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ES2929837T3 - Composiciones y métodos para mejorar la identificación de muestras en bibliotecas de ácidos nucleicos indexados - Google Patents

Composiciones y métodos para mejorar la identificación de muestras en bibliotecas de ácidos nucleicos indexados Download PDF

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ES2929837T3
ES2929837T3 ES21168956T ES21168956T ES2929837T3 ES 2929837 T3 ES2929837 T3 ES 2929837T3 ES 21168956 T ES21168956 T ES 21168956T ES 21168956 T ES21168956 T ES 21168956T ES 2929837 T3 ES2929837 T3 ES 2929837T3
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Mahdieh Khosroheidari
Angela Kalbande
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Abstract

La presente invención se refiere a composiciones y métodos para mejorar la tasa de identificación correcta de muestras en preparaciones de bibliotecas de ácidos nucleicos indexadas para secuenciación multiplex de próxima generación mediante tratamiento con exonucleasa después de que los adaptadores protectores se ligan a los polinucleótidos diana para degradar los adaptadores no incorporados antes de la amplificación y la secuenciación. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Composiciones y métodos para mejorar la identificación de muestras en bibliotecas de ácidos nucleicos indexados
Campo
La presente divulgación se refiere a métodos y kits para la secuenciación de polinucleótidos de múltiples bibliotecas indexadas; y más particularmente a aumentar la probabilidad de que la secuenciación identifique adecuadamente la biblioteca a partir de la cual se originaron los polinucleótidos.
Antecedentes
Las mejoras en las metodologías de secuenciación han permitido la secuenciación de polinucleótidos agrupados o multiplexados de diferentes bibliotecas en un único protocolo de secuenciación. Puede añadirse una secuencia específica de biblioteca (una "etiqueta de índice") a los ácidos polinucleicos de cada biblioteca para que el origen de cada ácido polinucleico secuenciado pueda identificarse adecuadamente. La secuencia de la etiqueta de índice se puede añadir a los polinucleótidos de una biblioteca, por ejemplo, ligando adaptadores que comprenden la secuencia de la etiqueta de índice a los extremos de los ácidos polinucleicos.
Los adaptadores pueden contener secuencias además de la secuencia de etiqueta de índice, tales como una secuencia de cebador de extensión universal y una secuencia de cebador de secuenciación universal. La secuencia del cebador de extensión universal puede, entre otras cosas, hibridar con un primer oligonucleótido acoplado a una superficie sólida. El primer oligonucleótido puede tener un extremo 3' libre desde el cual una polimerasa puede añadir nucleótidos para extender la secuencia usando el polinucleótido de biblioteca hibridado como molde, lo que da como resultado que una hebra inversa del polinucleótido de biblioteca se acople a la superficie sólida. Se pueden acoplar copias adicionales de hebras directas e inversas a la superficie sólida a través de la amplificación de agrupamiento. Un ejemplo de amplificación de agrupamiento es la amplificación de puente en la que el extremo 3' de los polinucleótidos previamente amplificados que están unidos a la superficie sólida se hibrida con segundos oligonucleótidos unidos a la superficie sólida. El segundo oligonucleótido puede tener un extremo 3' libre desde el cual una polimerasa puede añadir nucleótidos para extender la secuencia usando el polinucleótido de hebra inversa acoplado como molde, lo que da como resultado que una hebra directa del polinucleótido de la biblioteca se acople a la superficie sólida a través del segundo oligonucleótido. El proceso puede repetirse para producir agrupamientos de hebras directas e inversas acopladas a la superficie sólida. Las hebras directas o las hebras inversas pueden eliminarse, p. ej. a través de la escisión, antes de la secuenciación.
Un cebador de secuenciación puede hibridar con una parte de una hebra de polinucleótido acoplada al soporte sólido. Por ejemplo, el cebador de secuenciación puede hibridar con una secuencia de cebador de secuenciación universal, si está presente. La secuenciación puede ocurrir a través de múltiples rondas de adición de nucleótidos al cebador de secuenciación usando el polinucleótido acoplado como molde y detectando la identidad de los nucleótidos añadidos. La hibridación del cebador de secuenciación puede ocurrir en una localización en la hebra de polinucleótido acoplada para permitir la identificación de la secuencia de la etiqueta de índice, así como una secuencia diana del polinucleótido acoplado a la superficie sólida o pueden emplearse cebadores de secuenciación separados para secuenciar por separado la secuencia de etiqueta de índice y la secuencia diana. Por consiguiente, la secuencia diana puede indexarse en una biblioteca de origen particular basándose en la secuencia de etiqueta de índice asociada con la secuencia diana.
A pesar de la inclusión de una secuencia de etiqueta de índice específica de la biblioteca en cada ácido polinucleico que se va a secuenciar, pueden ocurrir errores al identificar el origen de la biblioteca de un ácido polinucleico secuenciado debido a un fenómeno conocido como salto de índice. El salto de índice ocurre cuando las secuencias de etiquetas de índice de una biblioteca se añaden inadvertidamente a un ácido polinucleico de una biblioteca diferente. El salto de índice puede ocurrir durante la preparación de la biblioteca o la amplificación de agrupamientos de los polinucleótidos en una celda de flujo u otro soporte sólido adecuado para la secuenciación. El salto de índice puede confundir los resultados de la secuenciación, tal como dando como resultado una asignación incorrecta del origen de la biblioteca de un polinucleótido secuenciado.
Rahula Sinha et al., bioRxiv, 9 de abril de 2017, DOI: 10.1101/125724 y Kircher M et al., Nucleic Acids Research, vol.
40, Número 1, páginas 3-8 analizan ambos el uso de la indexación dual durante la secuenciación de ácidos nucleicos.
Breve resumen
Los posibles mecanismos asociados con el salto de índice incluyen la degradación de polinucleótidos, incluidos los polinucleótidos diana y los adaptadores no incorporados, que no forman secuencias de polinucleótidos adaptadordiana-adaptador durante la preparación de la muestra de la biblioteca. Sin pretender limitarse a la teoría, se cree que el salto de índice puede ocurrir cuando un adaptador no incorporado que comprende una secuencia de etiqueta de índice para una biblioteca se hibrida con una parte de un adaptador de otra biblioteca, y el adaptador no incorporado sirve como cebador durante la amplificación de agrupamientos. Por tanto, una secuencia diana de una biblioteca puede etiquetarse con una etiqueta de índice de un adaptador de otra biblioteca. Durante las rondas posteriores de amplificación de agrupamientos, se pueden amplificar copias adicionales de la diana mal etiquetada antes de la secuenciación. Tal salto de índice puede confundir los resultados de la secuenciación posterior. Al degradar los adaptadores no incorporados durante la preparación de muestras de la biblioteca, los adaptadores no incorporados de otras bibliotecas no estarán disponibles para servir como cebadores durante la amplificación de agrupamientos y, por tanto, se puede mitigar el salto de índice.
De acuerdo con un aspecto de la invención, se proporciona un método que incluye proporcionar una primera pluralidad de fragmentos de polinucleótidos diana bicatenarios. Cada uno de los fragmentos de polinucleótido diana bicatenario tiene un primer extremo y un segundo extremo. El método incluye además proporcionar un primer oligonucleótido adaptador que comprende una primera hebra que tiene un extremo 5' y un extremo 3' y una segunda hebra que tiene un extremo 5' y un extremo 3'. El primer oligonucleótido adaptador comprende (i) una región bicatenaria que comprende el extremo 5' de la primera hebra y el extremo 3' de la segunda hebra, y (ii) una región monocatenaria en la que la primera y la segunda hebra son monocatenarias. La región monocatenaria comprende el extremo 3' de la primera hebra y el extremo 5' de la segunda hebra. El primer oligonucleótido adaptador comprende una primera secuencia específica de biblioteca. El extremo 3' de la primera hebra se modifica para evitar la digestión por una enzima que tiene actividad de exonucleasa 3', y el extremo 5' de la segunda hebra se modifica para evitar la digestión por una enzima que tiene actividad de exonucleasa 5'. El método comprende además incubar el primer oligonucleótido adaptador y la primera pluralidad de fragmentos de polinucleótido diana bicatenarios en condiciones adecuadas para ligar el extremo 5' de la primera hebra del primer adaptador y el extremo 3' de la segunda hebra del primer adaptador con los extremos primero y segundo de los fragmentos de polinucleótido diana bicatenario para producir una primera biblioteca de polinucleótidos que comprende secuencias primer adaptador-diana-primer adaptador. El método comprende además poner en contacto la primera biblioteca de polinucleótidos con una exonucleasa. La exonucleasa comprende actividad de exonucleasa monocatenaria 3' y 5', para degradar selectivamente los primeros oligonucleótidos adaptadores que no están ligados a los fragmentos de polinucleótidos diana bicatenarios. El método incluye además proporcionar una segunda pluralidad de fragmentos de polinucleótidos diana bicatenarios. Cada uno de los fragmentos de polinucleótido diana bicatenario tiene un primer extremo y un segundo extremo. El método incluye además proporcionar un segundo oligonucleótido adaptador que comprende una primera hebra que tiene un extremo 5' y un extremo 3' y una segunda hebra que tiene un extremo 5' y un extremo 3'. El segundo oligonucleótido adaptador comprende (i) una región bicatenaria que comprende el extremo 5' de la primera hebra y el extremo 3' de la segunda hebra, y (ii) una región monocatenaria en la que la primera y la segunda hebra son monocatenarias. La región monocatenaria comprende el extremo 3' de la primera hebra y el extremo 5' de la segunda hebra. El extremo 3' de la primera hebra se modifica para evitar la digestión por una enzima que tiene actividad de exonucleasa 3', y el extremo 5' de la segunda hebra se modifica para evitar la digestión por una enzima que tiene actividad de exonucleasa 5'. El segundo oligonucleótido adaptador comprende una segunda secuencia específica de biblioteca diferente de la primera secuencia específica de biblioteca. El método comprende además incubar el segundo oligonucleótido adaptador y la segunda pluralidad de fragmentos de polinucleótido diana bicatenario en condiciones adecuadas para ligar el extremo 5' de la primera hebra del segundo adaptador y el extremo 3' de la segunda hebra del segundo adaptador con los extremos primero y segundo de los fragmentos de polinucleótido diana bicatenario para producir una segunda biblioteca de polinucleótidos que comprende secuencias segundo adaptador-diana-segundo adaptador. El método comprende además poner en contacto la segunda biblioteca de polinucleótidos con una exonucleasa. La exonucleasa comprende actividad de exonucleasa monocatenaria 3' y 5', para degradar selectivamente los segundos oligonucleótidos adaptadores que no están ligados a los fragmentos de polinucleótidos diana bicatenarios.
En otro aspecto, se proporciona un kit que comprende un adaptador de oligonucleótidos para ligarse a un polinucleótido diana antes de la secuenciación que incluye una primera hebra de oligonucleótidos que tiene un extremo 5' y un extremo 3'; y una segunda hebra de oligonucleótidos que tiene un extremo 5' y un extremo 3'. Una región del extremo 5' de la primera hebra comprende nucleótidos complementarios de los nucleótidos de una región del extremo 3' de la segunda hebra de manera que las regiones complementarias son bicatenarias. Una región del extremo 3' de la primera hebra y una región del extremo 5' de la segunda hebra son suficientemente no complementarias para ser monocatenarias. Al menos una de la primera hebra y la segunda hebra comprende una secuencia de etiqueta de índice específica de biblioteca. El extremo 3' de la primera hebra se modifica para evitar la digestión por una enzima que tiene actividad de exonucleasa 3', y el extremo 5' de la segunda hebra se modifica para evitar la digestión por una enzima que tiene actividad de exonucleasa 5'. El kit también comprende una exonucleasa.
Los métodos y kits descritos en el presente documento pueden ser útiles para mitigar el salto de índice, por ejemplo, al degradar los adaptadores no incorporados durante la preparación de la muestra de la biblioteca. Al degradar los adaptadores no incorporados, los adaptadores no incorporados no estarán disponibles para servir potencialmente como amplificación de agrupamientos de cebadores de extensión inadvertida. Además, se entenderá que la degradación de productos incompletos, tales como los polinucleótidos diana a los que no se liga ningún adaptador o a los que solo se liga un adaptador, sería generalmente beneficiosa para reducir la unión de los ácidos polinucleicos al soporte sólido que pueden no servir como moldes eficaces para la secuenciación.
Breve descripción de los dibujos
La siguiente descripción detallada puede entenderse mejor cuando se lee junto con los siguientes dibujos.
La FIG. 1 es un dibujo esquemático de un adaptador según diversos aspectos de la divulgación presentada en el presente documento.
La FIG. 2 es un dibujo esquemático de un polinucleótido molde que tiene una secuencia adaptador-dianaadaptador (que puede incluir un adaptador generalmente como se muestra en la FIG. 1) según diversos aspectos de la divulgación presentada en el presente documento.
La FIG. 3 es un dibujo esquemático que ilustra los resultados de la incubación de productos de reacción y reactivos de una ligadura adaptador-diana con una exonucleasa.
La FIG. 4 es un dibujo esquemático que ilustra una realización de un proceso para la amplificación de agrupamientos que emplea una realización de un polinucleótido molde (que puede ser el polinucleótido molde representado en la FIG. 2) según diversos aspectos de la divulgación presentada en el presente documento.
La FIG. 5 es un dibujo esquemático que ilustra una realización de cómo el tratamiento con exonucleasa puede mitigar el salto de índice de acuerdo con diversas realizaciones descritas en el presente documento.
Las FIGS. 6A y 6B ilustran la naturaleza del fenómeno de salto de índice. La FIG. 6A muestra cómo las lecturas de una muestra dada se demultiplexan incorrectamente y se mezclan con una muestra diferente después de la demultiplexación. La FIG. 6B demuestra el salto de índice en un sistema de índice dual, donde conduce a combinaciones inesperadas de secuencias de etiquetas de índice.
Las FIGS. 7A y 7B ilustran el enfoque general para medir la tasa de salto de índice en un sistema dado. La FIG.
7A muestra un diseño de ejemplo de una placa adaptadora dual, en el que cada pocillo individual de una placa de 96 pocillos contiene un par único de secuencias de etiquetas de índice. La FIG.7B muestra una configuración experimental destinada a medir la tasa de salto de índice, en la que solo se usan combinaciones únicas de etiquetas de índice dual.
Las FIGS. 8A y 8B ilustran el efecto de los adaptadores no ligados sobre la tasa de salto de índice. La FIG. 8A muestra un aumento de 6 veces en el salto de índice asociado con una adición del 50 % de los adaptadores libres. La FIG. 8B muestra un efecto aproximadamente lineal del adaptador bifurcado libre sobre la tasa de salto de índice dentro del intervalo probado.
La FIG. 9 muestra el efecto del tratamiento combinado de exonucleasa y bloqueo en 3' con adaptadores protegidos según la presente invención sobre las tasas de salto de índice en el flujo de trabajo de preparación de bibliotecas Illumina TruSeq PCR-Free, con y sin adición de adaptador libre.
Los dibujos esquemáticos no están necesariamente a escala. Los números similares usados en las figuras se refieren a componentes y etapas similares. Sin embargo, se entenderá que el uso de un número para referirse a un componente en una figura dada no pretende limitar el componente en otra figura etiquetada con el mismo número. Además, el uso de diferentes números para referirse a los componentes no pretende indicar que los diferentes componentes numerados no pueden ser iguales o similares a otros componentes numerados.
Descripción detallada
Los aspectos de la invención se discutirán ahora con mayor detalle a continuación.
Definiciones
Todos los términos científicos y técnicos usados en el presente documento tienen significados comúnmente usados en la técnica a menos que se especifique lo contrario. Las definiciones proporcionadas en el presente documento son para facilitar la comprensión de ciertos términos que se usan con frecuencia en el presente documento.
Como se usa en el presente documento, las formas singulares "un", "una" y "el/la" incluyen referentes plurales a menos que el contexto dicte claramente lo contrario. Por tanto, por ejemplo, la referencia a una "exonucleasa" incluye ejemplos que tienen dos o más "exonucleasas" a menos que el contexto indique claramente lo contrario.
Tal como se usa en esta memoria descriptiva y en las reivindicaciones adjuntas, el término "o" se emplea generalmente en su sentido que incluye "y/o" a menos que el contenido indique claramente lo contrario. El término "y/o" significa uno o todos los elementos enumerados o una combinación de dos o más de los elementos enumerados. El uso de "y/o" en algunos casos no implica que el uso de "o" en otros casos no signifique "y/o".
Como se usa en el presente documento, "tienen", "tiene", "teniendo", "incluyen", "incluye", "incluyendo", "comprenden", "comprende", "comprendiendo" o similares se usan en su sentido inclusivo abierto, y generalmente significan "incluyen, pero sin limitación", "incluye, pero sin limitación " o "incluyendo, pero sin limitación".
"Opcional" u "opcionalmente" significa que el evento, circunstancia o componente descrito posteriormente puede o no ocurrir, y que la descripción incluye instancias en las que ocurre el evento, circunstancia o componente y instancias en las que no ocurre.
Las palabras "preferido" y "preferiblemente" se refieren a realizaciones de la divulgación que pueden brindar ciertos beneficios, bajo ciertas circunstancias. Sin embargo, también se pueden preferir otras realizaciones, bajo las mismas u otras circunstancias. Además, la enumeración de una o más realizaciones preferidas no implica que otras realizaciones no sean útiles, y no pretende excluir otras realizaciones del alcance de la tecnología inventiva.
También en el presente documento, las enumeraciones de intervalos numéricos por puntos finales incluyen todos los números englobados dentro de ese intervalo (por ejemplo, 1 a 5 incluye 1, 1,5, 2, 2,75, 3, 3,80, 4, 5, etc.). Cuando un intervalo de valores es "mayor que", "menor que", etc. un valor particular, ese valor se incluye dentro del intervalo.
A menos que se indique expresamente lo contrario, de ninguna manera se pretende que ningún método expuesto en el presente documento requiera que sus etapas se realicen en un orden específico. Por consiguiente, cuando la reivindicación de un método en realidad no enumere un orden a seguir por sus etapas o no se indique específicamente lo contrario en las reivindicaciones o descripciones, que las etapas deben limitarse a un orden específico, de ninguna manera se pretende inferir cualquier orden particular. Cualquier característica o aspecto único o múltiple enumerado en cualquier reivindicación puede combinarse o permutarse con cualquier otra característica o aspecto enumerado en cualquier otra reivindicación o reivindicaciones.
Si bien se pueden divulgar diversas características, elementos o etapas de realizaciones particulares usando la frase de transición "que comprende", se debe entender que están implícitas realizaciones alternativas, incluidas aquellas que pueden describirse usando las frases de transición "que consisten" o "que consisten esencialmente en". Por tanto, por ejemplo, las realizaciones alternativas implícitas de un polinucleótido que comprende una secuencia adaptadordiana-adaptador incluyen realizaciones donde el polinucleótido consiste en la secuencia adaptador-diana-adaptador y realizaciones donde el polinucleótido consiste esencialmente en la secuencia adaptador-diana-adaptador.
Como se usa en el presente documento, "proporcionar" en el contexto de un compuesto, composición o artículo significa elaborar el compuesto, composición o artículo, comprar el compuesto, composición o artículo, u obtener de otro modo el compuesto, composición o artículo.
Como se usa en el presente documento, "amplificar", "amplificando" o "reacción de amplificación" y sus derivados, se refieren generalmente a cualquier acción o proceso mediante el cual al menos una parte de un polinucleótido (p. ej., un polinucleótido molde) se replica o copia en al menos un polinucleótido adicional. El polinucleótido adicional incluye opcionalmente una secuencia que es sustancialmente idéntica a o sustancialmente complementaria de al menos alguna parte del polinucleótido molde. El polinucleótido molde puede ser monocatenario o bicatenario y el polinucleótido adicional puede ser independientemente monocatenario o bicatenario. La amplificación incluye opcionalmente la replicación lineal o exponencial de un polinucleótido. En algunas realizaciones, tal amplificación se puede realizar usando condiciones isotérmicas; en otras realizaciones, tal amplificación puede incluir termociclado. En algunas realizaciones, la amplificación es una amplificación multiplexada que incluye la amplificación simultánea de una pluralidad de secuencias diana en una sola reacción de amplificación. En algunas realizaciones, "amplificación" incluye la amplificación de al menos una parte de los ácidos nucleicos basados en ADN y ARN solos o en combinación. La reacción de amplificación puede incluir cualquiera de los procesos de amplificación conocidos por los expertos en la materia. En algunas realizaciones, la reacción de amplificación incluye la reacción en cadena de la polimerasa (PCR).
Como se usa en el presente documento, "condiciones de amplificación" y sus derivados, generalmente se refiere a condiciones adecuadas para amplificar una o más secuencias de polinucleótidos. Tal amplificación puede ser lineal o exponencial. En algunas realizaciones, las condiciones de amplificación pueden incluir condiciones isotérmicas o, como alternativa, pueden incluir condiciones de termociclado, o una combinación de condiciones isotérmicas y de termociclado. En algunas realizaciones, las condiciones adecuadas para amplificar una o más secuencias de polinucleótidos incluyen condiciones de reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Típicamente, las condiciones de amplificación se refieren a una mezcla de reacción que es suficiente para amplificar polinucleótidos tales como una o más secuencias diana, o para amplificar una secuencia diana amplificada ligada a uno o más adaptadores, por ejemplo, una secuencia diana amplificada ligada a adaptador. Generalmente, las condiciones de amplificación incluyen un catalizador para la amplificación o para la síntesis de polinucleótidos, por ejemplo, una polimerasa; un cebador que posee algún grado de complementariedad con el ácido nucleico a amplificar; y nucleótidos, tales como trifosfatos de desoxirribonucleótidos (dNTP) para promover la extensión del cebador una vez hibridado con el ácido nucleico. Las condiciones de amplificación pueden requerir la hibridación o reasociación de un cebador con un ácido nucleico, la extensión del cebador y una etapa de desnaturalización en la que el cebador extendido se separa de la secuencia de polinucleótidos que experimenta la amplificación. Típicamente, pero no necesariamente, las condiciones de amplificación pueden incluir termociclado; en algunas realizaciones, las condiciones de amplificación incluyen una pluralidad de ciclos donde se repiten las etapas de hibridación, extensión y separación. Típicamente, las condiciones de amplificación incluyen cationes tales como Mg++ o Mn++ y también pueden incluir diversos modificadores de la fuerza iónica.
Como se usa en el presente documento, el término "reacción en cadena de la polimerasa" ("PCR") se refiere al método de K. B. Mullis, pat. de EE. UU. n.° 4.683.195 y 4.683.202, que describen un método para aumentar la concentración de un segmento de un polinucleótido de interés en una mezcla de ADN genómico sin clonación ni purificación. Este proceso para amplificar el polinucleótido de interés consiste en introducir un gran exceso de dos oligonucleótidos cebadores en la mezcla de ADN que contiene el polinucleótido de interés deseado, seguido de una serie de ciclos térmicos en presencia de una ADN polimerasa. Los dos cebadores son complementarios de sus respectivas hebras del polinucleótido de interés bicatenario. La mezcla se desnaturaliza primero a una temperatura más alta y luego los cebadores se hibridan con secuencias complementarias dentro del polinucleótido de la molécula de interés. Después de la reasociación, los cebadores se extienden con una polimerasa para formar un nuevo par de hebras complementarias. Las etapas de desnaturalización, hibridación con cebadores y extensión con polimerasa pueden repetirse muchas veces (lo que se denomina termociclado) para obtener una alta concentración de un segmento amplificado del polinucleótido de interés deseado. La longitud del segmento amplificado del polinucleótido de interés deseado (amplicón) está determinada por las posiciones relativas de los cebadores entre sí y, por lo tanto, esta longitud es un parámetro controlable. En virtud de la repetición del proceso, el método se denomina "reacción en cadena de la polimerasa" (en lo sucesivo, "PCR"). Debido a que los segmentos amplificados deseados del polinucleótido de interés se convierten en las secuencias de ácido nucleico predominantes (en términos de concentración) en la mezcla, se dice que están "amplificados por PCR". En una modificación del método discutido anteriormente, los polinucleótidos pueden amplificarse por PCR usando una pluralidad de pares de cebadores diferentes, en algunos casos, uno o más pares de cebadores por polinucleótido de interés, formando así una reacción de PCR multiplexada.
Tal como se define en el presente documento, "amplificación multiplexada" se refiere a la amplificación selectiva y no aleatoria de dos o más secuencias diana dentro de una muestra usando al menos un cebador específico de la diana. En algunas realizaciones, la amplificación multiplexada se realiza de tal manera que algunas o todas las secuencias diana se amplifican dentro de un único recipiente de reacción. El "plexado" o "plex" de una amplificación multiplexada dada se refiere generalmente al número de diferentes secuencias específicas de la diana que se amplifican durante esa única amplificación multiplexada. El plexado puede ser de aproximadamente 12 plex, 24 plex, 48 plex, 96 plex, 192 plex, 384 plex, 768 plex, 1536 plex, 3072 plex, 6144 plex o superior. También es posible detectar las secuencias diana amplificadas mediante varias metodologías diferentes (p. ej., electroforesis en gel seguida de densitometría, cuantificación con un bioanalizador o PCR cuantitativa, hibridación con una sonda marcada; incorporación de cebadores biotinilados seguida de detección del conjugado avidina-enzima; incorporación de trifosfatos de desoxinucleótidos marcados con 32P en la secuencia diana amplificada).
Como se usa en el presente documento, el término "cebador" y sus derivados se refieren generalmente a cualquier polinucleótido que pueda hibridar con una secuencia diana de interés. Típicamente, el cebador funciona como un sustrato sobre el cual una polimerasa puede polimerizar los nucleótidos; sin embargo, el cebador puede incorporarse a la hebra de ácido nucleico sintetizado y proporcionar un sitio con el que otro cebador puede hibridarse para iniciar la síntesis de una nueva hebra que es complementaria de la molécula de ácido nucleico sintetizada. El cebador puede estar compuesto por cualquier combinación de nucleótidos o análogos de los mismos. En algunos casos, el cebador es un oligonucleótido o polinucleótido monocatenario. Como se usa en el presente documento, "secuencias diana amplificadas" y sus derivados, se refiere generalmente a una secuencia de polinucleótidos producida por la amplificación de las secuencias diana usando cebadores específicos de diana y los métodos proporcionados en el presente documento. Las secuencias diana amplificadas pueden ser del mismo sentido (es decir, la hebra positiva) o antisentido (es decir, la hebra negativa) con respecto a las secuencias diana.
Como se usa en el presente documento, el término "polimerasa" pretende ser consistente con su uso en la técnica e incluye, por ejemplo, una enzima que produce una réplica complementaria de un polinucleótido usando el polinucleótido como hebra molde. Típicamente, las ADN polimerasas se unen a la hebra molde y luego se mueven hacia abajo en la hebra molde añadiendo secuencialmente nucleótidos al grupo hidroxilo libre en el extremo 3' de una hebra creciente de ácido nucleico. Las ADN polimerasas sintetizan típicamente moléculas de ADN complementarias a partir de moldes de ADN y las ARN polimerasas sintetizan típicamente moléculas de ARN a partir de moldes de ADN (transcripción). Las polimerasas pueden usar una hebra corta de ARN o ADN, llamada cebador, para comenzar el crecimiento de la hebra. Algunas polimerasas pueden desplazar la hebra en dirección 5’ del sitio donde añaden bases a una cadena. Se dice que tales polimerasas desplazan la hebra, lo que significa que tienen una actividad que retira la hebra complementaria de una hebra molde que está siendo leída por la polimerasa. Los ejemplos de polimerasas que tienen actividad de desplazamiento de hebra incluyen, sin limitación, el fragmento grande de polimerasa Bst (Bacillus stearothermophilus), polimerasa exo-Klenow o exopolimerasa T7 de pureza de secuenciación. Algunas polimerasas degradan la hebra frente a ellas, reemplazándola efectivamente con la cadena en crecimiento detrás (actividad exonucleasa 5'). Algunas polimerasas tienen una actividad que degrada la hebra detrás de ellas (actividad exonucleasa 3'). Algunas polimerasas útiles se han modificado, ya sea por mutación o de otro modo, para reducir o eliminar la actividad exonucleasa 3' y/o 5'.
Como se usa en el presente documento, el término "secuencia universal" se refiere a una región de secuencia que es común a dos o más moléculas de ácido nucleico donde las moléculas también tienen regiones de secuencia que difieren entre sí. Una secuencia universal que está presente en diferentes miembros de una colección de moléculas puede permitir la captura de múltiples ácidos nucleicos diferentes usando una población de ácidos nucleicos de captura universales que son complementarios de la secuencia universal. De manera similar, una secuencia universal presente en diferentes miembros de una colección de moléculas puede permitir la replicación o amplificación de múltiples ácidos nucleicos diferentes usando una población de cebadores universales que son complementarios de la secuencia universal. Por tanto, un polinucleótido de captura universal o un cebador universal incluye una secuencia que puede hibridar específicamente con una secuencia universal. Los polinucleótidos pueden modificarse para fijarse a adaptadores universales, por ejemplo, en uno o ambos extremos de las diferentes secuencias.
Salto de índice
Esta divulgación se refiere, entre otras cosas, a la secuenciación de polinucleótidos de múltiples bibliotecas indexadas; y más particularmente a aumentar la probabilidad de que la secuenciación identifique adecuadamente la biblioteca a partir de la cual se originaron los polinucleótidos.
Cuando los polinucleótidos de diferentes bibliotecas se agrupan o multiplexan para la secuenciación, los polinucleótidos de cada biblioteca pueden modificarse para incluir una secuencia de etiqueta de índice específica de la biblioteca. Durante la secuenciación, la etiqueta de índice se secuencia junto con las secuencias de polinucleótidos diana de las bibliotecas. Por consiguiente, la secuencia de la etiqueta de índice se puede asociar con la secuencia de polinucleótidos diana para que se pueda identificar la biblioteca a partir de la cual se originó la secuencia diana.
Sin embargo, un fenómeno denominado como salto de índice puede ocurrir en un pequeño porcentaje de resultados de secuencia (típicamente 0,5 % a 2 %). El salto de índice se refiere a una secuencia de etiqueta de índice de una biblioteca que se asocia con el polinucleótido diana de otra biblioteca (véanse las FIGS. 6A y 6B). Si bien los mecanismos por los que puede ocurrir el salto de índice no se conocen por completo, la tasa de salto de índice se puede reducir de forma efectiva bloqueando el extremo 3' de los adaptadores no incorporados después de que los adaptadores se fijan a los polinucleótidos diana de una biblioteca para, entre otras cosas, fijar la secuencia de la etiqueta de índice al polinucleótido.
Preparación de muestras de biblioteca
Las bibliotecas que comprenden polinucleótidos se pueden preparar de cualquier manera adecuada para fijar adaptadores de oligonucleótidos a polinucleótidos diana. Como se usa en el presente documento, una "biblioteca" es una población de polinucleótidos de una fuente o muestra dada. Una biblioteca comprende una pluralidad de polinucleótidos diana. Como se usa en el presente documento, un "polinucleótido diana" es un polinucleótido que se desea secuenciar. El polinucleótido diana puede ser esencialmente cualquier polinucleótido de secuencia conocida o desconocida. Puede ser, por ejemplo, un fragmento de ADN genómico o ADNc. La secuenciación puede dar como resultado la determinación de la secuencia de la totalidad o de una parte de los polinucleótidos diana. Los polinucleótidos diana pueden derivarse de una muestra de polinucleótido primario que se ha fragmentado al azar. Los polinucleótidos diana pueden procesarse en moldes adecuados para la amplificación colocando secuencias de cebadores universales en los extremos de cada fragmento diana. Los polinucleótidos diana también se pueden obtener a partir de una muestra de ARN primario mediante transcripción inversa a ADNc.
Los términos "polinucleótido" y "oligonucleótido" se usan indistintamente en el presente documento para referirse a una forma polimérica de nucleótidos de cualquier longitud y pueden comprender ribonucleótidos, desoxirribonucleótidos, análogos de los mismos o mezclas de los mismos. Este término se refiere únicamente a la estructura primaria de la molécula. Por tanto, el término incluye ácido desoxirribonucleico ("ADN") tricatenario, bicatenario y monocatenario, así como ácido ribonucleico ("ARN") tricatenario, bicatenario y monocatenario. Los términos polinucleótido y oligonucleótido usados en el presente documento también abarcan ADNc, es decir, ADN complementario o copia producido a partir de un molde de ARN, por ejemplo, mediante la acción de la transcriptasa inversa.
Las moléculas de polinucleótidos primarios pueden originarse en forma de ADN bicatenario (ADNbc) (por ejemplo, fragmentos de ADN genómico, productos de PCR y amplificación y similares) o pueden haberse originado en forma monocatenaria, como ADN o ARN, y convertirse a forma de ADNbc. A modo de ejemplo, las moléculas de ARNm pueden copiarse a ADNc bicatenario usando técnicas estándares bien conocidas en la materia. La secuencia precisa de polinucleótidos primarios generalmente no es importante para la divulgación presentada en el presente documento y puede ser conocida o desconocida.
En algunas realizaciones, los polinucleótidos diana primarios son moléculas de ARN. En un aspecto de tales realizaciones, el ARN aislado de muestras específicas se convierte primero en ADN bicatenario usando técnicas conocidas en la materia. A continuación, el ADN bicatenario se puede marcar con un índice con una etiqueta específica de biblioteca. Se pueden generar, en paralelo, diferentes preparaciones de tal ADN bicatenario que comprenden etiquetas de índice específicas de biblioteca a partir de ARN aislado de diferentes fuentes o muestras. Posteriormente, pueden mezclarse y secuenciarse en masa diferentes preparaciones de ADN bicatenario que comprenden diferentes etiquetas de índice específicas de biblioteca, y determinarse la identidad de cada fragmento secuenciado con respecto a la biblioteca de la que se aisló/derivó en virtud de la presencia de una secuencia de etiqueta de índice específica de la biblioteca.
En algunas realizaciones, los polinucleótidos diana primarios son moléculas de ADN. Por ejemplo, los polinucleótidos primarios pueden representar el complemento genético completo de un organismo y son moléculas de ADN genómico, tales como moléculas de ADN humano, que incluyen tanto secuencias de intrones como de exones (secuencia codificante), así como secuencias reguladoras no codificantes tales como secuencias promotoras y potenciadoras. Aunque podría contemplarse que también podrían usarse subconjuntos particulares de secuencias de polinucleótidos o ADN genómico, tales como, por ejemplo, cromosomas particulares o una porción de los mismos. En muchas realizaciones, se desconoce la secuencia de los polinucleótidos primarios. Los polinucleótidos diana de ADN pueden tratarse química o enzimáticamente antes o después de un proceso de fragmentación, tal como un proceso de fragmentación aleatoria, y antes, durante o después de la ligadura de los oligonucleótidos adaptadores.
Preferiblemente, los polinucleótidos diana primarios se fragmentan en longitudes apropiadas adecuadas para la secuenciación. Los polinucleótidos diana pueden fragmentarse de cualquier manera adecuada. Preferiblemente, los polinucleótidos diana se fragmentan aleatoriamente. La fragmentación aleatoria se refiere a la fragmentación de un polinucleótido de forma no ordenada, por ejemplo, por medios enzimáticos, químicos o mecánicos. Tales métodos de fragmentación son conocidos en la materia y utilizan métodos estándares (Sambrook y Russell, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, tercera edición). En aras de la claridad, generar fragmentos más pequeños de una pieza más grande de polinucleótido a través de la amplificación por PCR específica de tales fragmentos más pequeños no es equivalente a fragmentar la pieza más grande de polinucleótido porque la pieza más grande de polinucleótido permanece intacta (es decir, no está fragmentada por la amplificación por PCR). Además, la fragmentación aleatoria está diseñada para producir fragmentos independientemente de la identidad de la secuencia o la posición de los nucleótidos que comprenden y/o rodean la ruptura.
En algunas realizaciones, la fragmentación aleatoria se realiza por medios mecánicos, tales como nebulización o sonicación, para producir fragmentos de aproximadamente 50 pares de bases de longitud a aproximadamente 1500 pares de bases de longitud, tales como 50-700 pares de bases de longitud o 50-500 pares de bases de longitud.
La fragmentación de moléculas de polinucleótidos por medios mecánicos (nebulización, sonicación e Hydroshear, por ejemplo) puede dar como resultado fragmentos con una mezcla heterogénea de extremos romos y protuberantes en 3' y 5'. Los extremos de los fragmentos pueden repararse usando métodos o kits (tal como el kit de reparación de extremos del terminador de ADN Lucigen) conocidos en la materia por generar extremos que son óptimos para la inserción, por ejemplo, en sitios romos de vectores de clonación. En algunas realizaciones, los extremos de los fragmentos de la población de polinucleótidos tienen extremos romos. Los extremos del fragmento pueden ser romos y fosforilados. El resto fosfato puede introducirse mediante tratamiento enzimático, por ejemplo, usando polinucleótido cinasa.
En algunas realizaciones, las secuencias de polinucleótidos diana se preparan con nucleótidos protuberantes únicos mediante, por ejemplo, la actividad de ciertos tipos de ADN polimerasa tales como la polimerasa Taq o la polimerasa Klenow exo menos, que tiene una actividad transferasa terminal no dependiente de molde que añade un solo desoxinucleótido, por ejemplo, desoxiadenosina (A) a los extremos 3' de, por ejemplo, productos de PCR. Tales enzimas se pueden utilizar para añadir un solo nucleótido 'A' al extremo romo 3' de cada hebra de los dúplex de polinucleótidos diana. Por tanto, se podría añadir una 'A' al extremo 3' de cada hebra dúplex reparada en el extremo del dúplex de polinucleótido diana por reacción con polimerasa Taq o Klenow exo menos, mientras que el constructo del polinucleótido adaptador podría ser un constructo T con una protuberancia “T” compatible presente en el extremo 3' de cada región dúplex del constructo adaptador. Esta modificación de los extremos también evita la autoligadura de los polinucleótidos diana, de tal modo que existe un sesgo hacia la formación de los polinucleótidos adaptador-diana ligados combinados.
En algunas realizaciones, la fragmentación se logra a través de la etiquetación como se describe, por ejemplo, en la publicación de solicitud de patente internacional WO 2016/130704. En tales métodos, se emplean transposasas para fragmentar un polinucleótido bicatenario. Los fragmentos bicatenarios resultantes pueden rellenarse como se describe en el documento WO 2016/130704 y prepararse para ligadura con un adaptador.
El polinucleótido diana puede contener un resto 5'-fosfato, ya sea residual del proceso de fragmentación o añadido usando una etapa de tratamiento enzimático, y ha sido reparado en los extremos y opcionalmente extendido por una base o bases protuberantes, para dar un 3'-OH adecuado para la ligadura. En este contexto, unión significa el enlazamiento covalente de hebras de polinucleótidos que no estaban previamente enlazadas covalentemente. Tal unión tiene lugar mediante la formación de un enlazamiento fosfodiéster entre las dos hebras de polinucleótidos, pero pueden usarse otros medios de enlazamiento covalente (p. ej., enlazamientos de cadena principal no fosfodiéster). La ligadura de adaptadores a polinucleótidos diana se describe con más detalle, por ejemplo, en la patente de EE. UU. n.° 8.053.192.
Los polinucleótidos fragmentados que han sido modificados antes de la ligadura, por ejemplo, para prepararlos mejor para la ligadura, pueden denominarse en el presente documento "fragmentos" de polinucleótidos.
Como se usa en el presente documento, los términos "ligar", "ligadura" y sus derivados se refieren generalmente al proceso para enlazar covalentemente dos o más moléculas, por ejemplo, enlazar covalentemente dos o más polinucleótidos entre sí. En algunas realizaciones, la ligadura incluye unir mellas entre nucleótidos de polinucleótidos adyacentes. En algunas realizaciones, la ligadura incluye formar un enlace covalente entre un extremo de un primer polinucleótido y un extremo de un segundo polinucleótido. En algunas realizaciones, la ligadura puede incluir la formación de un enlace covalente entre un grupo 5’ fosfato de un ácido nucleico y un grupo 3’ hidroxilo de un segundo ácido nucleico formando así un polinucleótido ligado. Generalmente, para los fines de esta divulgación, una secuencia diana puede ligarse a un adaptador para generar una secuencia diana ligada a adaptador.
Como se usa en el presente documento, "ligasa" y sus derivados se refiere generalmente a cualquier agente capaz de catalizar la ligadura de dos moléculas de sustrato. En algunas realizaciones, la ligasa incluye una enzima capaz de catalizar la unión de mellas entre nucleótidos adyacentes de un ácido nucleico. En algunas realizaciones, la ligasa incluye una enzima capaz de catalizar la formación de un enlace covalente entre un 5’ fosfato de una molécula de ácido nucleico y un 3’ hidroxilo de otra molécula de ácido nucleico formando así una molécula de ácido nucleico ligada. Las ligasas adecuadas pueden incluir, pero sin limitación, ADN ligasa de T4, ARN ligasa de T4 y ADN ligasa de E. coli.
Como se usa en el presente documento, "condiciones de ligadura" y sus derivados, generalmente se refiere a condiciones adecuadas para ligar dos moléculas entre sí. En algunas realizaciones, las condiciones de ligadura son adecuadas para sellar muescas o huecos entre ácidos nucleicos. Como se usa en el presente documento, el término mella o hueco es consistente con el uso del término en la materia. Típicamente, una mella o hueco puede ligarse en presencia de una enzima, tal como ligasa a una temperatura y pH apropiados. En algunas realizaciones, la ADN ligasa de T4 puede unir una mella entre los ácidos nucleicos a una temperatura de aproximadamente 70-72 °C.
Cualquier adaptador adecuado puede ligarse a un polinucleótido diana. Preferiblemente, el adaptador comprende una primera hebra de oligonucleótidos que tiene un extremo 5' y un extremo 3'; y una segunda hebra de oligonucleótidos que tiene un extremo 5' y un extremo 3'. Una región del extremo 5' de la primera hebra comprende nucleótidos complementarios de los nucleótidos de una región del extremo 3' de la segunda hebra, de tal manera que las regiones complementarias son bicatenarias. Una región del extremo 3' de la primera hebra y una región del extremo 5' de la segunda hebra son suficientemente no complementarias para ser monocatenarias.
Preferiblemente, la región bicatenaria del adaptador es lo más corta posible sin pérdida de función. En este contexto, "función" se refiere a la capacidad de la región bicatenaria para formar un dúplex estable en condiciones de reacción estándares. En algunas realizaciones, las condiciones de reacción estándares se refieren a las condiciones de reacción para una reacción de ligadura de polinucleótidos catalizada por enzimas, que será bien conocida por el lector experto (por ejemplo, incubación a una temperatura en el intervalo de 4 °C a 25 °C en un tampón de ligadura apropiado para la enzima), de tal manera que las dos hebras que forman el adaptador permanecen parcialmente reasociadas durante la ligadura del adaptador a una molécula diana. Los métodos de ligadura son conocidos en la materia y pueden utilizar métodos estándares (Sambrook y Russell, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, tercera edición). Tales métodos utilizan enzimas ligasa tales como ADN ligasa para efectuar o catalizar la unión de los extremos de las dos hebras de polinucleótidos, en este caso, el oligonucleótido dúplex adaptador y los dúplex de polinucleótidos diana, de tal modo que se formen enlazamientos covalentes. El oligonucleótido dúplex adaptador puede contener un resto 5'-fosfato para facilitar la ligadura a un polinucleótido diana 3'-OH.
La región bicatenaria del adaptador puede tener cualquier número adecuado de pares de bases. Preferiblemente, la región bicatenaria es una región bicatenaria corta, que típicamente comprende 5 o más pares de bases consecutivas, formada mediante reasociación de dos hebras de polinucleótidos parcialmente complementarias. Esta "región bicatenaria" del adaptador se refiere a una región en la que las dos hebras están reasociadas y no implica ninguna conformación estructural particular. En algunas realizaciones, la región bicatenaria comprende 20 o menos pares de bases consecutivas, como 10 o menos o 5 o menos pares de bases consecutivas.
La estabilidad de la región bicatenaria puede incrementarse, y por ello su longitud puede reducirse potencialmente, mediante la inclusión de nucleótidos no naturales que muestren un apareamiento de bases más fuerte que los pares de bases de Watson-Crick estándares. Preferiblemente, las dos hebras del adaptador son 100 % complementarias en la región bicatenaria.
Cuando el adaptador se fija al polinucleótido diana, la región monocatenaria no complementaria puede formar los extremos 5' y 3' del polinucleótido que se va a secuenciar. El término "región monocatenaria no complementaria" se refiere a una región del adaptador donde las secuencias de las dos hebras de polinucleótidos que forman el adaptador muestran un grado de falta de complementariedad tal que las dos hebras no son capaces de reasociarse completamente entre sí bajo condiciones de reasociación estándares para una reacción de PCR.
La región monocatenaria no complementaria la proporcionan diferentes partes de las mismas dos hebras de polinucleótidos que forman la región bicatenaria. El límite inferior de la longitud de la parte monocatenaria se determinará típicamente en función de, por ejemplo, proporcionar una secuencia adecuada para la unión de un cebador para la extensión del cebador, la PCR y/o la secuenciación. Teóricamente, no existe un límite superior en la longitud de la región no coincidente, excepto que, en general, es ventajoso minimizar la longitud total del adaptador, por ejemplo, para facilitar la separación de los adaptadores no unidos de los constructos adaptador-diana después de la etapa o etapas de unión. Por lo tanto, generalmente se prefiere que la región monocatenaria no complementaria del adaptador tenga una longitud de 50 o menos nucleótidos consecutivos, tal como una longitud de 40 o menos, 30 o menos o 25 o menos nucleótidos consecutivos.
Los extremos monocatenarios del adaptador se modifican para evitar la digestión por una exonucleasa. Por ejemplo, el extremo 3' puede modificarse para evitar la digestión por una exonucleasa 3' y el extremo 5' puede modificarse para evitar la digestión por una exonucleasa 5'. Para los fines de la presente divulgación, una modificación que "evita" la digestión por una exonucleasa inhibe la actividad de la exonucleasa con respecto a su acción en un extremo no modificado. Preferiblemente, una modificación que evita la digestión con exonucleasa elimina la capacidad de la exonucleasa para digerir la hebra de polinucleótido.
Los extremos libres de las regiones monocatenarias del adaptador pueden modificarse de cualquier manera adecuada para evitar la actividad exonucleasa. En algunas realizaciones, los extremos libres de las regiones monocatenarias del adaptador comprenden un enlace fosforotioato. Preferiblemente, los enlaces entre los tres nucleótidos terminales de los extremos libres de las regiones monocatenarias del adaptador comprenden enlaces fosforotioato. Para los fines de la presente divulgación, un extremo de un polinucleótido cuyos enlaces entre los tres nucleótidos terminales comprenden enlaces fosforotioato puede denominarse extremo que comprende tres enlaces fosforotioato. Los enlaces fosforotioato se pueden introducir en un extremo 5' o un extremo 3' de un polinucleótido de cualquier manera adecuada, como es bien conocido en la materia. Los oligonucleótidos que comprenden enlaces fosforotioato terminales pueden adquirirse de una serie de proveedores comerciales que incluyen, por ejemplo, Integrated DNA Technologies y Sigma-Aldrich.
En algunas realizaciones, una proteína de unión a ADN monocatenario (SSB) se une a los extremos libres de las regiones monocatenarias del adaptador para proteger los extremos libres del adaptador de la degradación por exonucleasa. Puede usarse cualquier SSB adecuada para unirse a las regiones monocatenarias del adaptador para proteger las regiones monocatenarias de la actividad exonucleasa. Los ejemplos de SSB adecuadas incluyen SSB del virus del herpes simple (HSV-1) (Mapelli M, Panjikar S, Tucker PA (2005). "The crystal structure of the herpes simplex virus 1 ssDNA-binding protein suggests the structural basis for flexible, cooperative single-stranded DNA binding''. J Biol Chem. 280 (4): 2990-7); SSB de E. coli (Meyer RR, Laine PS (diciembre de 1990). "The single-stranded DNA-binding protein of Escherichia coli". Microbiol. Ap. 54 (4): 342-80); SSB mitocondriales eucariotas, tales como SSB mitocondrial humana (mtSSB) (Tiranti, V; Rocchi, M; Di Donato, S; Zeviani, M (30 de abril de 1993). "Cloning of human and rat cDNA encoding the mithocondrial single-stranded DNA-binding protein (SSB)". Gene. 126 (2): 219-25) y SSB de Saccharomyces cerevisiae (Van Dyck, E.; Foury, F; Stillman, B; Brill, SJ (septiembre de 1992). "A single-stranded DNA binding protein required for mitocondrial DNA replication in S. cerevisiae is homologous to E. coli SSB". The EMBO Journal. 11 (9): 3421-30); y la proteína A de replicación eucariótica (Wold, MS (1997). "Replication protein A: heterotrimeric single-stranded DNA-binding protein required for eukaryotic DNA metabolism". Annual Review of Biochemistry. 66 (1): 61-92). Las SSB están disponibles comercialmente de una serie de proveedores, incluidos ThermoFisher Scientific (número de catálogo 70032Z500UG) y Sigma-Aldrich (número MDL MFCD00213047).
Las SSB se pueden unir a los extremos libres monocatenarios del adaptador antes, durante o después de la ligadura del adaptador al polinucleótido diana. Si las SSB unidas interfieren con la reacción de ligadura, las SSB se unen preferiblemente a los extremos libres monocatenarios del adaptador después de ligar los adaptadores al polinucleótido diana. Después de la ligadura del adaptador al polinucleótido diana, pueden permanecer las siguientes especies de polinucleótidos: adaptador, adaptador-diana y adaptador-diana-adaptador. Los extremos libres monocatenarios de los adaptadores estarán protegidos de la actividad exonucleasa por las SSB unidas, mientras que la región bicatenaria del adaptador y las moléculas adaptador-diana serán susceptibles a la actividad exonucleasa. Después de la degradación de la exonucleasa, el adaptador-diana-adaptador con SSB unidas permanecerá presente. Antes de hibridar los polinucleótidos de adaptador-diana-adaptador con una superficie sólida que tiene oligonucleótidos complementarios de al menos una secuencia de un adaptador de extremo libre, las SSB pueden retirarse para facilitar la hibridación. Las SSB se pueden retirar de cualquier manera adecuada. Por ejemplo, las SSB se pueden retirar en condiciones de desnaturalización.
En algunas realizaciones, los extremos libres de las regiones monocatenarias del adaptador incluyen un grupo de biotina al que pueden unirse avidina o estreptavidina para evitar la degradación por una exonucleasa. La biotina se puede fijar a los extremos 5' y 3' libres del adaptador de cualquier manera adecuada. Por ejemplo, la biotina se puede incorporar en un extremo 5' o 3' de un adaptador mediante la incorporación enzimática de un nucleótido marcado con biotina, mediante la modificación química del extremo 5' o 3' para fijar la biotina, mediante el uso de cebadores de oligonucleótidos marcados y similares. A modo de ejemplo, la biotina se puede incorporar en un extremo 3' usando, por ejemplo, desoxinucleotidil transferasa terminal (TdT) para catalizar la incorporación de nucleótidos no dirigida por molde de un nucleótido biotinilado en el extremo 3'-OH de ADN monocatenario. Un ejemplo de un kit para fijar biotina a un extremo 3' de un extremo libre de un adaptador es el kit de etiquetado de extremo 3' de biotina ThermoScientific Pierce (número de catálogo 89818), que incorporaba un ribonucleótido biotinilado 1-3 (biotina-11-UTP) en el extremo 3' del ADN monocatenario usando TdT.
El nucleótido marcado con biotina puede comprender un enlazador escindible, tal como un enlace disulfuro, que puede escindirse, por ejemplo, con ditiotreitol para liberar la biotina (y cualquier avidina o estreptavidina). Los marcadores de biotina con enlazadores escindibles, incluidos los nucleótidos marcados con biotina que tienen enlazadores escindibles, están disponibles comercialmente de varios proveedores, tales como Integrated DNA Technologies, Inc. (IDT) de Skokie, IL.
La avidina o la estreptavidina se pueden unir al adaptador antes, durante o después de la ligadura del adaptador al polinucleótido diana. Si la avidina o estreptavidina unida interfiere con la reacción de ligadura, la avidina o estreptavidina se unen preferiblemente a los extremos libres monocatenarios del adaptador después de ligar los adaptadores al polinucleótido diana. Después de la ligadura del adaptador al polinucleótido diana, pueden permanecer las siguientes especies de polinucleótidos: adaptador, adaptador-diana y adaptador-diana-adaptador. Los extremos libres monocatenarios de los adaptadores estarán protegidos de la actividad exonucleasa por la avidina o estreptavidina unida, mientras que la región bicatenaria del adaptador y las moléculas adaptador-diana serán susceptibles a la actividad exonucleasa. Después de la degradación de la exonucleasa, permanecerá presente adaptador-diana-adaptador con avidina o estreptavidina unidas. Antes de hibridar los polinucleótidos adaptador-dianaadaptador con una superficie sólida que tiene oligonucleótidos complementarios de al menos una secuencia de un adaptador de extremo libre, la avidina o la estreptavidina pueden retirarse para facilitar la hibridación. La avidina o la estreptavidina se pueden retirar de cualquier forma adecuada. Preferiblemente, el marcador de biotina comprende un enlazador escindible que permite retirar la biotina y la avidina o estreptavidina unida.
En algunas realizaciones, los extremos libres de las regiones monocatenarias del adaptador están unidos por anticuerpos dirigidos a los adaptadores en forma de Y para evitar la degradación de los extremos monocatenarios 5' y 3' del adaptador por una exonucleasa.
Preferiblemente, los extremos del adaptador que forman la región bicatenaria del adaptador son susceptibles a la actividad exonucleasa. Preferiblemente, los extremos del adaptador que forman la región bicatenaria del adaptador son al menos tan susceptibles a la actividad exonucleasa como los extremos que contienen nucleótidos no modificados. En algunas realizaciones, los extremos del adaptador que forman la región bicatenaria del adaptador contienen nucleótidos no modificados.
Las hebras individuales de oligonucleótidos pueden mezclarse y reasociarse para producir un adaptador que tenga una parte bicatenaria y una parte monocatenaria para ligar la parte bicatenaria a un fragmento diana bicatenario.
Al menos una de las hebras primera o segunda que forman el adaptador incluye una secuencia de etiqueta de índice específica de biblioteca. La secuencia de etiqueta de índice se puede fijar a los polinucleótidos diana de cada biblioteca ligando el adaptador a la diana antes de inmovilizar la muestra para la secuenciación. La etiqueta de índice misma no está formada por parte del polinucleótido diana, sino que se convierte en parte del molde para la amplificación. La etiqueta de índice puede ser una secuencia sintética de nucleótidos que se añade a la diana como parte de la etapa de preparación de molde. Por consiguiente, una etiqueta de índice específica de biblioteca es una etiqueta de secuencia de ácido nucleico que se fija a cada una de las moléculas diana de una biblioteca particular, cuya presencia es indicativa o se usa para identificar la biblioteca de la que se aislaron las moléculas diana.
Preferiblemente, la secuencia de la etiqueta de índice tiene una longitud de 20 nucleótidos o menos. Por ejemplo, la secuencia de la etiqueta índice puede tener una longitud de 1 a 10 nucleótidos o de 4 a 6 nucleótidos. Una etiqueta de índice de cuatro nucleótidos brinda la posibilidad de multiplexar 256 muestras en la misma matriz, una etiqueta de índice de seis bases permite procesar 4096 muestras en la misma matriz. Los adaptadores pueden contener más de una etiqueta de índice para que se puedan aumentar las posibilidades de multiplexación.
La secuencia de etiqueta de índice específica de biblioteca puede estar localizada en una región monocatenaria o bicatenaria, o abarcar regiones monocatenarias y bicatenarias del adaptador. Preferiblemente, la secuencia de la etiqueta de índice está en una región monocatenaria del adaptador.
Los adaptadores pueden incluir cualquier otra secuencia adecuada además de la secuencia de etiqueta de índice. Por ejemplo, los adaptadores pueden comprender secuencias de cebadores de extensión universal, que típicamente se localizan en el extremo 5' o 3' del adaptador y el polinucleótido resultante para la secuenciación. Las secuencias del cebador de extensión universal pueden hibridar con cebadores complementarios unidos a la superficie de un sustrato sólido. Los cebadores complementarios comprenden un extremo 3' libre desde el cual una polimerasa u otra enzima adecuada puede añadir nucleótidos para extender la secuencia usando el polinucleótido de biblioteca hibridado como molde, lo que da como resultado que una hebra inversa del polinucleótido de biblioteca se acople a la superficie sólida. Tal extensión puede ser parte de una serie de secuenciación o amplificación de agrupamientos.
En algunos casos, los adaptadores comprenden una o más secuencias de cebadores de secuenciación universales. Las secuencias de cebadores de secuenciación universales pueden unirse a cebadores de secuenciación para permitir la secuenciación de una secuencia de etiqueta de índice, una secuencia diana o una secuencia de etiqueta de índice y una secuencia diana.
La secuencia de nucleótidos precisa de los adaptadores generalmente no es importante para la invención y puede ser seleccionada por el usuario de tal manera que los elementos de secuencia deseados se incluyan finalmente en las secuencias comunes de la biblioteca de moldes derivados de los adaptadores para, por ejemplo, proporcionar sitios de unión para conjuntos particulares de cebadores de extensión universal y/o cebadores de secuenciación.
Preferiblemente, el adaptador se fija a ambos extremos de un polipéptido diana para producir un polinucleótido que tiene una secuencia de nucleótidos primer adaptador-diana-segundo adaptador. Los adaptadores primero y segundo pueden ser iguales o diferentes. Preferiblemente, los adaptadores primero y segundo son iguales. En tales realizaciones, el polinucleótido resultante tendría una secuencia de nucleótidos primer adaptador-diana-primer adaptador. Si los adaptadores primero y segundo son diferentes, al menos uno de los adaptadores primero y segundo comprende una secuencia de etiqueta de índice específica de biblioteca.
Se entenderá que una "secuencia primer adaptador-diana-segundo adaptador", "secuencia primer adaptador-dianaprimer adaptador" o una secuencia "adaptador-diana-adaptador" se refiere a la orientación de los adaptadores entre sí y con la diana y no significa necesariamente que la secuencia no pueda incluir secuencias adicionales, tales como secuencias enlazadoras, por ejemplo.
Se pueden preparar otras bibliotecas de manera similar, cada una de las cuales incluye al menos una secuencia de etiqueta de índice específica de biblioteca o combinaciones de secuencias de etiqueta de índice diferentes de una secuencia de etiqueta de índice o combinación de secuencias de etiqueta de índice de las otras bibliotecas.
Después de ligar los adaptadores a los polinucleótidos diana, los polinucleótidos resultantes pueden someterse a un proceso de limpieza para potenciar la pureza de los polinucleótidos adaptador-diana-adaptador retirando al menos una parte de los adaptadores no incorporados. Se puede usar cualquier proceso de limpieza adecuado, tal como electroforesis, cromatografía de exclusión por tamaño o similares. En algunas realizaciones, se pueden emplear perlas paramagnéticas de inmovilización inversa en fase sólida (SPRI) para separar los polinucleótidos adaptador-dianaadaptador de los adaptadores no fijados. Si bien tales procesos pueden potenciar la pureza de los polinucleótidos adaptador-diana-adaptador resultantes, es probable que permanezcan algunos oligonucleótidos adaptadores no fijados.
El proceso de limpieza se puede realizar solo en cada biblioteca o en bibliotecas agrupadas.
Tratamiento con exonucleasa
Las soluciones o composiciones que comprenden los polinucleótidos adaptador-diana-adaptador resultantes, ya sea que se hayan sometido primero o no a limpieza, junto con cualquier oligonucleótido adaptador no incorporado o polinucleótido diana se someten a tratamiento con una exonucleasa para digerir polinucleótidos que tienen un extremo 5' desprotegido o un extremo 3 desprotegido, incluidos los adaptadores no incorporados.
Puede usarse cualquier exonucleasa adecuada. Preferiblemente, la exonucleasa tiene actividad exonucleasa 5' y 3'. Una exonucleasa que tiene "actividad exonucleasa 5'" es una exonucleasa que digiere el ADN en la dirección de 5' a 3'. Una exonucleasa que tiene "actividad exonucleasa 3'" es una exonucleasa que digiere el ADN en la dirección de 3' a 5'. La exonucleasa puede comprender actividad para ADN bicatenario sin mellas. Un ejemplo de una exonucleasa adecuada que tiene actividad exonucleasa 5' y 3' y tiene actividad para ADN bicatenario sin mellas es la exonucleasa V, que es un complejo RecBCD de E. co liy está disponible, por ejemplo, en New England Biolabs (n.° de cat M0345S/L).
En algunas realizaciones, se pueden emplear dos exonucleasas, una con actividad exonucleasa 5' y la otra con actividad exonucleasa 3'. Los ejemplos de exonucleasas que tienen actividad exonucleasa 5' incluyen exonucleasa lambda (New England Biolabs) y exonucleasa VI11 truncada (New England Biolabs). Un ejemplo de una exonucleasa que tiene actividad exonucleasa 3' es la exonucleasa T (New England Biolabs).
El tratamiento con exonucleasa se puede realizar en cada biblioteca por separado o en bibliotecas agrupadas. Después del tratamiento con exonucleasa, se puede realizar una etapa de limpieza, como la descrita anteriormente, antes de inmovilizar los polinucleótidos sobre una superficie sólida para la secuenciación.
Si las bibliotecas no se han agrupado, se pueden agrupar antes de inmovilizarlas sobre una superficie de secuenciación.
Preparación de muestras inmovilizadas para secuenciación
Las preparaciones de bibliotecas tratadas con exonucleasas agrupadas se pueden inmovilizar luego sobre una superficie sólida para prepararlas para la secuenciación. La secuenciación se puede realizar como una matriz de moléculas individuales o se puede amplificar antes de la secuenciación. La amplificación puede llevarse a cabo usando uno o más cebadores inmovilizados. El cebador o cebadores inmovilizados pueden ser una capa sobre una superficie plana, agrupamientos sobre una superficie plana, en pocillos de una estructura de múltiples pocillos, sobre un grupo de perlas, o similares. El grupo de perlas se puede aislar en una emulsión con una sola perla en cada "compartimento" de la emulsión. A una concentración de solo un molde por "compartimento", solo se amplifica un solo molde en cada perla.
El término "amplificación en fase sólida", tal como se usa en el presente documento, se refiere a cualquier reacción de amplificación de polinucleótidos llevada a cabo sobre o en asociación con un soporte sólido de tal modo que todos o una parte de los productos amplificados se inmovilicen sobre el soporte sólido a medida que se forman. En particular, el término abarca la reacción en cadena de la polimerasa en fase sólida (PCR en fase sólida) y la amplificación isotérmica en fase sólida, que son reacciones análogas a la amplificación en fase de solución estándar, excepto que uno o ambos cebadores de amplificación directo e inverso están inmovilizados sobre el soporte sólido. La PCR en fase sólida cubre sistemas tales como emulsiones, en los que un cebador está anclado a una perla y el otro en solución libre, y la formación de colonias en matrices de gel en fase sólida en las que un cebador está anclado a la superficie y el otro en solución libre.
Aunque la divulgación abarca los métodos de amplificación en "fase sólida" en los que solo se inmoviliza un cebador de amplificación (el otro cebador suele estar presente en solución libre), se prefiere que el soporte sólido se proporcione con ambos cebadores directo e inverso inmovilizados. En la práctica, habrá una "pluralidad" de cebadores directos idénticos y/o una "pluralidad" de cebadores inversos idénticos inmovilizados sobre el soporte sólido, ya que el proceso de amplificación requiere un exceso de cebadores para sostener la amplificación. Las referencias en el presente documento a cebadores directos e inversos deben interpretarse por consiguiente como que abarcan una "pluralidad" de tales cebadores a menos que el contexto indique lo contrario.
Como apreciará el lector experto, cualquier reacción de amplificación dada requiere al menos un tipo de cebador directo y al menos un tipo de cebador inverso específico del molde a amplificar. Sin embargo, los cebadores directo e inverso pueden comprender partes específicas de molde de secuencia idéntica, y pueden tener una estructura y una secuencia de nucleótidos completamente idénticas (incluyendo cualquier modificación no nucleotídica). En otras palabras, es posible llevar a cabo la amplificación en fase sólida usando solo un tipo de cebador, y tales métodos de cebador único se engloban dentro del alcance de la invención. Otros pueden usar cebadores directos e inversos que contienen secuencias específicas de molde idénticas pero que difieren en algunas otras características estructurales.
Por ejemplo, un tipo de cebador puede contener una modificación no nucleotídica que no está presente en el otro.
A lo largo de esta divulgación, se usan los términos "P5" y "P7" cuando se refieren a adaptadores y/o cebadores de amplificación. Se entenderá que cualquier cebador de amplificación adecuado puede usarse en los métodos presentados en el presente documento, y que el uso de P5 y P7 son solo ejemplares. Los usos de cebadores de amplificación tales como P5 y P7 en celdas de flujo son conocidos en la materia, como se ejemplifica en las divulgaciones de los documentos WO 2007/010251, WO 2006/064199, WO 2005/065814, WO 2015/106941, WO 1998/044151 y WO 2000/018957. Por ejemplo, cualquier cebador de amplificación directo adecuado, ya sea inmovilizado o en solución, puede ser útil en los métodos presentados en el presente documento para la hibridación con una secuencia complementaria y la amplificación de una secuencia. De manera similar, cualquier cebador de amplificación inversa adecuado, ya sea inmovilizado o en solución, puede ser útil en los métodos presentados en el presente documento para la hibridación con una secuencia complementaria y la amplificación de una secuencia. Un experto en la materia comprenderá cómo diseñar y usar secuencias de cebadores que sean adecuadas para la captura y amplificación de ácidos nucleicos como se presenta en el presente documento.
Los cebadores para la amplificación en fase sólida se inmovilizan preferiblemente mediante unión covalente de un solo punto al soporte sólido en o cerca del extremo 5' del cebador, dejando la parte específica de molde del cebador libre para reasociarse con su molde afín y el grupo hidroxilo 3' libre para la extensión del cebador. Cualquier medio de unión covalente adecuado conocido en la materia puede usarse para este propósito. La química de unión elegida dependerá de la naturaleza del soporte sólido y de cualquier derivatización o funcionalización que se le aplique. El propio cebador puede incluir un resto, que puede ser una modificación química no nucleotídica, para facilitar la unión. En algunos casos, el cebador incluye un nucleófilo que contiene azufre, tal como fosforotioato o tiofosfato, en el extremo 5'. La superficie del soporte sólido puede incluir o modificarse para incluir un resto al que se puede fijar el nucleófilo que contiene azufre. Por ejemplo, un nucleófilo que contiene azufre puede unirse a un grupo bromoacetamida. En otros, un hidrogel de poliacrilamida con soporte sólido comprende un grupo bromoacetamida para unirse a un nucleófilo que contiene azufre. Un medio más particular de fijar cebadores y moldes a un soporte sólido es mediante la unión de fosforotioato 5' a un hidrogel compuesto de acrilamida polimerizada y N-(5-bromoacetamidilpentil)acrilamida (BRAPA), como se describe completamente en el documento WO/2005065814.
Los soportes sólidos compuestos por un sustrato o matriz inerte (por ejemplo, portaobjetos de vidrio, perlas de polímero, etc.) pueden "funcionalizarse", por ejemplo, mediante la aplicación de una capa o recubrimiento de un material intermedio que comprende grupos reactivos que permiten la unión covalente a biomoléculas, tales como polinucleótidos. Los ejemplos de tales soportes incluyen hidrogeles de poliacrilamida soportados sobre un sustrato inerte tal como el vidrio. Las biomoléculas (p. ej., polinucleótidos) pueden estar directamente fijadas de forma covalente al material intermedio (p. ej., el hidrogel), pero el propio material intermedio puede estar fijado de forma no covalente al sustrato o matriz (p. ej., el sustrato de vidrio). Por consiguiente, el término "unión covalente a un soporte sólido" debe interpretarse como que abarca este tipo de disposición.
Las muestras de la biblioteca agrupadas se pueden amplificar sobre una superficie sólida que contiene un cebador de amplificación directo e inverso. En algunos casos, las bibliotecas agrupadas de polinucleótidos se usan para preparar matrices agrupadas de colonias de ácido polinucleico, análogas a las descritas en la pub. de pat. de EE. UU. n.° 2005/0100900, la pat. de EE. UU. n.° 7.115.400, los documentos WO 00/18957 y WO 98/44151, por amplificación en fase sólida y más particularmente amplificación isotérmica en fase sólida. Los términos "agrupamiento" y "colonia" se usan indistintamente en el presente documento para referirse a un sitio discreto sobre un soporte sólido compuesto por una pluralidad de hebras de ácido nucleico inmovilizadas idénticas y una pluralidad de hebras de ácido nucleico complementarias inmovilizadas idénticas. El término "matriz agrupada" se refiere a una matriz formada a partir de dichos agrupamientos o colonias. En este contexto, el término "matriz" no debe entenderse como que requiere una disposición ordenada de agrupamientos.
El término fase sólida, o superficie, se utiliza para indicar una matriz plana en la que los cebadores se fijan a una superficie plana, por ejemplo, portaobjetos de microscopio de vidrio, sílice o plástico o dispositivos de celda de flujo similares; perlas, en las que uno o dos cebadores se fijan a las perlas y las perlas se amplifican; o una matriz de perlas sobre una superficie después de que las perlas hayan sido amplificadas.
Los términos "superficie sólida", "soporte sólido" y otros equivalentes gramaticales en el presente documento se refieren a cualquier material que sea apropiado o que pueda modificarse para que sea apropiado para la unión de los polinucleótidos molde. Como apreciarán los expertos en la materia, el número de sustratos posibles es muy grande. Los sustratos posibles incluyen vidrio y vidrio modificado o funcionalizado, plásticos (incluidos acrílicos, poliestireno y copolímeros de estireno y otros materiales, polipropileno, polietileno, polibutileno, poliuretanos, teflón™, etc.), polisacáridos, nailon o nitrocelulosa, cerámica, resinas, sílice o materiales a base de sílice, incluido el silicio y el silicio modificado, carbono, metales, vidrios inorgánicos, plásticos, haces de fibra óptica y una variedad de otros polímeros. Se localizan soportes sólidos y superficies sólidas particularmente útiles dentro de un aparato de celda de flujo. Las celdas de flujo ejemplares se exponen con mayor detalle a continuación.
En algunos casos, el soporte sólido comprende una superficie con patrón. Una "superficie con patrón” se refiere a una disposición de diferentes regiones en o sobre una capa expuesta de un soporte sólido. Por ejemplo, una o más de las regiones pueden ser características en las que están presentes uno o más cebadores de amplificación. Las características pueden estar separadas por regiones intersticiales donde los cebadores de amplificación no están presentes. El patrón puede ser un formato x-y de características que están en filas y columnas, una disposición repetitiva de características y/o regiones intersticiales, o una disposición aleatoria de características y/o regiones intersticiales. Se describen superficies con patrón ejemplares que se pueden usar en los métodos descritos en el presente documento en las pat. de EE. UU. n.28.778.848, 8.778.849, 9.079.148, y la Pub. de EE. UU. n.22014/0243224.
En algunos casos, el soporte sólido comprende una matriz de pocillos o depresiones en una superficie. Esto se puede fabricar como es conocido generalmente en la materia usando una variedad de técnicas, que incluyen, pero sin limitación, fotolitografía, técnicas de estampado, técnicas de moldeo y técnicas de micrograbado. Como apreciarán los expertos en la materia, la técnica usada dependerá de la composición y la forma del sustrato de la matriz.
Las características de una superficie con patrón pueden ser pocillos en una matriz de pocillos (por ejemplo, micropocillos o nanopocillos) sobre vidrio, silicona, plástico u otros soportes sólidos adecuados con gel enlazado covalentemente con patrón, tal como poli(N-(5-azidoacetamidilpentil)acrilamida-co-acrilamida) (PAZAM, véanse, por ejemplo, la pub. de Ee . UU. n.° 2013/184796 y los documentos WO 2016/066586 y WO 2015/002813). El proceso crea almohadillas de gel usadas para la secuenciación que pueden ser estables durante series de secuenciación con una gran cantidad de ciclos. El enlazamiento covalente del polímero a los pocillos es útil para mantener el gel en las características estructuradas a lo largo de la vida útil del sustrato estructurado durante una variedad de usos. Sin embargo, no es necesario que el gel esté enlazado covalentemente a los pocillos. Por ejemplo, en algunas condiciones, puede usarse acrilamida libre de silano (SFA, véase, por ejemplo, la pat. de EE. UU. n° 8.563.477) que no está fijada covalentemente a ninguna parte del sustrato estructurado, como material de gel.
Se puede elaborar un sustrato estructurado creando un patrón en un material de soporte sólido con pocillos (p. ej., micropocillos o nanopocillos), recubriendo el soporte con patrón con un material de gel (p. ej., PAZAM, SFA o variantes químicamente modificadas de los mismos, tales como la versión azidolizada de SFA (azido-SFA)) y pulir el soporte recubierto de gel, por ejemplo mediante pulido químico o mecánico, reteniendo así el gel en los pocillos pero retirando o inactivando sustancialmente todo el gel de las regiones intersticiales sobre la superficie del sustrato estructurado entre los pocillos. Los ácidos nucleicos cebadores se pueden fijar al material de gel. Una solución de ácidos nucleicos diana (p. ej., un genoma humano fragmentado) puede entonces ponerse en contacto con el sustrato pulido de tal manera que los ácidos nucleicos diana individuales sembrarán pocillos individuales a través de interacciones con cebadores fijados al material del gel; sin embargo, los ácidos nucleicos diana no ocuparán las regiones intersticiales debido a la ausencia o inactividad del material del gel. La amplificación de los ácidos nucleicos diana se limitará a los pocillos ya que la ausencia o la inactividad del gel en las regiones intersticiales evita la migración hacia el exterior de la colonia de ácidos nucleicos en crecimiento. El proceso se puede fabricar convenientemente, es escalable y utiliza métodos convencionales de micro- o nanofabricación.
El término "celda de flujo", como se usa en el presente documento, se refiere a una cámara que comprende una superficie sólida a través de la cual pueden fluir uno o más reactivos fluidos. Se describen ejemplos de celdas de flujo y sistemas fluídicos y plataformas de detección relacionados que pueden usarse fácilmente en los métodos de la presente divulgación, por ejemplo, en Bentley et al., Nature 456: 53-59 (2008), WO 04/018497; US 7.057.026; WO 91/06678; WO 07/123744; US 7.329.492; US 7.211.414; US 7.315.019; US 7.405.281, y US 2008/0108082.
El soporte sólido o su superficie no es plano, tal como la superficie interior o exterior de un tubo o recipiente. Como alternativa, el soporte sólido comprende microesferas o perlas. Por "microesferas" o "perlas" o "partículas" o equivalentes gramaticales en el presente documento se entiende pequeñas partículas discretas. Las composiciones de perlas adecuadas incluyen plásticos, cerámica, vidrio, poliestireno, metilestireno, polímeros acrílicos, materiales paramagnéticos, sol de toria, grafito de carbono, dióxido de titanio, látex o dextranos reticulados tales como Sepharose, celulosa, nailon, micelas reticuladas y teflón, así como cualquier otro material esbozado en el presente documento para soportes sólidos. "Microsphere Detection Guide” de Bangs Laboratories, Fishers Ind. es una guía útil. En ciertos casos, las microesferas son microesferas o perlas magnéticas.
No es necesario que las perlas sean esféricas; pueden usarse partículas irregulares. Como alternativa o adicionalmente, las perlas pueden ser porosas. Los tamaños de las perlas varían desde nanómetros, es decir, 100 nm, hasta milímetros, es decir, 1 mm, prefiriéndose perlas desde aproximadamente 0,2 micras hasta aproximadamente 200 micras, y siendo particularmente preferidas desde aproximadamente 0,5 hasta aproximadamente 5 micras, aunque pueden usarse perlas más pequeñas o más grandes.
Las matrices agrupadas se pueden preparar usando un proceso de termociclado, como se describe en el documento WO/9844151, o un proceso por el cual la temperatura se mantiene constante y se realizan ciclos de extensión y desnaturalización usando cambios de reactivos. Tales métodos de amplificación isotérmica se describen en las solicitudes de patente números WO/0246456 y US 2008/0009420. Debido a las temperaturas más bajas requeridas en el proceso isotérmico, este es particularmente preferido.
Se apreciará que cualquiera de las metodologías de amplificación descritas en el presente documento o generalmente conocidas en la materia se pueden utilizar con cebadores universales o específicos de diana para amplificar fragmentos de ADN inmovilizados. Los métodos adecuados para la amplificación incluyen la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), la amplificación por desplazamiento de hebra (SDA), la amplificación mediada por transcripción (TMA) y la amplificación basada en secuencias de ácidos nucleicos (NASBA), como se describe en la patente de EE. UU. n.° 8.003.354. Los métodos de amplificación anteriores pueden emplearse para amplificar uno o más ácidos nucleicos de interés. Por ejemplo, se puede utilizar PCR, que incluye PCR multiplexada, SDA, TMA, NASBA y similares, para amplificar fragmentos de ADN inmovilizados. En algunos casos, en la reacción de amplificación se incluyen cebadores dirigidos específicamente al polinucleótido de interés.
Otros métodos adecuados para la amplificación de polinucleótidos pueden incluir las tecnologías de extensión y ligadura de oligonucleótidos, amplificación por círculo rodante (RCA) (Lizardi et al., Nat. Genet. 19:225-232 (1998)) y ensayo de ligadura de oligonucleótidos (OLA) (véanse generalmente las pat. de Ee. UU. n.° 7.582.420, 5.185.243, 5.679.524 y 5.573.907; documentos EP 0 320 308 B1; EP 0 336 731 B1; EP 0 439 182 B1; WO 90/01069; WO 89/12696; y WO 89/09835). Se apreciará que estas metodologías de amplificación pueden diseñarse para amplificar fragmentos de ADN inmovilizados. Por ejemplo, el método de amplificación puede incluir amplificación de sonda de ligadura o reacciones de ensayo de ligadura de oligonucleótidos (OLA) que contienen cebadores dirigidos específicamente al ácido nucleico de interés; o una reacción de extensión-ligadura de cebadores que contiene cebadores dirigidos específicamente al ácido nucleico de interés. Como ejemplo de cebadores de extensión y ligadura de cebadores que pueden diseñarse específicamente para amplificar un ácido nucleico de interés, la amplificación puede incluir cebadores usados para el ensayo GoldenGate (Illumina, Inc., San Diego, CA) como se ejemplifica en las pat. de EE. UU. n.° 7.582.420 y 7.611.869.
Los ejemplos de métodos de amplificación isotérmica que pueden usarse en un método de la presente divulgación incluyen amplificación de desplazamiento múltiple (MDA) como se ejemplifica, por ejemplo, mediante Dean et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99:5261-66 (2002) o amplificación isotérmica de ácido nucleico por desplazamiento de hebra ejemplificada por, por ejemplo, por la pat. de EE. UU. n.° 6.214.587. Otros métodos no basados en PCR que pueden usarse en la presente divulgación incluyen, por ejemplo, la amplificación por desplazamiento de hebra (SDA) que se describe, por ejemplo, en Walker et al., Molecular Methods for Virus Detection, Academic Press, Inc., 1995; patentes de EE. Uu . n.° 5.455.166 y 5.130.238, y Walker et al., Nucl. Acids Res. 20:1691-96 (1992) o amplificación por desplazamiento de hebra hiperramificada que se describe, por ejemplo, en Lage et al., Genome Res. 13:294-307 (2003). Los métodos de amplificación isotérmica se pueden usar con la polimerasa Phi 29 de desplazamiento de hebra o el fragmento grande de la ADN polimerasa Bst, 5'->3' exo, para la amplificación de cebadores aleatorios de ADN genómico. El uso de estas polimerasas aprovecha su alta procesividad y actividad de desplazamiento de hebras. La alta procesividad permite que las polimerasas produzcan fragmentos de 10 a 20 kb de longitud. Como se expone anteriormente, se pueden producir fragmentos más pequeños en condiciones isotérmicas usando polimerasas que tienen baja procesividad y actividad de desplazamiento de hebras, tales como la polimerasa Klenow. La descripción adicional de las reacciones de amplificación, las condiciones y los componentes se exponen en detalle en la divulgación de la patente de EE. UU. n.° 7.670.810.
Otro método de amplificación de polinucleótidos que es útil en la presente divulgación es la PCR marcada, que usa una población de cebadores de dos dominios que tienen una región 5' constante seguida de una región 3' aleatoria como se describe, por ejemplo, en Grothues et al. Nucleic Acids Res. 21(5): 1321-2 (1993). Las primeras rondas de amplificación se llevan a cabo para permitir una multitud de iniciaciones en el ADN desnaturalizado por calor en función de la hibridación individual de la región 3' sintetizada al azar. Debido a la naturaleza de la región 3', se contempla que los sitios de iniciación sean aleatorios en todo el genoma. Posteriormente, los cebadores no unidos pueden retirarse y puede tener lugar una replicación adicional usando cebadores complementarios de la región 5' constante.
La amplificación isotérmica se puede realizar mediante la amplificación por exclusión cinética (KEA), también denominada amplificación por exclusión (ExAmp). Una biblioteca de ácidos nucleicos de la presente divulgación se puede elaborar usando un método que incluye una etapa de hacer reaccionar un reactivo de amplificación para producir una pluralidad de sitios de amplificación que incluyen cada uno una población sustancialmente clonal de amplicones de un ácido nucleico diana individual que ha sembrado el sitio. En algunos casos, la reacción de amplificación procede hasta que se genera un número suficiente de amplicones para llenar la capacidad del sitio de amplificación respectivo. Llenar un sitio ya sembrado hasta su capacidad de esta manera inhibe que los ácidos nucleicos diana lleguen y se amplifiquen en el sitio, produciendo así una población clonal de amplicones en el sitio. En algunas realizaciones, se puede lograr una clonalidad aparente incluso si un sitio de amplificación no se llena por completo antes de que un segundo ácido nucleico diana llegue al sitio. En algunas condiciones, la amplificación de un primer ácido nucleico diana puede proceder hasta el punto en que se elabora un número suficiente de copias para superar o sobrepasar eficazmente la producción de copias de un segundo ácido nucleico diana que se transporta al sitio. Por ejemplo, al usar un proceso de amplificación de puente en una característica circular que tiene menos de 500 nm de diámetro, se ha determinado que después de 14 ciclos de amplificación exponencial para un primer ácido nucleico diana, la contaminación de un segundo ácido nucleico diana en el mismo sitio producirá una cantidad insuficiente de amplicones contaminantes para afectar negativamente el análisis de secuenciación por síntesis en una plataforma de secuenciación de Illumina.
Como se demuestra en el ejemplo anterior, los sitios de amplificación en una matriz pueden ser, pero no necesariamente, completamente clonales en realizaciones particulares. Más bien, para algunas aplicaciones, un sitio de amplificación individual puede estar poblado predominantemente con amplicones de un primer ácido nucleico diana y también puede tener un nivel bajo de amplicones contaminantes de un segundo ácido nucleico diana. Una matriz puede tener uno o más sitios de amplificación que tengan un nivel bajo de amplicones contaminantes siempre que el nivel de contaminación no tenga un impacto inaceptable en un uso posterior de la matriz. Por ejemplo, cuando la matriz se va a usar en una aplicación de detección, un nivel aceptable de contaminación sería un nivel que no afecte la relación señal/ruido o la resolución de la técnica de detección de una manera inaceptable. Por consiguiente, la clonalidad aparente generalmente será relevante para un uso o aplicación particular de una matriz elaborada por los métodos expuestos en el presente documento. Los niveles ejemplares de contaminación que pueden ser aceptables en un sitio de amplificación individual para aplicaciones particulares incluyen, pero sin limitación, como máximo 0,1 %, 0,5 %, 1 %, 5 %, 10 % o 25 % de amplicones contaminantes. Una matriz puede incluir uno o más sitios de amplificación que tengan estos niveles ejemplares de amplicones contaminantes. Por ejemplo, hasta el 5 %, 10 %, 25 %, 50 %, 75 % o incluso el 100 % de los sitios de amplificación en una matriz pueden tener algunos amplicones contaminantes. Se entenderá que, en una matriz u otra colección de sitios, al menos el 50 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % o 99 % o más de los sitios pueden ser clonales o aparentemente clonales.
La exclusión cinética puede ocurrir cuando un proceso ocurre a una tasa lo suficientemente rápida como para excluir efectivamente que ocurra otro evento o proceso. Se toma, por ejemplo, la elaboración de una matriz de ácidos nucleicos donde los sitios de la matriz se siembran al azar con ácidos nucleicos diana de una solución y se generan copias del ácido nucleico diana en un proceso de amplificación para llenar cada uno de los sitios sembrados hasta su capacidad. De acuerdo con los métodos de exclusión cinética de la presente divulgación, los procesos de siembra y amplificación pueden proceder simultáneamente en condiciones en las que la tasa de amplificación excede la tasa de siembra. Como tal, la tasa relativamente rápida a la que se elaboran las copias en un sitio que ha sido sembrado por un primer ácido nucleico diana excluirá de forma efectiva que un segundo ácido nucleico siembre el sitio para la amplificación. Los métodos de amplificación de exclusión cinética se pueden realizar como se describe en detalle en la divulgación de la pub. de EE. u U. n.° 2013/0338042.
La exclusión cinética puede explotar una tasa relativamente lenta para iniciar la amplificación (por ejemplo, una tasa lenta para elaborar una primera copia de un ácido nucleico diana) frente a una tasa relativamente rápida para elaborar copias posteriores del ácido nucleico diana (o de la primera copia del ácido nucleico diana). En el ejemplo del párrafo anterior, la exclusión cinética ocurre debido a la tasa relativamente lenta de siembra del ácido nucleico diana (por ejemplo, difusión o transporte relativamente lento) frente a la tasa relativamente rápida a la que ocurre la amplificación para llenar el sitio con copias de la semilla de ácido nucleico. En otro ejemplo, la exclusión cinética puede ocurrir debido a un retraso en la formación de una primera copia de un ácido nucleico diana que ha sembrado un sitio (por ejemplo, activación retrasada o lenta) frente a la tasa relativamente rápida a la que se elaboran copias posteriores para llenar el sitio. En este ejemplo, un sitio individual puede haber sido sembrado con varios ácidos nucleicos diana diferentes (por ejemplo, varios ácidos nucleicos diana pueden estar presentes en cada sitio antes de la amplificación). Sin embargo, la formación de la primera copia para cualquier ácido nucleico diana dado puede activarse aleatoriamente de tal manera que la tasa media de formación de la primera copia sea relativamente lenta en comparación con la tasa a la que se generan las copias posteriores. En este caso, aunque un sitio individual puede haber sido sembrado con varios ácidos nucleicos diana diferentes, la exclusión cinética permitirá que solo se amplifique uno de esos ácidos nucleicos diana. Más específicamente, una vez que se ha activado un primer ácido nucleico diana para la amplificación, el sitio se llenará rápidamente con sus copias, evitando así que se elaboren copias de un segundo ácido nucleico diana en el sitio.
Un reactivo de amplificación puede incluir componentes adicionales que facilitan la formación de amplicones y, en algunos casos, aumentan la tasa de formación de amplicones. Un ejemplo es una recombinasa. La recombinasa puede facilitar la formación de amplicón al permitir la invasión/extensión repetida. Más específicamente, la recombinasa puede facilitar la invasión de un ácido nucleico diana por la polimerasa y la extensión de un cebador por la polimerasa usando el ácido nucleico diana como molde para la formación de amplicón. Este proceso se puede repetir como una reacción en cadena en la que los amplicones producidos en cada ronda de invasión/extensión sirven como moldes en una ronda posterior. El proceso puede ocurrir más rápidamente que la PCR estándar, ya que no se requiere un ciclo de desnaturalización (por ejemplo, mediante calentamiento o desnaturalización química). Como tal, la amplificación facilitada por recombinasa puede llevarse a cabo isotérmicamente. Generalmente es deseable incluir ATP u otros nucleótidos (o en algunos casos análogos no hidrolizables de los mismos) en un reactivo de amplificación facilitado por recombinasa para facilitar la amplificación. Una mezcla de recombinasa y proteína de unión monocatenaria (SSB) es particularmente útil ya que la SSB puede facilitar aún más la amplificación. Las formulaciones ejemplares para la amplificación facilitada por recombinasa incluyen las vendidas comercialmente como kits TwistAmp por TwistDx (Cambridge, Reino Unido). Los componentes útiles del reactivo de amplificación facilitado por recombinasa y las condiciones de reacción se exponen en las patentes de EE. UU. n.° 5.223.414 y 7.399.590.
Otro ejemplo de un componente que se puede incluir en un reactivo de amplificación para facilitar la formación de amplicón y, en algunos casos, para aumentar la tasa de formación de amplicón es una helicasa. La helicasa puede facilitar la formación de amplicones al permitir una reacción en cadena de formación de amplicones. El proceso puede ocurrir más rápidamente que la PCR estándar, ya que no se requiere un ciclo de desnaturalización (por ejemplo, mediante calentamiento o desnaturalización química). Como tal, la amplificación facilitada por helicasa puede llevarse a cabo isotérmicamente. Una mezcla de helicasa y proteína de unión monocatenaria (SSB) es particularmente útil ya que la SSB puede facilitar aún más la amplificación. Las formulaciones ejemplares para la amplificación facilitada por helicasa incluyen las que se venden comercialmente como kits IsoAmp de Biohelix (Beverly, MA). Además, los ejemplos de formulaciones útiles que incluyen una proteína helicasa se describen en los documentos US 7.399.590 y US 7.829.284.
Otro ejemplo más de un componente que se puede incluir en un reactivo de amplificación para facilitar la formación de amplicón y, en algunos casos, aumentar la tasa de formación de amplicón es una proteína de unión al origen.
Uso en secuenciación/métodos de secuenciación
Los polinucleótidos inmovilizados de las bibliotecas agrupadas se pueden secuenciar de cualquier manera adecuada. Preferiblemente, la secuenciación se realiza mediante secuenciación por síntesis en la que los nucleótidos se añaden sucesivamente a un grupo hidroxilo 3' libre de un cebador de secuenciación usando los polinucleótidos inmovilizados como molde, lo que da como resultado la síntesis de una cadena de polinucleótidos en la dirección 5' a 3'. La naturaleza del nucleótido añadido se determina preferiblemente después de cada adición de nucleótido. Las técnicas de secuenciación que usan la secuenciación por ligación, en las que no se secuencian todas las bases contiguas, y las técnicas tales como la secuenciación masiva en paralelo de firmas (MPSS) en las que las bases se retiran, en lugar de añadirse a las hebras en la superficie, también están dentro del alcance de la divulgación, al igual que las técnicas que usan la detección de la liberación de pirofosfato (pirosecuenciación). Tales técnicas basadas en pirosecuenciación son particularmente aplicables a la secuenciación de matrices de perlas donde las perlas se han amplificado en una emulsión, de tal manera que se amplifica un solo molde de la molécula de la biblioteca en cada perla.
El punto de iniciación de la reacción de secuenciación puede proporcionarse mediante la reasociación de un cebador de secuenciación con un producto de la reacción de amplificación en fase sólida. A este respecto, uno o ambos adaptadores añadidos durante la formación de la biblioteca de moldes pueden incluir una secuencia de nucleótidos que permita la reasociación de un cebador de secuenciación con polinucleótidos inmovilizados, tales como los polinucleótidos adaptador-diana-adaptador.
La secuencia de la etiqueta de índice y la secuencia diana pueden determinarse en una sola lectura de un solo cebador de secuenciación o en múltiples lecturas de más de un cebador de secuenciación. En el caso de dos lecturas de dos cebadores de secuenciación, la "lectura de etiqueta de índice" y la "lectura de diana" se pueden realizar en cualquier orden, con una etapa de desnaturalización adecuada para retirar el cebador reasociado después de completar la primera lectura de secuenciación. Las etapas de desnaturalización adecuadas pueden incluir formamida, hidróxido o calor, como se conoce generalmente en la materia.
Los productos de las reacciones de amplificación en fase sólida donde los cebadores de amplificación directos e inversos se inmovilizan covalentemente sobre la superficie sólida pueden ser las denominadas estructuras "de puente" formadas por reasociación de pares de hebras polinucleotídicas inmovilizadas y hebras complementarias inmovilizadas, estando ambas hebras fijadas al soporte sólido en el extremo 5'. Las matrices compuestas por tales estructuras de puente proporcionan moldes ineficaces para la secuenciación de ácidos nucleicos, ya que la hibridación de un cebador de secuenciación convencional con una de las hebras inmovilizadas no se ve favorecida en comparación con la reasociación de esta hebra con su hebra complementaria inmovilizada en condiciones estándares para la hibridación. Se describen ejemplos de amplificación de puente o en agrupamiento, por ejemplo, en las patentes de EE. UU. n.27.985.565 y 7.115.400.
Con el fin de proporcionar moldes más adecuados para la secuenciación de ácidos nucleicos, se prefiere retirar sustancialmente todo o retirar o desplazar al menos una parte de una de las hebras inmovilizadas en la estructura "de puente" para generar un molde que es al menos parcialmente monocatenario. La parte del molde que es monocatenaria estará así disponible para la hibridación con un cebador de secuenciación. El proceso de retirar la totalidad o una parte de una hebra inmovilizada en una estructura de ácido nucleico bicatenaria "de puente" puede denominarse en el presente documento "linealización", y se describe con más detalle en los documentos WO 2007/010251, WO 2006/064199, WO 2005/065814, WO 2015/106941, WO 1998/044151, y WO 2000/018957.
Las estructuras de molde de puente pueden linealizarse mediante la escisión de una o ambas hebras con una endonucleasa de restricción o mediante la escisión de una hebra con una endonucleasa nicasa. Se pueden usar otros métodos de escisión como alternativa a las enzimas de restricción o las enzimas nicasa, incluidos entre otros la escisión química (por ejemplo, escisión de un enlazamiento diol con peryodato), escisión de sitios abásicos por escisión con endonucleasa (por ejemplo, 'USER', según lo suministrado por NEB, número de pieza M5505S), o por exposición al calor o álcali, escisión de ribonucleótidos incorporados en productos de amplificación compuestos por lo demás por desoxirribonucleótidos, escisión fotoquímica o escisión de un enlazador peptídico.
Se apreciará que una etapa de linealización puede no ser esencial si la reacción de amplificación en fase sólida se realiza con solo un cebador inmovilizado covalentemente y el otro en solución libre.
Después de la etapa de escisión, independientemente del método usado para la escisión, el producto de la reacción de escisión puede someterse a condiciones desnaturalizantes para retirar la parte o partes de la hebra o hebras escindidas que no están fijadas al soporte sólido. Las condiciones desnaturalizantes adecuadas, por ejemplo, solución de hidróxido de sodio, solución de formamida o calor, serán evidentes para el lector experto con referencia a los protocolos estándares de biología molecular (Sambrook et al., 2001, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 3.a edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY; Current Protocols, eds. Ausubel et al.). La desnaturalización da como resultado la producción de un molde de secuenciación que es parcial o sustancialmente monocatenario. Puede iniciarse entonces una reacción de secuenciación mediante la hibridación de un cebador de secuenciación con la parte monocatenaria del molde.
Por tanto, en algunos casos, una reacción de secuenciación comprende la hibridación de un cebador de secuenciación con una región monocatenaria de un producto de amplificación linealizado, incorporando secuencialmente uno o más nucleótidos en una hebra polinucleotídica complementaria de la región de la hebra molde amplificada que se va a secuenciar, identificando el base presente en uno o más de los nucleótidos incorporados y determinando así la secuencia de una región de la hebra molde.
Un método de secuenciación preferido que puede usarse se basa en el uso de nucleótidos modificados que tienen bloques 3' retirables, por ejemplo, como se describe en el documento WO 2004/018497 y la pat. de EE. UU. n.° 7.057.026. Una vez que el nucleótido modificado se ha incorporado a la cadena de polinucleótidos en crecimiento complementaria de la región del molde que se está secuenciando, no hay un grupo 3'-OH libre disponible para dirigir una mayor extensión de la secuencia y, por lo tanto, la polimerasa no puede añadir más nucleótidos. Una vez que se ha determinado la naturaleza de la base incorporada en la cadena en crecimiento, se puede retirar el bloqueo 3' para permitir la adición del siguiente nucleótido sucesivo. Al ordenar los productos derivados usando estos nucleótidos modificados, es posible deducir la secuencia de ADN del molde de ADN. Tales reacciones se pueden realizar en un solo experimento si cada uno de los nucleótidos modificados tiene un marcador diferente fijado, que se sabe que corresponde a la base particular, para facilitar la discriminación entre las bases añadidas durante cada etapa de incorporación. Como alternativa, se puede llevar a cabo una reacción separada que contenga cada uno de los nucleótidos modificados por separado.
Los nucleótidos modificados pueden portar un marcador para facilitar su detección. Se puede usar un marcador fluorescente, por ejemplo, para la detección de nucleótidos modificados. Cada tipo de nucleótido puede portar por tanto un marcador fluorescente diferente, por ejemplo, como se describe en el documento WO 2007/135368. Sin embargo, no es necesario que el marcador detectable sea un marcador fluorescente. Puede usarse cualquier marcador que permita la detección de un nucleótido incorporado.
Un método para detectar nucleótidos marcados con fluorescencia comprende el uso de luz láser de una longitud de onda específica para los nucleótidos marcados, o el uso de otras fuentes de iluminación adecuadas. La fluorescencia del marcador en el nucleótido puede detectarse mediante una cámara de CCD u otro medio de detección adecuado. La instrumentación adecuada para grabar imágenes de matrices agrupadas se describe en el documento WO 2007/123744.
Por supuesto, puede emplearse cualquier otro método de secuenciación adecuado. Preferiblemente, el método de secuenciación se basa en la incorporación sucesiva de nucleótidos en una cadena de polinucleótidos. Las técnicas alternativas adecuadas incluyen, por ejemplo, pirosecuenciación, FISSEQ (secuenciación fluorescente in situ), MPSS y secuenciación mediante métodos basados en ligadura, por ejemplo, como se describe en la pat. de EE. UU. n.° 6.306.597.
La muestra de ácido nucleico puede analizarse adicionalmente para obtener una segunda lectura del extremo opuesto del fragmento. La metodología para secuenciar ambos extremos de un agrupamiento se describe en las solicitudes en trámite junto con las presentes WO 2007/010252 y WO 2008/041002. En un ejemplo, la serie de etapas puede realizarse como sigue; generar agrupamientos, linealizar, hibridar el primer cebador de secuenciación y obtener la primera lectura de secuenciación. El primer cebador de secuenciación se puede retirar, hibridar un segundo cebador y secuenciar la etiqueta de índice. La hebra de polinucleótidos puede "invertirse" entonces sobre la superficie sintetizando una copia complementaria a partir de los cebadores inmovilizados restantes usados en la amplificación de agrupamiento. Este proceso de resintetización de hebras regenera el agrupamiento bicatenario. La hebra molde original puede retirarse para linealizar la hebra resintetizada que luego puede hibridarse con un cebador de secuenciación y secuenciarse en una tercera ronda de secuenciación.
En los casos en los que se emplea la resíntesis de hebras, ambas hebras pueden inmovilizarse en la superficie de una manera que permita la liberación posterior de una parte de la hebra inmovilizada. Esto se puede lograr a través de una serie de mecanismos como se describe en el documento WO 2007/010251. Por ejemplo, un cebador puede contener un nucleótido uracilo, lo que significa que la hebra se puede escindir en la base uracilo usando las enzimas uracilo glicosilasa (UDG), que retira la base de nucleósido, y la endonucleasa VIII que escinde el nucleótido básico. Esta combinación de enzimas está disponible como enzima USER™ de New England Biolabs (n.° de cat. M5505). El segundo cebador puede comprender un nucleótido 8-oxoguanina, que luego se puede escindir mediante la enzima FPG (NEB n.° de cat. M0240). Este diseño de cebadores proporciona el control de qué cebador se escinde en qué punto del proceso y también en qué parte del agrupamiento ocurre la escisión. Los cebadores también pueden modificarse químicamente, por ejemplo, con una modificación de disulfuro o diol que permita la escisión química en localizaciones específicas.
Haciendo referencia ahora a la FIG. 1, se muestra un dibujo esquemático de un adaptador 100 que se pueden usar de acuerdo con diversas realizaciones descritas en el presente documento. El adaptador representado 100 comprende una región bicatenaria 110 y una región monocatenaria no complementaria 120. La región bicatenaria 110 puede fijarse a un polinucleótido diana bicatenario. En la realización representada, los extremos libres de cada hebra de la parte monocatenaria 120 se modifican (indicado por "X") para proteger los extremos de la actividad exonucleasa. En contraposición, el extremo 3' de una hebra y el extremo 5' de la otra hebra que forman la parte bicatenaria 110 son susceptibles a la degradación por exonucleasas. Si el adaptador 100 no está fijado a un fragmento diana bicatenario, el adaptador no incorporado puede ser digerido por una o más exonucleasas que tengan actividad exonucleasa 5' y 3'. Porque la exonucleasa comenzará la digestión desde la parte bicatenaria 110, la exonucleasa preferiblemente tiene actividad para ADN bicatenario sin mellas.
Una hebra representada del adaptador 100 comprende una secuencia de cebador de extensión universal 130, una secuencia de etiqueta de índice 132, y una secuencia de cebador de secuenciación 134. La otra hebra representada del adaptador 100 comprende una secuencia de cebador de extensión universal 140, una secuencia de etiqueta de índice 142, y una secuencia de cebador de secuenciación 144.
Las secuencias del cebador de extensión universal 130, 140 puede hibridarse con oligonucleótidos cebadores de extensión fijados a una superficie sólida con fines de amplificación o secuenciación (si el adaptador 100 estaba fijado a un polinucleótido diana). La secuencia de cebador de extensión universal 140, o una parte del mismo, también puede hibridarse con un cebador de secuenciación para secuenciar la secuencia de etiqueta de índice 142. Como alternativa, la hebra puede comprender una secuencia de cebador de secuenciación adicional (no mostrada).
La secuencia de cebador de secuenciación 134 puede hibridarse con un cebador de secuenciación para permitir la secuenciación de la secuencia de etiqueta de índice 132. La secuencia de etiqueta de índice 142 y la secuencia de etiqueta de índice 132 pueden ser iguales o diferentes.
La secuencia de cebador de secuenciación 144 puede hibridar con un cebador de secuenciación para permitir la secuenciación de una secuencia polinucleotídica diana (si está fijada al adaptador 100).
Las secuencias de cebadores de secuenciación 134, 144 pueden hibridarse, por ejemplo, con cebadores de PCR si los adaptadores se fijan a una diana en un proceso de varias etapas como se describe anteriormente.
Se entenderá que un adaptador adecuado para usar en diversas realizaciones descritas en el presente documento puede tener más o menos características de secuencia, u otras características de secuencia, que las descritas con respecto a la FIG. 1.
Haciendo referencia ahora a la FIG. 2 , se muestra un dibujo esquemático de un polinucleótido molde 200 de una biblioteca que tiene una secuencia adaptador 100-molde 210-adaptador 100. El polinucleótido molde 210 es bicatenario y está fijado a una parte bicatenaria de los adaptadores 100. Los extremos de las partes monocatenarias de los adaptadores se modifican para protegerlos de la digestión con exonucleasas (indicado por "X"). Porque los adaptadores 100 se ligan a ambos extremos del fragmento diana bicatenario 210, el polinucleótido molde resultante 200 es resistente a la digestión por exonucleasa.
Haciendo referencia ahora a la FIG. 3 , se muestra un dibujo esquemático que ilustra los resultados de la incubación de productos de reacción y reactivos de una ligadura de adaptador-diana con una exonucleasa 400. Después de la ligadura de un adaptador 100 a un fragmento diana 210, da como resultado algunos adaptadores no incorporados restantes 100, fragmento diana 210, y polinucleótido molde 200. Si la solución o composición resultante 500 se incuba con una exonucleasa 400 que tiene actividad exonucleasa 5' y que tiene actividad de exonucleasa 5', el adaptador no incorporado 100 y fragmento diana 210 serán digeridos por la exonucleasa 400 (véase la parte inferior de la FIG. 3). Después del tratamiento con exonucleasa, la solución resultante puede limpiarse y el polinucleótido molde 200 puede inmovilizarse sobre una superficie sólida para la secuenciación.
Haciendo referencia ahora a la FIG. 4 , se muestra una ilustración esquemática de un proceso para la amplificación de agrupamiento de un polinucleótido molde 200 de una biblioteca a una superficie sólida 300 para prepararse para la secuenciación. En el primer panel, el polinucleótido molde 200 que tiene extremos modificados (para la protección de la nucleasa) se hibrida con un primer cebador de extensión 310 fijado a la superficie sólida 300. Por ejemplo, la secuencia del cebador de extensión universal 140 representado en la FIG. 1 de la parte del adaptador puede hibridar con el primer cebador de extensión 310.
El primer cebador de extensión 310 comprende un extremo 3' libre y, por tanto, se pueden añadir nucleótidos al extremo 3' usando el polinucleótido molde 200 como molde para producir una hebra molde copia 201 (véase el segundo panel) fijada a la superficie sólida 300 en presencia de una polimerasa adecuada. La hebra molde 200 puede retirarse y la hebra copia 201 puede hibridarse con un segundo cebador de extensión 320 fijado a la superficie sólida 300 (véase el tercer panel). Por ejemplo, la secuencia del cebador de extensión universal 130 representado en la FIG.
1 de la parte del adaptador puede hibridar con el segundo cebador de extensión 320.
El segundo molde de extensión 320 comprende un extremo 3' libre y, por tanto, se pueden añadir nucleótidos al extremo 3' usando el polinucleótido molde copia 201 como molde para producir una hebra molde amplificada 202 (véase el cuarto panel) fijada a la superficie sólida 300 en presencia de una polimerasa adecuada. Se pueden realizar rondas adicionales de amplificación para producir un agrupamiento de hebras molde copia 201 y hebras molde amplificadas 202.
Con fines ilustrativos, el quinto panel de la FIG. 3 representa las hebras molde copia 201 y amplificada 202 en forma lineal.
Haciendo referencia ahora a la FIG.5, se muestra un dibujo esquemático que ilustra cómo el tratamiento con exonucleasa para retirar los adaptadores no incorporados puede mitigar el salto de índice. Los dos primeros paneles de la FIG. 5 son los mismos que los dos primeros paneles de la FIG. 4. Como se muestra en el panel inferior izquierdo de la FIG. 5 , un adaptador residual no incorporado (no fijado a un polinucleótido diana), o una hebra 104 del mismo, puede hibridarse con una parte adaptadora de la hebra molde copia 201 (por ejemplo, la hibridación puede ocurrir en la región bicatenaria del adaptador y la parte del adaptador del polinucleótido molde). La hebra adaptadora 104 puede ser de una biblioteca diferente a la biblioteca de la que deriva la hebra del molde copia 201. Por consiguiente, la hebra adaptadora 104 puede tener una secuencia de etiqueta de índice que es diferente a la secuencia de etiqueta de índice asociada con la hebra molde copia 201. La hebra adaptadora 104 puede servir como un cebador efectivo para extender y copiar la hebra molde copia 201. Se produciría una hebra amplificada en la que una etiqueta de índice incorrecta (etiqueta de índice de la hebra adaptadora 104 de una segunda biblioteca) se asociaría con un polinucleótido diana de otra biblioteca (polinucleótido diana del polinucleótido molde 201 de una primera biblioteca). En una ronda posterior de amplificación, un polinucleótido indexado incorrectamente podría unirse a la superficie 300. Sin embargo, y como se ilustra en el panel inferior derecho de la FIG.5 , si los adaptadores no incorporados se digieren mediante tratamiento con exonucleasa, la hebra adaptadora no está disponible para servir como cebador de extensión y se mitiga el salto de índice.
Haciendo referencia ahora a las FIGS. 6A y 6B, se ilustra la naturaleza del fenómeno de salto de índice. La FIG. 6A muestra cómo las lecturas de una muestra dada se demultiplexan incorrectamente y se mezclan con una muestra diferente después de la demultiplexación. La FIG.6B demuestra el salto de índice en un sistema de índice dual, donde conduce a combinaciones inesperadas de secuencias de etiquetas de índice.
Haciendo referencia ahora a las FIGS. 7A y 7B, se ilustra el enfoque general para medir la tasa de salto de índice en un sistema dado. La FIG. 7A muestra un diseño ejemplar de una placa adaptadora dual, en el que cada pocillo individual de una placa de 96 pocillos contiene un único par de secuencias de etiquetas de índice (12 índices P7 diferentes combinados con 8 índices P5 diferentes). La FIG. 7B muestra una configuración experimental destinada a medir la tasa de salto de índice, en la que se utilizan 8 combinaciones únicas de etiquetas de índice dual (es decir, no se espera que ningún índice P5 se empareje con más de un índice P7 y viceversa). Las combinaciones inesperadas de etiquetas de índice (por ejemplo, D505-D703) se identifican entonces fácilmente como casos de salto de índice.
Haciendo referencia ahora a las FIGS. 8A y 8B, se ilustra el efecto de los adaptadores no ligados sobre la tasa de salto de índice. La FIG. 8A muestra un aumento de 6 veces en el salto de índice asociado con una adición del 50 % de los adaptadores libres. La FIG. 8B muestra un efecto aproximadamente lineal del adaptador bifurcado libre sobre la tasa de salto de índice dentro del intervalo probado. Los inventores también observaron un efecto más pronunciado de los adaptadores P7 monocatenarios libres sobre la tasa de salto de índice en comparación con los adaptadores P5 monocatenarios libres (datos no mostrados).
Ejemplos
Ejemplo 1: Protocolo de muestra para tratamiento con exonucleasa con bloqueo en 3 ’ de bibliotecas indexadas con adaptadores protegidos
Este protocolo explica cómo realizar un tratamiento con exonucleasa con bloqueo en 3' de bibliotecas de ADN protegidas para reducir el salto de índice. Este método está diseñado para realizarse en grupos de bibliotecas de ADN antes de la etapa de desnaturalización y la posterior generación de agrupamientos con Illumina HiSeq® 4000 y plataformas de secuenciación similares que utilizan celdas de flujo con patrones y agrupamiento basado en ExAmp (por ejemplo, HiSeq® X y NovaSeq®).
Se ha observado que ocurre un salto de índice cuando se asignan secuencias de índice incorrectas a la secuencia de inserción, lo que da como resultado una asignación incorrecta de la muestra. La realización de este tratamiento en grupos de muestras de ADN antes de ejecutar HiSeq® 4000 debería reducir los niveles de salto de índice a algún nivel que en esta etapa no puede predecirse consistentemente.
Se puede considerar que el flujo de trabajo del tratamiento implica cuatro etapas: (i) producir un grupo de muestras de ADN; (ii) realizar el tratamiento, (iii) limpiar, muestrear y cuantificar; y (iv) agrupar y secuenciar el grupo de muestras.
Consumibles/Equipo: Los consumibles y el equipo pueden ser suministrados por un usuario o fabricante de secuenciación. Los consumibles suministrados por el usuario pueden incluir un grupo de muestras de biblioteca de ADN: 30 gl a una concentración que se usará para la desnaturalización durante el agrupamiento. El usuario también puede suministrar etanol al 80 % (EtOH) recién preparado.
La Tabla 1 a continuación ilustra algunos consumibles y equipos que se pueden usar.
Tabla 1: Consumibles y Equipos
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Un fabricante de secuenciadores puede suministrar EMX (mezcla de exonucleasa), BMX (mezcla de bloqueo); RSB (tampón de resuspensión) y SPB (perlas de purificación de muestra).
La EMX puede incluir un tampón de exonucleasa (NEBuffer 4, NEB n.° de cat. B7004S: acetato de potasio 50 mM, trisacetato 20 mM, acetato de magnesio 10 mM, DTT 1 mM) y exonucleasa V (New England Biolabs, n.° de cat. M0345S/L).
La BMX puede incluir una premezcla de secuenciación (tampón T ris, cloruro de sodio, sacarosa, sulfato de magnesio, EDTA y Tween 20), una mezcla de ddNTP, ADN polimerasa Pol19 y transferasa terminal TDT.
El RSB puede incluir un tampón Tris, pH 8,5.
Las SPB pueden incluir perlas Agencourt® AMPuro® XP (Beckman Coulter, n.° de cat. A63880). Las SPB deben agitarse vorticialmente antes de cada uso. Las SPB deben agitarse vorticialmente con frecuencia para asegurarse de que las perlas se distribuyan uniformemente. Las SPB deben aspirarse y dispensarse lentamente debido a la viscosidad de la solución.
Algunos de los consumibles deben almacenarse y prepararse como se indica en Tabla 2 siguiente.
Tabla 2: Almacenamiento y preparación de consumibles
Figure imgf000021_0002
El siguiente programa de EMX se puede guardar en el termociclador: (i) elegir la opción de precalentamiento de la tapa y ajuste a 100 °C; (ii) 37 °C durante 5 min; (iii) 70 °C durante 30 minutos; y (iv) mantener a 4 °C.
El siguiente programa de BMX se puede guardar en el termociclador: (i) elegir la opción de precalentamiento de la tapa y ajuste a 100 °C; (ii) 38 °C durante 20 minutos; (iii) 60 °C durante 20 minutos; y (iv) mantener a 4 °C.
Las muestras se pueden tratar de la siguiente manera: (i) centrifugar EMX a 600 x g durante 5 segundos; (ii) añadir 27 pl del grupo de muestras de la biblioteca de ADN al tubo de PCR; (iii) añadir 5 pl de EMX a cada muestra en cada tubo de PCR y luego mezclar completamente pipeteando hacia arriba y hacia abajo; (iv) incubar colocándolas en el termociclador y ejecutando el programa de EMX; (v) centrifugar BMX a 600 x g durante 5 segundos; (vi) añadir 32 pl de BMX directamente a cada reacción de exonucleasa en cada tubo de PCR y luego mezclar completamente pipeteando hacia arriba y hacia abajo; y (vii) incubar colocándolas en el termociclador y ejecutando el programa de BMX. Cada tubo contiene 64 pl.
La muestra agrupada tratada se puede limpiar de la siguiente manera: (1) agitar vorticialmente las SPB hasta que estén bien dispersas; (2) añadir 60 pl de SPB a cada tubo de tratamiento de muestra y mezcle completamente pipeteando hacia arriba y hacia abajo; (3) incubar a temperatura ambiente durante 5 minutos; (4) colocar en un soporte magnético y espere hasta que el líquido se aclare (2-5 minutos); (5) retirar y desechar todo el sobrenadante de cada tubo; (6) lavar 2 veces de la siguiente manera: (a) añadir 200 pl de EtOH al 80 % recién preparado a cada tubo, (b) incubar en el soporte magnético durante 30 segundos y (c) retirar y desechar todo el sobrenadante de cada tubo; (7) usar una pipeta de 20 pl para retirar el EtOH residual de cada tubo; (8) secar al aire en el soporte magnético durante 5 minutos; (9) añadir 22,5 pl de RSB a cada tubo; (10) retirar del soporte magnético y luego mezclar completamente pipeteando hacia arriba y hacia abajo; (11) incubar a temperatura ambiente durante 2 minutos; (12) colocar en un soporte magnético y esperar hasta que el líquido se aclare (2-5 minutos); (13) transferir 20 gl de sobrenadante a un tubo nuevo; (14) cuantificar las bibliotecas si es necesario y proceder con el agrupamiento estándar para la plataforma HiSeq® 4000 que comienza con la etapa de desnaturalización de NaOH; y (15) almacenar a entre -25 °C y -15 °C si no se agrupan inmediatamente.
Ejemplo 2: Reducción del salto de índice mediante tratamiento con exonucleasa con bloqueo en 3' de bibliotecas indexadas con adaptadores protegidos
El protocolo de tratamiento expuesto anteriormente en el Ejemplo 1 se aplicó en combinación con los siguientes materiales, equipos y métodos para agrupar y secuenciar en la plataforma Illumina.
Condiciones experimentales: (1) biblioteca de NA12878 humano de 450 pb (Instituto Coriell) TrueSeq® sin PCR preparada usando adaptadores protegidos con fosforotioato cargados a 300 pM; (2) instrumento HiSeq® X y química Illumina SBS según las instrucciones del fabricante; (3) celda de flujo ILS v3 de 550 nm; (4) amplificación ExAmp como se describió anteriormente; y (5) adaptador adicionado al 50 %: adaptador bifurcado libre de la placa adaptadora dual (DAP) de Illumina adicionado a la biblioteca de moldes antes de la desnaturalización, la neutralización, la adición de la mezcla ExAmp y el agrupamiento.
Los resultados de este experimento se resumen en Tabla 3 siguiente y en la FIG. 9.
Tabla 3: Reducción del salto de índice por tratamiento con exonucleasa de adaptadores protegidos con bloqueo en 3'
Figure imgf000022_0001
Como se ilustró anteriormente, el salto de índice disminuía con el tratamiento con exonucleasa de los adaptadores protegidos combinado con el bloqueo en 3'.
Además de los documentos ya citados en esta solicitud, se hace referencia por la presente a tres solicitudes de patentes provisionales tituladas idénticamente "Compositions and methods for improving sample identification in indexed nucleic acid libraries" que se presentaron el mismo día que la solicitud provisional de la que la presente solicitud reivindica la prioridad (solicitud de patente provisional de EE. UU. n.° de expediente del apoderado 62/488.824 (US 10.975.430 B2), 62/488.825 (US 2018/0305753 A1) y 62/488.833 (US 10,934,58 B2), que se presentaron el 23 de abril de 2018).

Claims (16)

REIVINDICACIONES
1. Un método, que comprende:
proporcionar una primera pluralidad de fragmentos de polinucleótidos diana bicatenarios, teniendo cada fragmento un primer extremo y un segundo extremo;
proporcionar un primer oligonucleótido adaptador que comprende una primera hebra que tiene un extremo 5' y un extremo 3' y una segunda hebra que tiene un extremo 5' y un extremo 3',
en el que el primer oligonucleótido adaptador comprende (i) una región bicatenaria que comprende el extremo 5' de la primera hebra y el extremo 3' de la segunda hebra, y (ii) una región monocatenaria en la que la primera y la segunda hebra son monocatenarias, en el que la región monocatenaria comprende el extremo 3' de la primera hebra y el extremo 5' de la segunda hebra,
en el que el primer oligonucleótido adaptador comprende una primera secuencia específica de biblioteca,
en el que el extremo 3' de la primera hebra se modifica para evitar la digestión por una enzima que tiene actividad exonucleasa 3' y en el que el extremo 5' de la segunda hebra se modifica para evitar la digestión por una enzima que tiene actividad exonucleasa 5';
incubar el primer oligonucleótido adaptador y la primera pluralidad de fragmentos de polinucleótido diana bicatenario en condiciones adecuadas para ligar el extremo 5' de la primera hebra del primer adaptador y el extremo 3' de la segunda hebra del primer adaptador al primero y al segundo extremos de los fragmentos de polinucleótido diana bicatenarios para producir una primera biblioteca de polinucleótidos que comprende secuencias primer adaptador-diana-primer adaptador;
poner en contacto la primera biblioteca de polinucleótidos con una exonucleasa, en la que la exonucleasa comprende actividad exonucleasa monocatenaria 3' y 5', para degradar selectivamente los primeros oligonucleótidos adaptadores que no están ligados a los fragmentos polinucleotídicos diana bicatenarios; y proporcionar una segunda pluralidad de fragmentos de polinucleótidos diana bicatenarios, teniendo cada fragmento un primer extremo y un segundo extremo;
proporcionar un segundo oligonucleótido adaptador que comprende una primera hebra que tiene un extremo 5' y un extremo 3' y una segunda hebra que tiene un extremo 5' y un extremo 3',
en el que el segundo oligonucleótido adaptador comprende (i) una región bicatenaria que comprende el extremo 5' de la primera hebra y el extremo 3' de la segunda hebra, y (ii) una región monocatenaria que comprende el extremo 3' de la primera hebra y el extremo 5' de la segunda hebra,
en el que el extremo 3' de la primera hebra se modifica para evitar la digestión por una enzima que tiene actividad exonucleasa 3' y en el que el extremo 5' de la segunda hebra se modifica para evitar la digestión por una enzima que tiene actividad exonucleasa 5',
en el que el segundo adaptador comprende una segunda secuencia específica de biblioteca diferente de la primera secuencia específica de biblioteca;
incubar el segundo oligonucleótido adaptador y la segunda pluralidad de fragmentos de polinucleótido diana bicatenarios en condiciones adecuadas para ligar el extremo 5' de la primera hebra del segundo adaptador y el extremo 3' de la segunda hebra del segundo adaptador al primero y al segundo extremos de los fragmentos de polinucleótido diana bicatenarios para producir una segunda biblioteca de polinucleótidos que comprende secuencias segundo adaptador-diana-segundo adaptador; y
poner en contacto la segunda biblioteca de polinucleótidos con una exonucleasa, en la que la exonucleasa comprende actividad exonucleasa monocatenaria 3' y 5', para degradar selectivamente los segundos oligonucleótidos adaptadores que no están ligados a los fragmentos polinucleotídicos diana bicatenarios.
2. Un método según la reivindicación 1, en el que la exonucleasa que se pone en contacto con la primera biblioteca de polinucleótidos comprende una actividad para el ADN bicatenario sin mellas para degradar los fragmentos de polinucleótido diana bicatenarios a los que los primeros oligonucleótidos adaptadores no están ligados en ambos extremos; y/o
en el que la exonucleasa que se pone en contacto con la segunda biblioteca de polinucleótidos comprende una actividad para el ADN bicatenario sin mellas para degradar los fragmentos polinucleotídicos diana bicatenarios a los que los segundos oligonucleótidos adaptadores no están ligados en ambos extremos.
3. Un método según la reivindicación 1 o la reivindicación 2,
en el que el extremo 3' de la primera hebra del primer adaptador comprende un enlace fosforotioato, en el que una proteína de unión al ADN monocatenario está unida al extremo 3' de la primera hebra del primer adaptador, en el que la biotina está fijada al extremo 3' de la primera hebra del primer adaptador, o en el que un anticuerpo está fijado al extremo 3' de la primera hebra del primer adaptador;
el extremo 5' de la segunda hebra del primer adaptador comprende un enlace fosforotioato, en el que una proteína de unión al ADN monocatenario está unida al extremo 5' de la segunda hebra del primer adaptador, en el que la biotina está fijada al extremo 5' de la segunda hebra del primer adaptador, o en el que un anticuerpo está fijado al extremo 5' de la segunda hebra del primer adaptador; y/o
el extremo 3' de la primera hebra del segundo adaptador comprende un enlace fosforotioato, en el que una proteína de unión al ADN monocatenario está unida al extremo 3' de la primera hebra del segundo adaptador, en el que la biotina está fijada al extremo 3' de la primera hebra del segundo adaptador, o en el que un anticuerpo está fijado al extremo 3' de la primera hebra del segundo adaptador; y
el extremo 5' de la segunda hebra del segundo adaptador comprende un enlace fosforotioato, en el que una proteína de unión al ADN monocatenario está unida al extremo 5' de la segunda hebra del segundo adaptador, o en el que la biotina está fijada al extremo 5' de la segunda hebra del segundo adaptador, o en el que un anticuerpo está fijado al extremo 5' de la segunda hebra del segundo adaptador.
4. Un método según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en el que el extremo 3' de la primera hebra del primer y/o segundo adaptador comprende tres enlaces fosforotioato, y en el que el extremo 5' de la segunda hebra del primer y/o segundo adaptador comprende tres enlaces fosforotioato.
5. Un método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que se purifican la primera y/o la segunda biblioteca de polinucleótidos.
6. Un método según la reivindicación 5, en el que purificar la segunda biblioteca de polinucleótidos y purificar la primera biblioteca de polinucleótidos comprende combinar la primera y la segunda biblioteca de polinucleótidos y purificar simultáneamente la primera y la segunda biblioteca de polinucleótidos.
7. Un método según la reivindicación 6, que comprende, además:
proporcionar un sustrato que tiene una superficie que comprende una pluralidad de oligonucleótidos fijados que tienen un extremo 3' libre;
poner en contacto la superficie del sustrato con una composición que comprende la primera biblioteca purificada de polinucleótidos en condiciones que permitan la hibridación de una parte de una hebra del primer adaptador de las secuencias primer adaptador-diana-primer adaptador con al menos una parte de los oligonucleótidos fijados a la superficie del sustrato; y/o
proporcionar el sustrato que tiene una superficie que comprende una pluralidad de oligonucleótidos fijados que tienen un extremo 3' libre; y
poner en contacto la superficie del sustrato con una composición que comprende la segunda biblioteca purificada de polinucleótidos en condiciones que permitan la hibridación de una parte de una hebra del segundo adaptador de las secuencias del segundo adaptador-diana-segundo adaptador con al menos una parte de los oligonucleótidos fijados a la superficie del sustrato.
8. Un método según la reivindicación 7, que comprende, además:
extender los oligonucleótidos fijados a la superficie del sustrato desde el extremo 3' libre mediante la incorporación de nucleótidos complementarios de una secuencia de polinucleótidos primer adaptador-dianaprimer adaptador hibridados con los oligonucleótidos fijados para producir una copia del primer polinucleótido hibridado de biblioteca tal que la copia se fije a la superficie del sustrato; y/o
extender los oligonucleótidos fijados a la superficie del sustrato desde el extremo 3' libre mediante la incorporación de nucleótidos complementarios de una secuencia de polinucleótidos segundo adaptadordiana-segundo adaptador hibridados con los oligonucleótidos fijados para producir una copia del segundo polinucleótido hibridado de biblioteca tal que la copia se fije a la superficie del sustrato.
9. Un método según la reivindicación 8, que comprende además amplificar la copia del primer y/o segundo polinucleótido de biblioteca fijado a la superficie del sustrato.
10. Un kit que comprende:
un adaptador de oligonucleótidos para ligarse a un polinucleótido diana antes de la secuenciación, que comprende:
una primera hebra de oligonucleótidos que tiene un extremo 5' y un extremo 3'; y
una segunda hebra de oligonucleótidos que tiene un extremo 5' y un extremo 3',
en el que una región del extremo 5' de la primera hebra comprende nucleótidos complementarios de los nucleótidos en una región del extremo 3' de la segunda hebra tal que las regiones complementarias sean bicatenarias,
en el que una región del extremo 3' de la primera hebra y una región del extremo 5' de la segunda hebra son suficientemente no complementarias para ser monocatenarias,
en el que al menos una de la primera hebra y la segunda hebra comprende una secuencia de etiqueta de índice específica de biblioteca, y
en el que el extremo 3' de la primera hebra se modifica para evitar la digestión por una enzima que tiene actividad exonucleasa 3' y en el que el extremo 5' de la segunda hebra se modifica para evitar la digestión por una enzima que tiene actividad exonucleasa 5'; y
una exonucleasa.
11. Un kit según la reivindicación 10 que comprende dicho adaptador de oligonucleótidos,
en el que el extremo 3' de la primera hebra del adaptador de oligonucleótidos comprende un enlace fosforotioato, en el que una proteína de unión al ADN monocatenario está unida al extremo 3' de la primera hebra, en el que la biotina está fijada al extremo 3' de la primera hebra, en el que un anticuerpo está fijado al extremo 3' de la primera hebra; y
en el que el extremo 5' de la segunda hebra del adaptador de oligonucleótidos comprende un enlace fosforotioato, en el que una proteína de unión al ADN monocatenario está unida al extremo 5' de la segunda hebra, en el que la biotina está fijada al extremo 5' de la segunda hebra, o en el que un anticuerpo está fijado al extremo 5' de la segunda hebra.
12. Un kit según la reivindicación 10 o la reivindicación 11, en el que el extremo 3' de la primera hebra del adaptador de oligonucleótidos comprende tres enlaces fosforotioato, y en el que el extremo 5' de la segunda hebra del adaptador de oligonucleótidos comprende tres enlaces fosforotioato.
13. Un kit según la reivindicación 10, en el que la exonucleasa comprende actividad exonucleasa 3' y actividad exonucleasa 5'.
14. Un kit según la reivindicación 10 o la reivindicación 11, en el que la exonucleasa comprende actividad para el ADN bicatenario sin mellas.
15. Un kit según la reivindicación 10, en el que la exonucleasa comprende una primera exonucleasa que tiene actividad exonucleasa 3' y una segunda exonucleasa que tiene actividad exonucleasa 5'.
16. Un kit según la reivindicación 10, en el que la exonucleasa es exonucleasa V.
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