ES2979072T3

ES2979072T3 - Péptidos largos sintéticos (SLP) para la vacunación terapéutica contra la infección por el virus de la hepatitis B

Info

Publication number: ES2979072T3
Application number: ES15732967T
Authority: ES
Inventors: Wilhelmus Johannes Theodorus Alexander Krebber; Johan Herman Kessler; Cornelis Joseph Maria Melief; Kitty Michelle Corinne Kwappenberg
Original assignee: ISA PHARMACEUTICALS BV
Current assignee: ISA PHARMACEUTICALS BV
Priority date: 2014-06-02
Filing date: 2015-06-01
Publication date: 2024-09-24
Anticipated expiration: 2035-06-01
Also published as: WO2015187009A1; US10376576B2; KR20170008873A; EP3148566A1; US20190314494A1; CN106573960A; US20170246293A1; US10898567B2; EP3148566B1; EP3148566C0; KR102569204B1; CN106573960B; JP2017518051A; CA2950863A1; JP6780852B2; CA2950863C

Abstract

La presente invención se refiere a los campos de la medicina y la inmunología. En particular, se refiere a nuevos péptidos que pueden utilizarse en el tratamiento y/o prevención de una infección por el virus de la hepatitis B y/o una enfermedad o afección relacionada con la hepatitis B. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Péptidos largos sintéticos (SLP) para la vacunación terapéutica contra la infección por el virus de la hepatitis BCAMPO DE LA INVENCIÓN

[0001] La presente invención se refiere a los campos de la medicina y la inmunología. En particular, se refiere a nuevos péptidos que pueden usarse en el tratamiento y/o la prevención de una infección viral de la hepatitis B y/o una enfermedad o afección relacionada con la hepatitis B.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

[0002] La infección crónica por el virus de la hepatitis B (VHB) es un importante problema de salud mundial. El VHB es el miembro prototipo de la familia Hepadnaviridae, que tienen una fuerte preferencia por infectar células hepáticas (Ganem et al, 2004).

A pesar de que desde hace tres décadas se dispone de una vacuna preventiva eficaz para la protección contra la hepatitis B, se estima que dos mil millones de personas han sido infectadas por el VHB y más de 240 millones padecen actualmente una infección crónica (de larga duración) por hepatitis B, con predominio geográfico en regiones fuera de Europa occidental y América del Norte (Organización Mundial de la Salud, julio de 2013).

[0003] La transmisión del virus entre personas se produce por contacto directo de sangre a sangre o a través del semen o el flujo vaginal de una persona infectada. En las zonas endémicas, la infección se produce característicamente por transmisión perinatal de madre a hijo. Así, aunque el VHB no se transmite de manera casual, el virus (a través de vías de entrada similares a las del virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), pero al menos 50 veces más infeccioso) puede transmitirse fácilmente por exposición perinatal, percutánea o sexual. En consecuencia, el contacto frecuente de persona a persona con personas infectadas plantea un riesgo grave para grupos como los trabajadores sanitarios.

[0004] La infección por VHB puede desarrollarse como una hepatitis viral aguda, una enfermedad que comienza con malestar general, pérdida de apetito, náuseas, vómitos, dolores corporales, fiebre leve y orina oscura, y luego progresa hasta desarrollar ictericia. La enfermedad dura algunas semanas y luego mejora gradualmente en la mayoría de los adultos afectados. Algunas personas pueden tener una enfermedad hepática más grave (insuficiencia hepática fulminante) y, como resultado, pueden morir. La infección puede ser completamente asintomática y pasar desapercibida. La infección crónica por el virus de la hepatitis B puede ser asintomática o estar asociada con una inflamación crónica del hígado (hepatitis crónica), que lleva a cirrosis durante un período de muchos años. Este tipo de infección aumenta drásticamente la incidencia de carcinoma hepatocelular (cáncer de hígado), también con una latencia de muchos años.

[0005] El tratamiento de personas con infección crónica por VHB con fármacos antivirales como análogos de nucleósidos/nucleótidos (por ejemplo, Entecavir y Tenofovir) o interferón (IFN)a disminuye eficazmente las cargas virales séricas. Sin embargo, la terapia antiviral rara vez conduce a una respuesta virológica sostenida y se produce resistencia a los medicamentos (Zoulim et al., 2012). Además, la gran mayoría de los portadores del VHB no reciben tratamiento.

[0006] Aproximadamente entre el 15 % y el 40 % de los portadores crónicos del VHB desarrollarán enfermedades hepáticas clínicamente significativas a lo largo de su vida, con un alto riesgo de muerte por cirrosis hepática e insuficiencia hepática asociada o carcinoma hepatocelular (CHC) (Lok, 2002; y Huang et al., 2011). Cada año mueren hasta un millón de personas en todo el mundo debido a las consecuencias agudas o crónicas de la hepatitis B (Michel et al, 2001; Grimm et al, 2013). Debido al fracaso de los medicamentos antivirales para erradicar la infección y, en consecuencia, a la necesidad de una terapia antiviral a largo plazo, si no de por vida, con sus inconvenientes como efectos secundarios tóxicos y altos costes, existe una necesidad urgente de nuevos métodos terapéuticos (Grimm et al., 2013).

[0007] La presente invención pretende permitir una vacunación terapéutica eficaz contra la infección crónica por VHB. La vacunación terapéutica constituye una estrategia prometedora para tratar la hepatitis B crónica (Michel et al., 2011).

[0008] Además de la respuesta inmunitaria humoral contra el VHB, que está implicada predominantemente en la protección contra la infección por VHB mediante las vacunas profilácticas actuales (Lok, 2002), la respuesta inmunitaria celular está inequívocamente implicada en la resistencia natural contra la infección por VHB.

[0009] La transmisión perinatal del VHB de madres a recién nacidos y las infecciones durante los primeros años de vida provocan una infección persistente en más del 90 % de los niños. Por el contrario, la infección durante la edad adulta desaparece espontáneamente en más del 90 % de los casos y da lugar a una inmunidad protectora de por vida (Rehermann et al., 2005).

[0010] En la infección aguda y autolimitada por el virus de la hepatitis B, se pueden demostrar fácilmente en la sangre periférica vigorosas respuestas policlonales y multiespecíficas de linfocitos T citotóxicos (CTL) CD8+ y linfocitos T colaboradores (Th) CD4+ a muchos antígenos del VHB (Michel et al., 2011).

[0011] Estas respuestas de los linfocitos T son cruciales en la eliminación y el control del VHB. Experimentos en chimpancés infectados por el VHB han demostrado el papel esencial de los linfocitos T CD8+ específicos para el VHB como células efectoras en este proceso (Thimme et al., 2003). A diferencia de la respuesta en pacientes con infecciones por VHB resueltas, en pacientes con hepatitis B crónica las respuestas de los linfocitos T suelen ser muy débiles, centradas solo en unos pocos epítopos y funcionalmente deterioradas (Michel et al., 2011). El objetivo de la vacunación terapéutica es establecer respuestas vigorosas y robustas de CTL y linfocitos T colaboradores multivalentes dirigidas a muchos antígenos del VHB, buscando así la eliminación viral, el control de la hepatitis y la cura.

[0012] El documento US 2012/149120 se refiere a un nanosensor que comprende una proteína quimérica de la proteína de la cápside del VHB y la proteína A estafilocócica o una proteína fluorescente y al uso de dichos sensores para detectar un marcador de enfermedad. WO 2006/097285 se refiere a una variante del VHB que muestra una sensibilidad reducida a los análogos de nucleósidos del VHB, a un método para detectar dicha variante en una muestra, al uso de dicha variante de detección de fármacos y al uso de dichos fármacos en un método de tratamiento. Zaaijer et al., 2008, J. Viral Hepatitis, 15(4) p.239-245 trata sobre la tasa de sustitución del gen de superficie del VHB y el papel de la sustitución del gen de superficie del VHB en la viremia. WO 2010/017209 se refiere a antígenos variantes del VHB que comprenden un inserto antigénico gp41 y el uso de estas variantes para inducir una respuesta inmunitaria al VIH-1. WO 2006/034545 trata sobre la variante del VHB que muestra una sensibilidad reducida a los análogos de nucleósidos del VHB, a los métodos para detectar la variante y al uso de dicha variante en el cribado de fármacos.

[0013] A pesar de que se han logrado grandes avances en la comprensión de la etiología y epidemiología de la enfermedad, todavía existe la necesidad de una vacuna terapéutica eficaz contra el VHB.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

[0014] Los inventores identificaron una selección de antígenos del VHB para utilizar para una vacunación terapéutica eficaz. Según las capacidades de unión al HLA de clase I y de clase II de los péptidos derivados de la proteína del VHB y según el análisis de la generación de estos péptidos de unión al HLA de clase I mediante escisiones hechas por el proteasoma, se han descubierto las regiones más inmunogénicas, que cubren un porcentaje muy alto de todos los linfocitos T posibles en la población mundial de pacientes con hepatitis B, en la proteína polimerasa del VHB, la proteína central, la proteína X y la proteína de superficie grande. Estas regiones contienen una gran cantidad de epítopos de linfocitos T y, cuando se administran al paciente con hepatitis B, ya sea como un péptido largo sintetizado químicamente o mediante métodos genéticos, se prevé que dicha vacunación induzca una respuesta vigorosa de los linfocitos T, que resuelva la infección por VHB.

[0015] El uso de péptidos relativamente cortos es muy preferido para fines médicos, ya que pueden sintetizarse de manera eficientein vitro,lo cual no es posible o no es rentable para proteínas nativas de más de aproximadamente 100, es decir, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105 aminoácidos. La síntesis química de péptidos es una práctica rutinaria y los expertos conocen varios métodos adecuados. La síntesis química de péptidos también supera los problemas asociados con la producción recombinante de proteínas intactas, que es difícil de estandarizar y requiere extensas medidas de purificación y control de calidad. Los péptidos con una longitud que excede la longitud de los epítopos de clase I y clase II del antígeno leucocitario humano (HLA) (por ejemplo, que tienen una longitud como se indica a continuación en el presente documento) son particularmente ventajosos para su uso como componente de una vacuna, ya que son lo suficientemente grandes como para ser absorbidos por células presentadoras de antígeno profesionales (CPA), en particular células dendríticas (CD), como se explica en WO02/070006, y procesados en las CD antes de que tenga lugar la presentación en la superficie celular de los epítopos presentados por HLA de clase I y presentados por HLA de clase II contenidos. Por lo tanto, la inducción desventajosa de la tolerancia de los linfocitos T mediante la presentación sistémica de epítopos mínimos presentados por HLA de clase I en células no presentadoras de antígenos (como se muestra en Toes et al., 1996a, y Toes et al., 1996b) se previene mediante la aplicación de péptidos que exceden la longitud de los epítopos de clase I y clase II del antígeno leucocitario humano (HLA) (como se muestra en Zwaveling et al., 2002).

[0016] La presente invención se refiere a nuevos péptidos de aproximadamente 15 a aproximadamente 100 aminoácidos de longitud, en donde dichos péptidos tienen como máximo 40 aminoácidos de longitud, también denominados en el presente documento péptidos largos, cada uno de los cuales excede la longitud de los epítopos de antígeno leucocitario humano (HLA) de clase I y clase II y que inducen una respuesta combinada de linfocitos T CD4+ y CD8+ que es terapéuticamente exitosa e induce la curación en un alto porcentaje de pacientes, en donde dichos péptidos son un péptido derivado de una proteína del virus de la hepatitis B (VHB), en donde dicho péptido tiene, como máximo, 40 aminoácidos de longitud y comprende una secuencia se aminoácidos seleccionada del grupo formado por la SEQ ID N.°: 55, 60, 63, 64, 68, 71, 74, 75, 76, 77 y 1469.

Preferiblemente, los péptidos largos de la invención son péptidos sintéticos, denominados en el presente documento péptidos sintéticos largos (SLP). En comparación con la vacunación con los péptidos de la presente invención, es probable que la vacunación terapéutica con proteínas del VHB de longitud completa sea menos potente (Rosalia et al., 2013). Desde el punto de vista de la fabricación y administración de péptidos a los pacientes, no es factible la inmunización con el conjunto completo de péptidos largos superpuestos o SLP que abarcan la polimerasa del VHB de longitud completa, la proteína central del VHB, la proteína X del VHB y la proteína de superficie grande del VHB. Para reducir la cantidad de péptidos en una vacuna, es necesario incorporar los SLP más inmunogénicos que sean reconocidos por el mayor porcentaje de pacientes. La presente invención proporciona péptidos y vacunas peptídicas para satisfacer esta necesidad. Utilizando un sofisticado procedimiento de selección gradual basado en análisis bioinformáticos respaldados experimentalmente, se identificaron las secuencias largas de péptidos y/o SLP con la mayor cobertura de epítopos de linfocitos T citotóxicos restringidos por HLA de clase I y epítopos de linfocitos T colaboradores restringidos por HLA de clase II. Las selecciones como se describen en el presente documento identifican las secuencias largas de péptidos y/o SLP que incorporan epítopos de linfocitos T derivados del VHB que se presentan en todos los alelos HLA de clase I y clase II predominantemente expresados. Al cubrir la gran mayoría de los haplotipos HLA expresados en todo el mundo (Bui et al., 2006), la composición de la vacuna de péptidos largos y/o SLP se puede utilizar en todos los individuos infectados por el VHB. La presente invención describe la identificación y selección de péptidos largos derivados del VHB, preferiblemente SLP, que son altamente inmunogénicos y capaces de inducir una respuesta combinada potente de linfocitos T colaboradores CD4+ y linfocitos citotóxicos CD8+ dirigidos al VHB, cuando se administra como una composición de vacuna a pacientes. Estos péptidos largos altamente inmunogénicos del VHB no se conocen en el estado de la técnica. Los péptidos largos derivados del VHB de la invención se identificaron basándose en una puntuación de inmunogenicidad putativa desarrollada y validada por los inventores y como se describe en el presente documento. La inmunogenicidad putativa se cuantifica en el presente documento utilizando la puntuación de Evaluación de Inmunogenicidad Regional de linfocitos T (TRIA). La puntuación TRIA se basa en la puntuación BCI-Clase I acumulativa de dicho péptido, que es indicativa de su capacidad inmunogénica de activación de CTL, y la puntuación B-Clase II acumulativa de dicho péptido, que es indicativa de su capacidad inmunogénica de activación de linfocitos Th. El cálculo de la puntuación BCI-Clase I acumulativa y la puntuación B-Clase II acumulativa se describe en detalle en la sección Ejemplos. La puntuación TRIA se calcula como la suma de la puntuación BCI-Clase I acumulativa y la puntuación B-Clase II acumulativa. Se halló una fuerte correlación entre esta puntuación TRIA y las respuestas de los linfocitos T encontradas en PBMC de donantes inmunes al VHB. Por lo tanto, la puntuación TRIA permite la selección de péptidos largos inmunogénicos óptimos.

[0017] En un primer aspecto, la presente invención proporciona un péptido derivado de una proteína del VHB, donde dicho péptido tiene como máximo 40 aminoácidos de longitud y comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID N.°: 55, 60, 63, 64, 68, 71, 74, 75, 76, 77 y 1469, incluso más preferiblemente seleccionados del grupo que consiste en la SEQ ID N.°: 55, 60, 63, 64, 68, 71, 74, 75, 77 y 1469, incluso más preferiblemente seleccionado del grupo que consiste en la SEQ ID N.°: 60, 63, 71, 74, 75 y 1469, de la manera más preferible seleccionado del grupo que consiste en la SEQ ID N.°: 75, 1469 y 63. También se proporciona un péptido derivado de una proteína del VHB, donde dicho péptido consiste en una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID N.°: 55, 60, 63, 64, 68, 71, 74, 75, 76, 77 y 1469. También se prefiere un péptido de la invención que comprende o consiste en un péptido seleccionado del grupo que consiste en la s Eq ID N.°: 63, 71 y 75. Preferiblemente, el péptido de la invención comprende al menos aproximadamente 70 epítopos de linfocitos T predichos. Más preferiblemente, el péptido de la invención comprende al menos aproximadamente 70 epítopos de linfocitos T predichos y al menos aproximadamente 3 sitios de escisión proteasomal. Preferiblemente, el péptido de la invención comprende al menos aproximadamente 70 epítopos de linfocitos T citotóxicos CD8+ restringidos por HLA de clase I predichos, al menos aproximadamente 1 epítopo de linfocitos T colaboradores CD4+ restringido por HLA de clase II predicho. Más preferiblemente, el péptido de la invención comprende al menos aproximadamente 70 epítopos de linfocitos T citotóxicos CD8+ restringidos por HLA de clase I predichos, al menos aproximadamente 1 epítopo de linfocitos T colaboradores CD4+ restringido por HLA de clase II predicho y al menos aproximadamente 3 sitios de escisión proteasomal. Los epítopos de linfocitos T citotóxicos CD8+ restringidos por HLA de clase I también se denominan en este documento epítopos de CTL, y los epítopos de linfocitos T colaboradores CD4+ restringidos por HLA de clase II también se denominan en el presente documento epítopos de linfocitos Th. Preferiblemente, el péptido de la invención comprende al menos aproximadamente 70 epítopos de CTL predichos, al menos aproximadamente 15 epítopos de linfocitos Th predichos. Más preferiblemente, el péptido de la invención comprende al menos aproximadamente 70 epítopos de CTL predichos, al menos aproximadamente 15 epítopos de linfocitos Th predichos y al menos aproximadamente 3 sitios de escisión proteasomal. Preferiblemente, el péptido de la invención comprende al menos aproximadamente 95 epítopos de CTL predichos, al menos aproximadamente 25 epítopos de linfocitos Th predichos. Más preferiblemente, el péptido de la invención comprende al menos aproximadamente 95 epítopos de CTL predichos, al menos aproximadamente 25 epítopos de linfocitos Th predichos y al menos aproximadamente 3 sitios de escisión proteasomal. Preferiblemente, el péptido de la invención comprende al menos aproximadamente 125 epítopos de CTL predichos, al menos aproximadamente 50 epítopos de linfocitos Th predichos. Más preferiblemente, un péptido de la invención comprende al menos aproximadamente 125 epítopos de CTL predichos, al menos aproximadamente 50 epítopos de linfocitos Th predichos y al menos aproximadamente 3 sitios de escisión proteasomal. Preferiblemente, un péptido de la invención tiene una puntuación TRIA de al menos aproximadamente 6300, al menos aproximadamente 8000, al menos aproximadamente 9000, al menos aproximadamente 10000 o preferiblemente al menos aproximadamente 14000.

[0018] Un péptido de la invención puede usarse ventajosamente en la prevención y/o el tratamiento de una enfermedad o afección relacionada con el VHB en un sujeto, preferiblemente un mamífero, más preferiblemente un ser humano. Preferiblemente, el péptido de la invención comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos, preferiblemente una secuencia de aminoácidos contiguos, de cualquiera de las proteínas seleccionadas del grupo que consiste en proteína polimerasa del VHB, proteína central del VHB, proteína X del VHB y proteína de superficie grande del VHB. Preferiblemente, dicho péptido comprende o consiste en un péptido seleccionado del grupo que consiste en la SEQ ID N.°: 51-79, 1142-1145 y 1468-1471. Un péptido de este grupo se caracteriza por el hecho de que tiene una puntuación TRIA de al menos 6300, lo que indica una alta capacidad inmunogénica para la activación de linfocitos T CD4+ y CD8+. Además, un péptido de este grupo se caracteriza por el hecho de que comprende al menos 70 epítopos de linfocitos T citotóxicos CD8+ restringidos por HLA de clase I predichos, al menos 1 epítopo de linfocitos T colaboradores CD4+ restringido por HLA de clase II predicho. Preferiblemente, un péptido de este grupo comprende al menos 3 sitios de escisión proteasomal.

[0019] Aún más preferiblemente, el péptido de la invención comprende o consiste en un péptido seleccionado del grupo que consiste en la SEQ ID N.°: 55, 60, 63, 64, 68, 71, 75, 77 y 1468. Un péptido de este grupo se caracteriza por el hecho de que comprende al menos 95 epítopos de CTL predichos, al menos 25 epítopos de linfocitos Th predichos. Preferiblemente, un péptido de este grupo comprende al menos 3 sitios de escisión proteasomal. Preferiblemente, el péptido de la invención comprende o consiste en un péptido seleccionado del grupo que consiste en la SEQ ID N.°: 55, 60, 63, 64, 68, 71, 75, 77, 1142, 1469.

[0020] Más preferiblemente, el péptido de la invención comprende o consiste en un péptido seleccionado del grupo que consiste en la SEQ ID N.°: 63, 75 y 1469. Un péptido de este grupo se caracteriza por el hecho de que tiene una puntuación TRIA de al menos 14000. Además, un péptido de este grupo se caracteriza por el hecho de que comprende al menos 125 epítopos de CTL predichos, al menos 50 epítopos de linfocitos Th predichos. Preferiblemente, un péptido de este grupo comprende al menos 3 sitios de escisión proteasomal.

[0021] Un "epítopo de linfocitos T" se define en el presente documento como un fragmento lineal de un antígeno polipeptídico, que es reconocido y unido por un receptor de linfocitos T, preferiblemente un receptor de linfocitos T humano, después de hacerse accesible a un receptor de linfocitos T mediante procesamiento proteolítico intracelular del antígeno polipeptídico y posterior presentación por una molécula de HLA de clase I o HLA de clase II en la superficie celular de una célula presentadora de antígeno. Un "epítopo de linfocitos T predicho” debe entenderse en el presente documento como un fragmento lineal de un antígeno polipeptídico para el cual se ha predicho la liberación de la proteína o péptido fuente mediante escisión proteolítica y el reconocimiento y/o unión del receptor de linfocitos T usando análisis bioinformáticos basados en algoritmos que predicen la unión de péptidos de HLA de clase I y II y la generación C-terminal por el proteosoma de todos los posibles péptidos de unión HLA de clase I (con una longitud de ligando HLA de clase I; 8-12 aa) contenidos en las proteínas del VHB. Un "epítopo de linfocitos T confirmado" debe entenderse en el presente documento como un fragmento lineal de un antígeno polipeptídico cuya capacidad de liberación de la proteína fuente o polipéptido fuente mediante escisión proteolítica y reconocimiento y/o unión al receptor de linfocitos T y, más preferiblemente, de activación de linfocitos T CD4+ o CD8+ se ha establecido experimentalmente como se describe en el presente documento. En el presente documento se entiende que un "fragmento lineal" es una secuencia de aminoácidos contiguos de un antígeno polipeptídico, siendo dicho antígeno polipeptídico preferiblemente una proteína del VHB, más preferiblemente una proteína seleccionada del grupo que consiste en proteína polimerasa del VHB, proteína central del VHB, proteína X del VHB y proteína de superficie grande del VHB. Un fragmento lineal idéntico de un antígeno polipeptídico que muestra afinidad de unión a un segundo o subsiguiente tipo adicional de molécula HLA de clase I o HLA de clase II debe entenderse en el presente documento como un segundo o subsiguiente epítopo de linfocitos T. En otras palabras, un fragmento lineal específico de un antígeno polipeptídico que es capaz de unirse a dos tipos de moléculas de HLA se entiende en el presente documento como dos epítopos de linfocitos T separados o distintos, y se puntúa dos veces en la puntuación acumulativa de BCI de Clase I y/o B de Clase II. Un epítopo de linfocitos T normalmente comprende o consiste en al menos 8 aminoácidos y hasta 20 o (excepcionalmente) incluso más aminoácidos. Un epítopo de linfocitos T puede ser un epítopo de linfocitos T citotóxicos (CTL) CD8+ restringido por HLA de clase I o un epítopo de linfocitos T colaboradores (Th) CD4+ restringido por HLA de clase II. Los epítopos restringidos por HLA de clase I (también denominados epítopos de CTL) se presentan típicamente a través de la ruta clásica de procesamiento de HLA de clase I dependiente de proteasoma, mientras que las moléculas de HLA de clase II generalmente se cargan con fragmentos lineales en el compartimento endosómico tardío. Preferiblemente, un péptido según la invención comprende epítopos de linfocitos T que se seleccionan del grupo que consiste en la SEQ ID N.°: 80-276, 278-314, 316-429, 432-483, 486-545, 548-636, 638. -1140 y 1146 - 1466 (véanse las Tablas 4-7). Un péptido preferido según la invención comprende al menos 70, 71, 72, 73, 74, 75, 79, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175, 180, 185, 190, 195, 200, 205, 210, 215, 220, 225 o de aproximadamente 230 a aproximadamente 233 epítopos de linfocitos T predichos a partir de la proteína central del VHB, polimerasa del VHB, proteína X del VHB y/o proteína de superficie grande del VHB. Un péptido más preferido según la invención comprende al menos 95, 96, 97, 98, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175, 180, 185, 190, 195, 200, 205, 210, 215, 220, 225 o de aproximadamente 230 a aproximadamente 233 epítopos de linfocitos T predichos de la proteína central del VHB, la polimerasa del VHB, la proteína X del VHB y/o la proteína de superficie grande del VHB. Un péptido aún más preferido según la invención comprende al menos 70, 71, 72, 73, 74, 75, 79, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175, 180, 185, 190, 195, 200, 205, 210, 215, 220, 225 o de aproximadamente 230 a aproximadamente 233 epítopos de linfocitos T predichos seleccionados de entre el grupo que consiste en la SEQ ID N.°: 80-276, 278-314, 316-429, 432-483, 486-545, 548-636, 638-1140 y 1146-1466. Un péptido aún más preferido según la invención comprende al menos 95, 96, 97, 98, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175, 180, 185, 190, 195, 200, 205, 210, 215, 220, 225 o de aproximadamente 230 a aproximadamente 233 epítopos de linfocitos T predichos seleccionados del grupo que consiste en la SEQ ID N.°: 80-276, 278-314, 316-429, 432-483, 486 -545, 548-636, 638-1140 y 1146 - 1466. Preferiblemente, los epítopos de linfocitos T predichos de la presente invención se confirman experimentalmente como se describe en el presente documento. Un péptido preferido según la invención comprende al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65 o 70 epítopos de linfocitos T confirmados de la proteína central del VHB, la polimerasa del VHB, la proteína X del VHB y/o la proteína de superficie grande del VHB. Un péptido más preferido según la invención comprende al menos 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90 o 95 epítopos de linfocitos T confirmados de la proteína central del VHB, la polimerasa del VHB, la proteína X del VHB y/o la proteína de superficie grande del VHB. Un péptido aún más preferido según la invención comprende al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65 o 70 epítopos de linfocitos T confirmados seleccionados del grupo que consiste en la SEQ ID N.°: 80-276, 278-314, 316-429, 432- 483, 486-545, 548-636, 638-1140 y 1146-1466. Un péptido aún más preferido según la invención comprende al menos 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90 o 95 epítopos de linfocitos T confirmados seleccionados del grupo que consiste en la SEQ ID N.°: 80-276, 278-314, 316-429, 432-483, 486-545, 548-636, 638-1140 y 1146-1466.

[0022] Un "sitio de escisión proteasomal" se entiende en el presente documento como un sitio en una proteína o polipéptido que es escindido por proteasoma, preferiblemente un proteasoma humano/un proteosoma presente de forma natural en una célula humana. Preferiblemente, un sitio de escisión proteasomal específico que libera el extremo C terminal del epítopo está presente exactamente después del extremo C terminal de la secuencia de aminoácidos del epítopo, para permitir que el residuo C-terminal del epítopo se libere del péptido más grande y sea presentado por la molécula HLA de clase I. El primer evento importante que define un epítopo de linfocitos T citotóxicos (CTL) CD8+ restringido por HLA de clase I es la liberación del epítopo (o del precursor del epítopo) de sus regiones proteicas flanqueantes a través de la escisión enzimática por peptidasas citosólicas. El proteosoma multicatalítico es el complejo enzimático primario necesario para la generación del extremo C terminal exacto de la gran mayoría de los epítopos de<c>T<l>(Rock et al., 2004). Los proteosomas son complejos enzimáticos multicatalíticos de abundante presencia intracelular y se consideran responsables de la generación del extremo C terminal de la gran mayoría de los epítopos de CTL (Craiu et al, 1997; Stoltze et al., 1998; Mo et al., 1999). La generación del extremo amino terminal de un epítopo de CTL, por otro lado, es mucho más flexible porque varias exopeptidasas amino terminales (como ERAP1, aminopeptidasa sensible a puromicina, bleomicina hidrolasa y otras) residen en el citosol y el retículo endoplásmico y estas enzimas de corte tienen la capacidad de acortar un precursor de epítopo alargado N-terminal hasta su longitud precisa. Por el contrario, no se ha observado un corte del extremo C-terminal. Por lo tanto, la identificación de los sitios de escisión mediados por proteasoma en una proteína o en un polipéptido, como un péptido de la invención, puede usarse como un identificador importante de casi todos los epítopos de CTL, porque las escisiones proteasómicas determinan y permiten la generación de epítopos C-terminales (Kessler et al., 2001; Kessler y Melief, 2007). La evaluación de los sitios de escisión proteasomal en la proteína central del VHB, la polimerasa del VHB, la proteína X del VHB y/o la proteína de superficie grande del VHB identifica los extremos C terminal de los fragmentos peptídicos del VHB producidos intracelularmente, específicamente para los fragmentos peptídicos presentados por HLA de clase I. Los requisitos de longitud son mucho menos estrictos para la carga de HLA de clase II con fragmentos peptídicos. Por lo tanto, no es necesaria la generación enzimática precisa del fragmento peptídico de unión a HLA de clase II. Estos requisitos de epítopos de linfocitos T se han utilizado en la presente invención para localizar y diseñar péptidos largos derivados de secuencias de longitud completa de una proteína del VHB que comprende epítopos de linfocitos T citotóxicos (CTL) CD8+ y de linfocitos T colaboradores (Th) CD4+ preferidos y/o combinaciones de estos y, por lo tanto, son péptidos altamente inmunogénicos y, por lo tanto, adecuados para fines de síntesis y vacunación (terapéutica).

[0023] Se pueden predecir las escisiones proteolíticas mediadas por proteasomain silicoutilizando un algoritmo de predicción. La escisión realizada por el proteasoma se puede verificar en un ensayo de escisión mediada por proteasoma como se describe en el presente documento, que mide la liberación C-terminal del epítopo de sus regiones flanqueantes (Kessler et al., 2001; Kessler y Melief, 2007). Se puede utilizar un ensayo de escisión de proteasoma libre de células que identifica y mide cuantitativamente las posiciones de los aminoácidos (aa) y la abundancia de escisiones por el proteosoma en un polipéptido para determinar qué péptidos se generan a partir de la proteína fuente (o polipéptido fuente), estableciendo así el conjunto de péptidos disponibles para la generación de epítopos. El ensayo de escisión de proteasoma libre de células implica la incubación conjunta de un polipéptido (preferiblemente con una longitud de 28-40 aa, más preferiblemente con una longitud de 30-39 aa) con una preparación de proteosomas purificados en una solución amortiguadora apropiada. Existen dos formas principales de proteosomas, los inmunoproteosomas, que se expresan principalmente en células presentadoras de antígenos profesionales, como, por ejemplo, células dendríticas, y los proteosomas constitutivos, que se expresan principalmente en otros tipos de células. Estos tipos contienen subunidades catalíticas variantes con actividad catalítica ligeramente diferente. Aunque la mayoría de los epítopos son liberados por ambos tipos de proteosomas, a veces se produce una generación diferencial de epítopos que depende del tipo de proteosoma (Morel et al., 2000; Chapiro et al., 2006). Por consiguiente, los ensayos de escisión mediada por proteasoma se pueden realizar por separado con estos dos tipos de proteasoma. Preferiblemente, se usa un proteasoma 20S constitutivo o un proteasoma 20S inmune, como se describe en el presente documento. La mezcla de reacción que comprende los péptidos que se van a escindir y cualquiera de los dos tipos de proteasoma (preparaciones de proteasoma purificadas) se incuba a 37 °C y se extraen muestras a las 1 h, 3 h, 6 h y 24 h, como se detalla en los Ejemplos de este documento. Posteriormente, los fragmentos de escisión del péptido generado y el polipéptido fuente restante se identifican y cuantifican mediante espectrometría de masas (Kessler et al., 2001). Esta prueba revela tanto las posiciones en el polipéptido (y, por tanto, en la proteína fuente) donde se escinde el proteasoma como la eficiencia de escisión (abundancia) en estas posiciones. Un sitio de escisión puede confirmarse mediante la detección de fragmentos que contienen como extremo COOH el residuo NH2-terminal del sitio de escisión junto con el/los (posible(s)) fragmento(s) complementario(s), calculado(s) a partir de las intensidades de los picos de los fragmentos en los espectros de masas (preferiblemente con una presencia >1 %, más preferiblemente con una presencia >7 %, a las 24 h de incubación), tanto en la digestión con proteosomas constitutivos como en la digestión con inmunoproteosomas. Preferiblemente, un péptido de la invención comprende al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 o más, preferiblemente al menos 3, sitios de escisión proteasomal como se define en el presente documento. Más preferiblemente, un péptido de la invención comprende al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 o más, preferiblemente al menos 3, sitios de escisión proteasomal según se evalúa y verifica en un ensayo de escisión proteasomal como se ha descrito anteriormente.

[0024] Como se ha indicado anteriormente, como ejemplos de epítopos de linfocitos T están los epítopos de linfocitos T citotóxicos (CTL) CD8+ restringidos por HLA de clase I y los epítopos de linfocitos T colaboradores (Th) CD4+ restringidos por HLA de clase II. En el presente documento, un "epítopo de CTL" se entiende como un fragmento lineal de un antígeno polipeptídico que se libera de la proteína fuente mediante escisión proteolítica mediada por proteasoma y posteriormente se presenta mediante una molécula HLA de clase I en la superficie celular de una célula presentadora de antígeno (CPA), preferiblemente una célula presentadora de antígeno humana. Un "epítopo de CTL predicho" se entiende en el presente documento como un fragmento lineal de un antígeno polipeptídico para el cual la liberación a partir de su proteína fuente mediante escisiones proteolíticas y la unión a la molécula HLA de clase I se han predicho usando análisis bioinformáticos basados en algoritmos que predicen la unión al péptido HLA de clase I y la generación C-terminal por el proteosoma de todos los péptidos cortos de unión a HLA de clase I (con una longitud de un epítopo de CTL; 8 - 12 aa) contenidos en las proteínas del VHB. Preferiblemente, un epítopo de CTL predicho de la presente invención se confirma experimentalmente como se describe en el presente documento. Un epítopo de CTL de la invención es preferiblemente capaz de activar una respuesta de los linfocitos T CD8+. Un "epítopo de CTL confirmado" se entiende en el presente documento como un fragmento lineal de un antígeno polipeptídico para el que la liberación mediante escisiones proteolíticas y unión a moléculas de HLA de clase I, más preferiblemente la activación de linfocitos T CD8+, se ha establecido experimentalmente como se describe en el presente documento. Un epítopo de CTL de la invención es preferiblemente capaz de activar una respuesta de los linfocitos T CD8+. Un epítopo de CTL normalmente comprende al menos de 8 a 12 o, excepcionalmente, hasta 13 o 14 aminoácidos. Preferiblemente, un epítopo de CTL consiste en 8-14 aminoácidos, es decir, tiene una longitud de al menos 8 hasta 14 aminoácidos.

[0025] Un epítopo de CTL se define por dos eventos intracelulares importantes, que son (i) la escisión proteolítica mediada por proteasoma y (ii) la unión a una molécula HLA de clase I, que tiene lugar en el retículo endoplásmico (RE). Cuanto más fuerte es la unión de un fragmento de péptido lineal y más lenta es la velocidad de eliminación, más probable es que este fragmento de péptido lineal se convierta en un epítopo de CTL inmunogénico presentado en la superficie celular (Van der Burg et al., 1996). El análisis de escisiones proteolíticas mediadas por proteosomas se puede llevar a cabo como se ha indicado anteriormente. Preferiblemente, la unión específica a una molécula HLA de clase I se predice usando un algoritmo de predicciónin silicoy se establece mediante el uso de un ensayo de unión de péptidos HLA de clase I como lo conocen los expertos en la técnica (Kessler y Melief, 2007; Kessler et al., 2003). Preferiblemente, se prevé que el epítopo restringido por HLA de clase I en un péptido largo según la invención sea generado en su extremo C terminal por el proteasoma y preferiblemente tiene una capacidad de unión de alta afinidad prevista para la molécula de HLA de clase I usando un ensayo como se describe en van der Burg et al., 1995 y Kessler et al., 2003; por ejemplo, CI50 ^ aproximadamente 5 pM puede considerarse unión de alta afinidad, aproximadamente 5 pM < CI50 ^ aproximadamente 15 pM puede considerarse unión de afinidad intermedia, aproximadamente 15 pM < CI50 ^ 100 pM puede considerarse unión de baja afinidad y CI50 > aproximadamente 100 pM puede considerarse sin unión. Para medir la afinidad de unión de clase I de un péptido o fragmentos de este, se encuentran disponibles varios ensayos de unión de HLA de clase I. Los ensayos se pueden dividir en ensayos sin células (que utilizan HLA soluble) frente a ensayos celulares (que utilizan moléculas de HLA de clase I en la superficie celular) y ensayos competitivos (que dan como resultado datos semicuantitativos) frente a ensayos que no utilizan un péptido de referencia etiquetado y, por lo tanto, son cuantitativos (Kessler y Melief, 2007; Viatte et al., 2006). Los ensayos tienen en común que la afinidad de unión del péptido HLA de clase I se evalúa de forma fiable.

[0026] La presentación real de un epítopo de CTL en la superficie celular, es decir, el resultado neto de la escisión proteasomal, de posibles otros eventos proteolíticos como el recorte N-terminal y de la unión y presentación por una molécula HLA de clase I, eventos que, juntos, definen un epítopo de CTL como se ha indicado anteriormente, se puede demostrar mediante un método bioquímico o mediante un método funcional utilizando linfocitos T citotóxicos con un receptor de linfocitos T específico para el epítopo y el (geno)tipo de molécula HLA de clase I, como lo conocen los expertos en la técnica (Kessler y Melief, 2007).

[0027] El método bioquímico implica la purificación bioquímica de complejos HLA-epítopo a partir de células que expresan el antígeno del VHB de la invención junto con el (geno)tipo de molécula HLA de clase I presentadora, seguido de la búsqueda por espectrometría de masas del epítopo en los ligandos del receptor de CTL unidos al HLA de clase I eluidos, como sabrán los expertos en la técnica (Schirle et al., 2000; Schirle et al., 2001).

[0028] El enfoque funcional implica una línea o clon de CTL que reconoce específicamente el epítopo HLA0, que se utiliza como herramienta para demostrar el procesamiento natural y la presentación real del epítopo por las moléculas de HLA de clase I. En esta metodología, utilizando un ensayo de inducción de CTL como se conoce en la técnica, se usa el mínimo generado sintéticamente (es decir, longitud exacta) del epítopo o la secuencia peptídica de interés que abarca el epítopo, por ejemplo, un péptido, péptidos largos y/o SLP como se define en el presente documento, para estimular y seleccionar linfocitos T citotóxicos específicos del epítopo de HLA. Con ese fin, brevemente, una población de linfocitos T CD8+ multivalente, o una población de linfocitos T CD8+ y CD4+ mixta multivalente, se estimula con células diana autólogas cuyas moléculas de HLA de clase I en la superficie celular están cargadas exógenamente con el epítopo sintético preciso o cargadas endógenamente con epítopos de CTL generados intracelularmente derivados del péptido largo cargado exógenamente de la invención después de su captación por las células diana presentadoras de antígeno. En caso de que las células diana autólogas estén cargadas con un péptido, por ejemplo, el péptido largo sintético de la invención, o fragmentos del mismo, que abarca el epítopo, el epítopo se genera después de la captación celular del péptido y su procesamiento intracelular por el proteasoma junto con otras peptidasas de corte N-terminal. Posteriormente, utilizando un ensayo de reconocimiento de linfocitos T, se utiliza el CTL específico del epítopo HLA para demostrar la generación intracelular y la presentación natural del epítopo de la invención mediante moléculas de HLA de clase I en la superficie de células infectadas por VHB. El reconocimiento específico de un epítopo restringido por HLA de clase I por un CTL demuestra la expresión del epítopo en la superficie celular y revela su inmunogenicidad, es decir, la presencia de linfocitos T específicos de epítopo en el repertorio (receptor de linfocitos T) de un donante seleccionado. Preferiblemente, la capacidad de activación de linfocitos T CD8+ se ha demostradoex vivoy/oin vivo,en linfocitos T de individuos de control sanos humanos o incluso más preferiblemente en linfocitos T de un paciente humano con una enfermedad o afección relacionada con el VHB y/o de un control sano. La activación se evalúa preferiblementeex vivooin vivo,más preferiblemente en un paciente humano con una enfermedad relacionada con el VHB. Un epítopo de CTL cuya liberación mediante escisión proteolítica y presentación de moléculas de HLA de clase I, o preferiblemente capacidad de activación de linfocitos T CD8+, se ha demostrado experimentalmente se denomina en el presente documento un epítopo de CTL confirmado.

[0029] Un péptido de la invención comprende preferiblemente al menos 70, 71, 72, 73, 74, 75, 79, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175, 180, 185, 190, 195, 200, 205, 210, 215, 220, 225, 230 y hasta 233 epítopos de CTL predichos como se define en el presente documento. Preferiblemente, un péptido de la invención comprende al menos 70, 71, 72, 73, 74, 75, 79, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175, 180, 185, 190, 195, 200, 205, 210, 215, 220, 225, 230 y hasta 233 epítopos de CTL predichos como se define en el presente documento. Preferiblemente, un péptido según la invención comprende al menos 70, 71, 72, 73, 74, 75, 79, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175, 180, 185, 190, 195, 200, 205, 210, 215, 220, 225, 230 y hasta 233 epítopos de CTL predichos de la proteína central del VHB, polimerasa del VHB, proteína X del VHB y/o proteína de superficie grande del VHB. Más preferiblemente un péptido según la invención comprende al menos 70, 71, 72, 73, 74, 75, 79, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175, 180, 185, 190, 195, 200, 205, 210, 215, 220, 225, 230 y hasta 233 epítopos de CTL predichos de la proteína central del VHB, polimerasa del VHB, proteína X del VHB o proteína de superficie grande del VHB. Aún más preferiblemente, un péptido según la invención comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos contiguos de cualquiera de las proteínas seleccionadas del grupo que consiste en proteína central del VHB, polimerasa del VHB, proteína X del VHB y proteína de superficie grande del VHB, en donde dicha secuencia de aminoácidos contiguos comprende al menos 70, 71, 72, 73, 74, 75, 79, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175, 180, 185, 190, 195, 200, 205, 210, 215, 220, 225, 230 y hasta 233 epítopos de CTL predichos. Preferiblemente, un péptido según la invención comprende al menos 70, 71, 72, 73, 74, 75, 79, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175, 180, 185, 190, 195, 200, 205, 210, 215, 220, 225, 230 y hasta 233 epítopos predichos de CTL seleccionados del grupo que consiste en la SEQ ID N.°: 80-276, 278-314, 316-429, 432-483, 486-545, 548-636, 638-685; 846-923, 959-1090 y 1146-1395 (véanse las Tablas 4a, 5a, 6a y 7a). Aún más preferiblemente, un péptido de la invención comprende preferiblemente al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 70, o preferiblemente al menos 95 epítopos de CTL confirmados como se define en el presente documento y verificados usando un ensayo bioquímico o funcional como se ha descrito anteriormente. Lo más preferido es un péptido de la invención que comprende al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65 o 70 o preferiblemente al menos 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90 o 95 epítopos de CTL confirmados como se define en el presente documento y verificados usando un ensayo funcional como se ha descrito anteriormente. Preferiblemente, un péptido de la invención comprende al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65 o 70 o preferiblemente al menos 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90 o 95 epítopos de CTL confirmados seleccionados del grupo que consiste en la SEQ ID N.°: 80-276, 278-314, 316-429, 432-483, 486 -545, 548-636, 638-685; 846-923, 959-1090 y 1146-1395.

[0030] En el presente documento, se entiende por "epítopo de linfocitos Th" un fragmento peptídico lineal que es reconocido por una molécula HLA de clase II. Un "epítopo de linfocitos Th predicho" se entiende en el presente documento como un fragmento lineal de un antígeno polipeptídico para el cual se ha predicho el reconocimiento de la molécula HLA de clase II utilizando análisis bioinformáticos sofisticados que están respaldados experimentalmente. Preferiblemente, un epítopo de linfocitos Th predicho de la presente invención se confirma experimentalmente como se describe en el presente documento. Un epítopo de linfocitos Th de la invención preferiblemente es capaz de inducir una respuesta de los linfocitos T CD4+. Un "epítopo de linfocitos Th confirmado" se entiende en el presente documento como un fragmento lineal de un antígeno polipeptídico para el cual se ha establecido experimentalmente el reconocimiento de la molécula HLA de clase II como saben los expertos en la técnica y se detalla más en el presente documento.

[0031] Un epítopo de linfocitos T colaboradores (linfocitos Th) CD4+ restringido por HLA de clase II normalmente comprende de 15 a 20, o excepcionalmente incluso más, aminoácidos. Preferiblemente, un epítopo de linfocitos T colaboradores restringido por HLA de clase II comprende de 10 a 20 o de 10 a 15 aminoácidos. El reconocimiento específico de un epítopo de linfocitos Th derivado del VHB predicho se puede probar y/o verificar en un ensayo de inducción de linfocitos Th. Para este fin, el péptido o fragmento de este, el péptido largo y/o la secuencia SLP de interés que comprende el epítopo de linfocitos Th predicho se carga exógenamente en la superficie de las células diana y posteriormente estas células diana cargadas con péptido se coincuban con una población autóloga multivalente de linfocitos T colaboradores. Después de varias rondas de estimulación, se pueden seleccionar linfocitos T colaboradores específicos de epítopo y se pueden realizar pruebas retrospectivas para el reconocimiento del epítopo de linfocitos T colaboradores contenido en el péptido o SLP, demostrando así su presentación natural en la superficie celular. Preferiblemente, un epítopo de linfocitos T colaboradores CD4+ restringido por HLA de clase II comprendido en un péptido según la invención es capaz de inducir o activar un linfocito T colaborador CD4+ en un paciente humano con una enfermedad o afección relacionada con el VHB. La inducción o activación se evalúa preferiblementeex vivooin vivo,más preferiblemente en un paciente humano con una enfermedad relacionada con el VHB. De la manera más preferible, el epítopo restringido por HLA de clase II es capaz de activar una memoria de linfocitos T colaboradores CD4+ y/o una respuesta efectora de linfocitos T colaboradores CD4+, es decir, la activación de un linfocito T colaborador CD4+ positivo para CD45RO. Esto conducirá, en virtud de la señal de 'licencia para matar' a través de la activación de CD mediada por C40 (Lanzavecchia, 1998), a una robusta respuesta efectora y de memoria de los linfocitos T citotóxicos CD8+. En otro entorno, los linfocitos T colaboradores CD4+ activados pueden activar las células asesinas del sistema inmunitario no restringidas por HLA. Un epítopo de linfocitos Th cuyo reconocimiento por una molécula HLA de clase II, o preferiblemente capacidad de activación de CD4+, se ha demostrado experimentalmente se denomina en el presente documento epítopo de linfocitos Th confirmado.

[0032] Preferiblemente, un péptido según la invención comprende al menos un epítopo de linfocitos Th predicho de la proteína central del VHB, la polimerasa del VHB, la proteína X del VHB y/o la proteína de superficie grande del VHB. Preferiblemente, un péptido de la invención comprende al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 7, 8, 9, 10 o preferiblemente al menos 15 epítopos de linfocitos Th predichos como se define en el presente documento. Preferiblemente, un péptido según la invención comprende al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 7, 8, 9, 10, o preferiblemente al menos 15 epítopos de linfocitos Th predichos de la proteína central del VHB, polimerasa del VHB, proteína X del VHB y/o proteína de superficie grande del VHB. Aún más preferiblemente, un péptido según la invención comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos contiguos de cualquiera de las proteínas seleccionadas del grupo que consiste en proteína central del VHB, polimerasa del VHB, proteína X del VHB y proteína de superficie grande del VHB, en donde dicha secuencia de aminoácidos contiguos comprende al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 7, 8, 9, 10, o preferiblemente al menos 15 epítopos de linfocitos Th predichos. Preferiblemente, un péptido según la invención comprende al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 7, 8, 9, 10, o preferiblemente al menos 15 epítopos de linfocitos Th predichos seleccionados del grupo que consiste en la SEQ ID N.°: 686-845; 924-958, 1091-1140 y 1396-1466 (véanse las Tablas 4b, 5b, 6b y 7b). Más preferiblemente, un péptido de la invención comprende al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 7, 8, 9, 10, o preferiblemente al menos 15 epítopos de linfocitos Th confirmados como se define en el presente documento. Aún más preferiblemente, un péptido de la invención comprende al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 7, 8, 9, 10, o preferiblemente al menos 15 epítopos de linfocitos Th confirmados como se define en el presente documento y verificados usando un ensayo de inducción de linfocitos T colaboradores como se ha descrito anteriormente. Preferiblemente, un péptido de la invención comprende al menos 1,2, 3, 4, 5, 6, 8, 7, 8, 9, 10, o preferiblemente al menos 15 epítopos de linfocitos Th confirmados seleccionados del grupo que consiste en la SEQ ID N.°: 686-845; 924-958, 109l-1140 y 1396 1466.

[0033] Preferiblemente, un péptido según la invención comprende al menos 70 epítopos de CTL predichos y al menos un epítopo de linfocitos Th predicho de la proteína central del VHB, la polimerasa del VHB, la proteína X del VHB y/o la proteína de superficie grande del VHB. Más preferiblemente, un péptido según la invención es un péptido derivado de la proteína central del VHB, polimerasa del VHB, proteína X del VHB y/o proteína de superficie grande del VHB, preferiblemente es un fragmento de la proteína central del VHB, polimerasa del VHB, proteína X del VHB y /o proteína de superficie grande del VHB, que comprende al menos 70 epítopos de CTL predichos, al menos un epítopo de linfocitos Th predicho y al menos 3 sitios de escisión proteasomal. Se ha observado que la presencia de al menos 3 sitios de escisión proteasomal, al menos 70 epítopos de CTL predichos y al menos 1 epítopo Th dentro de un único péptido según la invención, que es un fragmento continuo de aminoácidos de una proteína antigénica de interés, es particularmente ventajosa debido a la sinergia entre la respuesta Th y la respuesta CTL en el montaje y mantenimiento de una respuesta de los linfocitos T citotóxicos CD8+ efectiva. Varios estudios publicados han demostrado que los linfocitos T colaboradores CD4+, tras la interacción con el epítopo HLA de clase II que presenta células dendríticas (CD), regulan positivamente el ligando CD40. La interacción del linfocito Th por su ligando CD40 con la molécula CD40 de las CD conduce a la activación de las CD. Las CD activadas muestran moléculas coestimuladoras reguladas positivamente y secretan citoquinas promotoras de CTL. Esto permite una respuesta de CTL CD8+ más robusta inducida por una CD activada que presenta epítopos restringidos por HLA de clase I y una respuesta de memoria de CTL mucho más robusta (Ridge et al., 1998; Schoenberger et al., 1998; Sun et al., 2004). La necesidad de expresión de CD40 en CD para obtener respuestas de CTL CD8+ robustas después de la vacunación con péptidos largos sintéticos (longitud de 35 aa) se ha demostrado en Zwaveling et al. (2002).

[0034] Por consiguiente, un péptido preferido según la invención comprende al menos 70 epítopos de CTL predichos y al menos un epítopo de linfocitos Th predicho; preferiblemente al menos 70 epítopos de CTL predichos seleccionados del grupo que consiste en la SEQ ID N.°: 80-276, 278-314, 316-429, 432-483, 486-545, 548-636, 638-685; 846-923, 959-1090 y 1146-1395 y al menos un epítopo de linfocitos Th predicho seleccionado del grupo que consiste en la SEQ ID N.°: 686-845; 924-958, 1091-1140 y 1396-1466. Un péptido más preferido según la invención comprende al menos 70 epítopos de CTL predichos y al menos 15 epítopos de linfocitos Th predichos; preferiblemente al menos 70 epítopos de CTL predichos seleccionados del grupo que consiste en la SEQ ID N.°: 80-276, 278-314, 316-429, 432-483, 486-545, 548-636, 638-685; 846-923, 959-1090 y 1146-1395 y al menos 15 epítopos de linfocitos Th predichos seleccionados del grupo que consiste en la SEQ ID N.°: 686 845; 924-95, 1091-1140 y 1396-1466. Más preferiblemente, un péptido según la invención comprende al menos 71, 72, 73, 74, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170 y hasta 175 epítopos de CTL predichos seleccionados del grupo que consiste en la SEQ ID N.°: 80-276, 278-314, 316-429, 432-483, 486-545, 548-636, 638 -685; 846-923, 959-1090 y 1146-1395 y al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 , 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41,42, 43,44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56,57, 58, 59, 60, 61,62, 63, 64, 65, 66, 67, 68 , 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93 , 94, 95 y hasta 96 epítopos de linfocitos Th predichos seleccionados del grupo que consiste en la SEQ ID N.°: 686-845; 924-958, 1091-1140 y 1396-1466. Aún más preferiblemente, un péptido según la invención comprende al menos 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170 y hasta 175 epítopos de CTL predichos seleccionados del grupo que consiste en la SEQ ID N.°: 80-276, 278-314, 316-429, 432-483, 486-545, 548-636, 638-685; 846-923, 959-1090 y 1146-1395 y al menos 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41,42,43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56,57, 58, 59, 60, 61,62, 63, 64, 65, 66, 67,68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92 , 93, 94, 95 y hasta 96 epítopos de linfocitos Th predichos seleccionados del grupo que consiste en la SEQ ID N.°: 686-845; 924-958, 1091-1140 y 1396-1466. Preferiblemente, un péptido según la invención comprende al menos 95 epítopos de CTL predichos como se define en el presente documento y al menos 25 epítopos de linfocitos Th predichos como se define en el presente documento.

[0035] Más preferiblemente, un péptido preferido según la invención comprende al menos 5 epítopos de CTL confirmados y al menos un epítopo de linfocitos Th confirmado; preferiblemente al menos 5 epítopos de CTL confirmados seleccionados del grupo que consiste en la SEQ ID N.°: 80-276, 278-314, 316-429, 432-483, 486 545, 548-636, 638-685; 846-923, 959-1090 y 1146-1395 y al menos un epítopo de linfocitos Th confirmado seleccionado del grupo que consiste en la<s>E<q>ID N.°: 686-845; 924-958, 1091-1140 y 1396-1466. Un péptido más preferido según la invención comprende al menos 15 epítopos de CTL confirmados y al menos un epítopo de linfocitos Th confirmado; preferiblemente al menos 15 epítopos de CTL confirmados seleccionados del grupo que consiste en la SEQ ID N.°: 80-276, 278-314, 316-429, 432-483, 486-545, 548-636, 638-685; 846-923, 959 1090 y 1146-1395 y al menos un epítopo de linfocitos Th confirmado seleccionado del grupo que consiste en la SEQ ID N.°: 686-845; 924-95, 1091-1140 y 1396-1466. Más preferiblemente, un péptido según la invención comprende al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65 o 70 epítopos de CTL confirmados seleccionados del grupo que consiste en la SEQ ID N.°: 80-276, 278 314, 316-429, 432-483, 486-545, 548-636, 638-685; 846-923, 959-1090 y 1146 - 1395 y al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 , 19, 20 epítopos de linfocitos Th confirmados seleccionados del grupo que consiste en la SEQ ID N.°: 686-845; 924-958, 1091-1140 y 1396-1466. Aún más preferiblemente, un péptido según la invención comprende al menos 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90 o 95 epítopos de CTL confirmados seleccionados del grupo que consiste en la SEQ ID N.°: 80 276, 278-314, 316-429, 432-483, 486-545, 548-636, 638-685 ; 846-923, 959-1090 y 1146 - 1395 y al menos 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 , 19, 20 epítopos de linfocitos Th confirmados seleccionados del grupo que consiste en la SEQ ID N.°: 686-845; 924-958, 1091-1140 y 1396-1466. Preferiblemente, un péptido según la invención comprende al menos 15 epítopos de CTL confirmados como se define en el presente documento y al menos 5 epítopos de linfocitos Th confirmados como se define en el presente documento.

[0036] Los epítopos de HLA de clase I en los péptidos según la invención preferiblemente son capaces de presentarse en moléculas de HLA que están codificadas por alelos de HLA que son predominantes en la población de sujetos humanos que se desea tratar. Los epítopos HLA de clase I preferidos en los péptidos según la invención son epítopos capaces de unirse a: HLA-A0101; HLA-A0201; HLA-A0206; HLA-A0301; HLA-A1101; HLA-A2301; HLA-A2402; HLA-A2501; HLA-A2601; HLA-A2902; HLA-A3001; HLA-A3002; HLA-A3101; HLA-A3201; HLA-A3303; HLA-A6801; HLA-A6802; HLA-A7401; HLA-B0702; HLA-B0801; HLA-B1301; HLA-B1302; HLA-B1402; HLA-B1501; HLA-B1502; HLA-B1525; HLA-B1801; HLA-B2702; HLA-B2705; HLA-B3501; HLA-B3503; HLA-B3701; HLA-B3801; HLA-B3901; HLA-B4001; HLA-B4002; HLA-B4402; HLA-B4403; HLA-B4601; HLA-B4801; HLA-B4901; HLA-B5001; HLA-B5101; HLA-B5201; HLA-B5301; HLA-B5501; HLA-B5601; HLA-B5701; HLA-B5801 y HLA-B5802. En una forma de realización preferida, un péptido de la invención cubre al menos el 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % o 100 % de las moléculas de HLA de clase I que están codificadas por alelos de HLA predominantes en la población de sujetos humanos que se desea tratar, donde en el presente documento se entiende que "Cubrir una molécula de HLA de clase I" comprende un epítopo de CTL que muestra afinidad de unión, preferiblemente afinidad de unión intermedia, más preferiblemente afinidad de unión alta, a dicha molécula de HLA de clase I. Preferiblemente, un péptido de la invención cubre al menos el 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % o 100 % del grupo de moléculas de HLA de clase I que consiste en HLA -A0101; HLA-A0201; HLA-A0206; HLA-A0301; HLA-A1101; HLA-A2301; HLA-A2402; HLA-A2501; HLA-A2601; HLA-A2902; HLA-A3001; HLA-A3002; HLA-A3101; HLA-A3201; HLA-A3303; HLA-A6801; HLA-A6802; HLA-A7401; HLA-B0702; HLA-B0801; HLA-B1301; HLA-B1302; HLA-B1402; HLA-B1501; HLA-B1502; HLA-B1525; HLA-B1801; HLA-B2702; HLA-B2705; HLA-B3501; HLA-B3503; HLA-B3701; HLA-B3801; HLA-B3901; HLA-B4001; HLA-B4002; HLA-B4402; HLA-B4403; HLA-B4601; HLA-B4801; HLA-B4901; HLA-B5001; HLA-B5101; HLA-B5201; HLA-B5301; HLA-B5501; HLA-B5601; HLA-B5701; HLA-B5801 yHLA-B5802.

[0037] El genoma del VHB (SEQ ID N.°: 3; véase la Tabla 1) consiste en una molécula de ADN circular parcialmente bicatenaria que tiene cuatro marcos de lectura abiertos (ORF) superpuestos que son responsables de la transcripción y expresión de siete proteínas diferentes de la hepatitis B mediante el uso de múltiples codones de inicio en marco. Las proteínas del VHB son la proteína central y el antígeno e (HBeAg) codificado por el gen C, la polimerasa del VHB codificada por el gen P, las proteínas de superficie viral (pequeña (S), mediana (M) y grande (L)) codificadas por el gen S y la proteína X codificada por el gen X. Hay una capa exterior (o envoltura) compuesta por varias proteínas conocidas colectivamente como HB o proteínas de superficie. Esta capa exterior se denomina frecuentemente capa superficial. La capa superficial exterior rodea una capa proteica interna, compuesta de proteína HBc. Esta capa interna se conoce como partícula central o cápside. Finalmente, la partícula central rodea el ADN viral y la enzima ADN polimerasa.

[0038] La proteína central del VHB es el componente principal de la nucleocápside viral. Las secuencias de aminoácidos de la polimerasa del VHB, la proteína central del VHB, la proteína X del VHB y la proteína de superficie grande del VHB están representadas por las SEQ ID N.°: 1, 4, 45 y 1141 respectivamente (véase la Tabla 1).

[0039] Una secuencia de aminoácidos preferida de una proteína polimerasa del VHB humana es una secuencia que tiene al menos un 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %. 97 %, 98 %, 99 %, 100 % de identidad con la secuencia representada en la SEQ ID N.°: 1; una secuencia codificante preferida es una secuencia que tiene al menos aproximadamente un 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 100 % de identidad con la secuencia representada en la SEQ ID N.°: 2. Una secuencia de aminoácidos preferida de una proteína central del VHB es una secuencia que tiene al menos aproximadamente un 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 100 % de identidad con la secuencia representada en la SEQ ID N.°: 4; una secuencia codificante preferida es una secuencia que tiene al menos aproximadamente un 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 100 % de identidad con la secuencia representada en la SEQ ID N.°: 5. Una secuencia de aminoácidos preferida de una proteína de superficie grande del VHB es una secuencia que tiene al menos aproximadamente un 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 100 % de identidad con la secuencia representada en la SEQ ID N.°: 1141, una secuencia codificante preferida es una secuencia que tiene al menos al menos un 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 100 % de identidad con la secuencia representada en la SEQ ID N.°: 1467.

[0040] La secuencia de aminoácidos de consenso de longitud completa de la proteína X se obtuvo deduciendo la secuencia óptima de las 39 secuencias de aminoácidos de la proteína X del VHB de longitud completa publicadas y revisadas (154 aminoácidos) en la base de datos UniProt (en: www.uniprot.org). Estas 39 secuencias se alinearon primero y, posteriormente, para cada posición de aa se seleccionó el aa que aparecía con más frecuencia para esa posición en la secuencia de consenso. Se incluyeron en el análisis las 39 secuencias con las siguientes entradas: P69713; P03165; P0C686; P69714; Q8JMY5; Q69604; Q05499; 091531; Q9PX75; P20976; P20975; P20977; P24026; Q9PXA2; Q67923; P0C685; P0C678; 093195; Q9E6S8; P12936; Q91C38; Q913A9; Q8JMY3; Q8JN06; Q8JMZ5; Q69607; Q9IBI5; Q80IU5; Q4R1S9; Q4R1S1; Q9YZR6; P0C687; Q9QMI3; P0C681; Q80IU8; Q99HR6; P17102; Q67877; y Q69027 (véase la Tabla 2). Una secuencia de aminoácidos de consenso preferida de una proteína X del VHB humano es una secuencia que tiene al menos aproximadamente un 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %. %, 97 %, 98 %, 99 %, 100 % de identidad con la secuencia representada en la SEQ ID N.°: 45. La secuencia de aminoácidos de consenso puede estar codificada por cualquier secuencia codificante conocida o diseñada; el experto en la técnica sabe diseñar una secuencia codificante a partir de una secuencia de aminoácidos conocida; dicha secuencia codificante puede ser una secuencia optimizada con codones. Los términos "proteína VHB X" y "proteína VHB X de consenso" se utilizan indistintamente en el presente documento.

[0041] El porcentaje de identidad se determina aquí calculando la relación del número de nucleótidos/aminoácidos idénticos en la secuencia dividido por la longitud del total de nucleótidos/aminoácidos de dicha secuencia, menos las longitudes de cualquier espacio. Identidad con una SEQ ID N.° determinada significa identidad basada en la longitud total de dicha secuencia (es decir, en toda su longitud o en su totalidad).

[0042] En el contexto de la presente invención, "un péptido derivado de una proteína del VHB" significa que el péptido comprende al menos 15 y como máximo 100 aminoácidos consecutivos procedentes de la proteína central del VHB, la polimerasa del VHB, la proteína X de consenso del VHB y/o la proteína de superficie grande del VHB. En otras palabras, "un péptido derivado de la proteína polimerasa del VHB" comprende como máximo 100 aminoácidos consecutivos de la SEQ ID N.°: 1, "un péptido derivado de la proteína central del VHB" comprende como máximo 100 aminoácidos consecutivos de la SEQ ID N.°: 4, "un péptido derivado de la proteína X de consenso del VHB" comprende como máximo 100 aminoácidos consecutivos de la SEQ ID N.°: 45 y "un péptido derivado de la proteína de superficie grande de VHB" comprende como máximo 100 aminoácidos consecutivos de la SEQ ID N.°: 1141. Preferiblemente, "un péptido derivado de la proteína polimerasa del VHB" consiste en como máximo 100 aminoácidos consecutivos de la SEQ ID N.°: 1, "un péptido derivado de la proteína central del VHB" consiste en como máximo 100 aminoácidos consecutivos de la SEQ ID N.°: 4, "un péptido derivado de la proteína X de consenso del VHB" consiste en como máximo 100 aminoácidos consecutivos de la SEQ ID N.°: 45 y "un péptido derivado de la proteína de superficie grande del VHB" consiste en como máximo 100 aminoácidos consecutivos ácidos de la SEQ ID N.°: 1141. Por lo tanto, por definición, un péptido según la invención es distinto de una proteína central del VHB, polimerasa del VHB, proteína X del VHB y/o proteína de superficie grande del VHB de longitud completa, ya que todas estas proteínas de longitud completa tienen una longitud de más de 100 aminoácidos. Preferiblemente, el péptido de la presente invención tiene una longitud de aproximadamente 15 a como máximo 40 aminoácidos. Más preferiblemente, la longitud del péptido es de 15 hasta como máximo 40, la longitud indicada en el presente documento, ya que la longitud del péptido es de 15 a 40 aminoácidos, o preferiblemente la longitud del péptido es de 17 a 39, incluso más preferiblemente de 19 a 40 aminoácidos, incluso más preferiblemente de 22 a 40 aminoácidos, aún más preferiblemente de 28 a 40 e incluso más preferiblemente de 30 a 39 aminoácidos. En el contexto de la presente invención, "un péptido que comprende como máximo 40 aminoácidos derivados de una proteína del VHB" significa preferiblemente que el número de aminoácidos consecutivos que se originan a partir de una proteína del VHB, preferiblemente una proteína seleccionada del grupo que consiste en la proteína central del VHB, polimerasa del VHB, proteína de consenso X del VHB y proteína de superficie grande del VHB y presente en un péptido como se define en el presente documento, tiene 40, 39, 38, 37, 36, 35, 34, 33, 32, 31 o 30 aminoácidos o menos. En el contexto de la presente invención, "un péptido que comprende al menos 15 aminoácidos derivados de una proteína del VHB" significa preferiblemente que el número de aminoácidos consecutivos que se originan de una proteína seleccionada del grupo que consiste en proteína central del VHB, polimerasa del VHB, polimerasa del VHB, proteína X de consenso y proteína de superficie grande del VHB y presentes en un péptido como se define en el presente documento, son al menos 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 o 40 aminoácidos. En el contexto de la presente invención, "un péptido que comprende de 15 a 40 aminoácidos derivados de una proteína del VHB" significa preferiblemente que el número de aminoácidos consecutivos que se originan de una proteína seleccionada del grupo que consiste en proteína central del VHB, polimerasa del VHB, polimerasa del VHB, proteína X de consenso y proteína de superficie grande del VHB y presentes en un péptido como se define en el presente documento es de al menos 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 o 40 aminoácidos y no más de 40, 39, 38, 37, 36, 35, 34, 33, 32, 31 o 30.

[0043] Según una forma de realización, un péptido según la invención consiste en cualquiera de las secuencias de aminoácidos contiguas de la proteína central del VHB, la polimerasa del VHB, la proteína X del VHB y/o la proteína de superficie grande del VHB como se define en el presente documento y se indica mediante su<s>E<q>ID N.° representativa, por lo que se entiende que no hay aminoácidos añadidos a ninguno de los extremos de dicho péptido.

[0044] Según otra forma de realización, el péptido según la invención comprende cualquiera de las secuencias de aminoácidos contiguas de la proteína central del VHB, la polimerasa del VHB, la proteína X del VHB y/o la proteína de superficie grande del VHB como se define en el presente documento y se indica mediante su SEq ID N.° representativa y además puede comprender un aminoácido modificado y/o un grupo funcional unido covalentemente tal como un grupo fluorado, un ligando y/o agonista del receptor tipo Toll humano, un conjugado de oligonucleótido, PSA, una cadena de azúcar o glicano, un pam3cys y/o un derivado del mismo, preferiblemente un lipopéptido pam3cys o variante o derivado del mismo, preferiblemente tal como se describe en WO2013051936A1, oligodesoxinucleótidos CpG (CpG-ODN), dinucleótidos cíclicos (CDN), ácido 2-aminoisobutírico (Abu), muramil dipéptido (MDP), un casete de pulso de CD, un péptido derivado de la toxina tetánica.

[0045] En una forma de realización, el péptido de la invención comprende o consiste en una secuencia que no es de origen natural como resultado de la síntesis de longitudes no naturales o como resultado de comprender aminoácidos adicionales que no se originan a partir de una proteína central del VHB, polimerasa del VHB, proteína X del VHB y/o proteína de superficie grande del VHB o como resultado de comprender secuencias de aminoácidos no contiguas de una proteína central del VHB, polimerasa del VHB, proteína X del VHB y/o proteína de superficie grande del VHB, y/o como resultado de comprender un aminoácido modificado y/o un aminoácido no natural y/o un grupo funcional unido covalentemente, tal como un grupo fluorado, un grupo fluorcarbonado, un ligando y/o agonista del receptor de tipo Toll humano, un conjugado de oligonucleótido, PSA, una cadena de azúcar o glicano, un pam3cys y/o un derivado del mismo, preferiblemente tal como se describe en WO2013051936A1, oligodesoxinucleótidos CpG (CpG-ODN), dinucleótidos cíclicos (CDN), un casete de pulso de CD, un péptido derivado de la toxina tetánica, un péptido derivado de HMGB1 humana; ya sea dentro del péptido o añadido al péptido, como se ha indicado anteriormente. El péptido de la invención puede comprender ácido 2-aminoisobutírico (Abu, un isostereómero de la cisteína). Una cisteína del péptido de la invención puede sustituirse por Abu. Dentro de la presente invención se incluye un péptido de SEQ ID N.°: 77, en el que la cisteína N-terminal se ha reemplazado por Abu.

[0046] Preferiblemente, un péptido de la invención es un péptido aislado, donde "aislado" no refleja el grado en que el péptido está purificado, sino que indica que el péptido se ha extraído de su medio natural (es decir, que se ha sometido a manipulación humana), y puede ser un péptido producido de forma recombinante o un péptido producido sintéticamente.

[0047] Preferiblemente, la invención se refiere a un péptido que puede usarse de manera eficaz en la prevención, eliminación parcial y/o tratamiento o eliminación total de una enfermedad o afección relacionada con el VHB en un sujeto, preferiblemente detectable mediante:

- una activación o una inducción del sistema inmunitario y/o un aumento de los linfocitos T CD4+ y/o CD8+ activados específicos del VHB en sangre periférica o un aumento de las citocinas producidas por estos linfocitos T después de al menos una semana de tratamiento; y/o

- una inhibición de la proliferación de la infección por VHB o una disminución detectable de células infectadas por VHB o una disminución de la viabilidad celular de células infectadas por VHB; y/o - una inducción o una mayor inducción de la muerte de células infectadas por VHB; y/o

- una inhibición o prevención del aumento de células infectadas por VHB.

[0048] En todas las formas de realización de la presente invención, un sujeto es preferiblemente un mamífero, más preferiblemente un ser humano. Un sujeto puede ser un modelo animal, preferiblemente un modelo de mamífero no humano con moléculas de HLA de clase I y clase II humanizadas, o un órgano de mamífero, preferiblemente humano, tal como un hígado.

[0049] En todas las formas de realización de la presente invención, el término "enfermedad o afección relacionada con el VHB" se define preferiblemente como infección aguda por VHB, infección crónica por VHB y otras afecciones en las que el virus de la hepatitis se encuentra en la sangre o fluidos corporales que contienen sangre de un sujeto, tales como como cirrosis hepática y cáncer de hígado u, opcionalmente, de un sujeto asintomático, que se caracteriza por la presencia del virus en el cuerpo de dicho sujeto.

[0050] En el contexto de la invención, un paciente puede sobrevivir y puede considerarse libre de la enfermedad como consecuencia del tratamiento según la invención. Alternativamente, la enfermedad o afección puede haberse detenido o retrocedido (es decir, la infección ha desaparecido total o parcialmente). Un aumento significativo de linfocitos CD4+ o CD8+ activados específicos del<v>H<b>en sangre periférica al menos una semana después de la vacunación es preferiblemente un aumento de al menos un 5 %, 10 %, 20 %, 30 % o más. Una inhibición de la proliferación de células infectadas por VHB es preferiblemente de al menos un 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %. %, 70 %, 75 % de inhibición o más. Una inducción de muerte celular infectada por VHB puede ser al menos de un 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 6 %, 7 %, 8 %, 9 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %. o más. La infección por VHB puede inhibirse al menos en un 5 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 % o 75 % de inducción, o más. Las células infectadas por el VHB pueden reducirse al menos en un 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 98 % o 100 %.

[0051] En cada forma de realización, dentro de este u otros aspectos divulgados en el presente documento, donde se cuantifica el efecto de un péptido según la invención, una composición según la invención, un polinucleótido según la invención, un vector viral que comprende un polinucleótido según la invención y/o una célula según la invención y/o una célula obtenida u obtenible mediante un método según la invención, el ensayo puede realizarse por comparación con un sujeto no tratado o con el mismo sujeto antes del tratamiento.

[0052] La infección por VHB aguda y crónica se puede tratar usando la presente invención. Un péptido según la invención que comprende epítopos que deben presentarse a los receptores de linfocitos T citotóxicos CD8+ y/o de linfocitos T colaboradores CD4+ cumple preferiblemente una serie de requisitos estructurales tal como se define en el presente documento. Los experimentosin vitroyex vivocon linfocitos T se usan preferiblemente para confirmar la capacidad de los péptidos según la invención para inducir respuestas sustanciales de linfocitos T colaboradores CD4+ y citotóxicos CD8+. Los péptidos de la presente invención proporcionan, por lo tanto, una mejora marcada en la selección de péptidos relativamente cortos que pueden sintetizarse químicamente, que comprenden los epítopos de linfocitos T presentados por HLA de clase I y/o de clase II más potentes y más ampliamente aplicables derivados del VHB.

[0053] En una forma de realización, un péptido es distinto de una secuencia contigua de aminoácidos de la proteína central del VHB, la polimerasa del VHB, la proteína X del VHB y/o la proteína de superficie grande del VHB.

[0054] Un péptido según la invención que comprende un epítopo de linfocitos T de la proteína central del VHB, la polimerasa del VHB, la proteína X del VHB y/o la proteína de superficie grande del VHB, puede modificarse mediante deleción o sustitución de uno o más aminoácidos, por extensión en el extremo N terminal y/o extremo C terminal con aminoácidos o grupos funcionales adicionales, que pueden mejorar la biodisponibilidad, dirigiéndose a los linfocitos T, o comprender o liberar sustancias inmunomoduladoras que proporcionan funciones adyuvantes o (co)estimuladoras. Los aminoácidos adicionales opcionales en el extremo N y/o C terminal preferiblemente no están presentes en las posiciones correspondientes en la secuencia de aminoácidos nativa de la proteína central del v Hb , la polimerasa del VHB, la proteína X del VHB y/o la proteína de superficie grande del VHB.

[0055] Un péptido según la invención que comprende un epítopo de linfocitos T se puede obtener mediante síntesis química y posterior purificación según métodos conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, Atherton et al., 1989; Barany et al., 1979; Fields et al., 1997). Un péptido según la invención preferiblemente es soluble en soluciones acuosas fisiológicamente aceptables (por ejemplo, PBS) que comprenden no más de 35, 20, 10, 5 o 0 % de DMSO. En tal solución, el péptido según la invención es preferiblemente soluble en una concentración de al menos 0,5, 1, 2, 4 u 8 mg de péptido por ml. Más preferiblemente, una mezcla de más de un péptido diferente según la invención es soluble a una concentración de al menos 0,5, 1, 2, 4 u 8 mg de péptido por ml en dichas soluciones.

[0056] Los péptidos según la invención pueden sintetizarse con facilidad y son lo suficientemente grandes como para ser absorbidos por células presentadoras de antígenos profesionales, en particular células dendríticas (CD), procesadas por el proteasoma y/o el sistema de degradación endosómica/lisosomal y de procesamiento de antígenos y preferiblemente tienen una longitud suficiente para contener al menos 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 73, 75, 80, 85, 90, 95, 100 , 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170 y hasta preferiblemente 175 epítopos de CTL y/o al menos 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 y hasta preferiblemente 96 epítopos de linfocitos Th como se define en el presente documento. Opcionalmente, un péptido según la invención puede comprender extensiones N- o C-terminales, que pueden ser aminoácidos, aminoácidos modificados u otros grupos funcionales que pueden, por ejemplo, mejorar la biodisponibilidad, la absorción celular, el procesamiento y/o la solubilidad.

[0057] Preferiblemente, un péptido según la invención es un péptido que comprende un péptido con una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en:

- un fragmento de 15 a 39 aminoácidos de la SEQ ID N.°: 55, preferiblemente aminoácidos contiguos, - un fragmento de 15 a 38 aminoácidos de la SEQ ID N.°: 60, preferiblemente aminoácidos contiguos, - un fragmento de 15 a 34 aminoácidos de la SEQ ID N.°: 63, preferiblemente aminoácidos contiguos, - un fragmento de 15 a 36 aminoácidos de la SEQ ID N.°: 64, preferiblemente aminoácidos contiguos, - un fragmento de 15 a 39 aminoácidos de la SEQ ID N.°: 68, preferiblemente aminoácidos contiguos, - un fragmento de 15 a 38 aminoácidos de la SEQ ID N.°: 71, preferiblemente aminoácidos contiguos, - un fragmento de 15 a 35 aminoácidos de la SEQ ID N.°: 74, preferiblemente aminoácidos contiguos, - un fragmento de 15 a 34 aminoácidos de la SEQ ID N.°: 75, preferiblemente aminoácidos contiguos, - un fragmento de 15 a 33 aminoácidos de la SEQ ID N.°: 76, preferiblemente aminoácidos contiguos, - un fragmento de 15 a 35 aminoácidos de la SEQ ID N.°: 77, preferiblemente aminoácidos contiguos, - un fragmento de 15 a 31 aminoácidos de la SEQ ID N.°: 1469, preferiblemente aminoácidos contiguos, y;

en donde la longitud de la secuencia de aminoácidos preferiblemente contiguos es preferiblemente de al menos 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32 o 33 aminoácidos y/o preferiblemente de no más de 40, 39, 38, 37, 36, 35, 34, 33, 32, 31, 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15 aminoácidos, de la manera más preferible una longitud de 30-39 aminoácidos.

[0058] En un segundo aspecto, la invención proporciona un polinucleótido que codifica un péptido según la invención, preferiblemente un péptido como se ha definido antes en el presente documento. Un polinucleótido puede ser cualquier polinucleótido que comprenda, por ejemplo, ARN, ADN y/o ADNc; un polinucleótido puede ser monocatenario o bicatenario y puede comprender análogos de nucleótidos y/o equivalentes de nucleótidos tales como un análogo de morfolinonucleótido y un ácido peptidonucleico (APN). Un polinucleótido puede optimizarse con codones para un huésped de elección para facilitar la expresión de la materia codificada.

[0059] El polinucleótido según la invención no codifica una proteína central del VHB de longitud completa de tipo salvaje, polimerasa del VHB, proteína X del VHB y/o proteína de superficie grande del VHB, sino que codifica un péptido según la invención como tal, o flanqueado por una secuencia de aminoácidos que no son contiguos a una proteína central del VHB de tipo salvaje, polimerasa del VHB, proteína X del VHB y/o proteína de superficie grande del VHB. Dichos aminoácidos flanqueantes pueden ser de proteínas distintas a un VHB de tipo salvaje y/o pueden ser de otras ubicaciones dentro de una proteína central de VHB de tipo salvaje, polimerasa de VHB, proteína X de VHB y/o proteína de superficie grande de VHB que no son contiguas con el péptido al que flanquean. Preferiblemente, el polinucleótido codifica dos o más péptidos según la invención dispuestos como cuentas en una cuerda, por lo que los péptidos según la invención (las cuentas) están unidos directamente entre sí y/o están unidos a través de secuencias enlazadoras que son de proteínas distintas de una proteína central del VHB de tipo salvaje, polimerasa del VHB, proteína X del VHB y/o proteína de superficie grande del VHB, y/o de otras ubicaciones dentro de una proteína central del VHB de tipo salvaje, polimerasa del VHB, proteína X del VHB y/o proteína de superficie grande del VHB, que no son contiguas al péptido al que flanquean. Las secuencias de aminoácidos que flanquean o unen los péptidos pueden comprender sitios de escisión proteolítica. Se puede aplicar un polinucleótido según la invención para administrar un péptido según la invención de diversas maneras. Un polinucleótido según la invención puede, por ejemplo, usarse en la producción de proteína o péptido recombinante en una célula huésped adecuada (por ejemplo, una célula huésped bacteriana tal comoE. coli,una célula huésped de levadura adecuada tal como S.cerevisiae,un hongo filamentoso adecuado tal como unAspergilluso una célula huésped de mamífero) a partir de la cual se puede purificar la proteína o péptido recombinante. Alternativamente, el polinucleótido puede unirse operativamente a secuencias reguladoras de la expresión (promotores y similares) e incorporarse en una construcción de expresión para células humanas. Estas células (autólogas) pueden transfectarse o transducirse exvivopara ser (re)administradas a un sujeto que lo necesite. Alternativamente, dicha construcción de expresión según la invención puede incorporarse en un vector de terapia génica adecuado. Los vectores virales (basados en un virus defectuoso) son agentes más eficaces para la transferencia de genes en comparación con los agentes no virales. Las construcciones de expresión viral adecuadas incluyen, por ejemplo, vectores que se basan en adenovirus, virus adenoasociados (AAV), retrovirus o Vaccinia Ankara modificado (MVA). El polinucleótido según la invención también puede estar unido operativamente a una secuencia que codifica y un adyuvante tal como un ligando del receptor tipo Toll (TLR), un ligando NOD o un ligando RIG-I.

[0060] En un sexto aspecto, la presente invención proporciona una composición útil para la prevención y/o el tratamiento de una enfermedad o afección relacionada con el VHB, que comprende un péptido según la invención y/o un polinucleótido según la invención y/o una célula, preferiblemente un linfocito T, según la invención y/o una célula, preferiblemente un linfocito T, obtenida mediante el método según el cuarto aspecto de la invención y un vehículo aceptable desde el punto de vista farmacéutico.

[0061] Cuando comprende un péptido según la invención, la composición según la invención comprende preferiblemente al menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32 y hasta 33 péptidos diferentes según la invención. Preferiblemente, una composición según la invención comprende un péptido según la invención como se define en el primer aspecto de la invención. En una forma de realización preferida, una composición de la invención comprende una combinación de péptidos en la que dicha combinación de péptidos cubre al menos el 70 %, 80 %, 90 %, 92 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % de las moléculas de HLA de clase I que están codificadas por alelos HLA predominantes en la población de sujetos humanos que se desea tratar como se ha definido antes en el presente documento.

[0062] Cuando comprende un polinucleótido según la presente invención, la composición según la invención comprende preferiblemente al menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32 y hasta 33 polinucleótidos diferentes según la invención. Preferiblemente, una composición según la invención comprende un polinucleótido según la invención como se define en el segundo aspecto de la invención.

[0063] En una forma de realización preferida, la composición de la invención comprende al menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32 y hasta 33 péptidos diferentes de los péptidos que consisten en o que comprenden un péptido seleccionado del grupo que consiste en la SEQ ID N.°: 51-79, 1142-1145 y 1468-1471, más preferiblemente seleccionado del grupo que consiste en la SEQ ID N.°: 51, 55, 60, 63, 64, 68, 71, 74, 75, 76, 77, 1142 y 1469, más preferiblemente seleccionado del grupo que consiste en la SEQ ID N.°: 51, 55, 60, 63, 64, 68, 71, 74, 75, 77, 1142 y 1469, incluso más preferiblemente seleccionado del grupo que consiste en la SEQ ID N.°: 55,60, 63, 64, 68, 71, 74, 75, 76, 77 y 1469, incluso más preferiblemente seleccionado del grupo que consiste en la SEQ ID N.°: 55, 60, 63, 64, 68, 71, 74, 75, 77 y 1469, incluso más preferiblemente seleccionado del grupo que consiste en la SEQ ID N.°: 60, 63, 71, 74, 75 y 1469, de la manera más preferible seleccionado del grupo de la SEQ ID N.°: 75, 1469 y 63. Se prefiere aún más una composición que comprende al menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 , 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32 y hasta 33 péptidos diferentes de los péptidos que consisten en o que comprenden un péptido seleccionado del grupo que consiste en la SEQ ID N.°: 51,60, 63, 64, 68, 71, 74-77, más preferiblemente seleccionado del grupo que consiste en la SEQ ID N.°: 63, 71 y 75.

[0064] En una forma de realización preferida, la composición de la invención comprende al menos un péptido que comprende o consiste en un péptido de la SEQ ID N.°: 63 y un péptido que comprende o consiste en un péptido de la SEQ ID N.°: 1143.

[0065] También se prefiere una composición que comprende al menos un péptido que comprende o consiste en un péptido de la SEQ ID N.°: 63 y un péptido que comprende o consiste en un péptido de la SEQ ID N.°: 75.

[0066] También se prefiere una composición que comprende al menos un péptido que comprende o consiste en un péptido de la SEQ ID N.°: 1143 y un péptido que comprende o consiste en un péptido de la SEQ ID N.°: 75.

[0067] También se prefiere una composición que comprende al menos un péptido que comprende o consiste en un péptido de la SEQ ID N.°: 71 y un péptido que comprende o consiste en un péptido de la SEQ ID N.°: 75.

[0068] También se prefiere una composición que comprende al menos un péptido que comprende o consiste en un péptido de la SEQ ID N.°: 71 y un péptido que comprende o consiste en un péptido de la SEQ ID N.°: 63.

[0069] También se prefiere una composición que comprende al menos un péptido que comprende o consiste en un péptido de la SEQ ID N.°: 1144 y un péptido que comprende o consiste en un péptido de la SEQ ID N.°: 63.

[0070] También se prefiere una composición que comprende al menos un péptido que comprende o consiste en un péptido de la SEQ ID N.°: 1144 y un péptido que comprende o consiste en un péptido de la SEQ ID N.°: 75.

[0071] También se prefiere una composición que comprende al menos un péptido que comprende o consiste en un péptido de la SEQ ID N.°: 1144 y un péptido que comprende o consiste en un péptido de la SEQ ID N.°: 1143.

[0072] También se prefiere una composición que comprende al menos un péptido que comprende o consiste en un péptido de la SEQ ID N.°: 63, un péptido que comprende o consiste en un péptido de la SEQ ID N.°: 1143, y un péptido que comprende o consiste en un péptido de la SEQ ID N.°: 75.

[0073] También se prefiere una composición que comprende al menos un péptido que comprende o consiste en un péptido de la SEQ ID N.°: 63, un péptido que comprende o consiste en un péptido de la SEQ ID N.°: 1143, un péptido que comprende o consiste en un péptido de la SEQ ID N.°: 75, y un péptido que comprende o consiste en un péptido de la SEQ ID N.°: 1144.

[0074] También se prefiere una composición que comprende al menos un péptido que comprende o consiste en un péptido de la SEQ ID N.°: 75, y un péptido que comprende o consiste en un péptido de la SEQ ID N.°: 1469. También se prefiere una composición que comprende al menos al menos un péptido que comprende o consiste en un péptido de la SEQ ID N.°: 63, y un péptido que comprende o consiste en un péptido de la SEQ ID N.°: 1469.

[0075] También se prefiere una composición que comprende al menos un péptido que comprende o consiste en un péptido de la SEQ ID N.°: 75, un péptido que comprende o consiste en un péptido de la SEQ ID N.°: 1469, y un péptido que comprende o consiste en un péptido de la SEQ ID N.°: 63. Preferiblemente, dicha composición comprende además un péptido que comprende o consiste en un péptido de la SEQ ID N.°: 60 y/o que comprende o consiste en un péptido de la SEQ ID N.°: 71, y/o que comprende o consiste en un péptido de la SEQ ID N.°: 74.

[0076] Una composición preferida de la invención comprende un péptido que comprende o consiste en un péptido de la s Eq ID N.°: 75, un péptido que comprende o consiste en un péptido de la SEQ ID N.°: 63, y un péptido que comprende o consiste en un péptido de la SEQ ID N.°: 1469

[0077] Una composición preferida de la invención comprende un péptido que comprende o consiste en un péptido de la SEQ ID N.°: 75, un péptido que comprende o consiste en un péptido de la SEQ ID N.°: 63, y un péptido que comprende o consiste en un péptido de la SEQ ID N.°: 71.

[0078] Un vehículo aceptable desde el punto de vista farmacéutico puede ser cualquier vehículo conocido por el experto en la técnica, por ejemplo, soluciones acuosas con pH regulado con fuerza iónica fisiológica y/u osmolaridad (como, por ejemplo, PBS).

[0079] Preferiblemente, una composición según la presente invención comprende además al menos un adyuvante. Dicho adyuvante puede ser cualquier adyuvante conocido por los expertos en la técnica. Los adyuvantes preferidos se definen más adelante en el presente documento.

[0080] Un uso preferido de un péptido, polinucleótido o composición según la invención es el uso como medicamento. Un uso específico preferido de un péptido, polinucleótido o composición según la invención es para el tratamiento y/o prevención de una enfermedad o afección relacionada con el VHB. Por consiguiente, la invención proporciona el uso de un péptido, polinucleótido o composición según la invención para la fabricación de un medicamento para el tratamiento y/o prevención de una enfermedad relacionada con el VHB.

[0081] La divulgación proporciona además un método para la prevención y/o el tratamiento de una enfermedad o afección relacionada con el VHB que comprende administrar a un sujeto una cantidad eficaz de un péptido, polinucleótido o composición según la invención.

[0082] La formulación de medicamentos, las formas de administración y el uso de excipientes aceptables desde el punto de vista farmacéutico son conocidos y habituales en la técnica y, por ejemplo, se describen en Remington; The Science and Practice of Pharmacy 21a Edición 2005, University of Sciences in Philadelphia. Las composiciones farmacéuticas y los medicamentos según la invención se formulan preferiblemente para que sean adecuados para la administración intravenosa, subcutánea o intramuscular, aunque se pueden prever otras vías de administración, tales como la administración mucosa o la administración intradérmica y/o intracutánea, por ejemplo, mediante administración intradérmica y/o intracutánea, por ejemplo, por inyección. En este caso, se prefiere la administración intradérmica. Las ventajas y/o formas de realización preferidas que están asociadas específicamente con la administración intradérmica se definen más adelante en una sección aparte titulada "administración intradérmica".

[0083] Además, la presente invención abarca que la administración de un péptido, un polinucleótido o una composición según la invención con un excipiente farmacéutico apropiado tal como un adyuvante y/o un vehículo se pueda llevar a cabo como una administración única. Alternativamente, la administración puede repetirse si es necesario y/o pueden administrarse secuencialmente distintos péptidos, polinucleótidos y/o composiciones según la invención con excipientes farmacéuticos apropiados tales como adyuvantes y/o vehículos.

[0084] El péptido, polinucleótido o composición según la invención (también denominados medicamentos según la invención) puede comprender preferiblemente al menos un compuesto o adyuvante que estimule la respuesta inmunitaria. Ventajosamente, los medicamentos según la invención pueden contener además uno o más adyuvantes sintéticos. Dicho adyuvante puede mezclarse con el medicamento según la invención o puede administrarse por separado al sujeto, mamífero o humano al que se va a tratar. Se prefieren particularmente aquellos adyuvantes que se sabe que actúan a través de receptores de tipo Toll y/o a través de una proteína RIG-I (Gen-1 inducible por ácido retinoico) y/o a través de un receptor de endotelina. Los compuestos inmunomodificadores que son capaces de activar el sistema inmunitario innato se pueden activar particularmente bien a través de receptores de tipo Toll (TLR), incluidos los TLR 1 - 10. Los compuestos capaces de activar receptores TLR y sus modificaciones y derivados están ampliamente documentados en la técnica. TLR1 puede activarse mediante lipoproteínas bacterianas y sus formas acetiladas, TLR2 puede activarse además mediante glicolípidos bacterianos grampositivos, LPS, LPA, LTA, fimbrias, proteínas de la membrana externa, proteínas de choque térmico de bacterias o del huésped y lipoarabinomananos de micobacterias. TLR3 puede ser activado por ARNbc, en particular de origen viral, o por el compuesto químico poli(I:C). TLR4 puede ser activado por LPS gramnegativos, LTA, proteínas de choque térmico del huésped o de origen bacteriano, proteínas de la cubierta o envoltura viral, taxol o derivados de los mismos, hialuronano que contiene oligosacáridos y fibronectinas. TLR5 puede ser activado por flagelos bacterianos o flagelina. TLR6 puede ser activado por lipoproteínas de micobacterias y factor soluble sensible al calor de Streptococcus del grupo B (GBS-F) o modulinas de Staphylococcus. TLR7 puede ser activado por imidazoquinolinas, como imiquimod, resiquimod y derivados de imiquimod o resiquimod. TLR9 puede activarse mediante ADN CpG no metilado o complejos de cromatina-IgG.

En particular, TLR3, TLR7 y TLR9 desempeñan un papel importante en la mediación de una respuesta inmunitaria innata contra infecciones virales, y los compuestos capaces de activar estos receptores se prefieren particularmente para su uso en los métodos de tratamiento y en las composiciones o medicamentos según la invención. Los adyuvantes particularmente preferidos comprenden, entre otros, compuestos producidos sintéticamente que comprenden ARNbc, poli(I:C), ADN CpG no metilado que activa los receptores TLR3 y TLR9, IC31, un agonista de TLR 9, IMSAVAC, un agonista de TLR 4, Montanide ISA. -51, Montanide ISA 720 (un adyuvante producido por Seppic 7, Francia). Se sabe que la proteína RIG-I es activada por ARNbc al igual que TLR3 (Kato et al, 2005). Un ligando de TLR particularmente preferido es un pam3cys y/o un derivado de este, preferiblemente un lipopéptido pam3cys o una variante o derivado de este, preferiblemente tal como se describe en WO2013051936A1. Otros adyuvantes preferidos son dinucleótidos cíclicos (CDN), muramil dipéptido (MDP) y poli-ICLC. En una forma de realización preferida, los adyuvantes de la invención son adyuvantes de origen no natural tales como el derivado lipopéptido pam3cys como se describe en WO2013051936A1, Poly-ICLC, imidazoquinolina tal como imiquimod, resiquimod o derivados de los mismos, oligodesoxinucleótidos CpG (CpG-ODN) que tienen una secuencia no natural y adyuvantes basados en péptidos, tales como muramil dipéptido (MDP) o péptido toxoide tetánico, que comprende aminoácidos que no son de origen natural.

[0085] En otra forma de realización preferida, los compuestos adyuvantes sintéticos están unidos físicamente a los péptidos de la invención. La unión física de adyuvantes y compuestos coestimuladores o grupos funcionales al epítopo de HLA de clase I y HLA de clase II que comprende péptidos proporciona una respuesta inmunitaria mejorada al dirigirse mejor a las células presentadoras de antígenos, en particular a las células dendríticas, que internalizan, metabolizan y presentan el antígeno y al estimular simultáneamente tales células para regular positivamente la expresión de una variedad de moléculas coestimuladoras, convirtiéndose así en células inductoras y potenciadoras de respuesta de linfocitos T eficientes. Otro compuesto modificador inmunitario preferido es un inhibidor de un receptor de endotelina como BQ-788 (Buckanovich RJ et al., 2008; Ishikawa K, 1994). BQ-788 es N-cis-2,6-dimetilpiperidinocarbonil-L-gamma-metilleucil-D-1-metoxicarboniltriptofanil-D-norleucina. Sin embargo, cualquier derivado de BQ-788 o compuesto de BQ-788 modificado también está incluido dentro del alcance de esta invención. Otro compuesto o adyuvante estimulante de la respuesta inmunitaria preferido es el interferón alfa (IFNa), más preferiblemente el interferón alfa pegilado, que puede mezclarse con el medicamento según la invención, o puede administrarse por separado al sujeto como agente inmunomodulador. Se debe interpretar en el presente documento que, cuando se mezcla un compuesto estimulante de la respuesta inmunitaria al medicamento según la invención, se representa como un adyuvante; cuando se administra por separado, se describe como un agente de inmunomodulación, o un inmunomodulador, términos que se usan indistintamente en este documento. Además, se prefiere el uso de moléculas (co)estimuladoras de células presentadoras de antígenos, como se establece en WO99/61065 y en WO03/084999, en combinación con los péptidos y composiciones de la invención. En particular, el uso de ligandos 4-1BB y/o CD40, anticuerpos agonistas, ligandos OX40, ligandos CD27 o fragmentos funcionales y derivados de los mismos, así como compuestos sintéticos con actividad agonista similar, se administra preferiblemente por separado o en combinación con los péptidos de la invención a los sujetos que se desea tratar para estimular aún más la organización de una respuesta inmunitaria óptima en el sujeto.

[0086] Además, una forma de realización preferida comprende la administración de los medicamentos según la invención, con o sin estimulantes inmunitarios adicionales tales como ligandos TLR y/o anticuerpos anti CD40/anti-4-1BB/anti-OX-40 o anti-CD27 en un vehículo de liberación lenta, como aceite mineral (por ejemplo, Montanide ISA 51) o PLGA. Alternativamente, el medicamento según la invención se puede administrar por vía intradérmica, por ejemplo, mediante inyección, con o sin inmunoestimulantes (coadyuvantes y/o inmunomoduladores). Preferiblemente, para la administración intradérmica, los medicamentos según la invención se administran en una composición que consiste en los medicamentos y uno o más vehículos inmunológicamente inertes y aceptables desde el punto de vista farmacéutico, por ejemplo, soluciones acuosas con pH regulado con fuerza iónica fisiológica y/u osmolaridad (como, por ejemplo, PBS).

[0087] En una forma de realización preferida, un medicamento según la invención como se define en el presente documento se formula para que sea adecuado para la administración o aplicación intradérmica. La vía intradérmica es conocida por los expertos. En el contexto de la invención, intradérmico es sinónimo de intradérmico y es distinto de subcutáneo. La aplicación más superficial de una sustancia es epicutánea (en la piel), luego vendría una aplicación intradérmica (en la piel), luego una aplicación subcutánea (en los tejidos justo debajo de la piel), luego una aplicación intramuscular (en el cuerpo del músculo). La aplicación intradérmica generalmente se realiza mediante inyección. Se puede hacer una inyección intradérmica de una sustancia para probar una posible reacción, alergia y/o inmunidad celular, pero también se puede hacer para provocar una respuesta inmunitaria de anticuerpos o linfocitos T específicos. La aplicación subcutánea también se suele hacer por inyección: se inyecta una aguja en los tejidos debajo de la piel.

[0088] La ventaja de la administración intradérmica es que el procedimiento de formulación puede simplificarse y hacerse más robusto. Además, se ha demostrado repetidamente que la administración intradérmica de vacunas permite un ahorro significativo de la dosis para provocar respuestas de anticuerpos o linfocitos T inducidas por la vacuna en comparación con métodos de administración convencionales como la administración intramuscular y subcutánea. Este efecto se atribuye a la red relativamente densa de células inmunitarias presentes en la piel.

Esto también se demostró con los péptidos largos sintéticos del HPV16 en un estudio en humanos publicado por Van der Burg et al. (2007). En este estudio se demostró que la inyección intradérmica de grupos de péptidos largos sintéticos del VPH16 es segura y da como resultado la migración de linfocitos T específicos del VPH16 hacia la piel, así como un aumento en el número de linfocitos T específicos del VPH16 que circulan en la sangre.

[0089] En una forma de realización, un medicamento según la invención no comprende ningún adyuvante tal como Montanide ISA-51, y específicamente Montanide ISA-51. Esto significa que la formulación del medicamento es más sencilla: preferiblemente, tampoco está presente una emulsión a base de aceite y agua en un medicamento según la invención. Por consiguiente, un medicamento según la invención preferiblemente no comprende un adyuvante tal como Montanide ISA-51 y específicamente Montanide ISA-51 y/o no comprende una emulsión basada en aceite en agua; más preferiblemente, un medicamento según la invención no comprende ninguno de estos como adyuvante y, aún más preferiblemente, no comprende ningún adyuvante. Por lo tanto, en una forma de realización, el medicamento según la invención es una solución acuosa, preferiblemente con pH regulado, preferiblemente con osmolalidad y/o fuerza iónica fisiológica, tal como, por ejemplo, PBS (solución salina tamponada con fosfato) o agua para inyección (WFI), que comprende o consiste en uno o más medicamentos como se ha definido anteriormente en el presente documento. Los expertos saben cómo preparar dicha solución.

[0090] Un medicamento según la invención tiene otra ventaja, que es que, incluso al administrar por vía intradérmica pequeñas cantidades de un medicamento, preferiblemente un péptido como se ha definido anteriormente en este documento, se puede lograr un efecto inmunogénico. La cantidad utilizada de cada péptido oscila preferiblemente entre 1 y 1000 pg, más preferiblemente entre 5 y 500 pg, incluso más preferiblemente entre 10 y 100 pg.

[0091] En una forma de realización, el medicamento según la invención comprende un péptido como se ha definido anteriormente en el presente documento y al menos un adyuvante, donde dicho adyuvante no está formulado en una emulsión a base de aceite en agua y/o no es de un tipo de emulsión de aceite en agua como se ha definido anteriormente en este documento. Este tipo de medicamento según la invención se puede administrar en una sola administración. Alternativamente, la administración de un péptido como se ha definido anteriormente en el presente documento y/o un adyuvante puede repetirse si es necesario y/o pueden administrarse secuencialmente distintos péptidos y/o distintos adyuvantes. La presente invención abarca además que un péptido según la invención se administre por vía intradérmica, mientras que un adyuvante como se define en el presente documento se administre secuencialmente. El adyuvante puede administrarse por vía intradérmica. Sin embargo, se puede utilizar cualquier otra forma de administración para el adyuvante. La administración intradérmica de un péptido puede ser atractiva, ya que, típicamente y dependiendo de la enfermedad, la inyección de la vacuna se realiza en el sitio de la enfermedad o lo más cerca posible del mismo, lo que da como resultado la activación local del ganglio linfático que drena la enfermedad, lo que resulta en una activación local más fuerte del sistema inmunitario. Un compuesto estimulante de la respuesta inmunitaria (inmunomodulador) o adyuvante preferido para la administración intradérmica es el interferón alfa (IFNa), más preferiblemente el interferón alfa pegilado, que puede mezclarse con el medicamento según la invención, o puede administrarse por separado, por ejemplo, mediante inyección subcutánea, al sujeto. Cuando se administra por separado, el interferón alfa también se administra preferiblemente por vía subcutánea y se administra preferiblemente a una dosis de 1 microgramo/kilogramo de peso corporal dentro de 10 cm de proximidad al sitio donde se administra el medicamento según la invención, tal como se describe en Zeestraten et al, 2013.

[0092] Otra ventaja típica de los medicamentos según la invención es que se pueden utilizar cantidades relativamente bajas de péptidos, en una sola inyección, en una formulación sencilla y sin ningún adyuvante conocido que produzca efectos secundarios no deseados como Montanide ISA-51.

[0093] El medicamento para la administración intradérmica puede ser cualquier medicamento según la invención como se define en el presente documento. Un medicamento según la invención utilizado para la administración subcutánea puede ser el mismo que el utilizado para la administración intradérmica y, por tanto, puede ser cualquier medicamento según la invención tal como se define en el presente documento. Los expertos saben cómo formular un medicamento adecuado para la administración subcutánea.

[0094] Preferiblemente, un medicamento según la invención para la administración subcutánea comprende un péptido como ya se ha definido en el presente documento en combinación con un adyuvante. En el presente documento ya se han mencionado adyuvantes o moduladores inmunitarios preferidos. Otros adyuvantes preferidos son del tipo de emulsiones de aceite en agua, tales como el adyuvante incompleto de Freund o IF A, Montanide ISA-51 o Montanide ISA 720 (Seppic Francia). En una forma de realización preferida adicional, un medicamento según la invención adecuado para la administración subcutánea comprende uno o más péptidos según la invención, un adyuvante o modulador inmunológico como se ha definido anteriormente en el presente documento y un vehículo inerte y/o excipientes aceptables desde el punto de vista farmacéutico, todos como se ha definido anteriormente en el presente documento. La formulación de medicamentos y el uso de excipientes aceptables desde el punto de vista farmacéutico son conocidos y habituales en la técnica y, por ejemplo, se describen en Remington; The Science and Practice of Pharmacy, 21.a edición, 2005, University of Sciences in Philadelphia. Un compuesto estimulante de la respuesta inmunitaria o adyuvante preferido para la administración subcutánea es el interferón alfa (IFNa), más preferiblemente el interferón alfa pegilado, que puede mezclarse con el medicamento según la invención, o puede administrarse por separado al sujeto. Cuando se administra por separado, el interferón alfa también se administra preferiblemente por vía subcutánea y se administra preferiblemente a una dosis de 1 microgramo/kilogramo de peso corporal dentro de 10 cm de proximidad al sitio donde se administra el medicamento según la invención, tal como se describe en Zeestraten et al, 2013.

[0095] En una forma de realización, el medicamento según la invención adecuado para la administración intradérmica se puede administrar simultáneamente con un medicamento según la invención adecuado para la administración subcutánea. Alternativamente, ambos medicamentos pueden administrarse secuencialmente por vía intradérmica y posteriormente por vía subcutánea o viceversa (primero, administración subcutánea, seguida de administración intradérmica). En esta forma de realización, como en la forma de realización descrita anteriormente dedicada a la administración intradérmica, la administración intradérmica y/o subcutánea de un medicamento según la invención, preferiblemente un péptido según la invención, y/o de un adyuvante puede repetirse si es necesario y /o distintos medicamentos, preferiblemente péptidos y/o distintos adyuvantes, pueden administrarse secuencialmente por vía intradérmica y/o subcutánea. La presente invención abarca además que un medicamento según la invención, preferiblemente un péptido, se administre por vía intradérmica y/o subcutánea, mientras que un adyuvante como se define en el presente documento se administre secuencialmente como inmunomodulador. El adyuvante o inmunomodulador puede administrarse por vía intradérmica y/o subcutánea. Sin embargo, se puede utilizar cualquier otra forma de administración para el adyuvante o inmunomodulador.

[0096] Se espera que la combinación de una administración intradérmica y subcutánea de un medicamento según la invención sea ventajosa. Las CD de la epidermis son claramente diferentes de las CD de la dermis y del tejido subcutáneo. La inmunización intracutánea (intradérmica) provocará el procesamiento de antígenos y la activación de las CD epidérmicas (células de Langerhans positivas para langerina) que, a través de su red dendrítica, están en estrecho contacto con los queratinocitos. Esto también activará de manera óptima las vías inflamatorias en las interacciones entre las células de Langerhans y los queratinocitos, seguido del tráfico de células de Langerhans activadas y cargadas de antígeno a los ganglios linfáticos que drenan la piel. La administración subcutánea activará otros subconjuntos de CD, que también se cargarán con antígeno y viajarán de forma independiente a los ganglios linfáticos que drenan la piel. Posiblemente, el uso de un medicamento que pueda administrarse tanto por vía intradérmica como subcutánea pueda conducir a una estimulación sinérgica de los linfocitos T en estos ganglios de drenaje por parte de los diferentes subconjuntos de CD.

[0097] Un medicamento según la presente invención y los métodos de tratamiento descritos en el presente documento usando un medicamento según la invención se pueden combinar ventajosamente con otros medicamentos y métodos de tratamiento. Como tal, un medicamento según la invención o un método de tratamiento según la divulgación se puede combinar con, por ejemplo, terapia y/o terapia con anticuerpos contra una enfermedad relacionada con el VHB o puede combinarse con, por ejemplo, inmunoterapia y/o terapia con anticuerpos contra otra enfermedad que no esté relacionada con el VHB, o puede combinarse con inmunoterapia contra otro antígeno distinto del VHB para tratar una enfermedad relacionada con el VHB. Para los fines de la presente invención, cualquier referencia a un método de tratamiento que implique la administración o el uso de una composición/compuesto determinado debe entenderse como una referencia a dicha composición/compuesto para su uso en dicho tratamiento.

[0098] En este documento y en sus reivindicaciones, el verbo "comprender" y sus conjugaciones se utiliza en su sentido no limitativo para significar que se incluyen los elementos que siguen a la palabra, pero no se excluyen los elementos que no se mencionan específicamente. Además, la referencia a un elemento por el artículo indefinido "un" o "una" no excluye la posibilidad de que más de uno de los elementos esté presente, a menos que el contexto requiera claramente que haya uno y solo uno de los elementos. Por tanto, el artículo indefinido "un" o "una" suele significar "al menos un/a”. La palabra “alrededor de” o "aproximadamente”, cuando se usa en asociación con un valor numérico (por ejemplo, aproximadamente 10), significa preferiblemente que el valor puede ser el valor dado (de 10) más o menos el 0,1 % de dicho valor.

[0099] La información de secuencia proporcionada en este documento no debe interpretarse de manera tan estricta como para requerir la inclusión de bases identificadas erróneamente. El experto es capaz de identificar dichas bases identificadas erróneamente y sabe cómo corregir dichos errores. En caso de errores de secuencia, debe prevalecer la secuencia central del VHB, la polimerasa del VHB y los polipéptidos de la proteína de superficie grande del VHB que se pueden obtener mediante la expresión del gen presente en las SEQ ID N.°: 5, 2 y 1467 que contiene la secuencia de ácido nucleico respectiva que codifica los polipéptidos.

[0100] A menos que se indique lo contrario, en la aplicación a la práctica de la invención se emplearán métodos convencionales estándar de biología molecular, virología, microbiología o bioquímica. Estas técnicas se describen en Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning, A Laboratory Manual (segunda edición), Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press; en Sambrook y Russell (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, tercera edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Nueva York; en los volúmenes 1 y 2 de Ausubel et al. (1994) Current Protocols in Molecular Biology, Current Protocols, EE. UU.; y en los volúmenes I y II de Brown (1998) Molecular Biology LabFax, segunda edición, Academic Press (Reino Unido)); Oligonucleotide Synthesis (N. Gait editor); Nucleic Acid Hybridization (Hames and Higgins, eds.).

LEYENDAS DE LAS FIGURAS

[0101]

Figura 1: Patrón de escisión mediado por proteasoma de péptidos largos de vacunas como se predijoin silicoy observado en experimentos de digestiónin vitro.Para cada SLP, los sitios de escisión observados se indican con flechas (los sitios de escisión principales y secundarios se indican con flechas en negrita y delgadas, respectivamente, como se detalla más en el presente documento). Además, para cada uno de los diez SLP analizados en los experimentos de digestión (S<l>P1, SLP10 y SLP21 en la Figura 1A; SLP14, SLP18 y SLP21 en la Figura 1B; SL<p>24, SLP25 y SLP26 en la Figura 1C; y SLP 27 en la Figura 1D), la puntuación C prevista se indica en la primera fila, los sitios de escisión predichos confirmados se indican en la segunda fila (indicados como "+"), la posición de los aminoácidos dentro de la proteína fuente se indica en la tercera fila, los aminoácidos respectivos en la secuencia se indica en la cuarta fila, y el número de aminoácidos dentro del SLP se indica en la quinta fila. Para SLP27, C* indica la sustitución de cisteína por Abu.

Figura 2: Resumen de los donantes sin infección previa que respondieron después de la inducción con linfocitos T con péptidos largos derivados del VHB. Datos combinados de producción de IFNy medida mediante ELISA ("ELISA"); cuadro sombreado IE (Índice de estimulación) > 1,5, y proliferación de linfocitos T ("Prolif) medida por incorporación de 3H timidina; cuadro sombreado IE > 1,5. N.t.: sin analizar.

Figura 3: Resumen de los donantes inmunes al VHB que respondieron después de la estimulación con péptidos largos derivados del VHB. Los datos representan los resultados de ELISpot de IFNy, con cuadros sombreados que indican una respuesta positiva con IE (índice de estimulación)>3, cuadros en blanco SI<3.

Figura 4: El índice de estimulación (IE) medio para cada péptido, medido en un ensayo ELISpot de IFN<y>, se representó frente a la puntuación TRIA prevista del péptido correspondiente. Se indica Abu-SLP27 ($).

[0102] La invención se explica con más detalle en los siguientes ejemplos. Estos ejemplos no limitan el alcance de la invención, sino que simplemente sirven para aclarar la invención.

EJEMPLOS

Introducción

[0103] En la presente invención, desarrollamos una composición de vacuna inductora de linfocitos T óptima que consiste en péptidos largos sintéticos para tratar a pacientes con infección crónica por VHB. Se realizó una selección de 37 péptidos largos (Tabla 3; secuencias que varían de 30 a 39 aminoácidos) que abarcan las regiones de la polimerasa del VHB, la proteína central, el antígeno de superficie y la proteína X con la mayor capacidad inductora de inmunidad de linfocitos T putativa. Con este fin, se identificaron en estas proteínas los primeros epítopos de linfocitos T citotóxicos (CTL) putativos restringidos por HLA de clase I y los epítopos de linfocitos T colaboradores putativos restringidos por HLA de clase II en estas proteínas utilizando algoritmos que predicen la unión de péptidos HLA de clase I y II y la generación C-terminal por el proteosoma de todos los péptidos cortos de unión a HLA de clase I (con una longitud de un epítopo de CTL; 8 - 12 aa) contenidos en las proteínas del VHB. Se asignaron valores numéricos a todos los epítopos de CTL y epítopos de linfocitos T colaboradores putativos que reflejaban su calidad de inmunogenicidad. La calidad de cualquier epítopo de CTL se evaluó utilizando la denominada puntuación BCI-Clase I (puntuación de Unión-Escisión:Inmunogenicidad de Clase I), incorporando la combinación de la capacidad de unión a HLA de clase I del epítopo junto con la probabilidad de su liberación del extremo C terminal de la proteína fuente por parte del proteosoma. Los epítopos de linfocitos T colaboradores putativos se evaluaron utilizando la denominada puntuación B-Clase II (puntuación de unión de Clase II), que refleja su capacidad de unión y, por tanto, la calidad inmunogénica predicha. El valor acumulativo combinado, es decir, la suma de la puntuación BCI-Clase I acumulativa y la puntuación B-Clase II acumulativa se calculó para todos los péptidos largos posibles, reflejando la cantidad y calidad acumulativas de todos los epítopos de CTL y epítopos de linfocitos T colaboradores, y se expresa en la puntuación de Evaluación de Inmunogenicidad Regional de Linfocitos T (TRIA). En consecuencia, la puntuación TRIA permitió evaluar la inmunogenicidad total de los linfocitos T de cualquier posible péptido largo (longitud 30 - 39 aa) en las proteínas del VHB. Se seleccionaron los 37 péptidos largos derivados del VHB con las puntuaciones TRIA más altas. A continuación, se evaluó si los donantes sin infección previa y los donantes que habían pasado anteriormente una infección por VHB podían responder a uno o más de un subconjunto de 13 péptidos largos con puntuaciones TRIA variables seleccionadas del amplio conjunto de 37 péptidos largos.

[0104] Se obtuvieron PBMC de capas leucocitarias de doce donantes sanos, seis de los cuales no habían tenido nunca el VHB y otros seis habían superado una infección por el VHB anteriormente. Utilizando ensayos de inducción de linfocitos T a largo plazo, encontramos respuestas contra 12 de 13 péptidos en donantes sin infección previa (once de los cuales indujeron respuestas en múltiples donantes), lo que confirma la capacidad de estos SLP para inducir respuestas de linfocitos T en una gran mayoría de individuos que no habían tenido contacto con los antígenos antes. La fuerza de las respuestas de los linfocitos T halladas en PBMC de donantes inmunes al VHB contra estos 13 péptidos largos vacunales se correlacionó con la fuerza prevista de la inmunogenicidad general de los linfocitos T, tal como se expresa en sus puntuaciones TRIA, lo que valida el valor predictivo de la puntuación TRIA para seleccionar péptidos inmunogénicos. Por lo tanto, la puntuación TRIA es un criterio fiable para la selección de péptidos largos inmunogénicos óptimos, lo que nos anima a seleccionar los péptidos largos con las puntuaciones TRIA más altas en nuestra vacuna contra el VHB basada en SLP.

Material y métodos

Síntesis de péptidos

[0105] Los péptidos se sintetizaron usando química de Fmoc/tBu en fase sólida en un sintetizador de péptidos PTI Prelude y se purificaron en un sistema de HPLC preparativa Gilson hasta una pureza > 95 %. La identidad y pureza de los péptidos se confirmaron con UPLC-MS en un sistema Waters Acquity UPLC/TQD.

Predicción de la capacidad de inducción de inmunidad de linfocitos T colaboradores y CTL en SLP seleccionados derivados del VHB mediante un algoritmo basado en red

[0106] La capacidad inductora de inmunidad putativa de CTL por SLP se predijo calculando la puntuación BCI-Clase I acumulativa por SLP. Como se detalla a continuación, la puntuación BCI acumulativa se basa en la puntuación B-Clase I, que es una medida de la unión de péptidos de HLA de clase I, y la puntuación C, que es una medida de la liberación de epítopos proteosomales.

[0107] La capacidad de inducción de inmunidad putativa de los linfocitos T colaboradores por SLP se predijo calculando la puntuación B-Clase II acumulativa por SLP. Como se detalla a continuación, la puntuación B-Clase II acumulativa se basa en la puntuación B-Clase II, que es una medida de la unión de péptidos de HLA de clase

[0108] La capacidad inductora de inmunidad total putativa por SLP se predijo mediante la suma de la puntuación BCI-Clase I acumulativa y la puntuación B-Clase II acumulativa, cuyo valor se denomina en el presente documento puntuación TRIA.

Puntuación B-Clase I

[0109] Se evaluó la unión del péptido a 50 moléculas de HLA de clase I (véase el texto) de péptidos derivados de la polimerasa del VHB, péptidos derivados de la proteína central del VHB, péptidos derivados del antígeno de superficie del VHB y péptidos derivados de la proteína X del VHBin silicoutilizando un algoritmo patentado. Se seleccionó el percentil 1,5 superior de los péptidos de unión predichos para cada molécula de HLA de clase I. La "puntuación de unión de Clase I (puntuación B-Clase I)" se deriva de la clasificación de la afinidad de unión prevista de los péptidos. Brevemente, primero se invirtió la clasificación y posteriormente se normalizó a 100, de modo que el péptido que se predijo que se uniría mejor tuvo una puntuación de 100. Ejemplo: se seleccionaron cinco péptidos (5 dentro del grupo de percentil 1,5). A los péptidos se les asignó primero la "puntuación de clasificación inversa" de 5 a 1 (5 para el péptido con mejor unión). Posteriormente, cada puntuación de clasificación inversa se normaliza con la cantidad de péptidos dentro del percentil 1,5 superior, de modo que el que tiene mejor unión obtiene una puntuación de 100. Para ello, la puntuación de clasificación de cada péptido se multiplica por 100/5 (=20). El que tiene mejor unión obtiene entonces una puntuación B-Clase I: 5 x 20 = 100, el que tiene la segunda mejor unión tiene una puntuación B-Clase I de 4 x 20 = 80, etc. En general, la puntuación de clasificación se multiplica por 100/n (n= número de péptidos dentro del percentil 1,5). Como consecuencia, el péptido con mejor unión predicho (para una determinada molécula HLA de clase I) siempre obtiene una puntuación de 100, independientemente del número preciso de péptidos dentro del percentil 1,5 que se seleccionen.

Puntuación C

[0110] La generación C-terminal por el proteosoma del percentil 1,5 superior de péptidos de unión de alta afinidad predichos de la polimerasa del VHB, la proteína central del VHB, el antígeno de superficie del VHB y la proteína X del VHB (para cada molécula de HLA de clase I) se evaluó utilizando dos algoritmos patentados, que predicen la probabilidad de una escisión proteasomal después de la posición de un aminoácido determinado en la polimerasa del VHB, la proteína central del VHB, el antígeno de superficie del VHB y la proteína X del VHB, respectivamente, y pueden obtener una puntuación entre 0 y 1, donde un valor más alto representa una mayor probabilidad de escisión después del aminoácido. El valor 0,5 se puede utilizar como valor umbral arbitrario: > 0,5 es probable que se produzca la escisión, y < 0,5 es probable que no se produzca la escisión. En consecuencia, un valor cercano a 1 indica una alta probabilidad de escisión después del residuo específico.

Debido a que se producen grandes diferencias entre las predicciones de ambos algoritmos diferentes, se desarrolló la puntuación de escisión (puntuación C) que tiene en cuenta los resultados de predicción de ambos algoritmos patentados. La puntuación C es la suma de las puntuaciones separadas de ambos métodos. Por lo tanto, la puntuación C para cada posición en la polimerasa del VHB es como máximo (cerca de) 2 y como mínimo (cerca de) 0, donde cerca de 2 refleja una probabilidad muy alta mediante AMBOS métodos de que la escisión después del residuo se produzca por el proteasoma, y una puntuación C cercana a 1 se considera una tendencia indiferente a la escisión por parte del proteosoma (como se predice en promedio por ambos métodos de red).

Puntuación BCI-Clase I

[0111] Para incorporar en una medida cuantitativa tanto la puntuación B-Clase I como la puntuación C, que son las medidas indicativas de la probabilidad de que un péptido se una con alta afinidad a las moléculas de HLA de clase I y se produzca en el extremo C-terminal, se desarrolló la puntuación de unión-escisión-inmunogenicidad de Clase I (BCI-Clase I). La puntuación BCI-Clase I es la puntuación B-Clase I multiplicada por la puntuación C. Como tal, la BCI-Clase I puede alcanzar un valor máximo de 200 (100 x 2) (unidades arbitrarias).

Puntuación BCI-Clase I acumulativa

[0112] La puntuación BCI-Clase I acumulativa para cada péptido largo según la invención se usó como (uno de dos) criterio de selección para identificar los péptidos de la invención. La puntuación BCI-Clase I acumulativa es un reflejo cuantitativo tanto del número total de epítopos de linfocitos T citotóxicos CD8+ que están contenidos en un péptido largo según la invención como de su calidad prevista, en términos de capacidad de unión y probabilidad de generación intracelular por el proteasoma y, como tal, es indicativa del poder inductor de linfocitos T citotóxicos CD8+ de cada péptido según la invención (su inmunogenicidad de linfocitos T CD8+). Una puntuación BCI-Clase I acumulativa relativamente alta de un péptido según la invención indica un nivel alto de inmunogenicidad de linfocitos TCD8+.

Puntuación B-Clase II

[0113] Se evaluó la unión del péptido a 13 moléculas prevalentes de HLA de clase II de péptidos derivados de la polimerasa del VHB, péptidos derivados de la proteína central del VHB, péptidos derivados del antígeno de superficie del VHB y péptidos derivados de la proteína X del VHBin silicoutilizando un algoritmo patentado. La "puntuación de unión de clase II" (puntuación B-Clase II) se deriva de la clasificación de la afinidad de unión prevista de los péptidos. Brevemente, primero se invirtió la clasificación y posteriormente se normalizó a 100, de modo que el péptido que se predijo que se uniría mejor tenía una puntuación de 100. Para reducir el número de péptidos en la lista, se predijeron todas las variantes de longitud de los péptidos que se predijo que se unirían a una clase de HLA en particular. Las moléculas II con una unión prevista más baja (puntuación B-Clase II más baja) se descartan de la lista.

Puntuación B-Clase II acumulativa

[0114] La puntuación B-Clase II acumulativa para cada péptido largo según la invención se utilizó como segundo criterio de selección para identificar los péptidos de la invención. La puntuación B-Clase II acumulativa es un reflejo cuantitativo tanto del número total de epítopos de linfocitos T colaboradores CD4+ que están contenidos en un péptido largo según la invención y su calidad prevista, en términos de capacidad de unión y, como tal, es indicativa del poder inductor de linfocitos T CD4+de cada péptido según la invención (su inmunogenicidad de linfocitos T CD4+). Una puntuación B-Clase II acumulativa relativamente alta de un péptido según la invención indica un nivel alto inmunogenicidad de linfocitos T CD4+.

Puntuación de la Evaluación de Inmunogenicidad Regional de linfocitos T (TRIA)

[0115] La puntuación TRIA para un péptido particular de la invención (SLP) es la suma de la puntuación BCI-Clase I acumulativa y la puntuación B-Clase II acumulativa de ese péptido largo particular de la invención (SLP).Digestión proteosomal

[0116] Se disolvió ditiotreitol (DTT; Sigma-Aldrich) en agua de calidad UPLC y se añadió a un tampón de digestión de proteasoma concentrado 2X (base Trizma 60 mM; pH 7,5; Sigma-Aldrich, KCl 20 mM; Sigma-Aldrich, MgCh 10 mM); Sigma-Aldrich, NaCl 10 mM; Sigma-Aldrich) hasta una concentración final de DTT de 2 mM. Luego, se agregaron 130 pl de agua de calidad UPLC a 3 viales de reacción, junto con 150 pl del tampón de digestión de proteasoma concentrado 2X que contenía DTT 2 mM y 10 pl del péptido por analizar (concentración de solución madre 300 nmol/ml). Después de agitar los viales, se añadieron 10 pl de agua al vial 1 (digestión de control simulado), 1 pg (10 pl) de proteasoma constitutivo 20S (solución madre 0,1 mg/ml; Enzo Life Sciences) al vial 2 y 1 pg (10 pl) de proteasoma 20S inmune (solución madre 0,1 mg/ml; Enzo Life Sciences) al vial 3. Se tomó una muestra de 50 pl para T=0 directamente después de agitación con vórtex y se añadieron 4 l_il de ácido fórmico (Sigma-Aldrich) al vial 3 para detener la reacción. Los viales de reacción se agitaron y se incubaron a 37 °C. Se recogieron muestras de 50 |_il después de 1 h, 3 h, 6 h y 24 h de incubación. Las reacciones se detuvieron con 4 |_il de ácido fórmico y todas las muestras se almacenaron a 20 °C.

Análisis por espectrometría de masas de fragmentos digeridos

[0117] Para la espectrometría de masas con ionización por electrospray se utilizó un espectrómetro de masas Q-TOF1 (Waters) equipado con una interfaz de nanoelectrospray en línea con un caudal aproximado de 250 nl/min. Las muestras de digestión de péptidos se atraparon en una precolumna (MCA-300-05-C18; Dionex) y se eluyeron con un gradiente pronunciado de 70-90 % de tampón B durante 10 minutos (tampón A, agua, acetonitrilo y ácido fórmico, 95: 3:1 (vol/vol/vol); tampón B, agua, acetonitrilo y ácido fórmico, 10:90:1 (vol/vol/vol)). Los espectros de masas se registraron a partir de una masa de 50 a 2000 daltons. En el modo de espectrometría de masas en tándem, los iones se seleccionaron con una ventana de 3 daltons. El gas de colisión fue argón (4 x 10-5 mbar), y el voltaje de colisión fue de ~30 V. Para la digestión de péptidos mediante proteasoma e inmunoproteasoma constitutivos purificados, se buscaron picos en los espectros de masas en péptidos del sustrato fuente con el software BioLynx (Waters) y se evaluó cuantitativamente la abundancia de un fragmento de digestión específico como su porcentaje del total de intensidades sumadas, incluido el sustrato no digerido.

Células

[0118] Se aislaron células mononucleares de sangre periférica (PBMC) de donantes sanos mediante centrifugación en gradiente de Ficoll. Para generar células dendríticas (CD), aproximadamente 50*106 PBMC se llevaron a una concentración de 3*106 células/ml de medio completo (IMDM, Lonza, suplementado con HS al 8 %, Seralab; penicilina/estreptomicina, Lonza; L-glutamina, Lonza) y se sembraron 3 ml/pocillo en una placa de 6 pocillos (Corning). Después de una incubación durante 1,5 horas a 37 °C, las células no adherentes se eliminaron mediante lavado en tres pasos de lavado utilizando medio completo (día 0). Las células adherentes se cultivaron durante tres días a 37 °C en 2 ml/pocillo de medio completo que contenía 800 U/ml de GM-CSF y 500 U/ml de IL-4 (Peprotech). El día 3, se añadió a cada pocillo 1 ml de medio completo que contenía 2400 U/ml de GM-CSF y 1500 U/ml de IL-4 y se cultivó durante otros tres días a 37 °C.

Inducción de linfocitos T

[0119] El día 6, se añadieron péptidos largos distribuidos en 3 grupos a CD derivadas de monocitos de donantes que nunca habían tenido el virus a una concentración de 3 nmol/ml y se incubaron durante la noche a 37 °C. El grupo 1 comprende SLP 26 (SEQ ID N.°: 76), SLP 24 (SEQ ID N.°: 74), SLP 1 (SEQ ID N.°: 51) y SLP 30 (SEQ ID N.°: 1142); El grupo 2 comprende Abu-SLP 27 (s Eq ID N.°: 77, en donde la cisteína en la posición 1 del aminoácido está reemplazada por Abu), SLP 25 (SEQ ID N.°: 75), SLP 10 (SEQ ID N.°: 60) y SLP 34 (SEQ ID N.°: 1469); y el grupo 3 comprende SLP 5 (SEQ ID N.°: 55), SLP 13 (SEQ ID N.°: 63), SLP 14 (SEQ ID N.°: 64) y SLP 21 (SEq ID N.°: 21). El día 7, las células se lavaron dos veces con medio completo para eliminar los péptidos. Se cocultivaron CD y PBMC autólogas en una proporción de 1:10 durante 10 días a 37 °C en presencia de 10 ng/ml de IL-7 y 100 pg/ml de IL-12p70. Las líneas de linfocitos T generadas por este proceso se revisaron cada 2 o 3 días y se dividieron cuando fue necesario.

Reestimulación de líneas de linfocitos T

[0120] Tres días después de la inducción de linfocitos T (día 10), se diferenció un segundo lote de CD autólogas y se cargó con grupos de péptidos como se ha descrito anteriormente. El día 10 después del inicio de la línea de linfocitos T (día 17), las CD cargadas con péptido se lavaron dos veces con medio completo y se añadieron a los linfocitos T en una proporción de 1:10 (CD:linfocitos T) en presencia de 10 ng/ml de IL-7 y 100 pg/ml de IL-12p70. Las células se cultivaron conjuntamente durante 7 días. El día 17 también se diferenció un nuevo lote de CD y se cargó con conjuntos de péptidos como se ha descrito anteriormente. Para esta segunda reestimulación, a partir del día 24, se cultivaron conjuntamente CD y células T en una proporción de 1:10. Dos días después de la reestimulación, se añadieron al medio de cultivo 30 UI/ml de IL-2 (Peprotech) y 5 ng/ml de IL-15 (Peprotech). Se realizó una tercera reestimulación, a partir del día 31, de manera idéntica a la segunda reestimulación.

Proliferación de linfocitos T y producción de IFNy

[0121] Para medir la activación y proliferación de linfocitos T, se cargaron CD autólogas durante 6 horas con cada uno de los 13 péptidos derivados del VHB por separado los días 23, 30 y 37 del protocolo de inducción de linfocitos T descrito anteriormente. Las CD se lavaron y se cocultivaron 5000 CD cargadas con péptidos con 50000 linfocitos T durante 48 horas. Luego, se recogió el sobrenadante para ELISA (IFN<y>ELISA, Diaclone) y se añadió medio de cultivo que contenía 3H-timidina a todos los pocillos. La 3H-timidina se incorpora al ADN de células recién formadas (proliferadas), lo cual se mide después de 16 horas de incubación en un contador de centelleo líquido MicroBeta (Wallac/Perkin Elmer).

ELISpot de IFNy

[0122]Para detectar linfocitos T humanos productores de IFN<y>específico para antígenos, primero se preestimularon las PBMC con 3 nmol/ml del péptido indicado durante 72 horas a 37 °C. Durante esta estimulación, se recubrieron placas de PVDF para ELISpot (Mabtech) con 5 ug/ml de anticuerpo de recubrimiento anti-IFNY mAb 1-Dl K humano (Mabtech) en PBS y se incubaron durante la noche a 4 °C. Después de la estimulación de las PBMC, el anticuerpo de recubrimiento se aspiró de la placa y se lavó 4 veces con PBS. Para bloquear la unión no específica, se añadieron a todos los pocillos 100 pl de IMDM que contenía FCS al 8 % y se incubaron a 37 °C durante 1 hora. Mientras tanto, se recogieron las PBMC estimuladas, se centrifugaron, se resuspendieron en medio X-vivo 15 (Lonza) y se contaron. Todas las muestras de PBMC se llevaron a una concentración de 1,5*106 células/ml en medio X-vivo 15. Se aspiró el medio de los pocillos de la placa de PVDF y se añadieron a la placa 100 pl de cada muestra de PBMC por cuadruplicado. Las placas se incubaron a 37 °C durante la noche. Al día siguiente, se descartó el sobrenadante y las placas se lavaron 6 veces con PBS/Tween20 al 0,05 %. Se añadió mAb anti-IFNY humano 7-B6-1 biotinilado (Mabtech) a todos los pocillos (100 pl/pocillo) a una concentración de 0,3 pg/ml en PBS con FBS al 1 % y se incubaron durante 2 horas a temperatura ambiente. A continuación, las placas se lavaron 6 veces usando PBS/Tween20 al 0,05 % y se añadió 1 pg/ml de extravidina-fosfatasa alcalina (ALP) (Sigma-Aldrich) a todos los pocillos (100 pl/pocillo) en PBS con FBS al 1 %. Las placas se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente. Se preparó la solución de sustrato ALP BCIP/NBT-plus (Mabtech) y se añadieron 100 pl/pocillo a todos los pocillos después de lavar las placas 4 veces con PBS/Tween20 al 0,05 %. Para terminar la reacción colorimétrica (después de 1-20 minutos), se usó agua del grifo para lavar exhaustivamente las placas. Después del secado, las manchas formadas se midieron en un Biosys Bioreader 5000.

Resultados

Selección de péptidos largos basada en la predicción de unión de péptidos HLA de clase I y la generación C-terminal prevista de todos los epítopos de linfocitos T CD8+ posibles contenidos en los péptidos largos

[0123] Un epítopo de linfocitos T CD8+ de alta calidad se define como un péptido que posee una alta afinidad prevista por la molécula HLA de clase I a la que se une y también se prevé que se generará en su extremo C terminal mediante una escisión proteolítica del proteosoma. Los péptidos según la presente invención se seleccionaron en regiones proteicas del VHB que contienen cantidades óptimamente altas de epítopos de linfocitos T CD8+ y CD4+ de alta calidad. Para ello, primero se evaluó la unión de HLA de clase I y la generación C-terminal de todos los epítopos de linfocitos T CD8+ posibles utilizando un algoritmo patentado de unión de péptidos HLA de clase I y dos algoritmos patentados que predicen las escisiones realizadas por el proteosoma. Posteriormente, ideamos una única medida cuantitativa, la denominada puntuación de unión-escisióninmunogenicidad (BCI) de Clase I que, para cada péptido corto (8 - 13 aminoácidos), incorpora tanto su afinidad de unión prevista por la molécula HLA de clase I a la que se une como la probabilidad de que el péptido sea generado por el proteasoma de las células. La puntuación BCI-Clase I se calcula a partir de (1) la puntuación de unión de Clase I (puntuación B-Clase I), que se deriva de los resultados de predicciónin silicode la unión del péptido HLA de clase I usando el algoritmo antes mencionado, y (2) la puntuación de escisión (puntuación C), que se deriva de los resultados de la predicciónin silicode la generación C-terminal del péptido mediada por proteasoma por parte del proteasoma utilizando los algoritmos antes mencionados. Las tablas 4a, 5a, 6a y 7a presentan la puntuación BCI-Clase I para todos los epítopos de linfocitos T CD8+ posibles de estos SLP derivados de polimerasa, proteína central, antígeno de superficie o proteína X, respectivamente, junto con la puntuación de BCI-Clase I acumulativa. Las tablas 4b, 5b, 6b y 7b presentan la puntuación B-Clase II para todos los epítopos de linfocitos T CD4+ posibles de estos SLP derivados de polimerasa, proteína central, antígeno de superficie o proteína X, respectivamente, junto con la puntuación B-Clase II acumulativa. En conjunto, la puntuación BCI-Clase I acumulativa (para epítopos de CTL) y la puntuación B-Clase II acumulativa (para epítopos de linfocitos T colaboradores) dieron como resultado un valor cuantitativo, la denominada puntuación de Evaluación de Inmunogenicidad Regional Total (TRIA), que refleja la inmunogenicidad total de linfocitos T de una vacuna de péptidos largos (Tabla 3). Según las puntuaciones más altas de TRIA, se seleccionaron 37 SLP derivados de la polimerasa del VHB, la proteína central, el antígeno de superficie o la proteína X para una evaluación adicional (Tabla 3). De estos, para validar el poder predictivo de la puntuación TRIA, elegimos un conjunto representativo de 13 SLP, que incluían SLP con puntuaciones TRIA relativamente bajas y altas, para evaluar la inmunogenicidadin vitro. Estos 13 péptidos se dividieron en tres grupos de péptidos para llevar a cabo ensayos de inducción de linfocitos T, como se describe (véase lo siguiente).

El análisis de fragmentos de péptidos después de la digestión proteasomal de SLP revela una alta precisión de prediccionesin silico

[0124] Un componente importante de la identificación de epítopos de CTL putativos es la predicción de su generación C-terminal mediante una escisión mediada por proteasoma. Para validar la fiabilidad de esta predicción, se evaluaron experimentalmente los patrones de digestión proteasomal para todos menos 3 de los 13 péptidos largos vacunales analizados funcionalmente (tres péptidos largos no se escindieron por razones técnicas).

[0125] Los experimentos de digestión se realizaron por separado con preparaciones de proteosomas constitutivos 20S y de inmunoproteosomas 20S. El análisis combinado de las escisiones producidas por ambos tipos de proteosomas permite evaluar la generación C-terminal de epítopos de CTL que se expresan tanto en la superficie de células presentadoras de antígenos (principalmente células dendríticas), que contienen inmunoproteosomas, como en la superficie de células cancerosas, especialmente de tumores sólidos, que expresan principalmente proteosomas constitutivos. Para fines de vacunación, se prefieren estos epítopos porque la vacunación con tales epítopos permitirá la inducción de CTL mediante vacunación y la posterior erradicación de células cancerosas mediante estos CTL después del reconocimiento de los epítopos en la superficie de las células cancerosas.

[0126] Como se indica en la Figura 1, se coincubaron 10 péptidos largos de la invención (longitud 30 - 39 aa) en un tampón apropiado con las preparaciones de proteasoma a 37 °C durante 0, 1, 3, 6 y 24 h. Después de la incubación durante el intervalo indicado, se detuvieron las reacciones y las mezclas de digestión, que contenían los fragmentos de digestión, se midieron mediante espectrometría de masas como se describe en el presente documento. Los espectros de masas se analizaron (semicuantitativamente) para evaluar la posición y abundancia de los sitios de escisión. Los resultados de la digestión de 24 h se muestran en la Figura 1.

[0127] Los sitios de escisión observados después de 24 h de incubación se indican con flechas. Solo se muestran los sitios de escisión que se observaron tanto en la digestión con proteosomas constitutivos como en la digestión con inmunoproteosomas. Los sitios de escisión principales y los sitios de escisión secundarios en digestión de 24 h se representan con flechas en negrita y finas, respectivamente, de acuerdo con la siguiente clasificación:

Sitio de escisión principal: los fragmentos que contienen como extremo COOH el residuo NH2-terminal del sitio de escisión junto con los (posibles) fragmentos complementarios están presentes durante >7 % a las 24 h de incubación, según se calcula a partir de las intensidades de los picos de los fragmentos en los espectros de masas.

Sitio de escisión secundario: los fragmentos que contienen como extremo COOH el residuo NH2-terminal del sitio de escisión junto con los (posibles) fragmentos complementarios están presentes durante <7 % a las 24 h de incubación. No se muestran los sitios de escisión con una abundancia acumulada de fragmentos <1 %.

[0128] En la Figura 1 también se indica la puntuación C de la predicción de la escisión proteasomal. Esta puntuación indica la probabilidad de escisión del extremo C del residuo directamente debajo de la puntuación C. Si la puntuación C > 1, se considera que el sitio de escisión será escindido tanto por el proteasoma constitutivo como por el inmunoproteasoma. Como se describe en el presente documento, la puntuación C es una suma de las predicciones de dos algoritmosin silicoque predicen por separado las escisiones mediadas por proteosomas por proteosomas constitutivos y las escisiones por inmunoproteosomas. Cada predicción separada puede alcanzar un valor máximo de 1. En consecuencia, el valor máximo de la puntuación C es 2. Las puntuaciones C > 1 se cuentan juntas como el número total de sitios de escisión predichos (el extremo C del péptido sustrato largo no se tiene en cuenta porque no se puede comprobar la escisión después de este residuo).

[0129] En la Figura 1 se indican además las escisiones confirmadas (indicadas por "+"), que son aquellos sitios de escisión predichos (puntuación C >1) que se confirma que se escinden después de 24 h en el ensayo de digestión mediada por proteasoma.

[0130] Como se indica en la Figura 1, para SLP1 el 36 % (4/11), para SLP10 el 71 % (10/14), para SLP13 el 62 % (10/16), para SLP14 el 100 % (13/13), para SLP18 el 65 % (13/20), para SLP21 el 87 % (14/16), para SLP24 el 62 % (10/16), para SLP25 el 57 % (8/14), para SLP26 el 72 % (8/11) y para SLP27 el 75 % (9/12) de los sitios de escisión predichos se han confirmado aquí.

Inducción de respuestas de linfocitos T contra 12 de 13 péptidos seleccionados en una población sin infección previa

[0131] Para evaluar si los 13 péptidos seleccionados eran capaces de inducir una respuesta de linfocitos T en donantes no expuestos, se aislaron PBMC de capas leucocitarias derivadas de seis donantes sanos que no habían experimentado una infección por VHB. Estas PBMC se reestimularon con cualquiera de los 3 grupos de péptidos para obtener líneas de linfocitos T, que posteriormente se estimularon con los 13 péptidos seleccionados. La producción de IFN<y>y la proliferación de linfocitos T (incorporación de 3H-timidina) se midieron como lectura de la activación de linfocitos T. Los resultados se muestran en la Figura 2, en la que se indica el porcentaje de donantes que muestran una respuesta positiva de linfocitos T con un índice de estimulación (IE) de 1,5 o superior. El IE se calcula dividiendo el valor de la muestra medido por el valor de las células de control no estimuladas. Se detectaron respuestas inducidas en donantes sin infección previa en 12 de los 13 péptidos preseleccionados, mientras que 11 péptidos preseleccionados indujeron una respuesta en múltiples donantes sin infección previa.

La fuerza de las respuestas de linfocitos T preexistentes en donantes inmunes al VHB está correlacionada con la puntuación TRIA

[0132] Los sujetos que han pasado por una infección por VHB y la han eliminado con éxito poseen linfocitos T de memoria circulantes específicos para el VHB. Para evaluar la relevancia de los péptidos vacunales seleccionados para la eliminación de una infección por VHB de origen natural, se analizó la presencia de respuestas de linfocitos T contra los 13 péptidos de VHB seleccionados en PBMC derivadas de seis donantes inmunes al VHB. Después del aislamiento de las PBMC, las células se estimularon con cada uno de los 13 péptidos y se realizó un ELISpot de IFN<y>para detectar las respuestas de los linfocitos T. Las muestras de PBMC de 3 de 6 donantes analizados mostraron una respuesta positiva de IFN<y>contra uno o más de los 13 péptidos (SI > 3). Se observaron respuestas contra 11 (SLP 5, 10, 13, 14, 18, 21,24, 25, 26, 27 y 34, representados por la SEQ iD N.°: 55, 60, 63, 64, 68, 71, 74, 75, 76, 77 y 1469, respectivamente) de los 13 péptidos, de los cuales 6 indujeron respuestas en múltiples donantes (SLP 10, 13, 21, 24, 25 y 34, representados por la SEQ ID N.°: 60, 63, 71, 74, 75 y 1469, respectivamente). Los resultados se resumen en la Figura 3, indicando los donantes que muestran una respuesta positiva de IFNy+ de linfocitos T contra un péptido. Para cada SLP analizado, se calculó el IE medio de las respuestas de IFNy; 1,21 para SLP1, 2,11 para SlP5, 2,40 para SLP10, 2,44 para SLP13, 1,97 para SLP14, 1,86 para SLP18, 2,87 para SLP21, 2,54 para SLP24, 2,66 para SLP25, 1,56 para SLP26, 1,66 para Abu-SLP27, 1,49 para SLP30 y 3,02 para SLP34. Es importante destacar que, cuando el IE medio de las respuestas de IFNy a cada péptido se representa frente a la puntuación TRIA correspondiente, se observa una correlación significativa (Figura 4), al incluir (R2=0,37, p=0,028; véase la Figura 4) los resultados de Abu-SLP27 y al excluir (R2=0,34, p=0,048; no se muestra) los resultados de Abu-SLP27. Esto valida el uso de la puntuación TRIA para la selección de péptidos inmunogénicos.

Comentario

[0133] Los resultados experimentales presentados en el presente documento validan y, por lo tanto, respaldan la selección y subrayan la relevancia inmunológica de la vacuna de péptidos largos derivados del v Hb de la presente invención. Estos péptidos largos vacunales abarcan las regiones proteicas del VHB con el mayor número de epítopos de unión a HLA de clase I y HLA de clase II de alta calidad en una población exógena. Se incorporará una combinación preferida de los péptidos vacunales en una nueva composición de vacuna de SLP contra el VHB para tratar a pacientes con infección crónica por el VHB. Mediante el uso de algoritmos para predecir la afinidad de unión de péptidos cortos (8 - 12 aa) para todas las moléculas de HLA de clase I prevalentes y la probabilidad de la generación C-terminal de estos péptidos cortos mediante escisión por el proteosoma, en combinación con la identificación de epítopos de linfocitos T colaboradores putativos, identificamos regiones altamente inmunogénicas de las cuales se seleccionaron los 37 péptidos vacunales largos.

[0134] Para permitir la selección adecuada de los péptidos largos vacunales en la presente invención, se desarrolló una medida cuantitativa, la puntuación TRIA. Sin tal medida cuantitativa atribuida a todos los péptidos largos posibles del VHB, no es posible una selección adecuada de los péptidos largos óptimos. La puntuación TRIA es una representación cuantitativa de la calidad y cantidad de todos los epítopos de linfocitos T citotóxicos CD8+ putativos restringidos por HLA de clase I y epítopos de linfocitos T colaboradores CD4+restringidos por HLA de clase II contenidos en un péptido largo. La puntuación TRIA se calculó para todos los péptidos del VHB posibles con una longitud de 30 a 39 aa, que es la longitud óptima del péptido para fines de vacunación, lo que permite la selección racional de un conjunto de péptidos vacunales largos altamente inmunogénicos.

[0135] Para hacer más pruebas y validar la relevancia inmunológica, se seleccionó un conjunto de 13 SLP con diferentes puntuaciones TRIA. Primero, estos SLP se digirieron experimentalmente utilizando proteasoma constitutivo o inmunoproteasoma. Los fragmentos generados mostraron una clara superposición con los sitios de escisión C-terminal predichos, expresados en la puntuación BCI.

[0136] A partir de ahí, se realizaron ensayos de linfocitos T utilizando PBMC de donantes tanto sin infección previa como inmunizados contra el VHB. Casi los 13 SLP seleccionados pudieron inducir respuestas de linfocitos T en PBMC derivadas de donantes sanos sin infección previa, lo que demuestra que el conjunto de SLP seleccionado tiene el potencial de inducir respuestas del repertorio de linfocitos T que no se había estimulado antes. Dentro del mismo conjunto de péptidos vacunales, se observó una fuerte correlación entre la puntuación TRIA de un determinado péptido vacunal y la fuerza de la respuesta de IFNy en donantes inmunes al VHB, lo que indica que la puntuación TRIA es un valor predictivo de la inmunogenicidadin vivoy, por lo tanto, de la funcionalidad de los péptidos vacunales.

Tabla 1. Secuencias de proteínas y ADN de la polimerasa del VHB, del núcleo del VHB y de las proteínas de suerficie rande del VHB

T l 2. Dif r n v ri n l r ín X l VHB ni l r ín n n i

T l . ni i lr in i LP.

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Claims

REIVINDICACIONES

1. Péptido derivado de una proteína del virus de la hepatitis B (VHB), donde dicho péptido tiene como máximo 40 aminoácidos de longitud y comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID N.°: 55, 60, 63, 64, 68, 71, 74, 75, 76, 77 y 1469.

2. Péptido derivado de una proteína del VHB, donde dicho péptido consiste en una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID N.°: 55, 60, 63, 64, 68, 71, 74, 75, 76, 77 y 1469.

3. Péptido según la reivindicación 1, que comprende un aminoácido modificado, un aminoácido no natural y/o un grupo funcional unido covalentemente, donde el grupo funcional unido covalentemente se selecciona de un grupo fluorado, un ligando del receptor tipo Toll humano y /o agonista, un conjugado de oligonucleótido, antígeno prostático específico (PSA), una cadena de azúcar o glicano, un pam3cys y/o un derivado del mismo, preferiblemente un lipopéptido pam3cys o un derivado del mismo, oligodesoxinucleótidos CpG (CpG-ODN), dinucleótidos cíclicos (CON), ácido 2-aminoisobutírico (Abu), muramil dipéptido (MDP), un casete de pulso de células dendríticas (CD), un péptido derivado de la toxina tetánica.

4. Polinucleótido que codifica un péptido según la reivindicación 1 o 2.

5. Composición que comprende un péptido según la reivindicación 1 o la reivindicación 2 o la reivindicación 3 y/o un polinucleótido según la reivindicación 4, y un vehículo aceptable desde el punto de vista farmacéutico.

6. Composición que comprende al menos dos péptidos diferentes según la reivindicación 1 o la reivindicación 2 o la reivindicación 3 y/o al menos dos polinucleótidos diferentes según la reivindicación 4, y un vehículo aceptable desde el punto de vista farmacéutico.

7. Composición según la reivindicación 5 o 6, que comprende además al menos un adyuvante.

8. Composición según la reivindicación 7, donde al menos un adyuvante es un compuesto activador del receptor tipo Toll (TLR).

9. Péptido según la reivindicación 1 o 2 o 3 y/o polinucleótido según la reivindicación 4 y/o composición según cualquiera de las reivindicaciones 5-8, para su uso como medicamento, preferiblemente donde el medicamento es para administración intradérmica y/o o administración subcutánea.

10. Péptido según la reivindicación 1 o 2 o 3 y/o polinucleótido según la reivindicación 4 y/o composición según cualquiera de las reivindicaciones 5 a 8, para su uso en el tratamiento y/o prevención de la infección aguda por VHB, la infección crónica por VHB, la cirrosis hepática relacionada con el<v>H<b>o el cáncer de hígado relacionado con el VHB, preferiblemente en donde el péptido, el polinucleótido y/o la composición están formulados para la administración intradérmica y/o subcutánea.