ES2975773T3

ES2975773T3 - Métodos y sistemas para la evaluación automatizada de la sensibilidad a antibióticos

Info

Publication number: ES2975773T3
Application number: ES18782365T
Authority: ES
Inventors: Raphael Rodolphe Marcelpoil
Original assignee: BD Kiestra BV
Current assignee: BD Kiestra BV
Priority date: 2017-09-28
Filing date: 2018-09-27
Publication date: 2024-07-15
Anticipated expiration: 2038-09-27
Also published as: WO2019063690A1; JP7506599B2; CA3077109A1; CN111263817B; EP4365857A2; EP3688182A1; US11319575B2; AU2018338692A1; US11884959B2; CN117467736A; JP2024114728A; US20200291447A1; EP3688182C0; EP4365857A3; JP2020534847A; US20220213523A1; CN111263817A; EP3688182B1; US20240240225A1

Abstract

Un sistema y método de imágenes proporciona detección automatizada del crecimiento microbiano para pruebas de sensibilidad a los antibióticos. Un sistema de procesamiento que tiene un sensor de imágenes para capturar imágenes de una placa de cultivo inoculada que tiene discos de antibióticos dispuestos sobre los medios de cultivo captura imágenes de la placa en momentos separados (por ejemplo, primera y segunda imágenes). El sistema genera datos característicos de píxeles para los píxeles de la segunda imagen a partir de una comparación de la primera imagen y la segunda imagen. Los datos característicos de los píxeles pueden ser indicativos del crecimiento de la placa. El sistema puede acceder a datos de modelado de crecimiento relacionados con los discos de antibióticos y generar datos de imágenes simuladas con una función de modelo de crecimiento. La función del modelo de crecimiento utiliza los datos del modelo de crecimiento. Los datos de la imagen simulada simulan el crecimiento en la placa en relación con los discos. El sistema compara la imagen simulada y los datos característicos de los píxeles para identificar regiones de píxeles de la segunda imagen que difieren de la imagen simulada. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Métodos y sistemas para la evaluación automatizada de la sensibilidad a antibióticos

Antecedentes de la tecnología

Cada vez se presta más atención a las imágenes digitales de placas de cultivo para la detección del crecimiento microbiano. Las técnicas para obtener imágenes de placas para detectar el crecimiento microbiano se describen en la publicación PCT número WO2015/114121. Con estas técnicas, ya no es necesario que el personal del laboratorio lea las placas mediante inspección visual directa, sino que puede utilizar imágenes digitales de alta calidad para la inspección de las placas. Cambiar el flujo de trabajo del laboratorio y la toma de decisiones al examen de imágenes digitales de placas de cultivo también puede mejorar la eficacia. Un operador puede marcar las imágenes para su posterior análisis, ya sea por el mismo u otra persona con las habilidades adecuadas. También se pueden tomar y utilizar imágenes adicionales para guiar los procesos secundarios.

Por ejemplo, se pueden utilizar imágenes para pruebas de difusión en agar. En las pruebas de difusión en agar, se determina la sensibilidad de los microorganismos bacterianos a los antibióticos. Dichas pruebas, que pueden denominarse pruebas de sensibilidad a antibióticos (AST), típicamente implican la aplicación de varios discos de antibiótico a un medio (p. ej., agar) en una placa en la que se ha esparcido uniformemente una bacteria que se va a someter a prueba. Diferentes discos pueden tener diferentes concentraciones de un antibiótico concreto y/o varios antibióticos diferentes. La placa se puede incubar para permitir el tiempo de crecimiento de las bacterias. Luego se observa la placa. El crecimiento bacteriano en el área alrededor de cada disco de antibiótico proporciona una indicación del efecto del antibiótico concreto del disco. Por ejemplo, un antibiótico eficaz de un disco concreto puede tener una gran zona libre de crecimiento de las bacterias sometidas a prueba, mientras que un antibiótico ineficaz de un disco concreto puede no tener ninguna zona libre de crecimiento de las bacterias sometidas a prueba.

El tamaño de la zona libre de crecimiento puede proporcionar una indicación de una concentración inhibidora mínima del antibiótico de un disco cercano. Por ejemplo, en el caso del agar, después de colocar un disco, el antibiótico se alejará del disco con el tiempo. La migración difundirá la concentración de antibiótico según la distancia desde el disco y la tasa de difusión del antibiótico y el medio. La concentración de antibióticos será mayor cerca del disco. La concentración disminuirá a mayor distancia del disco. Típicamente, la concentración inhibidora mínima puede considerarse la concentración más baja más alejada del disco que incluye ausencia de crecimiento bacteriano.

Dichas determinaciones pueden ayudar a seleccionar antibióticos adecuados y sus dosis para diferentes infecciones bacterianas. Esto ayuda a definir los objetivos de un sistema de obtención de imágenes de microbiología moderno. Tener estos objetivos lo antes posible logra la meta de entregar los resultados a un paciente rápidamente y proporcionar dichos resultados y análisis de manera económica. La automatización del flujo de trabajo del laboratorio y la toma de decisiones puede mejorar la velocidad y el coste con el que se pueden lograr estos objetivos.

Aunque se han logrado avances considerables con respecto a las tecnologías de obtención de imágenes para detectar indicios de crecimiento microbiano, todavía se busca ampliar dichas tecnologías de obtención de imágenes para prestar soporte a un flujo de trabajo automatizado. Los aparatos y métodos para inspeccionar placas de cultivo en busca de indicaciones de crecimiento microbiano son difíciles de automatizar, debido en parte a la naturaleza altamente visual de la inspección de las placas. En este sentido, es deseable desarrollar técnicas que puedan automatizar la interpretación de imágenes de placas de cultivo (p. ej., identificación de crecimiento, pruebas de susceptibilidad, análisis de sensibilidad a antibióticos, etc.) y determinar las etapas siguientes a realizar en base a la interpretación automatizada.

Brigitte Lamy et al.: "How does susceptibility prevalence impact on the performance of disk diffusion susceptibility testing?", Diagnostic Microbiology and Infectious Disease, vol. 49, núm. 2, págs. 131-139, 1 de junio de 2004 (2004 06-01), incluye un análisis sobre la difusión de antibióticos a partir de discos con infusión de antibióticos para pruebas de susceptibilidad.

Bruce A. Craig et al.: "Modeling approach to diameter breakpoint determination", Diagnostic Microbiology and Infectious Disease, vol. 36, núm. 3, págs. 193-202, 1 de marzo de 2000 (2000-03-01) describe un planteamiento de modelado para determinar diámetros de punto de ruptura para determinar concentraciones inhibidoras mínimas.

Bhargav H. S. et al.: "Measurement of the zone of inhibition of an antibiotic", 2016 IEEE 6TH International Conference on Advanced Computing (IACC), 2016 IEEE, págs. 409-414, 27 de febrero de 2016 (2016-02-27) describe la medición de una zona de inhibición de un antibiótico en una prueba de antibióticos por difusión en disco.

Mathieu Daynac et al.: "Application of artificial intelligence to the prediction of the antimicrobial activity of essential oils", Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine, vol. 2015, págs. 1-9, 1 de enero de 2015 describe el uso de inteligencia artificial para medir la actividad antimicrobiana de los aceites esenciales.

Hejblum G. et al.: "Automated interpretation of disk diffusion antibiotic susceptibility tests with the radia profile analysis<algorithm", Journal of Clinical Microbiology, American Society For Microbiology, e>E.<UU., vol. 31, núm. 9, (págs. 2396->2401), 1 de septiembre de 1993, describe un algoritmo para proporcionar una zona de inhibición en pruebas de susceptibilidad a antibióticos realizadas con el método de difusión en disco.

Breve resumen de la tecnología

Un aspecto de la presente divulgación está dirigido a un método en un procesador para pruebas de susceptibilidad a antibióticos. En el método, se proporciona una placa de cultivo inoculada con una muestra biológica. La placa de cultivo tiene medios de cultivo y por lo menos un disco de antibiótico dispuesto en la misma. Los datos de la primera y la segunda imagen de la placa de cultivo se generan con un sensor de imagen. Los datos de la primera imagen y los datos de la segunda imagen representan respectivamente la primera y la segunda imagen capturada de la placa de cultivo. La primera y la segunda imagen capturada se tomaron en tiempos separados utilizando sensores de imagen. Los sensores de imagen se controlan para recopilar la información de imagen deseada (es decir, color, intensidad, etc.). Se generan datos de características de los píxeles para los píxeles de los datos de la segunda imagen a partir de una comparación de los datos de la primera imagen y los datos de la segunda imagen. Los datos de características de los píxeles son indicativos del crecimiento microbiano en la placa de cultivo a lo largo del tiempo. Luego se accede a los datos del modelado de crecimiento microbiano. Los datos para el modelado modelan el crecimiento microbiano en combinaciones de medios de cultivo, microorganismos, antibióticos, concentración de antibióticos en el disco y en los medios de cultivo. La concentración de antibióticos en los medios de cultivo es función de la concentración de antibióticos en el disco, el tiempo y la distancia desde el disco. Los datos de las imágenes simuladas se generan utilizando una función del modelo de crecimiento. Los datos de las imágenes simuladas simulan el crecimiento microbiano en la placa de cultivo inoculada basándose en por lo menos un disco de la pluralidad de discos de antibiótico dispuestos en los medios de cultivo, la concentración de antibiótico en por lo menos un disco; los medios de cultivo y la concentración del antibiótico en los medios de cultivo en función del tiempo y la distancia desde el disco de antibiótico. Los datos de las imágenes simuladas y los datos de características de los píxeles se comparan y se identifican una o más regiones de píxeles de los datos de la segunda imagen que difieren de una o más regiones de píxeles de los datos de las imágenes simuladas.

Un ejemplo de datos de características de los píxeles son los datos de contraste. Los datos de contraste pueden ser valores de intensidad de los píxeles. Los datos de contraste pueden incluir datos de opacidad, datos de color y datos de desenfoque.

Los datos de características de los píxeles también pueden incluir datos de distancias, representando los datos de distancias la distancia hasta por lo menos uno de la pluralidad de discos de antibiótico. Por ejemplo, los datos de distancias son una distancia desde el píxel hasta el centro de por lo menos uno de la pluralidad de discos de antibiótico.

La función del modelo de crecimiento puede modelar uno o más de crecimiento máximo, crecimiento mínimo, crecimiento promedio, crecimiento de la mediana o crecimiento percentil. En un ejemplo, la función del modelo de crecimiento caracteriza los datos de contraste como una función de la distancia radial desde por lo menos un disco de la pluralidad de discos de antibiótico. La función del modelo de crecimiento puede incluir un mapa de difusión para la difusión del antibiótico en los medios de cultivo.

El método puede incluir las etapas de detectar en los datos de la primera imagen o de la segunda imagen la imagen del propio disco, y analizar los datos de la imagen del disco para detectar datos de indicios. El acceso a los datos del modelado de crecimiento puede incluir la localización de los datos del modelo de crecimiento utilizando los datos de indicios. Los datos de modelado de crecimiento pueden incluir información de concentración para una carga de antibióticos de por lo menos un disco de la pluralidad de discos de antibiótico.

En un ejemplo, la función del modelo de crecimiento utiliza uno o más de: i) un parámetro de tiempo de crecimiento que representa el tiempo transcurrido para el crecimiento de la placa de crecimiento en el momento de la captura de los datos de la segunda imagen; ii) un parámetro de coeficiente de difusión; y iii) un parámetro de dimensionalidad.

En un ejemplo, los datos generados de las imágenes simuladas incluyen una máscara de la imagen que tiene píxeles de la primera imagen que representan una zona sin crecimiento correspondiente con una ubicación de por lo menos un disco de la pluralidad de discos de antibiótico en la placa de crecimiento y píxeles de la segunda imagen que representan una zona de crecimiento que se propaga desde la zona sin crecimiento y comienza a una distancia radial desde la ubicación, la distancia radial determinada a partir de la función del modelo de crecimiento, representando la distancia radial un límite de la zona de inhibición estimado para por lo menos un disco.

Al comparar los datos de las imágenes simuladas y los datos de características de los píxeles, se utiliza el contraste entre los píxeles en la máscara de la imagen y los datos de características de los píxeles para generar datos de diferencia de las imágenes. Luego se evalúa una región de los datos de la segunda imagen en base a los datos de diferencia de las imágenes. Para el contraste temporal (es decir, una diferencia en la intensidad de los píxeles a lo largo del tiempo), los datos de la primera imagen pueden servir como referencia previa al crecimiento.

En una realización, el método se pone en práctica mediante un ordenador. Específicamente, se pueden usar instrucciones ejecutadas por el procesador para realizar el método descrito anteriormente.

También se describe en la presente memoria un sistema para pruebas de susceptibilidad a antibióticos. El sistema incluye un sensor de imagen configurado para capturar imágenes de una placa de cultivo en la que están dispuestos medios de cultivo con por lo menos un disco de antibiótico dispuesto en la misma. La placa de cultivo se inocula con una muestra biológica en la que la placa de cultivo está dentro del campo de visión del sensor de imagen. El sistema incluye un procesador acoplado al sensor de imagen. El sistema también incluye un medio informático que contiene instrucciones de programación que, cuando las ejecuta el procesador, controlan el procesador para someter a prueba la susceptibilidad a antibióticos. Por ejemplo, las instrucciones del programa controlan el procesador para realizar el método descrito en la presente memoria.

En otra realización, el sistema incluye un sensor de imagen configurado para capturar imágenes de una placa de cultivo en la que están dispuestos medios de cultivo con una pluralidad de por lo menos un disco de antibiótico dispuesto en la misma. La placa de cultivo se inocula con una muestra biológica cuando la placa de cultivo está dentro de un campo de visión del sensor de imagen, generando el sensor de imagen datos de la primera imagen y datos de la segunda imagen, representando los datos de la primera imagen y los datos de la segunda imagen respectivamente la primera y la segunda imagen capturada de la placa de cultivo que incluyen la pluralidad de discos de antibiótico, la primera y la segunda imagen capturada tomadas en el primer y el segundo tiempo respectivos. El sistema incluye un procesador y una memoria. El procesador recibe los datos de la primera imagen y los datos de la segunda imagen y accede a la memoria. La memoria almacena los datos del modelado de crecimiento. El procesador genera datos de características de los píxeles para los píxeles de los datos de la segunda imagen a partir de una comparación de los datos de la primera imagen y los datos de la segunda imagen. Los datos de características de los píxeles son indicativos del crecimiento microbiano en la placa de cultivo. El procesador también accede a datos del modelado de crecimiento. Los datos del modelo de crecimiento modelan el crecimiento microbiano en función de los medios de cultivo, los microorganismos, los antibióticos y la concentración de antibióticos. El procesador también genera los datos de las imágenes simuladas con una función del modelo de crecimiento, utilizando la función del modelo de crecimiento los datos del modelado de crecimiento, simulando los datos de las imágenes simuladas el crecimiento microbiano en la placa de cultivo en relación con por lo menos un disco de la pluralidad de discos de antibiótico. Luego, el procesador compara los datos de las imágenes simuladas y los datos de características de los píxeles para identificar una o más regiones de píxeles de los datos de la segunda imagen que difieren de los datos de las imágenes simuladas.

Breve descripción de los dibujos

La figura 1 es un diagrama esquemático de un sistema de ejemplo para pruebas de susceptibilidad a antibióticos basadas en imágenes según un aspecto de la divulgación.

La figura 2 es un diagrama de flujo que ilustra un proceso automatizado de ejemplo para pruebas de susceptibilidad a antibióticos basadas en imágenes según un aspecto de la divulgación.

La figura 3 es una ilustración de una imagen de una placa de crecimiento con discos de antibiótico que muestra la placa antes de la incubación y/o sin ningún tiempo de crecimiento significativo.

La figura 4 es una ilustración de una imagen de una placa de crecimiento, tal como la placa de crecimiento de la figura 3, que tiene discos de antibiótico y muestra la placa después de la incubación y/o un tiempo de crecimiento significativo donde se ha producido crecimiento bacteriano.

La figura 5 es una imagen de una zona inhibidora mínima alrededor de un disco de antibiótico de una placa de crecimiento después de la incubación y/o un tiempo de crecimiento significativo donde se ha producido crecimiento bacteriano.

La figura 6 es una versión convertida de la imagen de la figura 5 donde las imágenes se han convertido mediante una transformada polar, que ilustra una distancia inhibidora mínima del disco.

La figura 7 es una imagen de una pluralidad de discos de antibiótico en una placa.

Las figuras 7A a 7F son imágenes en escala de grises que ilustran un mapeo de valores de intensidad para los píxeles de cada disco de la figura 7 en función de la distancia radial desde cada disco; donde el sombreado representa la distancia desde el disco y la intensidad se vuelve más clara a medida que aumenta la distancia desde el disco.

La figura 8 es un gráfico que mapea el crecimiento (p. ej., contraste) en función de la distancia radial desde el disco antibacteriano D1 de la figura 4 determinado según los valores de la mediana de los píxeles (p. ej., uno o más de intensidad, opacidad, color, desenfoque, etc.).

La figura 9 es una representación de la imagen del gráfico de la figura 8, para un solo disco de una placa, que enmascara información de imagen asociada con los otros discos de la placa y el área de la imagen fuera del límite de la placa.

La figura 10 es un gráfico que ilustra una función del modelo de crecimiento según un modelo de crecimiento que mapea el valor de gris de los píxeles según la distancia radial desde un disco antibacteriano de modelo para una bacteria modelada.

La figura 11 es el gráfico de la figura 10 que muestra puntos característicos del modelo a diversas distancias.

La figura 12 es una imagen simulada generada según la(s) función(es) del modelo de crecimiento (p. ej., una (intensidad) o más (color, opacidad, borrosidad) para cada disco) donde no se produce interacción entre los discos de antibiótico modelados y las bacterias modeladas.

La figura 13 es una imagen simulada generada según una función del modelo de crecimiento (p. ej., uno o más para cada disco) donde se produce la interacción entre algunos de los discos de antibiótico modelados y las bacterias modeladas.

La figura 14 representa información característica de los píxeles para una imagen observada derivada de un sensor de imagen tal como mediante un análisis de contraste que compara múltiples imágenes (p. ej., antes y después de un tiempo de crecimiento).

La figura 15 representa una comparación de la información característica de los píxeles y la imagen simulada que identifica regiones de píxeles (tal como en una máscara de la imagen) para una evaluación y/o análisis adicionales. La figura 16 ilustra un modelo del crecimiento que se produce cuando un disco contiene antibiótico cuyo crecimiento está fuertemente modulado dentro de 10 mm del disco y cuya respuesta ante el crecimiento del disco de antibiótico se modela como una función de la modulación del crecimiento en relación con la distancia desde el borde del disco. La figura 17 ilustra ejemplos de zonas inhibidoras formadas alrededor de discos de antibiótico para las bacteriasEnterococcus faecium, Enterococcus gallinarumyLeuconostoc.

La figura 18 ilustra el crecimiento microbiano en una placa de cultivo que contiene un disco de antibiótico donde el disco no provoca ninguna modulación del crecimiento (es decir, ninguna inhibición).

La figura 19 ilustra una variedad de modulación del crecimiento microbiano para diferentes microorganismos provocada por diferentes discos de antibiótico.

La figura 20 ilustra la modulación del crecimiento microbiano influenciada por discos contiguos.

Las figuras 21A-F ilustran transformaciones de la modulación del crecimiento provocada por uno o más discos de antibiótico en representaciones bidimensionales de la modulación en función de la distancia desde cada uno de los dos discos.

Descripción detallada

La presente divulgación proporciona aparatos y métodos para identificar y analizar el crecimiento microbiano para pruebas de susceptibilidad a antibióticos en medios en placas. Muchos de los métodos descritos en la presente memoria pueden automatizarse total o parcialmente, tal como integrarse como parte de un flujo de trabajo de laboratorio total o parcialmente automatizado.

Los sistemas descritos en la presente memoria se pueden implementar en sistemas ópticos para obtener imágenes de muestras de microbiología. Existen muchos de estos sistemas disponibles comercialmente, que no se describen en detalle en la presente memoria. Un ejemplo es el sistema de incubación y obtención de imágenes inteligente BD KiestraMT ReadA Compact. Otros sistemas de ejemplo incluyen los que se describen en la publicación PCT número W02015/114121 y la publicación de patente estadounidense 2015/0299639. Dichas plataformas de obtención de imágenes ópticas son bien conocidas por los expertos en la materia y no se describen en detalle en la presente memoria.

La figura 1 es un esquema de un sistema 100 de pruebas de susceptibilidad a antibióticos de ejemplo que tiene un módulo 110 de procesamiento y un dispositivo 120 de adquisición de imágenes (p. ej., una cámara) para proporcionar imágenes de alta calidad de medios en placas. Típicamente, el sistema también tendrá acceso a un medio 130 de almacenamiento de datos, tal como una o más memorias de datos, donde dichas memorias pueden incluir, por ejemplo, instrucciones de control del procesador que controlan un procesador para llevar a cabo cualquiera de los procesos o métodos descritos en la presente memoria. La memoria también puede incluir datos de discos de antibiótico; datos de concentración de antibióticos; datos de distancias; datos de imágenes; datos de imágenes simuladas, datos de modelos de crecimiento; funciones de modelos de crecimiento; datos de bacterias, etc. El módulo de procesamiento y el dispositivo de adquisición de imágenes pueden conectarse además y, por lo tanto, interactuar adicionalmente con otros componentes del sistema, tales como un módulo de incubación (no se muestra) para incubar los medios en placas que permiten el crecimiento de un cultivo inoculado en los medios en placas. Dicha conexión puede automatizarse total o parcialmente utilizando un sistema de seguimiento que recibe muestras para la incubación y las transporta a la incubadora, y luego entre la incubadora y el dispositivo de adquisición de imágenes.

El módulo 110 de procesamiento puede dar instrucciones a los otros componentes del sistema 100 para que realicen tareas basadas en el procesamiento de varios tipos de información. El procesador 110 puede ser hardware que realiza una o más operaciones. El procesador 110 puede ser cualquier procesador estándar, tal como una unidad central de procesamiento (CPU), o puede ser un procesador dedicado, tal como un circuito integrado de aplicación específica (ASIC) o una matriz de puertas programables in situ (FPGA). Si bien se muestra un bloque de procesador, el sistema 100 también puede incluir múltiples procesadores que pueden funcionar o no en paralelo, u otra lógica y memoria dedicadas para almacenar y rastrear información relacionada con los contenedores de muestras o placas AST en la incubadora y/o el dispositivo 120 de adquisición de imágenes. A este respecto, la unidad de procesamiento puede rastrear y/o almacenar varios tipos de información con respecto a una placa AST en el sistema 100, incluyendo, entre otros, la ubicación de la placa AST en el sistema (incubadora o dispositivo de adquisición de imágenes, ubicaciones y/o u orientación en el mismo, etc.), el tiempo de incubación, la información de los píxeles de las imágenes capturadas, el tipo de muestra de placa AST (p. ej., concentración(es) de antibiótico(s) y tipo de bacteria), el tipo de medio de cultivo, información de manipulación preventiva (p. ej., muestras peligrosas), etc. En este sentido, el procesador puede automatizar total o parcialmente las diversas rutinas descritas en la presente memoria. En una realización, las instrucciones de control del procesador para controlar las rutinas descritas en la presente memoria pueden almacenarse en un medio no transitorio legible por ordenador (p. ej., un programa de software).

La figura 2 es un diagrama de flujo que muestra un ejemplo de rutina 200 de laboratorio automatizada para llevar a cabo pruebas de sensibilidad a antibióticos. La rutina 200 puede implementarse mediante un sistema de laboratorio de microbiología automatizado, tal como el KiestraMT Total Lab Automation o el KiestraMT Work Cell Automation, ambos fabricados por Becton, Dickinson & Co. Los sistemas de ejemplo incluyen módulos interconectados, cada módulo configurado para ejecutar una o más etapas de la rutina 200. En el ejemplo, se puede entender que la rutina 200 incluye un proceso 202 de crecimiento y obtención de imágenes y un proceso 204 de evaluación de imágenes.

Proceso 202 de crecimiento y obtención de imágenes

En 206, se prepara una placa de cultivo, tal como con un medio de agar, para AST. La placa de cultivo, u otro recipiente adecuado, se proporciona y se inocula con una muestra biológica (p. ej., una bacteria). La placa de cultivo puede ser un recipiente ópticamente transparente, de modo que la muestra biológica y los discos de antibiótico puedan observarse en el recipiente mientras están iluminados desde diversos ángulos. La inoculación puede seguir un patrón o proceso predeterminado para aplicar uniformemente la bacteria al medio. Los expertos en la materia conocen bien los métodos automatizados para inocular la placa. En 206, se aplican al medio una o más muestras de antibióticos, p. ej., una oblea de antibiótico tal como en forma de disco.

En 208, el sensor de imagen del sistema puede capturar una primera imagen digital. Preferiblemente, dicha imagen se capturará en o cerca del tiempo de inicialización de la placa de cultivo antes de cualquier crecimiento.

A 210, el medio se incuba para permitir el crecimiento de la muestra biológica.

En 212, luego se puede capturar otra imagen digital (una o más) del medio y la muestra biológica, tal como en un tiempo predeterminado en relación con la inicialización de la placa AST. Se pueden obtener imágenes digitales del medio múltiples veces durante el proceso de incubación (p. ej., al inicio de la incubación, en un tiempo en el medio de la incubación, al final de la incubación) para que se puedan observar y analizar los cambios en el medio. La temporización puede basarse en la naturaleza de la placa AST, tal como el tipo y la concentración del (de los) antibiótico(s) a analizar. La obtención de imágenes del medio puede implicar retirar el medio de la incubadora. En el caso de que se toman múltiples imágenes del medio después de diferentes tiempos de incubación, el medio puede devolverse a la incubadora para una mayor incubación entre sesiones de imágenes.

Proceso 204 de evaluación de imágenes

Después de obtener las imágenes, la placa AST se analiza en base a la información de las imágenes digitales capturadas. El análisis de la imagen digital puede implicar el análisis de la información de los píxeles contenida en las imágenes. En algunos casos, la información de los píxeles se puede analizar píxel por píxel. En otros casos, la información de los píxeles se puede analizar bloque por bloque. En aún otros casos, los píxeles se pueden analizar en base a regiones de píxeles completas, por lo que la información de los píxeles individuales en la región se puede derivar al combinar información de los píxeles individuales, seleccionar píxeles de muestra o mediante otros métodos estadísticos tales como operaciones estadísticas con el histograma, que se describen con más detalle a continuación. En la presente divulgación, las operaciones que se describen como aplicadas a los "píxeles" son aplicables de forma parecida a bloques u otras agrupaciones de píxeles, y por la presente se pretende que el término "píxel" incluya dichas aplicaciones.

Típicamente, el análisis puede implicar determinar si se detecta crecimiento (o ausencia de crecimiento) en relación con los discos de antibiótico del medio. Desde una perspectiva de análisis de imágenes, el crecimiento se puede detectar en una imagen al identificar un objeto de la imagen (en base a las diferencias entre el objeto y su entorno contiguo) y luego identificar cambios en el objeto a lo largo del tiempo. Como se describe con más detalle en la presente memoria, estas diferencias y cambios son formas de "contraste". El contraste se puede representar, por ejemplo, píxel por píxel, mediante uno o más de valores de intensidad, valores de color, valores de gris, valores de opacidad y valores de desenfoque.

Por ejemplo, en 214, se pueden recibir en un procesador datos que representan la primera y la segunda imagen capturada de una placa concreta. La primera y la segunda imagen se toman en tiempos separados donde se entenderá que la "primera" imagen es una imagen tomada de la placa antes de la segunda imagen pero no es necesariamente la imagen inmediatamente anterior tomada de la placa antes de la segunda imagen. Se pueden tomar otras imágenes de la placa entre la primera y la segunda imagen. Típicamente, habrá un tiempo de incubación significativo entre la primera y la segunda imagen. (Véase, p. ej., la figura 4 que muestra el disco de la figura 3 con crecimiento G después de la incubación, pero sin crecimiento n G alrededor de los discos D1, D4, D5 y D6 y sin crecimiento parcial PNG alrededor de D3 y D2). En algunos casos, la primera imagen puede ser una imagen previa a la incubación, tal como una imagen tomada en el proceso 208 (véase, por ej., la figura 3 que muestra los discos D1-D6 y sin crecimiento en la imagen de la placa). En algunos casos, la primera imagen puede ser una imagen tomada después de por lo menos algún tiempo de incubación, tal como en el proceso 212.

En 216, el procesador puede generar datos de características de los píxeles para los píxeles de la segunda imagen a partir de un análisis de contraste que implica una comparación de los datos de la primera imagen y los datos de la segunda imagen. Como se describe con más detalle en la presente memoria, esto puede implicar una comparación de los datos de la primera imagen (p. ej., que sirven como propiedades de referencia) y los datos de la segunda imagen para evaluar el nivel de crecimiento logrado en los datos de la segunda imagen. Por ejemplo, al ignorar el disco de antibiótico en las imágenes, los datos de características de los píxeles pueden representar una indicación de las regiones de placa homogéneas más diferentes de una imagen reciente en comparación con una imagen anterior (p. ej., imagen previa a la incubación).

Opcionalmente, dicha comparación también puede realizarse región por región, tal como en relación con cada disco de antibiótico en la placa. Dicho proceso puede implicar la detección de una o más regiones concretas de la imagen mediante la detección de un disco de antibiótico y/o un marcado del disco de antibiótico. Opcionalmente, esto puede implicar la evaluación de una versión normalizada de la imagen. Por ejemplo, el procesador puede escanear la primera y/o segunda imagen, o una versión normalizada de la misma, al realizar el reconocimiento de caracteres de un marcador en los discos de antibiótico. Los caracteres reconocidos de los marcadores pueden servir como índice para acceder a una memoria, tal como una base de datos, que incluye información relativa a un disco de antibiótico concreto de la placa. Por ejemplo, la información puede incluir el tamaño del disco, la forma del disco, la ubicación del disco, el nombre del antibiótico, la concentración, etc.

Para cada disco, el proceso puede evaluar opcionalmente la modulación del nivel de crecimiento en función de la distancia al borde o bordes del disco de antibiótico. Por ejemplo, se puede derivar información de contraste píxel por píxel, que sirve como datos de características de los píxeles, para los píxeles de la segunda imagen de la placa en relación con la primera imagen de la placa. Estos datos característicos pueden incluir uno o más de valor de intensidad, valor(es) de color, valor de gris, valor de opacidad y valor de desenfoque para cada píxel de la imagen evaluada. Opcionalmente, estos valores también pueden caracterizarse según su distancia a un disco concreto. Dicha distancia se ilustra en la figura 9. Por ejemplo, los píxeles pueden resumirse como una función de la distancia, tal como en un mapa de distancias.

Se puede considerar un ejemplo de dichos datos de características de los píxeles en referencia a la figura 5 y figura 6. La figura 5 incluye una porción de una imagen de una placa de crecimiento de AST que muestra una región R con un disco 502 de antibiótico. Existe una región 504 sin crecimiento alrededor del disco 502. Las regiones de crecimiento G existen más alejadas de la región sin crecimiento y del disco 502. La imagen también muestra el borde 506 de la placa. La figura 6 muestra una transformada polar de información de contraste que puede derivarse de una comparación de la imagen de la figura 5 y la región correspondiente de una imagen anterior (no se muestra). En la figura 6, los píxeles se muestran como valores de intensidad. La transformación polar convierte la porción del disco 502 de la imagen de la figura 5 en una banda 608 de luz (intensidad más alta) a la izquierda de la imagen. En la transformación, la región 504 sin crecimiento se convierte en una banda 604 sin crecimiento que tiene una intensidad menor que la banda 608 de luz. Una región 610 de crecimiento que muestra un crecimiento G que tiene una intensidad mayor que la banda 604 sin crecimiento y una intensidad menor que la banda 608 de luz. La detección de bordes se puede emplear opcionalmente para detectar un borde 612 entre los píxeles de la banda de luz y la banda sin crecimiento y/o para detectar un borde entre los píxeles de la banda sin crecimiento y los píxeles de la región con crecimiento. Como se ilustra en la imagen de la figura 6, la detección de bordes puede determinar un borde entre los píxeles de la banda sin crecimiento 604 y los píxeles de la región con crecimiento para indicar o determinar la distancia inhibidora mínima para el disco 502 de antibiótico concreto y el crecimiento de bacterias en la placa.

Con la transformación polar de los píxeles de la imagen, los valores de intensidad se pueden resumir en función de la distancia al disco tal como, para formar un mapa de distancias. (véase, por ej., la figura 8). Por ejemplo, cada columna (xc) denpíxeles (xc, y0..n) se puede promediar donde xc representa una distancia de píxeles fija desde el centro del disco o el borde del disco. El promedio de cada distancia xc puede proporcionar colectivamente el mapa de distancias. De forma parecida, se pueden formar otros mapas de distancias, por ejemplo, al encontrar el valor máximo, mínimo, promedio, mediana y/o cualquier valor percentil de los píxeles para cada columna. Además de estos mapas de distancias de intensidad, se pueden formar otros mapas de este tipo con valores de color, valores de gris, valores de opacidad y valores de desenfoque asociados con los píxeles de la imagen. Aunque la transformada polar se puede utilizar para facilitar la caracterización de los píxeles según la distancia como se describe en la presente memoria, en algunas versiones se pueden utilizar coordenadas polares para caracterizar los píxeles según la distancia desde el disco sin transformación de los datos de contraste. Las transformaciones polares de los píxeles de la imagen se describen con más detalle a continuación.

En algunas versiones, los mapas que resumen la placa se pueden utilizar para una evaluación adicional de la placa AST concreta que se somete a prueba. Sin embargo, los mapas pueden, de forma adicional o alternativa, almacenarse en una base de datos junto con información relativa a los discos de antibiótico concretos (p. ej., tipo, concentración, etc.) de la placa e información relativa a la bacteria concreta sometida a prueba de modo que los mapas se pueden utilizar para modelar como se analiza con más detalle en la presente memoria.

Continuando con el proceso de la figura 2 para una evaluación de la imagen de la placa AST concreta, el sistema puede acceder a datos del modelo de crecimiento relativos a cualquier subconjunto de, o todos, los discos de la placa AST que se analiza. Dicho acceso puede implicar seleccionar datos de una memoria, tal como una base de datos, del medio 130 de almacenamiento de datos. El acceso a la memoria puede basarse en el reconocimiento del marcado de los discos de la placa AST como se describe previamente y/o basarse en un marcado de placa que está asociado con la placa AST concreta y su contenido. En algunas versiones, el acceso puede recuperar datos de la(s) base(s) de datos donde los datos incluyen, por ejemplo, uno o más mapas de distancias, datos de concentración de antibióticos, funciones del modelo de crecimiento, etc. que conciernen a uno o más de los discos de la placa AST y, opcionalmente, una bacteria que se somete a prueba. Los datos del modelo de crecimiento, incluidos dichos mapas o funciones, pueden derivarse según un modelo de crecimiento como se describe con más detalle en la presente memoria y pueden basarse además en los datos de las imágenes observadas, tales como funciones de mapas de otras placas AST. Típicamente, cada disco puede tener un mapa de distancias concreto o un conjunto de mapas de distancias asociados con el disco. Así, los mapas de distancias pueden variar dependiendo del antibiótico concreto, la concentración del antibiótico en el disco y la cantidad de tiempo transcurrido desde la colocación del antibiótico en el disco. Opcionalmente, el mapa de distancias para un disco de antibiótico concreto también puede depender del tipo y concentración de los discos de antibiótico vecinos de una placa AST.

Se pueden considerar mapas de distancias de ejemplo que se derivan de un modelo de crecimiento en referencia al mapa de ejemplo de las figuras 10 y 11. En el ejemplo de la figura 10, el mapa de distancias, parecido a los mapas descritos previamente, proporciona una estimación de un perfil radial que es indicativo del crecimiento de bacterias en función de la distancia desde un centro de un disco concreto. Para este mapa en concreto, los cambios en el valor de gris están asociados con distancias (p. ej., distancia de píxeles) desde el borde de un disco de antibiótico. Por ejemplo, los valores de gris más altos pueden ser una indicación de modelar una ausencia de crecimiento y los valores de gris más bajos pueden ser una indicación de modelar un crecimiento bacteriano. En este ejemplo, los valores de gris de la función pueden considerarse un valor de gris promedio. Sin embargo, otras funciones pueden emplear valores mínimos, valores máximos, valores de la mediana y/o valores percentiles. Como se ilustra en la figura 11, la función puede tener puntos característicos (ilustrados con flechas) que pueden ser indicativos de diferentes características de la relación entre las bacterias y la concentración concreta del antibiótico del disco (y potencialmente de los discos vecinos) con respecto a la distancia desde el disco de antibiótico. Por ejemplo, los puntos en la función ilustrada indican características tales como el borde del disco de antibiótico, el efecto máximo sobre el crecimiento (es decir, la cantidad máxima de modulación del crecimiento y su distancia desde el disco), la distancia desde el disco a la que se produce una modulación del 50 % de la respuesta del crecimiento, etc.

En algunas versiones, estos mapas modelo se pueden comparar con los mapas observados hechos para la placa AST concreta en el proceso 216 para detectar e indicar diferencias entre el mapa de distancias modelo y el mapa de distancias observado. Un proceso de comparación de este tipo puede implicar un análisis discrepante. En algunas de dichas versiones, la comparación puede implicar la generación de una imagen simulada según un mapa modelo. Así, en el proceso 220, el sistema puede generar los datos de las imágenes simuladas con una función del modelo de crecimiento que utiliza los datos del modelado de crecimiento a los que se accedió en 218. De este modo los datos de las imágenes simuladas simulan el crecimiento (y/o ningún crecimiento) en la placa de crecimiento de AST en relación con uno o más discos de la placa.

En los mapas de imágenes (ya sea para la imagen sometida a prueba o para las imágenes en la biblioteca de imágenes de placas con diferentes patrones de modulación del crecimiento microbiano para microorganismos específicos, antibióticos y concentración de antibióticos), el crecimiento se puede simular como una modulación del crecimiento observable cuando no hay disco AB (o una distancia infinita al disco AB). Por ejemplo, Csin<ab>es el contraste medido desarrollado por el organismo en crecimiento después del tiempo de incubación t cuando no hay ningún disco AB (es decir, esto es lo mismo que el crecimiento que se produce a una distancia infinita de cualquier disco de antibiótico (una zona sin absolutamente ninguna inhibición por parte del disco)).

El contraste observado se puede modelar utilizando la función sigmoidea siguiente:

con r igual a la distancia desde el disco que muestra una modulación del 50% del contraste observado y x igual a la distancia al borde del disco AB para el píxel concreto. El valor es cero si no se encuentra dicha modulación del crecimiento microbiano (como lo demuestra la falta de diferencia de contraste entre el píxel y los píxeles en una región con crecimiento microbiano no modulado) en comparación con las regiones alejadas de los discos de antibiótico. En caso de modulación, el valor es un factor que controla la inclinación de la modulación cerca del disco (la pendiente es igual a /4 en r). En referencia a la figura 16, cuando el contraste temporal medido debido al crecimiento es igual al 100 % (es decir, Csin<ab>), r es igual a 10 mm y es igual a 0,5 (donde los valores más grandes dan una pendiente más pronunciada), el contraste máximo se ve a unos 20 mm del borde del disco y permanece constante (es decir, no hay modulación negativa del crecimiento más lejos del disco AB) y la pendiente máxima se ve en R igual a 10 mm. Si se compara la figura 16 y la figura 8 se observa la misma función.

Se puede utilizar lo siguiente para optimizar la coincidencia entre el contraste medido y el simulado:

r x= 40m m

~ I'x=Omm<(^mOO ~ Cs(x))>

Donde C<m>es el contraste medido y Cs es el contraste simulado. El crecimiento modelado se puede ajustar estableciendo primero Csin<ab>y luego buscando la distancia r (en el intervalo de 0 mm a 45 mm) donde la modulación del crecimiento es del 50 % con un valor de igual a 10. El valor de en el intervalo de 0,1 a 10 se perfecciona o se estima la pendiente en r para establecer el valor de . Según la función, la pendiente en el valor r es /4.

Por ejemplo, como se ilustra en la figura 12, se puede generar una imagen de placa AST a partir de un conjunto de funciones (una o más) de distancias modeladas donde las funciones de distancias modeladas tienen un crecimiento modelado. Dichas funciones pueden incluir funciones de valor de opacidad, funciones de color y funciones de desenfoque, cada una de las cuales aplica un valor concreto del mapa a cada píxel de la imagen simulada según su distancia desde un disco y las funciones del mapa. En el ejemplo de la figura 12, el crecimiento se muestra incluso alrededor de los discos porque las funciones del modelo (no se muestran) modelaron el crecimiento de los discos concretos y las bacterias concretas de la placa de modo que las bacterias no se vieron afectadas por el antibiótico de los discos, o fueron resistentes a él (es decir, sin área de inhibición). La figura 13, por el contrario, muestra una imagen simulada con áreas de inhibición en algunas áreas porque las funciones del modelo para los discos respectivos modelan los diferentes efectos inhibidores del (de los) antibiótico(s) y/o sus concentraciones.

Muchos ejemplos de imágenes de modulación/inhibición del crecimiento de discos antibióticos contiguos se encuentran en http://cdstest.net/manual/plates/. Estas imágenes se proporcionan con fines ilustrativos en las figuras 17 a 20 y las figura 21A a 21F. Como se puede observar en la figura 17, los anillos oscuros alrededor de los discos de antibiótico son zonas de inhibición. Las regiones borrosas indican un crecimiento difuso. Las regiones más claras en el perímetro, tales como las que se ilustran en la placa 13.2.C para el disco VA5, indicaron zonas inhibidoras reducidas (es decir, modulación parcial a diferencia de modulación completa). Cuando el fondo se extiende hasta el perímetro del disco, como en la placa 13.2 D para los discos VA5 y TEC15, esta imagen muestra que no hubo modulación/inhibición del crecimiento para este microorganismo(Leuconostoc)para esos discos de antibiótico (en esas concentraciones).

Existen tres escenarios claramente diferentes para el modelado de crecimiento. El primer escenario es donde sencillamente no hay modulación del crecimiento en el disco de antibiótico. Este patrón (es decir, falta de modulación) se ilustra en la figura 18. Cuando el crecimiento está modulado por un solo disco, el crecimiento modulado/inhibido se manifestará en una amplia variedad de patrones (dependiendo del microorganismo específico y del antibiótico específico). En la figura 19 se ilustra una serie de ejemplos no limitativos de dicha modulación del crecimiento.

La modulación del crecimiento influenciada por múltiples discos de antibiótico también puede adoptar una variedad de patrones que varían dependiendo del tipo de microorganismo, los antibióticos y la distancia desde los múltiples discos. Dichos patrones se ilustran en la figura 20. Como se indica anteriormente, puede resultar una amplia variedad de patrones de modulación del crecimiento dependiendo de una variedad de factores (es decir, el microorganismo, el antibiótico del disco, la concentración del antibiótico en el disco, la proximidad de los discos entre sí en la placa, etc.). Por lo tanto, los modelos que simularán la modulación del crecimiento microbiano de un microorganismo mediante un antibiótico seleccionado para interpretar los datos de las imágenes varían en complejidad dependiendo de las interacciones que se modelan.

Para evaluar las áreas en una placa donde el crecimiento microbiano está modulado por múltiples discos, es útil transformar la intensidad de los píxeles en función de la distancia desde los dos discos. En referencia a la figura 21A, una ilustración de la modulación provocada por el disco D1 se ilustra como un anillo de luz alrededor del disco. El disco D2 no provoca ninguna modulación. A la izquierda se ilustra la transformación de la imagen. La distancia desde el disco D2 está en el eje x y la distancia desde el disco D1 está en el eje y. La intensidad de los píxeles en la zona de modulación (700) se ilustra como 700 en la transformada bidimensional. Hay una zona en la transformada que no representa una combinación de distancias desde los dos discos, que es lo que se ilustra en 701. En la figura 21B se ilustra una transformación bidimensional en la que dos discos provocan modulación cada uno modulación (es decir, un disco no influye en la modulación provocada por el otro disco). Las zonas de modulación (710, 711) se ilustran en relación con los discos D1 y D2 a la derecha y en la transformada bidimensional a la izquierda.

En la figura 21C se ilustra una interacción más compleja. Existen las zonas de modulación 720 y 721 como en los ejemplos anteriores. Sin embargo, hay claramente una zona en la que se superpone la modulación provocada por los discos. La superposición de influencias es evidente en la transformación de la izquierda porque las zonas de modulación se extienden entre sí.

En referencia a la figura 21D, se ilustra una situación en la que, individualmente, los discos no provocan ninguna modulación del crecimiento. Sin embargo, a cierta distancia de ambos discos, está presente una zona de modulación 730, lo que indica que la modulación del crecimiento es provocada por la combinación de los dos antibióticos y no por cada disco individualmente. Al transformar los datos de la imagen en este sentido, los patrones para determinados efectos combinatorios de múltiples discos se comparan más fácilmente con los patrones existentes para interpretar los datos de la imagen de la placa bajo inspección.

En algunos casos, el grado o alcance de la modulación puede variar con la distancia al disco. La figura 21E ilustra la primera (740) y la segunda (741) zona de modulación provocada por el disco D1. La primera zona es 740 de inhibición completa y la segunda es una zona de inhibición parcial. Dado que la intensidad de los píxeles variará en función del alcance de la modulación, las diferencias de intensidad también son evidentes a partir de los datos de transformación de la izquierda. Para simplificar la ilustración, el D2 no provoca ninguna modulación en la figura 21E.

La figura 21F ilustra una transformada en la que la modulación 750 provocada por el D2 inunda al D1, lo que no provoca ninguna modulación en sí misma. Si bien esto podría ser difícil de distinguir en una imagen tridimensional, a partir de los datos de la transformación polar queda claro que los píxeles directamente contiguos al D1 (ilustrados como la región 751 en los datos de la transformación) tienen una intensidad congruente sin modulación (es decir, la distancia d1 del D1 es cero para muchos píxeles que poseen una intensidad congruente con una modulación del crecimiento cero).

El sistema 100 puede aplicar dichas imágenes simuladas para hacer que las pruebas de susceptibilidad sean más eficaces. Por ejemplo, en el proceso 222, el sistema puede comparar la imagen simulada generada por el sistema con una imagen de la placa AST capturada por el sistema. Dicha comparación puede servir para contrastar la imagen capturada y la imagen simulada mediante un análisis discrepante. Por ejemplo, la figura 14 ilustra una imagen (o imagen de contraste) capturada por el sistema de modo que muestra el crecimiento G y diversas regiones de inhibición (RI1, RI2, RI3, RI4 y RI5) alrededor de algunos de los discos. Dicha imagen, que puede referirse a una imagen observada, puede procesarse en relación con una imagen anterior para mejorar el contraste indicativo de una observación del crecimiento como se analiza previamente. Esta imagen observada puede luego contrastarse con la imagen simulada. Por ejemplo, como se ilustra en la figura 15, se puede generar una máscara 1520 de la imagen para resaltar las áreas de diferencia entre la imagen observada (figura 14) y la imagen simulada (figura 13) para con el objetivo de resaltar las diferencias entre el crecimiento modelado y el crecimiento observado. Por ejemplo, la máscara de la imagen puede generarse mediante una comparación de los píxeles, píxel por píxel. En dicho ejemplo, si un píxel (x,y) dado de la imagen observada tiene un valor igual o no significativamente diferente (p. ej., dentro de un umbral de diferencia) del píxel correspondiente de la imagen simulada, el píxel correspondiente de la máscara de la imagen se puede establecer en un valor deseado (p. ej., negro). De lo contrario, el píxel correspondiente de la máscara de la imagen puede establecerse en un valor diferente (p. ej., blanco) para resaltar la ubicación de la diferencia. En algunos casos, la máscara de la imagen puede generarse con píxeles según un escalado de las diferencias de modo que las regiones con diferencias mayores destacan más de las regiones con diferencias menores.

Dichos análisis discrepantes del modelo frente a las imágenes observadas pueden servir como base para confirmar el modelo. Puede servir para identificar/resaltar regiones que el modelo no explica bien. También puede ayudar a simplificar la detección automatizada de interacciones con discos de antibiótico y el análisis posterior. A este respecto, como se ilustra con respecto a las figuras 13, 14 y 15, los discos D1, D4 y D6 tienen efectos antibióticos esperados (es decir, la figura 13 modelada es aproximadamente igual a la figura 14 observada) con regiones de inhibición típicas. Sin embargo, una región de inhibición RI4 parcial entre el disco D3 y D2 observada en la figura 14 indica alguna interacción inesperada entre el antibiótico de D2 y el antibiótico de D3. Esto da como resultado que se presenta una región 1522 de diferencia en la máscara de la figura 15. Una imagen o máscara de diferencia de este tipo puede servir como herramienta para ayudar con una evaluación visual de la placa AST, tal como si se presenta en un visualizador a un técnico de laboratorio, ya sea con la imagen observada (p. ej., cerca) o superpuesta con la imagen observada. Asimismo, dicha evaluación puede servir como base para comparar con una biblioteca de datos simulados o de imágenes. Dicha comparación puede producir una evaluación de la placa sin requerir la intervención del operador para ayudar en la interpretación. Así, el sistema 100 puede configurarse con un visualizador (p. ej., una pantalla de monitor) para presentar dichas imágenes en el visualizador junto con una evaluación del significado de la imagen (si el sistema es capaz de proporcionar dicha evaluación). De esta manera, los datos de la imagen de diferencia pueden detectar una sinergia concreta entre dos antibióticos diferentes.

Los procesos del sistema 100 descrito en la presente memoria también pueden permitir el modelado incremental de la respuesta AST. Por ejemplo, al ajustar el modelo después de cada etapa con la diferencia detectada entre el modelo y la observación, se puede modificar el siguiente nivel del modelo en detecciones posteriores. Cualquier discrepancia final entre el modelo y la imagen real puede resaltar la insuficiencia del modelo para interpretar automáticamente el AST. Así, el sistema puede aprender para mejorar o actualizar el modelo para la detección automatizada.

El sistema puede mejorar la detección automática de cualquiera de:

características del crecimiento (donde no hay modulación del crecimiento inducida por uno o más antibióticos) interpretación fina de la modulación del crecimiento inducida por un antibiótico determinado heterogeneidad de la población microbiana en caso de diferentes subpoblaciones susceptibles/resistentes u organismos mixtos.

patrones complejos de resistencia/susceptibilidad a causa de la sinergia de dos o más antibióticos.

Desarrollo de la teoría del modelado del crecimiento

En algunas versiones de la presente tecnología, los datos del modelado de crecimiento, tales como los mapas de distancias analizados previamente, que pueden entenderse como mapas de calibración de la difusión, pueden basarse en la concentración de antibióticos, el tiempo de prueba/difusión y las bacterias seleccionadas. Al desarrollar dichos mapas para un modelo del crecimiento, la modulación del crecimiento se puede medir como una función de la concentración "detectada" (una ubicación en el borde del crecimiento de las bacterias y sin crecimiento) dependiendo de la ubicación de los píxeles en la placa de agar como una función de la distancia a cada disco.

La concentración "detectada" para cada antibiótico debe seguir la ecuación siguiente:

Donde:

C<q>es la concentración inicial del disco, D es el coeficiente de difusión (ecuación de Stokes-Einstein), t es el tiempo, r la distancia a la fuente (hasta el borde del disco de antibiótico);

k= dimensionalidad (típicamente entre 1,0 y 3,0), normalmente cerca de 2,0.

En cuanto a los mapas de calibración de la difusión para cada antibiótico, se pueden utilizar discos con diferentes cargas de un antibiótico determinado y se pueden analizar los patrones de crecimiento respectivos para un organismo susceptible determinado. De facto, el límite de cada zona de inhibición debería corresponder a la misma concentración de antibiótico "detectada" por el organismo. Así, con un conjunto de radios de zonas de inhibición y una carga de antibióticos conocida, la ecuación de difusión puede resolverse para cada antibiótico.

Sobre la base de las concentraciones de antibióticos críticas y los diámetros críticos, r, en el momento de la lectura (p. ej., t=24 h), se pueden estimar D y k.

Por ejemplo, mediante el uso de dos discos con una concentración inicial C1 y C2 y radios de inhibición n y r2 esto da:

Si C1, C2, C3 son diluciones en cascada dobles con C2 = 1/2 Ci , C3 = 1/2 C2 entonces:

1r

ln (2 ) _ 1r k2k_‘ r 2k1r

= 1 3k

4Dt 4Dt

o<4>v-<- s 4 4 = o>bien partir del cual k puede estimarse fácilmente.

La finalización de la calibración se puede incluir en la ecuación de calibración si se proporciona la concentración inhibitoria mínima ("C/M'), oC(r,t),del organismo sometido a prueba en paralelo mediante un sistema de prueba automatizado para perfeccionar la ecuación de calibración.

Pongamos que B es 4Dt, entonces:

O bien

Una vez que se conocen k y B por antibiótico sometido a prueba, se puede estimar la concentración de cada antibiótico en los medios en función de la distancia al disco fuente (conociendo su concentración inicial Co) para producir mapas de distancias adecuados para diversos discos. Así, la modulación del crecimiento puede estimarse (modelarse) en función de la distancia a cada disco de antibiótico. Además, opcionalmente, la modulación del crecimiento puede estimarse (modelarse) en función de la concentración de antibiótico estimada.

Comparación y contraste de las imágenes

En los procesos mencionados anteriormente, determinar si existe crecimiento en relación con los discos de las placas se puede implementar a partir de la comparación de las imágenes (entre las observadas en el tiempo fe y las observadas en el tiempo tx y/u entre las observadas y las simuladas) para determinar el contraste entre ellas. En este sentido, con el tiempo, crecerán bacterias en una placa AST. Cuanto antes en el tiempo se coloquen las bacterias en la placa, menos bacterias habrá para detectar y, en consecuencia, habrá menor contraste con el fondo. Dicho de otra manera, un tamaño de colonia más pequeño produce una señal más pequeña, y una señal más pequeña en un fondo constante da como resultado un contraste más pequeño. Esto se refleja en la siguiente ecuación:

( 1)Contraste Señal-fondo

Señal+fondo

El contraste puede desempeñar un papel importante en la identificación de objetos de crecimiento en las imágenes. Un objeto puede detectarse en una imagen si difiere significativamente en brillo, color y/o textura de su entorno. Una vez que se ha detectado un objeto, el análisis también puede implicar identificar el tipo de objeto que se ha detectado. Dichas identificaciones también pueden depender de mediciones de contraste, tales como la suavidad de los bordes del objeto identificado o la uniformidad (o falta de uniformidad) del color y/o brillo del objeto. Este contraste debe ser lo suficientemente grande como para superar el ruido de la imagen (señales de fondo) que detectará el sensor de imagen.

La percepción humana del contraste (gobernada por la ley de Weber) es limitada. En condiciones óptimas, el ojo humano puede detectar una diferencia de nivel de luz del 1 %. La calidad y confianza de las mediciones de imagen (p. ej., brillo, color, contraste) se pueden caracterizar por una relación señal-ruido (SNR) de las mediciones, en la que un valor SNR de 100 (o 40 dB), independiente de las intensidades de los píxeles, igualaría las capacidades de detección humana. Las técnicas de imágenes digitales que utilizan información de obtención de imágenes de alta SNR e información de SNR por píxel conocida pueden facilitar la detección de colonias incluso cuando esas colonias aún no son visibles para el ojo humano.

Sin embargo, el contraste visualmente observable o perceptible no significa necesariamente que el contraste temporal observado, en sí mismo, sea una determinación fiable de la modulación del crecimiento microbiano en las proximidades de un disco de antibiótico. Puesto que el presente método puede determinar el alcance del contraste temporal, el presente método puede proporcionar una indicación al usuario de si el contraste temporal observado es adecuado o no para una determinación fiable de la modulación microbiana al establecer una cantidad umbral de contraste temporal (es decir, el 1 % o más, el 2 % o más, el 3 % o más, el 4 % o más, el 5 % o más, etc.) requerido antes de que se proporcione al usuario una indicación de que en ese momento se puede realizar una determinación fiable del crecimiento microbiano. El umbral seleccionado variará según el tipo de medio nutritivo (p. ej., agar Mueller Hinton (MH), agar Mueller Hinton con sangre de oveja al 5 %, agar chocolate Mueller Hinton, etc.) y el tipo de microorganismo (p. ej.,Neisseria o Haemophilussp., N.gonorrhoeae,E. coli Salmonella,Shigella, Staphylococcusaureus, etc.). Típicamente, se requiere una mayor cantidad de contraste cuando se forman colonias más claras en agares más claros (p. ej., MH) o cuando se forman colonias más oscuras de color parecido en agares más oscuros (p. ej., agar chocolate MH). Por lo tanto, se contempla que el alcance de contraste temporal requerido para una determinación fiable de la modulación del crecimiento microbiano se establecerá en diferentes umbrales para diferentes combinaciones de agar y microorganismos. Una vez que se detecta que el alcance de contraste temporal medido alcanza o sobrepasa el umbral establecido, se notificará al usuario que la placa está lista para el análisis. Si el alcance de contraste temporal medido no alcanza o sobrepasa el umbral especificado, se recomienda al usuario que continúe incubando la muestra durante otro ciclo o invalide la muestra debido a su mala calidad. Esto es ventajoso porque, si bien un usuario experto puede percibir el contraste, el usuario experto puede percibir el crecimiento, el usuario experto no siempre puede distinguir visualmente con exactitud una modulación del 50 % o del 80 % del crecimiento a partir de un cambio observado en la intensidad (cuando la diferencia absoluta es entre una diferencia de intensidad del 2 % y una diferencia de intensidad del 3 %), lo que da lugar a una lectura errónea de la región de inhibición alrededor de un disco de antibiótico determinado.

En la presente divulgación, el contraste se puede recoger de por lo menos dos maneras: espacial y temporalmente. El contraste espacial, o contraste local, cuantifica la diferencia de color o brillo entre una región determinada (p. ej., un píxel, un grupo de píxeles contiguos) y su entorno en una sola imagen. El contraste temporal, o contraste de tiempo, cuantifica la diferencia de color o brillo entre una región determinada de una imagen frente a esa misma región en otra imagen tomada en un tiempo diferente. La fórmula que rige el contraste temporal es parecida a la del contraste espacial:

(2)Contraste temporal<= I Señal ( t i ) - Señal(t2)\>

Señal( t i)+ Señal (r2)

En la cual t2 es un tiempo posterior a ti. Se pueden utilizar contrastes espaciales y temporales de una imagen determinada para identificar el crecimiento.

Para maximizar el contraste espacial o temporal de un objeto con respecto a su fondo, el sistema puede capturar imágenes utilizando diferentes luces incidentes en diferentes fondos. Por ejemplo, cualquiera de las luces superior, inferior o lateral se puede utilizar sobre un fondo blanco o negro.

En un momento dado, se pueden capturar múltiples imágenes bajo múltiples condiciones de iluminación. Las imágenes pueden capturarse utilizando diferentes fuentes de luz que son espectralmente diferentes como consecuencia del nivel de iluminación, el ángulo de iluminación y/o los filtros desplegados entre el objeto y el sensor (p. ej., filtros rojo, verde y azul). De esta manera, las condiciones de adquisición de imágenes pueden variarse en términos de posición de la fuente de luz (p. ej., superior, lateral, inferior), fondo (p. ej., negro, blanco, cualquier color, cualquier intensidad) y espectro de luz (p. ej., canal rojo, canal verde, canal azul). Por ejemplo, se puede capturar una primera imagen usando iluminación superior y un fondo negro, una segunda imagen capturada usando iluminación lateral y un fondo negro, y una tercera imagen capturada usando iluminación inferior y sin fondo (es decir, un fondo blanco). Además, se pueden usar algoritmos específicos para crear un conjunto de condiciones de adquisición de imágenes variables para maximizar el uso del contraste espacial. Estos u otros algoritmos también pueden ser útiles para maximizar el contraste temporal al variar las condiciones de adquisición de imágenes según una secuencia dada y/o durante un período de tiempo. Algunos de dichos algoritmos se describen en el número de publicación PCT W02015/114121.

Se puede determinar la información de contraste entre dos imágenes. La información de contraste se puede reunir píxel por píxel. Por ejemplo, los píxeles de la segunda imagen digital pueden compararse con los píxeles correspondientes (en las mismas coordenadas) de la primera imagen digital para determinar la presencia de contraste temporal. Además, los píxeles contiguos de la segunda imagen digital se pueden comparar entre sí, o con otros píxeles que se sabe que son píxeles del fondo, para determinar la presencia de contraste espacial. Los cambios en el color y/o el brillo de los píxeles son indicativos de contraste, y la magnitud de dichos cambios de una imagen a la siguiente o de un píxel (o región de píxeles) al siguiente puede medirse, calcularse, estimarse o determinarse de otro modo. En los casos en que se determina tanto el contraste temporal como el contraste espacial para una imagen dada, se puede determinar un contraste global de un píxel dado de la imagen a partir de una combinación (p. ej., promedio, promedio ponderado) de los contrastes espaciales y temporales de ese píxel dado.

El crecimiento en la segunda imagen digital puede identificarse en base a la información de contraste calculada. Se puede considerar que los píxeles contiguos de la segunda imagen digital que tienen información de contraste parecida pertenecen al mismo crecimiento. Por ejemplo, si la diferencia de brillo entre los píxeles contiguos y su fondo, o entre los píxeles y su brillo en la primera imagen digital, es aproximadamente la misma (p. ej., dentro de una cantidad umbral predeterminada), entonces se puede considerar que los píxeles pertenecen al mismo objeto de crecimiento. Como ejemplo, el sistema podría asignar un "1" a cualquier píxel que tenga un contraste significativo (p. ej., por encima de la cantidad umbral), y luego identificar un grupo de píxeles contiguos a todos ellos asignados con "1" como un objeto de crecimiento. Al objeto se le puede dar una etiqueta o máscara específica, de modo que los píxeles con la misma etiqueta compartan determinadas características. La etiqueta puede ayudar a diferenciar el crecimiento de otros objetos (p. ej., discos) y/o del fondo durante procesos posteriores.

Identificar objetos en una imagen digital puede implicar segmentar o dividir la imagen digital en múltiples regiones (p. ej., primer plano y fondo). El objetivo de la segmentación es convertir la imagen en una representación de múltiples componentes para que sea más fácil analizarlos. La segmentación de imágenes se utiliza para localizar objetos de interés en imágenes tales como discos de antibiótico.

El uso de dichos procesos automatizados puede facilitar pruebas AST más rápidas. Dichas pruebas en un proceso automatizado pueden comenzar poco después de la colocación inicial de los discos AST, y los resultados pueden obtenerse y notificarse más rápidamente. Por el contrario, dichas pruebas en un proceso manual a menudo requieren más tiempo para finalizarse antes de que los datos puedan revisarse y notificarse. Así, el proceso automatizado de la presente divulgación, ayudado con el procesamiento del modelado y/o contraste descrito en la presente memoria, puede proporcionar pruebas más rápidas sin afectar negativamente a la calidad o exactitud de los resultados de las pruebas.

Aunque la invención en la presente memoria se ha descrito en referencia a realizaciones particulares, debe entenderse que estas realizaciones son meramente ilustrativas de los principios y aplicaciones de la presente invención.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un método para pruebas de susceptibilidad a antibióticos mediante un procesador que comprende: proporcionar una placa de cultivo inoculada con una muestra biológica, la placa de cultivo

que tiene medios de cultivo y por lo menos un disco de antibiótico dispuesto en la misma;

recibir datos de la primera y la segunda imagen de la placa de cultivo generados con un sensor de imagen, los datos de imagen asociados con píxeles de imagen, representando respectivamente los datos de la primera imagen y los datos de la segunda imagen la primera y la segunda imagen capturada de la placa de cultivo con una pluralidad de discos de antibiótico en la misma, la primera y la segunda imagen capturada tomadas en el primer y el segundo tiempo, en el que la placa de cultivo se incuba entre el primer y el segundo tiempo y en el que, opcionalmente, los datos de la primera imagen sirven como referencia previa al crecimiento;

generar datos de características de los píxeles para los píxeles de datos de la primera y la segunda imagen a partir de una comparación de los datos de la primera imagen y los datos de la segunda imagen, comprendiendo los datos de características de los píxeles datos de contraste en el que, opcionalmente, los datos de contraste comprenden valores de intensidad de los píxeles;

identificar píxeles asociados con por lo menos un disco de antibiótico en los datos de las imágenes;

comparar los datos de la primera y la segunda imagen para identificar el crecimiento microbiano en la placa de cultivo ignorando los píxeles asociados con por lo menos un disco de antibiótico en los datos de las imágenes; e identificar una o más regiones de píxeles de los datos de la segunda imagen que difieren de una o más regiones de píxeles de los datos de la primera imagen en el que la una o más regiones de píxeles son contiguas a los discos de antibiótico; evaluar el crecimiento microbiano en la medida en que se refiere a la distancia desde un borde del disco de antibiótico; proporcionar información de contraste de píxeles a partir de la comparación de los datos de la primera y la segunda imagen para identificar el crecimiento microbiano en la placa de cultivo;

aplicar una transformación polar de los datos de contraste, lo cual proporciona una porción de disco en una banda de luz con una primera intensidad, una banda sin crecimiento con una segunda intensidad y una región con crecimiento con una tercera intensidad en la que la tercera intensidad es menor que la primera intensidad y mayor que la segunda intensidad;

opcionalmente detectar un borde entre los píxeles en la banda sin crecimiento y la región con crecimiento; y determinar la distancia inhibidora mínima para por lo menos un disco de antibiótico en base a la distancia de la región con crecimiento desde por lo menos un disco de antibiótico.

2. El método de la reivindicación 1, en el que el disco de antibiótico incluye un marcador, en el que el marcador está asociado en una base de datos en comunicación con el procesador que incluye por lo menos uno del tamaño del disco de antibiótico, la forma del disco de antibiótico, la ubicación del disco de antibiótico, el nombre del antibiótico o la concentración de antibiótico.

3. El método de la reivindicación 1, en el que los datos de contraste comprenden además uno o más de datos de opacidad, datos de color y datos de desenfoque.

4. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que comprende además controlar el sensor de imagen para capturar la primera y la segunda imagen capturada de la placa de cultivo.

5. El método de la reivindicación 1 a 3, en el que los datos de contraste comprenden datos de contraste temporal y datos de contraste espacial.

6. El procedimiento de la reivindicación 5, que además comprende:

establecer un valor umbral de contraste temporal como una indicación de la modulación del crecimiento microbiano provocado por, por lo menos, un disco de antibiótico; y

cuando un contraste temporal medido entre uno o más píxeles en los datos de la primera imagen y uno o más píxeles en los datos de la segunda imagen sobrepasa el valor umbral de contraste temporal, proporcionar una indicación a un usuario de que la segunda imagen capturada se puede utilizar para evaluar el crecimiento microbiano; o cuando el contraste temporal medido entre uno o más píxeles en los datos de la primera imagen y uno o más píxeles en los datos de la segunda imagen no sobrepasa el valor umbral de contraste temporal, proporcionar una indicación a un usuario de que la segunda imagen capturada no se puede utilizar para evaluar el crecimiento microbiano.

7. El procedimiento de la reivindicación 6, que además comprende:

en respuesta a la indicación de que los datos de la segunda imagen no se pueden utilizar para evaluar el crecimiento microbiano, o bien: i) continuar incubando la placa de cultivo durante un período de tiempo adicional después de que se ha obtenido la segunda imagen capturada;

cuando ha transcurrido el periodo de tiempo adicional, recibir datos de una tercera imagen de la placa de cultivo generada con el sensor de imagen, representando los datos de la tercera imagen una tercera imagen capturada de la placa de cultivo que incluye por lo menos un disco de antibiótico;

generar datos de características de los píxeles para los píxeles de los datos de la tercera imagen a partir de una comparación de los datos de la segunda imagen y los datos de la tercera imagen, los datos de características de los píxeles indicativos del crecimiento microbiano en la placa de cultivo a lo largo del tiempo;

acceder a datos del modelado de crecimiento para el crecimiento microbiano, en el que los datos del modelado de crecimiento modelan el crecimiento microbiano en combinaciones de medios de cultivo, microorganismos, antibióticos, concentración de antibióticos en por lo menos uno del disco de antibiótico y en los medios de cultivo;

generar datos de las imágenes simuladas con la función del modelo de crecimiento; y

comparar los datos de las imágenes simuladas y los datos de características de los píxeles e identificar una o más regiones de píxeles en los datos de la tercera imagen que difieren de una o más regiones de píxeles de los datos de las imágenes simuladas; o

ii) proporcionar una señal para invalidar la muestra.

8. El método de la reivindicación 1, que comprende además resumir la intensidad en función de la distancia desde por lo menos un disco de antibiótico.

9. El método de la reivindicación 8, que comprende además formar un mapa de distancias a partir del resumen.

10. Un medio informático que contiene instrucciones de programación que, cuando las ejecuta un procesador, controlan el procesador para pruebas de susceptibilidad a antibióticos, en el que las instrucciones del programa controlan el procesador para realizar el método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9.

11. Un sistema para pruebas de susceptibilidad a antibióticos que comprende:

un sensor de imagen configurado para capturar imágenes de una placa de cultivo en la que están dispuestos medios de cultivo con por lo menos un disco de antibiótico dispuesto en la misma, en el que la placa de cultivo está inoculada con una muestra biológica en el que la placa de cultivo está dentro de un campo de visión del sensor de imagen; un procesador acoplado al sensor de imagen; y

un medio informático que contiene instrucciones de programación que, cuando las ejecuta el procesador, controlan el procesador para someter a prueba la susceptibilidad a antibióticos,

en el que las instrucciones del programa controlan el procesador para realizar el método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9.

12. Un sistema para pruebas de susceptibilidad a antibióticos que comprende:

un sensor de imagen configurado para capturar imágenes de una placa de cultivo en la que están dispuestos medios de cultivo con una pluralidad de discos de antibiótico dispuestos en la misma, en el que la placa de cultivo se inocula con una muestra biológica cuando la placa de cultivo está dentro del campo de visión del sensor de imagen, generando el sensor de imagen datos de la primera imagen y datos de la segunda imagen, representando los datos de la primera imagen y los datos de la segunda imagen respectivamente la primera y la segunda imagen capturada de la placa de cultivo que incluyen la pluralidad de discos de antibiótico, la primera y la segunda imagen tomadas en tiempos diferentes;

un procesador y una memoria, estando configurado el procesador para recibir los datos de la primera imagen y los datos de la segunda imagen y acceder a la memoria;

en el que el procesador está configurado para:

recibir datos de la primera y la segunda imagen de la placa de cultivo generados con un sensor de imagen, los datos de imagen en forma de píxeles, representando respectivamente los datos de la primera imagen y los datos de la segunda imagen la primera y la segunda imagen capturada de la placa de cultivo con una pluralidad de discos de antibiótico sobre la misma, la primera y la segunda imagen capturada tomadas en el primer y el segundo tiempo, en el que la placa de cultivo se incuba entre el primer y el segundo tiempo y en el que, opcionalmente, los datos de la primera imagen sirven como referencia previa al crecimiento; generar datos de características de los píxeles para los píxeles de datos de la primera y la segunda imagen a partir de una comparación de los datos de la primera imagen y los datos de la segunda imagen, comprendiendo los datos de características de los píxeles datos de contraste en el que, opcionalmente, los datos de contraste comprenden valores de intensidad de los píxeles; identificar píxeles asociados con por lo menos un disco de antibiótico en los datos de las imágenes; y

comparar los datos de la primera y la segunda imagen para identificar el crecimiento microbiano en la placa de cultivo ignorando los píxeles asociados con por lo menos un disco en los datos de las imágenes; e identificar una o más regiones de píxeles de los datos de la segunda imagen que difieren de una o más regiones de píxeles de los datos de la primera imagen en el que la una o más regiones de píxeles son contiguas a los discos de antibiótico;

evaluar el crecimiento microbiano en la medida en que se refiere a la distancia desde un borde del disco de antibiótico;

proporcionar información de contraste de píxeles a partir de la comparación de los datos de la primera y la segunda imagen para identificar el crecimiento microbiano en la placa de cultivo;

aplicar una transformación polar de la información de contraste, lo cual proporciona una porción de disco en una banda de luz con una primera intensidad, una banda sin crecimiento con una segunda intensidad y una región con crecimiento con una tercera intensidad en la que la tercera intensidad es menor que la primera intensidad y mayor que la segunda intensidad;

opcionalmente detectar un borde entre los píxeles en la banda sin crecimiento y la región con crecimiento;

determinar la distancia inhibidora mínima para por lo menos un disco de antibiótico en base a la distancia de la región con crecimiento desde por lo menos un disco de antibiótico.

generar los datos de las imágenes simuladas con una función del modelo de crecimiento, utilizando la función del modelo de crecimiento los datos del modelado de crecimiento, simulando los datos de las imágenes simuladas el crecimiento microbiano en la placa de cultivo en relación con por lo menos un disco de la pluralidad de discos de antibiótico; y

comparar los datos de las imágenes simuladas y los datos de características de los píxeles para identificar una o más regiones de píxeles de los datos de la segunda imagen que difieren de los datos de las imágenes simuladas.