ES2918626T3

ES2918626T3 - Receptor antigénico quimérico.

Info

Publication number: ES2918626T3
Application number: ES14784368T
Authority: ES
Inventors: Martin Pule; Kwee Yong; Lydia Lee; Ben Draper
Original assignee: Autolus Ltd
Current assignee: Autolus Ltd
Priority date: 2013-10-10
Filing date: 2014-10-10
Publication date: 2022-07-19
Anticipated expiration: 2034-10-10
Also published as: US20160237139A1; BR112016007805A2; CA2926560A1; AU2014333564A1; US10160794B2; WO2015052538A1; US20210101959A1; KR20160067177A; GB201317929D0; MX2016004362A; RU2016117383A; JP2019052190A; US20190100571A1; SG11201602414SA; US20240076352A1; EP3055326A1; EP3055326B1; JP2016538830A; AU2014333564B2; RU2019102382A

Abstract

La presente invención proporciona un receptor de antígeno quimérico (CAR) que comprende: (i) un dominio de unión al antígeno de maduración de células B (BCMA) que comprende al menos parte de un ligando inductor de proliferación (abril); (ii) un dominio espaciador (iii) un dominio transmembrana; y (iv) un dominio de señalización de células T intracelular. La invención también proporciona el uso de dicha célula T que expresa dicho automóvil en el tratamiento de enfermedades mediadas por las células plasmáticas, como el mieloma múltiple. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Receptor antigénico quimérico

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se relaciona con un receptor antigénico quimérico (CAR) que se une al antígeno de maduración de células B (BCMA). Las células T que expresan tal CAR son útiles en el tratamiento de enfermedades de células plasmáticas, tales como el mieloma múltiple.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

Mieloma múltiple

El mieloma múltiple (mieloma) es una malignidad de células plasmáticas de la médula ósea. Colecciones de células plasmáticas anormales se acumulan en la médula ósea, donde interfieren con la producción de células sanguíneas normales. El mieloma es la segunda malignidad hematológica más común en E.U. (después del linfoma no de Hodgkin), y constituye el 13% de las malignidades hematológicas y 1% de todos los cánceres. La enfermedad es agobiante en cuanto al sufrimiento, así como al costo médico, dado que da lugar a fracturas patológicas, susceptibilidad a infecciones, falla renal y luego de médula ósea antes de la muerte.

A diferencia de muchos linfomas, el mieloma actualmente es incurable. Los agentes quimioterapéuticos estándar, utilizados en el linfoma, son inefectivos en gran medida para el mieloma. Además, dado que la expresión de CD20 se pierde en las células plasmáticas, el Rituximab no puede utilizarse contra esta enfermedad. Nuevos agentes, tales como Bortezamib y Lenolidomida, son parcialmente efectivos, pero no conducen a remisiones duraderas.

De esta manera, existe la necesidad de agentes alternativos para el tratamiento del mieloma, los cuales deben tener una eficacia incrementada y efectos a largo plazo mejorados.

Receptores antigénicos quiméricos (CAR)

Los receptores antigénicos quiméricos son proteínas que, en su formato usual, injertan la especificidad de un anticuerpo monoclonal (mAb) a la función efectora de una célula T. Su forma usual es la de una proteína de dominio transmembranal tipo I con un extremo amino terminal de reconocimiento de antígenos, un espaciador, un dominio transmembranal conectado en su totalidad a un endodominio compuesto que transmite señales de supervivencia y activación de células T (ver Figura 3).

La forma más común de estas moléculas usa fragmentos variables de cadena sencilla (scFv) derivados de anticuerpos monoclonales para reconocer un antígeno objetivo. El scFv se fusiona mediante un espaciador y un dominio transmembranal a un endodominio de señalización. Tales moléculas resultan en la activación de la célula T en respuesta al reconocimiento por el scFv de su objetivo. Cuando las células T expresan tal CAR, reconocen y eliminan células objetivo que expresan el antígeno objetivo. Varios CAR se han desarrollado contra antígenos asociados a tumores, y estrategias de transferencia adoptiva al utilizar tales células T que expresan CAR actualmente se encuentran en pruebas clínicas para el tratamiento de diversos cánceres. Carpenter et al (2013, Clin Cancer Res 19(8) 2048-60) describen un CAR que incorpora un scFv contra el antígeno de maduración de células B (BCMA).

El BCMA es una proteína transmembranal que se expresa preferencialmente en linfocitos maduros, es decir, células B de memoria, plasmoblastos y células plasmáticas de médula ósea. El BCMA también se expresa en células de mieloma múltiple.

Carpenter et al demuestran que las células T transducidas para expresar el CAR anti-BCMA son capaces de eliminar específicamente células de mieloma de un plasmacitoma de un paciente con mieloma.

Aunque las estrategias con CAR al utilizar anticuerpos anti-BCMA se muestran promisorias, una consideración particular cuando se orientan hacia este antígeno es la densidad particularmente baja de BCMA en células de mieloma en comparación, por ejemplo, con CD19 en una célula de linfoma. Por tanto, existe la necesidad de incrementar la sensibilidad del reconocimiento de células objetivo por una célula T con CAR anti-BCMA.

DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

Figura 1 - Especificidad de ligandos y asignación de funciones de APRIL y BAFF

El factor activador de células B (BAFF, TNFSF13B) interactúa con el Receptor de BAFF (BAFF-R, TNFRSF13C), antígeno de membrana de células B (BCMA, TNFRSF17) y el activador transmembranal y modulador de calcio e interactivador de ligando de ciclofilina (TACI, TNFRSF13B) mientras el ligando inductor de proliferación A (APRIL, TNFSF13) interactúa con BCMA, TACI y proteoglicanos. La activación de BAFF-R afecta la supervivencia de células B periféricas, mientras BCMA puede afectar la supervivencia de células plasmáticas. La interacción de APRIL con proteoglicanos implica al extremo amino terminal que contiene cadenas laterales de glicol-saminoglicano sulfatado ácido de APRIL.

Figura 2 - Datos de expresión de BCMA en mieloma

Las células de mieloma de muestras de médula ósea de 39 pacientes con mieloma múltiple se aislaron por una selección con perlas magnéticas y CD138+. Estas células se tiñeron con el anticuerpo monoclonal anti-BCMA, J6MO, conjugado con PE (GSK). El número de copia de antígeno se cuantificó al utilizar perlas PE Quantibrite (Becton Dickenson) conforme a las instrucciones del fabricante. Una gráfica de cuadros y puntos del número de copia de antígeno se presenta en conjunto con el intervalo, intercuartil y valores medios graficados. Encontramos que el intervalo es 348.7-4268.4 copias de BCMA por célula con una media de 1181 y una mediana de 1084.9.

Figura 3 - Diseño estándar de un receptor antigénico quimérico

Se muestra el formato típico de un receptor antigénico quimérico. Estos son proteínas transmembranales tipo I. Un ectodominio reconoce el antígeno. Este se compone de un fragmento variable de de cadena sencilla (scFv) derivado de anticuerpo que se asocia a un dominio espaciador. Este a su vez se conecta a un dominio transmembranal que actúa para anclar la molécula en la membrana. Finalmente, este se conecta a un endodominio que actúa para transmitir señales intracelulares a la célula. Este se compone de uno o más dominios de señalización.

Figura 4 -Diseño de los diferentes CAR generados basados en APRIL.

El diseño de los CAR, como se muestra en la Figura 3, se modificó a fin de que el scFv se reemplazara con una forma modificada de APRIL para actuar como dominio de unión a antígenos: APRIL se truncó a fin de que el extremo amino terminal de unión a proteoglicanos estuviera ausente. Un péptido de señal luego se asoció al extremo amino terminal de APRIL truncado para dirigir la proteína a la superficie celular. Tres CAR se generaron con este dominio de unión basado en APRIL: A. En el primer CAR, el dominio de tallo de CD8 humano se utilizó como dominio espaciador. B. En el segundo CAR, la bisagra de IgG1 se utilizó como dominio espaciador. C. En el tercer CAR, los dominios de bisagra, CH2 y CH3 de la IgG1 humana modificada con las mutaciones pva/a descritas por Hombach et al (2010 Gene Ther. 17:1206-1213) para reducir la unión de receptores Fc, se utilizaron como espaciador (de ahora en adelante referido como Fc-pvaa). En todos los CAR, estos espaciadores se conectaron al dominio transmembranal CD28 y luego a un endodominio tripartita que contiene una fusión del CD28, OX40 y el endodominio CD3-Zeta (Pule et al, Molecular Therapy, 2005: Volumen 12; Número 5; Páginas 933-41).

Figura 5 - Secuencia de aminoácidos acotada de los tres APRIL-CARS anteriores

A: Muestra la secuencia de aminoácidos acotada del CAR de APRIL de tallo de CD8. B: Muestra la secuencia de aminoácidos acotada del CAR basado en la bisagra de IgG1 de APRIL. C: Muestra la secuencia de aminoácidos acotada del CAR basado en Fc-pvaa de APRIL.

Figura 6- Expresión y unión a ligandos de diferentes CAR basados en APRIL

A. Los receptores se coexpresaron con un CD34 truncado con gen marcador en un vector génico retroviral. La expresión del gen marcador en células transducidas permite la confirmación de la transducción. B. Células T se transdujeron con CAR basados en APRIL ya sea con el espaciador de tallo de CD8, la bisagra de IgG1 o el espaciador de Fc. Para probar si estos receptores podían expresarse de modo estable en la superficie celular, las células T luego se tiñeron con anti-APRIL-biotina/estreptoavidina APC y anti-CD34. Se realizó análisis citométrico de flujo. APRIL se detectó de igual modo en la superficie celular en los tres CAR, lo que sugiere que se expresan de modo estable por igual. C. Después, se determinó la capacidad de los CAR para reconocer TACI y BCMA. Las células T transducidas se tiñeron ya sea con BCMA o TACI recombinantes fusionados a una fusión de Fc de IgG2a de ratón, en conjunto con un anticuerpo secundario antimouse y anti-CD34. Los tres formatos de receptores mostraron unión tanto a BCMA como TACI. Un hallazgo sorprendente fue que la unión a BCMA pareció mayor que a TACI. Un hallazgo sorprendente más fue que, aunque los tres CAR se expresaron de igual modo, los CAR de tallo de CD8 y bisagra de IgG1 parecieron mejores en reconocer BCMA y TACI que aquel con el espaciador de Fc.

Figura 7 - Función de las diferentes construcciones de CAR.

Se realizaron ensayos funcionales de los tres diferentes CAR basados en APRIL. Células T de sangre periférica de donantes normales se dejaron sin transducir (NT), o se transdujeron para expresar los diferentes CAR. La transducción se realizó al utilizar sobrenadante con igual título. Estas células T luego se agotaron en CD56 para remover la actividad NK inespecífica y se utilizaron como efectoras. Células SupT1, ya sea sin transducir (NT), o transducidas para expresar BCMA o TACI, se utilizaron como objetivos. Los datos mostrados son la media y la desviación estándar de 5 experimentos independientes. A. La eliminación específica de células T que expresan BCMA y TACI se determinó al utilizar liberación de cromo. B. La liberación de interferón-y también se determinó. Los objetivos y efectores se cocultivaron a una relación de 1:1. Después de 24 horas, el interferón-y en el sobrenadante se analizó por ELISA. C. La proliferación / supervivencia de células T con CAR también se determinaron al contar el número de células T con CAR en el mismo cocultivo incubado por 6 días más. Los 3 CAR dirigen respuestas contra objetivos que expresan BCMA y TACI. Las respuestas a BCMA fueron mayores que para TACI.

Figura 8 - Eliminación de células de mieloma primario por células T con CAR de APRIL

Dado que la mayor parte de las células de mieloma primario expresan un bajo número de moléculas de BCMA en su superficie, se investigó si la eliminación de células de mieloma primario se presenta a pesar de la expresión en baja densidad. Se seleccionaron tres casos que representaron el intervalo de expresión de BCMA descrito en la Figura 2: el primero tenía expresión débil (inferior a la media); el segundo caso tenía expresión intermedia (aproximadamente la expresión media) y el tercero era brillante (por arriba de la expresión media). Un histograma de tinción de BCMA contra el control de isotipo para los tres casos se muestra a la izquierda. En este ensayo, sólo se probaron los CAR de APRIL de tallo y y bisagra de CD8. A la izquierda, la supervivencia de células de mieloma en comparación con cifras iniciales se muestra en el día 3 y día 6 después de un cocultivo 1:1 de células de mieloma y células T con CAR. En el día 6, >95% de las células de mieloma se eliminaron, incluyendo aquellas con expresión débil de BCMA.

Figura 9 - Vector que coexpresa CAR basado en APRIL con CD34 truncado

Una línea celular que expresa el vector utilizado para el análisis selectivo se incubó con BCMA-Fc o TACI-Fc y se tiñó con mAb conjugados con PE y FITC anti-CD34 y anti-Fc humano. Las células entonces se estudiaron por citometría de flujo. Esto muestra un patrón típico de unión de BCMA y TACI en relación con el CD34 con gen marcador.

Figura 10A - Diagrama esquemático que ilustra un CAR clásico

B: Diseño de los diferentes CAR generados basados en APRIL.

Un péptido de señal se asocia al extremo amino terminal de APRIL truncado. Este se fusionó a diferentes espaciadores: los dominios de bisagra, CH2 y CH3 de IgG1 humana modificados con la mutación pvaa descrita por Hombach et al (2010 Gene Ther. 17:1206-1213) para reducir la unión de receptores Fc; el tallo de CD8a humano; y la bisagra de IgG1. Estos espaciadores se conectaron a un endodominio tripartita que contenía el dominio transmembranal de CD28, el endodominio OX40 y el endodominio CD3-Zeta.

Figura 11 - Expresión de diferentes CAR

Los receptores se coexpresaron con proteína de fluorescencia azul intensificada 2 (eBFP2) al utilizar una secuencia IRES. Células T humanas primarias se transdujeron y tiñeron con APC anti-APRIL-biotina/estreptoavidina. Se realizó análisis citométrico de flujo. La señal de eBFP2 se muestra contra la detección de APRIL. Los tres CAR se expresan de modo estable (experimento representativo de 3 experimentos independientes realizados al utilizar 3 diferentes donantes normales de células T).

Figura 12 - - Ensayo de liberación de cromo

Se utilizaron células T de sangre periférica de donantes normales ya sea sin transducir (NT), o transducidas para expresar diferentes CAR espaciadores como efectores, y células SupT1 ya sea sin transducir (NT), o transducidas para expresar BCMA o TACI como objetivos. Las células T se agotaron en CD56 para reducir la actividad NK. Este es uno representativo de tres experimentos independientes y se muestra como ejemplo. Los datos acumulativos de eliminación se muestran en la Figura 7^a. La eliminación específica de células T que expresan BCMA y TACI se ve sin actividad contra células objetivo negativas.

Figura 13 - Liberación de interferón gamma

Un cocultivo 1:1 de efectoras y objetivos se mide por ELISA. La construcción de tallo de CD8 parece tener la mejor especificidad, mientras los resultados de la construcción de bisagra en la mayor parte de la liberación de interferón demuestran cierta actividad inespecífica. Esto es representativo de 3 experimentos independientes y se muestra como ejemplo. Los datos acumulativos de liberación de interferón gamma se muestran en la Figura 7B.

Figura 14 - - Ejemplos de expresión de BCMA en mielomas primarios

Se muestran cuatro ejemplos de muestras de mieloma teñidas con el mAb de BCMA de rata anti-humano Vicky1. El primer panel muestra tinción brillante de BCMA en un paciente con leucemia de células plasmáticas (una forma inusual, avanzada y agresiva de mieloma). Los otros tres casos son clínica y morfológicamente mielomas típicos. Muestran la tinción intermedia o débil observada típicamente. La tinción con control de isotipo (gris) se superpone. Estos son ejemplos de datos acumulativos de expresión de BCMA mostrados en la Figura 2.

Figura 15 - Secuencia de aminoácidos de APRIL-CAR con un marcaje de epítopos V5.

A: dAPRIL-HCH2CH3pvaa-CD28OXZ

B: dAPRIL-CD8STK-CD28OXZ

C: dAPRIL-HNG-CD28OXZ

Las secuencias en esta Figura difieren de aquellas en la Figura 5 por tener un péptido de señal diferente y no marcaje V5.

Figura 16 - Demostración de función in vivo de células T con CAR de APRIL

Seis ratones NSG hembras de 3 meses de edad recibieron 1 x 107 células MM1.s.FLuc mediante inyección por vena caudal. Se capturaron imágenes de los ratones con bioluminiscencia al día 8 y día 13. Después de obtener imágenes en el día 13, cuatro ratones recibieron 5 x 106 células T con CAR de APRIL mediante inyección por vena caudal. Se obtuvieron imágenes de los ratones en el día 13 y día 18. Los ratones que recibieron células T con CAR se indican con (*). La remisión del mieloma pudo observarse al día 18 en todos los ratones tratados, mientras la enfermedad en los ratones sin tratamiento progresó.

SUMARIO DE LOS ASPECTOS DE LA INVENCIÓN

El antígeno de membrana de células B (BCMA) es una proteína de superficie expresada en casi todo mieloma múltiple (MM). El BCMA sólo se expresa de otro modo en células plasmáticas, por tanto, la orientación a este antígeno puede comprobar un tratamiento efectivo del mieloma. Sin embargo, la expresión de bajo nivel de BCMA (Ver Figura 2), es una consideración cuando se orienta hacia este antígeno.

Los presentes inventores han encontrado sorprendentemente que si un dominio de unión se utiliza con base en el ligando inductor de proliferación A (APRIL), en vez de un anticuerpo de unión a BCMA, en una molécula tipo CAR, las células T que expresan tales CAR dan lugar a una eliminación muy eficiente de células objetivo que expresan BCMA, incluso aquellas con bajos niveles de expresión.

Sin querer atenerse por teoría alguna, los presentes inventores predicen que esto se debe a la simetría de tres pliegues inherente en la unión de BCMA con APRIL. Esto significa que toda interacción entre el CAR y el BCMA implicará 3 CAR, que se aproximan a 3 endodominios en la superficie de las células T. Dado que la activación de células T se activa por la estrecha aproximación de endodominios de señalización en una sinapsis inmunológica, el diseño de CAR de la presente invención es altamente sensible y específico. Dado que el BCMA se expresa en una muy baja densidad en células de mieloma primario (ver Figuras 2 y 7), este diseño de receptor está particularmente adaptado a este objetivo.

De esta manera, en un primer aspecto, la presente invención proporciona un receptor antigénico quimérico (CAR) que comprende:

(i) un dominio de unión que comprende un ligando inductor de proliferación (APRIL) truncado que comprende el sitio de unión al antígeno de maduración de células B (BCMA) y al activador transmembranal y modulador de calcio e interactivador de ligando de ciclofilina (TACI) pero carece de la porción amino terminal de APRIL responsable de la unión a proteoglicanos; que comprende la secuencia que se muestra como SEQ ID No. 14;

(ii) un dominio espaciador

(iii) un dominio transmembranal; y

(iv) un dominio intracelular de señalización de células T.

El dominio de señalización de células T transmembranal e intracelular puede comprender la secuencia mostrada como SEQ ID No. 7, o una variante de la misma, que tiene por lo menos 80% de identidad de secuencias.

El dominio de unión a BCMA y el dominio transmembranal pueden conectarse por un espaciador. El espaciador puede comprender uno de los siguientes: un espaciador de IgG1 humana; una bisagra de IgG1; o un tallo de ^cD8.

El CAR del primer aspecto de la invención puede comprender la secuencia mostrada como SEQ ID No. 4, 5 o 6.

El CAR del primer aspecto de la invención puede unirse a BCMA como trímero.

En un segundo aspecto, la presente invención proporciona una secuencia de ácido nucleico que codifica un CAR de acuerdo con el primer aspecto de la invención.

La secuencia de ácido nucleico puede comprender la secuencia mostrada como SEQ ID No 18, 19 o 20.

En un tercer aspecto, la presente invención proporciona un vector que comprende una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con el segundo aspecto de la invención.

En un cuarto aspecto, la presente invención proporciona una célula T que expresa un CAR de acuerdo con el primer aspecto de la invención.

En un quinto aspecto, la presente invención proporciona un método para producir una célula T de acuerdo con el cuarto aspecto de la invención, que comprende la etapa de introducir un ácido nucleico, de acuerdo con el segundo aspecto de la invención, en una célula T.

En un sexto aspecto, la presente invención proporciona una composición farmacéutica que comprende una célula T de acuerdo con el cuarto aspecto de la invención, en conjunto con un portador, diluyente o excipiente farmacéuticamente aceptable.

En un séptimo aspecto, la presente invención proporciona una célula T de acuerdo con el cuarto aspecto de la invención para su uso en el tratamiento de un trastorno de células plasmáticas.

El trastorno de células plasmáticas puede seleccionarse de plasmacitoma, leucemia de células plasmáticas, mieloma múltiple, macroglobulinemia, amiloidosis, macroglobulinemia de Waldenstrom, plasmacitoma óseo solitario, plasmacitoma extramedular, mieloma osteoesclerótico, enfermedades de cadenas pesadas, gammapatía monoclonal de significado incierto y mieloma múltiple latente.

El trastorno de células plasmáticas puede ser mieloma múltiple.

RECEPTORES ANTIGÉNICOS QUIMÉRICOS (CAR)

Los receptores antigénicos quiméricos (CAR), también conocidos como receptores de células T quiméricos, receptores de células T artificiales e inmunorreceptores quiméricos, son receptores diseñados, que injertan una especificidad arbitraria en una célula inmune efectora. En un CAR clásico (Figura 3), la especificidad de un anticuerpo monoclonal se injerta en una célula T o célula NK. Los ácidos nucleicos que codifican CAR pueden introducirse en células T o células NK al utilizar, por ejemplo, vectores retrovirales. En esta forma, un gran número de células T o células NK específicas de cáncer pueden generarse para transferencia celular adoptiva. Los primeros estudios clínicos de esta estrategia han mostrado eficacia en algunos cánceres, principalmente cuando se orientan al antígeno de toda célula B, CD19, para tratar malignidades de células B.

El dominio de unión a antígenos objetivo de un CAR se fusiona comúnmente mediante un espaciador y dominio transmembranal a un endodominio de señalización. Cuando el CAR se une al antígeno objetivo, esto resulta en la transmisión de una señal de activación a la célula T en que se expresa.

El CAR de la presente invención comprende:

(ii) un espaciador; y

(iii) un dominio transmembranal; y

(iv) un dominio intracelular de señalización de células T.

El CAR de la presente invención puede comprender una de las secuencias de aminoácidos mostradas como SEQ ID NO.

4, 5 o 6. También se divulgan las secuencias:

SEQ ID No. 1 (dAPRI L-HCH2CH3pvaa-CD28OXZ) METDTLLLWVLLLWVPGSTGSVLHLVPINATSKDDSDVTEVMWQPALRRGRGLQAQGYGVRIQDAGVYLLYSQVLFQDV TFTMGQVVSREGQGRQETLFRCIRSMPSHPDRAYNSCYSAGVFHLHQGDILSVIIPRARAKLNLSPHGTFLGFVKLSGGG SDPAEPKSPDKTHTCPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMIARTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKP REEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKG FYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKKD PKFWVLVWGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRDQRLPPDA HKPPGGGSFRTPIQEEQADAHSTLAKIRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRR KNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR

SEQ ID No. 2 (dAPRI L-CD8STK-CD28OXZ) METDTLLLWVLLLWVPGSTGSVLHLVPINATSKDDSDVTEVMWQPALRRGRGLQAQGYGVRIQDAGVYLLYSQVLFQDV TFTMGQVVSREGQGRQETLFRCIRSMPSHPDRAYNSCYSAGVFHLHQGDILSVIIPRARAKLNLSPHGTFLGFVKLSGGG SDPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRS RLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRDQRLPPDAHKPPGGGSFRTPIQEEQADAHSTLAKIRVKFSRS ADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRG KGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR

SEQ ID No. 3 (dAPRIL-HNG-CD28OXZ) METDTLLLWVLLLWVPGSTGSVLHLVPINATSKDDSDVTEVMWQPALRRGRGLQAQGYGVRIQDAGVYLLYSQVLFQDV TFTMGQVVSREGQGRQETLFRCIRSMPSHPDRAYNSCYSAGVFHLHQGDILSVIIPRARAKLNLSPHGTFLGFVKLSGGG SDPAEPKSPDKTHTCPPCPKDPKFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQP YAPPRDFAAYRSRDQRLPPDAHKPPGGGSFRTPIQEEQADAHSTLAKIRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREE YDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQA LPPR

SEQ ID No. 4 (dAPRI L-HCH2CH3pvaa-CD28OXZ) MGTSLLCWMALCLLGADHADGKPIPNPLLGLDSTSGGGGSVLHLVPINATSKDDSDVTEVMWQPALRRGRGLQAQGYG VRIQDAGVYLLYSQVLFQDVTFTMGQVVSREGQGRQETLFRCIRSMPSHPDRAYNSCYSAGVFHLHQGDILSVIIPRARA KLNLSPHGTFLGFVKLSGGGSDPAEPKSPDKTHTCPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMIARTPEVTCVVVDVSHEDPE VKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTL PPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMH EALHNHYTQKSLSLSPGKKDPKFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPY APPRDFAAYRSRDQRLPPDAHKPPGGGSFRTPIQEEQADAHSTLAKIRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEY DVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQAL PPR

SEQ ID No. 5 (dAPRI L-CD8STK-CD28OXZ) MGTSLLCWMALCLLGADHADGKPIPNPLLGLDSTSGGGGSVLHLVPINATSKDDSDVTEVMWQPALRRGRGLQAQGYG VRIQDAGVYLLYSQVLFQDVTFTMGQVVSREGQGRQETLFRCIRSMPSHPDRAYNSCYSAGVFHLHQGDILSVIIPRARA KLNLSPHGTFLGFVKLSGGGSDPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIFWVLVVVGGVL ACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRDQRLPPDAHKPPGGGSFRTPI QEEQADAHSTLAKIRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQ KDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR

SEQ ID No. 6 (dAPRIL-HNG-CD28OXZ) MGTSLLCWMALCLLGADHADGKPIPNPLLGLDSTSGGGGSVLHLVPINATSKDDSDVTEVMWQPALRRGRGLQAQGYG VRIQDAGVYLLYSQVLFQDVTFTMGQWSREGQGRQETLFRCIRSMPSHPDRAYNSCYSAGVFHLHQGDILSVIIPRARA KLNLSPHGTFLGFVKLSGGGSDPAEPKSPDKTHTCPPCPKDPKFWVLWVGGVLACYSLLVTVAFMFWVRSKRSRLLHS DYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRDQRLPPDAHKPPGGGSFRTPIQEEQADAHSTLAKIRVKFSRSADAP AYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHD GLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR

La identidad porcentual entre dos secuencias polipeptídicas puede determinarse fácilmente por programas tales como el BLAST, que se encuentra disponible libremente en http://blast.ncbi.nlm.nih.gov.

DOMINIO TRANSMEMBRANAL

El dominio transmembranal es la secuencia del CAR que abarca la membrana. El mismo puede comprender una hélice alfa hidrofóbica. El dominio transmembranal puede derivarse de CD28, lo que ofrece una buena estabilidad del receptor. El dominio transmembranal puede derivarse de cualquier proteína transmembranal tipo I. El dominio transmembranal puede ser una secuencia sintética prevista para formar una hélice hidrofóbica.

DOMINIO INTRACELULAR DE SEÑALIZACIÓN DE CÉLULAS T (ENDODOMINIO)

El endodominio es la porción de transmisión de señales del CAR. Después del reconocimiento de antígenos, los receptores se agrupan y una señal se transmite a la célula. El componente de endodominio más comúnmente utilizado es el de CD3-zeta que contiene 3 ITAM. Este transmite una señal de activación a la célula T después de que el antígeno se une. CD3-zeta no puede proporcionar una señal de activación competente por completo y una señalización coestimulante adicional puede necesitarse. Por ejemplo, CD28 y OX40 quiméricos pueden utilizarse con CD3-Zeta para transmitir una señal proliferativa/de supervivencia, o los tres pueden utilizarse en conjunto (Pule et al, Molecular therapy, 2005: Volumen 12; Número 5; Páginas 933-41). El endodominio de CAR también puede derivarse de otros dominios de señalización, ya sea individualmente o en combinación, derivados de proteínas de señalización encontradas en la naturaleza o los artificiales construidos por los expertos en la técnica, de tal modo que el CAR transmita una señal adecuada para un CAR terapéutico efectivo.

El endodominio del CAR de la presente invención puede comprender el endodominio CD28 y OX40, y el endodominio CD3-Zeta.

El dominio de señalización de células T transmembranal e intracelular (endodominio) del CAR de la presente invención puede comprender la secuencia mostrada como SEQ ID No. 7, o una variante de la misma, que tiene por lo menos 80% de identidad de secuencias.

SEQ ID No. 7 FWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRDQRLPPDAHK PPGGGSFRTPIQEEQADAHSTLAKIRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKN PQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR

Una secuencia variante puede tener por lo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 98% o 99% de identidad de secuencias con la SEQ ID No. 7, siempre y cuando la secuencia proporcione un dominio transmembranal efectivo y un dominio intracelular de señalización de células T efectivo.

PÉPTIDO DE SEÑAL

El CAR de la presente invención puede comprender un péptido de señal a fin de que, cuando el CAR se exprese dentro de una célula, tal como una célula T, la proteína naciente se dirija al retículo endoplásmico y, subsecuentemente a la superficie celular, donde se expresa.

El núcleo del péptido de señal puede contener un tramo largo de aminoácidos hidrofóbicos que tiene tendencia a formar una sola hélice alfa. El péptido de señal puede comenzar con un tramo corto de aminoácidos cargados positivamente, lo cual ayuda a forzar la topología apropiada del polipéptido durante la traslocación. Al final del péptido de señal típicamente hay un tramo de aminoácidos que se reconoce y escinde por la peptidasa de señal. La peptidasa de señal puede escindir durante o después de la terminación de la traslocación para generar un péptido de señal libre y una proteína madura. Los péptidos de señal libres entonces se digieren por proteasas específicas.

El péptido de señal puede estar en el extremo amino terminal de la molécula.

El CAR de la invención puede tener la fórmula general:

Péptido de señal - dominio de unión a BCMA - dominio espaciador - dominio transmembranal - dominio intracelular de señalización de células T.

El péptido de señal puede comprender la SEQ ID No. 8 o 9, o una variante de la misma que tiene 5, 4, 3, 2 o 1 mutaciones de aminoácidos (inserciones, sustituciones o adiciones) siempre y cuando el péptido de señal aún funcione para dar lugar a la expresión en superficie celular del CAR.

SEQ ID No. 8: MGTSLLCWMALCLLGADHADG

SEQ ID No. 9: METDTLLLWVLLLWVPGSTG

El péptido de señal de la SEQ ID No. 8 y SEQ ID No 9 es compacto y altamente eficiente. Se prevé que ofrece aproximadamente 95% de escisión después de la glicina terminal, lo que da una eficiente remoción por la peptidasa de señal.

ESPACIADOR

El CAR de la presente invención puede comprender una secuencia espaciadora para conectar el dominio de unión a BCMA con el dominio transmembranal y separar espacialmente el dominio de unión a BCMA del endodominio. Un espaciador flexible permite que el dominio de unión a BCMA se oriente en diferentes direcciones para habilitar la unión de BCMA.

La secuencia espaciadora, por ejemplo, puede comprender una región Fc de IgG1, una bisagra de IgG1 o un tallo de CD8. El enlazador alternativamente puede comprender una secuencia enlazadora alternativa que tiene propiedades espaciadoras de longitud y/o dominio similares a las de una región Fc de IgG1, una bisagra de IgG1 o un tallo de CD8. El espaciador puede ser un espaciador corto, por ejemplo, un espaciador que comprende menos de 100, menos de 80, menos de 60 o menos de 45 aminoácidos. El espaciador puede ser o comprender una bisagra de IgG1, un tallo de CD8 o una versión modificada de los mismos.

Un espaciador de IgG1 humana puede alterarse para remover los motivos de unión de Fc.

Ejemplos de secuencias de aminoácidos para estos espaciadores se dan a continuación:

SEQ ID No. 10 (bisagra-CH2CH3 de IgG1 humana) AEPKSPDKTHTCPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMIARTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREE QYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYP SDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKKD SEQ ID No. 11 (tallo de CD8 humano):

TTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDI SEQ ID No. 12 (bisagra de IgG1 humana):

AEPKSPDKTHTCPPCPKDPK ANTÍGENO DE MEMBRANA DE CÉLULAS B (BCMA)

El CAR del primer aspecto de la invención comprende un dominio de unión como se define en el primer aspecto de la invención.

BCMA, también conocido como TNFRSF17, es un antígeno superficial específico de células plasmáticas que se expresa exclusivamente en células hematopoyéticas o células dendríticas de linaje B. Es un miembro de la familia de receptores del TNF. El BCMA no se expresa en células B sin contacto previo, pero se sobrerregula durante la diferenciación de células B a plasmoblastos, y se expresa intensamente en células B de memoria, plasmoblastos y células plasmáticas de médula ósea. El BCMA también se expresa en la mayor parte de las células de mieloma primario. A diferencia de otros objetivos de CAR, tales como el CD19, el BCMA se expresa en baja densidad (Figura 2).

El BCMA funciona dentro de una red de ligandos y receptores interconectados, lo cual se muestra esquemáticamente en la Figura 1. Otros dos receptores de TNF comparten los ligandos APRIL y BAFF con BCMA - TACI (^tN^fRSF13B) que se encuentra en células T activadas y todas las células B, y BAFF-R (TNFRSF13C) que se expresa predominantemente en linfocitos B. Las células de mieloma múltiple expresan TACI en algunos casos y BCMA en la mayor parte de los casos, pero nunca BAFF-R.

APRIL

El dominio de unión del CAR de la invención comprende un ligando inductor de proliferación (APRIL) truncado como se define en el primer aspecto de la invención. APRIL también se conoce como TNFSF13.

La secuencia de tipo silvestre de APRIL se encuentra disponible en UNIPROT/O75888 y se muestra a continuación (SEQ ID No. 13). No es una proteína secretada clásica en cuanto a que no tiene péptido de señal. Tiene un sitio de escisión por furina “KQKKQK” (subrayado en la SEQ ID No. 13). El extremo amino terminal se implica en unión a proteoglicanos.

El dominio de unión comprende el sitio de unión a BCMA de APRIL. El dominio de unión comprende un fragmento de APRIL que comprende el sitio de unión a BCMA.

El dominio de unión comprende un APRIL truncado que carece del extremo amino terminal de la molécula. El APRIL truncado retiene unión a BCMA y TACI, pero pierde la unión a proteoglicanos. El APRIL truncado puede escindirse en o inmediatamente después del sitio de escisión por furina. El APRIL truncado carece de los 116 aminoácidos amino terminales de la molécula de APRIL de tipo silvestre, mostrados como SEQ ID No. 13. El APRIL truncado comprende la secuencia mostrada como SEQ ID No. 14 (que corresponde a la porción de la SEQ ID No. 13 mostrada en negras). Esto corresponde a la porción de la molécula que se necesita para la unión a BCMA y TACI.

SEQ ID No. 13

10 20 30 40 50 60

MPASSPFLLA PKGPPGNMGG PVREPALSVA LWLSWGAALG AVACAMALLT QQTELQSLRR

70 80 90 100 110 120

EVSRLQGTGG PSQNGEGYPW QSLPEQSSDA LEAWENGERS RKRRAVLTQK QKKQHSVLHL

130 140 150 160 170 180

VPINATSKDD SDVTEVMWQP ALRRGRGLQA QGYGVRIQDA GVYLLYSQVL FQDVTFTMGQ

190 200 210 220 230 240

VVSREGQGRQ ETLFRCIRSM PSHPDRAYNS CYSAGVFHLH QGDILSVIIP RARAKLNLSP

250

HGTFLGFVKL

SEQ ID No. 14 VLHLVPINATSKDDSDVTEVMWQPALRRGRGLQAQGYGVRIQDAGVYLLYSQVLFQDVTFTMGQVVSREGQGRQETLF RCIRSMPSHPDRAYNSCYSAGVFHLHQGDILSVIIPRARAKLNLSPHGTFLGFVKL

SECUENCIA DE ÁCIDO NUCLEICO

El segundo aspecto de la invención se relaciona con una secuencia de ácido nucleico que codifica un CAR del primer aspecto de la invención.

La secuencia de ácido nucleico puede ser o comprender una de las secuencias SEQ ID No. 18, 19 o 20. También se divulgan las secuencias SEQ ID No. 15, 16 o 17:

SEQ ID No. 15 (dAPRIL-HCH2CH3pvaa-CD28OXZ) ATGGAGACCGACACCCTGCTGCTGTGGGTGCTGCTGCTGTGGGTGCCAGGCAGCACCGGCAGCGTGCTCCACCT GGTGCCCATCAACGCCACCAGCAAGGACGACTCTGATGTGACCGAGGTGATGTGGCAGCCAGCCCTGAGACGGG GCAGAGGCCTGCAGGCCCAGGGCTACGGCGTGAGAATCCAGGACGCTGGCGTGTACCTGCTGTACTCCCAGGTG CTGTTCCAGGACGTGACCTTCACAATGGGCCAGGTGGTGAGCCGGGAGGGCCAGGGCAGACAGGAGACCCTGTT CCGGTGCATCCGGAGCATGCCCAGCCACCCCGACAGAGCCTACAACAGCTGCTACAGCGCTGGCGTGTTTCACCT GCACCAGGGCGACATCCTGAGCGTGATCATCCCCAGAGCCAGAGCCAAGCTGAACCTGTCCCCCCACGGCACCTT TCTGGGCTTCGTGAAGCTGTCTGGAGGCGGCTCGGATCCCGCCGAGCCCAAATCTCCTGACAAAACTCACACATGC CCACCGTGCCCAGCACCTCCCGTGGCCGGCCCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGA TCGCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGT ACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTG GTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCC CTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCC CCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCG CCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAACCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCT CCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGAT GCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAAAAAGATCCCAAATTTTGG GTGCTGGTGGTGGTTGGTGGAGTCCTGGCTTGCTATAGCTTGCTAGTAACAGTGGCCTTT ATTATTTTCTGGGTGAGGAGTAAGAGGAGCAGGCTCCTGCACAGTGACTACATGAACATGACTCCCCGCCGCCCCG GGCCCACCCGCAAGCATTACCAGCCCTATGCCCCACCACGCGACTTCGCAGCCTATCGCTCCAGGGACCAGAGGC TGCCCCCCGATGCCCACAAGCCCCCTGGGGGAGGCAGTTTCCGGACCCCCATCCAAGAGGAGCAGGCCGACGCC CACTCCACCCTGGCCAAGATCAGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAAC CAGCT CT AT AACGAGCT CAAT CTAGGACGAAGAGAGGAGT ACGAT GTTTT GGACAAGAGACGT GGCCGGGACCCT G AGAT GGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCT CAGGAAGGCCT GT ACAAT GAACT GCAGAAAGAT AAGATGGCGG AGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTC AGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCTCCTCGCTAA

SEQ ID No. 16 (dAPRIL-CD8STK-CD28OXZ) ATGGAGACCGACACCCTGCTGCTGTGGGTGCTGCTGCTGTGGGTGCCAGGCAGCACCGGCAGCGTGCTCCACCT GGTGCCCATCAACGCCACCAGCAAGGACGACTCTGATGTGACCGAGGTGATGTGGCAGCCAGCCCTGAGACGGG GCAGAGGCCTGCAGGCCCAGGGCTACGGCGTGAGAATCCAGGACGCTGGCGTGTACCTGCTGTACTCCCAGGTG CTGTTCCAGGACGTGACCTTCACAATGGGCCAGGTGGTGAGCCGGGAGGGCCAGGGCAGACAGGAGACCCTGTT CCGGTGCATCCGGAGCATGCCCAGCCACCCCGACAGAGCCTACAACAGCTGCTACAGCGCTGGCGTGTTTCACCT GCACCAGGGCGACATCCTGAGCGTGATCATCCCCAGAGCCAGAGCCAAGCTGAACCTGTCCCCCCACGGCACCTT TCTGGGCTTCGTGAAGCTGTCTGGAGGCGGCTCGGATCCCACCACGACGCCAGCGCCGCGACCACCAACACCGG CGCCCACCATCGCGTCGCAGCCCCTGTCCCTGCGCCCAGAGGCGTGCCGGCCAGCGGCGGGGGGCGCAGTGCA CACGAGGGGGCTGGACTTCGCCTGTGATATCTTTTGGGTGCTGGTGGTGGTTGGTGGAGTCCTGGCTTGCTATAGC TTGCTAGTAACAGTGGCCTTTATTATTTTCTGGGTGAGGAGTAAGAGGAGCAGGCTCCTGCACAGTGACTACATGAA CATGACTCCCCGCCGCCCCGGGCCCACCCGCAAGCATTACCAGCCCTATGCCCCACCACGCGACTTCGCAGCCTA TCGCTCCAGGGACCAGAGGCTGCCCCCCGATGCCCACAAGCCCCCTGGGGGAGGCAGTTTCCGGACCCCCATCC AAGAGGAGCAGGCCGACGCCCACTCCACCCTGGCCAAGATCAGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCC GCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACA AGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAA CTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCA CGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCC CTGCCTCCTCGCTAA

SEQ ID No. 17 (dAPRIL-HNG-CD28OXZ) ATGGAGACCGACACCCTGCTGCTGTGGGTGCTGCTGCTGTGGGTGCCAGGCAGCACCGGCAGCGTGCTCCACCT GGTGCCCATCAACGCCACCAGCAAGGACGACTCTGATGTGACCGAGGTGATGTGGCAGCCAGCCCTGAGACGGG GCAGAGGCCTGCAGGCCCAGGGCTACGGCGTGAGAATCCAGGACGCTGGCGTGTACCTGCTGTACTCCCAGGTG CTGTTCCAGGACGTGACCTTCACAATGGGCCAGGTGGTGAGCCGGGAGGGCCAGGGCAGACAGGAGACCCTGTT CCGGTGCATCCGGAGCATGCCCAGCCACCCCGACAGAGCCTACAACAGCTGCTACAGCGCTGGCGTGTTTCACCT GCACCAGGGCGACATCCTGAGCGTGATCATCCCCAGAGCCAGAGCCAAGCTGAACCTGTCCCCCCACGGCACCTT TCTGGGCTTCGTGAAGCTGTCTGGAGGCGGCTCGGATCCCGCCGAGCCCAAATCTCCTGACAAAACTCACACATGC CCACCGTGCCCAAAAGATCCCAAATTTTGGGTGCTGGTGGTGGTTGGTGGAGTCCTGGCTTGCTATAGCTTGCTAG TAACAGTGGCCTTTATTATTTTCTGGGTGAGGAGTAAGAGGAGCAGGCTCCTGCACAGTGACTACATGAACATGACT CCCCGCCGCCCCGGGCCCACCCGCAAGCATTACCAGCCCTATGCCCCACCACGCGACTTCGCAGCCTATCGCTCC AGGGACCAGAGGCTGCCCCCCGATGCCCACAAGCCCCCTGGGGGAGGCAGTTTCCGGACCCCCATCCAAGAGGA GCAGGCCGACGCCCACTCCACCCTGGCCAAGATCAGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACC AGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACG TGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAA AGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCC TTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCTCCTCGCTAA

SEQ ID No. 18 (dAPRIL-HCH2CH3pvaa-CD28OXZ) ATGGGCACCTCCCTGCTGTGCTGGATGGCCCTGTGCCTGCTGGGAGCCGACCACGCCGACGGCAAGCCCATTCCC AACCCCCTGCTGGGCCTGGACTCCACCTCTGGCGGAGGCGGCAGCGTGCTGCACCTGGTGCCCATCAACGCCAC CAGCAAGGACGACTCTGATGTGACCGAGGTGATGTGGCAGCCAGCCCTGAGACGGGGCAGAGGCCTGCAGGCCC AGGGCTACGGCGTGAGAATCCAGGACGCTGGCGTGTACCTGCTGTACTCCCAGGTGCTGTTCCAGGACGTGACCT TCACAATGGGCCAGGTGGTGAGCCGGGAGGGCCAGGGCAGACAGGAGACCCTGTTCCGGTGCATCCGGAGCATG CCCAGCCACCCCGACAGAGCCTACAACAGCTGCTACAGCGCTGGCGTGTTTCACCTGCACCAGGGCGACATCCTG AGCGTGATCATCCCCAGAGCCAGAGCCAAGCTGAACCTGTCCCCCCACGGCACCTTTCTGGGCTTCGTGAAGCTGT CTGGAGGCGGCTCGGATCCCGCCGAGCCCAAATCTCCTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTC CCGTGGCCGGCCCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCGCCCGGACCCCTGAGG TCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGG TGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCC TGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGA AAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGA CCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCA ATGGGCAACCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAA GCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAA CCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAAAAAGATCCCAAATTTTGGGTGCTGGTGGTGGTTGGT GGAGTCCTGGCTTGCTATAGCTTGCTAGTAACAGTGGCCTTTATTATTTTCTGGGTGAGGAGTAAGAGGAGCAGGCT CCTGCACAGTGACTACATGAACATGACTCCCCGCCGCCCCGGGCCCACCCGCAAGCATTACCAGCCCTATGCCCC ACCACGCGACTTCGCAGCCTATCGCTCCAGGGACCAGAGGCTGCCCCCCGATGCCCACAAGCCCCCTGGGGGAG GCAGTTTCCGGACCCCCATCCAAGAGGAGCAGGCCGACGCCCACTCCACCCTGGCCAAGATCAGAGTGAAGTTCA GCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAG AGGAGT ACGAT GTTTT GGACAAGAGACGT GGCCGGGACCCT GAGAT GGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCT C AGGAAGGCCT GTACAAT GAACT GCAGAAAGAT AAGAT GGCGGAGGCCTACAGT GAGATT GGGAT GAAAGGCGAGC GCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTC ACATGCAGGCCCTGCCTCCTCGCTAA

SEQ ID No. 19 (dAPRIL-CD8STK-CD28OXZ) ATGGGCACCTCCCTGCTGTGCTGGATGGCCCTGTGCCTGCTGGGAGCCGACCACGCCGACGGCAAGCCCATTCCC AACCCCCTGCTGGGCCTGGACTCCACCTCTGGCGGAGGCGGCAGCGTGCTGCACCTGGTGCCCATCAACGCCAC CAGCAAGGACGACTCTGATGTGACCGAGGTGATGTGGCAGCCAGCCCTGAGACGGGGCAGAGGCCTGCAGGCCC AGGGCTACGGCGTGAGAATCCAGGACGCTGGCGTGTACCTGCTGTACTCCCAGGTGCTGTTCCAGGACGTGACCT TCACAATGGGCCAGGTGGTGAGCCGGGAGGGCCAGGGCAGACAGGAGACCCTGTTCCGGTGCATCCGGAGCATG CCCAGCCACCCCGACAGAGCCTACAACAGCTGCTACAGCGCTGGCGTGTTTCACCTGCACCAGGGCGACATCCTG AGCGTGATCATCCCCAGAGCCAGAGCCAAGCTGAACCTGTCCCCCCACGGCACCTTTCTGGGCTTCGTGAAGCTGT CTGGAGGCGGCTCGGATCCCACCACGACGCCAGCGCCGCGACCACCAACACCGGCGCCCACCATCGCGTCGCAG CCCCTGTCCCTGCGCCCAGAGGCGTGCCGGCCAGCGGCGGGGGGCGCAGTGCACACGAGGGGGCTGGACTTCG CCTGTGATATCTTTTGGGTGCTGGTGGTGGTTGGTGGAGTCCTGGCTTGCTATAGCTTGCTAGTAACAGTGGCCTTT ATTATTTTCTGGGTGAGGAGTAAGAGGAGCAGGCTCCTGCACAGTGACTACATGAACATGACTCCCCGCCGCCCCG GGCCCACCCGCAAGCATTACCAGCCCTATGCCCCACCACGCGACTTCGCAGCCTATCGCTCCAGGGACCAGAGGC TGCCCCCCGATGCCCACAAGCCCCCTGGGGGAGGCAGTTTCCGGACCCCCATCCAAGAGGAGCAGGCCGACGCC CACTCCACCCTGGCCAAGATCAGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAAC CAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTG AGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGG AGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTC AGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCTCCTCGCTAA

SEQ ID No. 20 (dAPRIL-HNG-CD28OXZ) ATGGGCACCTCCCTGCTGTGCTGGATGGCCCTGTGCCTGCTGGGAGCCGACCACGCCGACGGCAAGCCCATTCCC AACCCCCTGCTGGGCCTGGACTCCACCTCTGGCGGAGGCGGCAGCGTGCTGCACCTGGTGCCCATCAACGCCAC CAGCAAGGACGACTCTGATGTGACCGAGGTGATGTGGCAGCCAGCCCTGAGACGGGGCAGAGGCCTGCAGGCCC AGGGCTACGGCGTGAGAATCCAGGACGCTGGCGTGTACCTGCTGTACTCCCAGGTGCTGTTCCAGGACGTGACCT TCACAATGGGCCAGGTGGTGAGCCGGGAGGGCCAGGGCAGACAGGAGACCCTGTTCCGGTGCATCCGGAGCATG CCCAGCCACCCCGACAGAGCCTACAACAGCTGCTACAGCGCTGGCGTGTTTCACCTGCACCAGGGCGACATCCTG AGCGTGATCATCCCCAGAGCCAGAGCCAAGCTGAACCTGTCCCCCCACGGCACCTTTCTGGGCTTCGTGAAGCTGT CTGGAGGCGGCTCGGATCCCGCCGAGCCCAAATCTCCTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAAAAGATC CCAAATTTTGGGTGCTGGTGGTGGTTGGTGGAGTCCTGGCTTGCTATAGCTTGCTAGTAACAGTGGCCTTTATTATT TTCTGGGTGAGGAGTAAGAGGAGCAGGCTCCTGCACAGTGACTACATGAACATGACTCCCCGCCGCCCCGGGCCC ACCCGCAAGCATTACCAGCCCTATGCCCCACCACGCGACTTCGCAGCCTATCGCTCCAGGGACCAGAGGCTGCCC CCCGATGCCCACAAGCCCCCTGGGGGAGGCAGTTTCCGGACCCCCATCCAAGAGGAGCAGGCCGACGCCCACTC CACCCTGGCCAAGATCAGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCT CTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATG GGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCC TACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACA GCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCTCCTCGCTAA

La secuencia de ácido nucleico puede codificar la misma secuencia de aminoácidos que la codificada por la SEQ ID No.

18 19 o 20, pero puede tener una secuencia de ácido nucleico diferente, debido a la degeneración del código genético.

VECTOR

La presente invención también proporciona un vector que comprende una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la invención. Tal vector puede utilizarse para introducir la secuencia de ácido nucleico en una célula hospedadora a fin de que exprese y produzca una molécula de acuerdo con el primer aspecto de la invención.

El vector, por ejemplo, puede ser un plásmido o mRNA sintético o un vector viral, tal como un vector retroviral o un vector lentiviral.

El vector puede ser capaz de transfectar o transducir una célula efectora.

CÉLULA HOSPEDADORA

La invención también proporciona una célula T que comprende un ácido nucleico de acuerdo con la invención. La célula T es capaz de expresar un CAR de acuerdo con el primer aspecto de la invención.

La célula T puede ser una célula T humana. Se describe además una célula hospedadora que puede ser una célula NK humana.

Una célula T capaz de expresar un CAR de acuerdo con la invención puede producirse al transducir o transfectar una célula T con ácido nucleico que codifica CAR.

La célula T puede ser una célula T ex vivo. La célula T puede ser de una muestra de células mononucleares de sangre periférica (PBMC). Las células T pueden activarse y/o expandirse antes de transducirse con ácido nucleico que codifica CAR, por ejemplo, por el tratamiento con un anticuerpo monoclonal anti-CD3.

COMPOSICIÓN FARMACÉUTICA

La presente invención también se relaciona con una composición farmacéutica que contiene una célula T que expresa CAR de la invención, en conjunto con un portador, diluyente o excipiente farmacéuticamente aceptable y, opcionalmente, uno o más polipéptidos y/o compuestos farmacéuticamente activos adicionales. Tal formulación, por ejemplo, puede estar en forma adecuada para infusión intravenosa. En la presente se describe una composición farmacéutica que contiene un vector junto con un portador, diluyente o excipiente farmacéuticamente aceptable.

MÉTODO DE TRATAMIENTO

Las células T que expresan una molécula de CAR de la presente invención son capaces de eliminar células cancerosas, tales como células de mieloma múltiple. Las células T que expresan CAR pueden crearse ex vivo ya sea a partir de la sangre periférica propia de un paciente (1a parte), o en el entorno de un trasplante de células troncales hematopoyéticas de sangre periférica de donante (2a parte), o sangre periférica de un donante sin relación (3a parte). Alternativamente, las células T con CAR pueden derivarse de la diferenciación ex-vivo de células progenitoras inducibles o células progenitoras embrionarias a células T. En estos casos, las células T con CAR se generan al introducir DNA o RNA que codifica el CAR por uno de muchos medios, incluyendo la transducción con un vector viral, o transfección con DNA o RNA.

Las células T que expresan una molécula de CAR de la presente invención pueden utilizarse para el tratamiento de una enfermedad cancerosa, en particular un trastorno de células plasmáticas o un trastorno de células B que se correlaciona con la expresión potenciada de BCMA.

Los trastornos de células plasmáticas incluyen plasmacitoma, leucemia de células plasmáticas, mieloma múltiple, macroglobulinemia, amiloidosis, macroglobulinemia de Waldenstrom, plasmacitoma óseo solitario, plasmacitoma extramedular, mieloma osteoesclerótico (síndrome POEMS) y enfermedades de cadenas pesadas, así como la gammapatía monoclonal clínicamente indeterminada de significado incierto/mieloma múltiple latente.

La enfermedad puede ser mieloma múltiple.

Ejemplos para trastornos de células B que se correlacionan con niveles de expresión de BCMA elevados son CLL (leucemia linfocítica crónica) y linfoma no de Hodgkin (NHL). Los agentes de unión biespecíficos de la invención también pueden utilizarse en la terapia de enfermedades autoinmunes como lupus eritematoso sistémico (SLE), esclerosis múltiple (MS) y artritis reumatoide (RA).

El método descrito en la presente puede ser para tratar una enfermedad cancerosa, en particular un trastorno de células plasmáticas o un trastorno de células B que se correlaciona con la expresión potenciada de BCMA.

Un método descrito en la presente para el tratamiento de enfermedades se relaciona con el uso terapéutico de un vector o célula T de la invención. A este respecto, el vector o célula T puede administrarse a un sujeto que tiene una enfermedad o padecimiento existente con el fin de aminorar, reducir o mejorar por lo menos un síntoma asociado con la enfermedad y/o para desacelerar, reducir o bloquear la progresión de la enfermedad. El método descrito en la presente puede dar lugar o promover la eliminación mediada por células T de células que expresan BCMA, tales como células plasmáticas.

La invención se describirá ahora además por medio de Ejemplos, los cuales pretenden servir para ayudar a un experto en la técnica a llevar a cabo la invención y no se destinan en forma alguna a limitar el alcance de la invención.

EJEMPLOS

Ejemplo 1 - Caracterización de BCMA como objetivo para mieloma

Células de mieloma primario se aislaron al realizar una selección immunomagnética de CD138 sobre muestras frescas de médula ósea de pacientes de mieloma múltiple con enfermedad de frank reconocida. Estas células se tiñeron con el mAb J6MO específico de BCMA (GSK) que se conjugó a PE. Al mismo tiempo, un estándar de perlas con números conocidos de sitios de unión se generó al utilizar el equipo de perlas PE Quantibrite (Becton Dickenson) conforme a las instrucciones del fabricante. El número de copia de BCMA en células de mieloma podría derivarse al correlacionar la intensidad fluorescente media de las células de mieloma con la curva estándar derivada de las perlas. Se encontró que el intervalo de número de copia de BCMA en una superficie de célula de mieloma es bajo: a 348.7-4268.4 copias de BCMA por célula con una media de 1181 y una mediana de 1084.9 (Figura 2). Esto es considerablemente inferior a, por ejemplo, CD19 y GD2, objetivos clásicos para los CAR. La presencia de la expresión de BCMA en células de mieloma primario también se confirmó con el anticuerpo Vicky-1 (Abcam Ab17323), ejemplos de lo cual se muestran en la Figura 14.

Ejemplo 2 - Diseño y construcción de CAR basados en APRIL.

APRIL, en su forma natural, es una proteína secretada tipo II. El uso de APRIL, como dominio de unión de BCMA para un CAR, requiere la conversión de esta proteína secretada tipo II a una proteína asociada a membrana tipo I, y para que esta proteína sea estable y retenga la unión a BCMA en esta forma. Para generar moléculas candidatas, el extremo amino terminal de APRIL se eliminó para remover la unión a proteoglicanos. Después, un péptido de señal se agregó para dirigir la proteína naciente al retículo endoplásmico y, por tanto, a la superficie celular. También, dado que la naturaleza del espaciador utilizado puede alterar la función de un CAR, se probaron tres diferentes dominios espaciadores: se generó un CAR basado en APRIL que comprendía (i) un espaciador de IgG1 humana alterado para remover los motivos de unión de Fc; (ii) un tallo de CD8; y (iii) la bisagra de IgG1 sola (dibujo en la Figura 4 y secuencias de aminoácidos en la Figura 5, y también secuencias de aminoácidos en la Figura 19 que difieren de las secuencias en la Figura 5 al tener un péptido de señal diferente y el marcaje de epítopos V5). Estos CAR se expresaron en un vector retroviral bicistrónico (Figura 6A) a fin de que una proteína marcadora - CD34 truncado pudiera coexpresarse como gen marcador conveniente.

Ejemplo 3 - Expresión y función de CAR basados en APRIL.

La finalidad de este estudio fue probar si los CAR basados en APRIL, que se habían construido, se expresaban en la superficie celular y si APRIL se había plegado para formar la proteína nativa. Las células T se transdujeron con estas diferentes construcciones de CAR y se tiñeron al utilizar un mAb anti-APRIL comercialmente disponible, en conjunto con tinción para el gen marcador, y se analizaron por citometría de flujo. Los resultados de este experimento se muestran en la Figura 6B donde la unión de APRIL se grafica contra la fluorescencia del gen marcador. Estos datos muestran que, en este formato, los CAR basados en APRIL se expresan en la superficie celular y APRIL se pliega suficientemente para reconocerse por un mAb anti-APRIL.

Después, se determinó si APRIL, en este formato, podía reconocer BCMA y TACI. BCMA y TACI recombinantes se generaron como fusiones con IgG2a-Fc de ratón. Estas proteínas recombinantes se incubaron con las células T transducidas. Después de esto, las células se lavaron y tiñeron con un anticuerpo anti-ratón conjugado con fluoróforo y un anticuerpo para detectar el gen marcador conjugado a un fluoróforo diferente. Las células se analizaron por citometría de flujo y los resultados se presentan en la Figura 6C. Los diferentes CAR fueron capaces de unirse tanto a BCMA como a TACi . Sorprendentemente, los CAR fueron tuvieron una capacidad de unirse a BCMA mayor que a TACI. También, sorprendentemente, los CAR con un espaciador de tallo de ^cD8 o bisagra de IgG1 tuvieron mejor capacidad de unirse a BCMA y TACI que el CAR con un espaciador de Fc.

Ejemplo 4 - Los receptores antigénicos quiméricos basados en APRIL son activos contra células que expresan BCMA Células T de donantes normales se transdujeron con los diferentes CAR de APRIL y se probaron contra células SupT1 ya sea de tipo silvestre o diseñadas para expresar BCMA y TACI. Varios ensayos diferentes se utilizaron para determinar la función. Se realizó un ensayo clásico de liberación de cromo. Aquí, las células objetivo (las células SupT1) se etiquetaron con 51Cr y se mezclaron con efectores (las células T transducidas) a diferentes proporciones. La lisis de células objetivo se determinó por conteo de 51Cr en el sobrenadante de cocultivo (la Figura 6A muestra los datos acumulativos, datos ejemplares de un solo ensayo con diferentes proporciones efector:objetivo se muestran en la Figura 12).

Además, el sobrenadante de células T cultivadas 1:1 con células SupT1 se analizó por ELISA para interferón gamma (la Figura 6B muestra datos acumulativos, datos ejemplares de un solo ensayo se muestran en la Figura 13). La medición de la expansión de células T después de una semana de cocultivo con células SupT1 también se realizó (Figura 6C). Las células T se contaron por citometría de flujo calibrada con perlas de conteo. Estos datos experimentales muestran que los CAR basados en APRlL pueden eliminar objetivos que expresan BCMA. Además, estos datos muestran que los CAR basados en el tallo de CD8 o bisagra de IgG1 se desempeñaron mejor que el CAR basado en Fc-pvaa.

Ejemplo 5 - Los CAR basados en APRIL son capaces de eliminar células de mieloma primario

Los datos anteriores son alentadores dado que demuestran que, en principio, es posible producir un CAR basado en APRlL. Sin embargo, dado que la mayor parte de las células de mieloma primario expresan un bajo número de moléculas de BCMA en su superficie, se investigó si tal CAR basado en APRIL podría dar lugar a la eliminación de células de mieloma primario, particularmente en casos con expresión en baja densidad. Se seleccionaron tres casos que representaron el intervalo de expresión de BCMA descrito en la Figura 2: el primero tenía expresión débil (inferior a la media); el segundo caso tenía expresión intermedia (aproximadamente la expresión media) y el tercero era brillante (por arriba de la expresión media). La Figura 8 muestra un histograma de tinción de BCMA contra el control de isotipo para los tres casos a la izquierda para ilustrar la expresión de BCMA. Dado que, cuando se compararon los CAR basados en APRIL con diferentes espaciadores se había determinado que los CAR con espaciador de tallo de CD8 y espaciador de bisagra de IgG1 se desempeñaban mejor que el CAR con espaciador de Fc-pvaa, en este ensayo sólo se probaron los CAR de APRIL de tallo de CD8 y bisagra. A la izquierda, la supervivencia de células de mieloma en comparación con cifras iniciales se muestra en el día 3 y día 6 después de un cocultivo 1:1 de células de mieloma y células T con CAR. En el día 6, >95% de las células de mieloma se eliminaron, incluyendo aquellas con expresión débil de BCMA. Las células de mieloma que expresan BCMA débil pueden ser objetivo de los CAR de APRIL, aunque con un tiempo más lento de eliminación que en el caso de expresiones superiores.

Ejemplo 6 - APRIL truncado y secretado, fusionado a un espaciador de Fc, reconoce BCMA y TACI

Con el fin de investigar si APRIL truncado en un formato de CAR (es decir, fusionado a un dominio transmembranal y anclado a una membrana celular) puede unirse a BCMA y TACI, un CAR básico se diseñó en marco con el péptido 2A de fiebre aftosa de auto escisión con CD34 truncado, como gen marcador conveniente. Se estableció una línea celular SUPT1 estable, que expresaba esta construcción. BCMA y TACI truncados secretados, fusionados al dominio Fc de Ig humana (y otras especies, no mostradas), también se generaron y se produjo proteína recombinante. Se demostró que BCMA-Fc y TACI-Fc se unen a la línea celular SUPT1 diseñada. Se encontró que sólo las células que expresaban el gen marcador CD34 se unían a BCMA-Fc y TACI-Fc (Figura 9).

Ejemplo 7 - Los receptores antigénicos quiméricos basados en APRIL se expresan de modo estable en la superficie de células T

El dominio espaciador de CAR puede alterar la sensibilidad y especificidad. Tres versiones de un CAR basado en APRIL se generaron con tres dominios espaciadores: (i) un espaciador de IgG1 humana alterado para remover los motivos de unión de Fc; (ii) un tallo de CD8; y (iii) la bisagra de IgG1 sola (Figura 10B). Células T humanas primarias se transdujeron con estos diferentes CAR y se tiñeron al utilizar un mAb anti-APRIL comercialmente disponible (Figura 11).

Ejemplo 8 - Los receptores antigénicos quiméricos basados en APRIL son activos contra células que expresan objetivo afín

Células T de donantes normales se transdujeron con los diferentes CAR de APRIL y se probaron contra células SupT1 ya sea de tipo silvestre o diseñadas para expresar BCMA y TACI. Varios ensayos diferentes se utilizaron para determinar la función. Se realizó un ensayo clásico de liberación de cromo. Aquí, las células objetivo (las células SupT1) se etiquetaron con 51Cr y se mezclaron con efectores (las células T transducidas) a diferentes proporciones. La lisis de células objetivo se determinó por el conteo de 51Cr en el sobrenadante de cocultivo (Figura 12).

Además, el sobrenadante de células T cultivadas 1:1 con células SupT1 se analizó por ELISA para interferón gamma (Figura 13).

La medición de la expansión de células T después de una semana de cocultivo con células SupT 1 también se realizó. Las células T se contaron por citometría de flujo calibrada con perlas de conteo. Los datos iniciales (no mostrados) parecen indicar que la construcción basada en tallo de CD8 resulta en más proliferación de células T que las otras construcciones.

Ejemplo 9 - Demostración de función in vivo de células T con CAR de APRIL

Con el fin de demostrar la función de células T con CAR de APRIL in vivo, las células T con CAR de APRIL se probaron en un modelo quimérico de humano/ratón. MM1.s (ATCC CRL-2974) es una línea celular de mieloma humano que expresa niveles intermedios de BCMA. Los inventores diseñaron esta línea celular para expresar luciferasa de luciérnaga para obtener la línea celular MM1.s.FLuc.

Los ratones NOD scid gamma (NSG: NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ) son ratones profundamente inmunodeprimidos capaces de injertar varias líneas celulares humanas y linfocitos de sangre periférica humana. Ratones NSG hembras de tres meses de edad recibieron 1 x 107 células MM1.s.FLuc mediante inyección por vena caudal sin terapia preparativa alguna. El injerto se determinó por obtención de imágenes por bioluminiscencia en serie (Figura 16). Un injerto robusto y creciente en forma intramedular se observó en todos los ratones. En el día 13, 5 x 106 células T con CAR de APRIL-HNG-CD28OXZ se administraron mediante inyección por vena caudal. Se realizó bioluminiscencia en serie, lo cual mostró una rápida disminución en la carga de MM1.s (Figura 16) en todos los ratones tratados hasta una remisión completa. Esta respuesta a terapia con CAR se confirmó por citometría de flujo e inmunohistoquímica.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un receptor antigénico quimérico (CAR) que comprende:

(ii) un dominio espaciador; y

(ii) un dominio transmembranal; y

(iii) un dominio intracelular de señalización de células T.

2. El CAR de conformidad con cualquier reivindicación precedente, en donde el dominio de señalización de células T transmembranal e intracelular comprende la secuencia mostrada como SEQ ID No. 7, o una variante de la misma, que tiene por lo menos 80% de identidad de secuencia con respecto a SEQ ID No. 7.

3. El CAR de conformidad con cualquier reivindicación precedente, en donde el espaciador comprende uno de los siguientes: un espaciador de IgG1 humana; una bisagra de IgG1; o un tallo de CD8.

4. El CAR de conformidad con la reivindicación 3, en donde el espaciador comprende un tallo de CD8.

5. El CAR de conformidad con cualquier reivindicación precedente, que comprende la secuencia mostrada como SEQ ID No. 4, 5 o 6.

6. Una secuencia de ácido nucleico que codifica un CAR de conformidad con cualquier reivindicación precedente.

7. La secuencia de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 6, que comprende la secuencia mostrada como SEQ ID No 18, 19 o 20.

8. Un vector que comprende una secuencia de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 6 o 7.

9. Una célula T que expresa un CAR de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5.

10. Un método para producir una célula T de conformidad con la reivindicación 9, que comprende la etapa de introducir un ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 6 o 7 en una célula T ex vivo.

11. Una composición farmacéutica que comprende una célula T de conformidad con la reivindicación 9, en conjunto con un portador, diluyente o excipiente farmacéuticamente aceptable.

12. Una célula T de conformidad con la reivindicación 9 para su uso en el tratamiento de un trastorno de células plasmáticas.

13. Una célula T para su uso de conformidad con la reivindicación 12, en donde el trastorno de células plasmáticas se selecciona de plasmacitoma, leucemia de células plasmáticas, mieloma múltiple, macroglobulinemia, amiloidosis, macroglobulinemia de Waldenstrom, plasmacitoma óseo solitario, plasmacitoma extramedular, mieloma osteoesclerótico, enfermedades de cadenas pesadas, gammapatía monoclonal de significado incierto y mieloma múltiple latente.

14. Una célula T para su uso de conformidad con la reivindicación 13, en donde el trastorno de células plasmáticas es mieloma múltiple.