ES2929576T3

ES2929576T3 - Combinaciones de inhibidores de histona deacetilasa 6 y el inhibidor de Her2 lapatinib para el uso en el tratamiento del cáncer de mama

Info

Publication number: ES2929576T3
Application number: ES14851657T
Authority: ES
Inventors: David Lee Tamang; Min Yang; Simon S Jones
Original assignee: Acetylon Pharmaceuticals Inc
Current assignee: Acetylon Pharmaceuticals Inc
Priority date: 2013-10-08
Filing date: 2014-10-06
Publication date: 2022-11-30
Anticipated expiration: 2034-10-06
Also published as: EP3054952A1; US9403779B2; US20170020872A1; US20150099744A1; US10722512B2; WO2015054099A1; EP3054952B1; JP6626437B2; JP2016536286A; EP3054952A4

Abstract

La invención se refiere a combinaciones que comprenden un inhibidor de HDAC y un inhibidor de Her2 para el tratamiento del cáncer de mama en un sujeto que lo necesite. La invención también se refiere a combinaciones que comprenden un inhibidor de HDAC y un inhibidor de PI3K para el tratamiento del cáncer de mama en un sujeto que lo necesite. También se proporcionan en este documento métodos para tratar el cáncer de mama en un sujeto que lo necesite, que comprenden administrar al sujeto una cantidad eficaz de una de las combinaciones anteriores. Además se proporcionan métodos para inhibir la migración y/o la invasión de una célula de cáncer de mama en un sujeto mediante la administración al sujeto de un inhibidor específico de HDAC6. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Combinaciones de inhibidores de histona deacetilasa 6 y el inhibidor de Her2 lapatinib para el uso en el tratamiento del cáncer de mama

Referencia cruzada con las solicitudes relacionadas

Esta solicitud reivindica la prioridad de la solicitud provisional de los Estados Unidos con núm. de serie 61/888,207, presentada el 8 de octubre de 2013.

Antecedentes de la invención

El documento WO 2009/126662 se refiere a un método para tratar el cáncer en un paciente, que comprende administrar un inhibidor de HDAC y un inhibidor de HER-2. Sadeghi N y otros, Future Medicinal Chemistry, Future Science Ltd, GB, vol. 4, no. 9, 1 de junio de 2012, páginas 1153-1169, XP008166436, ISSN: 1756-8919, DOI: 10,4155/FMC. 12,56 se relaciona con “Targeting the PI3K pathway for cancer therapy”. El documento US 2008/182865 se refiere al uso de una combinación de inhibidores de histona deacetilasa e inhibidores de quinasa con actividad anti-EGFR.

El receptor de estrógeno (RE) y el Her2 sobreexpresado son dos proteínas oncogénicas importantes en los cánceres de mama con hormonas positivas. Se ha demostrado que los tratamientos corrientes para bloquear ER o Her2, ralentizan eficazmente el crecimiento tumoral. Sin embargo, la necesidad de superar la resistencia a los medicamentos que surge ha llevado al desarrollo de fármacos combinados y adyuvantes como nuevos enfoques terapéuticos.

Las fosfatidilinositol-3-quinasas (PI 3-quinasas, PI3K, PI(3)K, PI-3K, fosfatidilinositol-3-quinasas o fosfoinositida 3-quinasas) son una familia de las enzimas que participan en las funciones celulares, como el crecimiento, la proliferación celular, diferenciación, motilidad, supervivencia y el tráfico intracelular, que a su vez están implicados en el cáncer. Las PI3K son una familia de enzimas transductoras de señales intracelulares relacionadas, capaces de fosforilar el grupo hidroxilo de la posición 3 del anillo de inositol del fosfatidilinositol.

La inhibición de la histona deacetilasa (HDAC) puede detener el crecimiento de las células del cáncer de mama y se ha informado que reprime la transcripción tanto de ER como de Her2. Sin embargo, la inhibición de HDAC de Clase I conduce a efectos adversos significativos y es deseable un perfil conveniente de inhibición de HDAC, particularmente en combinación con otros agentes terapéuticos.

HDAC6 es una HDAC de clase llb y se sabe que elimina los grupos acetilo de muchas proteínas celulares, incluidas la a-tubulina y HSP90. Se ha informado que la hiperacetilación de HSP90 desestabiliza sus proteínas diana, incluidas ER y EGFR. Los inhibidores de HDAC6 han demostrado actividad proliferativa anticancerígena en varios tipos de cáncer, incluido cáncer de mama Her2+. Se ha demostrado que el bloqueo de la actividad de HDAC6 causa inhibición del crecimiento de células de cáncer de mama Her2+, a través de varios mecanismos, incluida la desestabilización del ARNm y la proteína Her2.

Debido a las toxicidades limitantes de la dosis de los inhibidores de la HDAC no selectivos, existe una necesidad continua en la técnica de composiciones y métodos más efectivos y menos tóxicos para el tratamiento del cáncer de mama. Con el fin de satisfacer estas necesidades, en la presente descripción se proporcionan combinaciones farmacéuticas para usar en el tratamiento del cáncer de mama que comprenden un inhibidor de HDAC y un inhibidor de Her2. Las combinaciones de la invención se toleran bien y no exhiben las toxicidades limitantes de la dosis de las terapias anteriores.

Resumen de la invención

La presente invención proporciona una combinación farmacéutica para usar en el tratamiento del cáncer de mama que comprende una cantidad terapéuticamente efectiva de un inhibidor de histona deacetilasa (HDAC) o una de sus sales farmacéuticamente aceptables, y un inhibidor de Her2 o una de sus sales farmacéuticamente aceptables, en donde el inhibidor de Her2 es lapatinib; y en donde el inhibidor de HDAC es:

El inhibidor de HDAC es un inhibidor específico de HDAC6. El inhibidor específico de HDAC6 es

o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo; o

o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

El inhibidor de Her2 es lapatinib o sales farmacéuticamente aceptables del mismo.

En algunas modalidades, el inhibidor de HDAC y el inhibidor de Her2 se administran con un portador farmacéuticamente aceptable.

En algunas modalidades, el inhibidor de HDAC y el inhibidor de Her2 se administran en formas de dosificación separadas. En otras modalidades, el inhibidor de HDAC y el inhibidor de Her2, se administran en una forma de dosificación única.

En algunas modalidades, el inhibidor de HDAC y el inhibidor de Her2 se administran en momentos diferentes. En otras modalidades, el inhibidor de HDAC y el inhibidor de Her2, se administran sustancialmente al mismo tiempo. En algunas modalidades, la combinación del inhibidor de HDAC y el inhibidor de Her2 logra un efecto sinérgico en el tratamiento del sujeto que lo necesita.

En modalidades específicas del uso, el inhibidor específico de HDAC6 es:

o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo; y el inhibidor de Her2 es el lapatinib, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

En modalidades específicas del uso, el inhibidor específico de HDAC6 es:

En la presente descripción se describen métodos para inhibir la migración y/o la invasión de una célula de cáncer de mama en un sujeto que lo necesita, que comprenden administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente efectiva de un inhibidor específico de histona deacetilasa 6 (HDAC6) o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo. El inhibidor específico de HDAC6 puede ser cualquier compuesto seleccionado del grupo que consiste en Compuesto A y Compuesto B.

Otros objetivos, características y ventajas se evidenciarán a partir de la siguiente descripción detallada. Además, los ejemplos demuestran el principio de la invención.

Breve descripción de las figuras

La figura 1 es un conjunto de cuatro gráficos que muestran que el inhibidor de PI3K GDC-0941 es potenciado por inhibidores específicos (selectivos) de HDAC6. La figura 1A muestra los valores IC50 para GDC-0941 a 0,05, 0,16, 0,5, 1,6, 5 y 16 pM del compuesto A. la figura 1B muestra los valores IC50 para GDC-0941 a 1,3, 4 y 12 pM del compuesto A. La figura 1C muestra los valores IC50 para GDC-0941 a 1,3, 4 y 12 pM del Compuesto C (no dentro del alcance de la presente invención reivindicada). La figura ID muestra los valores de IC⁵⁰para GDC-0941 a 0,5, 1,6 y 5 pM del Compuesto C (no dentro del alcance de la presente invención reivindicada).

La figura 2 es un par de gráficos que muestran los resultados de los ensayos de migración en células A549 (células de cáncer de pulmón) (Figura 2A) y células MDA-MB-231 (células de cáncer de mama) (Figura 2B) en las que no se utilizó EGF para estimular la migración de las células cancerosas. En ambos ensayos, no hubo pre-tratamiento con el inhibidor de HDAC6. En ambos ensayos, la Tubastatina A, el Compuesto C (no dentro del alcance de la presente invención reivindicada) y el Compuesto A se administraron en concentraciones en las que los fármacos son inhibidores selectivos de HDAC6. Gefitinib es un inhibidor de EGFR. ** significa P <0,01.

La figura 3 es un par de gráficos que muestran los resultados de los ensayos de migración en células A549 (células de cáncer de pulmón) (Figura 3A) y células MDA-MB-231 (células de cáncer de mama) (Figura 3B) en las que se utilizó EGF para estimular la migración de las células cancerosas. En la figura 3A, no hubo pretratamiento con el inhibidor de HDAC6. Por otro lado, en la figura 3B, hubo pretratamiento con el inhibidor de HDAC, ya que los inhibidores de HDAC6 tardan en actuar. En ambos ensayos, la Tubastatina A, el Compuesto C (no dentro del alcance de la presente invención reivindicada) y el Compuesto A se administraron en concentraciones en las que los fármacos son inhibidores selectivos de HDAC6. Gefitinib es un inhibidor de EGFR. Prueba t de dos colas de dos muestras de igual varianza, normalizada frente al grupo DMSO EGF. ** significa P < 0,01, * significa P < 0,05.

La figura 4 es un conjunto de fotografías que muestran la migración de MDA-MB-231 en DMSO (Figura 4A), 1 Gefitinib 5 pM (Figura 4^b), el Compuesto C (no dentro del alcance de la invención actualmente reivindicada) (Figura 4C), Tubastatina A 5 pM (Figura 4D) y 0,5 pM del Compuesto A (Figura 4E). Gefitinib es un inhibidor de EGFR. La figura 5 es un par de gráficos que muestran los resultados de los ensayos de invasión en células A549 (células de cáncer de pulmón) (Figura 5A) y células MDA-MB-231 (células de cáncer de mama) (Figura 5B), en las que se utilizó EGF para estimular la migración de células cancerosas. En ambos ensayos, la Tubastatina A, el Compuesto C (no dentro del alcance de la presente invención reivindicada) y el Compuesto A se administraron en concentraciones en las que los fármacos son inhibidores selectivos de HDAC6. Gefitinib es un inhibidor de EGFR. En la figura 5A, *** significa P < 0,001, ** significa P < 0,01 y * significa P < 0,05. En la figura 5B, * significa P < 0,05.

Descripción detallada

La presente solicitud está dirigida, generalmente, a una combinación farmacéutica para su uso en el tratamiento del cáncer de mama que comprende un inhibidor de histona deacetilasa (HDAC) y un inhibidor de Her2.

Definiciones

Más abajo se mencionan las definiciones de diversos términos usados para describir esta invención. Estas definiciones se aplican a los términos a medida que se usan a lo largo de esta descripción y reivindicaciones, a menos que se limite de cualquier otra manera en casos específicos, ya sea individualmente o como parte de un grupo más grande.

El término "aproximadamente", generalmente indica una posible variación de no más del 10 %, 5 % o 1 % de un valor. Por ejemplo, "aproximadamente 25 mg/kg" indicará, generalmente, en su sentido más amplio, un valor de 22,5-27,5 mg/kg, es decir, 25 ± 2,5 mg/kg.

El término "combinación", se refiere a dos o más agentes terapéuticos para tratar una condición o trastorno terapéutico, descritos en la presente descripción. Tal combinación de agentes terapéuticos puede estar en forma de una sola píldora, cápsula o solución intravenosa. Sin embargo, el término "combinación" abarca además la situación en la que los dos o más agentes terapéuticos están en píldoras, cápsulas o soluciones intravenosas separadas. Igualmente, el término "terapia de combinación", se refiere a la administración de dos o más agentes terapéuticos para tratar una condición o trastorno terapéutico descritos en la presente descripción. Tal administración comprende la coadministración de estos agentes terapéuticos de una manera sustancialmente simultánea, como en una única cápsula que tiene una relación fija de los ingredientes activos o en envases múltiples, separados (por ejemplo, cápsulas) para cada ingrediente activo. Además, dicha administración abarca además el uso de cada tipo de agente terapéutico de una manera secuencial, ya sea aproximadamente al mismo tiempo o a diferentes tiempos. En cualquier caso, el régimen de tratamiento proporcionará efectos beneficiosos de la combinación de fármacos en el tratamiento de las afecciones o los trastornos descritos en la presente descripción.

El término "la HDAC" se refiere a la histona deacetilasas, que son las enzimas que eliminan los grupos acetilo de los residuos de lisina en las histonas centrales, lo que conduce a la formación de una cromatina condensada y silenciada transcripcionalmente. Actualmente hay 18 histonas deacetilasas conocidas, que se clasifican en cuatro grupos. Las HDAC de clase I, que incluyen la ^hD^aC1, HDAC2, HDAC3 y la HDAC8, se relacionan con el gen de la levadura RPD3. Las HDAC de clase II, que incluyen la HDAC4, HDAC5, HDAC6, HDAC7, HDAC9 y la HDAC10, se relacionan con el gen de la Hdal de levadura. Las HDAC de clase III, que se conocen además como sirtuinas, se relacionan con el gen Sir2 e incluyen al SIRT1-7. Las HDAC de clase IV, que solo contienen la HDAC11, tienen características de las HDAC de clase I y II. El término "la HDAC" se refiere a una cualquiera o más de las 18 histonas deacetilasas conocidas, a menos que se especifique de cualquier otra manera.

El término "específico de HDAC6" significa que el compuesto se une a la HDAC6 en un grado sustancialmente mayor, como 5X, 10X, 15X, 20X o más, que a cualquier otro tipo de enzima HDAC, como la HDAC1 o la HDAC2. Es decir, el compuesto es selectivo para la HDAC6 sobre cualquier otro tipo de enzima HDAC. Por ejemplo, un compuesto que se une a la HDAC6 con un IC⁵⁰de 10 nM y a la HDAC1 con un IC⁵⁰de 50 nM es específico de HDAC6. Por otro lado, un compuesto que se une a la HDAC6 con un IC⁵⁰de 50 nM y a la HDAC 1 con un IC⁵⁰de 60 nM no es específico de HDAC6

El término "inhibidor" es sinónimo del término antagonista.

Inhibidores de la histona deacetilasa (HDAC)

En la presente descripción se proporcionan combinaciones farmacéuticas para el tratamiento del cáncer de mama en un sujeto que lo necesita.

Las combinaciones de la invención para usar comprenden un inhibidor de la histona deacetilasa (HDAC). El inhibidor de HDAC es un inhibidor específico de HDAC6. El inhibidor específico de HDAC6 es el Compuesto A o el Compuesto B (más abajo), o una de sus sales farmacéuticamente aceptable:

La preparación y las propiedades de los inhibidores selectivos de HDAC6, Compuestos A y B, se proporcionan en la solicitud de patente internacional núm. PCT/US2011/021982.

También se describen, pero no están dentro del alcance de la presente invención reivindicada, los Compuestos C y D:

La preparación y las propiedades de los inhibidores selectivos de HDAC6 de acuerdo con los Compuestos C y D, se proporcionan en la solicitud de patente internacional núm. PCT/US2011/060791.

En algunas modalidades, los compuestos descritos en la presente descripción, no están solvatados. En otras modalidades, uno o más de los compuestos están en forma solvatada. Como se conoce en la técnica, el solvato puede ser cualquier solvente farmacéuticamente aceptable, como el agua y el etanol.

Inhibidores Her2

La combinación para el uso de la invención comprende un inhibidor de Her2. El inhibidor de Her2 es lapatinib o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

Inhibidores de la fosfoinositida 3-quinasa 1P13K1

También se discuten en la presente descripción los inhibidores de PI3K. Los ejemplos de inhibidores de PI3K incluyen Wortmannina, demetoxiviridina, LY294002, perifosina, CAL-101, PX-866, IPI-145, BAY 80-6946, BEZ-235, RP-6503, TGR 1202, SF-1126, INK-1117, GDC-0941, BKM-120, XL-147, XL-765, Palomid 529, GSK-1059615, ZSTK-474, PWT-33597, IC-87114, TG100-115, CAL-263, RP-6530, PI-103, GNE-477, CUDC-907 y AEZS-136. Combinaciones farmacéuticas

En la presente descripción se proporcionan combinaciones para el tratamiento del cáncer de mama en un sujeto que lo necesita. Se proporcionan combinaciones que comprenden un inhibidor de histona deacetilasa (HDAC) y un inhibidor de Her2 para el tratamiento del cáncer de mama en un sujeto que lo necesita.

El inhibidor de HDAC es un inhibidor específico de HDAC6. El inhibidor específico de HDAC6 es:

o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo; o

o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

El inhibidor de Her2 es lapatinib o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

Aunque los compuestos A y B se representan en sus formas neutras, en algunas modalidades, estos compuestos se usan en forma de una sal farmacéuticamente aceptable. Como se usa en la presente descripción, "sales farmacéuticamente aceptables" se refiere a los derivados de los compuestos descritos en donde, el compuesto precursor, se modifica mediante la conversión de una porción de ácido o base existente en su forma de sal. Los ejemplos de las sales farmacéuticamente aceptables incluyen las sales de los ácidos orgánicos o minerales de los residuos básicos tales como las aminas; álcali o sales orgánicas de los residuos ácidos tales como los ácidos carboxílicos. Las sales farmacéuticamente aceptables de la presente invención incluyen las sales no tóxicas convencionales del compuesto precursor formado, por ejemplo, a partir de los ácidos orgánicos o inorgánicos no tóxicos. Las sales farmacéuticamente aceptables de la presente invención pueden sintetizarse a partir del compuesto precursor que contiene una porción básica o ácida, mediante los métodos químicos convencionales. Generalmente, tales sales pueden prepararse al hacer reaccionar las formas ácidas o bases libres de estos compuestos con una cantidad estequiométrica de la base o el ácido apropiados en agua o en un solvente orgánico, o en una mezcla de los dos; generalmente, se prefieren los medios no acuosos como el éter, acetato de etilo, etanol, isopropanol o acetonitrilo. Listas de sales adecuadas se encuentran en Remington's Pharmaceutical Sciences, 17th ed., Mack Publishing Company, Easton, Pa., 1985, p. 1418 y Journal of Pharmaceutical Science, 66, 2 (1977).

Dosis/Administración

En algunas modalidades, el inhibidor de HDAC (compuesto A o B) se administra simultáneamente con el inhibidor de Her2. La administración simultánea típicamente significa que ambos compuestos ingresan al paciente exactamente al mismo tiempo. Sin embargo, la administración simultánea incluye además la posibilidad de que el inhibidor de HDAC y el inhibidor de Her2 ingresen al paciente en diferentes tiempos, pero la diferencia de tiempo es lo suficientemente minúscula como para que el primer compuesto administrado no tenga el tiempo para hacer efecto en el paciente antes de la entrada del segundo compuesto administrado. Dichos tiempos de retardo corresponden típicamente a menos de 1 minuto y, más típicamente, a menos de 30 segundos. En un ejemplo, en donde los compuestos están en solución, puede lograrse la administración simultánea mediante la administración de una solución que contenga la combinación de los compuestos. En otro ejemplo, puede emplearse la administración simultánea de las soluciones separadas, una de las cuales contiene el inhibidor de HDAC y la otra contiene el inhibidor de Her2. En un ejemplo, en donde los compuestos están en forma sólida, puede lograrse la administración simultánea mediante la administración de una composición que contiene la combinación de los compuestos. Alternativamente, la administración simultánea puede lograrse mediante la administración de dos composiciones separadas, una que comprende el inhibidor de HDAC y la otra que comprende el inhibidor de Her2.

En otras modalidades, el inhibidor de HDAC y el inhibidor de Her2 no se administran simultáneamente. En algunas modalidades, el inhibidor de HDAC se administra antes que el inhibidor de Her2. En otras modalidades, el inhibidor de Her2 se administra antes que el inhibidor de HDAC. La diferencia en los tiempos de las administraciones no simultáneas puede ser superior a 1 minuto, cinco minutos, 10 minutos, 15 minutos, 30 minutos, 45 minutos, 60 minutos, dos horas, tres horas, seis horas, nueve horas, 12 horas, 24 horas, 36 horas, o 48 horas. En otras modalidades, se proporciona tiempo al primer compuesto administrado para que surta efecto en el paciente antes de que se administre el segundo compuesto administrado. Generalmente, la diferencia del tiempo no se extiende más allá del tiempo para que el primer compuesto administrado complete su efecto en el paciente, o más allá del tiempo en que el primer compuesto administrado se elimina o desactiva completa o sustancialmente en el paciente.

En algunas modalidades, tanto el inhibidor de HDAC como el inhibidor de Her2, se administran en una cantidad o dosificación terapéuticamente efectiva. Una "cantidad terapéuticamente efectiva" es una cantidad de inhibidor de HDAC6 (compuesto A o B) o un inhibidor de Her2 que, cuando se administra a un paciente por sí solo, trata de manera efectiva el cáncer de mama. Una cantidad que demuestra ser una "cantidad terapéuticamente efectiva" en un caso dado, para un sujeto en particular, puede no ser efectiva para el 100 % de los individuos tratados de manera similar por la enfermedad o la afección en consideración, incluso aunque dicha dosis se considere una "cantidad terapéuticamente efectiva" por profesionales expertos. La cantidad del compuesto que corresponde a una cantidad terapéuticamente efectiva depende en gran medida del tipo de cáncer, la etapa del cáncer, la edad del paciente que se está tratando y otros factores. Generalmente, las cantidades terapéuticamente efectivas de estos compuestos son bien conocidas en la técnica, tal como se proporciona en las referencias de apoyo citadas anteriormente.

En otras modalidades, el inhibidor de Her2 se administra en una cantidad o dosificación subterapéuticamente efectiva. Una cantidad subterapéuticamente efectiva es una cantidad del inhibidor de Her2 que, cuando se administra a un paciente por sí solo, no inhibe completamente en el tiempo de la actividad biológica del objetivo pretendido.

Ya sea que se administre en cantidades terapéuticas o subterapéuticas, la combinación del inhibidor de HDAC y el inhibidor de Her2 debería ser efectiva en el tratamiento del cáncer de mama. Por ejemplo, una cantidad subterapéutica de un compuesto del inhibidor de Her2 puede ser una cantidad efectiva si, cuando se combina con el compuesto A o B (inhibidor de HDAC), la combinación es efectiva en el tratamiento del cáncer de mama.

En algunas modalidades, la combinación de los compuestos exhibe un efecto sinérgico (es decir, mayor que el efecto aditivo) en el tratamiento del cáncer de mama. El término "efecto sinérgico" se refiere a la acción de dos agentes, tales como, por ejemplo, un inhibidor de HDAC y un inhibidor de Her2, que producen un efecto, por ejemplo, que retarda la progresión sintomática del cáncer o los síntomas del mismo, que es mayor que la simple adición de los efectos de cada fármaco administrado por sí solo. Puede calcularse un efecto sinérgico, por ejemplo, mediante el uso de los métodos adecuados como la ecuación Sigmoide-Emáx (Holford, N. H. G. and Scheiner, L. B., Clin. Pharmacokinet. 6: 429-453 (1981)), la ecuación de aditividad de Loewe (Loewe, S. y Muischnek, H., Arch. Exp. Pathol Pharmacol. 114: 313-326 (1926)) y la ecuación del efecto mediano (Chou, T. C. y Talalay, P., Adv. Enzyme Regul. 22: 27-55 (1984)). Cada ecuación mencionada anteriormente puede aplicarse a los datos experimentales para generar un gráfico correspondiente que ayude a evaluar los efectos de la combinación de los fármacos. Los gráficos correspondientes asociados con las ecuaciones referidas anteriormente son la curva de efecto de la concentración, curva de isobolograma y curva índice de combinación, respectivamente.

En diferentes modalidades, en dependencia de la combinación y las cantidades efectivas usadas, la combinación de los compuestos puede inhibir el crecimiento del cáncer, lograr la estasis del cáncer de mama o incluso lograr una regresión sustancial o completa del cáncer.

Si bien las cantidades de un inhibidor de HDAC y un inhibidor de Her2 deberían dar como resultado el tratamiento efectivo del cáncer de mama, las cantidades, cuando se combinan, preferentemente no son excesivamente tóxicas para el paciente (es decir, las cantidades están preferentemente dentro de los límites de la toxicidad establecidos por las guías médicas). En algunas modalidades, ya sea para prevenir una toxicidad excesiva y/o proporcionar un tratamiento más eficaz del cáncer de mama, se proporciona una limitación en la dosis total administrada. Típicamente, las cantidades consideradas en la presente descripción son por día; sin embargo, los ciclos de medio día y de dos o tres días se consideran además en la presente.

Se pueden usar diferentes regímenes de dosificación para tratar el cáncer de mama. En algunas modalidades, una dosis diaria, como cualquiera de las dosis ilustrativas descritas anteriormente, se administra una, dos, tres o cuatro veces al día durante tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve o diez días. En dependencia de la etapa y la gravedad del cáncer de mama, un tiempo de tratamiento más corto (por ejemplo, hasta cinco días) puede emplearse junto con una dosis alta o puede emplearse un tiempo de tratamiento más prolongado (por ejemplo, diez o más días, o semanas, o un mes, o más) junto con una dosis baja. En algunas modalidades, se administra una dosis de una o dos veces al día en días alternos. En algunas modalidades, cada dosis contiene tanto un inhibidor de HDAC como un inhibidor de Her2 a suministrar como una dosis única, mientras que, en otras modalidades, cada dosis contiene un inhibidor de HDAC y un inhibidor de Her2 a suministrar en dosis separadas.

Los compuestos A y B, o sus sales o formas solvatos farmacéuticamente aceptables, en forma pura o en una composición farmacéutica apropiada, pueden administrarse mediante cualquiera de los modos de administración aceptados o agentes conocidos en la técnica. Los compuestos pueden administrarse, por ejemplo, oralmente, nasalmente, parenteralmente (intravenosa, intramuscular o subcutánea), tópicamente, transdérmicamente, intravaginalmente, intravesicalmente, intracisternalmente o rectalmente. La forma de dosificación puede ser, por ejemplo, un polvo liofilizado, o una dosis líquida, como, por ejemplo, tabletas, píldoras, cápsulas de gelatina blanda elástica o dura, polvos, soluciones, suspensiones, supositorios, aerosoles, o similares, preferentemente en formas de dosificación unitarias adecuadas para la administración simple de dosis precisas. Una ruta de administración particular es la oral, particularmente una en la que puede ajustarse un régimen de dosificación diario conveniente de acuerdo con el grado de gravedad de la enfermedad a tratar.

Como se discutió anteriormente, el inhibidor de HDAC y el inhibidor de Her2 de la combinación farmacéutica pueden administrarse en una sola dosis unitaria o en formas de dosificación separadas. En consecuencia, la frase "combinación farmacéutica" incluye una combinación de dos fármacos en una forma de dosificación única o en formas de dosificación separadas, es decir, los portadores y excipientes farmacéuticamente aceptables descritos a lo largo de la solicitud pueden combinarse con un inhibidor de HDAC y un inhibidor de Her2 en una sola dosis unitaria, así como también combinarse individualmente con un inhibidor de HDAC y un inhibidor de Her2, cuando estos compuestos se administran por separado.

Los agentes auxiliares y adyuvantes pueden incluir, por ejemplo, agentes conservantes, humectantes, de suspensión, edulcorantes, aromatizantes, perfumes, emulsionantes y dispensadores. La prevención de la acción de los microorganismos generalmente la proporcionan diversos agentes antibacterianos y antifúngicos, tales como los parabenos, clorobutanol, fenol y el ácido sórbico. Pueden incluirse además los agentes isotónicos, como los azúcares y el cloruro de sodio. La absorción prolongada de una forma farmacéutica inyectable puede conseguirse mediante el uso de los agentes que retrasen la absorción, por ejemplo, el monoestearato de aluminio y la gelatina. Los agentes auxiliares pueden incluir además los agentes humectantes, agentes emulsionantes, agentes tamponantes del pH y antioxidantes, tales como, por ejemplo, el ácido cítrico, monolaurato de sorbitán, oleato de trietanolamjna e hidroxitolueno butilado.

Las formas de dosificación sólidas pueden prepararse con revestimientos y cubiertas, tales como los revestimientos entéricos y otros bien conocidos en la técnica. Ellos pueden contener agentes apaciguadores y pueden ser de una composición tal que liberen el compuesto o compuestos activos en una cierta parte del tracto intestinal en una manera retardada. Los ejemplos de composiciones embebidas que pueden usarse son sustancias poliméricas y ceras. Los compuestos activos pueden estar además en forma microencapsulada, si es apropiado, con uno o más de los excipientes mencionados anteriormente.

Las formas de dosificación líquidas para la administración oral incluyen emulsiones, soluciones, suspensiones, jarabes y elíxires farmacéuticamente aceptables. Dichas formas de dosificación se preparan, por ejemplo, disolviendo, dispersando, etc., los inhibidores de la HDAC o los inhibidores de Her2 descritos en la presente descripción, o una sal farmacéuticamente aceptable de estos, y los adyuvantes farmacéuticos opcionales en un portador, tal como, por ejemplo, el agua, solución salina, dextrosa acuosa, glicerol y etanol; los agentes solubilizantes y emulsionantes, como por ejemplo, el alcohol etílico, alcohol isopropílico, carbonato de etilo, acetato de etilo, alcohol bencílico, benzoato de bencilo, propilenglicol, 1,3-butilenglicol, dimetilformamida; los aceites, particularmente, el aceite de semilla de algodón, aceite de cacahuete, aceite de germen de maíz, aceite de oliva, aceite de ricino y aceite de sésamo, glicerol, alcohol tetrahidrofurfurílico, polietilenglicoles y los ésteres de los ácidos grasos de sorbitán; o las mezclas de estas sustancias, para formar de esta manera una solución o suspensión. Generalmente, en dependencia del modo de administración pretendido, las composiciones farmacéuticamente aceptables contendrán aproximadamente de 1 % a aproximadamente 99 % en peso, de los compuestos descritos en la presente, o una sal farmacéuticamente aceptable de estos, y de 99 % a 1 % en peso de un excipiente farmacéuticamente aceptable. En un ejemplo, la composición estará entre aproximadamente el 5 % y aproximadamente el 75 % en peso de un compuesto descrito en la presente descripción, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, siendo el resto excipientes farmacéuticos adecuados.

Los métodos corrientes para preparar esas formas de dosificación se conocen, o resultarán evidentes, para los expertos en esta técnica. Se hace referencia, por ejemplo, a Remington's Pharmaceutical Sciences, 18va Ed. (Mack Publishing Company, Easton, Pa., 1990).

Métodos

Se describen métodos (que no están dentro del alcance de la presente invención reivindicada) para tratar el cáncer de mama en un sujeto que lo necesita, que comprenden administrar al sujeto una combinación farmacéutica para el uso de la invención. Por tanto, en la presente descripción se proporcionan métodos para tratar el cáncer de mama en un sujeto que lo necesita, que comprenden administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente efectiva de una combinación que comprende un inhibidor de HDAC y un inhibidor de Her2.

El sujeto considerado en la presente descripción es típicamente un ser humano. Sin embargo, el sujeto puede ser cualquier mamífero para el que se desee un tratamiento. Así, los métodos descritos en la presente descripción pueden aplicarse tanto a las aplicaciones humanas como las veterinarias.

Los términos "tratar" o "tratamiento" indican que el método ha mitigado, al menos, la proliferación celular anormal. Por ejemplo, el método puede reducir la velocidad de crecimiento del cáncer de mama en un paciente, o prevenir el crecimiento continuo o la propagación del cáncer de mama, o incluso reducir el alcance global del cáncer de mama. Como tal, en la presente descripción se proporciona un método para tratar el cáncer de mama en un sujeto que lo necesita, que comprende administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente efectiva de Compuesto A y lapatinib, o sales farmacéuticamente aceptables de los mismos.

También se describe un método para tratar el cáncer de mama en un sujeto que lo necesita, que comprende administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente efectiva de Compuesto B y lapatinib, o sales farmacéuticamente aceptables de los mismos.

Ejemplos

Más abajo se exponen los ejemplos con el propósito de ilustrar y describir ciertas modalidades específicas de la invención. Sin embargo, el alcance de las reivindicaciones no debe limitarse de ninguna manera por los ejemplos expuestos en la presente descripción. Las definiciones de las variables en las estructuras de los esquemas de la presente descripción, son proporcionales a las de las posiciones correspondientes en las fórmulas presentadas en la presente descripción.

La síntesis de los compuestos de Fórmula I (Compuestos A y B) se proporciona en el documento PCT/US2011/021982. La síntesis de los compuestos de Fórmula II (Compuestos C y D) (que no están dentro del alcance de la presente invención reivindicada) se proporciona en el documento PCT/US2011/060791.

Ejemplo 1: Síntesis del 2-(d¡fen¡lam¡no)-N-(7-h¡drox¡am¡no)-7-oxohept¡l)p¡rim¡d¡na-5-carboxam¡da (Compuesto A)

Esquema de reacción

Síntesis del compuesto intermedio 2: Una mezcla de anilina (3,7 g, 40 mmol), compuesto 1 (7,5 g, 40 mmol) y K2CO3 (11 g, 80 mmol) en DMF (100 mL), se desgasificó y se agitó a 1200 C bajo N2 durante toda la noche. La mezcla de reacción se enfrió a r.t. y se diluyó con EtOAc (200 mL), luego se lavó con salmuera saturada (200 mL x 3). Las capas orgánicas se separaron y se secaron sobre Na2SC>4, se evaporó a sequedad y se purificó mediante cromatografía en gel de sílice (éteres de petróleo/EtOAc = 10/1) para dar el producto deseado en forma de un sólido blanco (6,2 g, 64 %).

Síntesis del compuesto intermedio 3: Una mezcla del compuesto 2 (6,2 g, 25 mmol), yodobenceno (6,12 g, 30 mmol), CuI (955 mg, 5,0 mmol), CS2CO3 (16,3 g, 50 mmol) en T^eO^s(200 mL) se desgasificó y se purgó con nitrógeno. La mezcla resultante se agitó a 140 °C durante 14 horas. Después de enfriar a temperatura ambiente, el residuo se diluyó con EtOAc (200 mL). EtOH al 95 % (200 mL) y N^h4^f-H2O en gel de sílice [50 g, preparado previamente mediante la adición de NH4F (100 g) en agua (1500 mL) a gel de sílice (500 g, 100-200 mesh)] y la mezcla resultante se mantuvo a r.t. durante 2 horas. Los materiales sólidos se filtraron y se lavaron con EtOAc. El filtrado se evaporó hasta secarse y el residuo se purificó mediante cromatografía en gel de sílice (éteres de petróleo/EtOAc = 10/1) para dar un sólido amarillo (3 g, 38 %).

Síntesis del compuesto intermedio 4: Se añadió NaOH 2 N (200 mL) a una solución del compuesto 3 (3,0 g, 9,4 mmol) en EtOH (200 mL). La mezcla se agitó a 600 C durante 30 min. Después de la evaporación del solvente, la solución se neutralizó con HCl 2 N para dar un precipitado blanco. La suspensión se extrajo con EtOAc (2 x 200 mL) y las capas orgánicas se separaron, se lavaron con agua (2 x 100 mL), salmuera (2 x 100 mL) y se secaron sobre Na2SO4. La eliminación del solvente dio un sólido marrón (2,5 g, 92 %).

Síntesis del compuesto intermedio 6: Una mezcla del compuesto 4 (2,5 g, 8,58 mmol), compuesto 5 (2,52 g, 12,87 mmol), HATU (3,91 g, 10,30 mmol) y DIPEA (4,43 g, 34,32 mmol) se agitaron a temperatura ambiente durante toda la noche. Después de filtrar la mezcla de reacción, el filtrado se evaporó hasta secarse y el residuo se purificó mediante cromatografía en gel de sílice (éteres de petróleo/EtOAc = 2/1) para dar un sólido marrón (2 g, 54 %). Síntesis del 2-(difenilamino)-N-(7-(hidroxiamino)-7-oxoheptil)pirimidina-5-carboxamida (Compuesto A): Una mezcla del compuesto 6 (2,0 g, 4,6 mmol), hidróxido de sodio (2 N, 20 mL) en MeOH (50 mL) y DCM (25 mL) se agitó a 00C durante 10 min. Se enfrió hidroxilamina (50 %) (10 mL) a 00C y se añadió a la mezcla. La mezcla resultante se agitó a r.t. durante 20 min. Después de eliminar el solvente, la mezcla se neutralizó con HCl 1 M para dar un precipitado blanco. El producto bruto se filtró y se purificó mediante pre-HPLC para dar un sólido blanco (950 mg, 48 %).

Ejemplo 2: Síntesis del 2-(2-clorofenil)fenil)amino)-N-7-hidroxiamino)-7-oxoheptil)pirimidina-5-carboxamida (Compuesto B)

Síntesis del compuesto intermedio 2: Ver la síntesis del compuesto intermedio 2 en el Ejemplo 1.

Síntesis del compuesto intermedio 3: Una mezcla del compuesto 2 (69,2 g, 1 equiv.), 1-cloro-2-yodobenceno (135,7 g, 2 equiv.), U2CO3 (42,04 g, 2 equiv.), K2CO3 (39,32 g, 1 equiv.), Cu (i equiv. 45 |jm) en DMSO (690 ml) se desgasificó y se purgó con nitrógeno. La mezcla resultante se agitó a 140o C. El tratamiento de la reacción dio el compuesto 3 con un rendimiento del 93 %.

Síntesis del compuesto intermedio 4: Ver la síntesis del compuesto intermedio 4 en el Ejemplo 1.

Síntesis del compuesto intermedio 6: Ver la síntesis del compuesto intermedio 6 en el Ejemplo 1.

Síntesis del 2-((2-clorofenil)fenil)amino)-N-(7-hidroxiamino)-7-oxoheptil)pirimidina-5-carboxamida (Compuesto B): Ver síntesis del Compuesto A en el Ejemplo 1.

Ejemplo de referencia 3 (no dentro del alcance de la presente invención reivindicada): Síntesis del 2-((1-(3-fluorofenil)ciclohexil)amino)-N-hidroxipirimidina-5-carboxamida (Compuesto C)

Síntesis del compuesto intermedio 2: A una solución del compuesto 1 (100 g, 0,74 mol) en DMF seca (1000 mL) se le añadió 1,5-dibromopentano (170 g, 0,74 mol). Se añadió NaH gota a gota (65 g, 2,2 equiv.) mientras la reacción se enfrió en un baño de hielo. La mezcla resultante se agitó vigorosamente durante toda la noche a 50 °C. La suspensión se inactivó cuidadosamente con agua con hielo y se extrajo con acetato de etilo (3 x 500 mL). Las capas orgánicas combinadas se concentraron para producir el producto bruto, que se purificó mediante cromatografía en columna ultrarrápida para dar el compuesto 2 como un sólido pálido (100 g, 67 %).

Síntesis del compuesto intermedio 3: Una solución del compuesto 2 (100 g, 0,49 mol) en PPA (500 mL) se calentó a 110 °C durante aproximadamente 5-6 horas. Una vez terminada, la mezcla resultante se ajustó cuidadosamente a un pH de aproximadamente 8-9 con solución saturada de NaHCO3. El precipitado resultante se recogió y se lavó con agua (1000 mL) para producir el compuesto 3 como un sólido blanco (95 g, 87 %).

Síntesis del compuesto intermedio 4: A una solución del compuesto 3 (95 g, 0,43 mol) en n-BuOH (800 mL) se añadió NaCIO (260 ml, 1,4 equiv.). Después se añadió NaOH 3 N (400 mL, 2,8 equiv.) a 0 °C y la reacción se agitó durante toda la noche a temperatura ambiente. La mezcla resultante se extrajo con EA (2 x 500 mL), y las capas orgánicas combinadas se lavaron con salmuera. El solvente se eliminó al vacío para proporcionar el producto bruto que se purificó adicionalmente mediante tratamiento con sal de HC1 para producir el compuesto 4 como un polvo blanco (72 g, 73 %).

Síntesis del compuesto intermedio 6: A una solución del compuesto 4 (2,29 g 10 mmol) en dioxano (50 mL) se añadió el compuesto 5 (1,87 g, 1,0 equiv.) Y DIPEA (2,58 g, 2,0 equiv.). La mezcla se calentó durante toda la noche a 110-120 °C. La mezcla resultante se purificó directamente en columna de gel de sílice para proporcionar el producto acoplado, compuesto 6, como un sólido blanco (1,37 g, 40 %).

Síntesis de 2-(( l-(3-fluorofenil)ciclohexil)amino)-N-hidroxipirimidina-5- carboxamida (Compuesto C):

A una solución del compuesto 6 (100 mg, 0,29 mmol) en MeOH/DCM (10 mL, 1:1) se añadió NH2OH al 50 % en agua (2 mL, exceso). Saturado. Después se añadió NaOH en MeOH (2 mL, exceso) a 0 °C y la reacción se agitó durante 3-4 horas. Después de terminada, la mixture resultante se concentró y acidificó con HCl 2N para alcanzar un pH de 4-5. El precipitado se recogió y se lavó con agua (10 mL) para eliminar el exceso de NH2OH. El secado del precipitado proporcionó 2-((1-(3-fluorofenil)ciclohexil)amino)-N-hidroxipirimidin-5-carboxamida como un polvo blanco (70 mg, 73 %).

Ejemplo de referencia 4 (no dentro del alcance de la presente invención reivindicada): Síntesis del N-hidroxi-2-((1-fenilciclopropil)amino)pirimidina-5-carboxamida (Compuesto D)

Esquema de reacción

Síntesis del compuesto intermedio 2: Una solución del compuesto 1, benzonitrilo (250 g, 1,0 equiv.) y Ti(OiPr)4 (1330 mL, 1,5 equiv.) en MBTE (3750 mL) se enfrió a aproximadamente -10 a -5 °C bajo una atmósfera de nitrógeno. Se añadió gota a gota EtMgBr (1610 mL, 3,0 M, 2,3 equiv.) durante un período de 60 min, durante el cual la temperatura interna de la reacción se mantuvo por debajo de 5 °C. Se dejó que la mezcla de reacción se calentara a 15-20 °C durante 1 hora. BF3-éter (1300 mL, 2,0 equiv.) se añadió gota a gota durante un período de 60 min., mientras que la temperatura interna se mantuvo por debajo de 15 °C. La mixture de reacción se agitó a 15-20 °C durante 1-2 horas y se detuvo cuando quedó un nivel bajo de benzonitrilo. Se añadió gota a gota HCl 1 N (2500 mL) mientras que la temperatura interna se mantuvo por debajo de 30 °C. Se añadió gota a gota NaOH (20 %, 3000 mL) para llevar el pH a aproximadamente 9,0, mientras que la temperatura interna se mantuvo por debajo de 30 °C. La mezcla de reacción se extrajo con MTBE (3 L x 2) y EtOAc (3 L x 2), y las capas orgánicas combinadas se secaron con Na²SO⁴anhidro y se concentró a presión reducida (por debajo de 45 °C) para producir un aceite rojo. Se añadió MTBE (2500 mL) al aceite para dar una solución transparente y, tras burbujear con gas HCl seco, precipitó un sólido. Este sólido se filtró y se secó al vacío produciendo 143 g del compuesto 2.

Síntesis del compuesto intermedio 4: Se disolvieron el compuesto 2 (620 g, 1,0 equiv.) y DIPEA (1080 g, 2,2 equiv.) en NMP (3100 mL) y se agitaron durante 20 min. Se añadió el compuesto 3 (680 g, 1,02 equiv.) y la mezcla de reacción se calentó a aproximadamente 85-95 °C durante 4 horas. Se dejó que la solución se enfriara lentamente a temperatura ambiente. Esta solución se vertió sobre H2O (20 L) y gran parte del sólido se precipitó de la solución bajo fuerte agitación. La mezcla se filtró y la torta se secó a presión reducida a 50 °C durante 24 horas, produciendo 896 g de compuesto 4 (sólido, 86,8 %).

Síntesis del N-hidroxi-2-((1-fenilciclopropil)amino)pirimidina-5-carboxamida (Compuesto D): Se enfrió una solución de MeOH (1000 mL) a aproximadamente 0-5 °C con agitación. Se añadió NH²OH HCl (1107 g, 10 equiv.), a continuación de una cuidadosa adición de NaOCH³(1000 g, 12,0 equiv.) La mezcla resultante se agitó a 0-5 °C durante una hora, y se filtró para eliminar el sólido. El compuesto 4 (450 g, 1,0 equiv.) se añadió a la mezcla de reacción en una porción, y se agitó a 10 °C durante dos horas hasta que el compuesto 4 se consumió. La mezcla de reacción se ajustó a un pH de aproximadamente 8,5-9 mediante la adición de HCl (6N), lo que provocó la precipitación. La mezcla se concentró a presión reducida. Se añadió agua (3000 mL) al residuo con agitación intensa y el precipitado se recogió por filtración. El producto se secó en un horno a 45 °C durante toda la noche (340 g, rendimiento del 79 %).

Ejemplo 5: Ensayos de la enzima HDAC

Los compuestos para el ensayo se diluyeron en DMSO a 50 veces la concentración final y se preparó una serie de diluciones en base a diez, tres veces. Los compuestos se diluyeron en tampón de ensayo (HOPES 50 mM, pH 7,4, KCl 100 mM, Tween-20 al 0,001 %, BSA al 0,05 %, 20 (pM TCEP) hasta 6 veces su concentración final. Las enzimas de la HDAC (adquiridas de BPS Biosciences) se diluyeron a 1,5 veces su concentración final en tampón de ensayo. El sustrato dipeptídico y la tripsina a una concentración final de 0,05 pM se diluyeron en tampón de ensayo a 6 veces su concentración final. Las concentraciones finales de la enzima usadas en estos ensayos fueron 3,3 ng/mL (la HDAC1), 0,2 ng/mL (la HDAC2), 0,08 ng/mL (la HDAC3) y 2 ng/mL (HDAC6). Las concentraciones finales del sustrato usadas fueron 16 pM (la HDAC1), 10 pM (la HDAC2), 17 pM (la HDAC3) y 14 pM (HDAC6). Se añadieron cinco pL del compuesto y 20 pL de la enzima a los pocillos de una placa negra y opaca de 384 pocillos, por duplicado. La enzima y el compuesto se incubaron juntos a temperatura ambiente durante 10 minutos. Se añadieron cinco pL de sustrato a cada pocillo, la placa se agitó durante 60 segundos y se colocó en un lector de placas de microtitulación Victor 2. Se controló el desarrollo de la fluorescencia durante 60 minutos y se calculó la velocidad lineal de la reacción. La IC⁵⁰se determinó mediante el uso del Graph Pad Prism, mediante un ajuste de curva de cuatro parámetros.

Ejemplo 6: Citotoxicidad del compuesto A y Actividad Sinérgica con el Fármaco Combinaciones en Células de Cáncer de Mama

Se trató un panel de 16 líneas celulares de cáncer de mama con Compuesto A, doxorrubicina, GDC-0941 o lapatinib y las combinaciones de fármacos durante 48 horas, y se midió la viabilidad celular mediante el ensayo MTA. Sinergia entre Compuesto A y los compuestos asociados se calcularon mediante el uso de CalcuSyn. Las viabilidades celulares se utilizaron para calcular los valores de "Fracción afectada" (Fa) e "Índice de combinación" (Cl) mediante el uso del método de Chou-Talalay. Cualquier combinación con un valor de Cl <0,70 a un valor de Fa entre 0,25 y 0,75 se definió como sinergia positiva.

Los resultados del experimento se muestran en la Tabla más abajo.

Ejemplo de referencia 7 (no dentro del alcance de la presente invención reivindicada): El Inhibidor PI3K GDC-0941 es Potenciado por Inhibidores Selectivos HDAC6

En este ejemplo, se examinó el efecto de potenciación del Compuesto A y del Compuesto C con el inhibidor de PI3K GDC-0941. A concentraciones no citotóxicas del Compuesto A o del Compuesto C, GDC-0941 se vuelve más potente (disminución del valor IC50). Ambos, el Compuesto A y el Compuesto C son inhibidores selectivos de HDAC6 con similar baja potencia nM con 13 veces y 1500 veces la selectividad de HDAC6 sobre las HDAC de clase I, respectivamente.

Los resultados de este experimento se muestran en la figura 1.

Ejemplo 8: Efecto de potenciación de los inhibidores de HDAC6 y los compuestos probados en líneas celulares de cáncer de mama Her2⁺

Para investigar el efecto de potenciación de los inhibidores de HDAC6, las líneas celulares de cáncer de mama MDA-MB-453 o BT-474 Her2⁺, se incubaron con combinaciones de un inhibidor de HDAC6, el Compuesto A o Compuesto C (el Compuesto C no está dentro del alcance de la presente invención reivindicada), y uno de los otros compuestos contra el cáncer de mama, lapatinib, GDC-0941, CAL-101 o IPI-145. Se calcularon los valores de la CI⁵⁰(Concentración inhibidora a la que el 50% de las células son viables) de estos 4 compuestos anticáncer de mama en presencia de concentraciones crecientes de un inhibidor de HDAC6. Ya que el Compuesto A o el Compuesto C solo no es citotóxico a las concentraciones probadas para estas células de cáncer de mama, cualquier disminución de los valores IC50 dependiente de la concentración del inhibidor de HDAC6 sugiere un efecto de potenciación del inhibidor de HDAC6 para los compuestos probados.

Ejemplo 9: La inhibición de la histona deacetilasa (HDAC) 6 potencia la citotoxicidad de los inhibidores lapatinib y PI3K en líneas celulares de cáncer de mama Her2+

En este ejemplo, se ha investigado el impacto de la inhibición de HDAC6 en el crecimiento de células de cáncer de mama Her2+ y en la migración celular, mediante el uso de un inhibidor de HDAC6 solo o en combinación con un inhibidor de Her2 (lapatinib) o un inhibidor de PI3K (el inhibidor de PI3K no está dentro del alcance de la invención actualmente reivindicada) (GDC-0941, IPI-145 y CAL-101).

La actividad antitumoral de Compuesto A se investigó mediante el uso de un panel de casi 100 líneas de células tumorales humanas derivadas de los principales tipos de cáncer, y Her2+, las células de cáncer de mama se encontraban entre las células más sensibles al compuesto A. Combinaciones del Compuesto A con el inhibidor de Her2 lapatinib o el inhibidor de PI3K GDC-0941 demostraron citotoxicidad sinérgica contra estas células cancerosas. Para ilustrar que los efectos se debieron a la inhibición de HDAC6, se usó el inhibidor altamente selectivo de HDAC6, el Compuesto C (no dentro del alcance de la invención actualmente reivindicada), que tiene más de 1500 veces de selectividad contra HDAC6 sobre HDAC de Clase I (HDAC1, 2 y 3). El compuesto C fue capaz de sensibilizar a células de cáncer de mama Her2+ a MDA-MB-453 y BT-474 a lapatinib e inhibidores de PI3K (IPI-145, GDC-0941 y CAL-101). El compuesto C también bloqueó la migración de células cancerosas en presencia o ausencia del factor de crecimiento epidérmico (EGF). De acuerdo con el mecanismo propuesto de muerte de células de cáncer de mama HDAC6, mediado por Her2+, Compuesto A, el tratamiento se correlacionó con una disminución de la proteína Her2, p-EGFR y p-AKT en línea celular de cáncer de mama MDA-MB-453 Her2+.

Aprovechando el inhibidor HDAC6 altamente selectivo Compuesto C, se mostraron actividades supresoras del crecimiento y la migración por inhibición de HDAC6 en células de cáncer de mama Her2+.

Ejemplo 10: Efecto anti-migración de los inhibidores de HDAC6 en líneas celulares de cáncer

Muchas células cancerosas cultivadas pueden migrar a través de una membrana y esta actividad indica el potencial metastásico de las células cancerosas. Se comparó la migración de dos células cancerosas, A549 y MDA-MB-231, en presencia o ausencia de un inhibidor de HDAC6. Las células cancerosas se sembraron y crecieron en la superficie de una membrana, y el número de células en el otro lado de la membrana se contó bajo un microscopio después de 12 horas. Un número reducido de células migradas por el inhibidor de HDAC6 sugiere una actividad de supresión de la migración del inhibidor de HDAC6. En el estudio, se añadió un inhibidor de HDAC a las células 2 horas antes o cuando se midió la migración. Se investigó el efecto del inhibidor de HDAC6 sobre el factor de crecimiento epidérmico (EGF) estimulado por la migración de células cancerosas mediante el uso de 20 ng/ml de EGF en el ensayo.

El protocolo para el Ensayo de Migración fue el siguiente. Los compuestos se prepararon en DMSO a 400x de las concentraciones finales requeridas.

Se añadieron 200 pl de medio RPMI1640 basal tibio al interior de los insertos, se dejó rehidratar durante 2 horas en una incubadora de cultivo de tejidos humidificada a 37 °C, en atmósfera de CO2 al 5 %. Durante la rehidratación, las células se recolectaron con tripsina, se lavaron 3 veces y luego se resuspendieron con medio RPMI1640 basal precalentado que contenía 500000 células/ml o 250000 células/ml. Los compuestos se diluyeron a 20x con medio RPMI1640 basal. Se añadieron 25 pl de compuesto 20x a la suspensión celular de 500 pl para preparar la suspensión celular final con el compuesto. Se añadieron 100 pl de compuesto 20x a 1900 pl de medio RpMI1640 con FBS al 10 % para obtener el medio final, y se añadieron 500 pl del medio final al pocillo en una nueva placa de 24 pocillos. Después de la rehidratación, se retiró el medio de los insertos y luego se añadieron a las cámaras 100 pl de la suspensión celular final. Las cámaras se transfirieron a los pocillos que contenían el medio final. Se añadieron 100 pl/pocillo de la suspensión celular final (diluida con el medio final hasta 1/2 de la densidad) a una placa de 96 pocillos (por triplicado). Después de 8 horas de incubación a 37 °C, las células no invasoras se retiraron de la superficie superior de la membrana con hisopos de algodón. Las células de la superficie inferior de la membrana se fijaron con paraformaldehído al 4 % durante 15 min a temperatura ambiente y luego se tiñeron con cristal violeta durante 30 min. Después de la tinción, los insertos se lavaron en PBS varias veces para asegurarse de que no hubiera cristal violeta en la membrana, excepto en las células. El número de células migradas se contó bajo un microscopio en cinco campos con un aumento de 100x. Las células viables se sembraron en la placa de 96 pocilios con el mismo tratamiento que en el ensayo de migración y se midieron mediante el uso de CTG (Cell Titer Glow). Los resultados de estos experimentos se muestran en las figuras 2, 3, y 4.

Ejemplo 11: Efecto de invasión de los inhibidores de HDAC6 en líneas celulares de cáncer

La invasión de células cancerosas A549 se comparó en presencia o ausencia de un inhibidor de HDAC6. Las células cancerosas se sembraron y crecieron en la superficie de una membrana, y el número de células en el otro lado de la membrana se contó bajo un microscopio después de 12 horas. Además de la migración (Ejemplo 10), las células también tenían que atravesar una barrera de colágeno.

Un número reducido de células migradas por el inhibidor de HDAC6 sugiere una actividad de supresión de la invasión del inhibidor de HDAC6. Se investigó el efecto del inhibidor de HDAC6 sobre el factor de crecimiento epidérmico (EGF) estimulado por la migración de células cancerosas mediante el uso de 20 ng/ml de EGF en el ensayo.

El protocolo para el Ensayo de Invasión fue el siguiente. Los compuestos se prepararon en DMSO a 400x de las concentraciones finales re ueridas.

Se añadieron 200 pl de medio RPMI1640 basal tibio al interior de los insertos, se dejó rehidratar durante 2 horas en una incubadora de cultivo de tejidos humidificada a 37 °C, en atmósfera de CO2 al 5 %. Durante la rehidratación, las células se recolectaron con tripsina, se lavaron 3 veces y luego se resuspendieron con medio RPMI1640 basal precalentado que contenía 500000 células/ml o 250000 células/ml. Los compuestos se diluyeron a 20x con medio RPMI1640 basal. Se añadieron 25 pl de compuesto 20x a la suspensión celular de 500 pl para preparar la suspensión celular final con el compuesto. Se añadieron 100 pl de compuesto 20x a 1900 pl de medio RpMI1640 con FBS al 10 % para obtener el medio final, y se añadieron 500 pl del medio final al pocillo en una nueva placa de 24 pocillos. Después de la rehidratación, se retiró el medio de los insertos y luego se añadieron a las cámaras 100 pl de la suspensión celular final. Las cámaras se transfirieron a los pocillos que contenían el medio final. Se añadieron 100 pl/pocillo de la suspensión celular final (diluida con el medio final hasta 1/2 de la densidad) a una placa de 96 pocillos (por triplicado). Después de 18 horas de incubación a 37 °C, las células no invasoras se retiraron de la superficie superior de la membrana con hisopos de algodón. Las células de la superficie inferior de la membrana se fijaron con paraformaldehído al 4 % durante 15 min a temperatura ambiente y luego se tiñeron con cristal violeta durante 30 min. Después de la tinción, los insertos se lavaron en PBS varias veces para asegurarse de que no hubiera cristal violeta en la membrana, excepto en las células. El número de células invadidas se contó bajo un microscopio en cinco campos con un aumento de 100x. Las células viables se sembraron en la placa de 96 pocillos con el mismo tratamiento que en el ensayo de invasión y se midieron mediante el uso de CTG (Cell Titer Glow). Los resultados de estos experimentos se muestran en la figura 5.

Claims

REIVINDICACIONES

Una combinación farmacéutica para usar en el tratamiento del cáncer de mama que comprende una cantidad terapéuticamente efectiva de un inhibidor de histona deacetilasa (HDAC) o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, y un inhibidor de Her2 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en donde el inhibidor de Her2 es lapatinib; y

en donde el inhibidor HDAC es:

La combinación farmacéutica para usar de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el inhibidor de histona deacetilasa (HDAC) es:

o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

La combinación farmacéutica para usar de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el inhibidor de histona deacetilasa (HDAC) es:

o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

La combinación farmacéutica para usar de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la combinación comprende además un portador farmacéuticamente aceptable.