ES2919961T3 - Método para aumentar la eficiencia de introducción de mutaciones en una técnica de modificación de secuencias genómicas, y complejo molecular para su uso en la misma - Google Patents

Abstract

La presente invención proporciona un método para modificar un sitio dirigido de un ADN de doble cadena, que comprende un paso de introducir un complejo en el que un módulo que reconoce la secuencia de ácido nucleico que se une específicamente a una secuencia de nucleótidos objetivo en un ADN doble y PMCDA1 unido, en una célula que contiene el ADN doble cadena, y cultivando la célula a baja temperatura al menos temporalmente para convertir el sitio dirigido, es decir, la secuencia de nucleótidos objetivo y los nucleótidos en la vecindad de los mismos, a otros nucleótidos, o eliminar el objetivo sitio o insertar nucleótido en el sitio. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Método para aumentar la eficiencia de introducción de mutaciones en una técnica de modificación de secuencias genómicas, y complejo molecular para su uso en la misma

[Campo técnico]

La presente invención se refiere a un método para mejorar la eficiencia de introducción de mutaciones en una técnica de modificación de secuencias genómicas que permite modificar una base de ácido nucleico en una región particular de un genoma sin escindir el ADN bicatenario, es decir, sin escisión o con escisión de una sola hebra, o insertando un fragmento de ADN exógeno, y un complejo de un módulo de reconocimiento de secuencias de ácido nucleico, a una enzima convertidora de bases de ácido nucleico y a un inhibidor de la reparación por escisión de bases que se utilizará para este fin.

[Antecedentes de la técnica]

En los últimos años, la edición del genoma está llamando la atención como técnica para modificar genes y regiones genómicas objetivo en varias especies. Convencionalmente, como método de edición del genoma, se ha propuesto un método que utiliza una combinación de una nucleasa artificial que comprende una molécula que tiene una capacidad de corte de ADN independiente de la secuencia y una molécula que tiene una capacidad de reconocimiento de la secuencia (documento no de patente 1).

Por ejemplo, un método para llevar a cabo la recombinación en un locus de gen diana en el ADN de una célula vegetal o una célula de insecto como hospedador, utilizando una nucleasa de dedo de cinc (ZFN) en donde un dominio de unión al ADN de dedo de cinc y un dominio de escisión de ADN no específico están unidos (documento de patente 1), un método para escindir o modificar un gen diana en una secuencia de nucleótidos particular o un sitio adyacente a la misma utilizando TALEN en donde un efector similar a un activador de transcripción (TAL) que es un módulo de unión al ADN que tiene la bacteria patógena de las plantas Xanthomonas y una endonucleasa de ADN (documento de patente 2), un método que utiliza el sistema CRISPR-Cas9 en donde se combinan la secuencia de ADN de CRISPR (repeticiones palindrómicas cortas agrupadas y regularmente espaciadas) que funciona en un sistema inmunitario adquirido que poseen las eubacterias y las arqueobacterias, y la familia de proteínas nucleasa Cas (asociada a CRISPR) que tiene una función importante junto con CRISPR (documento de patente 3) y similares. Además, también se ha informado de un método para escindir un gen diana en las proximidades de una secuencia particular, mediante el uso de una nucleasa artificial en donde se unen una proteína PPR constituida para reconocer una secuencia de nucleótidos particular mediante una serie de motivos PPR, cada uno de los cuales consta de 35 aminoácidos y reconoce una base de ácido nucleico, y una nucleasa (documento de patente 4).

Estas técnicas de edición del genoma presuponen básicamente roturas de ADN bicatenario (DSB). Sin embargo, debido a que incluyen modificaciones genómicas inesperadas, se producen efectos secundarios como una fuerte citotoxicidad, reordenamiento cromosómico y similares, tienen problemas comunes de fiabilidad para terapia génica, sobrevive un número extremadamente pequeño de células con modificación de nucleótidos y resulta difícil realizar modificaciones genéticas en óvulos de primates y microorganismos unicelulares.

Por otro lado, como método para realizar la modificación de nucleótidos sin DSB acompañante, los presentes inventores informaron que, en el sistema CRISPR-Cas en donde se inactiva al menos una capacidad de escisión de ADN de Cas, se modificó con éxito una secuencia genómica sin acompañamiento de DSB y por conversión de nucleobases en una región que contiene una secuencia de ADN específica. En el sistema, utilizaron una desaminasa que cataliza una reacción de desaminación, que estaba ligada a una molécula que tiene una capacidad de reconocimiento de una secuencia de ADN (documento de patente 5). Según esta técnica de edición del genoma, ya que la técnica no implica la inserción de ADN exógeno ni la escisión de ADN bicatenario, su seguridad es superior y en teoría, el grado de introducción de mutaciones puede ajustarse desde una sola base hasta varios cientos de bases. Sin embargo, había un problema debido a la baja eficiencia de introducción de mutaciones en comparación con la técnica de edición genómica que utiliza Cas9 que tiene capacidad de escisión del ADN normal.

En la técnica de edición del genoma, además, no se ha informado de un método para mejorar la eficacia de la introducción de mutaciones mediante el cambio de la temperatura de cultivo de la célula a una temperatura baja. Además, no hay ningún informe que enseñe que la actividad de la PmCDA1 (citosina desaminasa 1 de Petromyzon marinus) obtenida de Petromyzon marinus, que es un tipo de desaminasa, es mayor cuando la temperatura es inferior a aproximadamente 37 °C, que es generalmente la temperatura óptima para las enzimas.

Nishida K et al. (SCIENCE, vol. 353, 4 de agosto de 2016, página AAF8729 y Material Suplementario) informa de la edición dirigida de nucleótidos utilizando sistemas inmunitarios adaptativos híbridos de procariotas y vertebrados.

El documento WO 2017/070632 A1 divulga los editores de nucleobases que utilizan proteínas de fusión de Cas9 y usos de los mismos.

El documento WO 2017/090761 A1 divulga un método para convertir la secuencia genómica de una planta monocotiledónea en donde se convierte específicamente una base de ácido nucleico en la secuencia de ADN objetivo, y un complejo molecular utilizado en el mismo.

Onticello SG et al., (Mol. Biol. Evol., vol. 22, n.° 2, 2005, páginas 367-377) informa de la evolución de la familia de polinucleótido (desoxi)citidina desaminasas AID/APOBEC.

Komor AC et al. (Nature, vol. 533, n.° 7603, 20 de abril de 2016, páginas 420-424) informa de la edición programable de una base diana en el ADN genómico sin que se produzca la escisión del ADN bicatenario.

[Lista de documentos]

[Documentos de patente]

documento de patente 1: JP-B-4968498

documento de patente 2: Publicación nacional de la solicitud internacional de patente n.° 2013-513389 documento de patente 3: Publicación nacional de la solicitud internacional de patente n.° 2010-519929 documento de patente 4: JP-A-2013-128413

documento de patente 5: WO 2015/133554

[Documentos no de patente]

documento no de patente 1: Kelvin M Esvelt, Harris H Wang (2013) Genome-scale engineering for systems and synthetic biology, Molecular Systems Biology 9: 641

[Sumario de la invención]

[Problemas a resolver mediante la invención]

Un objeto de la presente invención es proporcionar un método de edición genómica mejorando la eficiencia de la introducción de mutaciones mediante la modificación de bases de ácido nucleico de una secuencia particular de un gen sin escindir el ADN bicatenario o escindir una sola hebra, y un compuesto para este fin de un módulo de reconocimiento de secuencias de ácido nucleico, una enzima convertidora de bases de ácido nucleico y un inhibidor de la reparación por escisión de bases.

[Medios para resolver los problemas]

Los presentes inventores investigaron para desarrollar un método para mejorar la eficiencia de introducción de mutaciones en la técnica de edición genómica utilizando una enzima convertidora de bases de ácido nucleico. En el desarrollo de un método para mejorar la eficacia de la introducción de mutaciones, en general, la atención se centró en un método para aumentar la capacidad de convertir bases de ácido nucleico mediante la mutación artificial de una enzima convertidora de bases de ácido nucleico o reemplazándola por otra enzima, o en un método para aumentar la capacidad de reconocimiento de ácidos nucleicos de un módulo de reconocimiento de secuencias de ácido nucleico y similares. Los presentes inventores cambiaron estas concepciones generales y asumieron que, en la técnica de edición genómica, una de las causas de la baja eficiencia de introducción de mutaciones podría deberse a que el mecanismo de reparación por escisión de bases mediado por una ADN glucosilasa o similares se activa en el sitio donde actuó la enzima convertidora de bases de ácido nucleico, reparando el emparejamiento erróneo introducido. Posteriormente conjeturaron que podría aumentarse la eficiencia de introducción de mutaciones mediante la inhibición de proteínas que actúan en los mecanismos de reparación por escisión de bases. De este modo, los presentes inventores coexpresaron un inhibidor de uracilo ADN glucosilasa (Ugi) que inhibe la reparación de bases desamidadas y observaron que mejoró sorprendentemente la eficiencia de introducción de mutaciones.

PmCDA1, que es un tipo de enzima convertidora de bases de ácidos nucleicos, procede de Petromyzon marinus, un animal poiquilotérmico. Por tanto, asumieron que la temperatura óptima para la actividad enzimática de PmCDA1 podría ser inferior a aproximadamente 37 °C, que es la temperatura óptima para las enzimas en general, y conjeturaron que la actividad enzimática podría mejorarse ajustando la temperatura de cultivo. Con el objetivo de mejorar la actividad enzimática de PmCDA1, cultivaron temporalmente células transfectadas con PmCDA1 a baja temperatura y observaron que se había mejorado la eficiencia de introducción de mutaciones.

Los presentes inventores han llevado a cabo estudios adicionales basándose en estos hallazgos y han completado la presente invención.

Por lo tanto, la presente invención es como se describe a continuación.

[1] Un método para modificar un sitio diana de un ADN bicatenario, que comprende una etapa de introducir un complejo en donde se unen un módulo de reconocimiento de secuencias de ácido nucleico que se une específicamente a una secuencia de nucleótidos diana en un ADN bicatenario determinado y PmCDAI, en una célula de mamífero que contiene el ADN bicatenario, y cultivar la célula a una temperatura de 20 °C a 35 °C, al menos temporalmente, para convertir uno o más nucleótidos en el sitio diana en otro u otros nucleótidos o eliminar uno o más nucleótidos, o insertar uno o más nucleótidos en dicho sitio diana, sin escindir al menos una hebra de dicho ADN bicatenario en el sitio diana, en donde el módulo de reconocimiento de secuencias de ácido nucleico es un sistema CRISPR-Cas en donde se inactiva al menos una capacidad de escisión de ADN de Cas.

[2] El método del punto [1], en donde la Cas anteriormente mencionada es deficiente en dos capacidades de corte de ADN.

[3] El método del punto [1] o [2], en donde la temperatura es de 20 °C a 25 °C.

[4] El método del punto [1] o [2], en donde la temperatura es de 25 °C.

[5] El método de cualquiera de los puntos [1] a [4], en donde el ADN bicatenario se pone en contacto con el complejo introduciendo un ácido nucleico que codifica el complejo en una célula de mamífero que tiene el ADN bicatenario.

[6] Un método para modificar un sitio diana de un ADN bicatenario, que comprende una etapa de poner en contacto un complejo en donde se unen un módulo de reconocimiento de secuencias de ácido nucleico que se une específicamente a una secuencia de nucleótidos diana en un ADN bicatenario específico, una enzima convertidora de bases de ácido nucleico y un inhibidor de la reparación por escisión de bases, a dicho ADN bicatenario para convertir uno o más nucleótidos en el sitio diana en otros uno o más nucleótidos o eliminar uno o más nucleótidos o insertar uno o más nucleótidos en dicho sitio diana, sin escindir al menos una hebra de dicho ADN bicatenario en el sitio diana,

en donde el módulo de reconocimiento de secuencias de ácido nucleico es un sistema CRISPR-Cas en donde se inactiva al menos una capacidad de escisión de ADN de Cas,

en donde la enzima convertidora de bases de ácido nucleico es PmCDA1 codificada por una secuencia de nucleótidos que tiene los codones optimizados para una célula hospedadora.

[7] El método del punto [6], en donde la Cas anteriormente mencionada es deficiente en dos capacidades de corte de ADN.

[8] El método del punto [6] o [7], en donde el inhibidor de la reparación por escisión de bases es un inhibidor de uracilo ADN glucosilasa.

[9] El método de acuerdo con el punto [6], en donde la célula hospedadora es una célula de mamífero.

[10] El método de cualquiera de los puntos [6] a [9], en donde el ADN bicatenario se pone en contacto con el complejo introduciendo un ácido nucleico que codifica el complejo en una célula que tiene el ADN bicatenario.

[11] Un complejo enzimático de modificación de ácidos nucleicos, en donde se unen un módulo de reconocimiento de secuencias que se une específicamente a una secuencia de nucleótidos diana en un ADN bicatenario específico, una enzima convertidora de bases de ácido nucleico y un inhibidor de la reparación por escisión de bases, convirtiendo dicho complejo uno o más nucleótidos en el sitio diana en uno o más nucleótidos diferentes o elimina uno o más nucleótidos o inserta uno o más nucleótidos en dicho sitio diana, sin escindir al menos una hebra de dicho ADN bicatenario en el sitio diana,

en donde el módulo de reconocimiento de secuencias de ácido nucleico es un sistema CRISPR-Cas en donde se inactiva al menos una capacidad de escisión de ADN de Cas, y

en donde la enzima convertidora de bases de ácido nucleico es PmCDA1 codificada por una secuencia de nucleótidos que tiene los codones optimizados para una célula hospedadora.

[12] El complejo enzimático modificador de ácidos nucleicos de acuerdo con el punto [11], en donde la célula hospedadora es una célula de mamífero.

[13] Un ácido nucleico que codifica el complejo enzimático modificador de ácidos nucleicos del punto [11] o [12].

[Efecto de la invención]

De acuerdo con la técnica de edición genómica de la presente invención, se mejora sorprendentemente la eficiencia de introducción de mutaciones en comparación con las técnicas de edición genómica convencionales mediante el uso de enzimas convertidoras de bases de ácidos nucleicos.

[Breve descripción de los dibujos]

La Fig. 1 es un esquema que muestra el plásmido de edición del genoma utilizado en los ejemplos.

La Fig. 2 es un esquema que muestra el método de evaluación de la eficiencia de la introducción de mutaciones.

La Fig. 3 muestra los resultados del análisis del patrón de mutación de la región del gen diana en las poblaciones mutantes obtenidas.

[Descripción de las realizaciones]

La presente invención proporciona un primer método de mejora de la eficiencia de introducción de mutaciones en la técnica de edición genómica, que incluye modificar un sitio diana de un ADN bicatenario convirtiendo la secuencia de nucleótidos diana y los nucleótidos próximos a la misma en el ADN bicatenario en otros nucleótidos, sin escindir al menos una hebra del ADN bicatenario que se va a modificar. El método comprende como característica una etapa de introducir un complejo en donde se unen un módulo de reconocimiento de secuencias de ácido nucleico que se une específicamente a la secuencia de nucleótidos diana en el ADN bicateriario y PmCDA1 en una célula de mamífero que tiene el ADN bicatenario y cultivar la célula a una temperatura de 20 °C a 35 °C, al menos temporalmente, para convertir el sitio diana, es decir, la secuencia de nucleótidos diana y los nucleótidos próximos a la misma, en otros nucleótidos, o eliminar el sitio diana, o insertar un nucleótido en el sitio, en donde el módulo de reconocimiento de secuencias de ácido nucleico es un sistema CRISPR-Cas en donde se inactiva al menos una capacidad de escisión de ADN de Cas.

En una realización, el primer método de la invención contiene característicamente una etapa de introducción de un complejo en donde se unen un módulo de reconocimiento de secuencias de ácido nucleico que se une específicamente a la secuencia de nucleótidos diana en el ADN bicatenario, y una enzima convertidora de bases de ácido nucleico, en una célula de mamífero que tiene el ADN bicatenario, e inhibir la reparación por escisión de bases de la célula para convertir el sitio diana, es decir, la secuencia de nucleótidos diana y los nucleótidos próximos a la misma, a otros nucleótidos, o eliminar el sitio diana, o insertar un nucleótido en el sitio.

La presente invención también proporciona un segundo método para modificar un sitio diana de un ADN bicatenario, que comprende una etapa de poner en contacto un complejo en donde se unen un módulo de reconocimiento de secuencias de ácido nucleico que se une específicamente a una secuencia de nucleótidos diana en un ADN bicatenario específico, una enzima convertidora de bases de ácido nucleico y un inhibidor de la reparación por escisión de bases, a dicho ADN bicatenario para convertir uno o más nucleótidos en el sitio diana en otros uno o más nucleótidos o eliminar uno o más nucleótidos o insertar uno o más nucleótidos en dicho sitio diana, sin escindir al menos una hebra de dicho ADN bicatenario en el sitio diana,

en donde el módulo de reconocimiento de secuencias de ácido nucleico es un sistema CRISPR-Cas en donde se inactiva al menos una capacidad de escisión de ADN de Cas,

en donde la enzima convertidora de bases de ácido nucleico es PmCDA1 codificada por una secuencia de nucleótidos que tiene los codones optimizados para una célula hospedadora.

En la presente invención, la "modificación" de un ADN bicatenario significa que un nucleótido (por ejemplo, dC) en una cadena de ADN se convierte en otro nucleótido (por ejemplo, dT, dA o dG), o se elimina, o se inserta un nucleótido o una secuencia de nucleótidos entre determinados nucleótidos de una cadena de ADN. Aunque no hay limitaciones concretas en lo referente al ADN bicatenario que se va a modificar, preferentemente es un ADN genómico. El "sitio diana" de un ADN bicatenario significa la "secuencia de nucleótidos diana" completa o parcial, que un módulo de reconocimiento de secuencias de ácido nucleico reconoce específicamente y a la que se une, o la zona próxima a la secuencia de nucleótidos diana (tanto en 5' cadena arriba como en 3' cadena abajo), y el rango del mismo puede ajustarse adecuadamente entre 1 base y varios cientos de bases de acuerdo con el objeto.

En la presente invención, el "módulo de reconocimiento de secuencias de ácido nucleico" es una molécula o complejo de moléculas que tiene la capacidad de reconocer específicamente y unirse a una secuencia de nucleótidos concreta (es decir, la secuencia de nucleótidos diana) en una cadena de ADN. La unión del módulo de reconocimiento de secuencias de ácido nucleico a una secuencia de nucleótidos diana permite que una enzima convertidora de bases de ácido nucleico y un inhibidor de la reparación por escisión de bases ligado al módulo actúen específicamente en un sitio diana de un ADN bicatenario.

En la presente invención, la "enzima convertidora de bases de ácido nucleico" es una enzima capaz de convertir un nucleótido diana en otro nucleótido catalizando una reacción de conversión de un sustituyente en un anillo de purina o pirimidina en una base de ADN en otro grupo o átomo, sin escindir la cadena de ADN.

En la presente invención, la "reparación por escisión de bases" es uno de los mecanismos de reparación del ADN de los organismos vivos, y significa un mecanismo para reparar los daños de las bases cortando las partes dañadas de las bases mediante enzimas y volviéndolas a unir. La escisión de las bases dañadas se realiza por la ADN glucosilasa, que es una enzima que hidroliza el enlace N-glicosídico del ADN. Un sitio abásico (sitio apurínico/aprimídico (AP)) resultante de la reacción abásica de la enzima se trata con una enzima posterior a la vía de reparación por escisión de bases (BER), como la endonucleasa AP, ADN polimerasa, ADN ligasa y similares. Algunos ejemplos de este tipo de genes o proteínas que participan en la vía de ^b E^r se encuentran, pero sin limitación, UNG (NM_003362), SMUG1 (NM_014311), MBD4 (NM_003925), TDG (NM_003211), OGG1 (NM_002542), MYH (NM_012222), NTHL1 (NM_002528), MPG (NM_002434), NEIL1 (NM_024608), NEIL2 (NM_145043), NEIL3 (NM_018248), APE1 (NM_001641), APE2 (NM_014481), LIG3 (NM_013975), XRCC1 (NM_006297), ADPRT (PARP1) (NM_0016718), ADPRTL2 (PARP2) (NM_005484) y similares (los paréntesis indican el número de refseq en el que está registrada la información de la secuencia bases de cada gen (ADNc)).

En la presente invención, el "inhibidor de la reparación por escisión de bases" es una proteína que, en consecuencia, inhibe la BER mediante la inhibición de cualquiera de las etapas de la vía de BER antes mencionada, o la inhibición de la expresión misma de la molécula movilizada por la vía de BER. En la presente invención, "inhibir la reparación por escisión de bases" significa inhibir consecuentemente la BER mediante la inhibición de cualquiera de las etapas de la vía de BER anteriormente mencionada, o la inhibición de la expresión misma de la molécula movilizada por la vía de BER.

En la presente invención, el "complejo de enzimas modificadoras de ácidos nucleicos" es un complejo molecular que comprende un módulo de reconocimiento de secuencias de ácidos nucleicos y una enzima convertidora de bases de ácidos nucleicos, y que tiene una actividad de enzima convertidora de bases de ácidos nucleicos y está dotado de una capacidad particular de reconocimiento de secuencias de nucleótidos. Un inhibidor de la reparación por escisión de bases puede estar ligado al complejo. El "complejo" abarca aquí no solo uno constituido por múltiples moléculas, sino también uno que tenga un módulo de reconocimiento de secuencias de ácido nucleico y una enzima convertidora de bases de ácido nucleico en una sola molécula, como una proteína de fusión. Además, "codificar el complejo" abarca tanto la codificación de cada molécula que constituye el complejo como la codificación de una proteína de fusión que contiene la molécula constitutiva en una sola molécula.

Como se divulga en el presente documento, la "baja temperatura" se refiere a una temperatura inferior a la temperatura de cultivo general para la proliferación de células en el cultivo celular. Por ejemplo, cuando la temperatura general de cultivo de la célula es de 37 °C, una temperatura inferior a 37 °C corresponde a la temperatura baja. Por otro lado, la temperatura baja debe ser una temperatura que no dañe las células, ya que éstas se dañan cuando la temperatura de cultivo es demasiado baja. Mientras que la baja temperatura varía en función del tipo de célula, el periodo de cultivo y otras condiciones del cultivo, por ejemplo, cuando la célula es una célula de mamífero, tal como células de ovario de hámster chino (CHO) y similares, suele ser de 20 °C a 35 °C, preferentemente de 20 °C a 30 °C, más preferentemente de 20 °C a 25 °C, aún más preferentemente de 25 °C.

Como se divulga en el presente documento, "cultivar a baja temperatura al menos temporalmente" significa cultivar una célula en las "condiciones de baja temperatura" anteriormente mencionadas durante al menos una parte de todo el periodo de cultivo y abarca el cultivo a baja temperatura durante todo el periodo de cultivo. Además, el cultivo de células a baja temperatura intermitente en múltiples ocasiones durante el periodo de cultivo también se engloba en "cultivo a baja temperatura al menos temporalmente". Aunque el momento y la duración del cultivo a baja temperatura no están especialmente limitados, generalmente, el cultivo a baja temperatura se mantiene durante no menos de una noche tras la introducción del complejo de un módulo de reconocimiento de secuencias de ácido nucleico y PmCDA1 o un ácido nucleico que lo codifica en la célula. El límite superior del periodo de cultivo no está particularmente limitado, siempre que sea el periodo mínimo necesario para la modificación del sitio diana del ADN bicatenario, y las células pueden cultivarse a una temperatura baja durante todo el periodo de cultivo. El periodo de cultivo completo varía en función del tipo de célula, el periodo de cultivo y otras condiciones del cultivo, por ejemplo, cuando una célula de mamífero como las células CHO y similares se cultivan a 25 °C, suele ser de aproximadamente 10 días a 14 días. En una realización preferida, una célula de mamífero, tal como una célula CHO y similares, se cultiva durante no menos de una noche, preferentemente de una noche a 7 días (por ejemplo, durante una noche) después de la introducción del complejo a de 20 °C a 35 °C, preferentemente de 20 °C a 30 °C, más preferentemente de 20 °C a 25 °C, aún más preferentemente de 25 °C.

La enzima convertidora de bases de ácidos nucleicos que se utilizará en la divulgación no está particularmente limitada siempre que pueda catalizar la reacción mencionada anteriormente, y ejemplos de la misma incluyen la desaminasa que pertenece a la superfamilia de las desaminasas de ácidos nucleicos/nucleótidos, que cataliza una reacción de desaminación que convierte un grupo amino en un grupo carbonilo. Algunos ejemplos preferidos incluyen la citidina desaminasa capaz de convertir la citosina o la 5-metilcitosina en uracilo o timina, respectivamente, adenosina desaminasa capaz de convertir la adenina en hipoxantina, guanosina desaminasa capaz de convertir la guanina en xantina y similares. Como citidina desaminasa, la más preferida es la citidina desaminasa inducida por activación (en adelante también denominada AID), que es una enzima que introduce una mutación en un gen de inmunoglobulina en la inmunidad adquirida de los vertebrados o similares.

Aunque la derivación de la enzima convertidora de bases de ácidos nucleicos no está particularmente limitada, por ejemplo, puede utilizarse para la invención PmCDA1 procedente de Petromyzon marinus (citosina desaminasa 1 de Petromyzon marinus). Por ejemplo, pueden consultarse los números de referencia de GenBank EF094822 y ABO15149 para obtener la secuencia de bases y la secuencia de aminoácidos del ADNc de PmCDA1. Desde el punto de vista de la actividad enzimática, es preferible PmCDA1. Como se muestra en los ejemplos mencionados a continuación, se observó que el riesgo de mutación fuera de la diana puede suprimirse incluso cuando se utiliza Ugi en combinación en una realización particular utilizando PmCDA1 como citidina desaminasa. Por lo tanto, desde el punto de vista de la reducción del riesgo de mutación fuera de la diana, es preferible PmCDA1.

Aunque el inhibidor de la reparación por escisión de bases que se utilizará en la divulgación no está particularmente limitado, siempre que inhiba consecuentemente la BER, desde el punto de vista de la eficacia, es preferible un inhibidor de la ADN glucosilasa anterior a la vía de BER. Los ejemplos del inhibidor de la ADN glucosilasa que se utilizará en la divulgación incluyen, pero sin limitación, un inhibidor de la timina ADN glucosilasa, un inhibidor de la uracilo ADN glucosilasa, un inhibidor de la oxoguanina ADN glucosilasa, un inhibidor de la alquilguanina ADN glucosilasa y similares. Por ejemplo, cuando se utiliza la citidina desaminasa como enzima convertidora de bases de ácidos nucleicos, es adecuado utilizar un inhibidor de la uracilo ADN glucosilasa para inhibir la reparación del emparejamiento erróneo U:G o G:U del ADN generado por la mutación.

Entre los ejemplos de dicho inhibidor de la uracilo ADN glucosilasa se incluyen, pero sin limitación, un inhibidor de la uracilo ADN glucosilasa (Ugi) derivado del bacteriófago de Bacillus subtilis, PBS1, y un inhibidor de la uracilo ADN glucosilasa (Ugi) derivado del bacteriófago de Bacillus subtilis, PBS2 (Wang, Z., y Mosbaugh, D.W. (1988) J. Bacteriol.

170, 1082-1091). En la divulgación se puede utilizar el inhibidor de la reparación del emparejamiento erróneo del ADN anteriormente mencionado. Concretamente, también se sabe que la Ugi derivada de ^p BS2 tiene el efecto de dificultar la mutación, la escisión y la recombinación distinta de T por C en el ADN, por lo que es adecuado el uso de Ugi derivada de PBS2.

Como se ha mencionado anteriormente, en el mecanismo de reparación por escisión de bases (BER), cuando se extrae una base por la ADN glucosilasa, la endonucleasa AP pone una muesca en el sitio abásico (sitio de AP), y la exonucleasa corta completamente el sitio de AP. Cuando se corta el sitio de AP, la ADN polimerasa produce una nueva base utilizando la base de la hebra opuesta como plantilla, y la ADN ligasa finalmente sella la muesca para completar la reparación. Se sabe que la endonucleasa A p mutante que ha perdido la actividad enzimática pero mantiene la capacidad de unión al sitio de AP inhibe competitivamente la BER. Por lo tanto, estas endonucleasas AP de mutación también pueden utilizarse como inhibidor de la reparación por escisión de bases en la divulgación. Si bien el origen de la endonucleasa AP mutante no está particularmente limitado, por ejemplo, pueden utilizarse endonucleasas AP procedentes de Escherichia coli, levadura, mamífero (por ejemplo, humano, ratón, cerdo, bovino, caballo, mono, etc.) y similares. Por ejemplo, La secuencia de aminoácidos del Apel humana puede consultarse en UniprotKB n.° P27695. Entre los ejemplos de endonucleasas AP mutantes que han perdido la actividad enzimática pero mantienen la capacidad de unión al sitio de AP se encuentran las proteínas que tienen el sitio activo mutado y el sitio de unión a Mg (cofactor) mutado. Por ejemplo, para Ape1 humana, pueden mencionarse E96Q, Y171A, Y171F, Y171H, D210N, D210A, N212A y similares.

La reparación por escisión de bases de la célula puede inhibirse introduciendo un inhibidor de la BER anteriormente mencionado o un ácido nucleico que lo codifique o un compuesto de bajo peso molecular que inhiba la BER. Como alternativa, puede inhibirse la BER en la célula mediante la supresión de la expresión de un gen implicado en la vía de la BER. Se puede realizar la supresión de la expresión génica, por ejemplo, introduciendo un ARNpi capaz de suprimir específicamente la expresión de un gen implicado en la vía de BER, un ácido nucleico antisentido o un vector de expresión capaz de expresar polinucleótidos de estos en las células. Como alternativa, la expresión génica puede suprimirse mediante la supresión de los genes implicados en la vía de BER.

Por lo tanto, como un aspecto de la divulgación, se proporciona un método para mejorar la eficiencia de introducción de mutaciones que comprende una etapa de introducción de un complejo en el que un módulo reconocedor de secuencias de ácido nucleico que se une específicamente a la secuencia de nucleótidos diana en el ADN bicatenario y una enzima convertidora de bases de ácido nucleico se unen en una célula que contiene el ADN bicatenario y que muestra la expresión suprimida de un gen relacionado con la vía de BER para convertir el sitio diana, es decir, la secuencia de nucleótidos diana y los nucleótidos en su proximidad, a otros nucleótidos, o eliminar el sitio diana, o insertar nucleótidos en el sitio.

El ARNpi es típicamente un oligo de ARN bicatenario que consiste en un ARN que tiene una secuencia complementaria a una secuencia de nucleótidos de ARNm o una secuencia parcial del mismo (en lo sucesivo, la secuencia de nucleótidos diana) del gen diana, y una cadena complementaria del mismo. Las secuencias de nucleótidos de estos ARN pueden diseñarse adecuadamente según la información de la secuencia de los genes implicados en la vía de BER. Se trata de un ARN monocatenario en el que una secuencia complementaria a la secuencia de nucleótidos diana (primera secuencia) y una secuencia complementaria a la misma (segunda secuencia) están unidas a través de una porción de bucle de horquilla, y un ARN (RNA pequeño en horquilla: ARNph) en el que la primera secuencia forma una estructura de doble cadena con la segunda secuencia adoptando una estructura de tipo bucle de horquilla es también uno de los aspectos preferibles del ARNpi.

El ácido nucleico antisentido es un ácido nucleico que contiene una secuencia de nucleótidos capaz de hibridarse específicamente con el ARNm diana en condiciones fisiológicas de las células que expresan el ARNm diana (ARNm maduro o producto de transcripción inicial) y capaz de inhibir la traducción del polipéptido codificado por el ARNm diana mientras está hibridado. El tipo de ácido nucleico antisentido puede ser ADN o ARN, o una quimera de ADN/ARN. La secuencia de nucleótidos de estos ácidos nucleicos puede diseñarse adecuadamente según la información de la secuencia de un gen implicado en la vía de BER.

La supresión génica de los genes implicados en la vía de BER significa que se han destruido todos o una parte de los genes implicados en la vía de BER o se han recombinado para no mostrar sus funciones originales. El gen puede destruirse o mutarse, de tal forma que no funcionará un alelo en el genoma y pueden destruirse o mutarse varios alelos. La supresión génica puede realizarse mediante cualquier método conocido. Por ejemplo, pueden mencionarse un método de supresión génica mediante la introducción de una construcción de ADN preparada para provocar una recombinación genética con el gen diana en la célula, un método de supresión génica mediante inserción, eliminación o sustitución de bases mediante un sistema de TALEN o de CRISPR-Cas9 o similares.

Una secuencia de nucleótidos diana en un ADN bicatenario que debe reconocerse por el módulo de reconocimiento de secuencias de ácido nucleico en el complejo enzimático modificador de ácido nucleico de la presente invención no está particularmente limitada siempre que el módulo se una específicamente a ella, y puede ser cualquier secuencia en el ADN bicatenario. La longitud de la secuencia de nucleótidos diana solo tiene que ser suficiente para la unión específica del módulo de reconocimiento de la secuencia de ácido nucleico. Por ejemplo, cuando se introduce una mutación en un sitio concreto del ADN genómico de un mamífero, no es menor de 12 nucleótidos, preferentemente, no es menor de 15 nucleótidos, más preferentemente, no es menor de 17 nucleótidos, según el tamaño del genoma del mismo. Aunque el límite superior de la longitud no está especialmente limitado, es preferentemente no mayor de 25 nucleótidos, más preferentemente no mayor de 22 nucleótidos.

Como módulo reconocedor de secuencias de ácidos nucleicos en el complejo enzimático modificador de ácidos nucleicos de la presente invención, pueden usarse un sistema CRISPR-Cas en donde se inactiva al menos una capacidad de escisión de ADN de la Cas (en lo sucesivo denominado "CRISPR-Cas mutante" y también abarca CRISPR-Cpf1 mutante), un motivo de dedo de cinc, un efector TAL y un motivo PPR y similares, así como un fragmento que contiene un dominio de unión a ADN de una proteína que se une específicamente al ADN, tal como una enzima de restricción, un factor de transcripción, una ARN polimerasa y similares, y exento de una capacidad de escisión del ADN bicatenario, pero el módulo no se limita a los mismos. Preferentemente, se pueden mencionar CRISPR-Cas mutante, el motivo de dedo de cinc, el efector TAL, el motivo PPR y similares.

Como técnica de edición del genoma mediante CRISPR, se ha informado de un caso en el que se utiliza CRISPR-Cpfl además de CRISPR-Cas9 (Zetsche B., et al., Cell, 163:759-771 (2015)). Cpf1 tiene propiedades diferentes a las de Cas9 en el sentido de que no requiere ARNtracr, el ADN escindido es un extremo cohesivo, la secuencia PAM está presente en el lado 5' y es una secuencia rica en T y similares. La Cpf1 capaz de editar el genoma en células de mamíferos incluye, pero sin limitación, Cpf1 procedente de Acidaminococcus sp. BV3L6, Cpf1 procedente de bacterias Lachnospiraceae ND2006 y similares. La Cpf1 que carece de capacidad de escisión del ADN incluye un mutante D917A en el que el resto a Sp 917 en Cpf1 (FnCpf1) procedente de Francisella novicida U112 se convierte en un resto de Ala, un mutante E1006A obtenido mediante la conversión del resto Glu 1006 en un resto de Ala, un mutante D1255A obtenido mediante la conversión del resto Asp 1255 en un resto de Ala y similares. El mutante no se limita a estos mutantes y puede utilizarse en la presente invención cualquier Cpf1 mutante que carezca de la capacidad de escindir el ADN.

Un motivo de dedo de cinc está constituido por la unión de 3 a 6 unidades diferentes de dedo de cinc del tipo Cys2His2 (1 dedo reconoce aproximadamente 3 bases), y puede reconocer una secuencia de nucleótidos diana de 9 a 18 bases. Un motivo de dedo de cinc puede producirse mediante un método conocido, como el método de ensamblaje modular (Nat Biotechnol (2002) 20: 135-141), el método OPEN (Mol Cell (2008) 31: 294-301), el método CoDA (Nat Methods (2011) 8: 67-69), el método de un híbrido de Escherichia coli (Nat Biotechnol (2008) 26:695-701) y similares. Se puede consultar el documento de patente 1 antes mencionado para conocer los detalles de la producción del motivo del dedo de cinc.

Un efector TAL tiene una estructura de repetición de módulo con aproximadamente 34 aminoácidos como unidad, y los restos de aminoácidos 12 y 13 (denominados RVD) de un módulo determinan la estabilidad de unión y la especificidad de base. Dado que cada módulo es altamente independiente, el efector TAL específico para una secuencia de nucleótidos diana puede producirse simplemente conectando el módulo. Para el efector t Al , se ha establecido un método de producción que utiliza un recurso abierto (método REAL (Curr Protoc Mol Biol (2012) Capítulo 12: Unidad 12.15), método FLASH (Nat Biotechnol (2012) 30: 460-465) y el método Golden Gate (Nucleic Acids Res (2011) 39: e82), etc.), y se puede diseñar convenientemente mediante comparación un efector TAL para una secuencia de nucleótidos diana. Se puede consultar el documento de patente 2 antes mencionado para conocer los detalles de la producción del efector TAL.

El motivo PPR está constituido de tal modo que se reconoce una secuencia de nucleótidos concreta mediante una serie de motivos PPR, consistiendo cada uno de ellos en 35 aminoácidos y reconociendo una base de ácido nucleico, y reconoce una base diana únicamente por 1, 4 y ii(-2) aminoácidos de cada motivo. El motivo constituyente no tiene ninguna dependencia, y está libre de interferencias de motivos en ambos lados. Por lo tanto, como efector TAL, se puede producir una proteína PPR específica para la secuencia de nucleótidos diana simplemente conectando motivos PPR. Se puede consultar el documento de patente 4 antes mencionado para conocer los detalles de la producción del motivo PPR.

Cuando se utiliza un fragmento de enzima de restricción, factor de transcripción, ARN polimerasa y similares, ya que los dominios de unión al ADN de estas proteínas son bien conocidos, se puede diseñar y construir fácilmente un fragmento que contenga el dominio y esté libre de la capacidad de corte de la doble cadena de ADN.

Puede proporcionarse cualquiera de los módulos de reconocimiento de secuencias de ácido nucleico anteriormente mencionados como proteína de fusión con la enzima convertidora de bases de ácidos nucleicos y/o el inhibidor de la reparación por escisión de bases anteriormente mencionados o un dominio de unión a proteínas, tal como el dominio s H3, el dominio PDZ, el dominio GK, el dominio GB y similares y puede fusionarse un compañero de unión del mismo con un módulo de reconocimiento de secuencias de ácido nucleico y una enzima convertidora de bases de ácido nucleico y/o un inhibidor de la reparación por escisión de bases, respectivamente, y proporcionarse en forma de un complejo de proteína mediante una interacción del dominio y un compañero de unión del mismo. Como alternativa, un módulo de reconocimiento de secuencias de ácido nucleico y una enzima convertidora de bases de ácido nucleico y/o un inhibidor de reparación por escisión de bases pueden estar fusionados cada uno con la inteína, y pueden unirse por ligadura después de la síntesis de la proteína.

El complejo enzimático modificador de ácidos nucleicos de la presente invención puede ponerse en contacto con un ADN bicatenario introduciendo el complejo o un ácido nucleico que codifique el complejo en una célula que tenga el ADN bicatenario objeto (por ejemplo, ADN genómico). Teniendo en cuenta la eficacia de la introducción y la expresión, es deseable introducir el complejo en forma de un ácido nucleico que lo codifique en lugar del propio complejo enzimático modificador de ácidos nucleicos, y expresar el complejo en la célula.

Por lo tanto, el módulo de reconocimiento de secuencias de ácidos nucleicos, la enzima convertidora de bases de ácido nucleico y el inhibidor de la reparación por escisión de bases se preparan preferentemente como un ácido nucleico que codifica una proteína de fusión de los mismos, o en una forma capaz de formar un complejo en una célula hospedadora después de la traducción en una proteína utilizando un dominio de unión, una inteína y similares, o como un ácido nucleico que codifica cada uno de ellos. El ácido nucleico puede ser un ADN o un ARN. Cuando se trata de un ADN, es preferentemente un ADN bicatenario, y se proporciona en forma de un vector de expresión dispuesto bajo la regulación de un promotor funcional en una célula hospedadora. Cuando se trata de un ARN, es preferentemente un ARN monocatenario.

Dado que el complejo de la presente invención no acompaña a las roturas de ADN bicatenario (DSB), es posible la edición del genoma con baja toxicidad, y el método de modificación genética de la presente invención puede aplicarse a una amplia gama de materiales biológicos. Por lo tanto, las células a las que se les va a introducir el ácido nucleico que codifica el complejo enzimático convertidor de ácidos nucleicos anteriormente mencionado puede abarcar células de cualquier especie, desde bacterias Escherichia coli y similares que son procariotas, células de microorganismos como las levaduras y similares que son eucariotas inferiores, hasta células de vertebrados, incluidos mamíferos, como seres humanos y similares, y células de eucariotas superiores como insectos, plantas y similares.

Un ADN que codifica un módulo de reconocimiento de secuencias de ácido nucleico, como un motivo de dedo de cinc, un efector TAL, un motivo PPR y similares pueden obtenerse por cualquier método mencionado anteriormente para cada módulo. Un ADN que codifica un módulo de reconocimiento de secuencias de enzima de restricción, factor de transcripción, ARN polimerasa y similares puede clonarse, por ejemplo, sintetizando un cebador de oligoADN que cubre una región que codifica una parte deseada de la proteína (parte que contiene el dominio de unión a ADN) basándose en la información de la secuencia del ADNc de la misma, y amplificar mediante el método de RT-PCR utilizando, como molde, la fracción de ARN total o ARNm preparada a partir de las células productoras de proteínas.

Un ADN que codifica una enzima convertidora de bases de ácido nucleico y un inhibidor de reparación por escisión de bases también puede clonarse de manera similar sintetizando un cebador de oligoADN basado en la información de la secuencia del ADNc del mismo, y amplificando por el método de RT-PCR utilizando, como molde, la fracción de ARN total o ARNm preparada a partir de las células productoras de enzimas. Por ejemplo, se puede clonar un ADN que codifique la Ugi de PBS2 diseñando cebadores adecuados para la región cadena arriba y cadena abajo del CDS a partir de la secuencia de ADN (n.° de referencia J04434) registrada en la base de datos del NCBI/GenBank, y clonando a partir del ARNm de PBS2 mediante el método de RT-PCR.

El ADN clonado puede utilizarse directamente como ADN que codifica una proteína, o prepararse en un ADN que codifica una proteína después de la digestión con una enzima de restricción cuando se desee, o después de la adición de un enlazador adecuado (por ejemplo, el enlazador GS, el enlazador GGGAR, etc.), un espaciador (por ejemplo, la secuencia FLAG, etc.) y/o una señal de localización nuclear (NLS) (cada señal de transferencia de los orgánulos cuando el ADN bicatenario diana es ADN mitocondrial o cloroplástico). Puede ligarse además con un ADN que codifique un módulo de reconocimiento de secuencias de ácido nucleico para preparar un ADN que codifique una proteína de fusión.

Como alternativa, un ADN que codifica un complejo enzimático de modificación de ácido nucleico puede fusionarse con un ADN que codifica un dominio de unión o un compañero de unión del mismo, o ambos ADN pueden fusionarse con un ADN que codifica una inteína de separación, de modo que el módulo de conversión que reconoce la secuencia del ácido nucleico y el complejo de enzimas de modificación del ácido nucleico se traducen en una célula hospedadora para formar un complejo. En estos casos, un enlazador y/o una señal de localización nuclear pueden unirse a una posición adecuada de uno o ambos ADN cuando se desee.

Un ADN que codifica un complejo enzimático de modificación de ácidos nucleicos puede obtenerse sintetizando químicamente la cadena de ADN, o conectando cadenas cortas de oligoADN sintetizadas y parcialmente superpuestas utilizando el método de PCR y el método de ensamblaje de Gibson para construir un ADN que codifique la longitud completa del mismo. La ventaja de construir un a Dn de longitud completa mediante síntesis química o una combinación del método de PCR o del método de ensamblaje de Gibson es que el codón que se va a utilizar puede diseñarse en un CDS de longitud completa según el hospedador en el que se introduzca el ADN. En la expresión de un ADN heterólogo, se espera que el nivel de expresión de la proteína aumente al convertir la secuencia de ADN de la misma en un codón de uso muy frecuente en el organismo hospedador. Como datos de frecuencia de uso de codones en el hospedador que se va a utilizar, por ejemplo, se puede utilizar la base de datos de frecuencia de uso de códigos genéticos (http://www.kazusa.or.jp/codon/index.html) divulgada en la página web del Instituto de Investigación del ADN de Kazusa, o se pueden consultar documentos que muestren la frecuencia de uso de codones en cada hospedador. Por referencia a los datos obtenidos y a la secuencia de ADN que se va a introducir, los codones que muestran una baja frecuencia de uso en el hospedador de entre los utilizados para la secuencia de ADN pueden convertirse en un codón que codifique el mismo aminoácido y que muestre una alta frecuencia de uso.

Se puede producir un vector de expresión que contenga un ADN que codifique un complejo enzimático de modificación de ácidos nucleicos, por ejemplo, uniendo el ADN cadena abajo de un promotor en un vector de expresión adecuado.

Como vector de expresión, se utilizan, entre otros, plásmidos de Escherichia coli (por ejemplo, pBR322, pBR325, pUC12, pUC13), plásmidos de Bacillus subtilis (por ejemplo, pUB110, pTP5, pC194), plásmidos de levadura (por ejemplo, pSH19, pSH15), plásmidos de expresión de células de insecto (por ejemplo, pFast-Bac), plásmidos de expresión de células animales (por ejemplo, pA1-11, pXT1, pRc/CMV, pRc/RSB, pcDNAI/Neo), bacteriófagos, tal como el fago A y similares, vectores de virus de insecto, tales como baculovirus y similares (por ejemplo, BmNPV, AcNPV), vectores víricos animales, tales como retrovirus, virus vaccinia, adenovirus y similares.

Como promotor, puede usarse cualquier promotor adecuado para el hospedador que se va a utilizar para la expresión génica. En un método convencional que acompañe al DSB, dado que la tasa de supervivencia de las células hospedadoras a veces disminuye notablemente debido a la toxicidad, es deseable aumentar el número de células al inicio de la inducción utilizando un promotor inducible. Sin embargo, ya que también se puede conseguir una proliferación celular suficiente expresando el complejo enzimático modificador de ácidos nucleicos de la presente invención, también puede utilizarse sin limitación un promotor constitutivo.

Por ejemplo, cuando el hospedador es una célula animal, se utilizan el promotor de SRa, el promotor de SV40, el promotor de LTR, el promotor de CMV (citomegalovirus), el promotor de RSV (virus del sarcoma de Rous), el LTR de MoMuLV (virus de la leucemia del ratón de Moloney), el promotor de HSV-TK (timidina cinasa del virus del herpes simple) y similares. De estos, son preferibles el promotor de CMV, el promotor de SRa y similares.

Cuando el hospedador es Escherichia coli, son preferibles el promotor trp, el promotor lac, el promotor recA, el promotor APL, el promotor lpp, el promotor T7 y similares.

Cuando el hospedador es del género Bacillus, son preferibles el promotor SPO1, el promotor SPO2, el promotor penP y similares.

Cuando el hospedador es una levadura, son preferibles el promotor Gal1/10, el promotor PHO5, el promotor PGK, el promotor GAP, el promotor ADH y similares.

Cuando el hospedador es una célula de insecto, son preferibles el promotor de poliedrina, el promotor P10 y similares.

Cuando el hospedador es una célula vegetal, son preferibles el promotor de CaMV35S, el promotor de CaMV19S, el promotor de NOS y similares.

Como vector de expresión, además de los mencionados anteriormente, puede utilizarse uno que contiene un potenciador, una señal de corte y empalme, un terminador, una señal de adición de poliA, un marcador de selección, tal como un gen de resistencia a fármacos, un gen complementario auxotrófico y similares, y un origen de replicación y similares, según sea necesario.

Puede prepararse un ARN que codifica un complejo enzimático de modificación de ácidos nucleicos, por ejemplo, mediante transcripción en ARNm en un sistema de transcripción in vitro conocido utilizando como molde un ADN que codifica cada proteína.

El complejo de la presente invención puede expresarse intracelularmente introduciendo un vector de expresión que contenga un ADN que codifica un complejo enzimático de modificación de ácidos nucleicos, y cultivando la célula hospedadora.

Como hospedador, se utilizan células del género Escherichia, del género Bacillus, de levadura, de insecto, de origen animal y similares.

Del género Escherichia, se utilizan Escherichia coli K12.DH1 [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 60, 160 (1968)], Escherichia coli JM103 [Nucleic Acids Research, 9, 309 (1981)], Escherichia coli JA221 [Journal of Molecular Biology, 120, 517 (1978)], Escherichia coli HB101 [Journal of Molecular Biology, 41, 459 (1969)], Escherichia coli C600 [Genetics, 39, 440 (1954)] y similares.

Del género Bacillus, se utilizan Bacillus subtilis MI114 [Gene, 24, 255 (1983)], Bacillus subtilis 207-21 [Journal of Biochemistry, 95, 87 (1984)] y similares.

Con levaduras, se utilizan Saccharomyces cerevisiae AH22, AH22R-, NA87-11A, DKD-5D, 20B-12, Schizosaccharomyces pombe NCYC1913, NCYC2036, Pichia pastoris KM71 y similares.

Con células de insecto, cuando el virus es AcNPV, se utiliza una línea celular establecida procedente de larvas de la oruga de la col (células de Spodoptera frugiperda, células Sf), células MG1 procedentes del intestino medio de Trichoplusia ni, células High Five™ de huevos de Trichoplusia ni, células de Mamestra brassicae, células de Estigmena acrea y similares. Con células de insecto, cuando el virus es BmNPV, se utiliza una línea celular establecida procedente de Bombyx mori (células N de Bombyx mori, células BmN) y similares. Con células Sf se utilizan, por ejemplo, células Sf9 (ATCC CRL1711), células Sf21 [citado anteriormente, In Vivo, 13, 213-217 (1977)] y similares. Como insecto se utilizan, por ejemplo, larvas de Bombyx mori, Drosophila, grillos y similares [Nature, 315, 592 (1985)]. Como células animales, se utilizan líneas celulares como células COS-7 de mono, células Vero de mono, células CHO, células CHO con deficiencia del gen dhfr, células L de ratón, células AtT-20 de ratón, células de mieloma de ratón, células GH3 de rata, células FL de ser humano, células de riñón fetal humano (por ejemplo, células HEK293) y similares, células madre pluripotentes como células iPS, células ES y similares de humano y otros mamíferos, y células primarias cultivadas preparadas a partir de diversos tejidos. Además, también pueden utilizarse embriones de pez cebra, ovocitos de Xenopus y similares.

Como células vegetales, se usan células cultivadas en suspensión, callos, protoplastos, segmentos foliares, segmentos radiculares y similares preparados de diversas plantas (por ejemplo, cereales, como arroz, trigo, maíz y similares, cultivos de producción, tales como tomate, pepino, berenjena y similares, plantas ornamentales, tales como claveles, Eustoma russellianum y similares, plantas experimentales, tales como tabaco, Arabidopsis thaliana y similares).

Todas las células hospedadoras mencionadas pueden ser haploides (monoploides), o poliploides (por ejemplo, diploides, triploides, tetraploides y similares).

Un vector de expresión puede introducirse mediante un método conocido (por ejemplo, el método de lisozimas, el método de competición, el método de PEG, el método de coprecipitación con CaCb, el método de electroporación, el método de microinyección, el método del cañón de partículas, el método de lipofección, el método de Agrobacterium y similares) en función del tipo de hospedador.

Las células de Escherichia coli pueden transformarse según los métodos descritos en, por ejemplo, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69, 2110 (1972), Gene, 17, 107 (1982) y similares.

Puede introducirse un vector en células del género Bacillus según los métodos descritos en, por ejemplo, Molecular & General Genetics, 168, 111 (1979) y similares.

Puede introducirse un vector en células de levadura según los métodos descritos en, por ejemplo, Methods in Enzymology, 194, 182-187 (1991), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75, 1929 (1978) y similares.

Puede introducirse un vector en una célula de insecto y en un insecto según los métodos descritos en, por ejemplo, Bio/Technology, 6, 47-55 (1988) y similares.

Puede introducirse un vector en una célula animal según los métodos descritos en, por ejemplo, Cell Engineering, volumen 8 adicional, New Cell Engineering Experiment Protocol, 263-267 (1995) (publicado por Shujunsha) y Virology, 52, 456 (1973).

Una célula en la que se ha introducido un vector puede cultivarse según un método conocido en función del tipo de hospedador.

Por ejemplo, cuando se cultivan células de Escherichia coli o del género Bacillus, es preferible utilizar un medio líquido para el cultivo. El medio contiene preferentemente una fuente de carbono, una fuente de nitrógeno, sustancias inorgánicas y similares que son necesarias para la proliferación del transformante. Algunos ejemplos de la fuente de carbono incluyen glucosa, dextrina, almidón soluble, sacarosa y similares; algunos ejemplos de la fuente de nitrógeno incluyen sustancias inorgánicas u orgánicas como sales de amonio, sales de nitrato, licor de maíz fermentado, peptona, caseína, extracto de carne, torta de soja, extracto de patata y similares; y algunos ejemplos de la sustancia inorgánica incluyen cloruro de calcio, dihidrogenofosfato de sodio, cloruro de magnesio y similares. El medio puede contener extracto de levadura, vitaminas, factor de promoción del crecimiento y similares. El pH del medio es preferentemente de aproximadamente 5 a aproximadamente 8.

Como medio para el cultivo de Escherichia coli es preferible, por ejemplo, el medio M9 con glucosa y casaminoácidos [Journal of Experiments in Molecular Genetics, 431-433, Cold Spring Harbor Laboratory, Nueva York 1972]. En caso necesario, por ejemplo, pueden añadirse al medio agentes como el ácido 3p-indolilacrílico para garantizar una función eficaz de un promotor. Las células de Escherichia coli se cultivan generalmente a de aproximadamente 15 °C a aproximadamente 43 °C. Cuando sea necesario, se puede realizar aireación y agitación.

El género Bacillus se cultiva generalmente a de aproximadamente 30 °C a aproximadamente 40 °C. Cuando sea necesario, se puede realizar aireación y agitación.

Algunos ejemplos de medios para el cultivo de levaduras incluyen el medio mínimo de Burkholder [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, 4505 (1980)], medio SD con casaminoácidos al 0,5 % [Proc. Acad. Sci. USA, 81,5330 (1984)] y similares. El pH del medio es preferentemente de aproximadamente 5 a aproximadamente 8. El cultivo se realiza generalmente a de aproximadamente 20 °C a aproximadamente 35 °C. Cuando sea necesario, se puede realizar aireación y agitación.

Como medio de cultivo de una célula de insecto o un insecto, por ejemplo, se utiliza medio para insectos de Grace [Nature, 195, 788 (1962)] que contiene un aditivo, tal como suero bovino inactivado al 10 % y similares, según sea necesario. El pH del medio es preferentemente de aproximadamente 6,2 a aproximadamente 6,4. El cultivo se realiza generalmente a aproximadamente 27 °C. Cuando sea necesario, se puede realizar aireación y agitación.

Como medio de cultivo de células animales, por ejemplo, se utilizan medio esencial mínimo (MEM) que contiene de aproximadamente un 5 % a aproximadamente un 20 % de suero bovino fetal [Science, 122, 501 (1952)], medio F12 de Ham, medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) [Virology, 8, 396 (1959)], medio RPMI 1640 [The Journal of the American Medical Association, 199, 519 (1967)], medio 199 [Proceeding of the Society for the Biological Medicine, 73, 1 (1950)] y similares. El pH del medio es preferentemente de aproximadamente 6 a aproximadamente 8. El cultivo se realiza generalmente a de aproximadamente 30 °C a aproximadamente 40 °C. Cuando sea necesario, se puede realizar aireación y agitación.

Como medio de cultivo de células vegetales, por ejemplo, se utilizan medio MS, medio LS, medio B5 y similares. El pH del medio es preferentemente de aproximadamente 5 a aproximadamente 8. El cultivo se realiza generalmente a de aproximadamente 20 °C a aproximadamente 30 °C. Cuando sea necesario, se puede realizar aireación y agitación.

El periodo de cultivo no está especialmente limitado, siempre que sea al menos el necesario para que se modifique el sitio diana del ADN bicatenario, y puede seleccionarse adecuadamente según la célula hospedadora. Para evitar mutaciones indeseables fuera de la diana, preferentemente, el cultivo no se realiza más allá de un periodo suficiente para modificar el sitio diana. El momento y la duración del cultivo a baja temperatura cuando se realiza la etapa de cultivo a baja temperatura, al menos temporalmente, es el descrito anteriormente.

Como se ha mencionado anteriormente, el complejo enzimático de modificación de ácidos nucleicos puede expresarse intracelularmente.

Un ARN que codifica un complejo enzimático de modificación de ácidos nucleicos puede introducirse en una célula hospedadora mediante el método de microinyección, el método de lipofección y similares. La introducción del ARN puede realizarse una vez o repetirse varias veces (por ejemplo, de 2 a 5 veces) a intervalos adecuados.

Cuando un complejo de un módulo de reconocimiento de secuencias de ácido nucleico y una enzima convertidora de bases de ácido nucleico se expresa mediante un vector de expresión o una molécula de ARN introducida en la célula, el módulo de reconocimiento de secuencias de ácidos nucleicos reconoce específicamente y se une a una secuencia de nucleótidos diana en el ADN bicatenario (por ejemplo, ADN genómico) de interés y, debido a la acción de la enzima convertidora de bases de ácido nucleico unida al módulo de reconocimiento de secuencias de ácido nucleico, la conversión de bases se produce en la cadena codificante o en la cadena no codificante del sitio diana (secuencia de nucleótidos diana completa o parcial, o ajustada adecuadamente dentro de varios cientos de bases, incluyendo sus proximidades) y se produce un emparejamiento erróneo en el ADN bicatenario (por ejemplo, cuando la citidina desaminasa, como PmCDA1, AID y similares se utilizan como enzima de conversión de bases de ácidos nucleicos, la citosina de la cadena codificante o no codificante en el sitio diana se convierte en uracilo para provocar un emparejamiento erróneo U:G o G:U). Cuando el emparejamiento erróneo no se repara correctamente, y cuando se repara de manera que una base de la cadena opuesta forma un par con una base de la cadena convertida (T-A o A-T en el ejemplo mencionado), o cuando se sustituye otro nucleótido (por ejemplo, U ^A , G) o cuando se suprimen o insertan de una a varias docenas de bases durante la reparación, se introducen diversas mutaciones. Utilizando inhibidores de la reparación por escisión de bases en combinación, se inhibe el mecanismo de BER en las células, aumenta la frecuencia de los errores de reparación, y puede mejorarse la eficacia de la introducción de mutaciones.

En cuanto al motivo de dedo de cinc, la producción de muchos motivos de dedos de cinc realmente funcionales no es fácil, ya que la eficiencia de producción de un dedo de cinc que se une específicamente a una secuencia de nucleótidos diana no es alta y la selección de un dedo de cinc que tenga una alta especificidad de unión es complicada. Mientras que el efector ^t A ^l y el motivo PPR tienen un alto grado de libertad de reconocimiento de la secuencia del ácido nucleico diana en comparación con el motivo del dedo de cinc, un problema sigue siendo la eficiencia, ya que hay que diseñar y construir una gran proteína cada vez según la secuencia de nucleótidos diana.

Por el contrario, ya que el sistema CRISPR-Cas reconoce la secuencia de ADN bicatenario diana por medio de un ARN guía complementario a la secuencia de nucleótidos diana, cualquier secuencia puede ser la diana simplemente sintetizando un oligoADN capaz de formar específicamente un híbrido con la secuencia de nucleótidos diana.

Por lo tanto, en una realización más preferida de la presente invención, como módulo de reconocimiento de secuencias de ácido nucleico se utiliza un sistema CRISPR-Cas en el que al menos una de las capacidades de escisión del ADN de Cas está inactivada (CRISPR-Cas mutante).

La Fig. 1 es un esquema del plásmido de edición del genoma de la presente invención, que utiliza CRISRP-Cas mutante como módulo de reconocimiento de secuencias de ácidos nucleicos.

El módulo de reconocimiento de secuencias de ácidos nucleicos de la presente invención que utiliza CRISRP-Cas mutante se proporciona como un complejo de una molécula de ARN que consiste en un ARN guía (ARNg) complementario a la secuencia de nucleótidos diana y el ARNtracr necesario para reclutar la proteína Cas mutante, y una proteína Cas mutante.

La proteína Cas que se utilizará en la presente invención no está particularmente limitada siempre que pertenezca al sistema CRISPR, y se prefiere Cas9. Los ejemplos de Cas9 incluyen, pero sin limitación, Cas9 de Streptococcus pyogenes (SpCas9), Cas9 de Streptococcus thermophilus (StCas9) y similares. Se prefiere SpCas9. Como Cas mutante para su uso en la presente invención, puede usarse cualquiera de las Cas en las que la capacidad de escisión de las dos hebras del a Dn bicatenario esté inactivada y una que tenga actividad nicasa en la que al menos la capacidad de escisión de una sola hebra esté inactivada. Por ejemplo, en el caso de SpCas9, pueden utilizarse de forma similar un mutante D10A en donde el resto de Asp 10 se convierte en un resto de Ala y carece de capacidad de escisión de una hebra opuesta a la que forma una hebra complementaria al ARN guía, o el mutante H840A en donde el resto de His 840 se convierte en un resto de Ala y carece de capacidad de escisión de la hebra complementaria al ARN guía, o un mutante doble de los mismos, y otros mutantes Cas.

Una enzima convertidora de bases de ácido nucleico y un inhibidor de la reparación por escisión de bases se proporcionan como un complejo con la Cas mutante por un método similar al esquema de acoplamiento con el dedo de cinc antes mencionado y similares. Como alternativa, una enzima convertidora de bases de ácido nucleico y/o un inhibidor de la reparación por escisión de bases y Cas mutante también pueden unirse utilizando aptámeros de ARN MS2F6, PP7 y similares y la cadena principal de ARN mediante la unión de proteínas al mismo. El ARN guía forma una cadena complementaria con la secuencia de nucleótidos diana, el ARNtracr unido recluta a Cas mutante y esta reconoce la secuencia de reconocimiento del PAM (motivo adyacente protoespaciador) del sitio de corte del ADN (cuando se utiliza SpCas9, el PAM es 3 bases de NGG (N es cualquier base), y, teóricamente, puede dirigirse a cualquier posición del genoma). Uno o ambos ADN no pueden escindirse y debido a la acción de la enzima convertidora de bases de ácido nucleico unidas a la Cas mutante, la conversión de bases de ácido nucleico se produce en el sitio diana (adecuadamente ajustada a varios cientos de bases, incluida la secuencia de nucleótidos diana completa o parcial) y se produce un emparejamiento erróneo en el ADN bicatenario. Debido al error del sistema de BER de la célula a reparar, se introducen diversas mutaciones.

Cuando se utiliza CRISRP-Cas mutante como módulo de reconocimiento de secuencias de ácidos nucleicos, se introduce deseablemente un CRISPR-Cas mutante, en forma de un ácido nucleico que codifica un complejo enzimático de modificación de ácidos nucleicos, en una célula que tenga un ADN bicatenario de interés, de manera similar a cuando se utilizan dedos de cinc y similares como módulo de reconocimiento de secuencias de ácidos nucleicos.

Un ADN que codifica Cas puede clonarse mediante un método similar al mencionado anteriormente para un ADN que codifica un inhibidor de la reparación por escisión de bases, de una célula que produce la enzima. Se puede obtener una Cas mutante introduciendo una mutación para convertir un resto de aminoácido de la parte importante para la actividad de corte del ADN (por ejemplo, el resto de Asp 10 y el resto de His 840 para Cas9, aunque sin limitarse a los mismos) en otro aminoácido, en un ADN que codifica la Cas clonada, mediante un método de inducción de mutaciones específicas conocido.

Como alternativa, un ADN que codifique la Cas mutante también puede construirse como un ADN que tenga un uso de codones adecuado para la expresión en una célula hospedadora que se vaya a utilizar, mediante un método similar a los mencionados anteriormente para un ADN que codifica un módulo de reconocimiento de secuencias de ácido nucleico y un ADN que codifica una ADN glucosilasa, y mediante una combinación de síntesis química o un método de PCR o un método de ensamblaje de Gibson. Por ejemplo, la secuencia del CDS y la secuencia de aminoácidos optimizada para la expresión de SpCas9 en células eucariotas se muestran en las SEQ ID NO: 3 y 4. En la secuencia mostrada en la SEQ ID NO: 3, cuando "A" se convierte en "C" en la base n.° 29, puede obtenerse un ADN que codifica un mutante D10A y cuando "CA" se convierte en "GC" en la base n.° 2518-2519, puede obtenerse un ADN que codifica un mutante H840A.

Un ADN que codifica una Cas mutante y un ADN que codifica una enzima convertidora de bases de ácido nucleico pueden estar unidos para permitir la expresión como una proteína de fusión, o diseñados para ser expresados por separado utilizando un dominio de unión, una inteína y similares, y formar un complejo en una célula hospedadora mediante la interacción proteína-proteína o la ligadura de proteínas. Como alternativa, se puede emplear un diseño en el que un ADN que codifica la Cas mutante y un ADN que codifica una enzima convertidora de bases de ácido nucleico se dividen cada uno en dos fragmentos en un sitio de división adecuado, los dos fragmentos se unen entre sí directamente o a través de un enlazador adecuado para expresar un complejo de enzimas modificadoras de ácidos nucleicos como dos complejos parciales, que se asocian y se repliegan en la célula para reconstituir la Cas mutante funcional que tiene una capacidad particular de reconocimiento de la secuencia de ácido nucleico, y se reconstituye una enzima convertidora de bases de ácido nucleico funcional que tiene una actividad catalizadora de la reacción de conversión de bases de ácido nucleico cuando la Cas mutante se une a la secuencia de nucleótidos diana. Por ejemplo, un ADN que codifica el fragmento del lado N-terminal de Cas9 mutante y un ADN que codifica el fragmento del lado C-terminal de Cas mutante se preparan, respectivamente, mediante el método de PCR utilizando cebadores adecuados; un ADN que codifica el fragmento del lado N-terminal de una enzima convertidora de bases de ácido nucleico y un ADN que codifica el fragmento del lado C-terminal de una enzima convertidora de bases de ácido nucleico se preparan de la misma manera; por ejemplo, los ADN que codifican los fragmentos del lado N-terminal están unidos entre sí, y los ADN que codifican los fragmentos del lado C-terminal están unidos entre sí por un método convencional, mediante el cual se puede producir un ADN que codifique dos complejos parciales. Como alternativa, un ADN que codifica el fragmento del lado N-terminal de la Cas mutante y un ADN que codifica el fragmento del lado C-terminal de una enzima convertidora de bases de ácido nucleico están unidos; y un ADN que codifica el fragmento del lado N-terminal de una enzima convertidora de bases de ácido nucleico y un ADN que codifica el fragmento del lado C-terminal de la Cas mutante están unidos, por lo que también se puede producir un ADN que codifique dos complejos parciales. Los respectivos complejos parciales pueden unirse para permitir la expresión como una proteína de fusión, o diseñarse para ser expresados por separado utilizando un dominio de unión, una inteína y similares, y formar un complejo en una célula hospedadora mediante la interacción proteína-proteína o la ligadura de proteínas. Dos complejos parciales pueden unirse para ser expresados como una proteína de fusión. El sitio de división de la Cas mutante no está particularmente limitado siempre que los dos fragmentos divididos puedan reconstituirse de forma que reconozcan y se unan a la secuencia nucleotídica diana, y puede dividirse en un sitio para proporcionar un fragmento del lado N-terminal y un fragmento del lado C-terminal, o pueden unirse adecuadamente no menos de 3 fragmentos obtenidos por división en dos o más sitios para dar dos fragmentos. Las estructuras tridimensionales de varias proteínas Cas son conocidas, y aquellos con conocimientos ordinarios en la materia pueden seleccionar apropiadamente el sitio de división basándose en dicha información. Por ejemplo, ya que la región comprendida entre los aminoácidos 94 y 718 del extremo N de SpCas9 es un dominio (REC) que participa en el reconocimiento de la secuencia de nucleótidos diana y del ARN guía, y la región comprendida entre el aminoácido 1099 y el aminoácido C-terminal es el dominio (PI) que participa en la interacción con el PAM, el fragmento del lado N-terminal y el fragmento del lado C-terminal pueden dividirse en cualquier sitio del dominio REC o del dominio PI, preferentemente en una región libre de una estructura (por ejemplo, entre el aminoácido 204 y el 205 desde el N-terminal (204..205), entre el aminoácido 535 y el 536 desde el N-terminal (535..536) y similares) (véase, por ejemplo, Nat Biotechnol. 33(2): 139­ 142 (2015)). Una combinación de un ADN que codifica un inhibidor de la reparación por escisión de bases y un ADN que codifica una Cas mutante y/o un ADN que codifica una enzima convertidora de bases de ácido nucleico también puede diseñarse de la misma manera que se ha descrito anteriormente.

El ADN obtenido que codifica una Cas mutante y/o una enzima convertidora de bases de ácido nucleico y/o un inhibidor de la reparación por escisión de bases puede insertarse en la región cadena abajo de un promotor de un vector de expresión similar al mencionado anteriormente, dependiendo del hospedador.

Por otro lado, el ADN que codifica el ARN guía y el ARNtracr puede obtenerse mediante el diseño de una secuencia de oligoADN que enlaza una secuencia codificadora de ARNcr que contiene una secuencia de nucleótidos complementaria a la secuencia de nucleótidos diana (por ejemplo, cuando se recluta FnCpfl como Cas, puede usarse el ARNcr que contiene la SEQ ID NO: 20; AAUUUCUACUGUUGUAGAU en el lado 5' de la secuencia de nucleótidos complementaria y las secuencias subrayadas forman pares de bases para adoptar una estructura de tallo-bucle), o una secuencia codificante de ARNcr y, según sea necesario, una secuencia codificadora de ARNtracr conocida (por ejemplo, como secuencia codificadora de ARNtracr cuando Cas9 se recluta como Cas, gttttagagctagaaatagcaagttaaaataaggctagtccgttatcaacttgaaaaagtggc accgagtcggtggtgctttt; SEQ ID NO: 9) y se sintetiza químicamente utilizando un sintetizador de ADN/ARN. Aunque el ADN que codifica el ARN guía y el ARNtracr también puede insertarse en un vector de expresión similar al mencionado anteriormente, dependiendo del hospedador. Como promotor, es preferible utilizar un promotor del sistema pol III (por ejemplo, SNR6, SNR52, SCR1, RPR1, U6, promotor H1, etc.) y un terminador (por ejemplo, la secuencia T6).

Se puede preparar un ARN que codifique la Cas mutante y/o una enzima convertidora de bases de ácido nucleico y/o un inhibidor de la reparación por escisión de bases, por ejemplo, mediante transcripción en ARNm en un sistema de transcripción in vitro conocido utilizando como molde un vector que codifica la Cas mutante anteriormente mencionada y/o una enzima convertidora de bases de ácido nucleico y/o un inhibidor de la reparación por escisión de bases.

El ARN guía-ARNt puede obtenerse diseñando una secuencia de oligoADN que enlace una secuencia complementaria a la secuencia de nucleótidos diana y a la secuencia conocida de ARNt y sintetizándola químicamente mediante un sintetizador de ADN/ARN.

Un ADN o ARN que codifica una Cas mutante y/o una enzima convertidora de bases de ácido nucleico y/o un inhibidor de la reparación por escisión de bases, el ARN guía-ARNtracr o un ADN que lo codifique puede introducirse en una célula hospedadora mediante un método similar al anterior, dependiendo del hospedador.

Dado que las nucleasas artificiales convencionales acompañan a las roturas de ADN bicatenario (DSB), la inhibición del crecimiento y la muerte de las células, supuestamente causada por la rotura desordenada del cromosoma (rotura no diana), se produce al dirigirse a una secuencia genómica. Su efecto es particularmente letal para muchos microorganismos y procariotas e impide su aplicabilidad. En el método de la presente invención, la citotoxicidad se reduce drásticamente en comparación con un método que utiliza una nucleasa artificial convencional, ya que la introducción de la mutación no se realiza por escisión del ADN, sino por reacción de conversión de bases de ácido nucleico en el ADN.

Cuando se producen módulos de reconocimiento de secuencia correspondientes a múltiples secuencias de nucleótidos adyacentes y se utilizan simultáneamente, la eficacia de la introducción de mutaciones puede aumentar más que utilizando una única secuencia de nucleótidos como diana. Como efecto de esto, la inducción de mutaciones es similar incluso cuando ambas secuencias de nucleótidos diana se solapan parcialmente o cuando ambas están separadas por aproximadamente 600 pb. Puede ocurrir tanto cuando las secuencias de nucleótidos objetivo están en la misma dirección (las secuencias de nucleótidos objetivo están presentes en la misma hebra), como cuando están opuestas (la secuencia de nucleótidos diana está presente en cada hebra del ADN bicatenario).

Dado que la técnica de edición del genoma de la presente invención muestra una eficiencia de introducción de mutaciones extremadamente alta, se puede realizar la modificación de múltiples regiones de ADN en posiciones completamente diferentes como dianas. Por lo tanto, en una realización preferida de la presente invención, pueden utilizarse dos o más tipos de módulos de reconocimiento de secuencias de ácidos nucleicos que se unen específicamente a diferentes secuencias de nucleótidos diana (que pueden estar presentes en un gen objetivo, o en dos o más genes objetivo diferentes, que pueden estar presentes en el mismo cromosoma o en cromosomas diferentes). En este caso, cada uno de estos módulos de reconocimiento de secuencias de ácido nucleico, una enzima convertidora de bases de ácido nucleico y un inhibidor de la reparación por escisión de bases forman un complejo enzimático modificador de ácidos nucleicos. En este caso, puede utilizarse una enzima convertidora de bases de ácido nucleico común y un inhibidor de la reparación por escisión de bases. Por ejemplo, cuando se utiliza el sistema CRISPR-Cas como módulo de reconocimiento de secuencias de ácidos nucleicos, se utilizan un complejo común de una proteína Cas, una enzima convertidora de bases de ácido nucleico y un inhibidor de la reparación por escisión de bases (incluida la proteína de fusión) y se producen dos o más tipos de ARN quiméricos de ARNtracr y cada uno de los dos o más ARN guía que forman respectivamente una hebra complementaria con una secuencia de nucleótidos diana diferente y se utilizan como ARN guía-ARNtracr. Por otro lado, cuando se utilizan el motivo del dedo de zinc, el efector TAL y similares como módulos de reconocimiento de secuencias de ácidos nucleicos, por ejemplo, pueden fusionarse una enzima convertidora de bases de ácido nucleico y un inhibidor de la reparación por escisión de bases con un módulo de reconocimiento de secuencias de ácido nucleico que se une específicamente a un nucleótido diana diferente.

Para expresar el complejo enzimático modificador de ácidos nucleicos de la presente invención en una célula hospedadora, como se ha mencionado anteriormente, se introduce en una célula hospedadora un vector de expresión que contiene un ADN que codifica el complejo enzimático modificador del ácidos nucleicos, o un ARN que codifica el complejo enzimático modificador del ácidos nucleicos. Para una introducción eficaz de la mutación, es deseable mantener una expresión del complejo enzimático modificador de ácidos nucleicos de un nivel determinado o superior durante un periodo no inferior al establecido. Desde este punto de vista, se garantiza la introducción de un vector de expresión (plásmido, etc.) replicable de forma autónoma en una célula hospedadora. Sin embargo, ya que el plásmido, etc., es un ADN exógeno, se eliminan preferentemente de forma rápida tras la introducción exitosa de la mutación. Por lo tanto, aunque está sujeta a cambios en función del tipo de célula hospedadora y similares, por ejemplo, el plásmido introducido se elimina deseablemente de la célula hospedadora después una vez transcurridas de 6 horas a 2 días desde la introducción de un vector de expresión utilizando varios métodos de eliminación de plásmidos bien conocidos en la técnica.

Como alternativa, siempre que se obtenga la expresión de un complejo enzimático modificador de ácidos nucleicos, suficiente para la introducción de la mutación, es preferible introducir la mutación en el ADN bicatenario diana mediante expresión transitoria utilizando un vector de expresión o un ARN sin replicabilidad autónoma en una célula hospedadora (por ejemplo, un vector, etc. que carezca de origen de replicación que funcione en la célula hospedadora y/o un gen que codifique la proteína necesaria para la replicación).

La presente invención se explica a continuación haciendo referencia a los ejemplos, que no deben interpretarse como limitativos.

[Ejemplos]

En los ejemplos mencionados a continuación, los experimentos se realizaron de la siguiente manera.

<Línea celular^Cultivo^TransformaciónHnducción de la expresión>

Se utilizaron células CHO-K1 adherentes procedentes de ovario de hámster chino. Estas células se cultivaron en medio F12 de Ham (Life Technologies, Carlsbad, CA, EE. UU.) complementado con un suero fetal bovino al 10 % (Biosera, Nuaille, Francia) y 100 pg/ml de penicilina-estreptomicina (Life Technologies, Carlsbad, CA, EE. UU.). Las células se incubaron en una atmósfera humidificada con un 5 % de CO2 a 37 °C. Para la transfección, se utilizó una placa de 24 pocillos y las células se sembraron a 0,5 * 105 células por pocillo y se cultivaron durante un día. Siguiendo las instrucciones del fabricante, se transfectaron en las células 1,5 pg de plásmido y 2 pl de lipofectamina 2000 (Life Technologies, Carlsbad, CA, EE. UU.). Después de 5 horas de la transfección, se cambió el medio por medio F12 de Ham con 0,125 mg/ml de G418 (InvivoGen, San Diego, CA, EE. UU.) y las células se incubaron durante 7 días. Posteriormente, las células se utilizaron para el cálculo de la siguiente eficiencia de introducción de mutaciones.

La etapa de cultivo a baja temperatura incluyó temporalmente la transfección similar a la mencionada, cambio de medio por medio F12 de Ham que contenía 0,125 mg/ml de G418 a las 5 horas del medio de transfección, cultivo continuo de una noche a 25 °C, y cultivo durante 2 días a 37 °C. A continuación, las células se utilizaron para el siguiente cálculo de la eficiencia de introducción de mutaciones.

<Cálculo de la eficacia de la introducción de mutaciones>

El esquema del cálculo de la eficacia de la introducción de mutaciones se muestra en la Fig. 2. La HPRT (hipoxantinaguanina fosforibosiltransferasa) es una de las enzimas metabólicas de las purinas, y las células con el gen HPRT destruido adquieren resistencia a la 6-TG (6-tioguanina). Para calcular la eficiencia de introducción de mutaciones en el gen HPRT, las células se desprendieron del plástico utilizando tripsina-EDTA (Life Technologies, Carlsbad, CA, EE. UU.) y se dispersaron 100-500 células en una placa que contenía medio F12 de Ham con G418 o G418 5 g/ml de 6-TG (Tokyo Chemical Industry, Tokio, Japón). Siete días después, se contó el número de colonias resistentes. La eficacia de la introducción de la mutación se calculó como una relación entre las colonias resistentes a 6TG y las colonias resistentes a G418.

<Análisis de la secuencia>

Para el análisis de la secuencia, las colonias resistentes a G418 y 6TG se trataron con tripsina y se sedimentaron por centrifugación. Siguiendo las instrucciones del fabricante, el ADN genómico se extrajo del sedimento utilizando el kit NucleoSpin Tissue XS (Macherey-Nagel, Duren, Alemania). Los fragmentos de PCR que contienen el sitio diana de HPRT se amplificaron a partir del ADN genómico utilizando el cebador directo (ggctacatagagggatcctgtgtca; SEQ ID NO: 18) y el cebador inverso (acagtagctcttcagtctgataaaa; SEQ ID NO: 19). El producto de la PCR se clonó por TA en el vector de Escherichia coli (E. coli) y se analizó por el método de Sanger.

<Operación de ácido nucleico>

El ADN se procesó o construyó mediante cualquiera del método de la PCR, el tratamiento con enzimas de restricción, ligamiento, el método de ensamblaje de Gibson y síntesis química artificial. El plásmido se amplificó con la cepa de Escherichia coli XL-10 gold o DH5a y se introdujo en las células por el método de lipofección.

<Construcción>

El esquema del vector plasmídico de edición del genoma utilizado en el Ejemplo se muestra en la Fig. 1. Utilizando el vector pcDNA3.1 como base, se construyó un vector utilizado para la transferencia de genes por transfección en células CHO. Se añadieron al mismo una señal de localización nuclear (ccc aag aag aag agg aag gtg; SEQ ID NO: 11 (PKKKRKV; que codifica la SEQ ID NO: 12)) que se añadió al ORF del gen de Cas9 de Streptococcus pyogenes que tenía los codones optimizados para la expresión en eucariotas (SEQ ID NO: 3 (que codifica la SEQ ID NO: 4)), la construcción resultante se ligó en la región cadena abajo de un promotor de CMV mediante una secuencia enlazadora, un ORF de gen de desaminasa (PmCDA1 de Petromyzon marinus) que tiene los codones optimizados para la expresión en células humanas (SEQ ID NO: 1 (que codifica la SEQ ID NO: 2)), y posteriormente se expresó el producto obtenido como una proteína de fusión. Además, también se produjo una construcción para la expresión de fusión del gen Ugi (procedente de PSB2 con codones optimizados para la expresión en células eucariotas: SEQ ID NO: 5 (que codifica la SEQ ID NO: 6)). También se ligó un gen de resistencia a medicamentos (NeoR: gen de resistencia a G418) mediante una secuencia que codifica el péptido 2A (gaa ggc agg gga agc ctt ctg act tgt ggg gat gtg gaa gaa aac cct ggt cca; SEQ ID NO: 13 (que codifica EG^r G^s LLT^c G^d VEENPGP; SEQ ID NO: 14)). Como secuencia enlazadora, se utilizó el enlazador 2xGS (dos repeticiones de ggt gga gga ggt tct; SEQ ID NO: 15 (que codifica GGGGS; SEQ ID NO: 16)). Como terminador, se ligó el terminador de señal de poli A de SV40 (SEQ ID NO: 17).

En el caso de Cas9, se utilizó el mutante Cas9 (nCas9) en el que se introdujo una mutación para convertir el resto de ácido aspártico 10 en alanina (D10A, correspondiente a la mutación de la secuencia de ADN a29c) y el mutante Cas9 (dCas9) en el que se introdujo además una mutación para convertir el resto de histidina 840 en alanina (H840A, correspondiente a la mutación de la secuencia de ADN ca2518 gc) para eliminar la capacidad de corte de cada uno o de ambos lados de la cadena de ADN.

El ARNg se colocó entre el promotor H1 (SEQ ID NO: 10) y la señal de poli T (tttttt) como una estructura quimérica con el ARNtracr (derivado de Streptococcus pyogenes; SEQ ID NO: 9) y se incorporó en un vector plasmídico para expresar el gen de desaminasa anteriormente mencionado y similares. Como secuencia de bases dirigida al ARNg, se utilizaron la secuencia de 16 a 34 (ccgagatgtcatgaaagaga; SEQ ID NO: 7) (sitio 1) desde el punto de inicio del exón 3 del gen HPRT, y una secuencia de la hebra complementaria (ccatgacggaatcggtcggc; SEQ ID NO: 8) (sitio 2R) hasta la secuencia -15 a 3 desde el punto de inicio del exón 1 del gen HPRT. Se introdujeron en las células y se expresaron para formar un complejo de ARNg-ARNtracr y Cas9-PmCDA1 o Cas9-PmCDA1-Ugi.

Ejemplo 1 Varios plásmidos de edición del genoma y evaluación de la eficacia de la introducción de mutaciones según las condiciones

Los resultados de la evaluación de varios plásmidos de edición del genoma y la eficiencia de introducción de mutaciones según las condiciones se muestran en la tabla 1. En el ejemplo 1, el sitio 1 (SEQ ID NO: 7) se utilizó como secuencia de bases del ARNg para todos los que no se describen como sitio 2R.

T l 11

Un plásmido que utiliza nCas9 como Cas9 mutante (nCas-PmCDA1-2A-Neo) mostró una eficiencia de introducción de mutaciones del 35,9 %, y un plásmido que utiliza dCas9 como Cas9 mutante (dCas-PmCDA1-2A-Neo) mostró una eficiencia de introducción de mutaciones del 2,08 %. Por otro lado, en los casos en que se utiliza un plásmido con Ugi ligado a PmCDA1, un plásmido que utiliza nCas9 como Cas9 mutante (+Ugi nCas-PmCDA1-2A-Neo) mostró una eficiencia de introducción de mutaciones del 91,0 %, y un plásmido que utiliza dCas9 como Cas9 mutante (+Ugi dCas-PmCDA1-2A-Neo) mostró una eficiencia de introducción de mutaciones del 86,2 %. Por lo tanto, se demostró que la eficacia de la introducción de mutaciones mejora significativamente mediante la expresión de la fusión de la proteína Ugi, que inhibe la reparación de las bases desaminadas, y en particular, uno utilizando dCas9 mostró un sorprendente aumento en la eficiencia de introducción de mutaciones mejorando el efecto por el uso combinado de Ugi. En la tabla 1, Cas muestra un plásmido que utiliza Cas9 sin introducir la mutación, nCas(D10A)-2A-Neo, dCas-2A-Neo sitio 1 y dCas-2A-Neo sitio 2r muestran plásmidos sin ligamiento de una enzima convertidora de bases de ácido nucleico, y cada uno de ellos se utilizó como control.

Además, se demostró que las células cultivadas temporalmente (durante una noche) a una temperatura baja de 25 °C (pulso de 25 °C) después de la transfección y utilizando cualquiera de las nCas9 (nCas-PmCDA1-2A-Neo) y dCas9 (dCas-PmCDA1-2A-Neo) presentan una eficiencia de introducción de mutaciones significativamente mejorada (61,9 % y 12,5 %, respectivamente). En la tabla 1, dCas-2A-Neo muestra un plásmido sin fusión con la enzima convertidora de bases de ácidos nucleicos y se utiliza como control.

A partir de lo anterior, se demostró que, según la técnica de edición del genoma de la presente invención, la eficacia de la introducción de mutaciones mejora notablemente en comparación con las técnicas convencionales de edición del genoma que utilizan enzimas de conversión de bases de ácidos nucleicos.

Ejemplo 2 Análisis del patrón de introducción de mutaciones

Se extrajo el ADN del genoma de las colonias de introducción de mutaciones obtenidas, la región diana del gen HPRT se amplificó mediante PCR, se llevó a cabo la clonación TA y se realizó el análisis de la secuencia. Los resultados se muestran en la Fig. 3. Los vectores de edición utilizados fueron Cas9, nCas9(D10A)-PmCDA1 y dCas9-PmCDA1, el inhibidor de la reparación por escisión de bases no se expresó, y se utilizaron las colonias de las células cultivadas a 37 °C. En la Figura, el TGG encerrado en una caja negra muestra la secuencia del PAM.

En la Cas9 libre de introducción de mutaciones, se observaron grandes eliminaciones e inserciones centradas directamente sobre la secuencia de PAM. Por otro lado, en nCas9 (D10A)-PmCDA1, se observó una supresión a pequeña escala de una docena de bases, y su región contenía una base diana de desaminación. En dCas9-PmCDA1, se observó una mutación de C a T entre 19 y 21 bases cadena arriba de la secuencia de PAM, y se introdujo una mutación puntual de una sola base en 10 clones del total de 14 clones sometidos a análisis de secuencia.

A partir de lo anterior, se demostró que la introducción de mutaciones puntuales es posible incluso cuando se aplica a las células de mamíferos una técnica de edición del genoma que utiliza una enzima convertidora de bases de ácido nucleico.

Ejemplo 3 Estudio con otras células de mamífero

Utilizando células HEK293T, que proceden de riñón fetal humano, se evaluó la eficacia de la introducción de mutaciones. Se utilizó como vector el mismo que en el Ejemplo 1, salvo que la secuencia de bases diana del ARNg fue la secuencia del gen EMX1 (mostrada en la SEQ ID No : 21) descrita en "Tsai S.Q. et al., (2015) Nat Biotechnol., 33(2): 187-197" y las secuencias candidatas no diana 1 a 4 (corresponden respectivamente a las secuencias de Emx 1 no diana 1 - Emx 1 no diana 4 en las tablas 2, 3 y mostradas en las SEQ ID NO: 22 - 25). El vector se introdujo en células HEK293T por transfección. Sin selección de las células, las células enteras se recuperaron dos días después y se extrajo el ^a Dⁿ genómico. Las condiciones de cultivo, salvo la selección de las células y el periodo hasta la recuperación total de las células y las condiciones de transfección, fueron las mismas que las de las células CHO-K1 mencionadas anteriormente. Posteriormente, según el método descrito en "Nishida K. et al. (2016) Science, 6: 353(6305)", se amplificaron las regiones que contienen los objetivos respectivos mediante PCR utilizando los cebadores que se muestran en la tabla 2, y el patrón de introducción de mutaciones se analizó utilizando un secuenciador de próxima generación. Los resultados se muestran en la tabla 3. En la tabla, el número debajo de la secuencia muestra la tasa de sustitución (%) del nucleótido.

Claims (13)

REIVINDICACIONES

1. Un método para modificar un sitio diana de un ADN bicatenario, que comprende una etapa de introducir un complejo en donde se unen un módulo de reconocimiento de secuencias de ácido nucleico que se une específicamente a una secuencia de nucleótidos diana en un ADN bicatenario determinado y PmCDA1, en una célula de mamífero que contiene el ADN bicatenario, y cultivar la célula a una temperatura de 20 °C a 35 °C, al menos temporalmente, para convertir uno o más nucleótidos en el sitio diana en otro u otros nucleótidos o eliminar uno o más nucleótidos, o insertar uno o más nucleótidos en dicho sitio diana, sin escindir al menos una hebra de dicho ADN bicatenario en el sitio diana, en donde el módulo de reconocimiento de secuencias de ácido nucleico es un sistema CRISPR-Cas en donde se inactiva al menos una capacidad de escisión de ADN de Cas.

2. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde dicha Cas es deficiente en dos capacidades de corte de ADN.

3. El método de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, en donde la temperatura es de 20 °C a 25 °C.

4. El método de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, en donde la temperatura es de 25 °C.

5. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde el ADN bicatenario se pone en contacto con el complejo introduciendo un ácido nucleico que codifica el complejo en una célula de mamífero que tiene el ADN bicatenario.

6. Un método para modificar un sitio diana de un ADN bicatenario, que comprende una etapa de poner en contacto un complejo en donde se unen un módulo de reconocimiento de secuencias de ácido nucleico que se une específicamente a una secuencia de nucleótidos diana en un ADN bicatenario específico, una enzima convertidora de bases de ácido nucleico y un inhibidor de la reparación por escisión de bases, a dicho ADN bicatenario para convertir uno o más nucleótidos en el sitio diana en otros uno o más nucleótidos o eliminar uno o más nucleótidos o insertar uno o más nucleótidos en dicho sitio diana, sin escindir al menos una hebra de dicho ADN bicatenario en el sitio diana,

en donde el módulo de reconocimiento de secuencias de ácido nucleico es un sistema CRISPR-Cas en donde se inactiva al menos una capacidad de escisión de ADN de Cas,

en donde la enzima convertidora de bases de ácido nucleico es PmCDA1 codificada por una secuencia de nucleótidos que tiene los codones optimizados para una célula hospedadora.

7. El método de acuerdo con la reivindicación 6, en donde dicha Cas es deficiente en dos capacidades de corte de ADN.

8. El método de acuerdo con la reivindicación 6 o 7, en donde el inhibidor de la reparación por escisión de bases es un inhibidor de uracilo ADN glucosilasa.

9. El método de acuerdo con la reivindicación 6, en donde la célula hospedadora es una célula de mamífero.

10. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 9, en donde el ADN bicatenario se pone en contacto con el complejo introduciendo un ácido nucleico que codifica el complejo en una célula que tiene el ADN bicatenario.

11. Un complejo enzimático de modificación de ácidos nucleicos, en donde se unen un módulo de reconocimiento de secuencias que se une específicamente a una secuencia de nucleótidos diana en un ADN bicatenario específico, una enzima convertidora de bases de ácido nucleico y un inhibidor de la reparación por escisión de bases, convirtiendo dicho complejo uno o más nucleótidos en el sitio diana en uno o más nucleótidos diferentes o elimina uno o más nucleótidos o inserta uno o más nucleótidos en dicho sitio diana, sin escindir al menos una hebra de dicho ADN bicatenario en el sitio diana,

en donde el módulo de reconocimiento de secuencias de ácido nucleico es un sistema CRISPR-Cas en donde se inactiva al menos una capacidad de escisión de ADN de Cas, y

en donde la enzima convertidora de bases de ácido nucleico es PmCDA1 codificada por una secuencia de nucleótidos que tiene los codones optimizados para una célula hospedadora.

12. El complejo enzimático modificador de ácidos nucleicos de acuerdo con la reivindicación 11, en donde la célula hospedadora es una célula de mamífero.

13. Un ácido nucleico que codifica el complejo enzimático modificador de ácidos nucleicos de acuerdo con la reivindicación 11 o 12.