ES2976495T3

ES2976495T3 - Vectores poxvirus que codifican antígenos del VIH y métodos de uso de los mismos

Info

Publication number: ES2976495T3
Application number: ES18749863T
Authority: ES
Inventors: Frank Wegmann; Johannes Petrus Maria Langedijk; Jerome Hubertina Henricus Victor Custers; Viki Bockstal; Markus Kalla
Original assignee: Bavarian Nordic AS; Janssen Vaccines and Prevention BV
Current assignee: Bavarian Nordic AS; Janssen Vaccines and Prevention BV
Priority date: 2017-06-15
Filing date: 2018-06-14
Publication date: 2024-08-02
Anticipated expiration: 2038-06-14
Also published as: BR112019026126A2; EP3638302A1; CN110958887A; JP7272965B2; US20220088172A1; WO2018229711A1; MA49397A; CO2019014677A2; KR20200015759A; EP3638302C0; US11723970B2; EA202090049A1; EP3638302B1; CN110958887B; US20200138938A1; CA3066573A1; US11229693B2; AU2018283811B2; AU2018283811A1; JP2020527029A

Abstract

Se proporcionan vectores de poxvirus que codifican un antígeno de envoltura de VIH sintético y otros antígenos de VIH, así como composiciones que contienen dichos vectores de poxvirus y usos de dichos vectores de poxvirus como vacunas para proporcionar inmunidad mejorada contra el VIH. También se proporcionan combinaciones de vacunas que contienen los vectores de poxvirus descritos, vectores de adenovirus que codifican uno o más antígenos de VIH y uno o más polipéptidos antigénicos de VIH aislados, y métodos para usar las combinaciones de vacunas para proporcionar inmunidad mejorada contra el VIH. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Vectores poxvirus que codifican antígenos del VIH y métodos de uso de los mismos

ANTECEDENTES

[0002] El virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) afecta a millones de personas en todo el mundo, y la prevención del VIH mediante una vacuna eficaz sigue siendo una prioridad muy alta, incluso en una era de tratamiento antirretroviral generalizado. El VIH-1 es la cepa más común y patógena del virus, y más del 90% de los casos de VIH/SIDA derivan de la infección por el VIH-1 grupo M. El grupo M se subdivide a su vez en clados o subtipos. Lo ideal sería que una vacuna eficaz fuera capaz de provocar tanto respuestas celulares potentes como anticuerpos ampliamente neutralizantes capaces de neutralizar cepas del VIH-1 de diferentes clados.

[0003] La alta variabilidad genética del VIH-1 hace que el desarrollo de una vacuna contra el VIH-1 sea un reto sin precedentes. Con el fin de mejorar la cobertura de epítopos potenciales de células T y mejorar las respuestas celulares, otros autores describieron y desarrollaron antígenos "mosaico" de Gag, Pol y Env del VIH-1, derivados de las proteínas antígeno de grupo (Gag), polimerasa (Pol) y envoltura (Env) del VIH, en un intento de proporcionar la máxima cobertura de epítopos potenciales de células T (p. ej., Barouch et al, Nat Med 2010, 16.II.2010): 319-323). Los antígenos mosaicos son similares en longitud y estructura de dominio a los antígenos del VIH-1 de tipo natural.

[0004] Por ejemplo, los antígenos mosaicos del VIH descritos y utilizados en vacunas incluyen los descritos en Barouch et al, supra, y WO 2010/059732 como:

(a) Antígenos del mosaico gag incluidos:

(a)(i) una primera secuencia Gag de mosaico ("mos1Gag") que tiene la secuencia de aminoácidos que se establece en el presente documento en SEQ ID NO: 33I; y

(a) (ii) una segunda secuencia Gag de mosaico ("mos2Gag") que tiene la secuencia de aminoácidos tal como se establece aquí en SEQ ID NO: 2;

(b) Antígenos del mosaico Pol, incluidos:

(b) (i) una primera secuencia Pol de mosaico ("mos1Pol") con la secuencia de aminoácidos que se indica en SEQ ID NO: 33I; y

(b) (ii) una segunda secuencia Pol de mosaico ("mos2Pol") con la secuencia de aminoácidos que se indica en SEQ ID NO: 4; y

(c) Antígenos de mosaico Env incluidos:

(c) (i) una primera secuencia Env de mosaico ("mos1Env") que tenga la secuencia de aminoácidos tal como se establece aquí en SEQ ID NO: 5, y

(c)(ii) una segunda secuencia Env de mosaico ("mos2Env") que tenga la secuencia de aminoácidos establecida en el presente documento en SEQ ID NO: 6.

[0005] Las secuencias que codifican estos antígenos se han clonado en vectores, por ejemplo, como vectores adenovirales recombinantes, por ejemplo, adenovirus recombinante serotipo 26 (rAd26), y estos vectores recombinantes se utilizaron anteriormente como vacunas para generar respuestas inmunitarias a los antígenos (véase, por ejemplo, Barouch et al, supra; y WO 2010/059732). Por ejemplo, las secuencias de antígenos de mosaico mos1Gag y mos1Pol se combinan típicamente en una proteína de fusión de Gag y Pol ("mos1GagPol"), y cuya secuencia codificante se clona en un primer vector Ad26 ("rAd26.mos1GagPol"); y las secuencias de antígenos mos2Gag y mos2Pol se combinan en otra proteína de fusión de Gag y Pol ("mos2GagPol"), cuya secuencia de codificación se clona en un segundo vector Ad26 ("rAd26.mos2GagPol"). Los constructos que codifican mos1Env y mos2Env suelen clonarse en vectores Ad26 separados ("rAd26.mos1Env" y "rAd26.mos2Env", respectivamente).

[0006] Un conjunto de antígenos de mosaico como el descrito anteriormente proporciona una buena cobertura global de las cepas aisladas del VIH-1 del grupo M, donde los vectores rAd26 que codifican secuencias de antígenos de mosaico 1 (p. ej, rAd26.mos1GagPol y rAd26.mos1Env) favorecen a los subtipos del VIH-1 del clado B y CRF01, y los vectores rAd26 que codifican secuencias de antígenos mosaico 2 (por ejemplo, rAd26.mos2GagPol y rAd26.mos2Env) favorecen a las cepas del clado C. Los antígenos Gag, Pol y Env mosaico del VIH-1 expresados en vectores rAd26 pueden utilizarse para mejorar tanto la amplitud como la profundidad de las respuestas de linfocitos T antígeno-específicas en monos rhesus, sin comprometer la magnitud de las respuestas tanto celulares como humorales cuando se comparan con antígenos del VIH-1 de secuencia consensuada o natural (Barouch et al, supra; y WO 2010/059732).

[0007] Sin embargo, tras nuevos esfuerzos de desarrollo de los componentes de la vacuna descritos anteriormente, se descubrió que el rAd26.mos2Env mostraba una expresión de la superficie celular y una respuesta inmunitaria no óptimas en primates no humanos, pero además mostraba una estabilidad genética no óptima, inesperada e impredecible hasta entonces, durante el proceso de fabricación, en comparación con los otros vectores rAd26, como el rAd26.mos1Env. Así pues, las vacunas que contienen rAd26.mos2Env pueden dar lugar a respuestas inmunitarias no óptimas contra los subtipos del VIH-1 del clado C, ya que el antígeno mosaico mos2Env favorece a las cepas del VIH-1 del clado C. Por consiguiente, se necesita una alternativa al antígeno mos2Env en las vacunas contra el VIH que pueda utilizarse para inducir respuestas inmunitarias mejoradas contra el VIH-1 clado C.

[0008] Los vectores poxvirus, como el virus Vaccinia Ankara modificado (MVA), pueden utilizarse para codificar antígenos de interés con fines de vacunación. Existe una necesidad en la técnica de vectores poxvirus que codifiquen combinaciones novedosas de antígenos del VIH.

RESUMEN DE LA INVENCIÓN

La invención proporciona un vector poxvirus que comprende ácido nucleico que codifica:

(a) un primer antígeno de la envoltura (Env) del VIH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 18;

(b) un segundo antígeno VIH Env diferente del primer antígeno VIH Env;

(c) un tercer antígeno y un cuarto antígeno, que son dos antígenos Gag del VIH diferentes; y

(d) un quinto antígeno y un sexto antígeno, que son dos antígenos diferentes del VIH Pol.

La invención proporciona además una vacuna que comprende un vector poxvirus según la invención y un portador farmacéuticamente aceptable.

La invención proporciona además una combinación de vacunas que comprende:

(a) una primera composición de vacuna que comprende una cantidad inmunológicamente eficaz de un vector de poxvirus según la invención; y al menos uno de:

(b) (i) una segunda composición de vacuna que comprende una cantidad inmunogénica aliadamente eficaz de uno o más vectores de adenovirus que codifican uno o más de los antígenos primero, segundo, tercero, cuarto, quinto y sexto; y

(ii) una tercera composición de vacuna que comprende uno o más polipéptidos que comprenden una cantidad inmunogénicamente eficaz de un polipéptido antigénico aislado del VIH, en la que la primera composición y la segunda y/o tercera composición están presentes en la misma composición o en una o más composiciones diferentes.

[0009] La invención se refiere a proteínas sintéticas de la envoltura del virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) que han mejorado la expresión en la superficie celular y la estabilidad genética en comparación con el antígeno mos2Env descrito anteriormente y un nuevo vector poxvirus que comprende la secuencia de ácido nucleico que codifica las proteínas sintéticas de la envoltura del VIH. La invención también se refiere a composiciones y métodos de utilización de dichos vectores poxvirus novedosos que comprenden la secuencia de ácido nucleico que codifica las proteínas sintéticas de la envoltura del VIH para inducir respuestas inmunitarias aumentadas contra el VIH-1, en particular el VIH-1 clado C y B, preferentemente cuando se utilizan en combinación con otros antígenos del VIH.

[0010] En aspectos particulares, la invención se refiere a vectores poxvirus, preferentemente vectores del virus Vaccinia Ankara modificado (MVA), que comprenden ácido nucleico que codifica la proteína sintética de la envoltura del VIH y preferentemente comprenden una secuencia de ácido nucleico que codifica antígenos adicionales del VIH.

[0011] En un aspecto general, la invención se refiere a un ácido nucleico que codifica una proteína sintética de la envoltura del VIH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 8. La proteína sintética de la envoltura del VIH puede comprender además una secuencia señal, por ejemplo, una secuencia señal que tenga la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NOs: 9-12. En una realización, la secuencia señal tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 9.

[0012] En ciertas realizaciones, la proteína sintética de la envoltura del VIH comprende además un dominio transmembrana, preferiblemente un dominio transmembrana que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 13. En ciertas realizaciones, la proteína sintética de la envoltura del VIH comprende además un fragmento de un dominio citoplasmático, preferentemente un fragmento de un dominio citoplasmático que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 14, o sus aminoácidos N-terminales 1-4 (es decir, NRVR). En las realizaciones en las que la proteína sintética de la envoltura del VIH comprende además un dominio transmembrana y un fragmento de un dominio citoplasmático, se prefiere que la proteína también comprenda la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 37, que está fusionado al carboxilo-terminal (C-terminal) de SEQ ID NO: 8 y el amino-terminal (N-terminal) de la región transmembrana.

[0013] En una realización más preferida, la invención se refiere a un vector poxvirus que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína sintética de la envoltura del VIH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: SEQ ID NO: 18, o aa 1-686 de SEQ ID NO: 19. Lo más preferible es que la proteína sintética de la envoltura del VIH codificada por el ácido nucleico comprenda o consista en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 18.

[0014] En realizaciones preferidas, el vector poxvirus comprende un ácido nucleico que codifica una proteína sintética de la envoltura del VIH como se ha descrito anteriormente, y al menos un antígeno adicional del VIH. En una realización preferida, el vector poxvirus es un vector Vaccinia virus Ankara modificado (MVA). Lo más preferible es que el vector MVA comprenda MVA-BN™ o derivados del mismo.

[0015] En una realización preferida, el vector poxvirus comprende (a) ácido nucleico que codifica un primer antígeno de la envoltura (Env) del VIH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 18, y preferentemente comprende además ácido nucleico que codifica: (b) un segundo antígeno VIH Env diferente del primer antígeno VIH Env; (c) un tercer antígeno y un cuarto antígeno, que son dos antígenos VIH Gag diferentes; y (d) un quinto antígeno y un sexto antígeno, que son dos antígenos VIH Pol diferentes. En ciertas realizaciones preferidas, (b) el segundo antígeno Env del VIH comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 5; c) los antígenos tercero y cuarto comprenden la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 o número de ID de SEQ:2. 2, respectivamente; y d) los antígenos quinto y sexto comprenden la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3 o número de ID de SEQ:2. 4, respectivamente. En ciertas realizaciones, los antígenos tercero y quinto se fusionan en un primer antígeno de fusión Gag-Pol, que comprende preferentemente SEQ ID NO: 28; y los antígenos cuarto y sexto se fusionan en un segundo antígeno de fusión Gag-Pol, que comprende preferentemente SEQ ID NO: 29. En ciertas realizaciones particulares, el primer antígeno Env del VIH está codificado por SEQ ID NO: 41. En una o más realizaciones particulares, el segundo antígeno Env del VIH está codificado por SEQ ID NO: 39; el primer antígeno de fusión Gag-Pol está codificado por SEQ ID NO: 38; y el segundo antígeno de fusión Gag-Pol está codificado por SEQ ID NO: 40.

[0016] En realizaciones en las que el vector poxvirus es un vector MVA, tal como un vector MVA que comprende MVA-BN™ o derivados del mismo, el primer antígeno de fusión Gag-Pol y el segundo antígeno Env se insertan preferentemente en la región intergénica (IGR) 44/45 del genoma MVA, y el segundo antígeno de fusión Gag-Pol y el primer antígeno Env se insertan preferentemente en la IGR 88/89 del genoma MVA. Más preferiblemente, el primer antígeno de fusión Gag-Pol y el segundo antígeno de fusión Gag-Pol están cada uno bajo el control de un promotor separado, preferiblemente un promotor Prl3.5, y el primer antígeno Env y el segundo antígeno Env están cada uno bajo el control de un promotor separado, preferiblemente un promotor PrHyb.

[0017] Otro aspecto general de la invención se refiere a una composición, preferiblemente una composición de vacuna, que comprende una cantidad inmunogénicamente eficaz de un vector de poxvirus que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína sintética de la envoltura del VIH según una realización de la invención y preferiblemente comprende además una secuencia de ácido nucleico que codifica uno o más antígenos adicionales del VIH, y un portador, en el que el ácido nucleico que codifica la proteína sintética de la envoltura del VIH está unido operablemente a una secuencia promotora. En una realización, la composición comprende además un vector de adenovirus, preferentemente un vector de adenovirus 26, que codifica una proteína sintética de la envoltura del VIH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 18. En ciertas realizaciones, la composición comprende un vector poxvirus, preferentemente un vector MVA, que codifica una proteína sintética de la envoltura del VIH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 18, y preferiblemente que codifiquen otros antígenos del VIH. En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención comprenden además vectores de expresión adicionales que codifican antígenos adicionales del VIH y/o polipéptido antigénico aislado del VIH.

[0018] En otro aspecto general, la invención se refiere a una combinación de vacunas para inducir una respuesta inmunitaria contra un virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) en un sujeto que la necesite. En una realización, la combinación de vacunas comprende:

a. una primera composición de vacuna que comprende una cantidad inmunogénicamente eficaz de un vector, preferiblemente un vector poxvirus, más preferiblemente un vector MVA, que codifica (i) una primera proteína de la envoltura del VIH (Env) que es una proteína sintética de la envoltura del VIH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 18 y preferentemente que comprenda además ácido nucleico que codifique: (ii) un segundo antígeno VIH Env diferente del primer antígeno VIH Env; (iii) un tercer antígeno y un cuarto antígeno, siendo dos antígenos Gag del VIH diferentes; y iv) un quinto antígeno y un sexto antígeno, que son dos antígenos Pol del VIH diferentes; y al menos uno de: b. (i) una segunda composición de vacuna que comprende una cantidad inmunogénica aliadamente eficaz de uno o más vectores, preferiblemente uno o más vectores de adenovirus, más preferiblemente uno o más vectores de adenovirus 26, que codifican uno o más de los antígenos del VIH primero, segundo, tercero, cuarto, quinto y sexto, preferiblemente que codifican uno o más antígenos del VIH que comprenden una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NOs: 1-5, 18, 28 y 29; y/o

c. (ii) una tercera composición de vacuna que comprende uno o más polipéptidos que comprenden una cantidad inmunogénicamente eficaz de un polipéptido antigénico aislado del VIH, por ejemplo, un polipéptido que comprende los residuos 30-708 de la secuencia de aminoácidos de<s>E<q>ID NO: 7, y/o un polipéptido que comprende los residuos 30-724 de SEQ ID NO: 36, en el que la primera composición y la segunda y/o tercera composiciones están presentes en la misma composición o en una o más composiciones diferentes.

[0019] En una realización en la que la combinación de vacuna comprende una segunda composición de vacuna, la segunda composición de vacuna comprende uno o más vectores de adenovirus 26 recombinantes que codifican uno o más antígenos que comprenden las secuencias de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste en SEQ ID NOs: 1-5, 18, 28 y 29, comprendiendo más preferiblemente dos, tres o cuatro vectores recombinantes de adenovirus 26 que codifican conjuntamente los SEQ ID n Os: 1, 2, 3, 4, 5 y 18;

[0020] Otro aspecto general de la invención se refiere a métodos para inducir una respuesta inmunitaria contra un virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) en un sujeto que lo necesita, que comprenden la administración al sujeto de una composición, como una composición de vacuna o una combinación de vacuna según una realización de la invención. La invención también se refiere a métodos para inducir una respuesta inmunitaria contra un VIH que comprenden el cebado y el refuerzo de la respuesta inmunitaria utilizando una composición o una combinación de vacunas según una realización de la invención.

[0021] En una realización particular, un método para inducir una respuesta inmunitaria contra un VIH en un sujeto que lo necesita comprende administrar al sujeto:

a. una primera vacuna que comprende uno o más vectores de adenovirus recombinantes, preferentemente vectores Ad26, que codifican uno o más de los SEQ ID NOs: 1,2, 3, 4, 5 y 18; y

b. una segunda vacuna que comprende un vector poxvirus, preferentemente un vector MVA, que codifica una primera proteína de la envoltura del VIH (Env) que es una proteína sintética de la envoltura del VIH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 18 y preferentemente la codificación de otros antígenos del VIH, preferiblemente un segundo antígeno Env del VIH diferente del primer antígeno Env del VIH, un tercer antígeno y un cuarto antígeno que sean dos antígenos Gag del VIH diferentes, y un quinto antígeno y un sexto antígeno que sean dos antígenos Pol del VIH diferentes, más preferiblemente uno o más antígenos del VIH que codifiquen las secuencias de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste en SEQ ID NOs: 1-5, 28 y 29,

en los que la primera vacuna es una vacuna de cebado y la segunda una vacuna de refuerzo, o en los que la segunda vacuna es una vacuna de cebado y la primera una vacuna de refuerzo. En ciertas realizaciones, uno o más polipéptidos antigénicos aislados del VIH comprenden preferentemente una cantidad inmunogénicamente eficaz de un polipéptido antigénico aislado del VIH, por ejemplo, un polipéptido que comprende los residuos 30-708 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 7, y/o un polipéptido que comprende los residuos 30-724 de SEQ ID NO: 36 se administran al sujeto aproximadamente al mismo tiempo que la vacuna de refuerzo en la misma composición que la vacuna de refuerzo o en una composición separada de la vacuna de refuerzo. Cualquier referencia en la descripción a métodos de tratamiento se refiere a los compuestos, composiciones farmacéuticas y medicamentos de la presente invención para su uso en un método de tratamiento del cuerpo humano (o animal) mediante terapia.

[0022] Otro aspecto de la invención se refiere a una célula, preferiblemente una célula aislada, que comprende un vector según una realización de la invención.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS VARIAS VISTAS DE LOS DIBUJOS

[0023] El resumen anterior, así como la siguiente descripción detallada de la invención, se entenderán mejor cuando se lean junto con los dibujos adjuntos. Debe entenderse que la invención no se limita a las realizaciones precisas que se muestran en los dibujos.

[0024] En los dibujos:

[0025] Las FIGS. 1A-1C son representaciones esquemáticas de la estructura de las proteínas de la envoltura del VIH; FIG. 1A muestra una proteína de la envoltura del VIH de longitud completa; FIG. 1B muestra la estructura de una proteína soluble de cadena simple de la envoltura del VIH según una realización de la invención en la que el dominio transmembrana (TM) se sustituye por un dominio de trimerización GCN4, y el sitio de escisión furina está mutado (sC4); FIG. 1C muestra la estructura de una proteína de la envoltura del VIH unida a la membrana según una realización de la invención que comprende un dominio transmembrana y un fragmento de un dominio citoplasmático (C4D7);

[0026] La FIG. 2 muestra los niveles de expresión de la proteína soluble de la envoltura del VIH sC1, que se basa en la secuencia del antígeno del mosaico mos2Env con un dominio de trimerización C-terminal adicional, y una proteína sintética soluble de la envoltura del VIH (sC4) según una realización de la invención; la expresión se midió por Western blot cuantitativo utilizando un anticuerpo policlonal contra gp120; los plásmidos que codifican sC1 o sC4 se expresaron transitoriamente dos veces, y cada transfección se cuantificó dos veces por densitometría; la proteína sC1 mostró muy baja en comparación con la proteína sintética de la envoltura del VIH sC4, que mostró niveles de expresión relativamente altos;

[0027] Las FIGS.3A y 3B muestran la unión de proteínas sintéticas de la envoltura del VIH con el anticuerpo monoclonal 17b (mAbl7b) en presencia (gris claro) y ausencia (gris oscuro) de CD4 soluble según se determina mediante ensayo ELISA; FIG. 3a muestra la unión de sC1; FIG. 3B muestra la unión de sC4;

[0028] La FIG. 4 es una imagen de un Western blot de una electroforesis en gel de poliacrilamida nativa de la proteína sC1, y de la proteína sintética de la envoltura del VIH sC4;

[0029] La FIG. 5 muestra los niveles relativos de expresión en la superficie celular de las proteínas sintéticas de la envoltura del VIH C1, C1D7, C4 y C4D7 unidas a la membrana mediante análisis FACS de células que expresan estas proteínas utilizando un anticuerpo policlonal anti-gp120 (GP120), y mediante la unión a anticuerpos ampliamente neutralizantes PG9 (PG9) y PG 16 (PG 16) que son dependientes de la estructura cuaternaria y se unen preferentemente al trímero Env correctamente plegado;

[0030] La FIG. 6 es una representación gráfica de la estabilidad de vectores de adenovirus que contienen secuencias que codifican proteínas sintéticas de la envoltura del VIH de la invención incluyendo C4 de longitud completa (FLC4), C4D7, y sC4 después de múltiples pasajes virales; se generaron vectores de adenovirus 26 recombinantes en células PER.C6; después de los 3 pasajes iniciales para transfección y purificación de placas, se seleccionaron 5 placas y se aumentaron para 10 pasajes en formato T25, lo que dio como resultado un número total de pasajes virales (vpn) de 13; se muestra la estabilidad después de vpn 3, 5, 10, y 13 según lo determinado por la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) del casete de transgenes El; por ejemplo, 3/5 significa que 3 placas fueron estables de 5 placas probadas, y 5/5 significa que 5 placas fueron estables de 5 placas probadas;

[0031] Las FIGS. 7A y 7B muestran los títulos de neutralización del virus frente a partículas víricas pseudotipadas (EVP) de la envoltura del VIH-1 en un ensayo de neutralización basado en células TZM-b1 en conejos; los valores IC<50>log 10-transformados de los grupos con dosis altas de vectores adenovirales se midieron frente a EVP VSV-G (control negativo) y MW965.26 (clado C de nivel 1A) en las semanas 1, 8, 14 y 20; cada punto representa el valor log 10-transformado de la IC<50>de un conejo individual, con la media del grupo indicada por una línea horizontal; HD: Dilución máxima probada (línea continua superior); LD: Dilución mínima probada (línea sólida inferior); LOB: límite de fondo, valor del percentil 95 de las muestras negativas compiladas (línea de puntos); los valores de LoglO IC<50>que superaban el umbral LD o HD se fijaron en la línea correspondiente; para cada punto temporal se realizó una comparación no paramétrica unidireccional con el control utilizando el método de Dunn para la clasificación conjunta; las diferencias estadísticamente significativas se indican en los gráficos: * = P<0,05, ** = P<0,01, y *** P<0.001; La FIG. 7A muestra los resultados con VSV-G (control negativo); y la FIG. 7B muestra los resultados con MW965.26 (clado C de nivel 1A).

[0032] La FIG. 8 es una representación gráfica de las inserciones en lugares específicos del genoma MVA para el vector MVA-mBN414; Prl3.5 y PrHyb son secuencias promotoras; IGRs son regiones intergénicas;

[0033] Las FIGS. 9A, 9B y 9C muestran las respuestas inmunitarias obtenidas en conejos en el día 85 tras la inmunización con Ad26.Mos.VIH (abreviado como Ad26), ya sea solo o combinado con MVA-mBN414 (abreviado en las FIGS. 9A-9C como "MVA"), el clado C gp140 (abreviado como GP140) o una combinación de los mismos; Machos (M) y Hembras (F) se muestran por separado; FIGS. 9A y 9B muestran los títulos ELISA específicos de gp140 del clado C y de gp140 del mosaico, respectivamente; cada punto representa el valor de potencia relativa transformado en log 10 (log 10 EU/ml) de un conejo individual, con la media del grupo indicada como línea horizontal; ULOQ, límite superior de cuantificación (línea continua superior), LLOQ, límite inferior de cuantificación (línea continua inferior), LOB, límite de fondo (línea de puntos); todos los valores por debajo del LOB se fijaron en el nivel LOB;

el análisis estadístico consistió en un modelo Tobit entre sexos; para la comparación de los grupos 1,2 y 3 se aplicó una corrección de Tukey; las diferencias estadísticamente significativas se indican en los gráficos: *P<0,05, **P<0,01, ***P<0,001; la FIG. 9C muestra los títulos de neutralización del virus frente a partículas de virus pseudotípicas de la envoltura BaL del VIH-1 en un ensayo de neutralización basado en células TZM-bl utilizando suero de conejo; cada punto representa el valor IC<50>loglO-transformado de un conejo individual, con la media del grupo indicada por una línea horizontal; HD: Dilución máxima probada (línea continua superior); LD: Dilución mínima probada (línea sólida inferior); LOB: límite de fondo, valor del percentil 95 de las muestras negativas compiladas (línea de puntos); los valores de loglO IC50 que superaban el umbral LD o HD se fijaron en la línea correspondiente; el análisis estadístico consistió en un modelo Tobit entre sexos; para la comparación de los grupos 1, 2 y 3, se aplicó una corrección de Tukey; las diferencias estadísticamente significativas se indican en los gráficos: *P<0,05, **P<0,01, ***P<0,001; y

[0034] Las FIGS. 10A-10E muestran las respuestas inmunitarias suscitadas en ratones tras la inmunización con primo solamente (semana 5) o primo-boost (semana 7) con Ad26.Mos4.VIH (abreviado como Ad26) seguido de MVA-mBN414 primo-boost u homólogo MVA-mBN414 (abreviado en las FIGS. 10A-10E como "MVA"); los grupos 1 y 2 se cebaron en la semana 0 con 2,5x109 o 2,5x108 vp de Ad26.Mos4.VIH , respectivamente, y se reforzaron en la semana 5 con 2,8x106 o 2,8x105 TCID<50>de MVA-mBN414, respectivamente; los grupos 3 y 4 se inmunizaron en la semana 0 y 5 con 2,8x106 o 2. 8x105 TCID<50>de MVA-mBN414, respectivamente; el Grupo 5 (control) fue cebado con 2,5x109 Ad26.Empty y reforzado con 2,8x106 TCID<50>de MVA- 9 BN™-empty; las FIGS. 10A y<1 0>B muestran los títulos ELISA específicos de la gp 140 del mosaico; cada punto representa el título final transformado log 10 de un ratón individual, con la media del grupo indicada como línea horizontal; UD, límite superior de dilución; LD, dilución más baja; todos los valores por debajo del LD se fijaron en el nivel LD; el análisis estadístico consistió en un modelo Tobit entre dosis; las diferencias estadísticamente significativas se indican en los gráficos: *P<0,05, **P<0,01, ***P<0,001; Las FIGS. 10C-10E muestran los datos ELISPOT de interferón-gamma (IFN-y) en la semana 7 del estudio; cada punto representa el recuento de células formadoras de manchas (SFC) por 106 esplenocitos de un ratón individual, con la media del grupo indicada como línea horizontal; LOD: límite de detección, valor del percentil 95 de controles compilados no estimulados (línea de puntos); las respuestas específicas de Env, Gag y Pol se determinaron mediante estimulación con los péptidos inmunodominantes Env, Gag y Pol IHIGPGRAFYTAGDI (SEQ ID NO: 44), AMQMLKETI (SEQ ID NO: 45) e YYDPSKDLI (SEQ ID NO: 46), respectivamente; las diferencias estadísticamente significativas se indican en los gráficos: *P<0,05, **P<0,01, ***P<0,001.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

[0035] Diversas publicaciones, artículos y patentes se citan o describen en los antecedentes y a lo largo de la especificación; para referencia del experto. La discusión de documentos, actos, materiales, dispositivos, artículos o similares que se ha incluido en la presente especificación tiene por objeto proporcionar contexto a la invención. Dicha discusión no constituye una admisión de que alguna o todas estas cuestiones formen parte del estado de la técnica con respecto a cualquier invención divulgada o reivindicada.

[0036] A menos que se definan de otro modo, todos los términos técnicos y científicos utilizados en el presente documento tienen el mismo significado que comúnmente se entiende para un experto en la materia a la que pertenece esta invención. Por lo demás, algunos términos utilizados en el presente documento tienen el significado que se indica en la especificación. Todas las patentes, solicitudes de patentes publicadas y publicaciones citadas en el presente documento son para referencia del experto. Cabe señalar que, tal como se utilizan en el presente documento y en las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares "un", "una" y "el" incluyen referencias plurales, a menos que el contexto indique claramente lo contrario.

[0037] A lo largo de esta especificación y de las reivindicaciones que siguen, a menos que el contexto requiera lo contrario, se entenderá que la palabra "comprende", y variaciones tales como "comprende" y "que comprende", implican la inclusión de un número entero o paso o grupo de números enteros o pasos, pero no la exclusión de cualquier otro número entero o paso o grupo de números enteros o pasos. En el presente documento, el término "que comprende" puede sustituirse por "que contiene" o "que incluye" o, a veces, por "que tiene".

[0038] Cuando se utiliza aquí "compuesto de" excluye cualquier elemento, paso o ingrediente no especificado en el elemento de la reivindicación. Cuando se utiliza en el presente documento, la expresión "consistente esencialmente en" no excluye materiales o pasos que no afecten materialmente a las características básicas y novedosas de la reivindicación. Cualquiera de los términos antes mencionados "que comprende", "que contiene", "que incluye" y "que tiene", siempre que se utilicen aquí en el contexto de un aspecto o realización de la invención, pueden sustituirse por el término "que consiste en" o "que consiste esencialmente en" para variar el alcance de la divulgación.

[0039] Tal como se utiliza en el presente documento, el término conjuntivo "y/o" entre múltiples elementos citados se entiende que abarca tanto opciones individuales como combinadas. Por ejemplo, cuando dos elementos están unidos por "y/o", una primera opción se refiere a la aplicabilidad del primer elemento sin el segundo. Una segunda opción se refiere a la aplicabilidad del segundo elemento sin el primero. Una tercera opción se refiere a la aplicabilidad conjunta de los elementos primero y segundo. Se entiende que cualquiera de estas opciones entra dentro del significado, y por lo tanto satisface el requisito del término "y/o" tal y como se utiliza aquí. La aplicabilidad concurrente de más de una de las opciones también se entiende incluida en el significado y, por tanto, satisface el requisito del término "y/o".

[0040] Como se usa aquí, "sujeto" significa cualquier animal, preferiblemente un mamífero, más preferiblemente un humano, al que se le administrará o se le ha administrado un vector, composición o combinación de vacuna según realizaciones de la invención. El término "mamífero", tal y como se utiliza aquí, engloba a cualquier mamífero. Ejemplos de mamíferos incluyen, pero no se limitan a, vacas, caballos, ovejas, cerdos, gatos, perros, ratones, ratas, conejos, cobayas, monos, humanos, etc., más preferiblemente un humano.

[0041] La invención se refiere en general a proteínas sintéticas de la envoltura del VIH, ácido nucleico y vectores que codifican las proteínas sintéticas de la envoltura del VIH, y métodos para inducir una respuesta inmunitaria contra el VlH con vectores que codifican las proteínas sintéticas de la envoltura del VIH y opcionalmente codifican antígenos adicionales del VIH, solos o en combinación con uno o más vectores adicionales que codifican uno o más antígenos adicionales del VIH y/o en combinación con uno o más polipéptidos antigénicos aislados adicionales del VIH.

[0042] El virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) es un miembro del género Lentivirinae, que forma parte de la familia de los Retroviridae. Dos especies de VIH infectan a los humanos: VIH-1 y VIH-2. El VIH-1 es la cepa más común del virus VIH, y se sabe que es más patógena que el VIH-2. En el presente documento, los términos "virus de la inmunodeficiencia humana" y "VIH" hacen referencia, aunque sin limitarse a ellos, al VIH-1 y al VIH-2.

[0043] El VIH se clasifica en múltiples clados con un alto grado de divergencia genética. En el presente documento, los términos "clado del VIH" o "subtipo del VIH" se refieren a virus de la inmunodeficiencia humana relacionados y clasificados según su grado de similitud genética. Actualmente existen tres grupos de aislados del VIH-1: M, N y O. El grupo M (cepas principales) consta de al menos diez clados, del A al J. El grupo O (cepas externas) puede constar de un número similar de clados. El grupo N es un nuevo aislado de VIH-1 que no ha sido categorizado ni en el grupo M ni en el O.

[0044] Tal como se utilizan aquí, los términos "polipéptido antigénico del VIH", "proteína antigénica del VIH", "antígeno del VIH" e "inmunógeno del VIH" se refieren a un polipéptido capaz de inducir una respuesta inmunitaria, por ejemplo, una respuesta mediada humoral y/o celular, contra el VIH en un sujeto. El polipéptido o antígeno antigénico puede ser una proteína del VIH, un fragmento o epítopo de la misma, o una combinación de múltiples proteínas del VIH o porciones de las mismas que pueden inducir una respuesta inmunitaria o producir una inmunidad, por ejemplo, inmunidad protectora, contra el VIH en un sujeto.

[0045] Preferiblemente, un polipéptido o antígeno antigénico es capaz de suscitar en un huésped una respuesta inmunitaria protectora, por ejemplo, inducir una respuesta inmunitaria contra una enfermedad o infección vírica, y/o producir una inmunidad en (es decir, vacunar) un sujeto contra una enfermedad o infección vírica, que proteja al sujeto contra la enfermedad o infección vírica. Por ejemplo, el polipéptido o antígeno antigénico puede comprender una proteína o fragmentos de la misma del virus de la inmunodeficiencia simia (VIS) o de un VIH, como la proteína gp160 de la envoltura del VIH o del VIS, las proteínas de la matriz/cápside del VIH o del VIS y los productos génicos gag, pol y env del VIH o del VIS.

[0046] Un polipéptido o antígeno antigénico del VIH puede ser cualquier antígeno del VIH-1 o VIH-2 o fragmento del mismo. Algunos ejemplos de antígenos del VIH son, entre otros, los productos génicos gag, pol y env , que codifican proteínas estructurales y enzimas esenciales. Los productos de los genes gag, pol y env se sintetizan como poliproteínas, que a su vez se procesan en otros muchos productos proteínicos. El principal producto proteínico del gen gag es la proteína estructural viral gag poliproteína, que se procesa posteriormente en productos proteínicos MA, CA, SP1, NC, SP2 y P6. El gen Pol codifica enzimas virales (Pol, polimerasa), y el producto proteico primario se procesa posteriormente en productos proteicos RT, RNasa H, IN y PR. El gen env codifica proteínas estructurales, concretamente glicoproteínas de la envoltura del virión. El producto proteínico primario del gen env es gp160, que se procesa posteriormente en gp120 y gp41. Otros ejemplos de antígenos del VIH incluyen las proteínas reguladoras de genes Tat y Rev; las proteínas accesorias Nef, Vpr, Vif y Vpu; las proteínas de la cápside, las proteínas de la nucleocápside y la proteína vírica p24.

[0047] En ciertas realizaciones, el polipéptido o antígeno antigénico del VIH comprende un antígeno Gag, Env o Pol del VIH, o cualquier porción antigénica o epítopo o combinación de los mismos, preferentemente un antígeno Gag, Env o Pol del VIH-1 o cualquier porción antigénica o epítopo o combinación de los mismos.

[0048] Los polipéptidos antigénicos del VIH también pueden ser antígenos mosaicos del VIH. Tal y como se utiliza aquí, "antígeno mosaico" se refiere a una proteína recombinante ensamblada a partir de fragmentos de secuencias naturales. Los antígenos en mosaico se parecen a los antígenos naturales, pero están optimizados para maximizar la cobertura de los epítopos potenciales de células T que se encuentran en las secuencias naturales, lo que mejora la amplitud y la cobertura de la respuesta inmunitaria. Los antígenos mosaicos del VIH para su uso con la invención son preferiblemente antígenos mosaicos de Gag, Pol y/o Env, y más preferiblemente antígenos mosaicos de Gag, Pol y/o Env del VIH-1. Tal como se utiliza en el presente documento, "un antígeno mosaico Gag, Pol y/o Env del VIH" se refiere específicamente a un antígeno mosaico que comprende múltiples epítopos derivados de una o más de las secuencias de poliproteínas Gag, Pol y/o Env del VIH.

[0049] En una realización, un antígeno VIH mosaico para uso con la invención es un antígeno VIH Gag mosaico con epítopos derivados de las secuencias de productos del gen gag (se proporcionan ejemplos en SEQ ID NOs: 1, 2); un antígeno Pol del VIH mosaico con epítopos derivados de las secuencias de los productos del gen pol (se proporcionan ejemplos en SEQ ID NO: 3, 4); o un antígeno Env del VIH en mosaico con epítopos derivados de las secuencias de los productos del gen env (se proporcionan ejemplos en SEQ ID NOs: 5, 6; también los antígenos sintéticos de la invención, por ejemplo en SEQ ID NOs: 8, 17, 18, 19, pueden considerarse antígenos Env del VIH en mosaico). En ciertas realizaciones, un antígeno mosaico del VIH para su uso con la invención comprende una combinación de epítopos derivados de secuencias de productos génicosgag, poly/oenv.Los ejemplos ilustrativos y no limitantes incluyen antígenos mosaicos Env-Pol con epítopos derivados de las secuencias de los productos génicosenvypol;antígenos mosaicos Gag-Pol con epítopos derivados de las secuencias de los productos génicosgagypol(los ejemplos se proporcionan en SEQ ID NOs: 28, 29); y antígenos mosaico Gag-Env con epítopos derivados de las secuencias de los productos génicos gag y env. Las secuencias de los productos génicos gag, pol y env pueden derivar de uno o más clados.

[0050] Entre los ejemplos de antígenos Gag, Pol y/o Env mosaicos del VIH que pueden utilizarse en la invención se incluyen los descritos en, por ejemplo, US20120076812; Barouch et al., Nat Med 2010, 16:319-323; y Barouch et al., Cell 155:1-9, 2013. Preferiblemente, los antígenos Gag, Pol y/o Env mosaicos del VIH para su uso con la presente invención incluyen, pero no se limitan a, mos1Gag (SEQ ID NO: 1), mos2Gag (SEQ ID NO: 2), mos1Pol (SEQ ID NO: 3), mos2Pol (SEQ ID NO: 4), mos1Env (SEQ ID NO: 5), mos2Env (SEQ ID NO: 6), mos1GagPol (SEQ ID NO: 28), mos2GagPol (SEQ ID NO: 29), y sus combinaciones.

[0051] Tal como se utiliza en el presente documento, cada uno de los términos "proteína de la envoltura del VIH", "proteína env" y "Env" se refiere a una proteína que se expresa en la envoltura de un virión del VIH y permite que el VIH se dirija a la membrana plasmática de las células infectadas por el VIH y se adhiera a ella, o a un fragmento o derivado de la misma que puede inducir una respuesta inmunitaria o producir inmunidad contra el VIH en un sujeto que lo necesite. El gen env del VIH codifica la proteína precursora gp160, que se escinde proteolíticamente en las dos glicoproteínas maduras de la envoltura, gp120 y gp41. La reacción de escisión está mediada por una proteasa de la célula huésped, la furina, en una secuencia muy conservada en las glicoproteínas precursoras de la envoltura retroviral. Más concretamente, gp160 se trimeriza a (gp 160)3 y luego se escinde en las dos gp120 y gp41 asociadas de forma no covalente. Posteriormente, la entrada viral está mediada por un trímero de heterodímeros gp120/gp41. Gp120 es el fragmento de unión al receptor, y se une al receptor CD4 en una célula diana que tenga dicho receptor, como, por ejemplo, una célula T colaboradora. La Gp41, que está unida de forma no covalente a la gp120, es el fragmento de fusión y proporciona el segundo paso por el que el VIH entra en la célula. La Gp41 está originalmente enterrada en la envoltura vírica, pero cuando la gp120 se une a un receptor CD4, la gp120 cambia su conformación haciendo que la gp41 quede expuesta, donde puede contribuir a la fusión con la célula huésped. Gp140 es el ectodominio no escindido de gp160 trimérico, es decir, (gp160), que se ha utilizado como sustituto del estado nativo de la espiga viral escindida.

[0052] Según realizaciones de la invención, una "proteína de envoltura del VIH" puede ser una proteína gp160, gp140, gp120, gp41, combinaciones, fusiones, truncamientos o derivados de las mismas. Por ejemplo, una "proteína de la envoltura del VIH" puede incluir una proteína gp120 asociada de forma no covalente con una proteína gp41. También puede incluir una proteína gp140 trimérica estabilizada que puede tener o puede modificarse para incluir un dominio de trimerización que estabilice los trímeros de gp140. Ejemplos de dominios de trimerización incluyen, pero no se limitan a, el dominio de trimerización "foldon" T4-fibritina; el dominio de trimerización coiled-coil derivado de GCN4; y la subunidad catalítica del aspartato transcarbamoilasa de E. coli como etiqueta de trimerización. Una "proteína de la envoltura del VIH" también puede ser una proteína truncada de la envoltura del VIH, incluidas, entre otras, las proteínas de la envoltura que comprenden un truncamiento C-terminal en el ectodominio (es decir, el dominio que se extiende en el espacio extracelular), un truncamiento en la gp41, como un truncamiento en el dominio transmembrana de la gp41, o un truncamiento en el dominio citoplasmático de la gp41. Una "proteína de la envoltura del VIH" puede ser además un derivado de una proteína de la envoltura del VIH natural que tenga mutaciones de secuencia, por ejemplo, en los sitios de escisión de la furina, y/o las denominadas mutaciones SOSIP.

[0053] Preferiblemente, una "proteína de la envoltura del VIH" es una "proteína sintética de la envoltura del VIH". Tal como se utiliza en el presente documento, el término "proteína sintética de la envoltura del VIH" se refiere a una proteína de la envoltura del VIH no natural que está optimizada para inducir una respuesta inmunitaria o producir una inmunidad contra una o más cepas naturales del VIH en un sujeto que la necesite. Las proteínas VIH Env en mosaico son ejemplos de proteínas VIH Env sintéticas, y la invención proporciona antígenos VIH Env sintéticos, por ejemplo, los que comprenden SEQ ID NOs: 8, 17, 18 o 19.

[0054] Como se usa aquí, "TCID<50>" se refiere a la Dosis Infecciosa de Cultivo de Tejido 50 dada como TCID<50>. La TCID<50>puede determinarse mediante diversos métodos conocidos por el experto, como por ejemplo un ensayo de Dosis Infecciosa 50 en Cultivo de Tejidos (TCID<50>). El ensayo TCID<50>es un método para valorar la infectividad de los vectores del virus Vaccinia Ankara modificado (MVA), utilizando diluciones de 10 veces en un formato de 96 pocillos, tal como se describe en el Ejemplo 2 del documento WO 03/053463. La infectividad de un poxvirus como el MVA puede determinarse utilizando diversos métodos conocidos por el experto, como por ejemplo mediante un ensayo basado en citometría de flujo o un ensayo de dosis infecciosa 50 en cultivo tisular (TCID<50>). En un aspecto ejemplar, se realiza una valoración de MVA en un ensayo basado en TCID<50>utilizando diluciones de 10 veces en un formato de 96 pocillos. Al final del ensayo, las células infectadas se visualizan utilizando un anticuerpo anti-vaccinia y una solución de tinción adecuada. Las células CEF primarias se preparan y cultivan en RPMI con un 10% de suero y un 1% de Gentamicina utilizando frascos en T durante 2-3 días a una densidad determinada tras la tripsinización y siembra en placas de 96 pocillos a una densidad de Ix105 células/mL utilizando RPMI con un 7% de suero. El título esperado de la muestra dicta el número de diluciones seriadas de 10 veces, que se realizan a través de una placa de pocillos profundos desde la columna 1 hasta, por ejemplo, la 10, utilizando 100 pL para la transferencia al pocillo siguiente. Tras la dilución, se siembran 100 pL por pocillo de placas de 96 pocillos. Las células se incuban durante 5 días a 34-38 °C y 4-6 % de CO<2>para permitir la infección y la replicación viral.

[0055] Cinco días después de la infección, las células se tiñen con un anticuerpo específico MVA. Para la detección del anticuerpo específico, se utiliza un anticuerpo secundario acoplado a peroxidasa de rábano picante (HRP). El anticuerpo específico<m>V<a>puede ser un anticuerpo anti-vaccinia virus, policlonal de conejo, o una fracción IgG (Quartett, Berlín, Alemania #9503-2057), por ejemplo. El anticuerpo secundario puede ser anticuerpo IgG anti-conejo, o policlonal de cabra acoplado a HRP (Promega, Mannheim, Alemania, # W4011), por ejemplo. El anticuerpo secundario se visualiza utilizando un sustrato TMB precipitante. Cada pocillo con células positivas en la reacción de color se marca como positivo para el cálculo de la TCID<50>. El título se calcula utilizando el método de cálculo de Spearman-Kaerber. Los datos también pueden representarse como un logaritmo del título del virus, que es la diferencia relativa para cualquier punto temporal dado con respecto al punto temporal T=0.

[0056] Un método alternativo para la cuantificación de la concentración de virus es el ensayo de placa viral, que es un método estándar bien conocido por el experto para determinar la concentración de virus en términos de dosis infecciosa. Brevemente, una monocapa confluente de células huésped se infecta con el virus en varias diluciones y se cubre con un medio semisólido. Se forma una placa vírica cuando un virus infecta una célula de la monocapa celular y el número de placas puede contarse en combinación con el factor de dilución para calcular el número de unidades formadoras de placas por volumen de muestra (ufp/mL). La pfu/mL representa el número de partículas infecciosas en la muestra. Debido a las diferencias en los métodos y principios de ensayo, la TCID<50>y las ufp/mL u otros resultados de ensayos de infecciosidad no son necesariamente equivalentes. Para MVA, se pueden utilizar ambos métodos (TCID<50>y ensayo de placa viral), y generalmente la dosis de un vector MVA para administración clínica a humanos se proporciona en ufp, o en TCID<50>. La dosis de un vector de adenovirus también puede indicarse en ufp o TCID<50>. Para la administración a humanos, generalmente la dosis de un vector de adenovirus se da en partículas virales (vp), y las concentraciones se expresan en vp/mL.

Proteínas sintéticas de la envoltura del VIH y sus secuencias codificantes

[0057] Las realizaciones de la invención se refieren a nuevos vectores poxvirus, preferentemente vectores MVA, que comprenden secuencias de ácido nucleico que codifican proteínas sintéticas de la envoltura del VIH y preferentemente que comprenden secuencias de ácido nucleico que codifican otros antígenos del VIH.

[0058] En una realización, una proteína sintética de la envoltura del VIH comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 8, o SEQ ID NO:8 con una o más mutaciones seleccionadas del grupo que consiste en (i) I529P, (ii) K480E, y (iii) una combinación de EK479-480RRRR, I529P, A471C y T575C. La SEQ ID NO: 8 comprende un gp120 maduro sintético y un gp41 truncado sintético sin la región transmembrana, ni el dominio citoplasmático. SEQ ID NO: 8 es una secuencia no natural compuesta por una quimera de secuencias del antígeno mosaico mos2Env (SEQ ID NO: 6), y otras secuencias de proteínas de la envoltura del VIH. La secuencia del antígeno Env sintético que comprende SEQ ID NO: 8 está optimizado para proporcionar una amplia cobertura y una mejor respuesta de las células T contra el clado C del VIH (en comparación con el antígeno mos2Env (SEQ ID NO: 6)). En determinadas realizaciones, pueden añadirse más aminoácidos a SEQ ID NO: 8 o una de sus variantes definidas en el presente documento.

[0059] En ciertas realizaciones, la proteína sintética de la envoltura del VIH comprende además una secuencia señal. La proteína sintética de la envoltura del VIH se sintetiza con una secuencia señal que se escinde de la cadena polipeptídica naciente durante su transporte al lumen del retículo endoplásmico (RE). En principio, podría utilizarse cualquier secuencia señal conocida. Preferiblemente se utiliza una secuencia señal Env del VIH o una variante de la misma. En la técnica se han utilizado diferentes secuencias señal para las proteínas VIH Env (véase, por ejemplo, el documento WO 2014/107744). En ciertas realizaciones, la secuencia señal comprende SEQ<i>D NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11 o SEQ ID NO: 12. En una realización preferida, la secuencia señal comprende SEQ ID NO: 9.

[0060] En ciertas realizaciones, la proteína sintética de la envoltura del VIH comprende además un dominio transmembrana. El dominio transmembrana ancla la proteína sintética de la envoltura del VIH a la membrana del RE y contribuye al ensamblaje de la membrana y a la función de la envoltura del VIH. Preferiblemente, el dominio transmembrana comprende SEQ ID NO: 13.

[0061] En otra realización, la proteína sintética de la envoltura del VIH comprende una gp41 que tiene un dominio citoplasmático truncado. La gp41 tiene un dominio citoplasmático inusualmente largo en su extremo carboxilo, normalmente de unos 150 aminoácidos (Edwards et al., J. Virology, 2002, 76:2683-2691). Se ha informado de que el truncamiento del dominio citoplasmático induce la exposición de regiones conservadas en el ectodominio de la proteína Env del VIH-1(Id.).El dominio citoplasmático truncado en una envoltura sintética del VIH de la invención puede variar de uno a unos 140 aminoácidos, como 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130 o 140 aminoácidos de un dominio citoplasmático de longitud completa. En ciertas realizaciones, el dominio citoplasmático truncado se deriva de los aminoácidos 704-862 de SEQ ID NO: 17 (es decir, del dominio citoplasmático de la molécula C4 de la invención), por truncamiento después de un aminoácido dado hasta el C-terminal. En una realización preferida, la proteína sintética de la envoltura del VlH comprende un dominio citoplasmático truncado que tiene de 1 a 10 residuos de aminoácidos, más preferiblemente de 4 a 8 residuos de aminoácidos, y más preferiblemente 7 residuos de aminoácidos de un dominio citoplasmático gp41 del VIH. El dominio citoplasmático o fragmento del mismo de una proteína sintética de envoltura del VIH se sitúa C-terminal al dominio extracelular (ectodominio), y cuando la proteína sintética de envoltura del VIH también comprende un dominio transmembrana, el dominio citoplasmático o fragmento del mismo se sitúa C-terminal al dominio transmembrana. Véase, por ejemplo, las FIGS. 1A e 1C. En una realización particular, la proteína sintética de la envoltura del VIH comprende una gp41 con un dominio citoplasmático truncado que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 14 o un fragmento del mismo, como los residuos 1-4 del mismo (es decir, NRVR). Se han descrito otros dominios citoplasmáticos truncados que podrían utilizarse (por ejemplo, Schiemle et al., PNAS 1997; Abrahamyan et al., J Virol 2005).

[0062] En las realizaciones en las que la proteína sintética de la envoltura del VIH comprende además un dominio transmembrana y un fragmento de un dominio citoplasmático, se prefiere que la proteína comprenda también la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 37, que contiene los residuos 655-682 de la SEQ ID NO: 18, en la que la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 37 está fusionada al C-terminal de la SEQ ID NO: 8 y al N-terminal del dominio transmembrana.

[0063] En una realización particularmente preferida de la invención, la proteína sintética de la envoltura del VIH comprende además un dominio transmembrana, como el que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 13, y un dominio citoplasmático truncado o un fragmento de un dominio citoplasmático, como el que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: TAPDAAFD: residuos 14 de la SEQ ID No : 14 (i.e., NRVR). Lo más preferible es que la proteína sintética de la envoltura del VIH comprenda o consista en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 18, con o sin la secuencia señal (es decir, los aminoácidos residen 1-29 de la SEQ ID NO: 18).

[0064] En otra realización, la proteína sintética de la envoltura del VIH comprende un dominio de trimerización que sustituye a una región transmembrana Env. El dominio de trimerización aumenta la estabilidad de una estructura trimérica de Env. Preferiblemente, la proteína sintética de la envoltura del VIH comprende un polipéptido gp140 modificado para incluir un dominio de trimerización que estabiliza los trímeros de gp140. Ejemplos de dominios de trimerización incluyen, pero no se limitan a, el dominio de trimerización "foldon" de T4-fibritina, como el que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 16; el dominio de trimerización en espiral derivado de GCN4, como el que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 15; la subunidad catalítica del aspartato transcarbamoilasa de E. coli como etiqueta de trímero; o motivos de trimerización basados en matrillina. Si está presente, el dominio de trimerización suele estar situado C-terminal al dominio extracelular (véase FIG. 1B). En ciertas realizaciones preferidas en las que la proteína sintética de la envoltura del VIH comprende un dominio de trimerización, la proteína sintética de la envoltura del VIH comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 19, con o sin la secuencia señal (es decir, los residuos de aminoácidos 1-29 de SEQ ID NO: 19). Estas realizaciones con dominios de trimerización son útiles principalmente para variantes de ectodominios solubles de la proteína sintética de la envoltura del VIH. En ciertas realizaciones de tales variantes solubles de la invención, es posible mutar el sitio de escisión de furina (por ejemplo, mutación de Lys a Glu en la posición 480 en SEQ ID NO: 8) para inactivar este sitio de escisión, de modo que la proteína será una sola cadena; esto combina bien con un dominio de trimerización, especialmente con el dominio de trimerización GCN4 de la SEQ ID NO: 19.

[0065] Versiones alternativas de tales variantes de ectodominio soluble de la proteína sintética de envoltura del VIH sin uso de dominios de trimerización son también realizaciones de la invención, y pueden prepararse a partir de SEQ ID NO: 8 combinando mutaciones que optimizan el sitio de escisión de la furina (por ejemplo, sustituyendo el dipéptido Gly-Lys en las posiciones 479-480 por cuatro residuos Arg), así como las llamadas mutaciones SOSIP (por ejemplo, mutación I a P en la posición 529, y introducción de un puente disulfuro entre las posiciones 471 y 575 mediante la sustitución de los respectivos Ala y Thr en dichas posiciones en SEQ ID NO: 8 cada uno con un residuo de Cys). Se obtiene así una proteína con la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 8 con la siguiente combinación de mutaciones: EK479-480RRRR, I529P, A471C and T575C.

[0066] Una posible modificación para aumentar aún más el contenido de trímero de una proteína sintética de la envoltura del VIH de la invención (que comprende SEQ ID NO: 8), es la modificación de Ile a Pro en la posición 529. Esto puede ser eficaz tanto para las variantes solubles como para las unidas a membranas.

[0067] Vectores

[0068] En un aspecto general, la invención se refiere a vectores que comprenden una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína sintética de la envoltura del VIH, y preferentemente que comprenden una secuencia de ácido nucleico que codifica al menos un antígeno adicional del VIH. Según realizaciones de la invención, los vectores pueden comprender cualquiera de las proteínas sintéticas de la envoltura del VIH descritas en el presente documento. En una realización particular de la invención, el vector es un vector poxvirus, preferiblemente un vector MVA, que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína sintética de la envoltura del VIH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18 o número de ID de SEQ: 19, y más preferiblemente SEQ ID NO: 18 o los residuos de aminoácidos 30-711 de la SEQ ID NO: 18.

[0069] Según realizaciones de la invención, la secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína sintética de la envoltura del VIH está unida operablemente a un promotor, lo que significa que el ácido nucleico está bajo el control de un promotor. El promotor puede ser un promotor homólogo (es decir, derivado de la misma fuente genética que el vector) o un promotor heterólogo (es decir, derivado de un vector o fuente genética diferente). Ejemplos no limitantes de promotores adecuados para los vectores adenovirales incluyen el promotor del citomegalovirus (CMV) y el promotor del virus del sarcoma de Rous (RSV). Preferiblemente, el promotor está situado aguas arriba del ácido nucleico dentro de un casete de expresión. Una secuencia promotora CMV ejemplar que puede unirse operablemente a la secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína sintética de la envoltura del VIH se muestra en SEQ ID NO: 24.

[0070] Ejemplos no limitantes de promotores adecuados para los vectores de poxvirus incluyen el promotor 30K, el promotor I3, el promotor PrS, el promotor PrS5E, el promotor Pr7.5K, el promotor largo Pr13.5, el promotor PrHyb, el promotor 40K, el promotor MVA-40K, el promotor FPV 40K, el promotor 30k, el promotor PrSynllm y el promotor PrLE1. En los documentos WO 2010/060632, WO 2010/102822, WO 2013/189611 y WO 2014/063832 se describen promotores adicionales. En realizaciones más preferidas, los antígenos del VIH, cuando incorporados como parte de un vector poxvirus según la invención, están enlazados operablemente al promotor Prl3.51ong (SEQ ID NO: 42) y/o el promotor PrHyb (SEQ ID NO: 43).

[0071] Según realizaciones de la invención, un vector puede ser un vector de expresión. Los vectores de expresión incluyen, entre otros, vectores para la expresión de proteínas recombinantes y vectores para la administración de ácido nucleico en un sujeto para su expresión en un tejido del sujeto, como un vector viral. Los ejemplos de vectores virales adecuados para su uso con la invención incluyen, entre otros, vectores adenovirales, vectores de virus adenoasociados, vectores de poxvirus, vectores de MVA, vectores de virus entéricos, vectores de virus de la encefalitis equina venezolana, vectores de virus del bosque Semliki, vectores de virus del mosaico del tabaco, vectores lentivirales, etc. El vector también puede ser un vector no viral. Ejemplos de vectores no virales incluyen, entre otros, plásmidos, cromosomas artificiales bacterianos, cromosomas artificiales de levadura, bacteriófagos, etc.

[0072] En ciertas realizaciones de la invención, el vector es un vector de adenovirus. Un adenovirus según la invención pertenece a la familia de los Adenoviridae, y preferentemente es uno que pertenece al género Mastadenovirus. Puede ser un adenovirus humano, pero también un adenovirus que infecte a otras especies, incluidos, entre otros, un adenovirus bovino (por ejemplo, adenovirus bovino 3, BAdV3), un adenovirus canino (por ejemplo, CAdV2), un adenovirus porcino (por ejemplo, PAdV3 o 5) o un adenovirus simio (que incluye un adenovirus de mono y un adenovirus de simio).p. ej., CAdV2), un adenovirus porcino (p. ej., PAdV3 o 5), o un adenovirus simio (que incluye un adenovirus mono y un adenovirus simio, como un adenovirus chimpancé o un adenovirus gorila). Preferiblemente, el adenovirus es un adenovirus humano (HAdV, o AdHu), o un adenovirus simiesco como el adenovirus de chimpancé o gorila (ChAd, AdCh, o SAdV), o un adenovirus de mono rhesus (RhAd). En la invención, se entiende un adenovirus humano si se hace referencia a él como Ad sin indicación de especie, por ejemplo, la breve notación "Ad26" significa lo mismo que HAdV26, que es el adenovirus humano serotipo 26. También en el presente documento, la notación "rAd" significa adenovirus recombinante, por ejemplo, "rAd26" se refiere al adenovirus humano recombinante 26.

[0073] La mayoría de los estudios avanzados se han realizado utilizando adenovirus humanos, y se prefieren los adenovirus humanos según ciertos aspectos de la invención. En ciertas realizaciones preferidas, un adenovirus recombinante según la invención se basa en un adenovirus humano. En realizaciones preferidas, el adenovirus recombinante se basa en un adenovirus humano de serotipo 5, 11, 26, 34, 35, 48, 49, 50, 52, etc. Según una realización particularmente preferida de la invención, un adenovirus es un adenovirus humano del serotipo 26. Las ventajas de estos serotipos incluyen una baja seroprevalencia y/o bajos títulos de anticuerpos neutralizantes preexistentes en la población humana, y experiencia con el uso en sujetos humanos en ensayos clínicos.

[0074] Por lo general, los adenovirus de los simios también tienen una baja seroprevalencia y/o bajos títulos de anticuerpos neutralizantes preexistentes en la población humana, y se ha informado de una cantidad significativa de trabajos en los que se han utilizado vectores de adenovirus de chimpancé (por ejemplo, US6083716; WO 2005/071093; WO 2010/086189; WO 2010085984; Farina et al, 2001, J Virol 75: 11603-13; Cohen et al, 2002, J Gen Virol 83: 151-55; Kobinger et al, 2006, Virology 346: 394-401; Tatsis et al., 2007, Molecular Therapy 15: 608-17; véase también la revisión de Bangari y Mittal, 2006, Vaccine 24: 849-62; y revisión de Lasaro y Ertl, 2009, Mol Ther 17: 1333-39). Por lo tanto, en otras realizaciones, el adenovirus recombinante según la invención se basa en un adenovirus simiesco, por ejemplo, un adenovirus de chimpancé. En ciertas realizaciones, el adenovirus recombinante se basa en adenovirus simios de tipo 1, 7, 8, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27.1,28.1, 29, 30, 31.1, 32, 33, 34, 35.1, 36, 37.2, 39, 40.1, 41.1,42.1, 43, 44, 45, 46, 48, 49, 50 o SA7P.

[0075] Preferiblemente, el vector de adenovirus es un vector viral recombinante de replicación deficiente, como rAd26, rAd35, rAd48, rAd5HVR48, etc.

[0076] En una realización preferida de la invención, los vectores adenovirales comprenden proteínas de cápside de serotipos raros incluyendo Ad26. En la realización típica, el vector es un virus rAd26. Una "proteína de cápside de adenovirus" se refiere a una proteína de la cápside de un adenovirus (por ejemplo, vectores Ad26, Ad35, rAd48, rAd5HVR48) que interviene en la determinación del serotipo y/o tropismo de un adenovirus concreto. Las proteínas de la cápside adenoviral suelen incluir las proteínas fiber, pentón y/o hexón. Tal como se utiliza en el presente documento, una "proteína de cápside" para un adenovirus concreto, como una "proteína de cápside Ad26" puede ser, por ejemplo, una proteína de cápside quimérica que incluya al menos una parte de una proteína de cápside Ad26. En ciertas realizaciones, la proteína de la cápside es una proteína de la cápside completa de Ad26. En ciertas realizaciones, el hexón, el pentón y la fibra son de Ad26.

[0077] Un experto en la materia reconocerá que los elementos derivados de múltiples serotipos pueden combinarse en un único vector de adenovirus recombinante. Así, se puede producir un adenovirus quimérico que combine propiedades deseables de diferentes serotipos. Así, en algunas realizaciones, un adenovirus quimérico de la invención podría combinar la ausencia de inmunidad preexistente de un primer serotipo con características como la estabilidad a la temperatura, el ensamblaje, el anclaje, el rendimiento de la producción, la infección redirigida o mejorada, la estabilidad del ADN en la célula diana, y similares.

[0078] En ciertas realizaciones, el vector de adenovirus recombinante útil en la invención se deriva principalmente o en su totalidad de Ad26 (es decir, el vector es rAd26). En algunas realizaciones, el adenovirus es de replicación deficiente, por ejemplo, porque contiene una deleción en la región E1 del genoma. En el caso de los adenovirus derivados de adenovirus no pertenecientes al grupo C, como Ad26 o Ad35, es habitual intercambiar la secuencia codificadora E4-orf6 del adenovirus con la E4-orf6 de un adenovirus del subgrupo C humano, como Ad5. Esto permite la propagación de dichos adenovirus en líneas celulares complementarias bien conocidas que expresan los genes E1 de Ad5, como por ejemplo células 293, células PER.C6 y similares (véase, por ejemplo. Havenga, et al., 2006, J Gen Virol 87: 2135-43; W o 03/104467). Sin embargo, estos adenovirus no serán capaces de replicarse en células no complementarias que no expresen los genes E1 de Ad5.

[0079] La preparación de vectores adenovirales recombinantes es bien conocida en la técnica. La preparación de vectores rAd26 se describe, por ejemplo, en WO 2007/104792 y en Abbink et al., (2007) Virol 81(9): 4654-63. Secuencias genómicas ejemplares de Ad26 se encuentran en GenBank Accession EF 153474 y en SEQ ID NO: 1 de WO 2007/104792. Entre los ejemplos de vectores útiles para la invención se incluyen, por ejemplo, los descritos en el documento WO2012/082918.

[0080] Típicamente, un vector útil en la invención se produce utilizando un ácido nucleico que comprende todo el genoma adenoviral recombinante (por ejemplo, un plásmido, cósmido o vector de baculovirus). Así, la invención también proporciona moléculas de ácido nucleico aisladas que codifican los vectores adenovirales de la invención. Las moléculas de ácido nucleico de la invención pueden estar en forma de ARN o en forma de ADN obtenido por clonación o producido sintéticamente. El ADN puede ser bicatenario o monocatenario.

[0081] Los vectores de adenovirus útiles en la invención son típicamente deficientes en replicación. En estas realizaciones, el virus se hace de replicación deficiente por deleción o inactivación de regiones críticas para la replicación del virus, como la región E1. Las regiones pueden suprimirse o inactivarse sustancialmente, por ejemplo, insertando un gen de interés, como un gen que codifique una proteína sintética de la envoltura del VIH (normalmente unido a un promotor), o un gen que codifique un polipéptido antigénico del VIH (normalmente unido a un promotor) dentro de la región. En algunas realizaciones, los vectores de la invención pueden contener deleciones en otras regiones, como las regiones E2, E3 o E4, o inserciones de genes heterólogos ligados a un promotor dentro de una o más de estas regiones. Para los adenovirus mutados E2- y/o E4, generalmente se utilizan líneas celulares complementarias E2- y/o E4 para generar adenovirus recombinantes. No es necesario que las mutaciones en la región E3 del adenovirus se complementen con la línea celular, ya que E3 no es necesario para la replicación.

[0082] Normalmente se utiliza una línea celular de empaquetamiento para producir cantidades suficientes de vectores de adenovirus para su uso en la invención. Una célula de empaquetamiento es una célula que comprende aquellos genes que han sido suprimidos o inactivados en un vector de replicación deficiente, permitiendo así que el virus se replique en la célula. Las líneas celulares de empaquetamiento adecuadas para adenovirus con una deleción en la región El incluyen, por ejemplo, PER.C6, 911, 293 y E1 A549.

[0083] En una realización preferida de la invención, el vector es un vector de adenovirus, y más preferiblemente un vector rAd26, más preferiblemente un vector rAd26 con al menos una deleción en la región E1 del genoma adenoviral, por ejemplo, como el descrito en Abbink, J Virol, 2007. 81(9): p. 4654-63. Típicamente, la secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína sintética de la envoltura del VIH y/u otros antígenos del VIH se clona en la región E1 y/o E3 del genoma adenoviral.

[0084] En un aspecto preferido de la invención, el vector que codifica el antígeno sintético del VIH descrito en el presente documento es un vector poxvirus. En un aspecto particularmente preferido, el vector es un vector del virus Vaccinia Ankara modificado (MVA). En otras realizaciones preferidas, el vector del virus MVA es MVA-BN™ o derivados del mismo.

[0085] El MVA se ha generado mediante más de 570 pases seriados en fibroblastos de embrión de pollo de la cepa de vaccinia dérmica Ankara (Chorioallantois vaccinia virus Ankara virus, CVA; para una revisión ver Mayr et al. (1975) Infection 3, 6-14) que se mantuvo en el Instituto de Vacunación de Ankara (Turquía) durante muchos años y se utilizó como base para la vacunación de seres humanos. El virus CVA atenuado MVA (Modified Vaccinia Virus Ankara) se obtuvo por propagación en serie (más de 570 pasajes) del CVA en fibroblastos primarios de embrión de pollo (CEF).

[0086] Sin embargo, debido a las complicaciones posvacunales a menudo graves asociadas a los virus vaccinia, hubo varios intentos de generar una vacuna más atenuada y segura. Como resultado del pasaje utilizado para atenuar la MVA, existe un número de cepas o aislamientos diferentes, dependiendo del número de pasajes realizados en células CEF. Se han desarrollado cepas de MVA con perfiles de seguridad mejorados para el desarrollo de productos más seguros, como vacunas o productos farmacéuticos, por ejemplo, por Bavarian Nordic. Bavarian Nordic ha seguido desarrollando la MVA, que ahora se denomina MVA-BN™. Una muestra representativa de MVA-BN™ se depositó el 30 de agosto de 2000 en la Colección Europea de Cultivos Celulares (ECACC) con el número de acceso VOOO83OO8. El MVA-BN™ se describe con más detalle en el documento WO 02/42480 (véase también, por ejemplo, la patente estadounidense n.°. 6.761.893 y 6.913.752 y US 2003/0206926) y WO 03/048184 (US 2006/0159699). Tanto el MVA como el MVA-BN™ carecen de aproximadamente un 15% (31 kb de seis regiones) del genoma en comparación con el virus CVA ancestral. Las deleciones afectan a varios genes de virulencia y del rango de hospedadores, así como al gen de los cuerpos de inclusión de tipo A.

[0087] En diversas realizaciones, el MVA o MVA utilizado para generar las recombinantes adecuadas para la presente invención son MVA-572, MVA-575, MVA-1721, MVA depositada como ATCC® VR-1508™, MVA depositada como ATCC® VR-1566™, ACAM3000 MVA, MVA-BN™ o cualquier cepa de MVA atenuada de forma similar. En las realizaciones preferidas, los MVA utilizados para generar las recombinantes son MVA-575, MVA como depositado como ATCC® VR- 1508™, MVA como depositado como ATCC® VR-1566™, ACAM3000 MVA y MVA-BN™. Más preferiblemente, el MVA utilizado para generar los recombinantes es MVA-BN™.

[0088] MVA-572 se depositó en la Colección Europea de Cultivos de Células Animales (ECACC, Vaccine Research and Production Laboratory, Public Health Laboratory Service, Centre for Applied Microbiology and Research, Porton Down, Salisbury, Wiltshire SP40JG, Reino Unido) con el número de depósito ECa CC V94012707 el 27 de enero de 1994. MVA-575 fue depositado bajo ECACC V00120707 el 7 de diciembre de 2000. Acam3000 MVA se depositó en la American Type Culture Collection (ATCC) con el número de acceso: PTA- 5095 el 27 de marzo de 2003 (American Type Culture Collection, 10801 University Blvd., Manassas, VA 20110-2209, EE.UU.). MVA-I721 se depositó como CNCM 1721 en la Collection Nationale de Cultures de Microorganisms, Institute Pasteur. MVA-BN™ se depositó el 30 de agosto de 2000 en el ECACC con el número V00083008. El MVA-BN™ se ha descrito en el documento W<o>02/042480.

[0089] También están comprendidos en la invención los derivados o variantes de cualquiera de los virus MVA o MVA-BN™ descritos en el presente documento. "Derivados" o "variantes" de MVA o MVA-BN™ se refieren a virus MVA o MVA-BN™ que presentan esencialmente las mismas características de replicación que el MVA o MVA-BN™ al que se refiere, pero que presentan diferencias en una o más partes de sus genomas. Los virus que tienen las mismas "características de replicación" que el virus depositado son virus que se replican con ratios de amplificación similares a los de la cepa depositada en células CEF y en las líneas celulares HaCat (Boukamp et al. (1988), J Cell Biol 106: 761- 771), la línea celular de osteosarcoma óseo humano 143B (n° ECACC 91112502), la línea celular de riñón de embrión humano 293 (n° ECACC 85120602) y la línea celular de adenocarcinoma de cérvix humano HeLa (n.° ATCC CCL-2). Las pruebas y ensayos para determinar estas propiedades del MVA, sus derivados y variantes son bien conocidos por el experto, como el ensayo de permisividad de la línea celular descrito en el documento WO 02/42480. En un ensayo ejemplar de permisividad de líneas celulares, las líneas celulares de mamíferos se infectan con el virus MVA parental y derivado o variante a una multiplicidad baja de infección por célula, es decir, 0,05 unidades infecciosas por célula (5 x104 TCID<50>). Tras la absorción de 1 hora, se retira el inóculo de virus y se lavan las células tres veces para eliminar cualquier resto de virus no absorbido. Medio fresco suplementado con 3 % de FCS y se dejan las infecciones durante un total de 4 días (a 37 °C, 5 % de CO<2>), en los que se pueden preparar extractos virales. Las infecciones se detienen congelando las placas a -80 °C durante tres veces. La multiplicación del virus y los efectos citopáticos (ECP) se determinan posteriormente en células CEF utilizando métodos bien conocidos por el experto, como los descritos en Carroll y Moss (1997), Virology 238, 198-211.

[0090] Más específicamente, el MVA-BN™ o un derivado o variante del MVA-BN™ tiene preferentemente la capacidad de replicación reproductiva en fibroblastos de embrión de pollo (CEF), pero ninguna capacidad de replicación reproductiva en la línea celular de queratinocitos humanos HaCat (Boukamp et al (1988), J. Cell Biol. 106:761-771), la línea celular de osteosarcoma óseo humano 143B (ECACC Deposit No. 91112502), la línea celular de riñón de embrión humano 293 (ECACC Deposit No. 85120602), y la línea celular de adenocarcinoma de cérvix humano HeLa (ATCC Deposit No. CCL-2). Además, un derivado o variante de MVA-BN™ tiene una relación de amplificación del virus al menos dos veces menor, más preferiblemente tres veces menor que MVA-575 en células Hela y líneas celulares HaCaT. Las pruebas y ensayos para estas propiedades de las variantes de MVA se describen en el documento WO 02/42480 o en el ensayo ejemplar de permisividad de la línea celular descrito anteriormente.

[0091] El término "no capaz de replicación reproductiva" o "sin capacidad de replicación reproductiva" se describe, por ejemplo, en el documento WO 02/42480, que también enseña cómo obtener MVA que tengan las propiedades deseadas mencionadas anteriormente. El término se aplica a un virus que tiene un índice de amplificación del virus a los 4 días de la infección inferior a 1 utilizando los ensayos descritos en el documento WO 02/42480 o en el documento de patente estadounidense n.° 6.761.893.

[0092] El término "no se replica reproductivamente" se refiere a un virus que tiene una relación de amplificación viral a los 4 días después de la infección de menos de 1. Ensayos descritos en W<o>02/42480 o en U.S. Patente n° 6.761.893 son aplicables para la determinación de la relación de amplificación del virus.

[0093] La amplificación o replicación de un virus se expresa normalmente como la relación entre el virus producido a partir de una célula infectada (salida) y la cantidad utilizada originalmente para infectar la célula en primer lugar (entrada), denominada "relación de amplificación". Una relación de amplificación de "1" define un estado de amplificación en el que la cantidad de virus producida a partir de las células infectadas es la misma que la cantidad utilizada inicialmente para infectar las células, lo que significa que las células infectadas son permisivas para la infección y reproducción del virus. Por el contrario, una relación de amplificación inferior a 1, p. ej., una disminución de la producción en comparación con el nivel de entrada, indica una falta de replicación reproductiva y, por lo tanto, la atenuación del virus.

[0094] Los vectores poxvirus recombinantes aquí proporcionados pueden generarse mediante métodos rutinarios conocidos en la técnica. Los métodos para obtener poxvirus recombinantes o para insertar secuencias codificantes exógenas en un genoma poxviral son bien conocidos por los expertos en la materia. Por ejemplo, los métodos para las técnicas estándar de biología molecular como la clonación de ADN, el aislamiento de ADN y ARN, el análisis Western blot, la RT-PCR y las técnicas de amplificación PCR se describen en Molecular Cloning, A laboratory Manual (2a Ed.) [J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)], y las técnicas para el manejo y manipulación de virus se describen en Virology Methods Manual [B.W.J. Mahy et al. (eds.), Academic Press (1996)]. Del mismo modo, en Virología molecular se describen las técnicas y los conocimientos para el manejo, la manipulación y la ingeniería genética de los MVA: A Practical Approach [A.J. Davison & R.M. Elliott (Eds.), The Practical Approach Series, IRL Press at Oxford University Press, Oxford, Reino Unido (1993) (véase, por ejemplo, el capítulo 9): Expression of genes by Vaccinia virus vectors)] y Current Protocols in Molecular Biology [John Wiley & Son, Inc. (1998) (véase, por ejemplo, el capítulo 16, sección iV: Expression of proteins in mammalian cells using vaccinia viral vector)].

[0095] Para la generación de los diversos poxvirus recombinantes aquí divulgados, son aplicables diferentes métodos. La secuencia de ADN que debe insertarse en el virus puede colocarse en una construcción plasmídica de E. coli en la que se ha insertado ADN homólogo a una sección de ADN del poxvirus. Por separado, la secuencia de ADN a insertar puede ligarse a un promotor. El enlace promotor-gen puede colocarse en la construcción plasmídica de modo que el enlace promotor-gen esté flanqueado en ambos extremos por ADN homólogo a una secuencia de ADN que flanquee una región de ADN poxviral que contenga un locus no esencial. La construcción plasmídica resultante puede amplificarse por propagación en bacterias E. coli y aislarse. El plásmido aislado que contiene la secuencia genética de<a>D<n>a insertar puede transfectarse en un cultivo celular, por ejemplo, de fibroblastos de embrión de pollo (CEF), al mismo tiempo que se infecta el cultivo con poxvirus. La recombinación entre ADN poxviral homólogo en el plásmido y el genoma viral, respectivamente, puede generar un poxvirus modificado por la presencia de secuencias de ADN extrañas.

[0096] Según una realización preferida, una célula de un cultivo celular adecuado como, por ejemplo, células CEF, puede infectarse con un poxvirus. La célula infectada puede, posteriormente, transfectarse con un primer vector plasmídico que comprende un gen o genes extraños o heterólogos, como uno o más de los ácidos nucleicos que codifican el antígeno del VIH proporcionados en la presente divulgación; preferentemente bajo el control transcripcional de un elemento de control de expresión de poxvirus. Como se ha explicado anteriormente, el vector plasmídico también comprende secuencias capaces de dirigir la inserción de la secuencia exógena en una parte seleccionada del genoma poxviral. Opcionalmente, el vector plasmídico también contiene un casete que comprende un gen marcador y/o de selección unido operablemente a un promotor poxviral. Los genes marcadores o de selección adecuados son, por ejemplo, los genes que codifican la proteína verde fluorescente, la p-galactosidasa, la neomicina-fosforribosiltransferasa u otros marcadores. El uso de casetes de selección o marcadores simplifica la identificación y el aislamiento de los poxvirus recombinantes generados. Sin embargo, un poxvirus recombinante también puede identificarse mediante la tecnología PCR. Posteriormente, otra célula puede infectarse con el poxvirus recombinante obtenido como se ha descrito anteriormente y transfectarse con un segundo vector que comprenda un segundo gen o genes extraños o heterólogos. En este caso, este gen se introducirá en un sitio de inserción diferente del genoma poxviral, y el segundo vector también difiere en las secuencias poxvirus-homólogas que dirigen la integración del segundo gen o genes extraños en el genoma del poxvirus. Una vez que se ha producido la recombinación homóloga, se puede aislar el virus recombinante que comprende dos o más genes extraños o heterólogos. Para introducir genes extraños adicionales en el virus recombinante, las etapas de infección y transfección pueden repetirse utilizando el virus recombinante aislado en las etapas anteriores para la infección y utilizando otro vector que comprenda otro gen o genes extraños para la transfección.

[0097] Alternativamente, los pasos de infección y transfección descritos anteriormente son intercambiables, es decir, una célula adecuada puede transfectarse primero con el vector plasmídico que comprende el gen extraño y, a continuación, infectarse con el poxvirus. Como alternativa adicional, también es posible introducir cada gen extraño en diferentes virus, coinfectar una célula con todos los virus recombinantes obtenidos y cribar un recombinante que incluya todos los genes extraños. Una tercera alternativa es la ligación del genoma de ADN y las secuencias extrañas in vitro y la reconstitución del genoma de ADN recombinado del virus vaccinia utilizando un virus auxiliar. Una cuarta alternativa es la recombinación homóloga en E. coli u otra especie bacteriana entre un genoma de poxvirus clonado como cromosoma artificial bacteriano (BAC) y una secuencia foránea lineal flanqueada con secuencias de ADN homólogas a las secuencias que flanquean el sitio deseado de integración en el genoma del virus vaccinia.

[0098] Una o más secuencias de ácido nucleico que codifican al menos un antígeno del VIH según realizaciones de la invención pueden insertarse en cualquier parte adecuada del poxvirus o vector poxviral. En un aspecto preferido, el poxvirus utilizado para la presente invención incluye un virus MVA. Las partes adecuadas del virus MVA en las que pueden insertarse uno o más ácidos nucleicos de la presente divulgación incluyen partes no esenciales del virus MVA.

[0099] Para el virus MVA, las partes no esenciales del genoma MVA pueden ser regiones intergénicas o los conocidos sitios de deleción 1-6 del genoma MVA. Alternativa o adicionalmente, las partes no esenciales del MVA recombinante pueden ser una región codificante del genoma del MVA que no sea esencial para el crecimiento viral. Sin embargo, los sitios de inserción no están restringidos a estos sitios de inserción preferidos en el genoma del MVA, ya que está dentro del alcance de la presente invención que los antígenos y ácidos nucleicos y cualquier promotor acompañante como se describe en el presente documento se pueden insertar en cualquier parte del genoma viral siempre que sea posible obtener recombinantes que se puedan amplificar y propagar en al menos un sistema de cultivo celular, como los fibroblastos de embrión de pollo (células CEF).

[0100] Preferiblemente, los ácidos nucleicos de la presente invención se insertan en una o más regiones intergénicas (IGR) del MVA. Los términos "región intergénica" e "IGR" se refieren preferentemente a aquellas partes del genoma viral situadas entre dos marcos abiertos de lectura (ORF) adyacentes del genoma MVA, preferentemente entre dos ORF esenciales del genoma del virus MVA. Para MVA, en ciertas realizaciones, el IGR se selecciona entre IGR 07/08, IGR 44/45, IGR 64/65, IGR 88/89, IGR 136/137, e IGR 148/149. En realizaciones más preferidas, los ácidos nucleicos de la presente invención se insertan en las regiones IGR 44/45 e IGR 88/89.

[0101] Según realizaciones de la invención, y como se ha indicado anteriormente, cualquiera de las proteínas sintéticas de la envoltura del VIH y/o antígenos del VIH descritos en el presente documento pueden expresarse en los vectores de la invención. En vista de la degeneración del código genético, el experto sabe perfectamente que se pueden diseñar varias secuencias de ácido nucleico que codifiquen la misma proteína, según métodos totalmente rutinarios en la técnica. Opcionalmente, el ácido nucleico que codifica la proteína sintética de la envoltura del VIH y/o los antígenos del VIH puede optimizarse mediante codones para garantizar una expresión adecuada en el hospedador tratado (por ejemplo, humano). La optimización de codones es una tecnología ampliamente aplicada en la técnica. Algunos ejemplos no limitantes de secuencias que codifican una proteína sintética de la envoltura del VIH de la invención se proporcionan en SEQ ID NOs: 26 (utilizado en vectores adenovirus en los ejemplos), y 41 (utilizado en vectores MVA en los ejemplos); y algunos ejemplos no limitantes de secuencias que codifican otros antígenos del VIH para su uso en la invención se proporcionan en SEQ ID NO: 20-22 (utilizados en los vectores adenovirus de los ejemplos), y 38-40 (utilizados en los vectores MVA de los ejemplos).

[0102] La invención también proporciona células, preferiblemente células aisladas, que comprenden cualquiera de los vectores descritos en el presente documento. Las células pueden utilizarse para la producción de proteínas recombinantes o de partículas víricas.

[0103] También se divulga un método para fabricar un polipéptido antigénico sintético del VIH. El método comprende transfectar una célula huésped con un vector de expresión que comprende ácido nucleico que codifica el polipéptido antigénico sintético del VIH unido operablemente a un promotor, cultivar la célula transfectada en condiciones adecuadas para la expresión del polipéptido antigénico sintético del VIH, y aislar el polipéptido antigénico sintético del VIH de la célula. El polipéptido antigénico sintético del VIH puede aislarse o recogerse de la célula por cualquier método conocido en la técnica, incluida la cromatografía de afinidad, etc. Las técnicas utilizadas para la expresión de proteínas recombinantes son bien conocidas por los expertos en la materia a la vista de la presente divulgación.

[0104] La invención también se refiere a un método para fabricar un vector que codifica un polipéptido antigénico sintético del VIH de la invención, el método comprende cultivar una célula que comprende el vector, para propagar y multiplicar el vector durante dicho cultivo, y aislar el vector que codifica el polipéptido antigénico sintético del VIH de la invención del cultivo celular, por ejemplo, de las células, del medio de cultivo, o de ambos. El vector puede purificarse aún más según métodos conocidos en la técnica.

[0105] En ciertas realizaciones, la invención proporciona un vector poxvirus, preferentemente un vector MVA, tal como un vector MVA-BN™, que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica un antígeno sintético del VIH. El vector poxvirus comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica un antígeno sintético de la envoltura (Env) del VIH según la invención, como el que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 18, y opcionalmente comprende además una secuencia de ácido nucleico que codifica al menos un antígeno adicional del VIH. En realizaciones preferidas, el vector poxvirus y más preferiblemente un vector MVA, comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica un primer antígeno VIH Env que es un antígeno VIH Env sintético que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 18, y al menos un antígeno adicional del VIH, como los antígenos Gag, Pol y/o Env, preferiblemente uno o más antígenos adicionales del VIH que comprendan las secuencias de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1-5, 28 y 29;

[0106] Por ejemplo, en una realización particular, un vector poxvirus puede comprender ácido nucleico que codifica un primer antígeno Env del VIH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 18; un segundo antígeno VIH Env diferente del primer antígeno VIH Env; un tercer antígeno y un cuarto antígeno, que son dos antígenos VIH Gag diferentes; y un quinto antígeno y un sexto antígeno, que son dos antígenos VIH Pol diferentes. Los antígenos Gag y Pol pueden fusionarse en un primer antígeno de fusión Gag-Pol y un segundo antígeno de fusión Gag-Pol, como los antígenos de fusión Gag-Pol que comprenden la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 28 o número de ID de SEQ:2. 29.

[0107] En ciertas realizaciones ejemplares, el vector poxvirus comprende ácido nucleico que codifica una o más secuencias de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste en SEQ ID NOs: 1-5, 18, 28 y 29; En una o más realizaciones específicas, el vector poxvirus comprende ácido nucleico que codifica las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NOs: 1-5, y 18, más preferiblemente SEQ ID NOs: 5, 18, 28 y 29;

[0108] En otras ciertas realizaciones ejemplares, un vector es un vector de adenovirus que comprende una secuencia de ácido nucleico seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 25, 26 y 27, preferentemente SEQ ID NO: 26. Otras realizaciones ejemplares incluyen vectores de adenovirus que codifican otros antígenos del VIH, tales vectores de adenovirus que comprenden una o más secuencias de ácido nucleico seleccionadas del grupo que consiste en SEQ ID NOs: 20, 21 y 22; En otras ciertas realizaciones, el vector es un vector poxvirus, preferiblemente un vector MVA, más preferiblemente MVA-BN™, el vector que comprende una o más secuencias de ácido nucleico seleccionadas del grupo que consiste en SEQ ID NOs: 38, 39, 40 y 41; En una o más realizaciones específicas, el vector poxvirus comprende s Eq ID NOs: 38, 39, 40 y 41;

[0109] La secuencia de ácido nucleico que codifica uno o más antígenos del VIH puede insertarse en cualquier sitio de inserción apropiado del genoma del vector poxvirus como se describe en el presente documento. En realizaciones particulares en las que el vector poxvirus es un vector MVA, tal como MVA-BN™ o derivados del mismo, que codifica uno o más antígenos de fusión Gag-Pol, la secuencia de ácido nucleico que codifica un primer antígeno de fusión Gag-Pol puede insertarse en la región intergénica (IGR) 44/45 del genoma MVA y la secuencia de ácido nucleico que codifica un segundo antígeno de fusión Gag-Pol puede insertarse en la IGR 88/89 del genoma MVA. Además, la secuencia de ácido nucleico que codifica los antígenos Env del VIH puede insertarse en los IGR 44/45 y/o IGR 88/89 del genoma MVA. En una o más realizaciones específicas, el vector poxvirus comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica un antígeno de fusión Gag-Pol que comprende SEQ ID NO: 28 y secuencia de ácido nucleico que codifica un antígeno Env del VIH que comprende SEQ ID NO: 5 en IGR 44/45 del genoma MVA y/o secuencia de ácido nucleico que codifica un antígeno de fusión Gag-Pol que comprende SEQ ID NO: 29 y secuencia de ácido nucleico que codifica un antígeno Env del VIH que comprende SEQ ID NO: 18 en IGR 88/89 del genoma MVA. Preferiblemente, los antígenos de fusión Gag-Pol están cada uno bajo el control de un promotor separado, preferiblemente un promotor Prl3.5, como el que se muestra en SEQ ID NO: 42 y/o los antígenos Env están cada uno bajo el control de un promotor separado, preferiblemente un promotor PrHyb, como el que se muestra en SEQ ID NO: 43.

[0110] Composiciones

[0111] En otro aspecto general, la invención se refiere a una composición que comprende un vector que comprende un ácido nucleico que codifica una proteína sintética de la envoltura del VIH y un portador. Preferiblemente, la composición es una composición vacunal, que se describe con más detalle a continuación. Según realizaciones de la invención, cualquiera de los vectores descritos en el presente documento puede incluirse en la composición. Preferiblemente, el vector es un vector viral, más preferiblemente un vector adenovirus o un vector poxvirus, y aún más preferiblemente un vector adenovirus 26 o un vector MVA.

[0112] En una realización, una composición de la invención comprende un vector poxvirus, preferiblemente un vector MVA, que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína sintética de la envoltura del VIH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 18 o número de ID de SEQ: 19, y más preferiblemente la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 18. En ciertas realizaciones preferidas, el vector es un vector MVA-BN™, o un derivado del mismo. En una o más realizaciones específicas, una composición de la invención comprende un vector poxvirus, vector MVA o vector MVA-BN™ que comprende ácido nucleico que codifica al menos un primer antígeno de la envoltura del VIH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 18. Más preferiblemente, dicho vector comprende además una secuencia de ácido nucleico que codifica: (b) un segundo antígeno VIH Env diferente del primer antígeno VIH Env; (c) un tercer antígeno y un cuarto antígeno, que son dos antígenos VIH Gag diferentes; y (d) un quinto antígeno y un sexto antígeno, que son dos antígenos VIH Pol diferentes. En realizaciones preferidas, el segundo antígeno VIH Env comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 5, los antígenos tercero y cuarto comprenden la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2, respectivamente; y los antígenos quinto y sexto comprenden la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3 y SEQ ID NO: 4, respectivamente. En ciertas realizaciones, los antígenos tercero y quinto se fusionan en un primer antígeno de fusión Gag-Pol que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 28, y los antígenos cuarto y sexto se fusionan en un segundo antígeno de fusión Gag-Pol que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 29.

[0113] Según realizaciones de la invención, una composición que comprende un vector poxvirus según la invención puede utilizarse junto con uno o más vectores adicionales que codifican uno o más antígenos VIH adicionales, y/o uno o más polipéptidos antigénicos VIH aislados. Los vectores adicionales y/o los polipéptidos antigénicos del VIH pueden estar presentes en la misma composición o en una o más composiciones diferentes. Preferentemente, el uno o más vectores adicionales son vectores virales, tales como vectores adenovirus, más preferentemente vectores adenovirus 26, o vectores poxvirus, más preferentemente vectores MVA. El uno o más vectores adicionales pueden codificar cualquier antígeno del VIH conocido por los expertos en la materia a la vista de la presente divulgación. Más preferiblemente, el uno o más vectores adicionales son vectores de adenovirus, preferiblemente vectores de adenovirus 26, que codifican uno o más antígenos del VIH que comprenden las secuencias de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1-5, 18, 28 y 29;

[0114] En un aspecto, la invención proporciona una vacuna combinada que comprende una o más vectores juntos que comprenden secuencias de ácido nucleico que codifican (a) una proteína sintética de la envoltura del VIH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 18; b) una segunda proteína de la envoltura del VIH, que comprende preferentemente la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 5; (c) un tercer antígeno y un cuarto antígeno, que son dos antígenos Gag del VIH diferentes, que comprenden preferentemente las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NOs: 1 y 2, respectivamente; y (d) un quinto antígeno y un sexto antígeno, que son dos antígenos VIH Pol diferentes, que comprenden preferentemente las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NOs: 3 y 4, respectivamente. En una o más realizaciones específicas, los antígenos tercero y quinto se fusionan en un primer antígeno de fusión Gag-Pol, que comprende preferentemente la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 28 y los antígenos cuarto y sexto se fusionan en un segundo antígeno de fusión Gag-Pol que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 29. Los vectores pueden estar cada uno en composiciones separadas, o pueden combinarse en una única composición. Los múltiples ácidos nucleicos del vector o vectores están destinados a ser administrados a un sujeto, lo que dará lugar a una respuesta inmunitaria frente al VIH más amplia que la que se obtendría con la administración de cualquiera de los vectores por separado. Las múltiples secuencias de ácido nucleico también podrían estar presentes en un único vector.

[0115] Según realizaciones de la invención, el uno o más vectores pueden ser vectores adenovirus, preferentemente vectores adenovirus 26, y/o vectores poxvirus, preferentemente vectores MVA. Las composiciones que comprenden vectores de adenovirus y/o poxvirus pueden, opcionalmente, comprender además uno o más polipéptidos antigénicos aislados del VIH. Cualquier polipéptido antigénico del VIH aislado puede utilizarse en las composiciones de la invención en vista de la presente divulgación. En ciertas realizaciones preferidas, el uno o más polipéptidos antigénicos del VIH aislados comprende un polipéptido que comprende los residuos 30-708 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 7, un polipéptido que comprende los residuos 30-724 de SEQ ID NO: 36, o una combinación de los mismos.

[0116] En una o más realizaciones específicas, una combinación comprende un vector de adenovirus, preferiblemente un vector de adenovirus 26, que comprende ácido nucleico que codifica uno o más antígenos del VIH preferiblemente seleccionados del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1-5, 18, 28, y 29 y un vector poxvirus, preferiblemente un vector MVA, que comprende ácido nucleico que codifica uno o más antígenos del VIH preferiblemente seleccionados del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1-5, 18, 28 y 29; Preferiblemente, uno o más vectores de adenovirus, preferiblemente vectores de adenovirus 26 codifican conjuntamente SEQ ID NO: 1-5 y 18; y el vector poxvirus, preferentemente el vector MVA, codifica SEQ ID NO: 1-5 y 18; Los vectores pueden estar presentes en una composición, o en una o más composiciones diferentes.

[0117] Según ciertas realizaciones de la invención, una composición, tal como una composición de vacuna, comprende una cantidad inmunogénica aliadamente eficaz de un vector, tal como un vector viral. Tal como se utiliza aquí, "una cantidad inmunogénicamente eficaz" o "una cantidad inmunológicamente eficaz" significa una cantidad de una composición suficiente para inducir un efecto inmunitario o una respuesta inmunitaria deseados en un sujeto que los necesite. En una realización, una cantidad inmunogénicamente eficaz significa una cantidad suficiente para inducir una respuesta inmunitaria en un sujeto que la necesite. En otra realización, una cantidad inmunogénicamente eficaz significa una cantidad suficiente para producir inmunidad en un sujeto que la necesite, por ejemplo, proporcionar un efecto protector contra una enfermedad como una infección vírica. Una cantidad inmunogénicamente eficaz puede variar en función de diversos factores, como la condición física del sujeto, edad, peso, salud, etc.; la aplicación particular, ya sea inducir una respuesta inmunitaria o proporcionar inmunidad protectora; el vector recombinante específico administrado; el inmunógeno o polipéptido antigénico codificado por el vector recombinante administrado; el polipéptido antigénico específico administrado; y la enfermedad particular, por ejemplo, infección vírica, para la que se desea inmunidad. Un experto en la materia puede determinar fácilmente una cantidad inmunogénicamente eficaz a la vista de la presente divulgación.

[0118] Como orientación general, una cantidad inmunogénicamente eficaz cuando se usa con referencia a un vector viral recombinante tal como un vector adenoviral puede ser por ejemplo de aproximadamente108 partículas virales a aproximadamente1012 partículas virales, por ejemplo 108,109, 1010,1011, o 1012 partículas virales. En ciertas realizaciones, una dosis única de vectores adenovirales para su administración a seres humanos oscila entre109y1011 partículas virales. Una cantidad inmunogénicamente eficaz cuando se utiliza con referencia a un vector viral recombinante como un vector poxviral puede ser, por ejemplo, de aproximadamente104 a1011 TCID<50 ,10>5 a 1010 TCID<50 ,10>6 a 109 TCID<50>, o 107 a 108 TCID<50>, como 104,105,106,107,108,109, 1010, o 1011 TCID<50>. Una dosis preferida para los sujetos (preferiblemente un humano) comprende de 105 a 1010 TCID<50>, incluyendo una dosis de 105 TCID<50 ,10>6 TCID<50 ,10>7 TCID<50 ,10>8 TCID<50 ,10>9 TCID<50>, o IO10 TCID<50>. La cantidad inmunogénicamente eficaz de un vector poxviral, como un vector MVA, puede expresarse alternativa y convenientemente en unidades formadoras de placa (ufp), y puede ser, por ejemplo, de aproximadamente105 a aproximadamente 1011 ufp, por ejemplo, aproximadamente105,106,107,108,109,1010 o 1011 ufp, preferiblemente de aproximadamente107 a 109 ufp , y más preferiblemente de aproximadamente 108 ufp, como por ejemplo aproximadamente 0,5 x108, 1 x108, 2 x108, 3 x108, 4 x108, o 5 x108 ufp. En ciertas realizaciones, la cantidad inmunogénicamente eficaz de un vector MVA según la invención administrada a un sujeto humano es alrededor de 1 x107 a 1 x109 ufp, preferiblemente alrededor de 1 x108 ufp, preferiblemente en un volumen de 0,1 mL a 1 mL, por ejemplo 0,5 mL.

[0119] Una cantidad inmunogénicamente eficaz de un vector, tal como un vector de MVA y/o un vector de adenovirus, puede administrarse en una única composición, o en múltiples composiciones, tales como 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, o 10 composiciones (por ejemplo, comprimidos, cápsulas o inyectables), en las que la administración de las múltiples cápsulas o inyecciones proporciona colectivamente al sujeto la cantidad inmunogénicamente eficaz. También es posible administrar una cantidad inmunogénicamente eficaz a un sujeto, y posteriormente administrar otra dosis de una cantidad inmunogénicamente eficaz al mismo sujeto, en lo que se denomina un régimen de prime-boost. Opcionalmente, pueden añadirse al régimen otras administraciones de refuerzo, según sea necesario. Este concepto general de régimen de cebado es bien conocido por los expertos en el campo de las vacunas y se describe con más detalle a continuación.

[0120] Las composiciones de la invención pueden comprender además un portador. Un portador puede incluir uno o más excipientes farmacéuticamente aceptables como aglutinantes, desintegrantes, agentes hinchantes, agentes de suspensión, agentes emulsionantes, agentes humectantes, lubricantes, aromatizantes, edulcorantes, conservantes, colorantes, solubilizantes y recubrimientos. La naturaleza precisa del portador u otro material puede depender de la vía de administración, por ejemplo, intramuscular, subcutánea, oral, intravenosa, cutánea, intramucosa (por ejemplo, intestinal), intranasal o intraperitoneal. Para preparaciones inyectables líquidas, por ejemplo, suspensiones y soluciones, los portadores y aditivos adecuados incluyen agua, glicoles, aceites, alcoholes, conservantes, colorantes y similares. Para las preparaciones orales sólidas, por ejemplo, polvos, cápsulas, cápsulas de gel y comprimidos, los portadores y aditivos adecuados incluyen almidones, azúcares, diluyentes, agentes granulantes, lubricantes, aglutinantes, agentes desintegradores y similares. Para los aerosoles nasales/mezclas inhalantes, la solución/suspensión acuosa puede comprender agua, glicoles, aceites, emolientes, estabilizantes, agentes humectantes, conservantes, aromatizantes, saborizantes y similares como portadores y aditivos adecuados.

[0121] Las composiciones de la invención pueden formularse en cualquier materia adecuada para la administración a un sujeto para facilitar la administración y mejorar la eficacia, incluyendo, pero sin limitarse a, la administración oral (enteral) y las inyecciones parenterales. Las inyecciones parenterales incluyen la inyección o infusión intravenosa, la inyección intraarterial, la inyección subcutánea, la inyección intramuscular y la inyección intraarticular. Las composiciones de la invención también pueden formularse para otras vías de administración, incluyendo transmucosa, ocular, rectal, implantación de acción prolongada, administración sublingual, bajo la lengua, desde la mucosa oral evitando la circulación portal, inhalación o intranasal.

[0122] Según ciertas realizaciones de la invención, una composición comprende una cantidad inmunogénicamente eficaz de vector purificado o parcialmente purificado, por ejemplo, vector de adenovirus, tal como un vector de adenovirus 26, o vector de poxvirus, tal como MVA o MVA-BN™, el vector que comprende un ácido nucleico que codifica una proteína sintética de la envoltura del VIH de la invención y opcionalmente uno o más antígenos adicionales del VIH. Dichas composiciones pueden formularse como una vacuna (también denominada "composición inmunogénica") según métodos bien conocidos en la técnica.

[0123] En ciertas realizaciones de la invención, una composición puede comprender además uno o más polipéptidos que comprenden una cantidad inmunogénicamente eficaz de un polipéptido antigénico aislado del VIH. En general, cuando se utiliza con referencia a un polipéptido, como un polipéptido antigénico aislado, una cantidad inmunogénicamente eficaz puede oscilar entre, por ejemplo, aproximadamente 0,3 y aproximadamente 3000 microgramos (|jg), por ejemplo 1-1000 |jg, por ejemplo 10-500 |jg, por ejemplo aproximadamente 50 o 250 |jg. Como ejemplo no limitativo, es posible combinar la administración de uno o más vectores que codifican el antígeno sintético VIH Env de la invención (por ejemplo, que tienen SEQ ID NO: 18) y opcionalmente uno o más antígenos adicionales del VIH (por ejemplo, que tengan SEQ ID NOs: 1-5, 28, y/o 29) con la administración de un polipéptido Env del VIH aislado, por ejemplo 250 jig de proteína Env trímero del VIH clado C que tenga los aminoácidos 30-708 de SEQ ID NO: 7 o 250 jig de la proteína Env trimérica del mosaico del VIH con los aminoácidos 30-708 de SEQ ID NO: 36.

[0124] En algunas realizaciones, las composiciones de la invención pueden comprender además opcionalmente un adyuvante para mejorar las respuestas inmunitarias. Los términos "adyuvante" y "estimulante inmunitario" se utilizan indistintamente en el presente documento, y se definen como una o más sustancias que provocan la estimulación del sistema inmunitario. En este contexto, se utiliza un adyuvante para potenciar una respuesta inmunitaria a los vectores que codifican proteínas sintéticas de la envoltura del VIH de la invención y opcionalmente uno o más antígenos adicionales del VIH y/o polipéptidos antigénicos del VIH utilizados en combinación con vectores que codifican proteínas sintéticas de la envoltura del VIH de la invención y opcionalmente uno o más antígenos adicionales del VIH.

[0125] Los adyuvantes adecuados para su uso con la invención deben ser potencialmente seguros, bien tolerados y eficaces en las personas, como por ejemplo QS-21, Detox-PC, MPL-SE, MoGM-CSF, TiterMax-G, CRL- 1005, GERBU, TERamide, PSC97B, Adjumer, PG-026, Gs K-I, GcMAF, B-alethine, MPC-026, Adjuvax, CpG ODN, Betafectin, sales de aluminio (p. ej., AdjuPhos) y MF59.p. ej. AdjuPhos), Adjuplex y MF59. Las proporciones óptimas de cada componente en la formulación pueden determinarse mediante técnicas bien conocidas por los expertos en la materia a la vista de la presente divulgación.

[0126] En una realización preferida, el adyuvante es una sal de aluminio, como el fosfato de aluminio, por ejemplo, AdjuPhos. En ciertas realizaciones, el fosfato de aluminio está preferiblemente presente en o administrado con una composición con polipéptido antigénico aislado del VIH, como gp140.

[0127] La preparación y el uso de composiciones inmunogénicas son bien conocidos por los expertos en la materia. Las composiciones farmacéuticas líquidas generalmente incluyen un portador líquido como agua, petróleo, aceites animales o vegetales, aceite mineral o aceite sintético. También puede incluirse solución salina fisiológica, dextrosa u otra solución de sacáridos o glicoles como etilenglicol, propilenglicol o polietilenglicol.

[0128] Por ejemplo, el vector de adenovirus recombinante puede almacenarse en el tampón que también se utiliza para el Adenovirus World Standard (Hoganson et al., 2002, Bioprocessing J 1: 43- 820 mM Tris pH 8, 25 mM NaCl, 2,5% glicerol. Otro tampón de formulación de adenovirus útil y adecuado para la administración a humanos es 20 mM Tris, 2 mM MgCh, 25 mM NaCl, sacarosa 10% p/v, polisorbato-800,02% p/v. Otro tampón de formulación que es adecuado para el adenovirus recombinante comprende tampón citrato 10-25 mM pH 5,9-6,2, 4-6% (p/p) hidroxipropil-beta-ciclodextrina (HBCD), 70-100 mM NaCl, 0,018-0,035% (p/p) polisorbato-80, y opcionalmente 0,3-0,45% (p/p) etanol. Obviamente, pueden utilizarse muchos otros tampones, y se conocen varios ejemplos de formulaciones adecuadas para el almacenamiento y la administración farmacéutica de vectores purificados.

[0129] Una preparación y almacenamiento ejemplares de vectores poxvirales, incluidos el MVA y el MVA-BN™, pueden basarse en la experiencia en la preparación de vacunas poxvirales utilizadas para la vacunación contra la viruela, como se describe, por ejemplo, en Stickl, H. et al., Dtsch. med. Wschr. 99, 2386-2392 (1974).

[0130] En una realización ejemplar, el poxvirus purificado se almacena a -80 °C con un título de 5 x108 TCID<50>/ml formulado en 10 mM Tris, 140 mM NaCl, pH 7.7. Para la preparación de vacunas inyectables, por ejemplo, 102-108 partículas del virus pueden liofilizarse en solución salina tamponada con fosfato (PBS) en presencia de 2% de peptona y 1% de albúmina humana en una ampolla, preferiblemente de vidrio. Alternativamente, las vacunas pueden prepararse por liofilización paso a paso del virus en una formulación. En ciertas realizaciones, la formulación contiene aditivos adicionales como manitol, dextrano, azúcar, glicina, lactosa, polivinilpirrolidona u otros aditivos, como, por ejemplo, antioxidantes o gas inerte, estabilizadores o proteínas recombinantes (por ejemplo, albúmina de suero humano) adecuados para la administración in vivo. A continuación, la ampolla se cierra herméticamente y puede almacenarse a una temperatura adecuada, por ejemplo, entre 4 °C y a temperatura ambiente durante varios meses. No obstante, mientras no sea necesario, la ampolla se conserva preferentemente a temperaturas inferiores a -20 °C.

[0131] En diversas realizaciones que implican vacunación o terapia, el liofilizado se disuelve en 0,1 a 0,5 ml de una solución acuosa, preferiblemente solución salina fisiológica o tampón Tris, y se administra sistémica o localmente, es decir, por vía parenteral, subcutánea, intravenosa, intramuscular, intranasal, intradérmica, o cualquier otra vía de administración conocida por un profesional experto. La optimización del modo de administración, la dosis y el número de administraciones está dentro de la habilidad y el conocimiento de un experto en la materia.

[0132] Una ventaja de las realizaciones en las que el vector o la combinación de vectores codifica ambos antígenos del VIH que comprenden los SEQ ID NO: 18 y 5, es una mayor amplitud de la respuesta inmunitaria (que abarca cepas de los clados B y C).

[0133] En ciertas realizaciones, una composición o una combinación de vacunas de la invención comprende además en el mismo u otros vectores, ácido nucleico que codifica un polipéptido antigénico del VIH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 28 (mos1GagPol) y/o SEQ iD n O: 29 (mos2GagPol).

[0134] En una realización particular, una composición o una combinación de vacunas de la invención comprende un primer vector de adenovirus, preferiblemente un vector de adenovirus 26, que codifica un antígeno del VIH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 18, y comprende además un segundo vector de adenovirus, preferentemente un vector de adenovirus 26, que codifica un antígeno del VIH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 5, y uno o más vectores de adenovirus adicionales, preferentemente vectores de adenovirus 26, que codifican uno o más antígenos del VIH que comprenden la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 28 o número de ID de SEQ:2. 29. Por ejemplo, una composición o una combinación de vacunas según una realización de la invención puede comprender cuatro vectores de adenovirus, preferentemente vectores de adenovirus 26, con un primer vector que codifica una proteína sintética de la envoltura del VlH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 18; un segundo vector que codifica un antígeno del VIH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 5; un tercer vector que codifica un antígeno del VIH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 28; y un cuarto vector que codifica un antígeno del VIH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 29. Preferiblemente, el vector poxvirus de la invención puede formar parte de una combinación de vacuna con esos vectores adenovirus. Dicho vector poxvirus, preferiblemente un vector MVA, por ejemplo, un vector MVA-BN™, en una realización preferida codifica cada uno de los SEQ ID NO: 18, 5, 28 y 29;

[0135] En una realización particularmente preferida de la invención, una composición o una combinación de vacuna comprende un vector poxvirus, preferiblemente un vector MVA, preferiblemente MVA-BN™, que comprende la secuencia de ácido nucleico que codifica seis antígenos diferentes del VlH, a saber, los antígenos codificados por SEQ ID NO: 18 (mos2S Env), SEQ ID NO: 5 (mos1 Env), SEQ ID NO: 1 (mos1 Gag), SEQ ID NO: 2 (mos2 Gag), SEQ ID NO: 3 (mos1 Pol), y SEQ ID NO: 4 (mos2 Pol), donde SEQ ID NO: 1 y 3 pueden fusionarse opcionalmente (SEQ ID n O: 28; mos1GagPol) y SEQ ID NOs: 2 y 4 pueden fusionarse opcionalmente (SEQ ID NO: 29: mos2GagPol). Una ventaja es que sólo es necesario fabricar, purificar, formular, probar, almacenar, enviar y administrar un único vector para administrar estos seis antígenos del VIH. Además, se sabe que los vectores poxvirales, como el MVA, incluido el MVA-BN™, proporcionan buenas respuestas inmunitarias contra los antígenos codificados en ellos. Además, pueden utilizarse ventajosamente junto con otras plataformas vectoriales, como los vectores adenovirales, por ejemplo, Ad26, en regímenes de cebado para generar respuestas inmunitarias aún mejores. Por ejemplo, el vector poxvirus que comprende la secuencia de ácido nucleico que codifica los seis antígenos diferentes del VIH codificados por SEQ ID NO: 1-5 y 18 pueden utilizarse junto con uno o más vectores de adenovirus, preferentemente vectores de adenovirus 26, que codifiquen uno o más antígenos del VIH codificados por SEQ ID NO: 1-5 y 18, preferentemente en los que uno o más vectores de adenovirus codifican conjuntamente los SEQ ID NO: 1-5 y 18.

[0136] Como se ha mencionado anteriormente, en algunas realizaciones, la composición o una combinación de vacunas comprende además uno o más polipéptidos antigénicos del VIH aislados. Cualquier polipéptido antigénico del VIH conocido por los expertos en la materia a la vista de la presente divulgación puede incluirse además en una composición o una combinación de vacunas de la invención, incluyendo, pero sin limitarse a ello, una proteína de la envoltura del VIH (por ejemplo, gp160, gp140, gp120 o gp41), preferentemente una proteína gp140 trimérica estabilizada, como una proteína gp140 estabilizada de clado C o clado A. En una realización preferida, el polipéptido antigénico aislado del VIH es una proteína gpI40 trimérica estabilizada del clado C del VIH, como la que comprende los residuos 30-708 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: TAPDAAFD: residuos 7 de la SEQ ID NO: 7 están en la secuencia de señales). Un polipéptido Env del VIH alternativo o adicional que podría utilizarse además de la proteína gp140 del clado C o solo, es una proteína Env trímero mosaico, por ejemplo, con una secuencia de aminoácidos como la descrita en los aminoácidos 30-724 de SEQ ID NO: 36 (correspondiente a SEQ ID NO: 2 de WO 2014/107744, en el que los residuos 1-29 de SEQ ID NO: 36 están en la secuencia de señales). En ciertas realizaciones, los polipéptidos antigénicos del VIH comprenden tanto (i) una proteína gp140 del clado C que comprende los residuos de aminoácidos 30-708 de SEQ ID NO: 7, y (ii) una proteína gp140 de mosaico que comprende los residuos de aminoácidos 30-724 de SEQ ID NO: 36.

[0137] La invención también se refiere a un método para producir una composición o una combinación de vacunas de la invención. Según realizaciones de la invención, un método de producir una composición o una combinación comprende combinar un vector que comprende ácido nucleico que codifica la proteína sintética de la envoltura del VIH de la invención con un portador, y opcionalmente uno o más vectores adicionales que codifican uno o más polipéptidos antigénicos del VIH adicionales y/o uno o más polipéptidos antigénicos del VIH aislados. Un experto en la materia estará familiarizado con las técnicas convencionales utilizadas para preparar dichas composiciones.

[0138] Vacuna y combinaciones de vacunas

[0139] Otros aspectos generales de la invención se refieren a vacunas y combinaciones de vacunas. En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención aquí descritas son vacunas. Tal como se utiliza en el presente documento, el término "vacuna" se refiere a una composición que comprende una cantidad inmunológicamente eficaz de un vector de expresión, preferentemente un vector viral, que codifica una proteína sintética de la envoltura del VIH de la invención y, opcionalmente, codifica además uno o más antígenos adicionales del VIH que pueden proporcionar inmunidad protectora o una respuesta inmunitaria protectora a un sujeto, o para vacunar a un sujeto. Según realizaciones de la invención, tras la administración de la composición a un sujeto, el vector de expresión expresa la proteína sintética de la envoltura del VIH codificada y opcionalmente otros antígenos del VIH codificados, y la proteína sintética de la envoltura del VIH expresada y opcionalmente otros antígenos del VIH codificados se presentan al sistema inmunitario del sujeto, induciendo así la respuesta requerida para producir inmunidad, o inducir una respuesta inmunitaria.

[0140] Así, en otro aspecto general, la invención proporciona una vacuna para inducir una respuesta inmunitaria contra un virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) en un sujeto. Según realizaciones de la invención, la vacuna comprende una composición que comprende una cantidad inmunogénicamente eficaz de un vector de expresión que codifica una proteína sintética de la envoltura del VIH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 18. Preferiblemente, el vector de expresión es un vector viral, más preferiblemente un vector adenovirus, por ejemplo, el vector adenovirus 26, y más preferiblemente un vector poxvirus, por ejemplo, el vector MVA o MVA-BN™.

[0141] Según realizaciones de la invención, las composiciones de vacuna pueden comprender además uno o más vectores adicionales, por ejemplo, vectores virales, tales como vectores de adenovirus, preferentemente vectores de adenovirus 26, que codifican uno o más polipéptidos antigénicos del VIH adicionales y/o uno o más polipéptidos antigénicos del VIH aislados. La proteína sintética de la envoltura del VIH, los vectores adicionales y/o uno o más polipéptidos antigénicos aislados del VIH pueden formularse en la misma composición o en una o más composiciones diferentes en la vacuna.

[0142] La invención también se refiere a combinaciones de vacunas para cebar y potenciar una respuesta inmunitaria frente a uno o más clados del VIH en un sujeto que lo necesite utilizando uno o más vectores, opcionalmente en combinación con un polipéptido antigénico aislado. Así, en otro aspecto general, la invención proporciona una combinación de vacuna para inducir una respuesta inmunitaria contra un VIH en un sujeto que comprende:

a. una primera composición de vacuna que comprende una cantidad inmunológicamente eficaz de un vector poxvirus que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica un primer antígeno Env del VIH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 18, y opcionalmente comprende además una secuencia de ácido nucleico que codifica otros antígenos del VIH, preferiblemente uno o más antígenos del VIH que comprenden las secuencias de aminoácidos seleccionadas de SEQ ID NOs: 1-5, 28, y 29; y al menos uno de:

b. (i) una segunda composición de vacuna que comprende una cantidad inmunogénicamente eficaz de uno o más vectores de adenovirus que codifican uno o más antígenos del VIH que comprenden las secuencias de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste en SEQ ID NOs: 1-5, 18, 28 y 29; y b. (ii) una tercera composición de vacuna que comprende uno o más polipéptidos que comprenden una cantidad inmunogénicamente eficaz de un polipéptido antigénico aislado del VIH, en la que la primera composición y la segunda y/o tercera composición están presentes en la misma composición o en una o más composiciones diferentes.

[0143] En ciertas realizaciones de la misma, la primera composición de vacuna comprende un vector MVA que codifica un primer antígeno Env del VIH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 18, un segundo antígeno VIH Env que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 5, tercero y cuarto antígenos Gag del VIH que comprenden la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2, respectivamente, y quinto y sexto antígenos Pol del VIH que comprenden la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3 y s Eq ID NO: 4, respectivamente. En ciertas realizaciones, los antígenos Gag y Pol de SEQ ID NO: 1 y 3 se combinan y presentan como un antígeno de fusión Gag-Pol que comprende SEQ ID NO: 28, y/o los antígenos Gag y Pol de los SEQ ID NO: 2 y 4 se combinan y presentan como un antígeno de fusión Gag-Pol que comprende SEQ ID NO: 29.

[0144] En ciertas realizaciones de la misma, la segunda composición de vacuna comprende un vector Ad26 que codifica un antígeno del VIH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 18, un vector Ad26 que codifica un antígeno del VIH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 5, un vector Ad26 que codifica un antígeno del VIH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 28, y un vector Ad26 que codifica un antígeno del VIH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 29.

[0145] En ciertas realizaciones de la invención, una combinación de vacuna comprende uno o más polipéptidos que comprenden una cantidad inmunogénicamente eficaz de un polipéptido antigénico VIH aislado. Preferiblemente, un polipéptido antigénico del VIH aislado comprende los residuos 30-708 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: TAPDAAFD: residuos 7 de la SEQ ID NO: 36. En ciertas realizaciones, dos polipéptidos antigénicos aislados del VIH se administran juntos en una composición, por ejemplo un primer polipéptido antigénico aislado del VIH que comprende los residuos 30-708 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 7, y un segundo polipéptido antigénico aislado del VIH que comprende los residuos 30-724 de SEQ ID NO: 36. El polipéptido antigénico del VIH aislado puede estar presente en una tercera composición o en las composiciones primera y/o segunda. La primera o segunda composición puede administrarse junto con uno o más polipéptidos antigénicos aislados del VIH, preferiblemente gp140, para las administraciones de cebado y/o refuerzo.

[0146] Tal como se utilizan en el presente documento, los términos "codistribución", "coadministración" o "administrado junto con" se refieren a la administración simultánea de dos o más componentes, como un vector de expresión viral y un polipéptido antigénico aislado, o múltiples vectores de expresión viral. "Administración simultánea" puede ser la administración de los dos o más componentes al menos en el mismo día. Cuando dos componentes se "administran junto con", pueden administrarse en composiciones separadas secuencialmente dentro de un corto período de tiempo, como 24, 20, 16, 12, 8 o 4 horas, o dentro de 1 hora o menos, como esencialmente simultáneamente, o pueden administrarse en una única composición al mismo tiempo.

[0147] Otro aspecto general de la invención se refiere a un kit que comprende una combinación de vacunas según una realización de la invención.

[0148] Otras realizaciones de la proteína sintética de la envoltura del VIH, vectores de expresión, vectores de expresión adicionales, antígenos del VIH codificados por los vectores de expresión, y polipéptido antigénico aislado del VIH, etc., que pueden utilizarse en las combinaciones de vacunas de la invención se discuten en detalle anteriormente y en los ejemplos ilustrativos a continuación.

[0149] Método para inducir inmunidad protectora contra la infección por VIH

[0150] La invención también se refiere a un método para inducir una respuesta inmunitaria contra uno o más clados del VIH en un sujeto que lo necesite. Los métodos aquí descritos incluyen métodos de cebado y refuerzo de una respuesta inmunitaria utilizando uno o más vectores de expresión opcionalmente en combinación con uno o más polipéptidos antigénicos aislados.

[0151] Según realizaciones de la invención, "inducir una respuesta inmunitaria" cuando se usa con referencia a los métodos y composiciones aquí descritos abarca proporcionar inmunidad protectora y/o vacunar a un sujeto contra una infección, tal como una infección por VIH, con fines profilácticos, así como causar una respuesta o efecto inmunitario deseado en un sujeto que lo necesite contra una infección, tal como una infección por VIH, para fines terapéuticos, es decir, la vacunación terapéutica. "Inducir una respuesta inmunitaria" también abarca proporcionar una inmunidad terapéutica para tratar contra un agente patógeno, es decir, el VIH. Típicamente, para la vacunación profiláctica, las composiciones y vacunas se administran a sujetos que no han sido previamente infectados por el VIH, mientras que para la vacunación terapéutica, las composiciones y vacunas se administran a un sujeto ya infectado por el VIH. La respuesta inmunitaria puede ser una respuesta inmunitaria celular y/o una respuesta inmunitaria humoral.

[0152] Tal como se utiliza aquí, el término "inmunidad protectora" o "respuesta inmunitaria protectora" significa que el sujeto vacunado es capaz de controlar una infección con el agente patógeno contra el que se realizó la vacunación. Por lo general, el sujeto que ha desarrollado una "respuesta inmunitaria protectora" sólo desarrolla síntomas clínicos de leves a moderados o ningún síntoma en absoluto. Normalmente, un sujeto que tiene una "respuesta inmunitaria protectora" o una "inmunidad protectora" contra un determinado agente no morirá como consecuencia de la infección con dicho agente.

[0153] Tal como se utiliza en el presente documento, el término "inmunidad terapéutica" o "respuesta inmunitaria terapéutica" significa que el sujeto vacunado infectado por el VIH es capaz de controlar una infección con el agente patógeno, es decir, el VIH, contra el que se realizó la vacunación. Típicamente, la administración de las composiciones de vacuna cebadora y de refuerzo según las realizaciones de la invención tendrá un objetivo terapéutico para generar una respuesta inmunitaria contra el VIH tras la infección por el VIH o el desarrollo de síntomas característicos de la infección por el VIH. Preferentemente, los métodos de la invención tienen fines terapéuticos, como la vacunación terapéutica, en la que las composiciones y vacunas descritas en el presente documento se administran a un sujeto ya infectado por el VIH. Así, la población de pacientes para el tratamiento según los métodos de la invención aquí descritos son preferentemente sujetos infectados por el VIH, y más preferentemente sujetos humanos infectados por el VIH. Los términos "infección por el VIH" e "infectado por el VIH" utilizados en el presente documento se refieren a la invasión de un huésped humano por el VIH. Tal como se utiliza en el presente documento, "un sujeto infectado por el VIH" se refiere a un sujeto en el que el VIH ha invadido y posteriormente se ha replicado y propagado dentro del huésped, provocando así que el huésped esté infectado por el V iH o tenga una infección por el VIH o síntomas de la misma.

[0154] En un aspecto general, un método para inducir una respuesta inmunitaria contra un virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) en un sujeto comprende administrar al sujeto una composición que comprende una cantidad inmunogénicamente eficaz de un vector de expresión, preferentemente un vector de poxvirus (por ejemplo, MVA o MVA-BN™) que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína sintética de la envoltura del VIH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 18, y preferiblemente que codifiquen otros antígenos del VIH como se describe en el presente documento. Cualquiera de las descritas en el presente documento puede utilizarse en un método para inducir una respuesta inmunitaria contra el VIH en un sujeto. La composición puede comprender además uno o más vectores adicionales, por ejemplo, adenovirus, que codifiquen el mismo antígeno o uno o más antígenos adicionales del VIH y/o uno o más polipéptidos antigénicos aislados adicionales del VIH. También es posible codificar uno o más antígenos adicionales del VIH en el mismo vector que el vector que codifica la proteína de la envoltura del VIH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 18. Esto es particularmente adecuado para vectores poxvirus como el MVA, incluido el MVA-BN™, como se muestra en el presente documento.

[0155] En otro aspecto general, un método para inducir una respuesta inmunitaria contra un virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) en un sujeto comprende administrar al sujeto:

(a) una primera vacuna que comprende uno o más vectores de adenovirus recombinantes, preferentemente vectores Ad26, que codifican uno o más de los SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 4, 5, 18, 28, y 29; y Q

(b) una segunda vacuna que comprende un vector poxvirus, preferentemente un vector MVA que codifica SEQ ID NO: 18 y preferiblemente codifican además uno o más antígenos del VIH que comprenden las secuencias de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1-5, 28, y 29,

en los que los pasos (a) y (b) se llevan a cabo en cualquier orden, con uno de los pasos para la inmunización de cebado y el otro paso para reforzar la inmunización.

[0156] En algunas realizaciones, un método para inducir una respuesta inmunitaria comprende además administrar al sujeto uno o más polipéptidos antigénicos del VIH aislados, preferentemente uno o más polipéptidos antigénicos del VIH que comprenden (i) un polipéptido que comprende los residuos 30-708 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 7, o (ii) un polipéptido que comprende los residuos 30-724 de SEQ ID NO: 36, o (iii) ambos polipéptidos (i) y (ii). El uno o más polipéptidos antigénicos del VIH aislados pueden estar presentes en la misma composición que la primera y/o segunda composición o en una o más composiciones adicionales. En una realización preferida, el uno o más polipéptidos antigénicos aislados del VIH se administran aproximadamente al mismo tiempo que la composición utilizada para la inmunización de refuerzo. En ciertas realizaciones, el uno o más polipéptidos antigénicos aislados del VIH están presentes en la misma composición que la vacuna de refuerzo. En otras realizaciones, el uno o más polipéptidos antigénicos aislados del VIH están presentes en una composición separada de la vacuna de refuerzo. En ciertas realizaciones, el polipéptido antigénico del VIH aislado está en una composición que comprende un adyuvante, por ejemplo, fosfato de aluminio.

[0157] En una realización particular de un método de inducción de una respuesta inmunitaria según la invención, la primera composición comprende un vector de adenovirus, preferentemente un vector adenovirus 26, que codifica una proteína sintética de la envoltura del VIH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 18 y un segundo vector de adenovirus, preferentemente un vector de adenovirus 26, que codifica un antígeno del VIH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 5; la segunda composición comprende un vector poxvirus, preferentemente un vector MVA, tal como un vector MVA-BN™, según la invención que comprende ácido nucleico que codifica el antígeno sintético del VIH que comprende el aminoácido de SEQ ID NO: 18, y preferiblemente comprende además la secuencia de ácido nucleico que codifica uno o más antígenos del VIH que comprenden las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NOs: 1-5, 28 y 29, más preferiblemente antígenos del VIH que comprenden las secuencias de aminoácidos de los SEQ ID NOs: 5, 28 y 29; en los que la primera composición se administra al sujeto una o más veces para preparar la inmunización, y la segunda composición se administra al sujeto una o más veces para reforzar la inmunización, o en los que la primera composición se administra al sujeto una o más veces para reforzar la inmunización y la segunda composición se administra al sujeto una o más veces para preparar la inmunización. En realizaciones preferidas, la primera composición comprende además un tercer vector de adenovirus, preferiblemente un vector Ad26, que codifica un polipéptido antigénico del VIH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 28, y un cuarto vector de adenovirus, preferentemente un vector Ad26, que codifica un polipéptido antigénico del VIH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 29.

[0158] En otra realización particular de un método para inducir una respuesta inmunitaria, la primera composición comprende un primer vector de adenovirus, preferiblemente un vector de adenovirus 26, que codifica una proteína sintética de la envoltura del VIH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 18 y un segundo vector de adenovirus, preferentemente un vector de adenovirus 26, que codifica un polipéptido antigénico del VIH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 5; la segunda composición comprende un vector poxvirus, preferentemente un vector MVA, más preferentemente MVA- BN™, que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica antígenos del VIH que comprenden las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 1-5 y 18, más preferiblemente SEQ ID NO: 5, 18, 28, y 29, y combinaciones de los mismos; en el que la primera composición se administra al sujeto, una o más veces para la inmunización de cebado, y la segunda composición se administra al sujeto una o más veces para reforzar la inmunización, opcionalmente junto con uno o más polipéptidos antigénicos aislados del VIH; o en el que la segunda composición se administra al sujeto, una o más veces para la inmunización de cebado, y la primera composición se administra al sujeto una o más veces para reforzar la inmunización, opcionalmente junto con uno o más polipéptidos antigénicos aislados del VIH. En realizaciones preferidas, la primera composición comprende además un tercer vector de adenovirus, preferiblemente un vector Ad26, que codifica un polipéptido antigénico del VIH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 28, y un cuarto vector de adenovirus, preferentemente un vector Ad26, que codifica un polipéptido antigénico del VIH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 29.

[0159] La administración de las composiciones inmunogénicas que comprenden los vectores de expresión y/o los polipéptidos antigénicos es típicamente intramuscular, intradérmica o subcutánea. No obstante, también pueden contemplarse otros modos de administración, como intravenosa, rectal, cutánea, oral, nasal, etc. La administración intramuscular de las composiciones inmunogénicas puede lograrse utilizando una aguja para inyectar una suspensión de los vectores de expresión, por ejemplo, vectores de adenovirus, y/o polipéptidos antigénicos. Una alternativa es el uso de un dispositivo de inyección sin aguja para administrar la composición (utilizando, por ejemplo, Biojector™) o un polvo liofilizado que contenga la vacuna.

[0160] Para inyección intramuscular, intravenosa, cutánea o subcutánea, o inyección en el lugar de la aflicción, el vector estará en forma de una solución acuosa parenteralmente aceptable que esté libre de pirógenos y tenga pH, isotonicidad y estabilidad adecuados. Asimismo, el polipéptido antigénico aislado estará en forma de una solución parenteralmente aceptable que tenga un pH, isotonicidad y estabilidad adecuados. Los expertos en la materia pueden preparar soluciones adecuadas utilizando, por ejemplo, vehículos isotónicos como la inyección de cloruro sódico, la inyección de Ringer o la inyección de Ringer lactato. Pueden incluirse conservantes, estabilizantes, tampones, antioxidantes y/u otros aditivos, según sea necesario. También puede emplearse una formulación de liberación lenta.

[0161] Típicamente, la administración de las composiciones vacunales según realizaciones de la invención tendrá un objetivo terapéutico de generar una respuesta inmunitaria contra un antígeno del VIH tras la infección o el desarrollo de síntomas. En otras realizaciones, los vectores de expresión, por ejemplo, vectores de adenovirus y/o vectores de poxvirus, y/o los polipéptidos antigénicos del VIH pueden administrarse con fines profilácticos antes de la infección o el desarrollo de síntomas.

[0162] Las composiciones inmunogénicas que contienen los vectores de expresión, por ejemplo, vectores de adenovirus y/o vectores de poxvirus, y/o polipéptidos antigénicos se administran a un sujeto, dando lugar a una respuesta inmunitaria contra el VIH en el sujeto. Una cantidad de una composición suficiente para inducir una respuesta inmune detectable se define como una "dosis inmunogénicamente eficaz" o "cantidad inmunogénicamente eficaz". En una realización típica de la invención, la respuesta inmunitaria es una respuesta inmunitaria terapéutica.

[0163] La cantidad real administrada, así como el ritmo y el curso temporal de la administración, dependerán de la naturaleza y la gravedad de lo que se esté tratando. La prescripción de tratamientos, por ejemplo, las decisiones sobre dosificación, etc., son responsabilidad de los médicos generalistas y otros profesionales de la salud y otros médicos, o en un contexto veterinario un veterinario, y suele tener en cuenta el trastorno a tratar, el estado de cada paciente, el lugar de administración, el método de administración y otros factores conocidos por los profesionales. Pueden encontrarse ejemplos de las técnicas y protocolos mencionados en Remington's Pharmaceutical Sciences, 16a edición, Osol, A. ed., 1980.

[0164] Tras la producción de vectores de adenovirus y/o vectores de poxvirus como los vectores MVA y la formulación opcional de dichas partículas en composiciones, los vectores pueden administrarse a un individuo, en particular a un ser humano u otro primate. La administración a un mamífero no humano no tiene por qué tener fines terapéuticos, pero puede utilizarse en un contexto experimental, por ejemplo, en la investigación de los mecanismos de respuesta inmunitaria a la proteína sintética de la envoltura del VIH y otros antígenos del VIH expresados por los vectores de adenovirus y/o los vectores de poxvirus de la invención.

[0165] En una realización de los métodos divulgados, se utilizan uno o más vectores de adenovirus que codifican uno o más antígenos del VIH divulgados aquí para cebar la respuesta inmunitaria. Uno o más polipéptidos antigénicos aislados del VIH pueden utilizarse junto con uno o más vectores de adenovirus para la inmunización de cebado. En otra realización, uno o más vectores poxvirales, preferiblemente MVA o MVA-BN™, los vectores poxvirales que codifican uno o más antígenos del VIH de la presente invención se utilizan para cebar la respuesta inmunitaria. Uno o más polipéptidos antigénicos aislados del VIH pueden utilizarse junto con uno o más vectores poxvirales para la inmunización de cebado. La inmunización de cebado puede administrarse una sola vez, pero opcionalmente también puede administrarse varias veces, por ejemplo, una administración inicial de cebado en el momento 0, seguida de otra administración de cebado aproximadamente entre 1 y 24 semanas después de la administración inicial de cebado. Uno o más polipéptidos antigénicos aislados del VIH, opcionalmente junto con uno o más vectores adicionales de adenovirus o poxvirus que codifican uno o más antígenos adicionales del VIH, pueden utilizarse para potenciar la respuesta inmunitaria.

[0166] Tras la administración de cebado, uno o más de los vectores adenovirales de la presente invención o los vectores poxvirales de la presente invención pueden utilizarse en una o más inmunizaciones de refuerzo. También puede administrarse una inmunización de refuerzo una o varias veces, por ejemplo, primero a las 4-52 semanas aproximadamente de la administración inicial de refuerzo, seguida opcionalmente de otra administración de refuerzo, por ejemplo, a las 8-100 semanas aproximadamente de la administración inicial de refuerzo. En algunas otras realizaciones, uno o más vectores adenovíricos de la presente invención se administran junto con uno o más vectores poxvirales de la presente invención para la inmunización de cebado y/o de refuerzo. Se controla la respuesta inmunitaria inducida por la inmunización.

[0167] Por lo general, se prefieren los regímenes prime-boost para generar respuestas inmunitarias fuertes. Es posible administrar el mismo vector varias veces, lo que se conoce como prime-boost homólogo. Según la invención, es preferible aplicar un régimen heterólogo de cebado y refuerzo, que en este contexto indica que los vectores de cebado y refuerzo son diferentes. En algunas realizaciones de este régimen heterólogo de cebado y refuerzo, por ejemplo, el cebado se realiza con un vector adenoviral, por ejemplo, Ad26, y el refuerzo se realiza con un vector poxviral, por ejemplo, MVA, por ejemplo, MVA-BN™. En otras realizaciones del régimen heterólogo de cebado y refuerzo, por ejemplo, el cebado se realiza con un vector poxviral, por ejemplo, MVA, como MVA-BN™, y el refuerzo se realiza con un vector adenoviral, por ejemplo, Ad26. Opcionalmente, en los regímenes de cebado y refuerzo, el polipéptido antigénico aislado del VIH, como gp140, puede administrarse aproximadamente al mismo tiempo que la administración de cebado o refuerzo de dicho vector adenoviral o poxviral.

[0168] En una realización ejemplar y no limitante, se administran a un sujeto cuatro vectores adenovirales 26 diferentes, que codifican conjuntamente antígenos del VIH que comprenden SEQ ID NO: 5, 18, 28 y 29, en los que los vectores están presentes en una proporción 1:1:1:1 y se administran a una dosis total de 5x1010 partículas virales en 0,5 mL mediante inyección intramuscular en las semanas 0 y 12, seguida de la administración de un vector MVA que codifica antígenos del VIH que comprenden los SEQ ID NO: 5, 18, 28 y 29, a una dosis de aproximadamente108 unidades formadoras de placa por inyección de 0,5 ml administrada por vía intramuscular en las semanas 24 y 48.

[0169] Los expertos en la materia apreciarán fácilmente que el régimen para las administraciones de cebado y refuerzo puede ajustarse basándose en las respuestas inmunitarias medidas tras las administraciones. Por ejemplo, las composiciones de refuerzo se administran generalmente semanas o meses o incluso años después de la administración de la composición de cebado.

[0170] Según realizaciones de la invención, puede administrarse un adyuvante junto con el polipéptido antigénico del VIH aislado como parte de la inmunización de cebado y/o refuerzo. Puede utilizarse cualquier adyuvante junto con el polipéptido antigénico del VIH aislado en vista de la presente divulgación, y en ciertas realizaciones el adyuvante es una sal de aluminio, como el fosfato de aluminio.

[0171] En una realización preferida de la invención, los vectores de adenovirus utilizados en los métodos aquí divulgados incluyen un vector rAd26 y los vectores de poxvirus utilizados en los métodos aquí divulgados incluyen un vector MVA.

[0172] En una realización ejemplar, un vector rAd26 que codifica una proteína sintética de la envoltura del VIH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 18 se utiliza para cebar la respuesta inmunitaria en combinación con un vector rAd26 que codifica un antígeno del VIH que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 5. Uno o más vectores rAd26 adicionales que codifican una o más antígenos del VIH adicionales que tengan las secuencias de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste en SEQ ID NOs: 1-4, 28 y 29 también pueden administrarse junto con los otros vectores rAd26 para preparar la respuesta inmunitaria. En ciertas realizaciones, la administración de cebado puede volver a administrarse antes de que se administre cualquier inmunización de refuerzo. Un vector MVA que codifica una proteína sintética de la envoltura del VIH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 18 y codificando además SEQ ID NOs: 5, 28 y 29 se utiliza para potenciar la respuesta inmunitaria en estas realizaciones. Opcionalmente, un polipéptido antigénico del VIH aislado, como el que comprende los residuos 30-708 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 7, o la que comprende los residuos 30-724 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 36, o una combinación de al menos dos de esos polipéptidos antigénicos aislados del VIH, se administra junto con el vector MVA para potenciar la respuesta inmunitaria. Preferiblemente, se administra además un adyuvante con el polipéptido antigénico del VIH aislado en la inmunización de refuerzo.

[0173] En otra realización ejemplar, un vector MVA o MVA-BN™ que codifica una proteína sintética de la envoltura del VIH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 18 y codificando además SEQ ID NOs: 5, 28 y 29 se utiliza para preparar la respuesta inmunitaria. En ciertas realizaciones, la administración de cebado se vuelve a administrar antes de que se administre cualquier inmunización de refuerzo. Después de la administración de cebado, se administra una o más inmunizaciones de refuerzo, la inmunización de refuerzo comprende un vector rAd26 que codifica una proteína sintética de la envoltura del VIH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 18 en combinación con un vector rAd26 que codifica un antígeno del VIH que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 5. Uno o más vectores rAd26 adicionales que codifican uno o más polipéptidos antigénicos del VIH adicionales que tienen las secuencias de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste en SEQ ID NOs: 1-4, 28 y 29 también se administran preferentemente junto con los otros vectores rAd26 para potenciar la respuesta inmunitaria. Opcionalmente, un polipéptido antigénico del VIH aislado, como el que comprende los residuos 30-708 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 7, o la que comprende los residuos 30-724 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 36, o una combinación de al menos dos de esos polipéptidos antigénicos aislados del VIH, se administra junto con los vectores rAd26 para potenciar la respuesta inmunitaria.

[0174] En una realización particularmente ejemplar, se ceba una respuesta inmunitaria mediante la administración de cuatro antígenos del VIH codificados en vectores adenovirales, preferentemente vectores rAd26, siendo los cuatro antígenos codificados: (i) una proteína sintética de la envoltura del VIH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 18, (ii) el antígeno Env del VIH que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 5, (iii) el antígeno de fusión Gag-Pol del VIH que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 28, y (iv) el antígeno de fusión GagPol del VIH que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 29. Cada uno de estos cuatro antígenos puede codificarse en un vector adenoviral independiente, preferiblemente un vector rAd26, administrado a una dosis total de aproximadamente 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 x1010 partículas virales (vp), por ejemplo, aproximadamente 5x1010 vp (para todos los vectores juntos). Los vectores pueden mezclarse previamente, por ejemplo, en una proporción 1:1:1:1. La administración de los vectores de adenovirus se realiza preferentemente mediante inyección intramuscular. La administración de cebado puede volver a administrarse tras la administración inicial de cebado. En esta realización, se potencia una respuesta inmunitaria mediante la administración de un vector MVA o MVA-BN™ que codifica cuatro antígenos del VIH que comprenden SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 28 y SEQ ID NO: 29 a una dosis de 105 a 1011 ufp, por ejemplo una dosis de 107 ufp, 108 ufp o 109 ufp, o a una dosis de 105 a 1010 TCID<50>, por ejemplo 107, 108 o 109 TCID<50>. Preferiblemente, la dosis es de 2 x 105 a 5 x 108 ufp. Preferiblemente, la dosis para humanos comprende al menos 5 x 107 ufp, por ejemplo, al menos 1 x 108 ufp, o alternativamente al menos 2x107 TCID<50>, al menos 3x107 TCID<50>, al menos 5x107 TCID<50>, por ejemplo, al menos Ix108 TCID<50>, o al menos 2x108 TCID<50>.. La administración de MVA o MVA-BN™ para reforzar la respuesta inmunitaria puede realizarse en cualquier momento después de la administración inicial de cebado. La administración de refuerzo puede repetirse tras la administración inicial de refuerzo. Todas las administraciones de MVA según esta realización pueden realizarse, por ejemplo, por vía intramuscular o subcutánea.

[0175] Alternativamente, el vector MVA puede usarse para la administración de cebado y los vectores Ad26 para la administración de refuerzo, todo esencialmente como se indicó anteriormente excepto en el orden inverso de administración de los tipos de vectores adenoviral y poxviral. Opcionalmente, la proteína gp140 aislada puede administrarse junto con la administración de refuerzo. Por ejemplo, la proteína Env gp140 aislada, por ejemplo, la proteína gp140 del clado C (que comprende los residuos 30-708 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 7), o la proteína gp140 del mosaico (que comprende los residuos 30- 724 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 36), o proteína gp140 del clado C y proteína gp140 del mosaico, a una dosis total de aproximadamente 50-300 pg de proteína, por ejemplo 50 o 250 microgramos de proteína gp140 del clado C, o por ejemplo 50 o 250 microgramos de proteína gp140 del mosaico, o por ejemplo 50 o 250 microgramos de una combinación de proteína gp140 del clado C y proteína gp140 del mosaico (por ejemplo en proporción 1:1, ya sea mezcladas o administradas por separado). 50 o 250 microgramos de una combinación de proteína gp140 de clado C y proteína gp140 de mosaico (por ejemplo, en una proporción 1:1, mezcladas o administradas por separado) pueden administrarse junto con el vector poxvirus para la inmunización de refuerzo. Preferiblemente, la proteína gp140 se administra junto con un adyuvante, por ejemplo, fosfato de aluminio.

[0176] En ciertas realizaciones, un método de inducción de una respuesta inmunitaria según la invención comprende además la administración de un agente purgador de reservorios virales latentes. Las células infectadas de forma latente por el VIH portan un virus integrado que es transcripcionalmente silencioso, lo que dificulta la erradicación eficaz de la infección por VIH en los sujetos tratados. En el presente documento, "agente purgante de reservatorios" y "agente purgante de reservorios virales latentes" se refieren a una sustancia que reduce el reservorio latente del VIH reactivando los reservorios del VIH, por ejemplo, induciendo la expresión del VIH quiescente. Ejemplos de agentes de purga de reservorios virales latentes adecuados para su uso con la invención incluyen, pero no se limitan a, inhibidores de histona deacetilasa (HDAC) y moduladores de receptores tipo Toll (por ejemplo, TLR7), como los descritos en W02016/007765 y WO2016/177833. El agente de purga del reservorio viral latente puede administrarse antes, después o junto con una o más de las inmunizaciones de cebado y refuerzo descritas en el presente documento. La vacunación de una combinación de vectores de adenovirus 26 que codifican los antígenos Gag, Pol y Env como cebador, seguida de vectores MVA que codifican dichos antígenos como refuerzo, en combinación con la estimulación de TLR7 ha demostrado dar lugar a una mejora del control virológico y un retraso del rebote viral tras la interrupción de la terapia antirretroviral en estudios con modelos de monos rhesus, lo que demuestra el potencial de la vacunación terapéutica combinada con la estimulación inmunitaria innata para aspirar a la cura funcional de la infección por VIH (Borducchi E.N., et al, 2016, Nature 540: 284 287 (doi: 10/1038/nature20583)).

[0177] En ciertas realizaciones de la invención, las inmunizaciones de cebado y refuerzo aquí descritas para inducir una respuesta inmunitaria pueden combinarse con un tratamiento estándar, por ejemplo, terapia antirretrovírica (TAR). Los sujetos tratados según las inmunizaciones de cebado/reforzamiento de la invención también pueden someterse a TAR con cualquier medicamento antirretroviral conocido en la técnica en vista de la presente divulgación. Los antirretrovirales son medicamentos que tratan el VIH, aunque no matan ni curan el virus. Sin embargo, cuando se toman en combinación pueden impedir el crecimiento del virus. Cuando el virus se ralentiza, también lo hace la enfermedad del VIH. Los medicamentos antirretrovirales se denominan ARV. La terapia antirretrovírica combinada (TARC) se conoce como terapia antirretrovírica de gran actividad (TARGA). Un experto en la materia podrá determinar el tratamiento antirretrovírico adecuado, la frecuencia de administración, la dosificación del TAR, etc. para que sea compatible con la administración de las inmunizaciones de cebado/reforzamiento de la invención.

[0178] Los ejemplos de fármacos antirretrovirales utilizados para el TAR incluyen, pero no se limitan a los inhibidores nucleósidos de la transcriptasa inversa (INTR, cuyos ejemplos no limitantes incluyen zidovudina, didanosina, estavudina, lamivudina, abacavir, tenofovir, combivir [combinación de zidovudina y lamivudina], trizivir [combinación de zidovudina, lamivudina y abacavir], emtricitabina, truvada [combinación de emtricitabina y tenofovir] y epzicom [combinación de abacavir y lamivudina]), inhibidores no nucleosídicos de la transcriptasa inversa (ITINN, entre los que se incluyen, a título de ejemplo no limitativo, nevirapina, delavirdina, efavirenz, etravirina y rilpivirina), inhibidores de la proteasa (inhibidores de la proteasa, como saquinavir, indinavir, ritonavir, nelfinavir, amprenavir, lopinavir/ritonavir y atazanavir), fosamprenavir, tipranavir, darunavir), inhibidores de la integrasa (INSTIs, ejemplos no limitantes incluyendo raltegravir, elvitegravir, y dolutegravir), e inhibidores de fusión, inhibidores de entrada y/o antagonistas de receptores de quimioquinas (FIs, antagonistas CCR5; ejemplos no limitantes incluyendo enfuvirtida, aplaviroc, maraviroc, vicriviroc, y cnicriviroc).

[0179] En otras realizaciones, los sujetos se someten a la interrupción (también referida como discontinuación, usada indistintamente aquí) del ART después de la finalización de una inmunización de cebado/reforzamiento según realizaciones de la invención. En algunas realizaciones, los sujetos pueden someterse a una interrupción analítica del tratamiento antirretroviral (ARV ATI) tras la finalización de una inmunización de refuerzo de cebado según realizaciones de la invención. "Interrupción del tratamiento antirretroviral analítico" e "ARV ATI", tal como se utilizan en la invención, se refieren a la interrupción del tratamiento con fármacos antirretrovirales con el fin de evaluar la supresión viral y el control virémico en ausencia de ART continuado. Normalmente, los sujetos pueden someterse a una ITA antirretroviral, es decir, se puede interrumpir la terapia antirretroviral, cuando el sujeto tiene niveles plasmáticos de ARN del VIH inferiores a 50 copias/mL durante al menos 52 semanas, pero un sujeto puede someterse a una ITA antirretroviral incluso si tiene uno o más episodios (es decir, instancias) de ARN del VIH en plasma superiores a 50 copias/mL e inferiores a 200 copias/mL dentro de este periodo, siempre que el cribado inmediatamente anterior a la ARV ATI muestre menos de 50 copias/mL de ARN del VIH en plasma.

[0180] Según realizaciones de la invención, el tratamiento antirretroviral puede interrumpirse entre 4 y 20 semanas después de la administración de la última vacuna de refuerzo. En ciertas realizaciones, para los sujetos que están en tratamiento antirretroviral basado en inhibidores no nucleósidos de la transcriptasa inversa NNRTI), se puede administrar un inhibidor de la proteasa potenciado en lugar del NNRTI durante 1-2 semanas antes de interrumpir el tratamiento antirretroviral para reducir el riesgo de desarrollar resistencia a los NNRTI. También es posible administrar un activador (por ejemplo, un inhibidor de la histona desacetilasa o un modulador de TLR7) durante la fase de ATI para activar cualquier reservorio de VIH (por ejemplo, latente) y mejorar así la respuesta inmunitaria.

[0181] Los sujetos sometidos a una ARV ATI pueden ser monitorizados, por ejemplo, midiendo los niveles plasmáticos de ARN del VIH. Por ejemplo, la monitorización tras el inicio de la ARV ATI puede realizarse hasta dos veces por semana durante las primeras seis semanas, cuando es más probable que se produzca viremia de rebote. "Viremia de rebote" se define como niveles plasmáticos de ARN del VIH superiores a 1.000 copias/ml tras la ARV ATI. El tratamiento antirretroviral puede reiniciarse en sujetos con viremia de rebote. Preferiblemente, un sujeto tratado según los métodos de la invención mantendrá el control virémico tras la interrupción del TAR. Tal y como se utiliza aquí, "mantener el control virémico" se define como al menos 24 semanas con un ARN del VIH en plasma inferior a 50 copias/mL tras el ARV ATI. Se sigue considerando que se cumple el criterio de "mantener el control virémico" si hay uno o más casos de ARN del VIH en plasma de más de 50 copias/ml a menos de 1000 copias/ml, siempre que el sujeto no tenga niveles de ARN del VIH en plasma superiores a 1000 copias/ml en dos determinaciones consecutivas separadas por al menos una semana.

[0182] Típicamente (no utilizando los métodos de la presente invención) los sujetos humanos infectados por el VIH tienen un retorno de la viremia después de 2-3 semanas tras la interrupción del ART. Sin querer estar limitado por ninguna teoría, se cree que la inmunización de cebado/reforzamiento según las realizaciones de la invención entre individuos con VIH totalmente suprimido dará lugar a una respuesta inmunitaria mensurable y mantendrá el control virémico después de la ARV ATI en al menos ciertos individuos. En algunas realizaciones, los sujetos pueden interrumpir el tratamiento antirretroviral después de haber sido tratados según un método de la invención. La interrupción del tratamiento antirretroviral puede durar largos periodos de tiempo (por ejemplo, al menos 24 semanas, preferiblemente más, por ejemplo, al menos 28, 32, 36, 40, 44, 48, 52 semanas, 16 meses, 18, 20, 22, 24 meses, o incluso más). Estos periodos en los que se suspende o interrumpe el tratamiento antirretroviral se denominan "vacaciones", "vacaciones del tratamiento antirretroviral" o "vacaciones del tratamiento". En otras realizaciones, la terapia con vacunas según los métodos de la invención puede proporcionar la remisión del VIH, lo que significa que la supresión viral se mantiene en ausencia de ART.

EJEMPLOS

Ejemplo 1: Diseño de secuencias de antígenos de la envoltura del VIH

[0229] Se diseñaron varias secuencias del antígeno de la envoltura del VIH que tenían similitud de secuencia con el antígeno mosaico del VIH mos2Env (SEQ ID NO: 6; anteriormente descrito también en WO 2010/059732). Las secuencias de nuevo diseño, unidas a la membrana, se basaron en (una combinación de) secuencias de tipo salvaje totalmente naturales de proteínas de la envoltura del VIH, o una quimera de secuencias mos2Env y secuencias de proteínas de la envoltura del VIH de tipo salvaje. Además de las secuencias completas de las proteínas de la envoltura (véase FIG. 1A), también se diseñaron secuencias con un truncamiento C-terminal del dominio citoplasmático (véase, por ejemplo, FIG.

1C). Véase también, por ejemplo, Schiernle et al., PNAS 1997; Abrahamyan et al., J Virol 2005; Edwards et al., J. Virology, 2002, 76:2683- 2691. También se prepararon variantes solubles por truncamiento C-terminal antes de la región transmembrana (TM), que se sustituyó por un dominio de trimerización, como un dominio de trimerización GCN4 (véase, por ejemplo, FIG. 1B). Estas variantes solubles se convirtieron además en una variante de cadena única mediante la mutación del sitio de escisión de furina, inhibiendo así el procesamiento del dominio extracelular de la proteína de la envoltura en las subunidades gp120 y gp41.

[0230] De todas las construcciones generadas y probadas, las construcciones basadas en C4 tenían las propiedades más óptimas, por ejemplo, buena manufacturabilidad, plegamiento, inmunogenicidad, etc. y éstas fueron seleccionadas para estudios posteriores. Una variante soluble de la construcción C4 que tiene un dominio de trimerización GCN4 en lugar del dominio transmembrana (sC4, FIG. 1B), y una variante que comprende un fragmento de 7 aminoácidos del dominio citoplasmático (C4D7, FIG. 1C) también se generaron y probaron en otros estudios. Las secuencias de aminoácidos de C4, sC4 y C4D7 se muestran en SEQ ID NO: 17, 19 y 18, respectivamente. Las secuencias que las codifican se muestran en SEQ ID NO: 25, 27 y 26, respectivamente. El constructo Cl tiene una secuencia de dominio extracelular basada en la secuencia mos2Env (SEQ ID NO: 6). Una variante soluble de la construcción Cl que tiene un dominio de trimerización GCN4 en lugar del dominio transmembrana (sC1), y una variante que comprende un fragmento de 7 aminoácidos del dominio citoplasmático (C1D7), similar a sC4 y C4D7 como se muestra en las FIGS. 1B e 1C, respectivamente. El constructo C1 y sus variantes se utilizaron en estudios posteriores con fines comparativos, ya que son basada esencialmente en la secuencia mos2Env del estado de la técnica. Las secuencias de aminoácidos de C1, sC1 y C1D7 se muestran en SEQ ID NO: 31, 30 y 32, respectivamente. Las secuencias de ácido nucleico que las codifican se muestran en SEQ ID NO: 34, 33 y 35, respectivamente. Otros constructos que se probaron resultaron menos óptimos que los basados en el constructo C4 y no se tuvieron en cuenta para su desarrollo posterior.

Ejemplo 2: Expresión y plegamiento de proteínas sintéticas de la envoltura del VIH

[0231] Se midió el nivel de expresión, el plegamiento y la expresión en la superficie celular de las proteínas sintéticas de la envoltura del VIH.

[0232] Niveles de expresión

[0233] Las células HEK293F se transfectaron transitoriamente con un plásmido que codifica las proteínas sintéticas solubles de la envoltura del VIH sC1 y sC4 como se describe en el Ejemplo 1. Los niveles de expresión de la proteína soluble se midieron en el sobrenadante mediante Western blot cuantitativo (QWB). Los resultados se muestran en la Tabla 2. 2. Los bajos niveles de expresión de sC1 (que corresponde esencialmente a mos2Env con un dominio transmembrana añadido) concuerdan con nuestros recientes descubrimientos sobre mos2Env. Como demuestran los resultados, la variante sC4 de la invención mostró niveles de expresión significativamente más altos que la variante sC1 (control).

[0234] Plegado de proteínas

[0235] El plegamiento de la proteína se probó midiendo la unión de proteínas sintéticas solubles de la envoltura del VIH a un anticuerpo (MAb 17b) que se sabe que se une al sitio de unión del correceptor de la proteína de la envoltura del VIH, que se expone sólo después de la unión de CD4, mediante un ensayo inmunoenzimático (ELISA). En particular, se probó la unión de sC4 purificado a MAb 17b con unión previa de sC4 a CD4, y sin unión previa de sC4 a CD4. Se utilizó sC1 purificado como control. La unión de MAb 17b a sC4 sin unión previa de CD4 a la proteína de la envoltura es una indicación de proteína de la envoltura parcialmente desplegada o pre-desplegada (es decir, una Env inestable que adopta la conformación "abierta" en ausencia de unión de CD4). Los resultados del ensayo ELISA se muestran en las FIGS. 3A y 3B.

[0236] Como se muestra en la FIG. 3B, sC4 muestra una fuerte unión a MAb 17b con unión previa a CD4, pero ninguna unión detectable a MAb 17b sin unión previa a CD4. Por el contrario, como se muestra en la FIG. 3A, sC1 mostró una unión mucho menor a MAb 17 tanto con como sin unión previa a CD4. Los resultados sugieren que sC4 tiene un patrón de plegamiento correcto, sin exposición del sitio de unión al correceptor antes de la unión a CD4.

[0237] El plegamiento de la proteína también se analizó mediante electroforesis en gel de poliacrilamida nativa (PAGE) de sC1 y sC4 para evaluar la estructura cuaternaria de las variantes de proteína soluble, y la posible formación incorrecta de puentes disulfuro entre los protómeros. Después de la electroforesis en un gel nativo, la proteína en el gel se detectó mediante análisis Western blot. Como muestran los resultados de la FIG. 4, la mayor parte de sC4 está presente en estado trimérico, que es la estructura cuaternaria correcta.

[0238] En conjunto, los resultados de los experimentos de plegamiento de proteínas demuestran que la proteína sintética soluble de la envoltura del VIH sC4 tiene el perfil de plegamiento deseado, que mejora en comparación con el perfil de plegamiento del antígeno mos2Env existente (representado por sC1).

[0239] Expresión en la superficie celular

[0240] Expresión en la superficie celular de las variantes unidas a la membrana de las proteínas de la envoltura del VIH C1 (longitud completa), c 4 (longitud completa, ver FIG. 1A), C1D7 y C4D7. Las células HEK293T se transfectaron transitoriamente sólo con el plásmido que codifica la eGFP (control negativo, NC), o con el plásmido que codifica la eGFP junto con un constructo de expresión que codifica una variante de la proteína de la envoltura del VIH. Dos días después de la transfección, las células se sometieron a un análisis de clasificación celular activada por fluorescencia (FACS) tras la exposición a varios anticuerpos poli y monoclonales dirigidos contra gpl20, y anticuerpos secundarios, y después se examinaron los niveles de expresión de la superficie celular de la proteína envolvente. La calidad de las variantes de la envoltura se evaluó determinando los niveles de expresión global utilizando un anticuerpo policlonal anti-gp120, y evaluando la unión relativa de los anticuerpos ampliamente neutralizantes PG9 y PG 16, que son dependientes de la estructura cuaternaria, y se unen preferentemente al trímero de la envoltura correctamente plegado.

[0241] Los resultados de los experimentos de expresión en la superficie celular se muestran en la FIG. 5. Los niveles de expresión en superficie de las variantes truncadas C1D7 y C4D7, medidos con un anticuerpo anti gpl20, son muy superiores a los niveles de expresión en superficie de sus homólogas de longitud completa, Cl y C4, respectivamente. Esto confirma que la deleción de 144 residuos del carboxi-terminal de Env aumenta los niveles de expresión en la superficie de la envoltura. La construcción C4 de longitud completa de la invención también mostró una mejor unión a<p>G9 y PG 16 en comparación con Cl de longitud completa, lo que sugiere que la secuencia de envoltura C4 está correctamente plegada (es decir, un trímero) en la superficie celular.

[0242] Los resultados también demuestran que la variante C1D7, que es esencialmente Mos2Env con un dominio transmembrana añadido y 7 aminoácidos del dominio citoplasmático, puede expresarse superficialmente en células HEK293T. Esto contrasta con la construcción soluble en Ad26.mos2Env, que no puede expresarse a niveles detectables en la superficie cuando se transfecta a células A549. Sin embargo, la unión relativa a PG9 y PG 16 es apenas detectable por encima del fondo, lo que sugiere que la secuencia de envoltura de C1D7 está mal plegada y probablemente no está presente como un trímero intacto en la superficie celular.

[0243] En general, la variante de la envoltura C4D7 tiene el perfil de unión de anticuerpos más óptimo, con mayor expresión de gp120 que su homólogo de longitud completa C4, y con una unión PG9 y PG16 mayor de 15 veces en comparación con C1 y C1D7 (FIG. 5).

Ejemplo 3: Estabilidad de los vectores que codifican secuencias de la envoltura del VIH

[0244] Trabajos anteriores en nuestros laboratorios (no publicados) indicaron que los vectores de adenovirus 26 (Ad26) que codificaban la secuencia del antígeno mos2Env mostraban relaciones VP/IU relativamente altas (lo que indicaba una menor calidad de los lotes de productos de adenovirus) y, además, que dichos vectores mostraban problemas de estabilidad. Por consiguiente, era importante probar la estabilidad de las construcciones sintéticas de proteína de envoltura del VIH de la invención en un fondo de adenovirus.

[0245] Se generaron en células PER.C6 vectores Ad26 recombinantes (rAd26) que codifican secuencias de antígenos del VIH de la invención C4, C4D7 y sC4 como se describió anteriormente en el Ejemplo 1 (denominados "rAd26.C4", "rAd26.C4D7" y "rAd26.sC4", respectivamente). Se escogieron clones de vectores (placas) y se escalaron para la generación de lotes de investigación. Se escaló un máximo de 5 clones virales (placas) a formato T25 y se pasaron en serie durante 10 pasajes en formato T25 (los pasajes 1-3 son los pasos de transfección y purificación de la placa, seguidos de 10 pasajes en formato T25, lo que da un total de 13 pasajes). La estabilidad genética se evaluó en el número de pasaje viral (vpn) 3, 5, 10 y 13 mediante un ensayo de PCR del casete transgénico El, seguido de secuenciación en el vpn 13. Los resultados se muestran en la Fig. 6.

[0246] Los vectores rAd26 que codifican C4 en toda su longitud (rAd26.C4) mostraron características de crecimiento deficientes, determinadas por la ausencia de efecto citopatógeno (ECP) completo en 2-3 días; inestabilidad genética, determinada por deleciones de la región del casete transgénico El; o una combinación de las mismas (FIG. 6). Debido a las deficientes características de crecimiento y a la inestabilidad genética observada, no se prosiguió con este vector que codifica C4 en toda su longitud.

[0247] En contraste, para los vectores rAd26 que codifican C4D7 (rAd26.C4D7) y sC4 (rAd26.sC4), todas las placas propagadas permanecieron genéticamente estables durante el curso del experimento (FIG. 6). Así pues, las nuevas construcciones sC4 y C4D7 superan a la construcción mos2Env original en cuanto a estabilidad en un fondo de vector adenoviral. La prueba de estabilidad genética hasta vpn 13 representa una propagación varios pasajes más allá de la utilizada en la preparación a escala industrial de los vectores.

Ejemplo 4: Expresión e in vivo Antigenicidad de secuencias de la envoltura del VIH en vectores de adenovirus

[0248] La expresión y antigenicidad de rAd26.C4D7 y rAd26.sC4 se evaluaron por separado o en combinación con un vector Ad26 recombinante que codifica mos1Env (SEQ ID NO: 5) (en adelante "rAd26.mos1Env") en células A549 (línea celular humana) transducidas por vector in vitro (datos no mostrados). El análisis de citometría de flujo demostró que todos los antígenos se expresaban en cultivos celulares transducidos con 2xl04 partículas virales (vp) de los antígenos de envoltura únicos como controles, o con IxlO4 vp de los 2 antígenos Env combinados mediante transducción adenovírica. Todas las transducciones contenían además dosis únicas (IxlO4 vp) de vectores adenovirales que codificaban mos1GagPol ("rAd26.mos1GagPol") y mos2GagPol ("rAd26.mos2GagPol") (Barouch et al, Nat Med 2010, 16:319-323), de modo que las combinaciones de vectores evaluadas presentaban las mismas proporciones relativas de los distintos vectores adenovirales previstas para uso preclínico y clínico. Preferiblemente, los vectores que codifican las proteínas sintéticas de la envoltura del VIH de la invención se combinan con vectores que codifican los antígenos mos1GagPol y mos2GagPol para uso clínico.

[0249] La combinación de rAd26.mos1Env y rAd26.C4D7 produjo una máxima cobertura de los epítopos evaluados determinada por la unión de anticuerpos monoclonales. En particular, la exposición del epítopo PG16, al que contribuyó la transformación con Ad26.C4D7, es prometedora para el uso en vacunas, ya que PG16 representa un anticuerpo monoclonal ampliamente neutralizante que reconoce la región del bucle V1/V2 del Env del VIH-1 (Walker et al, Science 326:258-9, 2009). Por lo tanto, la proteína sintética de la envoltura del VIH de la invención derivada de la secuencia C4 aumenta la amplitud de la respuesta inmunitaria contra la proteína de la envoltura del VIH en comparación con la respuesta inmunitaria generada únicamente por mos1Env. Se ha demostrado que las respuestas de anticuerpos inducidas por la vacuna y dirigidas hacia la región de la proteína de la envoltura se correlacionan con la protección frente a la infección por VIH-1 en el estudio RV144 (Haynes et al, N Engl J Med. 336:1275-86, 2012), por lo que la proteína sintética de la envoltura del VIH de la invención es un candidato prometedor para incluir en los regímenes de vacunas contra el VIH.

Ejemplo 5: Inmunogenicidad de los vectores que codifican proteínas sintéticas de la envoltura del VIH

[0250] Las secuencias de proteínas sintéticas de la envoltura del VIH de la invención en un fondo de vector Ad26 se probaron en conejos para determinar si estas construcciones eran una alternativa inmunogénica a la construcción rAd26.mos2Env.

[0251] La inmunogenicidad del vector de adenovirus que codifica mos1Env (rAd26.mos1Env; SEQ ID NO: 5) solo y en combinación con vectores de adenovirus que codifican proteínas sintéticas de la envoltura del VIH de la invención (rAd26.C4D7 y rAd26.sC4; que comprenden SEQ ID NO: 8, en particular SEQ ID NOs: 18 y 19, respectivamente). En todos los casos, los vectores de adenovirus 26 que codifican los antígenos mos1GagPol y mos2GagPol (rAd26.mos1GagPol [SEQ ID NO: 28] y rAd26.mos2GagPol [SEQ ID NO: 29], respectivamente). Más concretamente, la inmunogenicidad de rAd26.mos1Env sola (vacuna trivalente: rAd26.mos1GagPol, rAd26.mos2GagPol y rAd26.mos1Env) se comparó con la inmunogenicidad de rAd26.mos1Env en combinación con uno de rAd26.C4D7 o rAd26.sC4 (vacuna tetravalente: administración de rAd26.mos1GagPol, rAd26.mos2GagPol, rAd26.mos1Env y rAd26.C4D7; o administración de rAd26.mos1GagPol, rAd26.mos2GagPol, rAd26.mos1Env y rAd26.sC4). Esta comparación de la vacuna trivalente, que carece de vectores que codifiquen las proteínas sintéticas de la envoltura del VIH de la invención, con la vacuna tetravalente, que contiene vectores que codifican las proteínas sintéticas de la envoltura del VIH de la invención, permite determinar si las proteínas de la envoltura del VIH de la invención contribuyen a la amplitud de la protección.

[0252] La administración se realizó en regímenes de vacuna, en los que estos vectores Ad26 se administraron en las semanas 0 y 6 como doble cebado, y una proteína gp140 del clado C (una proteína Env gp140 trivalente que tiene SEQ ID NO: 7 sin la secuencia del péptido señal de los residuos 1- 29, véase también el documento WO 2010/042942) en las semanas 12 y 18 como doble refuerzo (véase, por ejemplo, Barouch et al, 2015, Science 349: 320-324). En la Tabla 1 se describen los regímenes vacunales utilizados en el presente estudio. rAd26.Empty se refiere a un vector de control que carece de cualquier gen que codifique una secuencia para una proteína antigénica del VIH. Cada grupo contenía seis conejos.

Tabla 1: Regímenes vacunales probados en un estudio de inmunogenicidad en conejos

[0253] La comparación de la vacuna trivalente Ad26 (que carece de los antígenos Env novedosos de la invención) con la vacuna tetravalente Ad26 (que comprende los antígenos Env novedosos sC4 o C4D7) permite probar si los antígenos novedosos de la invención contribuyen a la amplitud de la protección. Un ensayo establecido de neutralización basado en células TZM-b1 [Montefiori DC. Methods Mol Biol 2009,485:395-405; Sarzotti-Kelsoe M et al., J Immunol Methods 2014,409:131-146] para medir la actividad neutralizante de las vacunas candidatas.

[0254] Los resultados se muestran en la Fig 7, y se analizaron estadísticamente utilizando la vacuna trivalente (grupo 1 en la Tabla 1) como grupo de control y comparando con cada una de las nuevas vacunas tetravalentes (grupos 2 y 3 en la Tabla 1).

[0255] En general, las nuevas proteínas derivadas de C4 (es decir, que codifican proteínas Env que comprenden SEQ ID NO: 8, siendo una alternativa para mos2Env) resultaron inmunogénicas tras dos inmunizaciones intramusculares homólogas en conejos.

[0256] La capacidad de neutralización de los sueros inmunes de conejo contra los pseudovirus Tier IB fue nula (datos no mostrados), lo que no es inesperado ya que se sabía que dichos virus son más difíciles de neutralizar.

[0257] La capacidad de neutralización de pseudovirus de sueros inmunes de conejo contra un virus del clado B Tier 1A no se vio afectada por la adición de nuevos componentes (datos no mostrados). Esto demuestra que el nuevo antígeno no interfirió negativamente en la inmunogenicidad del antígeno existente del clado B presente en la vacuna (aunque los nuevos componentes estaban dirigidos al clado C, no se podía excluir a priori tal interferencia indeseable antes de haberla probado).

[0258] La capacidad de neutralización de pseudovirus de los sueros inmunes de conejos contra un virus del clado C Tier 1A aumentó significativamente en la inmunización tetravalente que contenía adeno C4D7 (tetravalente, grupo 2), en comparación con la inmunización trivalente (que contenía solo mos1Env) sola (grupo 1) (Fig 7 panel B). Además, la capacidad de neutralización de pseudovirus de los sueros inmunes de conejo frente a un virus del clado C Tier 1A en la semana 8 fue significativamente mayor en la inmunización tetravalente con el nuevo adenovirus sC4 (tetravalente, grupo 3), en comparación con la inmunización trivalente (que sólo tenía mos1Env) sola (grupo 1) (Fig 7 panel B).

[0259] En conclusión, las construcciones C4D7 y sC4 codificadas en Ad26 fueron inmunogénicas y su adición amplió la capacidad de unión y neutralización de una vacuna que tiene mos1Env (principalmente clado B) como único componente Env codificado en Ad26, hacia cepas del clado C (Fig 7B).

Ejemplo 6: Inmunogenicidad de regímenes vacunales que incluyen vectores que codifican proteínas sintéticas de la envoltura del VIH de la invención

[0260] En otro estudio con conejos se evaluó la combinación de vectores tetravalentes Ad26.Mos4.VIH (formada por cuatro vectores adenovirales: Ad26.mos1GagPol [codificación SEQ ID NO: 28], Ad26.Mos2GagPol [codificación SEQ ID NO: 29], Ad26.mos1Env [codificación SEQ ID NO: 5] y Ad26.Mos2SEnv [el nombre "C4D7" utilizado anteriormente también se denomina "Mos2S"; este vector codifica el novedoso SEQ ID NO: 18 según la invención], en una mezcla 1:1:1:1 a una dosis total de 5x109 vp,) aplicadas por vía intramuscular como inmunizaciones de cebado doble en las semanas 0 y 6, en combinación con refuerzos de proteína Env del VIH-1 recombinante utilizando gp140 del clado C [que tiene la secuencia de residuos de aminoácidos 30-708 de SEQ ID NO: 7], Mosaic gp140 [con la secuencia de residuos de aminoácidos 30-724 de SEQ ID NO: 36], o una combinación de gp140 del clado C y gp140 del Mosaico, en las semanas 13 y 19. Estos refuerzos proteínicos se aplicaron por vía intramuscular a una dosis total de 10 o 50 microgramos de proteína combinada con 250 microgramos de adyuvante de fosfato de aluminio formulado el día de la inmunización.

[0261] Los resultados indican que todos los regímenes probados fueron inmunogénicos en todos los animales, induciendo altos títulos de anticuerpos y actividad de neutralización moderada contra virus pseudotipados Env de Nivel 1. Si se utilizó gp140 mosaico como antígeno vacunal, solo o en combinación con gp140 clado C, los títulos ELISA específicos de gp 140 mosaico y el reconocimiento de pseudovirus clado B aumentaron significativamente en la semana 15 en comparación con el grupo de referencia reforzado con gp140 clado C solo. El tamaño global del efecto de la mejora fue moderado, y mayor para el grupo reforzado con la combinación bivalente clado C gp140 - Mosaico gp140 en comparación con Mosaico gp140 solo. En la semana 21 del estudio, estas diferencias se perdieron y las respuestas inmunitarias medidas para las cohortes que recibieron refuerzos bivalentes de gp140 del clado C - gp140 mosaico o refuerzos monovalentes de gp140 del clado C fueron estadísticamente indistinguibles.

[0262] El régimen de proteína bivalente mostró una inducción comparable de los títulos ELISA del clado C y del reconocimiento de pseudovirus que el régimen reforzado de gp140 solo para el clado C, lo que indica que la inclusión del inmunógeno Mosaic gp140 relacionado con el clado B no tuvo ningún efecto negativo en la cobertura del antígeno del clado C, mientras que mejoró significativamente la cobertura del clado B en la semana 15 del estudio.

[0263] Los datos confirman que el vector Ad26.Mos2SEnv que codifica un antígeno Env sintético según la invención puede utilizarse con éxito en regímenes vacunales.

Ejemplo 7: Construcción de vectores MVA que codifican proteínas sintéticas de la envoltura del VIH de la invención en combinación con otros antígenos del VIH

[0264] En el presente ejemplo, se generó un vector MVA-BN™ (denominado "MVA- mBN414"), que comprende un ácido nucleico que codifica el nuevo antígeno mos2SEnv del VIH descrito en el presente documento como SEQ ID NO: 18 (también denominado C4D7). El vector MVA-mBN414 comprendía además ácidos nucleicos que codificaban los siguientes antígenos del VIH: moslEnv (SEQ ID NO: 5); mosIGag (SEQ ID NO: 1); mos2Gag (SEQ ID NO: 2); mosIPol (SEQ ID NO: 33I; y mos2Pol (SEQ ID NO: 4). En el MVA-mBN414, el mos1Gag (SEQ ID NO:1) y el mos1Pol (SEQ ID NO: 3) se codificaron como una proteína de fusión (SEQ ID NO:28, "mos1GagPol") y el mos2Gag y el mos2Pol se codificaron como una proteína de fusión (SEQ ID NO: 29, “mos2GagPol”). Véase la FIG. 8 para una representación esquemática de las inserciones en regiones del genoma MVA.

[0265] Diseñamos un ácido nucleico novedoso (SEQ ID NO: 41) que codifica el antígeno mos2SEnv del VIH (SEQ ID NO: 18); un nuevo ácido nucleico (SEQ ID NO: 39) que codifica el antígeno mos1Env del VIH (SEQ ID NO: 5); un nuevo ácido nucleico (SEQ ID NO: 38) que codifica el antígeno mos1GagPol del VIH (SEQ ID NO: 28); y un nuevo ácido nucleico (SEQ ID NO: 40) que codifica el antígeno mos2GagPol del VIH (SEQ ID NO: 29). Los nuevos ácidos nucleicos se diseñaron para la expresión humana, una homología mínima entre sí y tramos poli-nt reducidos, así como elementos repetitivos.

[0266] El promotor largo PrMVA13.5 (SEQ ID NO: 42) delante del codón de inicio ATG de las secuencias de antígenos mos1GagPol y mos2GagPol. El promotor PrHyb (SEQ ID NO: 43) delante del codón de inicio ATG de las secuencias de antígenos mos2SEnv y mos1Env.

[0267] Las secuencias codificantes mos1GagPol y mos1Env se insertaron mediante SacII y Pad en pBNX208, un vector de transferencia que codifica regiones homólogas<i>G<r>44/45 de MVA-BN™, permitiendo así la inserción en la región diana (IGR 44/45) de<m>VA-BN™ mediante recombinación homóloga. Además, pBNX208 codifica heGFP y nptll para la selección positiva, así como secuencias repetitivas de la región homóloga IGR 44/45 MVA-BN™ Flank 2 o posterior escisión del casete de selección mediante recombinación homóloga en ausencia de presión selectiva. Las secuencias codificantes mos2GagPol y mos2Env se insertaron mediante Notl en pBNX227, un vector de transferencia que codifica regiones homólogas IGR88/89 de MVA-BN™, permitiendo así la inserción en la región objetivo (IGR 88/89) de MVA-BN™ mediante recombinación homóloga. Además, pBNX227 codifica mRFPl y ecogpt para la selección positiva, que están flanqueados por dos sitios loxP para la posterior escisión del casete de selección en ausencia de presión selectiva tras la transfección con un plásmido que codifica la CRE-recombinasa, que cataliza la escisión precisa de secuencias de ácido nucleico flanqueadas por su secuencia diana 1oxP.

[0268] Los vectores basados en MVA se generaron en fibroblastos primarios de pollo (CEF) y se produjeron como se describe en el presente documento. Las células CEF se aislaron semanalmente de embriones de pollo y se mantuvieron en medio VP-SFM sin FBS. Brevemente, se transfectaron células CEF con el plásmido vectorial MVA, utilizando Fugene según las instrucciones proporcionadas por el fabricante (Promega) y se realizó una coinfección con MVA-BN™. Las células se cosecharon después de dos o tres días, se sonifica y se sigue pasificando. El virus se purificó en placa en células CEF cultivadas en una placa de cultivo de tejidos de 96 pocillos múltiples tras su amplificación en un único pocillo de una placa de cultivo de tejidos de 12 pocillos múltiples. La amplificación posterior se llevó a cabo en células CEF cultivadas en un único pocillo de una placa multipocillo de 6 tejidos y, posteriormente, en un matraz de cultivo de tejidos T175.

[0269] El MVA-mBN414 es, por tanto, un MVA-BN™ que comprende en su región IGR 44/45 un ácido nucleico que codifica mos1GagPol (SEQ ID NO: 28) bajo el control de un promotor PrMVA13.51ong (SEQ ID NO: 42) y un ácido nucleico que codifica mos1Env (SEQ ID NO: 5) bajo el control de un promotor PrHyb (SEQ ID NO: 43). En la región IGR 88/89 hay un ácido nucleico que codifica el mos2GagPol (SEQ ID NO: 29) bajo el control de un promotor PrMVA13.51ong (SEQ ID NO: 42) y un ácido nucleico que codifica mos2SEnv (SEQ ID NO: 18) bajo el control de un promotor PrHyb (SEQ ID NO: 43). El vector MVA-mBN414 se utilizó en experimentos posteriores en regímenes de cebado con vectores de adenovirus que codifican antígenos descritos en el presente documento.

Ejemplo 8: Inmunogenicidad de MVA-mBN414 en conejos

[0270] La inmunogenicidad de MVA-mBN414 (véase el Ejemplo 7) en conejos blancos de Nueva Zelanda (NZW) se evaluó en el contexto de Ad26.Mos.VIH (una vacuna trivalente que tiene 3 vectores Ad26 juntos que codifican antígenos del VIH con SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 4 y 5; en forma de antígenos mos1GagPol (SEQ ID NO: 28), mos2GagPol (SEQ ID NO: 29), y mos1Env (SEQ ID NO: 5)) prime, y en comparación con el prime-boost homólogo con Ad26.Mos.VIH. Además, se evaluó el beneficio añadido de la aplicación conjunta de la proteína gpl40 del clado C (adyuvada con fosfato de aluminio) en los días 42 y 62 (inyección en músculos contralaterales (es decir, en extremidades separadas)).

[0271] El esquema de inmunización que se utilizó se proporciona en la siguiente Tabla 2:

Tabla 2: Calendario de inmunización para el estudio de inmunogenicidad en conejo

[0272] Los ensayos de lectura fueron un ciado C (residuos aa 30-708 de SEQ ID NO:7)y gp140 mosaico (residuos aa 30-724 de SEQ ID NO: 36) ELISA, y un ensayo de neutralización de pseudovirus VIH-1. Se comprobó la capacidad de neutralización de los sueros de conejos inmunizados frente a las partículas del virus pseudotipado (VPE) del VIH-1 ENV mediante la inhibición de la entrada en las células TZM-bl. Las células TZM-b1 expresan altos niveles de CD4 y de los correceptores CCR5 y CXCR4 y contienen un gen reportero de luciferasa integrado que responde al tat bajo el control de una secuencia de repetición terminal larga del VIH. Un efecto neutralizante de los anticuerpos Env del VIH-1 que contienen suero contra los EPV da lugar a una reducción de la expresión de luciferasa y, por tanto, a una reducción de la señal de luminiscencia en combinación con el sustrato que contiene luciferina. El suero o los anticuerpos se analizaron en una dilución seriada triple en 6 pasos, comenzando en 1/20. La expresión máxima de luciferasa se midió añadiendo únicamente células EPV en un pocillo sin suero ni anticuerpos. La expresión de luciferasa de fondo se midió añadiendo sólo células a un pocillo, sin suero/anticuerpos ni EPV. Se ajustó una curva no lineal de 4 parámetros entre la señal de luciferasa máxima y de fondo y se determinaron los valores de IC50 transformados en log10 como valor notificable.

[0273] Los resultados se muestran en la Fig. 9.

[0274] Los resultados muestran que el MVA-mBN414 fue inmunogénico en todos los conejos. No se observaron diferencias evidentes en la inmunogenicidad entre machos y hembras. El refuerzo de MVA en el contexto de Ad26 prime indujo un aumento de la respuesta inmunitaria humoral específica del VIH (medible en ELISA de clado C, ELISA de mosaico de clado B y en VNA de clado B) en comparación con el refuerzo homólogo de Ad26 prime.

[0275] La coadministración de la proteína gpl40 del clado C con MVA como refuerzo indujo un aumento de los títulos ELISA de gp140 del clado C (homólogo) y ELISA de gp140 del mosaico (heterólogo) en comparación con un refuerzo con MVA solamente.

Ejemplo 9: Inmunogenicidad de MVA-mBN414 en ratones

[0276] También se evaluó la inmunogenicidad del MVA-mBN414 en ratones CBF1, con el objetivo de evaluar la inmunogenicidad de un cebado heterólogo Ad26.Mos4.VIH (véase el ejemplo 6) y un refuerzo con MVA-mBN414 (véase el ejemplo 7), en comparación con un cebado-refuerzo con MVA homólogo (es decir, tanto el cebado como el refuerzo con MVA- mBN414).

[0277] El esquema de inmunización que se utilizó se proporciona en la siguiente Tabla 3:

Tabla 3: Calendario de inmunización para el estudio de inmunogenicidad en conejos

[0278] Los ensayos de lectura para las respuestas inmunitarias humorales (medición de IgG específica de antígeno en las semanas 5 y 7) fueron un gpl40 mosaico (residuos aa 30-724 de SEQ ID NO: 36) ELISA (véase el ejemplo 8). El ensayo de lectura de las respuestas inmunitarias celulares (en la semana 7) fue un IFN-y ELISPOT (ensayo descrito en Khan et al, Int J Cancer, 2017, Mar 6, doi:10.1002/ijc.30679. [publicación electrónica antes de impresión]; 2017, Jul 14, 141(2), 393-404), utilizando péptidos inmunodominantes Env, Gag y Pol como estímulos.

[0279] Los resultados de la ELISPOT se muestran en la FIG. 10. También se realizó un ensayo de tinción intracelular de citocinas (ICS), que arrojó resultados similares (no mostrados).

[0280] Los resultados indican que el cebado con Ad26 o MVA indujo respuestas inmunes detectables en la semana 5 (FIG. 10A), que se incrementan aún más por la inmunización de refuerzo con MVA en la semana 7 (FIG. 10B) para ambos, el régimen heterólogo Ad-MVA y el régimen homólogo MVA-MVA. El primer refuerzo heterólogo Ad-MVA indujo títulos ELISA significativamente más altos que el régimen de primer refuerzo homólogo MVA-MVA. Esto también se observó para las respuestas inmunes celulares medidas por ELISPOT contra los antígenos Env, Gag y Pol en la semana 7 (Fig 10C-E). La inmunización homóloga MVA prime-boost indujo una respuesta inmune celular baja pero detectable contra los antígenos Gag y Pol que es claramente diferenciable de los datos de control.

[0281] ] En general, los resultados muestran que un MVA con antígenos del VIH según la invención es inmunogénico. Además, se demuestra que dicho vector puede ser ventajosamente utilizados en regímenes de cebado con vectores adenovirales que codifican antígenos del VIH, y/o con proteínas gpl40 aisladas del VIH.

REFERENCIAS

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Claims

REIVINDICACIONES

1. Un vector poxvirus que comprende ácido nucleico que codifica:

(b) un segundo antígeno VIH Env diferente del primer antígeno VIH Env;

2. El vector poxvirus de la reivindicación 1, en el que:

el segundo antígeno VIH Env comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 5,

los antígenos tercero y cuarto comprenden la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2%, respectivamente; and

los antígenos quinto y sexto comprenden la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3 y SEQ ID NO: 4, respectivamente.

3. El vector poxvirus de la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en el que los antígenos tercero y quinto están fusionados en un primer antígeno de fusión Gag-Pol que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 28, y los antígenos cuarto y sexto se fusionan en un segundo antígeno de fusión Gag-Pol que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 29.

4. El vector poxvirus de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el primer antígeno VIH Env está codificado por SEQ ID NO: 41.

5. El vector poxvirus de la reivindicación 3, en el que

el primer antígeno Env del VIH está codificado por SEQ ID NO: 41;

el segundo antígeno Env del VIH está codificado por SEQ ID NO: 39;

el primer antígeno de fusión Gag-Pol está codificado por SEQ ID NO: 38; y

el segundo antígeno de fusión Gag-Pol está codificado por SEQ ID NO: 40.

6. El vector poxvirus de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el vector poxvirus es un vector recombinante del virus Vaccinia Ankara modificado (MVA).

7. El vector poxvirus de la reivindicación 6, en el que el primer antígeno de fusión Gag-Pol y el segundo antígeno Env se insertan en la región intergénica (IGR) 44/45 del genoma MVA, y el segundo antígeno de fusión Gag-Pol y el primer antígeno Env se insertan en la IGR 88/89 del genoma MVA.

8. El vector poxvirus de cualquiera de las reivindicaciones 6-7, en el que el primer antígeno de fusión Gag-Pol y el segundo antígeno de fusión Gag-Pol están cada uno bajo el control de un Prl3.5, y el primer antígeno Env y el segundo antígeno Env están cada uno bajo el control de un promotor PrHyb independiente.

9. Una vacuna que comprende un vector poxvirus según cualquiera de las reivindicaciones 1-8 y un portador farmacéuticamente aceptable.

10. Una combinación de vacunas que comprende:

(a) una primera composición de vacuna que comprende una cantidad inmunológicamente eficaz de un vector poxvirus según cualquiera de las reivindicaciones 1-8; y al menos uno de:

(c) (ii) una tercera composición de vacuna que comprende uno o más polipéptidos que comprenden una cantidad inmunogénicamente eficaz de un polipéptido antigénico aislado del VIH, en la que la primera composición y la segunda y/o tercera composición están presentes en la misma composición o en una o más composiciones diferentes.

11. La combinación de vacuna de la reivindicación 10, en la que la segunda composición de vacuna comprende vectores Ad26 recombinantes que codifican conjuntamente SEQ ID NOs: 18, 5, 1,2, 3 y 4;

12. La combinación de vacunas de la reivindicación 10 u 11, en la que uno o más polipéptidos antigénicos del VIH aislados en la tercera composición de vacuna comprenden:

(i) un polipéptido que comprende los residuos 30-708 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 7, o

(ii) un polipéptido que comprende los residuos 30-724 de SEQ ID NO: 36; o

(iii) ambos polipéptidos (i) y (ii).

13. La vacuna de la reivindicación 9 o la combinación de vacunas de cualquiera de las reivindicaciones 10-12, para su uso en un método de inducción de una respuesta inmunitaria contra un virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) en un sujeto que la necesite, comprendiendo el método la administración al sujeto de la vacuna o la combinación de vacunas.

14. La vacuna o combinación de vacunas para su uso según la reivindicación 13, en la que el método comprende la administración al sujeto:

(a) una primera vacuna que comprende uno o más vectores de adenovirus recombinantes, preferentemente vectores Ad26, que codifican uno o más de los SEQ ID NOs: 1,2, 3, 4, 5 y 18; y

(b) una segunda vacuna que comprenda un vector de poxvirus según cualquiera de las reivindicaciones 1-8, en la que la primera vacuna sea una vacuna de cebado y la segunda una vacuna de refuerzo, o en la que la segunda vacuna sea una vacuna de cebado y la primera una vacuna de refuerzo.

15. La vacuna o combinación de vacunas para su uso según la reivindicación 14, que comprende además administrar al sujeto uno o más polipéptidos antigénicos del VIH aislados, aproximadamente al mismo tiempo que la vacuna de refuerzo, en la que el uno o más polipéptidos antigénicos del VIH comprenden preferentemente

(i) un polipéptido que comprende los residuos 30-708 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 7, o (ii) un polipéptido que comprende los residuos 30-724 de SEQ ID NO: 36; o

(iii) ambos polipéptidos (i) y (ii),

y en el que uno o más polipéptidos antigénicos aislados del VIH se encuentran en la misma composición que la vacuna de refuerzo o en una composición separada de la vacuna de refuerzo.

16. La vacuna o combinación de vacunas para su uso según cualquiera de las reivindicaciones 13-15, en la que el sujeto es un sujeto que ha sido infectado por el VIH.