celulares que afectan a las células mamarias. Los trastornos de proliferación celular de la mama pueden incluir cáncer de mama, una afección de precáncer o precancerosa de la mama, tumores o lesiones benignos de la mama y tumores o lesiones malignos de la mama, y lesiones metastásicas en tejidos y órganos del cuerpo diferentes a la mama. Los trastornos de proliferación celular de la mama pueden incluir hiperplasia, metaplasia y displasia de la mama.

Un trastorno proliferativo celular de la mama puede ser una afección precancerosa de la mama. Las composiciones descritas en el presente documento se pueden usar para tratar un estado precanceroso de la mama. Una afección precancerosa de la mama puede incluir hiperplasia atípica de la mama, carcinoma ductal in situ (CDIS), carcinoma intraductal, carcinoma lobular in situ (LCIS), neoplasia lobular y crecimiento o lesión de la mama en estadio 0 o grado 0 (por ejemplo, cáncer de mama en estadio 0 o grado 0 o carcinoma in situ). Una afección precancerosa de la mama se puede estadificar de acuerdo con el esquema de clasificación TNM aceptado por el American Joint Committee on Cancer (AJCC), donde al tumor primario (T) se le ha asignado un estadio de T0 o Tis; y donde a los ganglios linfáticos regionales (N) se les ha asignado un estadio de N0; y donde a la metástasis distante (M) se le ha asignado un estadio de M0.

El trastorno proliferativo celular de la mama puede ser cáncer de mama. En un aspecto, las composiciones descritas en el presente documento se pueden usar para tratar el cáncer de mama o se pueden usar para identificar candidatos adecuados para dichos fines. El cáncer de mama puede incluir todas las formas de cáncer de mama. El cáncer de mama puede incluir cánceres de mama epiteliales primarios. El cáncer de mama puede incluir cánceres en los que la mama está afectada por otros tumores tales como linfoma, sarcoma o melanoma. El cáncer de mama puede incluir carcinoma de mama, carcinoma ductal de mama, carcinoma lobular de mama, carcinoma indiferenciado de mama, cistosarcoma filoides de mama, angiosarcoma de mama y linfoma primario de mama. El cáncer de mama puede incluir cáncer de mama en estadio I, II, IIIA, IIIB, IIIC y IV. El carcinoma ductal de mama puede incluir carcinoma invasivo, carcinoma invasivo in situ con componente intraductal predominante, cáncer de mama inflamatorio y un carcinoma ductal de mama con un tipo histológico seleccionado del grupo que consiste en comedón, mucinoso (coloide), medular, medular con infiltrado linfocitario, papilar, escirroso y tubular. El carcinoma lobular de mama puede incluir carcinoma lobular invasivo con componente predominante in situ, carcinoma lobular invasivo y carcinoma lobular infiltrante. El cáncer de mama puede incluir la enfermedad de Paget, la enfermedad de Paget con carcinoma intraductal y la enfermedad de Paget con carcinoma ductal invasivo. El cáncer de mama puede incluir neoplasias de mama que tienen heterogeneidad histológica y ultraestructural, por ejemplo, tipos celulares mixtos).

Los compuestos descritos en el presente documento se pueden usar para tratar el cáncer de mama o se pueden usar para identificar candidatos adecuados para dichos fines. Un cáncer de mama que se va a tratar puede incluir cáncer de mama familiar. Un cáncer de mama que se va a tratar puede incluir cáncer de mama esporádico. Un cáncer de mama que se va a tratar puede surgir en un sujeto masculino. Un cáncer de mama que se va a tratar puede surgir en un sujeto femenino. Un cáncer de mama que se va a tratar puede surgir en un sujeto femenino premenopáusico o en un sujeto femenino posmenopáusico. Un cáncer de mama a tratar puede surgir en un sujeto igual o mayor de 30 años, o en un sujeto menor de 30 años. Un cáncer de mama que se va a tratar ha surgido en un sujeto igual o mayor de 50 años, o en un sujeto menor de 50 años. Un cáncer de mama a tratar puede surgir en un sujeto igual o mayor de 70 años, o en un sujeto menor de 70 años.

Un cáncer de mama que se va a tratar se puede tipificar para identificar una mutación familiar o espontánea en BRCA1, BRCA2 o p53. Un cáncer de mama que se va a tratar se puede tipificar como si tuviera una amplificación del gen HER2/neu, si sobreexpresara HER2/neu, o si tuviera un nivel bajo, intermedio o alto de expresión de HER2/neu. Un cáncer de mama que se va a tratar se puede tipificar para un marcador seleccionado del grupo que consiste en receptor de estrógeno (ER), receptor de progesterona (PR), receptor-2 del factor de crecimiento epidérmico humano, Ki-67, CA 15-3, CA 27-29, y c-Met. Un cáncer de mama que se va a tratar se puede clasificar como desconocido para ER, rico en ER o pobre en ER. Un cáncer de mama que se va a tratar se puede clasificar como negativo para ER o positivo para ER. La tipificación de ER de un cáncer de mama se puede realizar por cualquier medio reproducible. La tipificación de ER de un cáncer de mama se puede realizar como se establece en Onkologie 27: 175-179 (2004). Un cáncer de mama que se va a tratar se puede clasificar como desconocido para PR, rico en PR o pobre en PR. Un cáncer de mama que se va a tratar se puede tipificar como negativo para PR o positivo para PR. Un cáncer de mama que se va a tratar puede clasificarse como receptor positivo o receptor negativo. Un cáncer de mama que se va a tratar puede clasificarse como asociado con niveles sanguíneos elevados de CA 15-3, o CA 27-29, o ambos.

Un cáncer de mama que se va a tratar puede incluir un tumor localizado en la mama. Un cáncer de mama que se va a tratar puede incluir un tumor de mama asociado con una biopsia negativa de ganglio linfático centinela (SLN). Un cáncer de mama que se va a tratar puede incluir un tumor de mama asociado con una biopsia positiva de ganglio linfático centinela (SLN). Un cáncer de mama que se va a tratar puede incluir un tumor de mama que está asociado con uno o más ganglios linfáticos axilares positivos, donde los ganglios linfáticos axilares se han estadificado mediante cualquier método aplicable. Un cáncer de mama que se va a tratar puede incluir un tumor de mama que se ha tipificado como que tiene un estado nodal negativo (por ejemplo, negativo para el nodo) o estado nodal positivo (por ejemplo, positivo para el nodo). Un cáncer de mama que se va a tratar puede incluir un tumor de mama que ha hecho metástasis en otros lugares del cuerpo. Un cáncer de mama que se va a tratar se puede clasificar como que ha hecho metástasis en un lugar seleccionado del grupo que consiste en hueso, pulmón, hígado o cerebro. Un cáncer de mama que se va a tratar se puede clasificar de acuerdo con una característica seleccionada del grupo que consiste en metastásico, localizado, regional, local-regional, localmente avanzado, distante, multicéntrico, bilateral, ipsilateral, contralateral, recién diagnosticado, recurrente e inoperable.

Un compuesto descrito en el presente documento se puede usar para tratar o prevenir un trastorno proliferativo celular de la mama, o para tratar o prevenir el cáncer de mama, en un sujeto que tiene un mayor riesgo de desarrollar cáncer de mama en relación con la población en general, o se puede usar para identificar candidatos para tales fines. Un sujeto con un mayor riesgo de desarrollar cáncer de mama en relación con la población en general es un sujeto femenino con antecedentes familiares o antecedentes personales de cáncer de mama. Un sujeto con un mayor riesgo de desarrollar cáncer de mama en relación con la población en general es un sujeto femenino que tiene una mutación espontánea o de línea germinal en BRCA1 o BRCA2, o ambos. Un sujeto con un mayor riesgo de desarrollar cáncer de mama en relación con la población en general es un sujeto femenino con antecedentes familiares de cáncer de mama y una mutación espontánea o de línea germinal en BRCA1 o BRCA2, o ambos. Un sujeto con un mayor riesgo de desarrollar cáncer de mama en relación con la población en general es una mujer mayor de 30 años, mayor de 40 años, mayor de 50 años, mayor de 60 años, mayor de 70 años, mayor de 80 años, o mayor de 90 años. Un sujeto con un mayor riesgo de desarrollar cáncer de mama en relación con la población en general es un sujeto con hiperplasia atípica de mama, carcinoma ductal in situ (DCIS), carcinoma intraductal, carcinoma lobular in situ (LCIS), neoplasia lobular, o un crecimiento o lesión de la mama en estadio 0 (por ejemplo, cáncer de mama en estadio 0 o grado 0 o carcinoma in situ).

Un cáncer de mama que se va a tratar puede clasificarse histológicamente de acuerdo con el sistema de Scarff-Bloom-Richardson, en el que a un tumor de mama se le ha asignado una puntuación de recuento de mitosis de 1,2 o 3; una puntuación de pleiomorfismo nuclear de 1,2 o 3; una puntuación de formación de túbulos de 1, 2 o 3; y una puntuación total de Scarff-Bloom-Richardson de entre 3 y 9. A un cáncer de mama que se va a tratar se le puede asignar un grado de tumor de acuerdo con el Panel de Consenso Internacional sobre el Tratamiento del Cáncer de Mama seleccionado del grupo que consta de grado 1, grado 1-2, grado 2, grado 2-3 o grado 3.

En el presente documento se describe un método para tratar el cáncer de mama que comprende administrar a un sujeto que lo necesite una cantidad eficaz del bromhidrato del Compuesto I.

En el presente documento se describe un método para tratar el cáncer de mama que comprende administrar a un sujeto que lo necesite una cantidad eficaz de Polimorfo A.

Un cáncer que se va a tratar puede clasificarse en etapas de acuerdo con el sistema de clasificación TNM del American Joint Committee on Cancer (AJCC), donde al tumor (T) se le ha asignado una estadio de TX, T1, T1mic, T1a, T1b, T1c, T2 , T3, T4, T4a, T4b, T4c o T4d; y donde a los ganglios linfáticos regionales (N) se les ha asignado un estadio de NX, N0, N1, N2, N2a, N2b, N3, N3a, N3b o N3c; y donde a la metástasis distante (m ) se le puede asignar un estadio de MX, M0 o M1. Un cáncer que se va a tratar puede estadificarse de acuerdo con la clasificación del American Joint Committee on Cancer (AJCC) como Estadio I, Estadio IIA, Estadio IIB, Estadio IIIA, Estadio IIIB, Estadio IIIC o Estadio IV. A un cáncer que se va a tratar se le puede asignar un grado de acuerdo con una clasificación del AJCC como Grado GX (por ejemplo, Grado que no se puede evaluar), Grado 1, Grado 2, Grado 3 o Grado 4. Un cáncer que se va a tratar se puede estadificar de acuerdo con una clasificación patológica (pN) del AJCC de pNX, pN0, PN0 (I-), PN0 (I+), PN0 (mol-), PN0 (mol+), PN1, PN1(mi), PN1a, PN1b, PN1c, pN2, pN2a, pN2b, pN3, pN3a, pN3b o pN3c.

Un cáncer que se va a tratar puede incluir un tumor que se ha determinado que tiene menos o igual a aproximadamente 2 centímetros de diámetro. Un cáncer que se va a tratar puede incluir un tumor que se ha determinado que tiene entre aproximadamente 2 y aproximadamente 5 centímetros de diámetro. Un cáncer que se va a tratar puede incluir un tumor que se ha determinado que es mayor o igual a aproximadamente 3 centímetros de diámetro. Un cáncer que se va a tratar puede incluir un tumor que se ha determinado que tiene más de 5 centímetros de diámetro. Un cáncer que se va a tratar puede clasificarse por apariencia microscópica como bien diferenciado, moderadamente diferenciado, pobremente diferenciado o indiferenciado. Un cáncer que se va a tratar se puede clasificar por apariencia microscópica con respecto al recuento de mitosis (por ejemplo, cantidad de división celular) o pleiomorfismo nuclear (por ejemplo, cambio en las células). Un cáncer que se va a tratar puede clasificarse por su apariencia microscópica como asociado con áreas de necrosis (por ejemplo, áreas de células muertas o degeneradas). Un cáncer que se va a tratar se puede clasificar como que tiene un cariotipo anormal, que tiene un número anormal de cromosomas o que tiene uno o más cromosomas que tienen una apariencia anormal. Un cáncer que se va a tratar puede clasificarse como aneuploide, triploide, tetraploide o con ploidía alterada. Un cáncer que se va a tratar se puede clasificar como que tiene una translocación cromosómica, o una eliminación o duplicación de un cromosoma completo, o una región de eliminación, duplicación o amplificación de una porción de un cromosoma.

Un cáncer que se va a tratar puede evaluarse mediante citometría de ADN, citometría de flujo o citometría de imagen. Un cáncer que se va a tratar se puede clasificar con un 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 % o 90 % de células en la etapa de síntesis de la división celular (por ejemplo, en la fase S de la división celular). Un cáncer que se va a tratar se puede tipificar como si tuviera una fracción de fase S baja o una fracción de fase S alta.

Como se usa en el presente documento, una "célula normal" es una célula que no puede clasificarse como parte de un "trastorno proliferativo celular". Una célula normal carece de crecimiento no regulado o anormal, o ambos, que pueden conducir al desarrollo de una condición o enfermedad no deseada. Preferiblemente, una célula normal posee mecanismos de control de puntos de control del ciclo celular que funcionan normalmente.

Como se usa en el presente documento, "ponerse en contacto con una célula" se refiere a una condición en la que un compuesto u otra composición de materia está en contacto directo con una célula, o está lo suficientemente cerca para inducir un efecto biológico deseado en una célula.

Como se usa en este documento, "compuesto candidato" se refiere a un compuesto descrito en este documento (es decir, el bromhidrato del Compuesto I, así como el Polimorfo A) que ha sido o será probado en uno o más ensayos biológicos in vitro o in vivo, con el fin de determinar si es probable que ese compuesto provoque una respuesta biológica o médica deseada en una célula, tejido, sistema, animal o ser humano que está buscando un investigador o un médico. Un compuesto candidato es un compuesto descrito en el presente documento. La respuesta biológica o médica puede ser el tratamiento del cáncer. La respuesta biológica o médica puede ser el tratamiento o la prevención de un trastorno de proliferación celular. La respuesta o efecto biológico también puede incluir un cambio en la proliferación o crecimiento celular que ocurre in vitro o en un modelo animal, así como otros cambios biológicos que son observables in vitro. Los ensayos biológicos in vitro o in vivo pueden incluir, entre otros, ensayos de actividad enzimática, ensayos de cambio de movilidad electroforética, ensayos de genes informadores, ensayos de viabilidad celular in vitro y los ensayos descritos en el presente documento.

Como se usa en el presente documento, "monoterapia" se refiere a la administración de un solo compuesto activo o terapéutico a un sujeto que lo necesita. Preferiblemente, la monoterapia implicará la administración de una cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto activo. Por ejemplo, la monoterapia contra el cáncer con uno de los compuestos descritos en el presente documento (es decir, el bromhidrato del Compuesto I, así como el Polimorfo A) a un sujeto que necesita tratamiento de cáncer. La monoterapia puede contrastarse con la terapia de combinación, en la que se administra una combinación de múltiples compuestos activos, preferiblemente con cada componente de la combinación presente en una cantidad terapéuticamente eficaz. En un aspecto, la monoterapia con un compuesto descrito en el presente documento es más eficaz que la terapia de combinación para inducir un efecto biológico deseado.

Como se usa en el presente documento, "tratamiento" o "tratar" describe el manejo y cuidado de un paciente con el fin de combatir una enfermedad, afección o trastorno e incluye la administración de un compuesto de la presente invención (es decir, el bromhidrato del Compuesto I, así como el Polimorfo A) para aliviar los síntomas o complicaciones de una enfermedad, afección o trastorno, o para eliminar la enfermedad, afección o trastorno. El término "tratar" también puede incluir el tratamiento de una célula in vitro o un modelo animal.

Un compuesto descrito en este documento (es decir, el bromhidrato del Compuesto I, así como el Polimorfo A) también se puede usar para prevenir una enfermedad, afección o trastorno, o se puede usar para identificar candidatos adecuados para dichos fines. Como se usa en el presente documento, "que previene" o "prevenir" describe reducir o eliminar la aparición de los síntomas o complicaciones de la enfermedad, afección o trastorno.

Como se usa en el presente documento, el término "aliviar" pretende describir un proceso mediante el cual se reduce la gravedad de un signo o síntoma de un trastorno. Es importante destacar que un signo o síntoma puede aliviarse sin eliminarse. La administración de las composiciones farmacéuticas descritas en el presente documento puede conducir a la eliminación de un signo o síntoma, sin embargo, no se requiere la eliminación. Se espera que las dosis efectivas reduzcan la gravedad de un signo o síntoma. Por ejemplo, un signo o síntoma de un trastorno como el cáncer, que puede ocurrir en múltiples ubicaciones, se alivia si la gravedad del cáncer disminuye en al menos una de las múltiples ubicaciones.

Como se usa en el presente documento, el término "gravedad" pretende describir el potencial del cáncer para transformarse de un estado precanceroso o benigno a un estado maligno. Alternativamente, o además, la gravedad pretende describir una etapa del cáncer, por ejemplo, de acuerdo con el sistema TNM (aceptado por la Unión Internacional contra el Cáncer (UICC) y el American Joint Committee on Cancer (AJCC)) o por otros métodos reconocidos en la técnica. El estadio del cáncer se refiere a la extensión o gravedad del cáncer, de acuerdo con factores como la ubicación del tumor primario, el tamaño del tumor, la cantidad de tumores y la afectación de los ganglios linfáticos (propagación del cáncer a los ganglios linfáticos). Alternativamente, o además, se pretende que la gravedad describa el grado del tumor mediante métodos reconocidos en la técnica (véase, Instituto Nacional del Cáncer, www.cancer.gov). El grado del tumor es un sistema que se usa para clasificar las células cancerosas en términos de qué tan anormales se ven bajo un microscopio y qué tan rápido es probable que el tumor crezca y se propague. Se consideran muchos factores al determinar el grado del tumor, incluida la estructura y el patrón de crecimiento de las células. Los factores específicos usados para determinar el grado del tumor varían con cada tipo de cáncer. La gravedad también describe un grado histológico, también llamado diferenciación, que se refiere a cuánto se parecen las células tumorales a las células normales del mismo tipo de tejido (véase el Instituto Nacional del Cáncer, www.cancer.gov). Además, la gravedad describe un grado nuclear, que se refiere al tamaño y la forma del núcleo en las células tumorales y el porcentaje de células tumorales que se están dividiendo (véase el Instituto Nacional del Cáncer, www.cancer.gov).

La gravedad describe el grado en que un tumor ha secretado factores de crecimiento, ha degradado la matriz extracelular, se ha vascularizado, ha perdido la adhesión a los tejidos yuxtapuestos o ha hecho metástasis. Además, la gravedad describe el número de ubicaciones a las que ha hecho metástasis un tumor primario. Finalmente, la gravedad incluye la dificultad de tratar tumores de diferentes tipos y ubicaciones. Por ejemplo, los tumores inoperables, aquellos cánceres que tienen mayor acceso a múltiples sistemas del cuerpo (tumores hematológicos e inmunológicos) y aquellos que son más resistentes a los tratamientos tradicionales se consideran más graves. En estas situaciones, prolongar la esperanza de vida del sujeto y/o reducir el dolor, disminuir la proporción de células cancerosas o restringir las células a un sistema y mejorar el estadio del cáncer/grado tumoral/grado histológico/grado nuclear se considera que alivia un signo o síntoma del cáncer

Como se usa en el presente documento, el término "síntoma" se define como una indicación de enfermedad, dolencia, lesión o que algo no está bien en el cuerpo. Los síntomas son sentidos o notados por el individuo que experimenta el síntoma, pero es posible que otros no los noten fácilmente. Otros se definen como profesionales no sanitarios.

Como se usa en el presente documento, el término "signo" también se define como una indicación de que algo no está bien en el cuerpo. Pero los signos se definen como cosas que pueden ser vistas por un médico, una enfermera u otro profesional de la salud.

El cáncer es un grupo de enfermedades que pueden causar casi cualquier signo o síntoma. Los signos y síntomas dependerán de la ubicación del cáncer, el tamaño del cáncer y cuánto afecta a los órganos o estructuras cercanos. Si un cáncer se propaga (hace metástasis), los síntomas pueden aparecer en diferentes partes del cuerpo.

A medida que el cáncer crece, comienza a presionar los órganos, vasos sanguíneos y nervios cercanos. Esta presión crea algunos de los signos y síntomas del cáncer. Si el cáncer está en un área crítica, como ciertas partes del cerebro, incluso el tumor más pequeño puede causar síntomas tempranos.

Pero a veces los cánceres comienzan en lugares donde no causan ningún síntoma hasta que el cáncer ha crecido bastante. Los cánceres de páncreas, por ejemplo, no suelen crecer lo suficiente como para sentirse desde el exterior del cuerpo. Algunos cánceres de páncreas no causan síntomas hasta que comienzan a crecer alrededor de los nervios cercanos (esto provoca dolor de espalda). Otros crecen alrededor del conducto biliar, lo que bloquea el flujo de bilis y provoca una coloración amarillenta de la piel conocida como ictericia. Cuando un cáncer de páncreas causa estos signos o síntomas, por lo general ha llegado a una etapa avanzada.

Un cáncer también puede causar síntomas como fiebre, fatiga o pérdida de peso. Esto puede deberse a que las células cancerosas consumen gran parte del suministro de energía del cuerpo o liberan sustancias que modifican el metabolismo del cuerpo. O el cáncer puede hacer que el sistema inmunitario reaccione de manera que produzca estos síntomas.

A veces, las células cancerosas liberan sustancias en el torrente sanguíneo que causan síntomas que generalmente no se cree que se deban a los cánceres. Por ejemplo, algunos cánceres de páncreas pueden liberar sustancias que provocan la formación de coágulos de sangre en las venas de las piernas. Algunos cánceres de pulmón producen sustancias similares a las hormonas que afectan los niveles de calcio en la sangre, lo que afecta los nervios y los músculos y causa debilidad y mareos.

El cáncer presenta varios signos o síntomas generales que ocurren cuando hay una variedad de subtipos de células cancerosas presentes. La mayoría de las personas con cáncer perderán peso en algún momento de su enfermedad. Una pérdida de peso inexplicable (involuntaria) de 10 libras o más puede ser el primer signo de cáncer, particularmente de cáncer de páncreas, estómago, esófago o pulmón.

La fiebre es muy común con el cáncer, pero se observa con mayor frecuencia en la enfermedad avanzada. Casi todos los pacientes con cáncer tendrán fiebre en algún momento, especialmente si el cáncer o su tratamiento afectan el sistema inmunitario y dificultan que el cuerpo combata las infecciones. Con menos frecuencia, la fiebre puede ser un signo temprano de cáncer, como leucemia o linfoma.

La fatiga puede ser un síntoma importante a medida que avanza el cáncer. Sin embargo, puede ocurrir temprano en cánceres como la leucemia, o si el cáncer está causando una pérdida continua de sangre, como en algunos cánceres de colon o de estómago.

El dolor puede ser un síntoma temprano de algunos tipos de cáncer, como el cáncer de hueso o el cáncer de testículo. Pero la mayoría de las veces el dolor es un síntoma de enfermedad avanzada.

Junto con los cánceres de piel (véase la siguiente sección), algunos cánceres internos pueden causar signos visibles en la piel. Estos cambios incluyen que la piel se vea más oscura (hiperpigmentación), amarilla (ictericia) o roja (eritema); comezón; o crecimiento excesivo de vello.

Alternativamente, o además, los subtipos de cáncer presentan signos o síntomas específicos. Los cambios en los hábitos intestinales o la función de la vejiga podrían indicar cáncer. El estreñimiento prolongado, la diarrea o un cambio en el tamaño de las heces pueden ser un signo de cáncer de colon. El dolor al orinar, la sangre en la orina o un cambio en la función de la vejiga (como orinar con más o menos frecuencia) podrían estar relacionados con el cáncer de vejiga o de próstata.

Los cambios en la condición de la piel o la aparición de una nueva condición de la piel podrían indicar cáncer. Los cánceres de piel pueden sangrar y parecer llagas que no cicatrizan. Una llaga prolongada en la boca podría ser un cáncer oral, especialmente en pacientes que fuman, mascan tabaco o beben alcohol con frecuencia. Las llagas en el pene o la vagina pueden ser signos de infección o de un cáncer temprano.

Un sangrado o secreción inusual podría indicar cáncer. El sangrado inusual puede ocurrir en cáncer temprano o avanzado. La sangre en el esputo (flema) puede ser un signo de cáncer de pulmón. La sangre en las heces (o heces oscuras o negras) podría ser un signo de cáncer de colon o recto. El cáncer del cuello uterino o del endometrio (revestimiento del útero) puede causar sangrado vaginal. La sangre en la orina puede ser un signo de cáncer de vejiga o riñón. Una secreción sanguinolenta del pezón puede ser un signo de cáncer de mama.

Un engrasamiento o bulto en el seno o en otras partes del cuerpo podría indicar la presencia de un cáncer. Muchos cánceres se pueden sentir a través de la piel, principalmente en el seno, testículo, ganglios linfáticos (glándulas) y los tejidos blandos del cuerpo. Un bulto o engrasamiento puede ser un signo temprano o tardío de cáncer. Cualquier bulto o engrasamiento podría ser indicativo de cáncer, especialmente si la formación es nueva o ha aumentado de tamaño.

La indigestión o la dificultad para tragar pueden indicar cáncer. Si bien estos síntomas comúnmente tienen otras causas, la indigestión o los problemas para tragar pueden ser un signo de cáncer de esófago, estómago o faringe (garganta).

Los cambios recientes en una verruga o un lunar podrían ser indicativos de cáncer. Cualquier verruga, lunar o peca que cambie de color, tamaño o forma, o que pierda sus bordes definidos, indica el desarrollo potencial de cáncer. Por ejemplo, la lesión de la piel puede ser un melanoma.

La tos persistente o ronquera pueden ser indicativos de cáncer. Una tos que no desaparece puede ser un signo de cáncer de pulmón. La ronquera puede ser un signo de cáncer de laringe (caja de voz) o tiroides.

Si bien los signos y síntomas enumerados anteriormente son los más comunes que se observan con el cáncer, hay muchos otros que son menos comunes y no se enumeran en el presente documento. Sin embargo, todos los signos y síntomas de cáncer reconocidos en la técnica están contemplados y abarcados por la presente invención.

El tratamiento del cáncer puede dar como resultado una reducción del tamaño de un tumor. Una reducción del tamaño de un tumor también puede denominarse "regresión tumoral". Preferiblemente, después del tratamiento, el tamaño del tumor se reduce en un 5% o más con respecto a su tamaño antes del tratamiento; más preferiblemente, el tamaño del tumor se reduce en un 10% o más; más preferiblemente, se reduce en un 20% o más; más preferiblemente, se reduce en un 30% o más; más preferiblemente, se reduce en un 40% o más; aún más preferiblemente, se reduce en un 50% o más; y lo más preferiblemente, se reduce en más del 75% o más. El tamaño de un tumor puede medirse por cualquier medio de medición reproducible. El tamaño de un tumor se puede medir como el diámetro del tumor.

El tratamiento del cáncer puede dar como resultado una reducción del volumen del tumor. Preferiblemente, después del tratamiento, el volumen del tumor se reduce en un 5% o más con respecto a su tamaño antes del tratamiento; más preferiblemente, el volumen del tumor se reduce en un 10% o más; más preferiblemente, se reduce en un 20% o más; más preferiblemente, se reduce en un 30% o más; más preferiblemente, se reduce en un 40% o más; aún más preferiblemente, se reduce en un 50% o más; y lo más preferiblemente, se reduce en más del 75% o más. El volumen del tumor puede medirse por cualquier medio de medición reproducible.

El tratamiento del cáncer da como resultado una disminución en el número de tumores. Preferiblemente, después del tratamiento, el número de tumores se reduce en un 5% o más en relación con el número antes del tratamiento; más preferiblemente, el número de tumores se reduce en un 10% o más; más preferiblemente, se reduce en un 20% o más; más preferiblemente, se reduce en un 30% o más; más preferiblemente, se reduce en un 40% o más; aún más preferiblemente, se reduce en un 50% o más; y lo más preferiblemente, se reduce en más del 75%. El número de tumores puede medirse por cualquier medio de medición reproducible. El número de tumores puede medirse contando los tumores visibles a simple vista o con un aumento específico. Preferiblemente, el aumento especificado es 2x, 3x, 4x, 5x, 10x o 50x.

El tratamiento del cáncer puede dar como resultado una disminución del número de lesiones metastásicas en otros tejidos u órganos distantes del sitio del tumor primario. Preferiblemente, después del tratamiento, el número de lesiones metastásicas se reduce en un 5 % o más en relación con el número antes del tratamiento; más preferiblemente, el número de lesiones metastásicas se reduce en un 10 % o más; más preferiblemente, se reduce en un 20 % o más; más preferiblemente, se reduce en un 30 % o más; más preferiblemente, se reduce en un 40 % o más; aún más preferiblemente, se reduce en un 50 % o más; y lo más preferiblemente, se reduce en más del 75 %. El número de lesiones metastásicas puede medirse por cualquier medio de medición reproducible. El número de lesiones metastásicas puede medirse contando las lesiones metastásicas visibles a simple vista o a un aumento específico. Preferiblemente, el aumento especificado es 2x, 3x, 4x, 5x, 10x o 50x.

El tratamiento del cáncer puede dar como resultado un aumento en el tiempo promedio de supervivencia de una población de sujetos tratados en comparación con una población que recibe el vehículo solo. Preferiblemente, el tiempo promedio de supervivencia se incrementa en más de 30 días; más preferiblemente, en más de 60 días; más preferiblemente, en más de 90 días; y lo más preferiblemente, en más de 120 días. Un aumento en el tiempo promedio de supervivencia de una población puede medirse por cualquier medio reproducible. Puede medirse un aumento en el tiempo promedio de supervivencia de una población, por ejemplo, calculando para una población la duración promedio de supervivencia tras el inicio del tratamiento con un compuesto activo. También puede medirse un aumento en el tiempo promedio de supervivencia de una población, por ejemplo, calculando para una población la duración promedio de supervivencia tras la finalización de una primera ronda de tratamiento con un compuesto activo.

El tratamiento del cáncer puede dar como resultado un aumento en el tiempo promedio de supervivencia de una población de sujetos tratados en comparación con una población de sujetos no tratados. Preferiblemente, el tiempo promedio de supervivencia se incrementa en más de 30 días; más preferiblemente, en más de 60 días; más preferiblemente, en más de 90 días; y lo más preferiblemente, en más de 120 días. Un aumento en el tiempo promedio de supervivencia de una población puede medirse por cualquier medio reproducible. Puede medirse un aumento en el tiempo promedio de supervivencia de una población, por ejemplo, calculando para una población la duración promedio de supervivencia tras el inicio del tratamiento con un compuesto activo. También puede medirse un aumento en el tiempo promedio de supervivencia de una población, por ejemplo, calculando para una población la duración promedio de supervivencia tras la finalización de una primera ronda de tratamiento con un compuesto activo.

El tratamiento del cáncer puede dar como resultado un aumento en el tiempo promedio de supervivencia de una población de sujetos tratados en comparación con una población que recibe monoterapia con un fármaco que no es un compuesto descrito en este documento. Preferiblemente, el tiempo promedio de supervivencia se incrementa en más de 30 días; más preferiblemente, en más de 60 días; más preferiblemente, en más de 90 días; y lo más preferiblemente, en más de 120 días. Un aumento en el tiempo promedio de supervivencia de una población puede medirse por cualquier medio reproducible. Puede medirse un aumento en el tiempo promedio de supervivencia de una población, por ejemplo, calculando para una población el tiempo promedio de supervivencia tras el inicio del tratamiento con un compuesto activo. También puede medirse un aumento en el tiempo promedio de supervivencia de una población, por ejemplo, calculando para una población la duración media de la supervivencia tras la finalización de una primera ronda de tratamiento con un compuesto activo.

El tratamiento del cáncer puede dar como resultado una disminución en la tasa de mortalidad de una población de sujetos tratados en comparación con una población que recibe solo vehículo. El tratamiento del cáncer puede dar como resultado una disminución de la tasa de mortalidad de una población de sujetos tratados en comparación con una población no tratada. El tratamiento del cáncer puede dar como resultado una disminución en la tasa de mortalidad de una población de sujetos tratados en comparación con una población que recibe monoterapia con un fármaco que no es un compuesto descrito en el presente documento. Preferiblemente, la tasa de mortalidad se reduce en más del 2 %; más preferiblemente, en más del 5 %; más preferiblemente, en más del 10 %; y lo más preferiblemente, en más del 25 %. Una disminución en la tasa de mortalidad de una población de sujetos tratados puede medirse por cualquier medio reproducible. Puede medirse una disminución en la tasa de mortalidad de una población, por ejemplo, calculando para una población el número promedio de muertes relacionadas con la enfermedad por unidad de tiempo tras el inicio del tratamiento con un compuesto activo. También se puede medir una disminución en la tasa de mortalidad de una población, por ejemplo, calculando para una población el número promedio de muertes relacionadas con la enfermedad por unidad de tiempo después de completar una primera ronda de tratamiento con un compuesto activo.

El tratamiento del cáncer puede dar como resultado una disminución en la tasa de crecimiento del tumor. Preferiblemente, después del tratamiento, la tasa de crecimiento del tumor se reduce en al menos un 5 % con respecto al número antes del tratamiento; más preferiblemente, la tasa de crecimiento del tumor se reduce en al menos un 10 %; más preferiblemente, se reduce en al menos un 20 %; más preferiblemente, se reduce en al menos un 30 %; más preferiblemente, se reduce en al menos un 40 %; más preferiblemente, se reduce en al menos un 50 %; aún más preferiblemente, se reduce en al menos un 50 %; y lo más preferiblemente, se reduce en al menos un 75 %. La tasa de crecimiento del tumor puede medirse por cualquier medio de medición reproducible. La tasa de crecimiento del tumor se puede medir de acuerdo con un cambio en el diámetro del tumor por unidad de tiempo.

El tratamiento del cáncer puede dar como resultado una disminución en el nuevo crecimiento del tumor. Preferiblemente, después del tratamiento, el nuevo crecimiento del tumor es inferior al 5 %; más preferiblemente, el nuevo crecimiento del tumor es inferior al 10 %; más preferiblemente, inferior al 20 %; más preferiblemente, inferior al 30 %; más preferiblemente, inferior al 40 %; más preferiblemente, inferior al 50 %; aún más preferiblemente, inferior al 50 %; y lo más preferiblemente, inferior al 75 %. El nuevo crecimiento del tumor se puede medir por cualquier medio de medición reproducible. El nuevo crecimiento del tumor se mide, por ejemplo, midiendo un aumento en el diámetro de un tumor después de una reducción tumoral previa que siguió al tratamiento. Una disminución en el nuevo crecimiento del tumor está indicada por la imposibilidad de que los tumores vuelvan a aparecer después de que se ha detenido el tratamiento.

El tratamiento o la prevención de un trastorno de proliferación celular puede dar como resultado una reducción en la tasa de proliferación celular. Preferiblemente, después del tratamiento, la tasa de proliferación celular se reduce en al menos un 5 %; más preferiblemente, en al menos un 10 %; más preferiblemente, en al menos un 20 %; más preferiblemente, en al menos un 30 %; más preferiblemente, en al menos un 40 %; más preferiblemente, en al menos un 50 %; aún más preferiblemente, en al menos un 50 %; y lo más preferiblemente, en al menos un 75 %. La tasa de proliferación celular puede medirse por cualquier medio de medición reproducible. La tasa de proliferación celular se mide, por ejemplo, midiendo el número de células en división en una muestra de tejido por unidad de tiempo.

El tratamiento o la prevención de un trastorno de proliferación celular puede dar como resultado una reducción en la proporción de células en proliferación. Preferiblemente, después del tratamiento, la proporción de células en proliferación se reduce en al menos un 5 %; más preferiblemente, en al menos un 10 %; más preferiblemente, en al menos un 20 %; más preferiblemente, en al menos un 30 %; más preferiblemente, en al menos un 40 %; más preferiblemente, en al menos un 50 %; aún más preferiblemente, en al menos un 50 %; y lo más preferiblemente, en al menos un 75 %. La proporción de células en proliferación puede medirse por cualquier medio de medición reproducible. Preferiblemente, la proporción de células en proliferación se mide, por ejemplo, cuantificando el número de células en división con respecto al número de células que no se dividen en una muestra de tejido. La proporción de células en proliferación puede ser equivalente al índice mitótico.

El tratamiento o la prevención de un trastorno de proliferación celular puede dar como resultado una disminución del tamaño de un área o zona de proliferación celular. Preferiblemente, después del tratamiento, el tamaño de un área o zona de proliferación celular se reduce en al menos un 5 % con respecto a su tamaño antes del tratamiento; más preferiblemente, se reduce en al menos un 10 %; más preferiblemente, se reduce en al menos un 20 %; más preferiblemente, se reduce en al menos un 30 %; más preferiblemente, se reduce en al menos un 40 %; más preferiblemente, se reduce en al menos un 50 %; aún más preferiblemente, se reduce en al menos un 50 %; y lo más preferiblemente, se reduce en al menos un 75 %. El tamaño de un área o zona de proliferación celular puede medirse por cualquier medio de medición reproducible. El tamaño de un área o zona de proliferación celular puede medirse como un diámetro o ancho de un área o zona de proliferación celular.

El tratamiento o la prevención de un trastorno de proliferación celular puede dar como resultado una disminución en el número o la proporción de células que tienen una apariencia o morfología anormal. Preferiblemente, después del tratamiento, el número de células que tienen una morfología anormal se reduce en al menos un 5 % con respecto a su tamaño antes del tratamiento; más preferiblemente, se reduce en al menos un 10 %; más preferiblemente, se reduce en al menos un 20 %; más preferiblemente, se reduce en al menos un 30 %; más preferiblemente, se reduce en al menos un 40 %; más preferiblemente, se reduce en al menos un 50 %; aún más preferiblemente, se reduce en al menos un 50 %; y lo más preferiblemente, se reduce en al menos un 75 %. Una apariencia o morfología celular anormal puede medirse por cualquier medio de medición reproducible. Una morfología celular anormal puede medirse mediante microscopía, por ejemplo, usando un microscopio de cultivo de tejido invertido. Una morfología celular anormal puede tomar la forma de pleiomorfismo nuclear.

Como se usa en el presente documento, el término "selectivamente" significa que tiende a ocurrir con mayor frecuencia en una población que en otra población. Las poblaciones comparadas pueden ser poblaciones celulares. Preferiblemente, un compuesto descrito en este documento (es decir, el bromhidrato del Compuesto I, así como el Polimorfo A) actúa selectivamente sobre una célula cancerosa o precancerosa pero no sobre una célula normal. Preferiblemente, un compuesto descrito en este documento actúa selectivamente para modular una diana molecular (por ejemplo, una proteína diana metiltransferasa) pero no modula significativamente otra diana molecular (por ejemplo, una proteína metiltransferasa no diana). La invención también proporciona un método para inhibir selectivamente la actividad de una enzima, tal como una proteína metiltransferasa. Preferiblemente, un evento ocurre selectivamente en la población A en relación con la población B si ocurre con una frecuencia dos veces mayor en la población A en comparación con la población B. Un evento ocurre selectivamente si ocurre con una frecuencia cinco veces mayor en la población A. Un evento ocurre selectivamente si ocurre más de diez veces más frecuentemente en la población A; más preferiblemente, más de cincuenta veces; aún más preferiblemente, más de 100 veces; y lo más preferiblemente, más de 1000 veces más frecuente en la población A en comparación con la población B. Por ejemplo, se diría que la muerte celular ocurre selectivamente en las células cancerosas si ocurriera con más del doble de frecuencia en las células cancerosas en comparación con las células normales.

Un compuesto descrito en este documento puede modular la actividad de una diana molecular (por ejemplo, una proteína diana metiltransferasa). La modulación se refiere a estimular o inhibir una actividad de una diana molecular. Preferiblemente, un compuesto de los descritos en este documento modula la actividad de una diana molecular si estimula o inhibe la actividad de la diana molecular al menos 2 veces en relación con la actividad de la diana molecular en las mismas condiciones, pero careciendo únicamente de la presencia de dicho compuesto. Más preferiblemente, un compuesto descrito en el presente documento modula la actividad de una diana molecular si estimula o inhibe la actividad de la diana molecular en al menos 5 veces, al menos 10 veces, al menos 20 veces, al menos 50 veces, al menos 100 veces con respecto a la actividad de la diana molecular en las mismas condiciones, pero careciendo únicamente de la presencia de dicho compuesto. La actividad de una diana molecular puede medirse por cualquier medio reproducible. La actividad una diana molecular puede medirse in vitro o in vivo. Por ejemplo, la actividad de una diana molecular puede medirse in vitro mediante un ensayo de actividad enzimática o un ensayo de unión al ADN, o puede medirse la actividad de una diana molecular in vivo analizando la expresión de un gen informador.

Un compuesto descrito en este documento (es decir, el bromhidrato del Compuesto I, así como el Polimorfo A) no modula significativamente la actividad de una diana molecular si la adición del compuesto no estimula o inhibe la actividad de la diana molecular en más del 10 % con respecto a la actividad de la diana molecular en las mismas condiciones, pero careciendo únicamente de la presencia de dicho compuesto.

Como se usa en el presente documento, el término "selectivo para isoenzima" significa inhibición o estimulación preferencial de una primera isoforma de una enzima en comparación con una segunda isoforma de una enzima (por ejemplo, inhibición o estimulación preferencial de una proteína metiltransferasa isozima alfa en comparación con una proteína metiltransferasa isozima beta). Preferiblemente, un compuesto descrito en el presente documento demuestra una diferencia mínima de cuatro veces, preferiblemente una diferencia de diez veces, más preferiblemente una diferencia de cincuenta veces, en la dosificación requerida para lograr un efecto biológico. Preferiblemente, un compuesto descrito en el presente documento demuestra este diferencial en todo el rango de inhibición, y el diferencial se ejemplifica en la IC50 es decir, una inhibición del 50 %, para una diana molecular de interés.

La administración de un compuesto descrito en este documento a una célula o a un sujeto que lo necesite puede dar como resultado la modulación (es decir, estimulación o inhibición) de una actividad de una proteína metiltransferasa de interés.

El tratamiento del cáncer o de un trastorno de proliferación celular puede dar como resultado la muerte celular y, preferiblemente, la muerte celular da como resultado una disminución de al menos un 10 % en el número de células en una población. Más preferiblemente, muerte celular significa una disminución de al menos un 20 %; más preferiblemente, una disminución de al menos el 30 %; más preferiblemente, una disminución de al menos el 40 %; más preferiblemente, una disminución de al menos el 50 %; lo más preferiblemente, una disminución de al menos el 75 %. El número de células en una población puede medirse por cualquier medio reproducible. Se puede medir un número de células en una población mediante clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS), microscopía de inmunofluorescencia y microscopía óptica. Los métodos para medir la muerte celular son los que se muestran en Li et al., Proc Natl Acad Sci USA. 100(5): 2674-8, 2003. En un aspecto, la muerte celular se produce por apoptosis.

Preferiblemente, una cantidad eficaz de un compuesto descrito en el presente documento no es significativamente citotóxica para las células normales. Una cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto no es significativamente citotóxica para las células normales si la administración del compuesto en una cantidad terapéuticamente eficaz no induce la muerte celular en más del 10 % de las células normales. Una cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto no afecta significativamente a la viabilidad de las células normales si la administración del compuesto en una cantidad terapéuticamente eficaz no induce la muerte celular en más del 10 % de las células normales. En un aspecto, la muerte celular se produce por apoptosis.

Poner en contacto una célula con un compuesto descrito en este documento puede inducir o activar la muerte celular selectivamente en células cancerosas. Administrar a un sujeto que lo necesite un compuesto descrito en el presente documento puede inducir o activar la muerte celular selectivamente en células cancerosas. Poner en contacto una célula con un compuesto descrito en el presente documento puede inducir la muerte celular selectivamente en una o más células afectadas por un trastorno de proliferación celular. Preferiblemente, la administración a un sujeto que lo necesite de un compuesto descrito en el presente documento induce la muerte celular selectivamente en una o más células afectadas por un trastorno de proliferación celular.

En el presente documento se describe un método para tratar o prevenir el cáncer (por ejemplo, cuyo curso puede verse influido por la modulación de la metilación de la proteína mediada por EZH2) mediante la administración de un compuesto descrito en el presente documento (es decir, el bromhidrato del Compuesto I, así como el Polimorfo A) a un sujeto que lo necesite, donde la administración del compuesto descrito en este documento da como resultado uno o más de los siguientes: prevención de la proliferación de células cancerosas mediante la acumulación de células en una o más fases del ciclo celular (por ejemplo, G1, G1/S, G2/M), o inducción de senescencia celular, o promoción de diferenciación de células tumorales; promoción de la muerte celular en células cancerosas a través de citotoxicidad, necrosis o apoptosis, sin una cantidad significativa de muerte celular en células normales, actividad antitumoral en animales con un índice terapéutico de al menos 2. Como se usa en este documento, "índice terapéutico" es la dosis máxima tolerada dividida por la dosis eficaz. También se describe en el presente documento un método usado para identificar candidatos adecuados para tratar o prevenir el cáncer.

Un experto en la materia puede consultar los textos de referencia general para obtener descripciones detalladas de técnicas conocidas discutidas en el presente documento o técnicas equivalentes. Estos textos incluyen Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Inc. (2005); Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual (3rd edition), Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York (2000); Coligan et al., Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons, N.Y.; Enna et al., Current Protocols in Pharmacology, John Wiley & Sons, N.Y.; Fingl et al., The Pharmacological Basis of Therapeutics (1975), Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, PA, 18th edition (1990). Por supuesto, también se puede hacer referencia a estos textos al hacer o usar un aspecto de la invención.

Ejemplificación

Materiales y métodos

Difracción de rayos X en polvo

La PXRD para todas las muestras se tomó en un Rigaku MultiFlex (Objetivo: Cu; Voltaje del tubo: 40 kV; Corriente del tubo: 30 mA).

Calorimetría diferencial de barrido

La DSC para todas las muestras se tomó en un DSC 1/700 de Mettler-Toledo (condiciones de ejecución: Temperatura inicial 35 °C, Temperatura final 325 °C, Velocidad de calentamiento 30 °C/min).

Cristalografía de Rayos X

Se montó una placa de cristal incoloro con unas dimensiones de 0.28 x 0.22 x 0.06 mm en un bucle de nailon utilizando una cantidad muy pequeña de aceite de paratona. Los datos se recopilaron utilizando un difractómetro basado en CCD Bruker (dispositivo de carga acoplada) equipado con un aparato de baja temperatura Oxford Cryostream que funciona a 173 K. Los datos se midieron utilizando exploraciones omega y phi de 0.5 ° por cuadro durante 45 s. El número total de imágenes se basó en los resultados del programa COSMO, donde se esperaba una redundancia de 4.0 y una integridad del 100 % hasta 0.83 A. Los parámetros de las celdas se recuperaron con el software APEX II y se refinaron con SAINT en todos los reflejos observados. La reducción de datos se realizó utilizando el software SAINT que corrige para Lp. Las correcciones de escala y absorción se aplicaron utilizando la técnica de escaneo múltiple SADABS, proporcionada por George Sheldrick. Las estructuras se resuelven por el método directo usando el programa SHELXS-97 y se refinan por el método de mínimos cuadrados en F2, SHELXL-97, que se incorporan en SHELXTL-PC V 6.10.

La estructura que se muestra en la Figura 11 se resolvió en el grupo espacial P2i/c (# 14). Todos los átomos que no son de hidrógeno se refinan anisotrópicamente. Los hidrógenos se calcularon mediante métodos geométricos y se refinaron como un modelo de conducción. El cristal utilizado para el estudio de difracción no mostró descomposición durante la recopilación de datos. Todos los dibujos están hechos de elipsoides al 50%.

Sorción dinámica de vapor

La DVS se midió en un sistema VTI Modelo SGA-100. Método de medida: La humedad relativa (HR) se cambió de manera controlada, en etapas de 5 % desde 5.0 % hasta 95.0% y luego se midió nuevamente a 5.0 % utilizando el sistema de sorción de vapor gravimétrico, y el cambio de porcentaje de peso (% en peso) de la muestra en cada etapa.

HPLC

La HPLC se realizó en un HPLC Agilent 1200 con bomba cuaternaria mezclando a baja presión, con un desgasificador en línea. Condiciones del método analítico: Se inyectó una muestra 8 pL (20 mg de ER-581982-06 diluidos con 50 mL de metanol para proporcionar una solución de aproximadamente 0.4 mg/mL) en un Agilent Zorbax Eclipse XDB-C18 (4.6 x 150 mm, 3.5 pm), condiciones de cromatografía : fase móvil A, agua con formiato de amonio 5 mM; fase móvil B, formiato de amonio 5 mM en acetonitrilo/metanol/agua 50/45/5; caudal, 1.5 mL/min; gradiente: isocrático al 10% de B de 0 a 3 min; aumento lineal hasta 70% B de 3 a 7 min; isocrático a 70% B de 7 a 12 min; incremento lineal al 100% B de 12 a 15 min isocrático a 100% B de 15 a 20 min; temperatura de la columna, 35 °C; detección, UV 230 nm. Tiempo de retención aproximado del Compuesto I = 10.7 min.

Síntesis del Polimorfo A

Ácido 5-bromo-2-metil-3-nitrobenzoico. A una solución agitada de ácido 2-metil-3-nitrobenzoico (100 g, 552 mmol) en H2SO4 concentrado (400 mL), se le añadió en porciones a temperatura ambiente 1,3-dibromo-5,5-dimetil-2,4-imidazolidindiona (88 g, 308 mmol) y luego la mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 5 horas. La mezcla de reacción se vertió sobre agua helada, el sólido precipitado se filtró, se lavó con agua y se secó al vacío para proporcionar el compuesto deseado como un sólido (140 g, 98 %). El compuesto aislado se llevó directamente a la siguiente etapa. RMN 1H (DMSO-cfe, 400 MHz) 88.31 (s, 1H), 8.17 (s, 1H), 2.43 (s, 3H).

5-bromo-2-metil-3-nitrobenzoato de metilo. A una solución agitada de ácido 5-bromo-2-metil-3-nitrobenzoico (285 g, 1105 mmol) en DMF (2.8 L) a temperatura ambiente, se le añadió carbonato de sodio (468 g, 4415 mmol) seguido de la adición de yoduro de metilo (626.6 g, 4415 milimol). La mezcla de reacción resultante se calentó a 60 °C durante 8 h. Una vez completada (controlada por TLC), la mezcla de reacción se filtró (para eliminar el carbonato de sodio) y se lavó con acetato de etilo (1 L x 3). El filtrado combinado se lavó con agua (3 L x 5) y la fase acuosa se volvió a extraer con acetato de etilo (1 L x 3). Las capas orgánicas combinadas se secaron sobre sulfato de sodio anhidro, se filtraron y concentraron a presión reducida para proporcionar el compuesto del título como un sólido (290 g, 97 % de rendimiento). El compuesto aislado se llevó directamente a la siguiente etapa. RMN 1H (CDCh, 400 MHz) 88.17 (s, 1H), 7.91 (s, 1H), 3.96 (s, 3H), 2.59 (s, 3H).

3-amino-5-bromo-2-metilbenzoato de metilo (1). A una solución agitada de 5-bromo-2-metil-3-nitrobenzoato de metilo (290 g, 1058 mmol) en etanol (1.5 L) se le añadió cloruro de amonio acuoso (283 g, 5290 mmol disuelto en 1.5 L de agua). La mezcla resultante se agitó a 80 °C a la que se añadió polvo de hierro (472 g, 8451 mmol) en porciones. La mezcla de reacción resultante se calentó a 80 °C durante 12 h. Una vez completada de acuerdo con lo determinado por TLC, la mezcla de reacción se filtró en caliente sobre Celite® y el lecho de Celite se lavó con metanol (5 L) seguido de lavado con MeOH al 30 % en DCM (5 L). El filtrado combinado se concentró al vacío, el residuo obtenido se diluyó con solución acuosa de bicarbonato de sodio (2 L) y se extrajo con acetato de etilo (5 L x 3). Las capas orgánicas combinadas se secaron sobre sulfato de sodio anhidro, se filtraron y concentraron a presión reducida para producir el compuesto del título como un sólido (220 g, 85 %). El compuesto se llevó directamente a la siguiente etapa. RMN 1H (CDCls, 400 MHz) S 7.37 (s, 1H), 6.92 (s, 1H), 3.94 (s, 3H), 3.80 (bs, 2H), 2.31 (s, 3H).

5-bromo-2-metil-3-((tetrahidro-2H-piran-4-il)amino)benzoato de metilo (2). Se cargó un reactor con 3-amino-5-bromo-2-metilbenzoato de metilo (455.8 g, 1.87 mol), 1,2-dicloroetano (4.56 L) y ácido acético (535 mL, 9.34 mol). A la mezcla se le añadieron dihidro-2H-piran-4(3H)-ona (280 g, 2.80 mol) y triacetoxiborohidruro de sodio (594 g, 2.80 mol) manteniendo la temperatura interna por debajo de 40 °C. La mezcla se agitó a 25 °C durante 2.5 h y luego la reacción se inactivó con una solución de hidróxido de sodio (448 g, 11.20 mol) en agua (5.61 L). Después de agitar durante 20 minutos a temperatura ambiente, la capa orgánica se separó y la capa acuosa se extrajo con acetato de etilo (3.65 L). Las capas orgánicas se combinaron, se lavaron con salmuera (1.5 L) y se concentraron al vacío.

El residuo se trató con acetato de etilo (1,8 L) y se calentó a 65-70 °C. La mezcla se agitó a 65-70 °C durante 15 minutos para producir una solución clara y luego se trató con n-heptano (7.3 L) manteniendo la temperatura entre 60­ 70 °C. Una vez que se añadió completamente el heptano a la solución, la mezcla se mantuvo a 65-70 °C durante 15 minutos y luego se dejó enfriar a 18-22 °C durante 3 h. La suspensión resultante se agitó a 18-22 °C durante 4 h, se enfrió a 0-5 °C durante 1 h y se mantuvo a 0-5 °C durante 2 h. El precipitado se filtró, se lavó dos veces con n-heptano (1.4 L) y se secó al vacío para producir el compuesto del título (540 g, 88 %). El patrón de XRPD de este compuesto se muestra en la Figura 17.

5-bromo-3-(etil(tetrahidro-2H-piran-4-il)amino)-2-metilbenzoato de metilo (3). A una solución agitada de 5-bromo-2-metil-3-((tetrahidro-2H-piran-4-il)amino)benzoato de metilo (14 g, 42.7 mmol) en dicloroetano (150 mL) se le añadió acetaldehído (3.75 g , 85.2 mmol) y ácido acético (15.3 g, 256 mmol). La mezcla de reacción resultante se agitó a temperatura ambiente durante 15 minutos. La mezcla se enfrió a 0 °C y se añadió triacetoxiborohidruro de sodio (27 g, 128 mmol). La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 3 horas. Una vez completada la reacción según lo determinado por TLC, se añadió una solución acuosa de bicarbonato de sodio a la mezcla de reacción hasta que se obtuvo un pH de 7-8, se separó la fase orgánica y se extrajo la fase acuosa con acetato de etilo. Las capas orgánicas combinadas se secaron sobre sulfato de sodio anhidro, se filtraron y se concentraron a presión reducida. El compuesto crudo se purificó mediante cromatografía en columna (gel de sílice de malla 100-200) eluyendo con acetato de etilo:hexano para proporcionar el compuesto deseado como un líquido viscoso (14 g, 93 %). RMN 1H (DMSO-de, 400 MHz) S 7.62 (s, 1H), 7.52 (s, 1H), 3.80 (bs, 5H), 3.31 (t, 2H), 2.97 - 3.05 (m, 2H), 2.87 - 2.96 (m, 1H), 2.38 (s, 3H), 1.52 - 1.61 (m, 2H), 1.37 - 1.50 (m, 2H), 0.87 (t, 3H, J = 6,8 Hz).

5-(etil(tetrahidro-2H-piran-4-il)amino)-4-metil-4'-(morfolinometil)-[1,1'-bifenil]-3-carboxilato de metilo (4): Una mezcla de 5-bromo-3-(etil(tetrahidro-2H-piran-4-il)amino)-2-metilbenzoato de metilo (580 g, 1.63 mol), 4-(4-(4,4,5,5) -tetrametil-1,3,2-dioxaborolan-2-il)bencil)morfolina (592 g, 1.95 mol), 1,4-dioxano (3.86 L), carbonato de sodio (618 g, 5.83 mol) y agua (771 mL) se desgasificó burbujeando nitrógeno a través de la mezcla a 20 °C durante 20 minutos y se trató con tetrakis(trifenilfosfina)paladio(0) (14.11 g, 12.21 mmol). La mezcla resultante se desgasificó durante 20 minutos más y luego se calentó a 87-89 °C durante 17 h. Después de enfriar a 20 °C, la mezcla se diluyó con acetato de etilo (5.80 L) y una solución de ácido (R)-2-amino-3-mercaptopropiónico (232 g) en agua (2.320 L). Después de agitar durante 1 hora a 20 °C, la capa orgánica se separó y se lavó nuevamente con una solución de ácido (R)-2-amino-3-mercaptopropiónico (232 g) en agua (2.320 L). Las capas acuosas se combinaron y se extrajeron con acetato de etilo (5.80 L). Las capas orgánicas se combinaron, se lavaron con una solución de hidróxido de sodio (93 g) en agua (2,32 L) y se concentraron al vacío a 35 °C para producir el compuesto del título como un aceite de color naranja (1.21 Kg, 164 % de rendimiento).

Ácido 5-(etil(tetrahidro-2H-piran-4-il)amino)-4-metil-4'-(morfolinometil)-[1,1'-bifenil]-3-carboxílico (5): Se suspendió 5-(etil(tetrahidro-2H-piran-4-il)amino)-4-metil-4'-(morfolinometil)-[1,1'-bifenil]-3-carboxilato de metilo (69.0 g, 152.5 mmol) (con base en el rendimiento teórico de la etapa anterior) en etanol (380 mL) y se trató con una solución de hidróxido de sodio (24.84 g, 621.0 mmol) en agua (207 mL). La mezcla se agitó a 40 °C durante 18 h. Después de enfriar a 0-5 °C, la mezcla se neutralizó a pH 6.5 con ácido clorhídrico 1 N (580 mL) manteniendo la temperatura por debajo de 25 °C. Luego, la mezcla se extrajo dos veces con una mezcla de diclorometano (690 mL) y metanol (69.0 mL). Las capas orgánicas se combinaron y concentraron al vacío para producir un producto crudo como un sólido amarillo (127 g).

El producto crudo se disolvió en 2-metiltetrahidrofurano (656 mL) a 70 °C y luego se trató con IPA (828 mL). La mezcla se dejó enfriar a temperatura ambiente durante 3-4 h y luego se agitó durante la noche a temperatura ambiente. El precipitado se filtró, se lavó dos veces con IPA (207 mL) y se secó al vacío para producir el compuesto del título como un sólido blanquecino (53.54 g, 80 %). El patrón de XRPD de este compuesto se muestra en la Figura 9.

N-((4,6-dimetil-2-oxo-1,2-dihidropiridin-3-il)metil)-5-(etil(tetrahidro-2H-piran-4-il)amino)-4-metil-4'-(morfolinometil)-[1,1' -bifenil]-3-carboxamida (Compuesto I): Una mezcla de ácido 5-(etil(tetrahidro-2H-piran-4-il)amino)-4-metil-4'-(morfolinometil)-[1,1'-bifenil]-3-carboxílico (540 g, 1.23 mol) y clorhidrato de 3-(aminometil)-4,6-dimetil-dihidro-piridin-2(1H)-ona (279 g, 1.48 mol) se suspendió en DMSO (2.70 L) y se trató con trietilamina (223 mL, 1.60 mol). La mezcla se agitó a 25 °C durante 30 min y se trató con EDC-HCl (354 g, 1.85 mol) e hidrato de HOBT (283 g, 1.85 mol). La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 16 h. Después de la adición de trietilamina (292 mL, 2.09 mol), la mezcla se enfrió a 15 °C, se diluyó con agua (10.1 L) manteniendo la temperatura por debajo de 30 °C y se agitó a 19-25 °C durante 4 h. El precipitado resultante se filtró, se lavó dos veces con agua (2.70 L) y se secó al vacío para producir un producto crudo (695 g, análisis peso-peso = 78%).

Para la purificación adicional del producto, se llevó a cabo la recristalización. Se suspendió un producto crudo (20.00 g, 34.92 mmol) en una mezcla de etanol (190 mL) y agua (10.00 mL) y se calentó a 75 °C hasta que se obtuvo una solución transparente. La solución se dejó enfriar a temperatura ambiente durante la noche. El precipitado se filtró, se lavó dos veces con una mezcla de etanol (30.0 mL) y agua (30.0 mL) y se secó al vacío a 35 °C para producir el compuesto del título como un sólido blanquecino (14.0 g, 70 % de recuperación del crudo y 90 % de rendimiento basado en el ensayo peso-peso).

Bromuro de 4-((3'-(((4,6-dimetil-2-oxo-1,2-dihidropiridin-3-il)metil)carbamoil)-5'-(etil(tetrahidro-2H-piran-4-ilo)amino)-4'-metil-[1,1'-bifenil]-4-il)metil)morfolin-4-io (Polimorfo A): Una N-((4,6-dimetil-2-oxo-1,2-dihidropiridin-3-il)metil)-5-(etil(tetrahidro-2H-piran-4-il)amino)-4-metil-4'-(morfolinometil)-[1,1'-bifenil]-3-carboxamida cruda (595 g, 464 g con base en el ensayo peso-peso, 810.3 mmol) se suspendió en etanol (3.33 L). Después de calentar a 70 °C, la mezcla se trató con HBr acuoso al 48 % (97 mL, 850.8 mmol) y se agitó a 70 °C durante 30 min. La solución de color rojo anaranjado resultante se trató con acetato de etilo (3.33 L) manteniendo la temperatura por encima de 60 °C. La mezcla se enfrió lentamente a temperatura ambiente durante 18 h. La mezcla se enfrió a 0 °C durante 1 h y se agitó a esa temperatura durante 5.5 h. El precipitado resultante se filtró, se lavó dos veces con acetato de etilo (1.39 L) y se secó al vacío para producir el compuesto del título como un sólido blanquecino (515 g, 97 % de rendimiento).

Recristalización del Polimorfo A: Se suspendió bromuro de 4-((3'-(((4,6-dimetil-2-oxo-1,2-dihidropiridin-3-il)metil)carbamoil)-5'-(etil(tetrahidro-2H-piran-4-ilo)amino)-4'-metil-[1,1'-bifenil]-4-il)metil)morfolin-4-io (0.50 g, 0.77 mmol; 95.6 % puro por HPLC) en etanol (3,0 mL ) y se calentó a 80 °C hasta obtener una solución transparente. A la solución se le añadió MTBE (5,0 mL) lentamente. La solución resultante se dejó enfriar a 18-22 °C durante 3 h y se agitó a 18- 22 °C durante 15 h. El precipitado se filtró, se lavó dos veces con MTBE (2 mL) y se secó al vacío para producir 0.45 g del compuesto del título (89 % de recuperación, 96.6 % de pureza por HPLC). El patrón de difracción de rayos X en polvo del Polimorfo A (monobromhidrato) se muestra en la Figura 1. La Tabla 1, a continuación, enumera los picos más significativos.

Tabla 1

Evaluación del bromhidrato del Compuesto I y el Polimorfo A

Se prepararon y seleccionaron varias formas de sal diferentes del Compuesto I, incluidas sales de clorhidrato, bromhidrato, hemisulfato, sodio, fosfato, nitrato, maleato, malonato y L-tartrato. Entre ellos, la sal de bromhidrato (HBr) tenía las propiedades fisicoquímicas más ventajosas en términos de facilidad de preparación e higroscopicidad.

Se llevaron a cabo estudios detallados de la base libre del Compuesto I así como de la sal de HCl de este compuesto. Se detectaron al menos cinco formas cristalinas diferentes a partir de la forma libre del Compuesto I durante la selección preliminar de polimorfos usando XRD y DSC. Debido al alto grado de variabilidad observado durante la cristalización de la forma libre, se buscaron formas cristalinas de otras sales. De las sales seleccionadas, las formas de monoclorhidrato, monobromhidrato, hemisulfato, fosfato, maleato, L-tartrato y sal de sodio eran cristalinas. Las sales de fosfato y maleato eran muy higroscópicas y el L-tartrato tenía poca cristalinidad.

Fue difícil obtener un alto grado de cristalinidad a partir de la sal de HCl del Compuesto I. Se obtuvo una mezcla de material cristalino y amorfo independientemente de las condiciones de cristalización. Como se muestra en la Figura 8, los datos de DSC de la sal de monoclorhidrato del Compuesto I indican algún grado de falta de cristalinidad con una endoterma a 190.5 °C. Además, se obtuvieron datos de sorción dinámica de vapor (DVS) para la sal de monoclorhidrato del Compuesto I y se encontró que mostraban cierta higroscopicidad: se observó un aumento de peso de entre el 4 - 6 % al 75 % de humedad relativa (HR) a 25 °C (Figura 18B). Esto puede atribuirse a una cierta cantidad de naturaleza no cristalina de la sal de monoclorhidrato. Véase, por ejemplo, la Figura 18A, que muestra un Compuesto I de triclorhidrato amorfo. Debido a que el nivel de cristalinidad no era controlable, la sal de HCl no se consideró para desarrollo adicional.

Como se muestra en la Figura 6, el análisis de DVS de la sal sódica del Compuesto I mostró una higroscopicidad significativa: se observó un aumento de peso de aproximadamente un 15 % a una humedad relativa (HR) del 75 % a 25 °C. Como se muestra en la Figura 7, la sal de hemisulfato del Compuesto I mostró una higroscopicidad moderadamente alta: se observó un aumento de peso de entre el 9 -11 % a una humedad relativa (HR) del 75 % a 25 °C. Esto puede atribuirse a la naturaleza altamente no cristalina del compuesto, ya que los datos de DSC de la sal de hemisulfato indican un grado muy alto de falta de cristalinidad sin endoterma limpia.

De estos compuestos cristalinos, el monobromhidrato fue el más cristalino y menos higroscópico (véanse las Figuras 1, 3 y 4). Además, el monobromhidrato es muy estable y resiste la generación de impurezas (la Figura 5 muestra el análisis por HPLC del Polimorfo A durante tres días a una temperatura elevada. El Polimorfo A produjo impurezas mínimas durante tres días a 100 °C). Curiosamente, se encontró que la sal de di-HBr del Compuesto I era principalmente amorfa (Figura 2).

Se obtuvieron dos formas cristalinas diferentes del monobromhidrato del Compuesto I (polimorfos A y B) a partir de diferentes sistemas de disolventes y se caracterizaron mediante análisis por XRD, DSC y TGA-DSC. Los datos de XRD y DSC para estas dos formas cristalinas diferentes de lotes representativos del Compuesto I se muestran en la Figura 1, Figura 3 y Figura 10. El Polimorfo B se caracteriza por un patrón de XRD en polvo con picos de 8.5, 10.9, 16.7, 17.4, 20.9, 22.1 y 25.7 ± 0.2 grados 2 theta (véase la Figura 10). Entre estos dos, se encontró que el Polimorfo A era de naturaleza más cristalina. Los estudios de adsorción dinámica de vapor (DVS) mostraron que el Polimorfo A no es higroscópico (Figura 4). En los análisis térmicos, se observó un solo pico endotérmico con una temperatura de inicio de aproximadamente 251 °C. Además, fue evidente a partir del análisis por DSC que la recristalización del Polimorfo A aumenta significativamente la cristalinidad del material (véase la Figura 3).

En varios procesos a escala de laboratorio, el Polimorfo A se obtuvo de forma reproducible y los ligeros cambios en las condiciones de cristalización no dieron como resultado diferentes formas de cristal.

Ensayos de la enzima PRC2 de tipo silvestre y mutante

Materiales Generales. Se adquirieron S-adenosilmetionina (SAM), S-adenosilhomocisteína (SAH), bicina, KCl, Tween20, dimetilsulfóxido (DMSO) y gelatina de piel de bovino (BSG) a través de Sigma-Aldrich con el mayor nivel de pureza posible. El ditiotreitol (DTT) se adquirió de EMD. 3H-SAM se adquirió a través de American Radiolabeled Chemicals con una actividad específica de 80 Ci/mmol. Se adquirieron Flashplates de estreptavidina de 384 pocillos a través de PerkinElmer.

Sustratos. Se sintetizaron péptidos representativos de los residuos 21 - 44 de la histona humana H3 que contenían una lisina 27 no modificada (H3K27me0) o una lisina 27 dimetilada (H3K27me2) con un motivo de etiqueta de afinidad al enlazador G(K-biotina) del terminal C y un tope de amida en el terminal C de21StCentury Biochemicals. Los péptidos se purificaron mediante cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) a una pureza superior al 95 % y se confirmaron mediante espectrometría de masas por cromatografía líquida (LC-MS). Las secuencias se enumeran a continuación.

H3K27me0: ATKAARKSAPATGGVKKPHRYRPGGK(biotina)-amida (SEQ ID NO: 1)

H3K27me2: ATKAARK(me2)SAPATGGVKKPHRYRPGGK(biotina)-amida (SEQ ID NO: 2)

Los oligonucleosomas de eritrocitos de pollo se purificaron a partir de sangre de pollo de acuerdo con los procedimientos establecidos.

Complejos PRC2 recombinantes. Los complejos PRC2 humanos se purificaron como complejos enzimáticos de 4 componentes coexpresados en células de Spodoptera frugiperda (sf9) usando un sistema de expresión de baculovirus. Las subunidades expresadas fueron los mutantes Y641F, N, H, S o C de EZH2 de tipo silvestre (NM_004456) o EZH2, generados a partir del constructo EZH2 de tipo silvestre, EED (NM_003797), Suz12 (ⁿ M _015355 ) y RbAp48 (NM_005610). La subunidad EED contenía una etiqueta FLAG en el terminal N, que se utilizó para purificar todo el complejo de 4 componentes a partir de lisados de células sf9. La pureza de los complejos cumplió o superó el 95 % de acuerdo con lo determinado por SDS-PAGE y análisis mediante un Agilent Bioanalyzer. Las concentraciones de enzimas madre (generalmente 0.3 -1.0 mg/mL) se determinaron utilizando un ensayo de Bradford frente a un estándar de albúmina de suero bovino (BSA).

Procedimiento general para ensayos de enzimas PRC2 en sustratos peptídicos. Todos los ensayos se realizaron en un tampón que consistía en bicina 20 mM (pH = 7.6), DTT 0.5 mM, B ^s G al 0.005 % y Tween20 al 0.002 %, preparados el día de su uso. Los compuestos en D M S ^o al 100 % (1 pL) se colocaron en placas con fondo en V de 384 pocillos de polipropileno (Greiner) utilizando un Platemate 2 * 3 equipado con un cabezal de pipeta de 384 canales (Thermo). Se agregó DMSO (1 pL) a las columnas 11, 12, 23, 24, filas A - H para el control máximo de la señal, y se agregó SAH, un producto conocido e inhibidor de PRC2 (1 pL) a las columnas 11, 12, 23, 24, filas I - P para el control de la señal mínima. Multidrop Combi (Thermo) añadió un cóctel (40 pL) que contenía la enzima PRC2 de tipo silvestre y el péptido H3K27me0 o cualquiera de las enzimas mutantes Y641 y el péptido H3K27me2. Se permitió que los compuestos se incubaran con PRC2 durante 30 min a 25 °C, luego se preparó un cóctel (10 pL) que contenía una mezcla de compuestos no radiactivos y se añadió 3H-SAM para iniciar la reacción (volumen final = 51 pL). En todos los casos, las concentraciones finales fueron las siguientes: la enzima PRC2 de tipo silvestre o mutante fue de 4 nM, la SAH en los pocillos de control de señal mínima fue de 1 mM y la concentración de DMSO fue del 1%. Las concentraciones finales del resto de componentes se indican en la Tabla 2, a continuación. Los ensayos se detuvieron mediante la adición de SAM no radiactivo (10 pL) a una concentración final de 600 pM, que diluye el 3H-SAM a un nivel en el que su incorporación al sustrato peptídico ya no es detectable. A continuación, se transfirieron 50 pL de la reacción en la placa de polipropileno de 384 pocillos a una Flashplate de 384 pocillos y se permitió que los péptidos biotinilados se unieran a la superficie de estreptavidina durante al menos 1 hora antes de lavarlos tres veces con Tween20 al 0.1 % en un lavador de placas Biotek ELx405. Luego se leyeron las placas en un lector de placas PerkinElmer TopCount para medir la cantidad de péptido marcado con 3H unido a la superficie del Flashplate, medido como desintegraciones por minuto (dpm) o, alternativamente, referido como conteo por minuto (cpm).

Tabla 2: Concentraciones finales de componentes para cada variación de ensayo en función de la identidad de EZH2 (EZH2 de tipo silvestre o mutante Y641)

Procedimiento general para el ensayo de enzima PRC2 de tipo silvestre en sustrato de oligonucleosoma. Los ensayos se realizaron en un tampón que constaba de bicina 20 mM (pH = 7.6), DTT 0.5 mM, BSG al 0.005 %, KCl 100 mM y Tween20 al 0.002 %, preparados el día del uso. Los compuestos en DMSO al 100 % (1 ^j L) se colocaron en placas con fondo en V de 384 pocillos de polipropileno (Greiner) utilizando un Platemate 2 * 3 equipado con un cabezal de pipeta de 384 canales (Thermo). Se agregó D ^m S ^o (1 ^j L) a las columnas 11, 12, 23, 24, filas A - H para el control de señal máxima, y se agregó SAH, un producto conocido e inhibidor de PRC2 (1 ^j L) a las columnas 11, 12, 23, 24, filas I - P para el control de señal mínima. Multidrop Combi (Thermo) añadió un cóctel (40 ^j L) que contenía la enzima PRC2 de tipo silvestre y el oligonucleosoma de eritrocitos de pollo. Se permitió que los compuestos se incubaran con PRC2 durante 30 min a 25 °C, luego se preparó un cóctel (10 ^j L) que contenía una mezcla de compuestos no radiactivos y se añadió 3H-SAM para iniciar la reacción (volumen final = 51 ^j L). Las concentraciones finales fueron las siguientes: la enzima PRC2 de tipo silvestre fue 4 nM, SAM no radiactiva fue 430 nM, 3H-SAM fue 120 nM, el oligonucleosoma de eritrocitos de pollo fue 120 nM, SAH en los pocillos de control de señal mínima fue 1 mM y la concentración de DMSO fue del 1%. El ensayo se detuvo mediante la adición de SAM no radiactivo (10 ^j L) a una concentración final de 600 ^j M, que diluye el 3H-SAM a un nivel en el que su incorporación en el sustrato del oligonucleosoma de eritrocitos de pollo ya no es detectable. A continuación, se transfirieron 50 ^j L de la reacción en la placa de polipropileno de 384 pocillos a un Flashplate de 384 pocillos y se inmovilizaron los nucleosomas de eritrocitos de pollo en la superficie de la placa, que luego se lavó tres veces con Tween20 al 0.1 % en un lavador de placas Biotek ELx405. Luego se leyeron las placas en un lector de placas PerkinElmer TopCount para medir la cantidad de oligonucleosoma de eritrocitos de pollo marcados con 3H unida a la superficie de la Flashplate, medido como desintegraciones por minuto (dpm) o, alternativamente, referido como conteos por minuto (cpm).

Cálculo del % de inhibición

% inh-100-f _{V dpnv&.-cipm^n} ) _/ xlOO

Donde dpm = desintegraciones por minuto, cmpd = señal en el pocillo de ensayo, y mín. y máx. son los controles de señal mínimo y máximo respectivos.

Ajuste de IC50 de cuatro parámetros

(A b a jo - A rr ib a )

Y= A b a jo -------------------------------2_|_^ X ^Coeficiente de Hill

ics<¡

Donde la parte de arriba y la de abajo normalmente se permite que floten, pero pueden fijarse en 100 o 0 respectivamente en un ajuste de 3 parámetros. El coeficiente de Hill normalmente se permite que flote, pero también se puede fijar en 1 en un ajuste de 3 parámetros. Y es el % de inhibición y X es la concentración del compuesto.

Los valores de IC50 para los ensayos de la enzima PRC2 en sustratos peptídicos (por ejemplo, EZH2 de tipo silvestre e Y641F) se presentan en la Tabla 3 a continuación.

Ensayo de metilación de WSU-DLCL2

Las células en suspensión WSU-DLCL2 se adquirieron a través de la DSMZ (Colección Alemana de Microorganismos y Cultivos Celulares, Braunschweig, Alemania). Medio RPMI/Glutamax, penicilina-estreptomicina, suero bovino fetal inactivado por calor y D-PBS se adquirieron a través de Life Technologies, Grand Island, NY, EE. UU. El tampón de extracción y el tampón de neutralización (5X) se adquirieron a través de Active Motif, Carlsbad, CA, EE. UU. El anticuerpo anti-histona H3 de conejo se adquirió a través de Abcam, Cambridge, MA, EE. UU. Los anticuerpos anti-H3K27me3 de conejo y anti-IgG de conejo conjugado con HRP se adquirieron a través de Cell Signaling Technology, Danvers, MA, EE. UU. El sustrato TMB "Super Sensitivo" se obtuvo a través de BioFX Laboratories, Owings Mills, ^m D, EE. UU. La albúmina de suero bovino libre de IgG se adquirió a través de Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA, EE. UU. El PBS con Tween (PBST10X) se adquirió a través de KPL, Gaithersburg, MD, EE. UU. El ácido sulfúrico se adquirió a través de Ricca Chemical, Arlington, TX, EE. UU. Las placas Immulon ELISA se adquirieron a través de Thermo, Rochester, NY, EE. UU. Las placas de cultivo celular con fondo en V se adquirieron a través de Corning Inc., Corning, NY, EE. UU. Las placas de polipropileno con fondo en V se adquirieron a través de Greiner Bio-One, Monroe, NC, EE. UU.

Las células en suspensión WSU-DLCL2 se mantuvieron en medio de cultivo (RPMI 1640 complementado con suero bovino fetal al 10 % v/v inactivado por calor y 100 unidades/mL de penicilina-estreptomicina) y se cultivaron a 37 °C en una atmósfera de 5 % de CO2. En las condiciones del ensayo, las células se incubaron en medio de ensayo (RPMI 1640 complementado con suero bovino fetal al 20 % v/v inactivado por calor y 100 unidades/mL de penicilinaestreptomicina) a 37 °C en una atmósfera de 5 % de CO2 en un agitador de placas.

Las células WSU-DLCL2 se sembraron en medio de ensayo a una concentración de 50,000 células por mL en una placa de cultivo celular con fondo en V de 96 pocillos con 200 ^j L por pocillo. El compuesto (1 ^j L) de las placas fuente de 96 pocillos se añadió directamente a la placa de células con fondo en V. Las placas se incubaron en un agitador de placas de titulación a 37 °C, 5 % de CO2 durante 96 horas. Después de cuatro días de incubación, las placas se centrifugaron a 241 * g durante cinco minutos y el medio se aspiró suavemente de cada pocillo de la placa celular sin perturbar el sedimento celular. El sedimento se resuspendió en 200 ^j L de DPBS y las placas se volvieron a centrifugar a 241 * g durante cinco minutos. El sobrenadante se aspiró y se añadió tampón de extracción frío (4 °C) (100 ^j L) por pocillo. Las placas se incubaron a 4 °C en un agitador orbital durante dos horas. Las placas se centrifugaron a 3427 * g * 10 minutos. El sobrenadante (80 ^j L por pocillo) se transfirió a su respectivo pocillo en una placa de polipropileno con fondo en V de 96 pocillos. Se añadió tampón de neutralización 5x (20 ^j L por pocillo) a una placa de polipropileno con fondo en V que contenía sobrenadante. Se incubaron placas de polipropileno con fondo en V que contenían preparación de histona cruda (CHP) en un agitador orbital durante cinco minutos. Se añadieron preparaciones de histona cruda (2 ^j L por pocillo) a cada pocillo respectivo en placas de ELISA de 96 pocillos por duplicado que contenían 100 ^j L de tampón de recubrimiento (PBS 1x BSA al 0.05 % p/v). Las placas se sellaron y se incubaron durante la noche a 4 °C. Al día siguiente, las placas se lavaron tres veces con 300 ^j L por pocillo de PBST 1X. Los pocillos se bloquearon durante dos horas con 300 ^j L por pocillo de diluyente de ELISA ( (P ^b S (1^x ) BSA (2 % p/v) y Tween20 (0.05 % v/v)). Las placas se lavaron tres veces con PBST 1x. Para la placa de detección de Histona H3, se añadieron 100 ^j L por pocillo de anticuerpo anti-Histona-H3 (Abcam, ab1791) diluido 1:10,000 en diluyente de ELISA. Para la placa de detección de trimetilación de H3K27, se añadieron 100 ^j L por pocillo de anti-H3K27me3 diluido 1:2000 en diluyente de ELISA. Las placas se incubaron durante 90 minutos a temperatura ambiente. Las placas se lavaron tres veces con 300 ^j L PBST 1x por pocillo. Para la detección de histona H3, se añadieron por pocillo 100 ^j L de anticuerpo anti-IgG de conejo conjugado con HRP diluido a 1:6000 en diluyente de ELISA. Para la detección de H3K27me3, se añadieron por pocillo 100 ^j L de anticuerpo anti-IgG de conejo conjugado con HRP diluido a 1:4000 en diluyente de ELISA. Las placas se incubaron a temperatura ambiente durante 90 minutos. Las placas se lavaron cuatro veces con PBST 1x 300 ^j L por pocillo. Se añadieron 100 ^j L de sustrato TMB por pocillo. Las placas de histona H3 se incubaron durante cinco minutos a temperatura ambiente. Las placas de H3K27me3 se incubaron durante 10 minutos a temperatura ambiente. La reacción se detuvo con ácido sulfúrico 1N (100 ^j L por pocillo). La absorbancia de cada placa se leyó a 450 nm.

En primer lugar, la relación para cada pocillo se determinó mediante:

valor de OD450 para H3K27me3\

V valor de OD450 para Histona H3/

Cada placa incluía ocho pocillos de control de tratamiento solo con DMSO (inhibición mínima) así como ocho pocillos de control para inhibición máxima (pocillos de fondo).

Se calculó el promedio de los valores de relación para cada tipo de control y se usó para determinar el porcentaje de inhibición para cada pozo de prueba en la placa. El compuesto de prueba se diluyó tres veces en serie en DMSO para un total de diez concentraciones de prueba, comenzando con 25 ^j M. Se determinó el porcentaje de inhibición y se generaron curvas de IC50 utilizando pocillos duplicados por concentración de compuesto. Los valores de IC50 para este ensayo se presentan en la Tabla 3 a continuación.

(Relación de muestra de prueba individual) -(Relación promedio de fondo)

Porcentaje de inhibición = 100

((- (Relación de inhibición mínima) -(Relación promedio de fondo) ^* 100

Análisis de proliferación celular

Las células WSU-DLCL2 en suspensión se adquirieron a través de la DSMZ (Colección Alemana de Microorganismos y Cultivos Celulares, Braunschweig, Alemania). Medio RPMI/Glutamax, penicilina-estreptomicina, suero bovino fetal inactivado por calor se adquirieron a través de Life Technologies, Grand Island, NY, EE. UU. Las placas de 384 pocilios de polipropileno con fondo en V se adquirieron a través de Greiner Bio-One, Monroe, NC, ^e E. UU. Se adquirieron placas blancas opacas de 384 pocillos de cultivo celular a través de Perkin Elmer, Waltham, MA, EE. UU. Cell-Titer Glo® se adquirió a través de Promega Corporation, Madison, WI, EE. UU. El lector de placas SpectraMax M5 se adquirió a través de Molecular Devices LLC, Sunnyvale, CA, EE. UU.

Las células WSU-DLCL2 en suspensión se mantuvieron en medio de crecimiento (RPMI 1640 complementado con suero fetal bovino inactivado por calor al 10 % v/v y se cultivaron a 37 °C en una atmósfera de 5 % de CO2). En las condiciones del ensayo, las células se incubaron en medio de ensayo (RPMI 1640 complementado con suero bovino fetal inactivado por calor al 20 % v/v y 100 unidades/mL de penicilina-estreptomicina) a 37 °C en una atmósfera de 5 % de CO2.

Para la evaluación del efecto de los compuestos sobre la proliferación de la línea celular WSU-DLCL2, se sembraron células en crecimiento exponencial en placas opacas blancas de 384 pocillos a una densidad de 1250 células/mL en un volumen final de 50 pL de medio de ensayo. Se preparó una placa fuente del compuesto realizando diluciones en serie triples de nueve puntos por triplicado en DMS^o , comenzando con 10 mM (la concentración máxima final del compuesto en el ensayo fue de 20 pM y el DMSO fue del 0.2 %). Se añadió una alícuota de 100 nL de la placa madre del compuesto a su pocillo respectivo en la placa de células. El control de inhibición al 100 % consistió en células tratadas con una concentración final de estaurosporina de 200 nM y el control de inhibición al 0 % consistió en células tratadas con DMSO. Después de la adición de los compuestos, las placas de ensayo se incubaron durante 6 días a 37 °C, 5 % de CO2, humedad relativa > 90% durante 6 días. La viabilidad celular se midió mediante la cuantificación del ATP presente en los cultivos celulares, añadiendo 35 pL del reactivo Cell Titer Glo® a las placas de células. La luminiscencia se leyó en el SpectraMax M5. La concentración que inhibía la viabilidad celular en un 50 % se determinó usando un ajuste de 4 parámetros de las curvas normalizadas de respuesta a la dosis. Los valores de IC50 para este ensayo se presentan en la Tabla 3 a continuación.

Tabla 3

Estudio in vivo - Línea celular de linfoma humano SUDHL10

Ratones

Los ratones hembra Fox Chase SCID® (CB 17/Icr-Prkdcscid/IcrIcoCrl, Beijing Vitalriver Laboratory Animal Co., LTD) tenían entre 6 y 8 semanas de edad y un rango de peso corporal (PW) de 16,0 a 21,1 g en el D1 del estudio. Los animales fueron alimentados a voluntad con agua (estéril) y alimento granulado seco esterilizado por irradiación. Los ratones se alojaron en camas de mazorcas de maíz en microaisladores estáticos en un ciclo de luz de 12 horas a 20­ 22 °C (68 - 72 °F) y 40 -60 % de humedad. Todos los procedimientos cumplen con las recomendaciones de la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio con respecto a la inmovilización, la cría, los procedimientos quirúrgicos, la regulación de alimentos y líquidos, y la atención veterinaria.

Cultivo de células tumorales

La línea celular de linfoma humana SUDHL10 se obtuvo de la DSMZ y se mantuvo en la CRO como cultivos en suspensión en medio RPMI-1640 que contenía 100 unidades/mL de sal sódica de penicilina G, 100 g/mL de estreptomicina y suero bovino fetal al 10 %. Las células se cultivaron en frascos de cultivo de tejidos en una incubadora humidificada a 37 °C, en una atmósfera de 5 % de CO2 y 95 % de aire. Solo se usaron cultivos por debajo del pase 12 para la implantación.

Implantación de tumores in vivo

La línea celular de linfoma humano SUDHL10 se recolectó durante el crecimiento de la fase logarítmica media y se resuspendió en PBS con MatrigelMC al 50 % (BD Biociencias). Cada ratón recibió 1 * 107 células (0.2 mL de suspensión celular) por vía subcutánea en el flanco derecho. Los tumores se calibraron en dos dimensiones para controlar el crecimiento a medida que el volumen medio se acercaba al rango deseado de 80 - 120 mm3. El tamaño del tumor, en mm3, se calculó a partir de:

w " X l

Volumen del tumor = -----------2

donde w = ancho y l = longitud, en mm, del tumor. El peso del tumor se puede estimar asumiendo que 1 mg es equivalente a 1 mm3 de volumen del tumor. Después de 10 días los ratones con tumores de 72-256 mm3 se clasificaron en cuatro grupos (n = 16 por grupo) con volúmenes medios de tumores de 173- 179 mm3.

Artículos de prueba

El bromhidrato del Compuesto I se almacenó a temperatura ambiente y se protegió de la luz. En cada día de tratamiento, se prepararon formulaciones de compuestos frescos suspendiendo el polvo en carboximetilcelulosa sódica al 0.5 % (NaCMC) y Tween® 80 al 0.1 % en agua desionizada. El vehículo, NaCMC al 0.5% y Tween® 80 al 0.1% en agua desionizada, se usó para tratar al grupo de control con el mismo programa. Las formulaciones se almacenaron protegidas de la luz a 4 °C antes de la administración.

Plan de tratamiento

Los ratones se trataron con dosis del bromhidrato del Compuesto I que oscilaban entre 125 y 500 mg/Kg y en programas BID (dos veces al día cada 12 h) durante 28 días mediante sonda oral. Cada dosis se administró en un volumen de 0.2 mL/20 g de ratón (10 mL/Kg) y se ajustó al último peso registrado de los animales individuales. En el día 25, se eligieron los 8 ratones con los tumores más pequeños por grupo para un punto final de retraso del crecimiento del tumor (observación hasta 60 días). Los animales restantes fueron sacrificados el día 28, 3 horas después de la última dosis para la recolección del tumor.

Volumen medio del tumor (MTV) y Análisis de inhibición del crecimiento del tumor (TGI)

La eficacia del tratamiento se determinó el último día del tratamiento. Para cada grupo se determinó MTV(n), la mediana del volumen del tumor para el número de animales, n, evaluable el último día. El porcentaje de inhibición del crecimiento del tumor (%TGI) se puede definir de varias maneras. En primer lugar, la diferencia entre el MTV(n) del grupo de control designado y el MTV(n) del grupo tratado con fármacos se expresa como porcentaje del MTV(n) del grupo de control:

100

Otra forma de calcular el %TGI es tener en cuenta el cambio del tamaño del tumor del día 1 al día n, siendo n el último día de tratamiento.

%TGI = ( ^{A M TVcontrol - A M E Etratado}

AM TVc o n tro l )^100

AMTVcontrol = MTV(n)control MTV(1)control

AMTVtratado = MTV(n)tratado — MTV(1)tratado

Análisis de retraso del crecimiento del tumor

Ocho ratones por grupo se mantuvieron vivos después del último día de tratamiento para el análisis del retraso del crecimiento del tumor. Los tumores se calibraron dos veces por semana y cada animal de prueba se sacrificó cuando su neoplasia alcanzó el volumen de punto final de 2000 mm3 o en el último día preespecificado del estudio, lo que ocurriera primero. Se realizó un análisis de supervivencia de Kaplan Meier.

Toxicidad

Los animales se pesaron diariamente en los días 1-5 y luego dos veces por semana hasta la finalización del estudio. Los ratones se examinaron con frecuencia en busca de signos evidentes de cualquier efecto secundario adverso relacionado con el tratamiento, que se documentaron. La toxicidad aceptable para la dosis máxima tolerada (MTD) se definió como una pérdida de peso corporal media del grupo de menos del 20 % durante la prueba y no más del 10 % de mortalidad debido a muertes por TR. Una muerte se clasificaría como TR si era atribuible a efectos secundarios del tratamiento evidenciados por signos clínicos y/o necropsia, o debido a causas desconocidas durante el período de dosificación. Una muerte debía clasificarse como NTR si había evidencia de que la muerte no estaba relacionada con los efectos secundarios del tratamiento. Las muertes por NTR durante el intervalo de dosificación normalmente se clasificarían como NTRa (debido a un accidente o error humano) o NTRm (debido a la diseminación del tumor confirmada por necropsia por invasión y/o metástasis). Los animales tratados por vía oral que mueren por causas desconocidas durante el período de dosificación pueden clasificarse como NTRu cuando el desempeño del grupo no respalda una clasificación de TR y necropsia, para descartar un error de dosificación, no es factible.

Muestreo

El día 28, se tomaron muestras de ocho ratones con los tumores más grandes de una manera preespecificada para evaluar la inhibición de la diana en los tumores. Los tumores se recogieron de ratones especificados en condiciones libres de RNasa y se dividieron en dos. Se midió el peso total del tumor. El tejido tumoral congelado de cada animal se congeló instantáneamente en N2 líquido y se pulverizo con un mortero y pistilo.

Análisis estadísticos y gráficos

Todos los análisis estadísticos y gráficos se realizaron con Prism 3.03 (GraphPad) para Windows. Para ensayar la significación estadística entre los grupos de control y tratados durante todo el transcurso del tiempo de tratamiento, se empleó una prueba ANOVA de medidas repetidas seguida de una prueba posterior de comparación múltiple de Dunnets. Prism informa los resultados como no significativos (ns) con P > 0.05, significativo (simbolizado por "*") con 0.01 < P < 0.05, muy significativo ("**") en 0.001 < P < 0.01 y extremadamente significativo ("***") con P < 0.001. Para el brazo de retraso del crecimiento del tumor del estudio, el porcentaje de animales en cada grupo que permanecía en el estudio frente al tiempo se presentó en un diagrama de supervivencia de Kaplan-Meier.

Extracción de histonas

Para el aislamiento de histonas, se homogeneizaron 60-90 mg de tejido tumoral en 1.5 mL de tampón de extracción nuclear (Tris-HCl 10 mM, MgCh 10 mM, KCl 25 mM, Triton X-100 al 1 %, sacarosa al 8.6 %, más un comprimido inhibidor de proteasa de Roche 1836145) y se incubó en hielo durante 5 minutos. Los núcleos se recogieron por centrifugación a 600 g durante 5 minutos a 4 °C y se lavaron una vez en PBS. Se eliminó el sobrenadante y se extrajeron las histonas durante una hora, con agitación tipo vórtice cada 15 minutos, con ácido sulfúrico frío 0.4 N. Los extractos se clarificaron por centrifugación a 10000 g durante 10 minutos a 4 °C y se transfirieron a un tubo de microcentrífuga nuevo que contenía volumen de 10x de acetona fría. Las histonas se precipitaron a -20 °C durante 2 horas durante la noche, se sedimentaron mediante centrifugación a 10000 g durante 10 minutos y se resuspendieron en agua.

ELISA

Las histonas se prepararon en concentraciones equivalentes en tampón de recubrimiento (PBS BSA al 0.05 %), lo que produjo 0.5 ng/pL de muestra, y se añadieron 100 pL de muestra o estándar por duplicado a 2 placas de ELISA de 96 pocillos (Thermo Labsystems, Immulon 4HBX #3885). Las placas se sellaron y se incubaron durante la noche a 4 °C. Al día siguiente, las placas se lavaron 3x con 300 pL/pocillo de PBST (PBS Tween 20 al 0.05 %; PBST 10x, KPL #51-14-02) en un lavador de placas Bio Tek. Las placas se bloquearon con 300 pL /pocilio de diluyente (PBS BSA al 2% Tween 20 al 0.05%), se incubaron a temperatura ambiente durante 2 horas y se lavaron 3x con PBST. Todos los anticuerpos se diluyeron en diluyente. Se añadieron a cada placa 100 pL/pocillo de anticuerpo anti-H3K27me3 (CST #9733, patrón de glicerol al 50% 1:1,000) o anticuerpo anti-H3 total (Abcam ab1791, glicerol al 50% 1:10,000). Las placas se incubaron durante 90 min a temperatura ambiente y se lavaron 3 veces con PBST. Se añadieron 100 pL/pocillo de anti-IgG de conejo conjugado con HRP (Cell Signaling Technology, 7074) 1:2,000 a la placa de H3K27Me3 y 1:6,000 a la placa de H3 y se incubó durante 90 min a temperatura ambiente. Las placas se lavaron 4x con PBST. Para la detección, se añadieron 100 pL/pocillo de sustrato TMB (BioFx Laboratories, #TMBS) y las placas se incubaron en la oscuridad a temperatura ambiente durante 5 min. La reacción se detuvo con 100 ul/pocillo 1N H2ASI QUE4. Se leyó la absorbancia a 450 nm en un lector de microplacas SpectraMax M5.

Resultados:

Se trataron ratones con xenoinjertos de tumores SUDHL10 con bromhidrato del Compuesto I a la dosis máxima tolerada de 500 mg/Kg BID y fracciones de la MTD ( ^ y % de la MTD). Todas las dosis fueron bien toleradas durante 28 días sin pérdida significativa de peso corporal. Hubo una muerte no relacionada con el tratamiento en el grupo de 500 mg/Kg el día 15 debido a un error de dosificación. Todas las dosis dieron como resultado una inhibición del crecimiento del tumor en comparación con el vehículo el día 28 (Tabla 4), y los grupos de 250 mg/Kg y 500 mg/Kg BID indujeron regresiones (TGI > 100%).

Tabla 4:

La Figura 12A muestra el crecimiento de los tumores de xenoinjerto de SUDHL10 a lo largo del tiempo para los diferentes grupos de tratamiento. El grupo de 125 mg/Kg BID no fue significativamente diferente del grupo del vehículo mediante ANOVA de medidas repetidas y la prueba posterior de Dunnett, pero el tamaño medio del tumor terminal en el día 28 fue significativamente menor que el del grupo del vehículo (ANOVA de 2 vías con prueba posterior de Bonferroni), p < 0.0001). La dosificación de 250 mg/Kg BID y 500 mg/Kg BID del bromhidrato del Compuesto I durante 28 días indujo respuestas de regresión comparables ya que los pesos terminales del tumor el día 28 fueron similares para esos 2 grupos (Figura 12B).

Las histonas aisladas de tumores recolectados el día 28 (3 h después de la última dosis) se sometieron a análisis ELISA para niveles globales de H3K27me3. La Figura 13 muestra una clara subregulación dependiente de la dosis de la marca de metilo de H3K27me3 con el tratamiento con bromhidrato del Compuesto I. Esta figura muestra la metilación global de H3K27me3 en tumores de SUDHL10 de ratones tratados con el bromhidrato del Compuesto I durante 28 días.

El día 25, se eligieron ocho ratones por grupo con los tumores más pequeños para un estudio de retraso del crecimiento del tumor para evaluar el nuevo crecimiento de los tumores después de la suspensión de la dosis el día 28. Los ratones fueron sacrificados cuando sus tumores alcanzaron un tamaño de 2000 mm3 o el día 60 (lo que ocurra primero). Estos datos se utilizaron para realizar un análisis de supervivencia de Kaplan Meier. La Figura 14A muestra que el nuevo crecimiento del tumor fue claramente dependiente de la dosis, y todos los ratones tratados con la dosis más alta de 500 mg/Kg BID durante 28 días sobrevivieron hasta el día 60. Solo 2 ratones tuvieron que ser sacrificados en el grupo de 250 mg/Kg antes del día 60. Los ratones en el grupo de 125 mg/Kg tuvieron un claro beneficio de supervivencia sobre los ratones tratados con vehículo con un aumento en la mediana de supervivencia de 15.5 días (Figura 14B).

Efecto anticancerígeno del bromhidrato del Compuesto I en el modelo de xenoinjerto de ratón de linfoma de células B grandes difusas humanas de Pfeiffer.

Se probó la actividad anticancerígena del monobromhidrato del Compuesto I en el modelo de xenoinjerto de ratón Pfeiffer, que es un modelo de xenoinjerto de linfoma de células B grandes difusas humanas. Las hembras de ratones NSG de 5 semanas de edad (Jackson Labs, Bar Harbor, Maine) se les implantaron por vía subcutánea de 20 a 25 mg de fragmentos de tumoral. El tratamiento se inició aproximadamente 31 días después de la implantación del tumor, cuando los tumores promedio alcanzaron aproximadamente 365 mm3. El esquema de tratamiento se describe en la Tabla 5.

Tabla 5. Esquema de dosificación

Se controló el volumen del tumor durante todo el experimento. El volumen del tumor se midió dos veces por semana después del inicio del tratamiento. La carga tumoral se calculó (mg = mm3) a partir de mediciones de calibre mediante la fórmula para el volumen de un elipsoide alargado (L * W2)/2 donde L y W son las respectivas medidas ortogonales de largo y ancho (mm).

El día 1 fue el día del primer tratamiento y el día 28 fue el día del último tratamiento. Este estudio finalizó 36 días después de la última dosis, por lo que el día 64 fue el día de finalización del estudio. Los criterios de valoración primarios utilizados para evaluar la eficacia en este estudio fueron las regresiones tumorales completas (CR), los tamaños de los tumores entre los grupos y el porcentaje de inhibición tumoral al final del estudio. Una respuesta completa se definió como una disminución en el tamaño del tumor a un tamaño indetectable (< 20 mm3) al final del estudio. Los valores del porcentaje de inhibición tumoral se calcularon a partir de la fórmula [1-(AT/AC)] * 100, donde AT y AC son cambios en el volumen medio del tumor (Acrecimiento) para cada grupo tratado (T) y control con vehículo (C) . T0 y C0 (un día antes de la primera dosis) se usaron para el volumen inicial del tumor. Además, los volúmenes del tumor que se tomaron un día después de la última dosis (T29 y C29) se utilizaron para el cálculo de AT y AC. Cuando el valor era superior al 100%, se concluyó como 100%. A continuación, se muestra la fórmula utilizada para el cálculo del porcentaje de inhibición del tumor.

r T2g T0

Porcentaje de inhibición del tumor = -1 1 — ------------------- [■ X 100 %

L C29 — CD J

Durante el período de tratamiento, se encontró que los animales no pueden tolerar el tratamiento diario de 1142 mg/Kg de bromhidrato del Compuesto I y tres animales en este grupo (grupo E) requirieron eutanasia después de la primera semana de tratamiento debido a una pérdida de más del 20% del peso corporal inicial. Por lo tanto, la administración del fármaco para este grupo se detuvo después de 12 dosis. Los animales de los otros tres grupos de dosificación, excepto un animal del grupo D (342 mg/Kg de bromhidrato del Compuesto I), toleraron bien el tratamiento de 28 días con una pérdida de peso corporal mínima. El peso corporal relativo del ratón se representó gráficamente en la Figura 15. El peso corporal del animal obtenido el día 0 se utilizó como peso corporal de referencia en el gráfico.

El bromhidrato del Compuesto I mostró una actividad anticancerígena potente y de larga duración en el modelo de Pfeiffer con una tasa de CR del 100 % en tres de los cuatro grupos de dosificación (Tabla 6). Además, no se observó un nuevo crecimiento del tumor incluso 36 días después de la interrupción del tratamiento. Esto sugiere que todas las células tumorales murieron durante el tratamiento. Aunque se observó un nuevo crecimiento del tumor en el grupo con la dosis más baja (grupo B, 34.2 mg/Kg), se observó una clara actividad de estasis del tumor durante el período de tratamiento (Figura 16). El tumor sólo comenzó a crecer tras la interrupción del tratamiento (Figura 16). Este resultado también sugiere que la actividad de estasis tumoral observada en el grupo B es de hecho actividad inducida por el artículo de prueba.

Tabla 6. Tabla de resumen de resultados

Claims (19)

REIVINDICACIONES

1. Bromhidrato de N-((4,6-dimetil-2-oxo-1,2-dihidropiridin-3-M)metM)-5-(etil (tetrahidro-2H-piran-4-N)amino)-4-metN-4'-(morfolinometil)-[1,1'-bifenil]-3-carboxamida para su uso en el tratamiento de un trastorno de proliferación celular.

2. Un compuesto para su uso de acuerdo con la reivindicación 1, que es un monobromhidrato.

3. Un compuesto para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, en el que dicho compuesto es cristalino.

4. Un compuesto para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que dicho compuesto está libre de impurezas.

5. Un compuesto para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que dicho compuesto es un sólido cristalino sustancialmente libre de bromhidrato de N-((4,6-dimetil-2-oxo-1,2-dihidropiridin-3-il)metil)-5-(etil (tetrahidro-2H-piran-4-il)amino)-4-metil-4'-(morfolinometil)-[1,1'-bifenil]-3-carboxamida amorfo.

6. Un compuesto para su uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el compuesto es el Polimorfo A del bromhidrato de N-((4,6-dimetil-2-oxo-1,2-dihidropiridin-3-il)metil)-5-(etil (tetrahidro-2H-piran-4-il)amino)-4-metil-4'-(morfolinometil)-[1,1'-bifenil]-3-carboxamida, en el que el Polimorfo A exhibe un patrón de difracción de rayos X en polvo que comprende uno o más picos seleccionados de picos característicos expresados en grados 2-theta a 3.9 /- 0.3 grados, 17.5 /- 0.3 grados y 22.0 /- 0.3 grados 2-theta.

7. Un compuesto para su uso de acuerdo con la reivindicación 6; en el que el polimorfo exhibe un patrón de difracción de rayos X en polvo que comprende picos característicos expresados en grados 2-theta a 3.9 /- 0.3 grados, 17.5 /-0.3 grados y 22.0 /- 0.3 grados 2-theta.

8. Un compuesto para su uso de acuerdo con la reivindicación 6; en el que el polimorfo exhibe un patrón de difracción de rayos X en polvo que comprende picos característicos expresados en grados 2-theta a 3.9 /- 0.3 grados, 14.3 /-0.3 grados, 18.7 /-0.3 grados, 23.3 /-0.3 grados y 23.6 /-0.3 grados 2-theta.

9. Un compuesto para su uso de acuerdo con la reivindicación 6; en el que el polimorfo exhibe un patrón de difracción de rayos X en polvo que comprende al menos 5 picos seleccionados de picos característicos expresados en grados 2-theta a 3.9 /- 0.3 grados, 10.1 /- 0.3 grados, 14.3 /- 0.3 grados, 17.5 /- 0.3 grados, 18.7 /- 0.3 grados, 20.6 /-0.3 grados, 20.9 /- 0.3 grados, 21.8 /- 0.3 grados, 22.0 /- 0.3 grados, 23.3 /- 0.3 grados y 23.6 /- 0.3 grados 2-theta.

10. Un compuesto para su uso de acuerdo con la reivindicación 6; en el que el polimorfo exhibe un patrón de difracción de rayos X en polvo que comprende al menos 10 picos seleccionados de picos característicos expresados en grados 2-theta a 3.9 /- 0.3 grados, 10.1 /- 0.3 grados, 14.3 /- 0.3 grados, 17.5 /- 0.3 grados , 18.7 /- 0.3 grados, 20.6 /-0.3 grados, 20.9 /- 0.3 grados, 21.8 /- 0.3 grados, 22.0 /- 0.3 grados, 23.3 /- 0.3 grados y 23.6 /- 0.3 grados 2-theta.

11. Un compuesto para su uso de acuerdo con la reivindicación 6; en el que el polimorfo exhibe un patrón de difracción de rayos X en polvo que comprende picos característicos expresados en grados 2-theta a 3.9 /- 0.3 grados, 10.1 /-0.3 grados, 14.3 /- 0.3 grados, 17.5 /- 0.3 grados, 18.7 /- 0.3 grados , 20.6 /- 0.3 grados, 20.9 /- 0.3 grados, 21.8 /- 0.3 grados, 22.0 /- 0.3 grados, 23.3 /- 0.3 grados y 23.6 /- 0.3 grados 2-theta.

12. Un compuesto para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 11, en el que el polimorfo exhibe un patrón de difracción de rayos X en polvo sustancialmente de acuerdo con la Figura 1 y/o el polimorfo exhibe un patrón de difracción de rayos X en polvo sustancialmente de acuerdo con la Tabla 1:

Tabla 1

13. Un compuesto para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 12, en el que el polimorfo exhibe un termograma de calorimetría diferencial de barrido que tiene un pico característico expresado en unidades de °C a una temperatura de 255 /- 5 °C.

14. Un compuesto para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 13, en el que el polimorfo exhibe un termograma de calorimetría diferencial de barrido sustancialmente de acuerdo con la Figura 3.

15. Una composición farmacéutica que comprende bromhidrato de N-((4,6-dimetil-2-oxo-1,2-dihidropiridin-3-il)metil)-5 -(etil(tetrahidro-2H-piran-4-il)amino)-4-metil-4'-(morfolinometil)-[1,1'-bifenil]-3-carboxamida o Polimorfo A de bromhidrato de N-((4,6-dimetil-2-oxo-1,2-dihidropiridin-3-il)metil)-5-(etil(tetrahidro-2H-piran-4-il)amino)-4-metil-4'-(morfolinometil)-[1,1'-bifenil]-3-carboxamida como se define en la reivindicación 6 y un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable para su uso en el tratamiento de un trastorno de proliferación celular.

16. Un compuesto para su uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, o una composición farmacéutica para su uso de acuerdo con la reivindicación 15, en el que el trastorno proliferativo celular se selecciona de un trastorno proliferativo celular de la próstata, un trastorno proliferativo celular del pulmón, un trastorno proliferativo celular del colon, un trastorno proliferativo celular del páncreas, un trastorno proliferativo celular de la piel, un trastorno proliferativo celular del ovario, un trastorno proliferativo celular de la mama, o una condición de precáncer o precancerosa.

17. Un compuesto para su uso, o una composición farmacéutica para su uso de acuerdo con la reivindicación 16, en el que el trastorno proliferativo de células de la próstata se selecciona de cáncer de próstata, una condición de precáncer o precancerosa de la próstata, crecimientos benignos o lesiones de la próstata, crecimientos malignos o lesiones de la próstata, y lesiones metastásicas en tejidos y órganos del cuerpo distintos de la próstata.

18. Un compuesto para su uso, o una composición farmacéutica para su uso de acuerdo con la reivindicación 16, en el que el trastorno proliferativo de células de la próstata se selecciona de hiperplasia, metaplasia y displasia de la próstata.

19. Un compuesto para su uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14 o una composición farmacéutica para su uso de acuerdo con la reivindicación 15, en el que el trastorno de proliferación celular es un cáncer seleccionado de

(i) linfomas, incluidos linfoma no Hodgkin, linfoma folicular (FL) y el linfoma difuso de células B grandes (DLBCL); melanoma; y leucemia, incluyendo CML;

(ii) cáncer de pulmón de células pequeñas ("SCLC"); y

(iii) mieloma múltiple.