ES2973856T3

ES2973856T3 - Anticuerpos neutralizantes de poliomavirus

Info

Publication number: ES2973856T3
Application number: ES16766397T
Authority: ES
Inventors: Johanna Abend; Zorica Dragic; Adam Lloyd Feire; Mark Knapp; Steven Kovacs; Elisabetta Traggiai; Lichun Wang; Yongqiang Wang; Danqing Wu; Qilong Wu; Fangmin Xu
Original assignee: Novartis AG
Current assignee: Novartis AG
Priority date: 2015-09-16
Filing date: 2016-09-08
Publication date: 2024-06-24
Anticipated expiration: 2036-09-08
Also published as: US20190071488A1; HUE065935T2; TW202200611A; EP4414385A2; UY36905A; PT3350218T; US12077571B2; EP4414385A3; JP2022002524A; US20220363735A1; WO2017046676A1; MX2022005253A; TWI789744B; US9862760B2; US20180079799A1; MX2018003282A; IL257541A; CN113929771A; TWI726911B; RS65441B1

Abstract

La presente invención se refiere a anticuerpos anti-VP1, fragmentos de anticuerpos y sus usos para la prevención y el tratamiento de la infección por el virus del polioma y enfermedades asociadas. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Anticuerpos neutralizantes de poliomavirus

Campo de la invención

La presente divulgación se dirige a anticuerpos anti-VP1, a fragmentos de anticuerpos y a sus usos para reducir la probabilidad o el tratamiento de una infección por el virus del polioma.

Antecedentes de la invención

De los poliomavirus humanos, el virus BK (BKV) y el virus JC (JCV) fueron los dos primeros identificados. Estos dos poliomavirus se aislaron de pacientes inmunodeprimidos y se publicaron en el mismo número de Lancet en 1971 (Gardner et al., Lancet 1971 1: 1253-1527 y Padgett et al., Lancet 1971 1:1257-1260). Los poliomavirus son virus de ADN bicatenario, icosaédricos y sin envoltura. Miden entre 40 y 45 nm de diámetro y están compuestos por un 88% de proteína y un 12% de ADN.

El genoma del BKV es un ADN circular bicatenario de aproximadamente 5 Kb de longitud y contiene tres divisiones principales: la región codificadora temprana, la región codificadora tardía y una región de control no codificante. La región codificadora temprana codifica las tres proteínas reguladoras (antígeno tumoral grande [TAg], antígeno tumoral pequeño [tAg] y antígeno tumoral truncado [truncTAg]), que son las primeras proteínas virales expresadas en una célula recién infectada y son responsables de facilitar la replicación del ADN viral y establecer un entorno celular favorable. La región codificadora tardía codifica las tres proteínas estructurales (VP1, VP2 y VP3) que forman la cápside viral, así como la agnoproteína, cuyo papel durante la replicación viral está menos definido. La región de control no codificante contiene el origen de replicación, así como los promotores tempranos y tardíos que impulsan la expresión de los productos genéticos virales.

El BKV se ha detectado en muchos tipos de células diferentes, incluidas las células epiteliales del riñón, la vejiga y el uréter (sitios típicos de persistencia), tejido amigdalino y linfocitos (sitios propuestos de infección primaria y diseminación) (Chatterjee et al., J. Med. Virol. 2000; 60:353-362, Goudsmit et al., J. Med. Virol. 1982; 10:91-99, Heritage et al., J. Med. Virol. 1981; 8:143-150, Shinohara et al., J. Med. Virol. 1993; 41(4):301-305). Los principales receptores de la superficie celular para BKV son los gangliósidos GT1 b, GD1b y GD3, todos los cuales tienen un ácido siálico con enlace a2,8 terminal y son bastante ubicuos, lo que permite la infección de varios tipos de células (Neu et al., PLos Patholog. 2013; 9(10): e1003714 y e1003688, véase también, O'Hara et al., Virus Res. 2014; 189:208-285). El virión icosaédrico sin envoltura de BKV está compuesto por tres proteínas virales diferentes: 360 copias de la proteína de la cápside viral principal VP1 dispuestas en 72 pentámeros y 72 copias combinadas de las proteínas de la cápside viral menor VP2 y VP3, con una molécula de VP2 o VP3 asociada con cada pentámero de Vp1. Solo VP1 está expuesta en la superficie del virión en el momento de la entrada y cada pentámero tiene cinco sitios de unión de baja afinidad para el receptor de gangliósidos. La unión de los pentámeros Vp1 a los receptores de gangliósidos en la superficie celular inicia la internalización a través de una vía endocítica mediada por caveolas, seguida del traslado del virus al retículo endoplásmico y finalmente al núcleo (Tsai y Qian, J. Virol 2010;84(19):9840-9852).

La infección con el poliomavirus BK humano (BKV) es esencialmente ubicua y se estima que entre el 80 y el 90% de la población mundial está infectada (Knowles W.A., Adv. Exp. Med. Biol. 2006;577:19-45). La infección primaria ocurre con mayor frecuencia durante la niñez (es decir, antes de los 10 años) y da lugar a una enfermedad leve, inespecífica y autolimitada o a ningún síntoma. Una infección persistente se establece en las células epiteliales de los túbulos renales, los uréteres y la vejiga y está controlada eficazmente por el sistema inmunológico. Una eliminación viral asintomática transitoria en la orina de adultos inmunocompetentes ocurre esporádicamente pero no produce enfermedad ni secuelas. Sin embargo, una función inmune comprometida, particularmente con inmunosupresión después de un trasplante renal o de células madre hematopoyéticas, puede conducir a una replicación incontrolada del BKV y, en última instancia, a una nefropatía asociada al BKV (BKVAN) o cistitis hemorrágica (CH), una enfermedad dolorosa de la vejiga. No existen terapias antivirales eficaces contra el BKV y el estándar de atención actual es la reducción de la inmunosupresión, lo que aumenta el riesgo de rechazo agudo. Incluso con los enfoques actuales más agresivos de seguimiento y prevención, hasta el 10% de los receptores de trasplantes renales desarrollarán BKVAN y entre el 15 y el 30% de esos pacientes sufrirán la pérdida del injerto debido a BKVAN. Entre aquellos que se someten a una reducción del régimen inmunosupresor tras la detección de una viremia por BKV, hasta el 30% experimentará un episodio de rechazo agudo como resultado.

Aunque el BKV se describió por primera vez en 1971(supra),no fue hasta la década de 1990 cuando la nefropatía asociada a BK (BKVAN) se describió en las publicaciones como causa de lesión en el trasplante de riñón (Purighalla et al., Am. J. Kidney Dis. 1995; 26:671-673 y Randhawa et al., Transplantation 1999; 67:103-109). En el tratamiento inicial de BKVAN, una prueba positiva para BK tenía consecuencias graves y más del 50% de los pacientes sufrían disfunción y pérdida del injerto (Hirsch et al., New Engl. J. Med. 2002; 347:488-496). Una reactivación del virus BK puede comenzar después del trasplante y se observa en aproximadamente el 30%-50% de los pacientes, 3 meses después del trasplante (Bressollette-Bodin et al., Am J. Transplant. 2005; 5(8):1926-1933 y Brennan et al., Am. J. Trasplant. 2004;4(12):2132-2134). La reactivación del virus BK se puede observar primero a través del virus y el ADN viral en la orina, luego en el plasma y finalmente en el riñón. (Brennan et al., Am. J. Trasplant. 2005;5(3):582-594 y Hirsch et al., N Eng. J. Med. 2002; 347(7):488-496). Alrededor del 80% de los pacientes con trasplante de riñón tienen virus BK en la orina (viruria de BK) y entre el 5 y el 10% de estos pacientes progresan a BKVAN (Binet et al., Transplantation 1999; 67(6):918-922 y Bressollette-Bodin et al., Am J. Transplant. 2005; 5(8):1926-1933). El BKV afecta a las células epiteliales tubulares renales causando necrosis y destrucción lítica con denudación de la membrana basal, lo que permite que el líquido tubular se acumule en el intersticio, lo que da lugar a una fibrosis intersticial y atrofia tubular (Nickeleit et al., J. Am. Soc. Neprol. 1999; 10(5):1080-1089), todo lo cual puede afectar al estado del trasplante. Los pacientes pueden presentar deterioro de la función renal, nefritis túbulo-intersticial y estenosis ureteral (Gamer et al., Lancet 1971; 1(7712):1253-1257 y Hirsch Am. J. Trasplant 2002; 2(1)25-30).

El BKV también puede causar neumonitis, retinitis y meningoencefalitis en hospedadores inmunocomprometidos (Reploeg et al., Clin. Infect. Dis. 2001;33(2):191-202). La enfermedad por BKV en receptores de trasplantes de células madre hematopoyéticas (TCMH) generalmente se manifiesta como cistitis hemorrágica (CH), que puede variar en gravedad. La viruria (pero no la viremia) y la hematuria dolorosa se asocian con la presentación clínica de la CH. El estándar actual de atención es de naturaleza de apoyo, involucrando principalmente una hidratación forzada/diuresis y medidas de control del dolor. Los casos más graves requieren transfusiones de sangre, evacuación de coágulos y, en algunos casos, pueden provocar la muerte. La CH por cualquier causa (por ejemplo, fármacos, radiación, virus) es relativamente común entre los receptores de TCMH, pero la CH asociada al BKV ocurre en aproximadamente el 10-12% de los pacientes, generalmente en los 6 meses posteriores al trasplante. Existen otras etiologías virales de la CH, siendo el adenovirus una causa más común de CH entre los receptores pediátricos de TCMH, en comparación con los receptores adultos de TCMH. El virus BK también se ha observado en otras enfermedades inmunocomprometidas como el lupus eritematoso sistémico, otros trasplantes de órganos sólidos y en pacientes con VIH/SIDA (Jiang et al., Virol. 2009; 384:266-273).

En este punto, el tratamiento de la nefropatía por BK asociada con el trasplante de órganos es la reducción de la inmunosupresión en un intento de prevenir la disfunción y la pérdida del injerto (Wiseman et al., Am. J. Kidney Dis.

2009; 54(1): 131-142 y Hirsch et al., Transplantation 2005; 79(1): 1277-1286). No existen regímenes clínicos fijos para la reducción, ya que la reducción de la inmunosupresión puede ayudar a prevenir la progresión desde viremia a daño extenso asociado con nefropatía clínica, pero esto también aumenta el riesgo de rechazo agudo de órganos (Brennan et al., Am. J. Trasplant 2005; 5(3):582-594). Los médicos han descrito el uso de terapias como cidofovir, leflunomida o quinolonas en combinación con la reducción de inmunosupresores; sin embargo, los informes encuentran que este enfoque es ineficaz, con la carga adicional de controlar los efectos secundarios adicionales (Randhawa y Brennan Am. J. Trasplant 2006; 6(9):2000-2005). Por ello, existe una necesidad útil e insatisfecha en el campo de las terapias que neutralicen los virus del polioma como el BK y que puedan usarse en un hospedador inmunocomprometido.

El virus JC también es un virus de polioma que también tiene una alta prevalencia en la población (80%), aunque el virus JC generalmente se adquiere más tarde que el virus BK (Padgett et al., J. Infect. Dis. 1973;127(4):467-470 y Sabath et al., J. Infect. Dis. 2002; 186 Supl. 2:5180-5186). Después de la infección inicial, el virus JC establece una latencia en los órganos linfoides y los riñones y, cuando se reactiva, invade el sistema nervioso central a través de los linfocitos B infectados. Una vez en el SNC, el virus JC causa leucoencefalopatía multifocal progresiva (LMP), que es un trastorno desmielinizante progresivo del sistema nervioso central. La LMP se presenta con mayor frecuencia como una infección oportunista en pacientes con VIH/SIDA y también se ha descrito en pacientes inmunodeprimidos (Angstrom et al., Brain 1958; 81(1 ):93-111 y García-Suárez et al., Am. J. Hematol. 2005; 80(4):271-281). Los pacientes con LMP presentan confusión, cambios en el estado mental, ataxia de la marcha, defectos neurológicos focales como hemiparesia, paresia de las extremidades y cambios visuales (Richardson EP, N. Eng. J. Med. 1961; 265:815-823). El pronóstico de los pacientes con LMP es malo y es especialmente malo en pacientes con VIH/SIDA (Antinori et al., J. Neurovirol. 2003;9 suplemento 1:47-53). Esto destaca aún más la necesidad insatisfecha y útil en el campo de las terapias que neutralicen los virus del polioma como el JC.

El documento WO2014/102399 y Parmjeet et al., J Gen Virol. 2009 90(3):634 a 639 describen anticuerpos que reconocen tanto VP1 de JCV como BKV, pero no describen la capacidad de esos anticuerpos para neutralizar la infección con los serotipos I-IV de BK y JCV.

Compendio de la invención

La presente divulgación se dirige a un anticuerpo, en donde dicho anticuerpo o fragmento del mismo que se une a antígeno comprende: una región variable de cadena pesada que comprende (a) una HCDR1 (Región Determinante<de Complementariedad, CDR por sus siglas en inglés) de SEQ ID NO: 6, (b) una HCDR2 de>S<e>Q<ID NO: 7, (c) una>HCDR3 de SEQ ID NO: 8 y una región variable de cadena ligera que comprende: (d) una LCDR1 de SEQ ID NO: 16, (e) una LCDR2 de SEQ ID NO: 17 y (f) una LCDR3 de SEQ ID NO: 18

El anticuerpo, en donde dicho anticuerpo o fragmento del mismo que se une a antígeno comprende:

(i) una región variable de cadena pesada (vH) que comprende SEQ ID NO: 12 y una región variable de cadena<ligera (vL) que comprende SEQ i>D<NO: 22;>

(ii) una región variable de cadena pesada (vH) que comprende SEQ ID NO: 32 y una región variable de cadena ligera (vL) que comprende SEQ ID NO: 42;

(iii) una región variable de cadena pesada (vH) que comprende SEQ ID NO: 52 y una región variable de cadena ligera (vL) que comprende SEQ ID NO: 62;

(iv) una región variable de cadena pesada (vH) que comprende SEQ ID NO: 72 y una región variable de cadena ligera (vL) que comprende SEQ ID NO: 82;

(v) una región variable de cadena pesada (vH) que comprende SEQ ID NO: 92 y una región variable de cadena ligera (vL) que comprende SEQ ID NO: 102;

(vi) una región variable de cadena pesada (vH) que comprende SEQ ID NO: 112 y una región variable de cadena ligera (vL) que comprende SEQ ID NO: 122.

El anticuerpo que conserva al menos un 95, 96, 97, 98 o 99% de identidad en la región ligera variable o pesada variable. El anticuerpo, en donde el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo quimérico, un anticuerpo humanizado, un anticuerpo de cadena sencilla (scFv) o un fragmento de anticuerpo.

El anticuerpo según cualquiera de las realizaciones precedentes, en donde el anticuerpo o un fragmento del mismo tiene glicosilación reducida o no tiene glicosilación o está hipofucosilado.

Una composición que comprende una pluralidad de un anticuerpo o un fragmento que se une a antígeno de cualquiera de las realizaciones precedentes, en donde al menos un 0,05%, 0,1%, 0,5%, 1%, 2%, 3%, 5% o más de los anticuerpos en la composición tiene un residuo de ácido siálico con enlace a2,3

Una composición que comprende una pluralidad de un anticuerpo o un fragmento que se une a antígeno de cualquiera de las realizaciones precedentes, en donde ninguno de los anticuerpos comprende GlcNAc bisectante.

El anticuerpo o un fragmento del mismo de cualquiera de las realizaciones precedentes para uso como medicamento. El anticuerpo o un fragmento del mismo o la composición farmacéutica, para uso en la neutralización de una infección por virus BK o JC.

El anticuerpo o un fragmento del mismo o la composición farmacéutica para uso en el tratamiento o reducción de la probabilidad de: nefropatía, BKVAN, cistitis hemorrágica (CH), leucoencefalopatía multifocal progresiva (LMP), neuronopatía de células granulares (NCG), enfermedad renal intersticial, estenosis ureteral, vasculitis, colitis, retinitis, meningitis y síndrome inflamatorio de reconstitución inmune (SIRI).

El uso del anticuerpo o un fragmento del mismo, administrado en combinación con otro agente terapéutico.

El uso del anticuerpo o un fragmento del mismo, en donde el agente terapéutico es un agente inmunosupresor. El uso del anticuerpo o un fragmento del mismo, en donde el agente inmunosupresor es un inhibidor de la monofosfato deshidrogenasa, un inhibidor de la síntesis de purinas, un inhibidor de la calcineurina o un inhibidor de mTOR. Un ácido nucleico que codifica el anticuerpo o un fragmento que se une a antígeno, según cualquiera de las realizaciones precedentes.

Un vector que comprende el ácido nucleico.

Una célula hospedadora que comprende el vector.

Un procedimiento para producir un anticuerpo o un fragmento que se une a antígeno que comprende cultivar la célula hospedadora y recuperar el anticuerpo desde el cultivo.

Un reactivo de diagnóstico que comprende el anticuerpo o un fragmento del mismo que se une a antígeno que está marcado.

El reactivo de diagnóstico, en donde el marcador se selecciona a partir del grupo que consiste en un radiomarcador, un fluoróforo, un cromóforo, un agente de formación de imágenes y un ion metálico.

Cualquier referencia a métodos de tratamiento en los párrafos siguientes de esta descripción debe interpretarse como referencia a compuestos, composiciones farmacéuticas y medicamentos de la presente invención para uso en un método para el tratamiento del cuerpo humano o animal mediante terapia o para diagnóstico.

Definiciones

A menos que se indique lo contrario, los siguientes términos y expresiones utilizados en este documento tienen los siguientes significados:

El término "anticuerpo", tal como se utiliza en el presente documento, se refiere a un polipéptido de la familia de las inmunoglobulinas que es capaz de unirse a un antígeno correspondiente de forma no covalente, reversible y de una manera específica. Por ejemplo, un anticuerpo IgG de origen natural es un tetrámero que comprende al menos dos regiones pesadas que comprenden: (d) una LCDR1 de SEQ ID NO: 216, (e) una LCDR2 de S<e>Q ID NO: 217 y (f) una LCDR3 de SEQ ID NO: 218;

(xii) una región variable de cadena pesada que comprende: (a) una HCDR1 de SEQ ID NO: 226, (b) una HCDR2 de SEQ ID NO: 227, (c) una HCDR3 de Se Q ID NO: 228; y una región variable de cadena ligera que comprende: (d) una LCDR1 de SEQ ID NO: 236, (e) una LCDR2 de SEQ ID NO: 237 y (f) una LCDR3 de SEQ ID NO: 238;

(xiii) una región variable de cadena pesada que comprende: (a) una HCDR1 de SEQ ID NO: 246, (b) una HCDR2 de SEQ ID NO: 247, (c) una HCDR3 de SEQ ID NO: 248; y una región variable de cadena ligera que comprende: (d) una LCDR1 de SEQ ID NO: 256, (e) una LCDR2 de SEQ ID NO: 257 y (f) una LCDR3 de SEQ ID NO: 258;

(xiv) una región variable de cadena pesada que comprende: (a) una HCDR1 de SEQ ID NO: 266, (b) una HCDR2 de Se Q ID NO: 267, (c) una HCDR3 de SEQ ID NO: 268; y una región variable de cadena ligera que comprende: (d) una LCDR1 de SEQ ID NO: 276, (e) una LCDR2 de SEQ ID NO: 277 y (f) una LCDR3 de SEQ ID NO: 278;

(xv) una región variable de cadena pesada que comprende: (a) una HCDR1 de SEQ ID NO: 286, (b) una HCDR2 de SEQ ID NO: 287, (c) una HCDR3 de Se Q ID NO: 288; y una región variable de cadena ligera que comprende: (d) una LCDR1 de SEQ ID NO: 296, (e) una LCDR2 de SEQ ID NO: 297 y (f) una LCDR3 de SEQ ID NO: 298;

(xvi) una región variable de cadena pesada que comprende: (a) una HCDR1 de SEQ ID NO: 306, (b) una HCDR2 de Se Q ID NO: 307, (c) una HCDR3 de SEQ ID NO: 308; y una región variable de cadena ligera que comprende: (d) una LCDR1 de SEQ ID NO: 314, (e) una LCDR2 de SEQ ID NO: 315 y (f) una LCDR3 de SEQ ID NO: 316;

(xvii) una región variable de cadena pesada que comprende: (a) una HCDR1 de SEQ ID NO: 322, (b) una HCDR2 de SEQ ID NO: 323, (c) una HCDR3 de SEQ ID NO: 324; y una región variable de cadena ligera que comprende: (d) una LCDR1 de SEQ ID NO: 332, (e) una LCDR2 de SEQ ID NO: 333 y (f) una LCDR3 de SEQ ID NO: 334;

(xviii) una región variable de cadena pesada que comprende: (a) una HCDR1 de SEQ ID NO: 342, (b) una HCDR2 de SEQ ID NO: 343, (c) una HCDR3 de SEQ ID NO: 344; y una región variable de cadena ligera que comprende: (d) una LCDR1 de SEQ ID NO: 349, (e) una LCDR2 de SEQ ID NO: 350 y (f) una LCDR3 de SEQ ID NO: 351;

(xix) una región variable de cadena pesada que comprende: (a) una HCDR1 de SEQ ID NO: 356, (b) una HCDR2 de SEQ ID NO: 357, (c) una HCDR3 de SEQ ID NO: 358; y una región variable de cadena ligera que comprende: (d) una LCDR1 de SEQ ID NO: 363, (e) una LCDR2 de SEQ ID NO: 364 y (f) una LCDR3 de SEQ ID NO: 365;

(xx) una región variable de cadena pesada que comprende: (a) una HCDR1 de SEQ ID NO: 370, (b) una HCDR2 de SEQ ID NO: 371, (c) una HCDR3 de Se Q ID NO: 372; y una región variable de cadena ligera que comprende: (d) una LCDR1 de SEQ ID NO: 377, (e) una LCDR2 de SEQ ID NO: 378 y (f) una LCDR3 de SEQ ID NO: 379;

(xxi) una región variable de cadena pesada que comprende: (a) una HCDR1 de SEQ ID NO: 384, (b) una HCDR2 de SEQ ID NO: 385, (c) una HCDR3 de SEQ ID NO: 386; y una región variable de cadena ligera que comprende: (d) una LCDR1 de SEQ ID NO: 391, (e) una LCDR2 de SEQ ID NO: 392 y (f) una LCDR3 de SEQ ID NO: 393;

(xxii) una región variable de cadena pesada que comprende: (a) una HCDR1 de SEQ ID NO: 398, (b) una HCDR2 de SEQ ID NO: 399, (c) una HCDR3 de SEQ ID NO: 400; y una región variable de cadena ligera que comprende: (d) una LCDR1 de SEQ ID NO: 405, (e) una LCDR2 de SEQ ID NO: 406 y (f) una LCDR3 de SEQ ID NO: 407;

(xxiii) una región variable de cadena pesada que comprende: (a) una HCDR1 de SEQ ID NO: 412, (b) una HCDR2 de SEQ ID NO: 413, (c) una HCDR3 de SEQ ID NO: 414; y una región variable de cadena ligera que comprende: (d) una LCDR1 de SEQ ID NO: 419, (e) una LCDR2 de SEQ ID NO: 420 y (f) una LCDR3 de SEQ ID NO: 421;

(xxiv) una región variable de cadena pesada que comprende: (a) una HCDR1 de SEQ ID NO: 426, (b) una HCDR2 de SEQ ID NO: 427, (c) una HCDR3 de SEQ ID NO: 428; y una región variable de cadena ligera que comprende: (d) una LCDR1 de SEQ ID NO: 433, (e) una LCDR2 de SEQ ID NO: 434 y (f) una LCDR3 de SEQ ID NO: 435;

(xxv) una región variable de cadena pesada que comprende: (a) una HCDR1 de SEQ ID NO: 440, (b) una HCDR2 de SEQ ID NO: 441, (c) una HCDR3 de SEQ ID NO: 442; y una región variable de cadena ligera que comprende: (d) una LCDR1 de SEQ ID NO: 447, (e) una LCDR2 de SEQ ID NO: 448 y (f) una LCDR3 de SEQ ID NO: 449;

(xxvi) una región variable de cadena pesada que comprende: (a) una HCDR1 de SEQ ID NO: 454, (b) una HCDR2 de SEQ ID NO: 455, (c) una HCDR3 de SEQ ID NO: 456; y una región variable de cadena ligera que comprende: (d) una LCDR1 de SEQ ID NO: 461, (e) una LCDR2 de SEQ ID NO: 462 y (f) una LCDR3 de SEQ ID NO: 463;

(xxvii) una región variable de cadena pesada que comprende: (a) una HCDR1 de SEQ ID NO: 468, (b) una HCDR2 de SEQ ID NO: 469, (c) una HCDR3 de SEQ ID NO: 470; y una región variable de cadena ligera que comprende: (d) una LCDR1 de SEQ ID NO: 475, (e) una LCDR2 de SEQ ID NO: 476 y (f) una LCDR3 de SEQ ID NO: 477;

(xxviii) una región variable de cadena pesada que comprende: (a) una HCDR1 de SEQ ID NO: 482, (b) una HCDR2 de SEQ ID NO: 483, (c) una HCDR3 de SEQD NO: 484; y una región variable de cadena ligera que comprende: (d) una LCDR1 de SEQ ID NO: 489, (e) una LCDR2 de SEQ ID NO: 490 y (f) una LCDR3 de SEQ ID NO: 491.

Un anticuerpo, en donde dicho anticuerpo o un fragmento del mismo que se une a antígeno comprende:

(i) una región variable de cadena pesada que comprende (a) una HCDR1 (CDR-Región Determinante de Complementariedad) de SEQ ID NO: 508, (b) una HCDR2 de SEQ ID NO: 509, (c) una HCDR3 de SEQ ID NO: 510 y una región variable de cadena ligera que comprende: (d) una LCDR1 de SEQ ID NO: 511, (e) una LCDR2 de SEQ ID NO: 512 y (f) una LCDR3 de SEQ ID NO: 513;

(ii) una región variable de cadena pesada que comprende (a) una HCDR1 de SEQ ID NO: 514, (b) una HCDR2 de SEQ ID NO: 515, (c) una HCDR3 de SEQ ID NO: 516; y una región variable de cadena ligera que comprende: (d) una LCDR1 de SEQ ID NO: 517, (e) una LCDR2 de SEQ ID NO: 518 y (f) una LCDR3 de SEQ ID NO: 519;

(iii) una región variable de cadena pesada que comprende (a) una HCDR1 de SEQ ID NO: 520, (b) una HCDR2 de SEQ ID NO: 521, (c) una HCDR3 de Se Q ID NO: 522; y una región variable de cadena ligera que comprende: (d) una LCDR1 de SEQ ID NO: 523, (e) una LCDR2 de SEQ ID NO: 524 y (f) una LCDR3 de SEQ ID NO: 525;

(iv) una región variable de cadena pesada que comprende: (a) una HCDR1 de SEQ ID NO: 526, (b) una HCDR2 de SEQ ID NO: 527, (c) una HCDR3 de SEQ ID NO: 528; y una región variable de cadena ligera que comprende: (d) una LCDR1 de SEQ ID NO: 529, (e) una LCDR2 de SEQ ID NO: 530 y (f) una LCDR3 de SEQ ID NO: 531;

(v) una región variable de cadena pesada que comprende: (a) una HCDR1 de SEQ ID NO: 532, (b) una HCDR2 de SEQ ID NO: 533, (c) una HCDR3 de SEQ ID NO: 534; y una región variable de cadena ligera que comprende: (d) una LCDR1 de SEQ ID NO: 535, (e) una LCDR2 de SEQ ID NO: 536 y (f) una LCDR3 de SEQ ID NO: 537;

(vi) una región variable de cadena pesada que comprende: (a) una HCDR1 de SEQ ID NO: 538, (b) una HCDR2 de SEQ ID NO: 539, (c) una HCDR3 de SEQ ID NO: 540; y una región variable de cadena ligera que comprende: (d) una LCDR1 de SEQ ID NO: 541, (e) una LCDR2 de SEQ ID NO: 542 y (f) una LCDR3 de SEQ ID NO: 543.

El anticuerpo, en donde al menos un aminoácido dentro de una CDR está sustituido por un residuo correspondiente de una CDR correspondiente de otro anticuerpo anti-VP1 de la Tabla 2.

El anticuerpo, en donde uno o dos aminoácidos dentro de una CDR se han modificado, eliminado o sustituido.

El anticuerpo que conserva al menos un 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 o 99% de identidad de la región de cadena pesada variable o la región de cadena ligera variable.

El anticuerpo que comprende las modificaciones de la Tabla 3.

El anticuerpo, en donde el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo quimérico, un anticuerpo humanizado, un anticuerpo diseñado de forma humana, un anticuerpo humano, un anticuerpo de cadena sencilla (scFv) o un fragmento de anticuerpo.

(i) una región variable de cadena pesada (vH) que comprende SEQ ID NO: 12 y una región variable de cadena ligera (vL) que comprende SEQ ID NO: 22;

(vi) una región variable de cadena pesada (vH) que comprende SEQ ID NO: 112 y una región variable de cadena ligera (vL) que comprende SEQ ID NO: 122;

(vii) una región variable de cadena pesada (vH) que comprende SEQ ID NO: 132 y una región variable de cadena ligera (vL) que comprende SEQ ID NO: 142;

(viii) una región variable de cadena pesada (vH) que comprende SEQ ID NO: 152 y una región variable de cadena ligera (vL) que comprende SEQ ID NO: 162;

(ix) una región variable de cadena pesada (vH) que comprende SEQ ID NO: 172 y una región variable de cadena ligera (vL) que comprende SEQ ID NO: 182;

(x) una región variable de cadena pesada (vH) que comprende SEQ ID NO: 192 y una región variable de cadena ligera (vL) que comprende SEQD NO: 202;

(xi) una región variable de cadena pesada (vH) que comprende SEQ ID NO: 212 y una región variable de cadena ligera (vL) que comprende SEQ ID NO: 222;

(xii) una región variable de cadena pesada (vH) que comprende SEQ ID NO: 232 y una región variable de cadena ligera (vL) que comprende SEQ ID NO: 242;

(xiii) una región variable de cadena pesada (vH) que comprende SEQ ID NO: 252 y una región variable de cadena ligera (vL) que comprende SEQ ID NO: 262;

(xiv) una región variable de cadena pesada (vH) que comprende SEQ ID NO: 272 y una región variable de cadena ligera (vL) que comprende SEQ ID NO: 282;

(xv) una región variable de cadena pesada (vH) que comprende SEQ ID NO: 292 y una región variable de cadena ligera (vL) que comprende SEQ ID NO: 302;

(xvi) una región variable de cadena pesada (vH) que comprende SEQ ID NO: 312 y una región variable de cadena ligera (vL) que comprende SEQ ID NO: 320;

(xvii) una región variable de cadena pesada (vH) que comprende SEQ ID NO: 328 y una región variable de cadena ligera (vL) que comprende SEQ ID NO: 338;

(xviii) una región variable de cadena pesada (vH) que comprende SEQ ID NO: 348 y una región variable de cadena ligera (vL) que comprende SEQ ID NO: 355;

(xix) una región variable de cadena pesada (vH) que comprende SEQ ID NO: 362 y una región variable de cadena ligera (vL) que comprende SEQ ID NO: 369;

(xx) una región variable de cadena pesada (vH) que comprende SEQ ID NO: 376 y una región variable de cadena ligera (vL) que comprende SEQ ID NO: 383;

(xxi) una región variable de cadena pesada (vH) que comprende SEQ ID NO: 390 y una región variable de cadena ligera (vL) que comprende SEQ ID NO: 397;

(xxii) una región variable de cadena pesada (vH) que comprende SEQ ID NO: 404 y una región variable de cadena ligera (vL) que comprende SEQ ID NO: 411;

(xxiii) una región variable de cadena pesada (vH) que comprende SEQ ID NO: 418 y una región variable de cadena ligera (vL) que comprende SEQ ID NO: 425;

(xxiv) una región variable de cadena pesada (vH) que comprende SEQ ID NO: 432 y una región variable de cadena ligera (vL) que comprende SEQ ID NO: 439;

(xxv) una región variable de cadena pesada (vH) que comprende SEQ ID NO: 446 y una región variable de cadena ligera (vL) que comprende SEQ ID NO: 453;

(xxvi) una región variable de cadena pesada (vH) que comprende SEQ ID NO: 460 y una región variable de cadena ligera (vL) que comprende SEQ ID NO: 467;

(xxvii) una región variable de cadena pesada (vH) que comprende SEQ ID NO: 474 y una región variable de cadena ligera (vL) que comprende SEQ ID NO: 481; o

(xxviii) una región variable de cadena pesada (vH) que comprende SEQ ID NO: 488 y una región variable de cadena ligera (vL) que comprende SEQ ID NO: 495.

El anticuerpo que conserva al menos un 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 o 99% de identidad en la región ligera variable o pesada variable.

El anticuerpo, en donde uno, dos, tres, cuatro o cinco, pero menos de 10 aminoácidos dentro de la región ligera variable o pesada variable se han modificado, eliminado o sustituido.

El anticuerpo según cualquiera de las realizaciones precedentes, en donde el anticuerpo o un fragmento del mismo tiene ua glicosilación reducida o no tiene glicosilación o está hipofucosilado.

Una composición que comprende una pluralidad de un anticuerpo o un fragmento que se une a antígeno según cualquiera de las realizaciones precedentes, en donde al menos un 0,05%, 0,1%, 0,5%, 1%, 2%, 3%, 5% o más de los anticuerpos en la composición tiene un residuo de ácido siálico con enlace a2,3 y en donde dicho anticuerpo o fragmento del mismo que se une a antígeno comprende:

(i) una región variable de cadena pesada que comprende (a) una HCDR1 (Región Determinante de Complementariedad de CDR) de SEQ ID NO: 6, (b) una HCDR2 de SEQ ID NO: 7, (c) una HCDR3 de SEQ ID NO: 8 y una región variable de cadena ligera que comprende: (d) una LCDR1 de SEQ ID NO: 16, (e) una LCDR2 de SEQ ID NO: 17 y (f) una LCDR3 de SEQ ID NO: 18;

(ii) una región variable de cadena pesada que comprende (a) una HCDR1 de SEQ ID NO: 26, (b) una HCDR2 de SEQ ID NO: 27, (c) una HCDR3 de SEQ ID NO: 28; y una región variable de cadena ligera que comprende: (d) una LCDR1 de SEQ ID NO: 36, (e) una LCDR2 de SEQ ID NO: 37 y (f) una LCDR3 de SEQ ID NO: 38;

(iii) una región variable de cadena pesada que comprende (a) una HCDR1 de SEQ ID NO: 46, (b) una HCDR2 de SEQ ID NO: 47, (c) una HCDR3 de SEQ ID NO: 48; y una región variable de cadena ligera que comprende: (d) una LCDR1 de SEQ ID NO: 56, (e) una LCDR2 de SEQ ID NO: 57 y (f) una LCDR3 de SEQ ID NO: 58;

(iv) una región variable de cadena pesada que comprende: (a) una HCDR1 de SEQ ID NO: 66, (b) una HCDR2 de SEQ ID NO: 67, (c) una HCDR3 de SEQ ID NO: 68; y una región variable de cadena ligera que comprende: (d) una LCDR1 de SEQ ID NO: 76, (e) una LCDR2 de SEQ ID NO: 77 y (f) una LCDR3 de SEQ ID NO: 78;

(v) una región variable de cadena pesada que comprende: (a) una HCDR1 de SEQ ID NO: 86, (b) una HCDR2 de SEQ ID NO: 87, (c) una HCDR3 de SEQ ID NO: 88; y una región variable de cadena ligera que comprende: (d) una LCDR1 de SEQ ID NO: 96, (e) una LCDR2 de SEQ ID NO: 97 y (f) una LCDR3 de SEQ ID NO: 98;

(vi) una región variable de cadena pesada que comprende: (a) una HCDR1 de SEQ ID NO: 106, (b) una HCDR2 de SEQ ID NO: 107, (c) una HCDR3 de Se Q ID NO: 108; y una región variable de cadena ligera que comprende: (d) una LCDR1 de SEQ ID NO: 116, (e) una LCDR2 de SEQ ID NO: 117 y (f) una LCDR3 de SEQ ID NO: 118;

(vii) una región variable de cadena pesada que comprende: (a) una HCDR1 de SEQ ID NO: 126, (b) una HCDR2 de SEQ ID NO: 127, (c) una HCDR3 de Se Q ID NO: 128; y una región variable de cadena ligera que comprende: (d) una LCDR1 de SEQ ID NO: 136, (e) una LCDR2 de SEQ ID NO: 137 y (f) una LCDR3 de SEQ ID NO: 138;

(viii) una región variable de cadena pesada que comprende: (a) una HCDR1 de SEQ ID NO: 146, (b) una HCDR2 de SEQ ID NO: 147, (c) una HCDR3 de SEQ ID NO: 148; y una región variable de cadena ligera que comprende: (d) una LCDR1 de SEQ ID NO: 156, (e) una LCDR2 de SEQ ID NO: 157 y (f) una LCDR3 de SEQ ID NO: 158;

(ix) una región variable de cadena pesada que comprende: (a) una HCDR1 de SEQ ID NO: 166, (b) una HCDR2 de SEQ ID NO: 167, (c) una HCDR3 de Se Q ID NO: 168; y una región variable de cadena ligera que comprende: (d) una LCDR1 de SEQ ID NO: 176, (e) una LCDR2 de SEQ ID NO: 177 y (f) una LCDR3 de SEQ ID NO: 178;

(x) una región variable de cadena pesada que comprende: (a) una HCDR1 de SEQ ID NO: 186, (b) una HCDR2 de SEQ ID NO: 187, (c) una HCDR3 de SEQ ID NO: 188; y una región variable de cadena ligera que comprende: (d) una LCDR1 de SEQ ID NO: 196, (e) una LCDR2 de SEQ ID NO: 197 y (f) una LCDR3 de SEQ ID NO: 198;

(xi) una región variable de cadena pesada que comprende: (a) una HCDR1 de SEQ ID NO: 206, (b) una HCDR2 de SEQ ID NO: 207, (c) una HCDR3 de Se Q ID NO: 208; y una región variable de cadena ligera que comprende: (d) una LCDR1 de SEQ ID NO: 216, (e) una LCDR2 de SEQ ID NO: 217 y (f) una LCDR3 de SEQ ID NO: 218;

(xv) una región variable de cadena pesada que comprende: (a) una HCDR1 de SEQ ID NO: 286, (b) una HCDR2 de SEQ ID NO: 287, (c) una HCDR3 de S<e>Q ID NO: 288; y una región variable de cadena ligera que comprende: (d) una LCDR1 de SEQ ID NO: 296, (e) una LCDR2 de SEQ ID NO: 297 y (f) una LCDR3 de SEQ ID NO: 298;

(xvi) una región variable de cadena pesada que comprende: (a) una HCDR1 de SEQ ID NO: 306, (b) una HCDR2 de S<e>Q ID NO: 307, (c) una HCDR3 de SEQ ID NO: 308; y una región variable de cadena ligera que comprende: (d) una LCDR1 de SEQ ID NO: 314, (e) una LCDR2 de SEQ ID NO: 315 y (f) una LCDR3 de SEQ ID NO: 316;

(xxviii) una región variable de cadena pesada que comprende: (a) una HCDR1 de SEQ ID NO: 482, (b) una HCDR2 de SEQ ID NO: 483, (c) una HCDR3 de SEQ iD NO: 484; y una región variable de cadena ligera que comprende: (d) una LCDR1 de SEQ ID NO: 489, (e) una LCDR2 de SEQ ID NO: 490 y (f) una LCDR3 de SEQ ID NO: 491.

Una composición que comprende una pluralidad de un anticuerpo o un fragmento que se une a antígeno de cualquiera de las realizaciones precedentes, en donde ninguno de los anticuerpos comprende una GlcNAc bisectante.

Una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo o un fragmento del mismo, según cualquiera de las realizaciones precedentes, en donde la composición se prepara como un liofilizado.

Una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo o un fragmento del mismo según cualquiera de las realizaciones precedentes y un vehículo farmacéuticamente aceptable. En una realización, el vehículo es un tampón de histidina. En una realización, la composición farmacéutica comprende un azúcar (por ejemplo, sacarosa).

Un método para neutralizar una infección por el virus BK o el virus JC que comprende administrar mediante inyección o infusión a un paciente que lo necesita una cantidad eficaz del anticuerpo o la composición farmacéutica. El método, en donde el anticuerpo o un fragmento del mismo que se une a antígeno, neutraliza el serotipo I de BKV y el serotipo II de BKV. En otra realización, el anticuerpo o un fragmento del mismo que se une a antígeno neutraliza el serotipo I de BKV y el serotipo III de BKV. En otra realización, el anticuerpo o un fragmento del mismo que se une a antígeno neutraliza el serotipo I de BKV y el serotipo IV de BKV. En otra realización, el anticuerpo o un fragmento del mismo que se une a antígeno neutraliza el serotipo II de BKV y el serotipo III de BKV. En otra realización, el anticuerpo o un fragmento del mismo que se une a antígeno neutraliza el serotipo II de BKV y el serotipo IV de BKV. En otra realización, el anticuerpo o un fragmento del mismo que se une a antígeno neutraliza el serotipo I de BKV y VJC. En una realización específica, el anticuerpo o un fragmento del mismo que se une a antígeno neutraliza los serotipos I, II, III y IV de BKV. Además, el anticuerpo o un fragmento del mismo que se une a antígeno neutraliza los serotipos I, II, III y IV de BKV y JCV. En una realización preferida, los anticuerpos anti-VP1 neutralizaban la infección con los cuatro serotipos de BKV (I-IV); esos anticuerpos anti-VP1 incluyen específicamente P8D11, las modificaciones de P8D11 y EBB-C1975-B5.

Un método para tratar o reducir la probabilidad de un trastorno asociado al virus BK o al virus JC, que comprende administrar mediante inyección o infusión a un paciente que lo necesita una cantidad eficaz del anticuerpo o la composición farmacéutica y en donde el trastorno es: nefropatía, BKVAN, cistitis hemorrágica (CH), leucoencefalopatía multifocal progresiva (LMP), neuronopatía de células granulares (NCG), enfermedad renal intersticial, estenosis ureteral, vasculitis, colitis, retinitis, meningitis y síndrome inflamatorio de reconstitución inmune (SIRI).

El método, en donde el anticuerpo o la composición se reconstituye antes de la inyección o infusión.

El método, en donde el anticuerpo o la composición farmacéutica se administra en combinación con otro agente terapéutico.

El método, en donde el agente terapéutico es un agente inmunosupresor.

El método, en donde el agente inmunosupresor es un inhibidor de la monofosfato deshidrogenasa, un inhibidor de la síntesis de purinas, un inhibidor de la calcineurina o un inhibidor de mTOR.

El método, en donde el agente inmunosupresor es micofenolato de mofetilo (MMF), micofenolato de sodio, azatioprina, tacrolimús, sirolimús o ciclosporina.

El método, en donde el agente terapéutico es un anticuerpo anti-VP1 adicional.

El anticuerpo o un fragmento del mismo según de cualquiera de las realizaciones precedentes para uso como medicamento.

El anticuerpo o un fragmento del mismo o la composición farmacéutica, para uso en la neutralización de una infección por virus BK o JC.

El anticuerpo o un fragmento del mismo o la composición farmacéutica, para uso en el tratamiento o reducción de la probabilidad de: nefropatía, BKVAN, cistitis hemorrágica (CH), leucoencefalopatía multifocal progresiva (LMP), neuronopatía de células granulares (NCG), enfermedad renal intersticial, estenosis ureteral, vasculitis, colitis, retinitis, meningitis y síndrome inflamatorio de reconstitución inmune (SIRI).

El uso del anticuerpo o un fragmento del mismo, en donde el agente terapéutico es un agente inmunosupresor.

El uso del anticuerpo o un fragmento del mismo, en donde el agente inmunosupresor es un inhibidor de la monofosfato deshidrogenasa, un inhibidor de la síntesis de purinas, un inhibidor de la calcineurina o un inhibidor de mTOR.

El uso del anticuerpo o fragmento del mismo, en donde el agente inmunosupresor es: micofenolato de mofetilo (MMF), micofenolato de sodio, azatioprina, tacrolimús, sirolimús o ciclosporina.

Un ácido nucleico que codifica el anticuerpo o un fragmento que se une a antígeno según cualquiera de las realizaciones precedentes.

Un vector que comprende el ácido nucleico.

Una célula hospedadora que comprende el vector.

El reactivo de diagnóstico en donde el marcador se selecciona a partir del grupo que consiste en un radiomarcador, un fluoróforo, un cromóforo, un agente de formación de imágenes y un ion metálico.

Definiciones

El término "anticuerpo", tal como se utiliza en el presente documento, se refiere a un polipéptido de la familia de las inmunoglobulinas que es capaz de unirse a un antígeno correspondiente de forma no covalente, reversible y de una manera específica. Por ejemplo, un anticuerpo IgG de origen natural es un tetrámero que comprende al menos dos cadenas pesadas (H) y dos cadenas ligeras (L) interconectadas por enlaces disulfuro. Cada cadena pesada está compuesta por una región variable de cadena pesada (abreviada en el presente documento como VH) y una región constante de cadena pesada. La región constante de cadena pesada se compone de tres dominios, CH1, CH2 y CH3. Cada cadena ligera está compuesta por una región variable de cadena ligera (abreviada en el presente documento como VL) y una región constante de cadena ligera. La región constante de cadena ligera está compuesta por un<dominio c>L.<Las regiones VH y VL se pueden subdividir en regiones de hipervariabilidad, denominadas regiones>determinantes de complementariedad (CDR), intercaladas con regiones que están más conservadas, denominadas regiones estructurales (FR). Cada VH y VL está compuesta por tres CDRs y cuatro FRs dispuestas desde el extremo amino terminal al extremo carboxilo terminal en el siguiente orden: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 y FR4. Las regiones variables de las cadenas pesada y ligera contienen un dominio de unión que interacciona con un antígeno. Las regiones constantes de los anticuerpos pueden mediar en la unión de la inmunoglobulina a tejidos o factores de un hospedador, incluidas varias células del sistema inmunológico (p. ej., células efectoras) y el primer componente (Clq) del sistema de complemento clásico.

El término "anticuerpo" incluye, pero no se limita a, anticuerpos monoclonales, anticuerpos humanos, anticuerpos humanizados, anticuerpos de camélido, anticuerpos quiméricos y anticuerpos antiidiotípicos (anti-Id) (incluidos, por ejemplo, anticuerpos anti-Id contra anticuerpos de la presente divulgación). Los anticuerpos pueden ser de cualquier isotipo/clase (por ejemplo, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA e IgY) o subclase (por ejemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 e IgA2).

"Dominios determinantes de la complementariedad" o "regiones determinantes de la complementariedad ("CDRs") se refieren indistintamente a las regiones hipervariables de VL y VH. Las CDRs son el sitio de unión a la proteína diana de las cadenas de anticuerpos que tiene especificidad hacia esa proteína diana. Hay tres CDRs (CDR1-3, numeradas secuencialmente desde el extremo N-terminal) en cada VL o VH humana, que constituyen aproximadamente el 15-20% de los dominios variables. Se puede hacer referencia a las CDRs por su región y orden. Por ejemplo, "VHCDR1" o "HCDR1" se refieren ambas a la primera CDR de la región variable de la cadena pesada. Las CDRs son estructuralmente complementarias al epítopo de la proteína diana y, por lo tanto, son directamente responsables de la especificidad de la unión. Los tramos restantes de VL o VH, las llamadas regiones estructurales, exhiben menos variación en la secuencia de aminoácidos (Kuby, Immunology, 4a ed., capítulo 4. W.H. Freeman & Co., Nueva York, 2000).

Las posiciones de las CDRs y las regiones estructurales se pueden determinar usando diversas definiciones bien conocidas en la técnica, p. ej., Kabat, Chothia y AbM (véase, p. ej., Johnson et al., Nucleic Acids Res., 29:205-206 (2001); Chothia y Lesk, J. Mol. Biol., 196:901-917 (1987); Chothia et al., Nature, 342:877-883 (1989); Chothia et al., J. Mol. Biol., 227:799-817 (1992); Al-Lazikani et al., J. Mol. Biol., 273:927-748 (1997)). Las definiciones de sitios de combinación de antígenos también se describen a continuación: Ruiz et al., Nucleic Acids Res., 28:219-221 (2000); y Lefranc, MP, Nucleic Acids Res., 29:207-209 (2001); MacCallum et al., J. Mol. Biol., 262:732-745 (1996); y Martin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86:9268-9272 (1989); Martin et al., Methods Enzymol., 203:121-153 (1991); y Rees et al., en Sternberg M.J.E. (ed.), Protein Structure Prediction, Oxford University Press, Oxford, 141-172 (1996). En un esquema de numeración combinado de Kabat y Chothia, en algunas realizaciones, las CDRs corresponden a los residuos de aminoácidos que forman parte de una CDR de Kabat, una CDR de Chothia o ambas. Por ejemplo, en algunas realizaciones, las CDRs corresponden a los residuos de aminoácidos 26-35 (HC CDR1), 50-65 (HC CDR2) y 95-102 (HC CDR3) en una VH, por ejemplo, una VH de mamífero, por ejemplo, una VH humana; y los residuos de<aminoácidos 24-34 (LC CDR1), 50-56>(<l>C<CDR2) y 89-97 (LC>CD<r>3)<en una VL, por ejemplo, una VL de mamífero,>por ejemplo, una VL humana.

Tanto las cadenas ligeras como las pesadas se dividen en regiones de homología estructural y funcional. Los términos "constante" y "variable" se utilizan funcionalmente. A este respecto, se apreciará que los dominios variables de las porciones de la cadena ligera (VL) y pesada (VH) determinan el reconocimiento y la especificidad del antígeno. Por el contrario, los dominios constantes de la cadena ligera (CL) y la cadena pesada (CH1, CH2 o CH3) confieren propiedades biológicas importantes, tales como secreción, movilidad transplacentaria, unión al receptor de Fc, unión al complemento y similares. Por convención, la numeración de los dominios de la región constante se incrementa a medida que se vuelven más distales del sitio de unión al antígeno o del extremo amino-terminal del anticuerpo. El extremo N-terminal es una región variable y el extremo C-terminal es una región constante; los dominios CH3 y CL en realidad comprenden los dominios carboxi-terminales de la cadena pesada y ligera, respectivamente.

La expresión "fragmento que se une a antígeno", tal como se usa en el presente documento, se refiere a una o más porciones de un anticuerpo que conservan la capacidad de interaccionar específicamente (por ejemplo, mediante unión, impedimento estérico, estabilización/desestabilización, distribución espacial) con un epítopo de un antígeno. Ejemplos de fragmentos de unión incluyen, entre otros, Fvs monocatenarios (scFv), Fvs unidos por puentes disulfuro (sdFv), fragmentos Fab, fragmentos F(ab'), un fragmento monovalente que consiste en los dominios VL, VH, CL y CH1; un fragmento F(ab)2, un fragmento bivalente que comprende dos fragmentos Fab unidos por un puente disulfuro en la región bisagra; un fragmento Fd que consiste en los dominios VH y CH1; un fragmento Fv que consiste en los dominios VL y VH de un solo brazo de un anticuerpo; un fragmento dAb (Ward et al., Nature 341:544-546, 1989), que consiste en un dominio VH; y una región determinante de complementariedad (CDR) aislada, u otros fragmentos que se unen a un epítopo de un anticuerpo.

Además, aunque los dos dominios del fragmento Fv, VL y VH, están codificados por genes distintos, se pueden unir, usando métodos recombinantes, mediante un enlazador sintético que les permite formar una única cadena proteica, en donde las regiones VL y VH se emparejan para formar moléculas monovalentes (conocidas como Fv de cadena sencilla ("scFv"); (véase, p. ej., Bird et al., Science 242:423-426, 1988; y Houston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 85:5879-5883, 1988). También se entiende que esos anticuerpos de cadena sencilla están incluidos dentro de la expresión "fragmento que se une a antígeno". Esos fragmentos que se unen a antígeno se obtienen usando técnicas convencionales conocidas por los expertos en la técnica y los fragmentos se analizan para determinar su utilidad de la misma manera que con los anticuerpos intactos.

Los fragmentos que se unen a antígeno también se pueden incorporar en anticuerpos de dominio único, maxicuerpos, minicuerpos, nanocuerpos, intracuerpos, diacuerpos, tricuerpos, tetracuerpos, v-NAR y bis-scFv (véase, por ejemplo, Hollinger y Hudson, Nature Biotechnology 23:1126-1136, 2005). Los fragmentos que se unen a antígeno se pueden injertar en estructuras basadas en polipéptidos como la fibronectina de tipo III (Fn3) (véase el documento de patente de EE. UU. núm. 6.703.199, que describe monocuerpos polipeptídicos de fibronectina).

Los fragmentos que se unen a antígeno se pueden incorporar en moléculas de cadena sencilla que comprenden una pareja de segmentos Fv en tándem (VH-CH1-VH-CH1) que, junto con polipéptidos de cadena ligera complementarios, forman una pareja de regiones que se unen a antígeno (Zapata et al., Protein Eng. 8:1057-1062, 1995; y documento<de patente de e>E.<UU. núm. 5.641.870).>

La expresión "anticuerpo monoclonal" o "composición de anticuerpo monoclonal", tal como se usa en el presente documento, se refiere a polipéptidos, incluidos anticuerpos y fragmentos que se unen a antígeno que tienen una secuencia de aminoácidos sustancialmente idéntica o se obtienen a partir de la misma fuente genética. Esa expresión también incluye preparaciones de moléculas de anticuerpos de composición molecular única. Una composición de anticuerpo monoclonal muestra una especificidad de unión única y afinidad hacia un epítopo particular.

La expresión "anticuerpo humano", tal como se usa en el presente documento, incluye anticuerpos que tienen regiones variables en donde tanto las regiones estructurales como las CDRs se obtienen a partir de secuencias de origen humano. Además, si el anticuerpo contiene una región constante, la región constante también se obtiene a partir de esas secuencias humanas, p. ej., secuencias de la línea germinal humana o versiones mutadas de secuencias de la línea germinal humana o anticuerpos que contienen secuencias estructurales de consenso obtenidas a partir del análisis de secuencias estructurales humanas, por ejemplo, como se describe en Knappik et al., J. Mol. Biol. 296:57-86, 2000).

Los anticuerpos humanos de la presente divulgación pueden incluir residuos de aminoácidos no codificados por secuencias humanas (p. ej., mutaciones introducidas por mutagénesis aleatoria o específica del sitioin vitroo mediante mutación somáticain vivo,o una sustitución conservadora para promover la estabilidad o la producción).

El término "reconocer", tal como se utiliza en el presente documento, se refiere a un anticuerpo o un fragmento del mismo que se une a antígeno que encuentra e interacciona (p. ej., se une) con su epítopo, siendo ese epítopo lineal o conformacional. El término "epítopo" se refiere a un sitio en un antígeno al que se une específicamente un anticuerpo o un fragmento que se une a antígeno de la divulgación. Los epítopos pueden formarse tanto a partir de aminoácidos contiguos como a partir de aminoácidos no contiguos, yuxtapuestos mediante plegamiento terciario de una proteína. Los epítopos formados a partir de aminoácidos contiguos, normalmente se conservan al exponerlos a disolventes desnaturalizantes, mientras que los epítopos formados por plegamiento terciario, normalmente se pierden al tratar con disolventes desnaturalizantes. Un epítopo normalmente incluye al menos 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 o 15 aminoácidos en una conformación espacial única. Los métodos para determinar la conformación espacial de los epítopos incluyen métodos en la técnica, por ejemplo, cristalografía de rayos X y resonancia magnética nuclear bidimensional (véase, por ejemplo, Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, vol. 66, GE Morris, Ed. (1996)). Un "paratopo" es la parte del anticuerpo que reconoce el epítopo del antígeno.

La expresión "se une específicamente" o "se une selectivamente", cuando se usa en el contexto de describir la interacción entre un antígeno (p. ej., una proteína) y un anticuerpo, fragmento de anticuerpo o agente de unión obtenido a partir de un anticuerpo, se refiere a una reacción de unión que es determinante de la presencia del antígeno en una población heterogénea de proteínas y otros productos biológicos, p. ej., en una muestra biológica, p. ej., una muestra de sangre, suero, plasma o tejido. Por lo tanto, en ciertas condiciones de inmunoensayo concretas, los anticuerpos o agentes de unión con una especificidad de unión particular, se unen a un antígeno particular con al menos el doble de especificidad de unión que la del ruido de fondo y no se unen sustancialmente con una cantidad significativa a otros antígenos presentes en la muestra. En un aspecto, en condiciones de inmunoensayo concretas, el anticuerpo o el agente de unión con una especificidad de unión particular, se une a un antígeno particular al menos con diez (10) veces más especificidad que el ruido de fondo y no se une sustancialmente con una cantidad significativa a otros antígenos presentes en la muestra. La unión específica a un anticuerpo o a un agente de unión en tales condiciones puede requerir que el anticuerpo o el agente haya sido seleccionado por su especificidad para una proteína particular. Según se desee o sea apropiado, esa selección se puede lograr eliminando los anticuerpos que reaccionan de forma cruzada con moléculas de otras especies (p. ej., ratón o rata) u otros subtipos. Alternativamente, en algunos aspectos, se seleccionan anticuerpos o fragmentos de anticuerpos que reaccionan de forma cruzada con ciertas moléculas deseadas.

El término "afinidad", tal como se utiliza en el presente documento, se refiere a la fuerza de la interacción entre un anticuerpo y un antígeno en sitios antigénicos únicos. Dentro de cada sitio antigénico, la región variable del "brazo" del anticuerpo interacciona a través de fuerzas débiles no covalentes con el antígeno en numerosos sitios; cuantas más interacciones haya, más fuerte es la afinidad.

La expresión "anticuerpo aislado" se refiere a un anticuerpo que está sustancialmente exento de otros anticuerpos que tienen diferentes especificidades antigénicas. Sin embargo, un anticuerpo aislado que se une específicamente a un antígeno puede tener reactividad cruzada con otros antígenos. Además, un anticuerpo aislado puede estar sustancialmente exento de otro material celular y/o productos químicos.

La expresión "secuencia de la línea germinal humana correspondiente" se refiere a la secuencia de ácidos nucleicos que codifica una secuencia o subsecuencia de aminoácidos de la región variable humana que comparte la identidad de secuencia de aminoácidos determinada más alta con una secuencia o subsecuencia de aminoácidos de la región variable de referencia, en comparación con todas las demás secuencias de aminoácidos de la región variable conocidas, codificadas por secuencias de la región variable de una inmunoglobulina de la línea germinal humana. La secuencia de la línea germinal humana correspondiente también puede referirse a la secuencia o subsecuencia de aminoácidos de la región variable humana con la mayor identidad de secuencia de aminoácidos con una secuencia o subsecuencia de aminoácidos de la región variable de referencia, en comparación con todas las demás secuencias de aminoácidos de la región variable evaluadas. La secuencia de la línea germinal humana correspondiente puede consistir solo en regiones estructurales, solo regiones determinantes de complementariedad, regiones estructurales y determinantes de complementariedad, un segmento variable (como se ha definido anteriormente) u otras combinaciones de secuencias o subsecuencias que comprenden una región variable. La identidad de secuencia se puede determinar usando los métodos descritos en el presente documento, por ejemplo, alineando dos secuencias usando BLAST, ALIGN u otro algoritmo de alineamiento conocido en la técnica. La correspondiente secuencia de aminoácidos o ácidos nucleicos de la línea germinal humana puede tener al menos aproximadamente un 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% de identidad de secuencia con secuencia de aminoácidos o ácidos nucleicos de la región variable de referencia.

Se puede utilizar una variedad de formatos de inmunoensayo para seleccionar anticuerpos específicamente inmunorreactivos con una proteína particular. Por ejemplo, los inmunoensayos ELISA en fase sólida se utilizan habitualmente para seleccionar anticuerpos específicamente inmunorreactivos con una proteína (véase, p. ej., Harlow & Lane, Using Antibodies, A Laboratory Manual (1998), para una descripción de los formatos y condiciones de inmunoensayo que pueden usarse para determinar una inmunorreactividad específica). Normalmente, una reacción de unión específica o selectiva producirá una señal al menos dos veces mayor que la señal de fondo y más normalmente al menos de 10 a 100 veces mayor que la señal de fondo.

La expresión "constante de disociación en equilibrio (KD, M)" se refiere a la constante de la tasa de disociación (kd, tiempo-1) dividida por la constante de la tasa de asociación (ka, tiempo-1, M-1). Las constantes de disociación en equilibrio se pueden medir usando cualquier método conocido en la técnica. Los anticuerpos de la presente divulgación generalmente tendrán una constante de disociación en equilibrio de menos de aproximadamente 10-7 o 10-8 M, por ejemplo, menos de aproximadamente 10-9 M o 10-10 M, en algunos aspectos, menos de aproximadamente 10-11 M, 10-12 M o 10-13 M.

El término "biodisponibilidad" se refiere a la disponibilidad sistémica (es decir, niveles en sangre/plasma) de una cantidad determinada de fármaco administrado a un paciente. La biodisponibilidad es un término absoluto que indica la medición tanto del tiempo (tasa) como de la cantidad total (medida) de fármaco que llega a la circulación general desde una forma farmacéutica administrada.

Tal como se usa en el presente documento, la expresión "que consiste esencialmente en" se refiere a los géneros o especies de agentes farmacéuticos activos incluidos en un método o composición, así como a cualquier excipiente inactivo para el fin previsto de los métodos o composiciones. En algunos aspectos, la expresión "que consiste esencialmente en" excluye expresamente la inclusión de uno o más agentes activos adicionales distintos de un anticuerpo anti-VP1 de la presente divulgación. En algunos aspectos, la expresión "que consiste esencialmente en" excluye expresamente la inclusión de uno o más agentes activos adicionales distintos de un anticuerpo anti-VP1 de la presente divulgación y un segundo agente coadministrado.

El término "aminoácido" se refiere a aminoácidos naturales, sintéticos y no naturales, así como a análogos de aminoácidos y miméticos de aminoácidos que funcionan de manera similar a los aminoácidos naturales. Los aminoácidos naturales son aquellos codificados por el código genético, así como aquellos aminoácidos que posteriormente son modificados, p. ej., hidroxiprolina, Y-carboxiglutamato y O-fosfoserina. Los análogos de aminoácidos se refieren a compuestos que tienen la misma estructura química básica que un aminoácido natural, es decir, un carbono a que está unido a un hidrógeno, un grupo carboxilo, un grupo amino y un grupo R, p. ej., homoserina, norleucina, sulfóxido de metionina, metionina metil sulfonio. Tales análogos tienen grupos R modificados (p. ej., norleucina) o cadenas peptídicas modificadas, pero conservan la misma estructura química básica que un aminoácido natural. Los miméticos de aminoácidos se refieren a compuestos químicos que tienen una estructura diferente de la estructura química general de un aminoácido, pero que funcionan de manera similar a un aminoácido natural.

La expresión "variante modificada de forma conservadora" se aplica tanto a secuencias de aminoácidos como de ácidos nucleicos. Con respecto a secuencias de ácidos nucleicos particulares, variantes modificadas de forma conservadora se refiere a aquellos ácidos nucleicos que codifican secuencias de aminoácidos idénticas o esencialmente idénticas o, cuando el ácido nucleico no codifica una secuencia de aminoácidos, a secuencias esencialmente idénticas. Debido a la degeneración del código genético, una gran cantidad de ácidos nucleicos funcionalmente idénticos codifican cualquier proteína determinada. Por ejemplo, los codones GCA, GCC, GCG y GCU codifican el aminoácido alanina. Por tanto, en cada posición en la que una alanina está especificada por un codón, el codón se puede alterar a cualquiera de los codones correspondientes descritos sin alterar el polipéptido codificado. Tales variaciones de ácido nucleico son "variaciones silenciosas", que son una especie de variaciones modificadas de forma conservadora. Cada secuencia de ácido nucleico del presente documento que codifica un polipéptido también describe cada posible variación silenciosa del ácido nucleico. Un experto reconocerá que cada codón en un ácido nucleico (excepto AUG, que normalmente es el único codón para metionina y TGG, que normalmente es el único codón para triptófano) puede modificarse para producir una molécula funcionalmente idéntica. En consecuencia, cada variación silenciosa de un ácido nucleico que codifica un polipéptido está implícita en cada secuencia descrita.

Para las secuencias polipeptídicas, las "variantes modificadas de forma conservadora" incluyen sustituciones, deleciones o adiciones individuales a una secuencia polipeptídica que dan como resultado la sustitución de un aminoácido por un aminoácido químicamente similar. Las tablas de sustituciones conservadoras que proporcionan aminoácidos funcionalmente similares son bien conocidas en la técnica. Esas variantes modificadas de forma conservadora se suman a las variantes polimórficas, homólogos entre especies y alelos y no las excluyen. Los ocho grupos siguientes contienen aminoácidos que son sustituciones conservadoras entre sí: 1) Alanina (A), Glicina (G); 2) Ácido aspártico (D), Ácido glutámico (E); 3) Asparagina (N), Glutamina (Q); 4) Arginina (R), Lisina (K); 5) Isoleucina (I), Leucina (L), Metionina (M), Valina (V); 6) Fenilalanina (F), Tirosina (y ), Triptófano (W); 7) Serina (s ), Treonina (T); y 8) Cisteína (C), Metionina (M) (véase, p. ej., Creighton, Proteins (1984)). En algunos aspectos, la expresión "modificaciones de secuencias conservadoras" se usa para referirse a modificaciones de aminoácidos que no afectan ni alteran significativamente las características de unión del anticuerpo que contiene la secuencia de aminoácidos.

El término "optimizado" tal como se usa en el presente documento, se refiere a una secuencia de nucleótidos que ha sido alterada para codificar una secuencia de aminoácidos usando codones que se prefieren en la célula u organismo de producción, generalmente una célula eucariota, por ejemplo, una célula de levadura, una célula de Pichia, una célula fúngica, una célula de Trichoderma, una célula de ovario de hámster chino (CHO) o una célula humana. La secuencia de nucleótidos optimizada está diseñada para conservar completamente o tanto como sea posible la secuencia de aminoácidos originalmente codificada por la secuencia de nucleótidos inicial, que también se conoce como secuencia "parental".

Las expresiones "identidad en porcentaje" o "porcentaje de identidad", en el contexto de dos o más ácidos nucleicos o secuencias polipeptídicas, se refieren al grado en que dos o más secuencias o subsecuencias son iguales. Dos secuencias son "idénticas" si tienen la misma secuencia de aminoácidos o nucleótidos en la región que se compara. Dos secuencias son "sustancialmente idénticas" si dos secuencias tienen un porcentaje especificado de residuos de aminoácidos o nucleótidos que son iguales (es decir, 60% de identidad, opcionalmente 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% o 99% de identidad en una región especificada o, cuando no se especifica, en toda la secuencia), cuando se comparan y alinean para una correspondencia máxima en una ventana de comparación, o región designada medida usando uno de los siguientes algoritmos de comparación de secuencias o mediante alineamiento manual e inspección visual. Opcionalmente, la identidad existe en una región que tiene al menos aproximadamente 30 nucleótidos (o 10 aminoácidos) de longitud, o más preferiblemente en una región que tiene de 100 a 500 o 1000 o más nucleótidos (o 20, 50, 200 o más aminoácidos) de longitud.

Para la comparación de secuencias, normalmente una secuencia actúa como secuencia de referencia, con la que se comparan las secuencias de la prueba. Cuando se utiliza un algoritmo de comparación de secuencias, las secuencias de la prueba y de referencia se registran en un ordenador, se designan las coordenadas de la subsecuencia, si es necesario y se designan los parámetros del programa del algoritmo de secuencias. Se pueden utilizar los parámetros predeterminados del programa o se pueden designar parámetros alternativos. Luego, el algoritmo de comparación de secuencias calcula el porcentaje de identidad de secuencia para las secuencias de la prueba en relación con la secuencia de referencia, basándose en los parámetros del programa.

Una "ventana de comparación", tal como se usa en el presente documento, incluye la referencia a un segmento de una cualquiera entre la cantidad de posiciones contiguas seleccionadas a partir del grupo que consiste en 20 a 600, normalmente de aproximadamente 50 a aproximadamente 200, más habitualmente de aproximadamente 100 a aproximadamente 150, en donde una secuencia puede compararse con una secuencia de referencia con el mismo número de posiciones contiguas después de que las dos secuencias se alinean de manera óptima. Los métodos de alineamiento de secuencias para una comparación son bien conocidos en la técnica. Se puede realizar un alineamiento óptimo de secuencias para comparar, p. ej., con el algoritmo de homología local de Smith y Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482c (1970), con el algoritmo de alineamiento por homología de Needleman y Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443 (1970), con el método de búsqueda de similitud de Pearson y Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444 (1988), mediante implementaciones informatizadas de esos algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA y TFASTA en Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI), o mediante alineamiento manual e inspección visual (véase, p. ej., Brent et al., Current Protocols in Molecular Biology, 2003).

Dos ejemplos de algoritmos que son adecuados para determinar el porcentaje de identidad de secuencia y la similitud de secuencia son los algoritmos BLAST y BLAST 2.0, que se describen en Altschul et al., Nuc. Acids Res. 25:3389-3402, 1977; y Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-410, 1990, respectivamente. El programa informático para realizar los análisis BLAST está disponible públicamente a través del Centro Nacional de Información Biotecnológica. Ese algoritmo implica primero identificar pares de secuencias con puntuación alta (HSP) mediante la identificación de palabras cortas de longitud W en la secuencia de consulta, que coinciden o satisfacen alguna puntuación umbral de valor positivo T cuando se alinean con una palabra de la misma longitud en una secuencia de la base de datos. T se conoce como el umbral de puntuación de palabras vecinas (Altschulet al.,supra). Esas coincidencias iniciales de palabras vecinas actúan como semillas para iniciar búsquedas para encontrar HSPs más largas que las contengan. Las coincidencias de palabras se extienden en ambas direcciones a lo largo de cada secuencia hasta donde se puede incrementar la puntuación de alineamiento acumulada. Las puntuaciones acumuladas se calculan utilizando, para las secuencias de nucleótidos, los parámetros M (puntuación de recompensa para una pareja de residuos coincidentes; siempre >0) y N (puntuación de penalización por residuos no coincidentes; siempre <0). Para las secuencias de aminoácidos, se utiliza una matriz de puntuación para calcular la puntuación acumulativa. La extensión de las coincidencias de palabras en cada dirección se detiene cuando: la puntuación de alineamiento acumulada cae en una cantidad X desde su valor máximo alcanzado; la puntuación acumulada llega a cero o menos, debido a la acumulación de uno o más alineamientos de residuos con puntuación negativa; o se llega al final de cualquiera de las secuencias. Los parámetros W, T y X del algoritmo BLAST determinan la sensibilidad y la velocidad del alineamiento. El programa BLASTN (para secuencias de nucleótidos) utiliza por defecto una longitud de palabra (W) de 11, una expectativa (E) o 10, M=5, N=-4 y una comparación de ambas cadenas. Para secuencias de aminoácidos, el programa b La STP utiliza por defecto una longitud de palabra de 3 y una expectativa (E) de 10 y la matriz de puntuación BLOSUM62 (véase, Henikoff y Henikoff, (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915) alineamientos (B) de 50, expectativa (E) de 10, M=5, N=-4 y una comparación de ambas cadenas.

El algoritmo BLAST también realiza un análisis estadístico de la similitud entre dos secuencias (véase, p. ej., Karlin y Altschul, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5787, 1993). Una medida de la similitud proporcionada por el algoritmo BLAST es la probabilidad de suma más baja (P(N)), que proporciona una indicación de la probabilidad por la cual se produciría por casualidad una coincidencia entre dos secuencias de nucleótidos o aminoácidos. Por ejemplo, un ácido nucleico se considera similar a una secuencia de referencia si la probabilidad de suma más baja en una comparación del ácido nucleico de prueba con el ácido nucleico de referencia es menor que aproximadamente 0,2, más preferiblemente menor que aproximadamente 0,01 y lo más preferiblemente menor que aproximadamente 0,001.

El porcentaje de identidad entre dos secuencias de aminoácidos también se puede determinar utilizando el algoritmo de E. Meyers y W. Miller, (Comput. Appl. Biosci. 4:11-17, 1988) que se ha incorporado al programa ALIGN (versión 2.0), usando una tabla de residuos de peso PAM120, una penalización por longitud de hueco de 12 y una penalización por hueco de 4. Además, el porcentaje de identidad entre dos secuencias de aminoácidos se puede determinar usando el algoritmo de Needleman y Wunsch, (J. Mol. Biol. 48:444-453, 1970), que se ha incorporado al programa GAP en el paquete de programas informáticos GCG (disponible en la Universidad de South Florida), utilizando una matriz BLOSUM 62 o una matriz PAM250 y un peso de hueco de 16, 14, 12, 10, 8, 6 o 4 y un peso de longitud de 1, 2, 3, 4, 5 o 6.

Aparte del porcentaje de identidad de secuencia señalado anteriormente, otra indicación de que dos secuencias de ácidos nucleicos o polipéptidos son sustancialmente idénticas es que el polipéptido codificado por el primer ácido nucleico tiene reactividad cruzada inmunológica con los anticuerpos generados contra el polipéptido codificado por el segundo ácido nucleico, como se describe más abajo. Por tanto, un polipéptido suele ser sustancialmente idéntico a un segundo polipéptido, por ejemplo, cuando los dos péptidos difieren solo por sustituciones conservadoras. Otra indicación de que dos secuencias de ácidos nucleicos son sustancialmente idénticas es que las dos moléculas o sus complementos se hibridan entre sí en condiciones estrictas, como se describe a continuación. Aún otra indicación de que dos secuencias de ácidos nucleicos son sustancialmente idénticas es que se pueden usar los mismos cebadores para amplificar la secuencia.

La expresión "ácido nucleico" se usa en este documento indistintamente con el término "polinucleótido" y se refiere a desoxirribonucleótidos o ribonucleótidos y polímeros de los mismos en forma monocatenaria o bicatenaria. La expresión incluye ácidos nucleicos que contienen análogos de nucleótidos conocidos o residuos o enlaces de la cadena principal modificados, que son sintéticos, de origen natural y de origen no natural, que tienen propiedades de unión similares a las del ácido nucleico de referencia y que se metabolizan de una manera similar a los nucleótidos de referencia. Ejemplos de tales análogos incluyen, sin limitación, fosforotioatos, fosforamidatos, metilfosfonatos, metilfosfonatos quirales, 2-O-metilribonucleótidos y ácidos peptidonucleicos (PNAs).

A menos que se indique lo contrario, una secuencia de ácido nucleico particular también incluye implícitamente sus variantes modificadas de forma conservadora (por ejemplo, sustituciones de codones degenerados) y secuencias complementarias, así como la secuencia indicada explícitamente. Específicamente, tal como se detalla a continuación, las sustituciones de codones degenerados se pueden lograr generando secuencias en las que la tercera posición de uno o más codones seleccionados (o todos) se sustituye con residuos de base mixta y/o desoxiinosina (Batzer et al., (1991) Nucleic Acid Res. 19:5081; Ohtsuka et al., (1985) J. Biol. Chem. 260:2605-2608; y Rossolini et al., (1994) Mol. Cell. Probes 8:91-98).

La expresión "ligado funcionalmente" en el contexto de ácidos nucleicos se refiere a una relación funcional entre dos o más segmentos de polinucleótidos (por ejemplo, ADN). Normalmente, se refiere a la relación funcional de una secuencia reguladora transcripcional con una secuencia transcrita. Por ejemplo, una secuencia promotora o potenciadora está ligada funcionalmente a una secuencia codificante si estimula o modula la transcripción de la secuencia codificante en una célula hospedadora apropiada u otro sistema de expresión. Generalmente, las secuencias reguladoras transcripcionales promotoras que están ligadas funcionalmente a una secuencia transcrita, están contiguas físicamente a la secuencia transcrita, es decir, actúan en cis. Sin embargo, algunas secuencias reguladoras de la transcripción, como las potenciadoras, no necesitan estar contiguas físicamente ni estar ubicadas muy cerca de las secuencias codificantes cuya transcripción potencian.

Los términos "polipéptido" y "proteína" se usan indistintamente en el presente documento para referirse a un polímero de residuos de aminoácidos. Los términos se aplican a polímeros de aminoácidos en donde uno o más residuos de aminoácidos son un mimético químico artificial de un correspondiente aminoácido de origen natural, así como a polímeros de aminoácidos de origen natural y a polímeros de aminoácidos de origen no natural. A menos que se indique lo contrario, una secuencia polipeptídica particular también incluye implícitamente sus variantes modificadas de forma conservadora.

El término "sujeto" incluye seres humanos y animales no humanos. Los animales no humanos incluyen todos los vertebrados, por ejemplo, mamíferos y no mamíferos, tales como primates no humanos, ovejas, perros, vacas, pollos, anfibios y reptiles. Excepto cuando se indique lo contrario, los términos "paciente" o "sujeto" se utilizan en este documento indistintamente.

Los términos "BKV" o "virus BK" se refieren a un miembro de la familiaPolyomaviridae,géneroOrthopolyomavirus.Los poliomavirus son virus de ADN icosaédricos, sin envoltura, de doble cadena y con un genoma de aproximadamente 5.000 pares de bases. Miden aproximadamente 40-45 nM de diámetro (Bennett et al., Microbes and Infection. 2012:14(9):672-683).

"JCV" o "virus JC" se refiere a un miembro de la familiaPolyomaviridae,géneroOrthopolyomavirus.El JCV está relacionado con el BKV y también es un virus de ADN bicatenario, sin envoltura, icosaédrico, con un genoma de aproximadamente 5.000 pares de bases. Miden aproximadamente 40-45 nM de diámetro (Johne et al., Arch. Virol.

2011 ;156(9):1627-1634).

Las expresiones "nefropatía por BKV" o "nefropatía asociada a BKV" o "BKVAN" se refieren a la nefropatía intersticial inflamatoria resultante de la infección lítica por BKV, caracterizada por cambios citopatógenos virales y expresión de genes virales, principalmente en el epitelio tubular renal.

El término "VP1" se refiere a la proteína de la subunidad principal de la cápside del virus del polioma. Los "pentámeros de VP1" están compuestos por cinco monómeros de VP1.

Tabla 1 - Secuencias de VP1

Las "partículas similares a virus" o "VLPs" son un ensamblaje de pentámeros de VP1 en cápsides virales. Las VLPs están compuestas por 72 pentámeros de VP1. Las VLPs son estructuralmente muy similares a los virus reales, pero carecen de las proteínas menores de la cápside (VP2 y VP3), así como del genoma del ADN viral y, por lo tanto, no son infecciosas. Las VLPs son útiles ya que los epítopos virales se presentan en una conformación similar al virus real.

"CI50" (concentración inhibidora media máxima) se refiere a la concentración de un anticuerpo particular que induce una señal que es la mitad (50%) entre el control inicial y la señal máxima posible. Por ejemplo, la CI50 es la concentración de anticuerpo a la que están ocupados el 50% de los sitios de unión disponibles en el antígeno VP1.

"CE50" (concentración efectiva media máxima) se refiere a la concentración de un anticuerpo particular que induce una respuesta que es la mitad (50%) entre el control inicial y el efecto máximo posible después de una exposición o un tiempo de tratamiento específico. Por ejemplo, la CE50 es la concentración de anticuerpos con la que la infección viral se neutraliza en un 50%.

"CE90" se refiere a la concentración de un anticuerpo particular que induce una respuesta correspondiente al 90% del efecto máximo posible después de una exposición o tiempo de tratamiento específico. Por ejemplo, CE90 es la concentración de anticuerpos con la que la infección viral se neutraliza en un 90%.

"Neutralización" se refiere a la inhibición de la infección viral de una célula hospedadora, como se demuestra por la ausencia de expresión génica viral. Sin apegarnos a ninguna teoría, los mecanismos de neutralización de un anticuerpo particular podrían incluir el bloqueo de la interacción de las proteínas de la cápside viral con los receptores de la superficie celular o la interrupción de cualquier etapa del proceso de entrada y transporte antes de la entrega del genoma viral al núcleo de la célula hospedadora.

Tal como se usa en el presente documento, los términos "tratar", "tratando" o "tratamiento" de cualquier enfermedad o trastorno, se refieren en un aspecto a mejorar la enfermedad o trastorno (es decir, retardar o detener o reducir el desarrollo de la enfermedad o al menos uno de los síntomas clínicos del mismo). En otro aspecto, "tratar", "tratando" o "tratamiento" se refiere a aliviar o mejorar al menos un parámetro físico, incluidos aquellos que pueden no ser discernibles por el paciente. En otro aspecto más, "tratar", "tratando" o "tratamiento" se refiere a modular la enfermedad o el trastorno, ya sea físicamente (por ejemplo, estabilización de un síntoma discernible), fisiológicamente (por ejemplo, estabilización de un parámetro físico) o ambos.

La expresión "reducir la probabilidad" se refiere a retrasar la aparición, el desarrollo o la progresión de la enfermedad, infección o trastorno.

La expresión "cantidad terapéuticamente aceptable" o "dosis terapéuticamente eficaz" se refiere indistintamente a una cantidad suficiente para lograr el resultado deseado (es decir, una reducción en el tamaño del tumor, inhibición del crecimiento del tumor, prevención de metástasis, inhibición o prevención de infecciones virales, bacterianas, por hongos o parásitos). En algunos aspectos, una cantidad terapéuticamente aceptable no induce ni causa efectos secundarios indeseables. Se puede determinar una cantidad terapéuticamente aceptable administrando primero una dosis baja y luego aumentando gradualmente esa dosis hasta que se logra el efecto deseado. Una "dosificación profilácticamente eficaz" y una "dosificación terapéuticamente eficaz" de las moléculas de la presente divulgación pueden prevenir la aparición o dar como resultado una disminución de la gravedad, respectivamente, de los síntomas de la enfermedad, incluidos los síntomas asociados a una infección viral por polioma.

El término "coadministrar" se refiere a la presencia simultánea de dos agentes activos en la sangre de un individuo. Los agentes activos que se coadministran se pueden administrar de forma simultánea o secuencial.

Breve descripción de los dibujos

Las Figuras 1A-1D representan gráficamente mediciones de la afinidad para anticuerpos anti-VP1 hacia pentámeros de VP1 para los serotipos I-IV de BKV mediante el ensayo SET.

La Figura 2 es una tabla de valores de la afinidad SET (K<d>) para anticuerpos anti-VP1 en pentámeros de VP1 para los serotipos I-IV de BKV.

La Figura 3A-3E representa gráficamente las mediciones de la afinidad para anticuerpos anti-VP1 en pentámeros de VP1 o VLPs para los serotipos I-IV de BKV mediante Biacore.

La Figura 4 es un gráfico de anticuerpos anti-VP1 que se unen a VLPs de serotipo I de BKV tal y como se mide mediante ELISA.

La Figura 5 es un gráfico de anticuerpos anti-VP1 que se unen a VLPs de serotipo IV de BKV tal y como se mide mediante ELISA.

La Figura 6 es un gráfico de anticuerpos anti-VP1 que se unen a pentámeros de VP1 de serotipo IV de BKV tal y como se mide mediante ELISA.

La Figura 7 es una tabla de valores de CI50 generados por ELISA para anticuerpos anti-VP1 que se unen a VLPs 0 pentámeros de VP1 para los serotipos I y IV de BKV.

La Figura 8 es un gráfico de anticuerpos anti-VP1 que se unen a VLPs de serotipo I de BKV tal y como se mide mediante ELISA.

La Figura 9 es una tabla de valores de CI50 generados por ELISA para anticuerpos anti-VP1 que se unen a VLPs de serotipo I de BKV.

La Figura 10 es un gráfico de anticuerpos anti-VP1 que se unen a VLPs del virus JC tal y como se mide mediante ELISA.

La Figura 11 es una tabla de valores de CI50 generados por ELISA para anticuerpos anti-VP1 que se unen a VLPs de JCV.

La Figura 12A-B muestra dos transferencias. El panel superior (Figura 12A) es una transferencia Western que demuestra la falta de unión de anticuerpos anti-VP1 a VP1 de BKV desnaturalizada. El panel inferior (Figura 12) es una transferencia puntual de pentámeros de VP1 de BKV sin desnaturalizar, que demuestra la unión de anticuerpos anti-VP1 a pentámeros de VP1 sin desnaturalizar.

Las Figuras 13A-13F representan gráficamente la unión de anticuerpos anti-VP1 a pentámeros de VP1 de serotipo 1 de BKV de tipo silvestre mediante Biacore, pero esas mutaciones puntuales en<v>P1 pueden alterar la unión. La Figura 14 es una tabla que resume los residuos clave para la unión identificados en los epítopos de anticuerpos anti-VP1.

La Figura 15 es un gráfico de anticuerpos anti-VP1 que neutralizan la infección por BKV de serotipo I.

La Figura 16 es un gráfico de anticuerpos anti-VP1 que neutralizan la infección por BKV de serotipo II.

La Figura 17 es un gráfico de anticuerpos anti-VP1 que neutralizan la infección por BKV de serotipo III.

La Figura 18 es un gráfico de anticuerpos anti-VP1 que neutralizan la infección por BKV de serotipo IV.

La Figura 19 es una tabla que resume la actividad neutralizante (CE50 y CE90) de los anticuerpos anti-VP1 sobre los serotipos I-IV de BKV y el virus JC.

La Figura 20 es un gráfico de anticuerpos anti-VP1 que neutralizan la infección con los serotipos I, II y IV de BKV.

La Figura 21 es una tabla que resume la actividad neutralizante (CE50 y CE90) de los anticuerpos anti-VP1 sobre los serotipos I-IV de BKV.

La Figura 22 es un gráfico de anticuerpos anti-VP1 que neutralizan la infección con BKV de serotipo I.

La Figura 23 es una tabla que resume la actividad neutralizante (CE50 y CE90) de los anticuerpos anti-VP1 sobre el serotipo I de BKV.

La Figura 24 es un gráfico de anticuerpos anti-VP1 que neutralizan la infección con JCV.

La Figura 25 es un gráfico de anticuerpos anti-VP1 que neutralizan la infección con JCV.

La Figura 26 es una tabla que resume la actividad neutralizante (CE50 y CE90) de los anticuerpos anti-VP1 sobre la infección por JCV.

La Figura 27 es una tabla de afinidad del anticuerpo P8D11 sobre VLPs del virus JC y VLPs que contienen mutaciones puntuales.

La Figura 28 es un cartografiado del epítopo con intercambio de deuterio de un Fab P8D11 unido a pentámeros de VP1 de BKV.

La Figura 29A es una tabla que muestra los residuos de contacto del anticuerpo anti-BKV en el bucle EF cuando se introducen ciertas mutaciones mediante exploración de alanina. Las Figuras 29B-29C muestran los gráficos SPR de la unión del anticuerpo anti-BKV a residuos de tipo silvestre y mutados en VP1.

La Figura 30 es una estructura cristalina de rayos X de P8D11 en un complejo con el pentámero de VP1 de BKV.

La Figura 31A-B es una representación gráfica de cómo P8D11 se pone en contacto con los residuos del pentámero de VP1.

Descripción detallada

La presente divulgación proporciona anticuerpos, fragmentos de anticuerpos (por ejemplo, fragmentos que se unen a antígeno), que se unen y neutralizan el BKV. En particular, la presente divulgación se dirige a anticuerpos y fragmentos de anticuerpos (por ejemplo, fragmentos que se unen a antígeno) que se unen a proteínas VP1 y neutralizan la infección viral tras esa unión. Además, la presente divulgación proporciona anticuerpos que tienen características farmacocinéticas deseables y otros atributos deseables y que por lo tanto pueden usarse para reducir la probabilidad de o para tratar una nefropatía asociada al virus BK (por ejemplo, BKVAN). La presente divulgación proporciona además composiciones farmacéuticas que comprenden los anticuerpos y métodos para preparar y usar esas composiciones farmacéuticas para la prevención y el tratamiento de una infección por el virus del polioma y trastornos asociados.

Anticuerpos anti-VP1

La presente divulgación proporciona anticuerpos o fragmentos de anticuerpos (por ejemplo, fragmentos que se unen a antígeno) que se unen específicamente a VP1. Los anticuerpos o fragmentos de anticuerpos (p. ej., fragmentos que se unen a antígeno) de la presente divulgación incluyen, pero no se limitan a, los anticuerpos monoclonales humanos o fragmentos de los mismos, aislados como se describe en los Ejemplos siguientes.

La presente divulgación en ciertos aspectos proporciona anticuerpos o fragmentos de anticuerpos (por ejemplo, fragmentos que se unen a antígeno) que se unen específicamente a VP1, dichos anticuerpos o fragmentos de anticuerpos (por ejemplo, fragmentos que se unen a antígeno) comprenden un dominio VH que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 12, 32, 52, 72, 92, 112, 132, 152, 172, 192, 212, 232, 252, 272, 292, 312, 328, 348, 362, 376, 390, 404, 418, 432, 446, 460, 474 y 488 (Tabla 2). La presente divulgación también proporciona anticuerpos o fragmentos de anticuerpos (por ejemplo, fragmentos que se unen a antígeno) que se unen específicamente a VP1, dichos anticuerpos o fragmentos de anticuerpos (por ejemplo, fragmentos que se unen a antígeno) comprenden una CDR de VH que tiene una secuencia de aminoácidos de cualquiera de las CDRs de VH indicadas en la Tabla 2. En aspectos particulares, la presente divulgación proporciona anticuerpos o fragmentos de anticuerpos (por ejemplo, fragmentos que se unen a antígeno) que se unen específicamente a VP1, comprendiendo dichos anticuerpos (o alternativamente, consistiendo en) una, dos, tres o más CDRs de VH que tienen una secuencia de aminoácidos de cualquiera de las CDRs de VH indicadas en la Tabla 2.

La presente divulgación proporciona anticuerpos o fragmentos de anticuerpos (por ejemplo, fragmentos que se unen a antígeno) que se unen específicamente a VP1, dichos anticuerpos o fragmentos de anticuerpos (por ejemplo, fragmentos que se unen a antígeno) comprenden un dominio VL que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 22, 42, 62, 82, 102, 122, 142, 162, 182, 202, 222, 242, 262, 282, 302, 320, 338, 355, 369, 383, 397, 411, 425, 439, 453, 467, 481 y 495 (Tabla 2). La presente divulgación también proporciona anticuerpos o fragmentos de anticuerpos (por ejemplo, fragmentos que se unen a antígeno) que se unen específicamente a<v>P1 , dichos anticuerpos o fragmentos de anticuerpos (por ejemplo, fragmentos que se unen a antígeno) comprenden una CDR de VL que tiene una secuencia de aminoácidos de cualquiera de las CDRs de VL indicadas en la Tabla 2. En particular, la divulgación proporciona anticuerpos o fragmentos de anticuerpos (por ejemplo, fragmentos que se unen a antígeno) que se unen específicamente a VP1, dichos anticuerpos o fragmentos de anticuerpos (por ejemplo, fragmentos que se unen a antígeno) comprenden (o alternativamente, consisten en) uno, dos, tres o más CDRs de VL que tienen una secuencia de aminoácidos de cualquiera de las CDRs de VL indicadas en la Tabla 2.

Otros anticuerpos o fragmentos de anticuerpos (por ejemplo, fragmentos que se unen a antígeno) de la presente divulgación incluyen aminoácidos que han sido mutados, pero que aún tienen al menos un 60, 70, 80, 90 o 95 por ciento de identidad en las regiones CDRs con las regiones CDRs representadas en la secuencias descritas en la Tabla 2. En algunos aspectos, incluye secuencias de aminoácidos mutantes en las que no se han mutado más de 1,2, 3, 4 o 5 aminoácidos en las regiones CDRs, en comparación con las regiones CDRs representadas en la secuencia descrita en Tabla 2.

La presente divulgación también proporciona secuencias de ácidos nucleicos que codifican VH, VL, la cadena pesada de longitud completa y la cadena ligera de longitud completa de los anticuerpos que se unen específicamente a VP1. Esas secuencias de ácidos nucleicos pueden optimizarse para su expresión en células de mamíferos.

Tabla 2: Anticuerpos anti-VP1

(Combinado)

Otros anticuerpos de la presente divulgación incluyen aquellos en los que los aminoácidos o ácidos nucleicos que codifican los aminoácidos se han mutado; todavía tienen al menos un 60, 70, 80, 90 o 95 por ciento de identidad con las secuencias descritas en la Tabla 2. En algunos aspectos, incluye secuencias de aminoácidos mutantes en donde no se han mutado más de 1, 2, 3, 4 o 5 aminoácidos en las regiones variables en comparación con las regiones variables representadas en la secuencia descrita en la Tabla 2, conservando al mismo tiempo sustancialmente la misma actividad terapéutica.

Dado que cada uno de estos anticuerpos puede unirse a VP1, las secuencias de VH, VL, cadena ligera de longitud completa y cadena pesada de longitud completa (secuencias de aminoácidos y las secuencias de nucleótidos que codifican las secuencias de aminoácidos) pueden "mezclarse y emparejarse" para crear otros anticuerpos que se unen a VP1. Esos anticuerpos que se unen a VP1 "mezclados y emparejados" se pueden someter a ensayo usando los ensayos de unión conocidos en la técnica (p. ej., ELISA y otros ensayos descritos en la sección de Ejemplos). Cuando esas cadenas se mezclan y se emparejan, una secuencia VH de una pareja VH/VL particular debe reemplazarse con una secuencia de VH estructuralmente similar. Asimismo, una secuencia de la cadena pesada de longitud completa procedente de una pareja particular de cadena pesada de longitud completa/cadena ligera de longitud completa debería sustituirse por una secuencia de cadena pesada de longitud completa estructuralmente similar. Asimismo, una secuencia VL de una pareja VH/VL particular debe reemplazarse con una secuencia de VL estructuralmente similar. Asimismo, una secuencia de la cadena ligera de longitud completa de una pareja particular de cadena pesada de longitud completa/cadena ligera de longitud completa debería sustituirse por una secuencia de cadena ligera de longitud completa estructuralmente similar. Por consiguiente, en un aspecto, la divulgación proporciona un anticuerpo monoclonal aislado o una región que se une a antígeno del mismo que tiene: una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada a partir del grupo que consiste en SEQ ID NOs: 12, 32, 52, 72, 92, 112, 132, 152, 172, 192, 212, 232, 252, 272, 292, 312, 328, 348, 362, 376, 390, 404, 418, 432, 446, 460, 474 y 488 (Tabla 2); y una región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada a partir del grupo que consiste en SEQ ID NOs: 22, 42, 62, 82, 102, 122, 142, 162, 182, 202, 222, 242, 262, 282, 302, 320, 338, 355, 369, 383, 397, 411, 425, 439, 453, 467, 481 y 495 (Tabla 2); en donde el anticuerpo se une específicamente a VP1.

En otro aspecto, la divulgación proporciona (i) un anticuerpo monoclonal aislado que tiene: una cadena pesada de longitud completa que comprende una secuencia de aminoácidos que se ha optimizado para la expresión en la célula de un mamífero, seleccionada a partir del grupo que consiste en SEQ ID NOs: 14, 34, 54, 74, 94, 114, 134, 154, 174, 194, 214, 234, 254, 274, 294, 313 y 330; y una cadena ligera de longitud completa que comprende una secuencia de aminoácidos que se ha optimizado para la expresión en la célula de un mamífero, seleccionada a partir del grupo que consiste en SEQ ID NOs: 24, 44, 64, 84, 104, 124, 144, 164, 184, 204, 224, 244, 264, 284, 304, 321, 340, o (ii) una proteína funcional que comprende una porción del mismo que se une a antígeno.

En otro aspecto, la presente divulgación proporciona anticuerpos que se unen a VP1 que comprenden las CDRs1, CDRs2 y CDRs3 de cadena pesada y cadena ligera tal como se describen en la Tabla 2, o combinaciones de las mismas. Las secuencias de aminoácidos de las CDRs1 de VH de los anticuerpos se muestran en SEQ ID NOs: 6, 26, 46, 66, 86, 106, 126, 146, 166, 186, 206, 226, 246, 266, 286, 306, 322, 342, 356, 370, 384, 398, 412, 426, 440, 454, 468 y 482. Las secuencias de aminoácidos de las CDRs2 de VH de los anticuerpos se muestran en SEQ ID NOs: 7, 27, 47, 67, 87, 107, 127, 147, 167, 187, 207, 227, 247, 267, 287, 307, 323, 343, 357, 371, 385, 399, 413, 427, 441, 455, 469 y 483. Las secuencias de aminoácidos de las CDRs3 de VH de los anticuerpos se muestran en SEQ ID NOs: 8, 28, 48, 68, 88, 108, 128, 148, 168, 188, 208, 228, 248, 268, 288, 308, 324, 344, 358, 372, 386, 400, 414, 428, 442, 456, 470 y 484. Las secuencias de aminoácidos de las CDRs1 de VL de los anticuerpos se muestran en SEQ ID NOs: 16, 36, 56, 76, 96, 116, 136, 156, 176, 196, 216, 236, 256, 276, 296, 314, 332, 349, 363, 377, 391,405, 419, 433, 447, 461, 475 y 489. Las secuencias de aminoácidos de las CDRs2 de VL de los anticuerpos se muestran en SEQ ID NOs: 17, 37, 57, 77, 97, 117, 137, 157, 177, 197, 217, 237, 257, 277, 297, 315, 333, 350, 364, 378, 392, 406, 420, 434, 448, 462, 476 y 490. Las secuencias de aminoácidos de las CDRs3 de VL de los anticuerpos se muestran en SEQ ID NOs: 18, 38, 58, 78, 98, 118, 138, 158, 178, 198, 218, 238, 258, 278, 298, 316, 334, 351, 365, 379, 393, 407, 421,435, 449, 463, 477 y 491.

Dado que cada uno de esos anticuerpos puede unirse a VP1 y que la especificidad de la unión al antígeno la proporcionan principalmente las regiones c DR1, 2 y 3, las secuencias de VH de CDR1, 2 y 3 y las secuencias de VL de CDR1, 2 y 3 se pueden "mezclar y emparejar" (es decir, las CDRs de diferentes anticuerpos se pueden mezclar y emparejar, aunque cada anticuerpo debe contener una VH de CDR1, 2 y 3 y una VL de CDR1, 2 y 3 para crear otras moléculas que se unen a VP1. Esos anticuerpos que se unen a VP1 "mezcladas y emparejadas" se pueden someter a ensayo usando los ensayos de unión conocidos en la técnica y los descritos en los Ejemplos (por ejemplo, ELISA). Cuando las secuencias de CDRs de VH se mezclan y se emparejan, la secuencia de CDR1, CDR2 y/o CDR3 de una secuencia de VH particular se debe reemplazar con una o unas secuencias de CDRs estructuralmente similares. Del mismo modo, cuando las secuencias de CDRs de VL se mezclan y se emparejan, la secuencia de CDR1, CDR2 y/o CDR3 de una secuencia VL particular se debe reemplazar con una o unas secuencias de CDRs estructuralmente similares. Será claramente evidente para el experto habitual en la técnica que se pueden crear nuevas secuencias de VH y VL sustituyendo una o más secuencias de la región CDR de VH y/o VL con secuencias estructuralmente similares de las secuencias de CDRs mostradas en el presente documento para los anticuerpos monoclonales de la presente divulgación.

Por consiguiente, la presente divulgación proporciona un anticuerpo monoclonal aislado o una región que se une a antígeno del mismo que comprende una Cd R1 de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada a partir del grupo que consiste en SEQ ID NO: 6, 26, 46, 66, 86, 106, 126, 146, 166, 186, 206, 226, 246, 266, 286, 306, 322, 342, 356, 370, 384, 398, 412, 426, 440, 454, 468 y 482; una CDR2 de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada a partir del grupo que consiste en SEQ ID NO: 7, 27, 47, 67, 87, 107, 127, 147, 167, 187, 207, 227, 247, 267, 287, 307, 323, 343, 357, 371, 385, 399, 413, 427, 441, 455, 469 y 483; una CDR3 de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada a partir del grupo que consiste en SEQ ID NO: 8, 28, 48, 68, 88, 108, 128, 148, 168, 188, 208, 228, 248, 268, 288, 308, 324, 344, 358, 372, 386, 400, 414, 428, 442, 456, 470 y 484; una CDR1 de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada a partir del grupo que consiste en SEQ ID NO: 16, 36, 56, 76, 96, 116, 136, 156, 176, 196, 216, 236, 256, 276, 296, 314, 332, 349, 363, 377, 391, 405, 419, 433, 447, 461, 475 y 489; una CDR2 de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada a partir del grupo que consiste en SEQ ID NO: 17, 37, 57, 77, 97, 117, 137, 157, 177, 197, 217, 237, 257, 277, 297, 315, 333, 350, 364, 378, 392, 406, 420, 434, 448, 462, 476 y 490; y una CDR3 de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada a partir del grupo que consiste en SEQ ID NO: 18, 38, 58, 78, 98, 118, 138, 158, 178, 198, 218, 238, 258, 278, 298, 316, 334, 351, 365, 379, 393, 407, 421, 435, 449, 463, 477 y 491; en donde el anticuerpo se une específicamente a VP1.

En ciertos aspectos, un anticuerpo que se une específicamente a VP1 es un anticuerpo o fragmento de anticuerpo (p. ej., un fragmento que se une a antígeno) que se describe en la Tabla 2.

1. Identificación de epítopos y anticuerpos que se unen al mismo epítopo

La presente divulgación proporciona anticuerpos y fragmentos de anticuerpos (p. ej., fragmentos que se unen a antígeno) que se unen a un epítopo de VP1. En ciertos aspectos, los anticuerpos y los fragmentos de anticuerpos pueden unirse al mismo epítopo dentro de los cuatro serotipos de BKV y/o JCV.

La presente divulgación también proporciona anticuerpos y fragmentos de anticuerpos (p. ej., fragmentos que se unen a antígeno) que se unen al mismo epítopo que los anticuerpos anti-VP1 descritos en la Tabla 2. Anticuerpos y fragmentos de anticuerpos adicionales (p. ej., fragmentos que se unen a antígeno) pueden identificarse en función de su capacidad de competencia cruzada (p. ej., para inhibir competitivamente la unión, de una manera estadísticamente significativa), con otros anticuerpos en ensayos de unión. La capacidad de un anticuerpo de una prueba para inhibir la unión de anticuerpos y fragmentos de anticuerpos (p. ej., fragmentos que se unen a antígeno) de la presente divulgación a VP1 (p. ej., VP1 humano de BKV o<j>C<v>) demuestra que el anticuerpo de la prueba puede competir con ese anticuerpo o fragmento de anticuerpo (p. ej., fragmentos que se unen a antígeno) para unirse a VP1; ese anticuerpo puede, según una teoría no limitante, unirse al mismo epítopo o a uno relacionado (p. ej., un epítopo estructuralmente similar o espacialmente proximal) sobre VP1 que el anticuerpo o fragmento de anticuerpo (p. ej., fragmentos que se unen a antígeno) con el que compite. En cierto aspecto, el anticuerpo que se une al mismo epítopo en VP1 que los anticuerpos o fragmentos de anticuerpos (p. ej., fragmentos que se unen a antígeno) de la presente divulgación, es un anticuerpo monoclonal humano o humanizado. Esos anticuerpos monoclonales humanos o humanizados se pueden preparar y aislar tal como se describe en el presente documento.

2. Alteración adicional de la estructura de la región Fc

La presente divulgación describe anticuerpos anti-VP1 específicos. Esos anticuerpos comprenden anticuerpos modificados o fragmentos de los mismos que se unen a antígeno que comprenden además modificaciones de los residuos estructurales dentro de VH y/o VL, p. ej., para mejorar las propiedades del anticuerpo. Normalmente, esas modificaciones de la estructura se realizan para disminuir la inmunogenicidad del anticuerpo. Por ejemplo, un enfoque consiste en "retromutar" uno o más residuos estructurales en la secuencia de la línea germinal correspondiente. Más específicamente, un anticuerpo que ha sufrido una mutación somática puede contener residuos estructurales que difieren de la secuencia de la línea germinal a partir de la que ha obtenido el anticuerpo. Esos residuos pueden identificarse comparando las secuencias estructurales del anticuerpo con las secuencias de la línea germinal a partir de las que se ha obtenido el anticuerpo. Para que las secuencias de la región estructural vuelvan a su configuración de la línea germinal, las mutaciones somáticas se pueden "retromutar" a la secuencia de la línea germinal mediante, por ejemplo, mutagénesis dirigida al sitio. También se entiende que esos anticuerpos "retromutados" están incluidos.

Otro tipo de modificación de la estructura implica mutar uno o más residuos dentro de la región estructural, o incluso dentro de una o más regiones CDRs, para eliminar epítopos de linfocitos T y reducir así la inmunogenicidad potencial del anticuerpo. Este enfoque también se conoce como "desinmunización" y se describe con más detalle en el documento de publicación de patente de EE. UU. núm. 2003/0153043 de Carr et al.

Además o como alternativa a las modificaciones realizadas dentro de las regiones estructurales o CDRs, los anticuerpos pueden diseñarse para incluir modificaciones dentro de la región Fc, típicamente para alterar una o más propiedades funcionales del anticuerpo, tales como la semivida en suero, la fijación del complemento, la unión al receptor de Fc y/o la citotoxicidad celular dependiente de antígeno. Además, un anticuerpo se puede modificar químicamente (p. ej., se pueden unir uno o más restos químicos al anticuerpo) o se puede modificar para alterar su glicosilación, nuevamente para alterar una o más propiedades funcionales del anticuerpo. Cada uno de estos aspectos se describe con más detalle a continuación.

En un aspecto, la región bisagra de CH1 se modifica de manera que se altera el número de residuos de cisteína en la región bisagra. p. ej., aumentando o disminuyéndolos. Este enfoque se describe más detalladamente en el documento de patente de Ee . UU. núm. 5.677.425 de Bodmer et al. El número de residuos de cisteína en la región bisagra de CH1 se altera para, por ejemplo, facilitar el ensamblaje de las cadenas ligera y pesada o para aumentar o disminuir la estabilidad del anticuerpo.

En otro aspecto, se muta la región bisagra de Fc de un anticuerpo para disminuir la semivida biológica del anticuerpo. Más específicamente, se introducen una o más mutaciones de aminoácidos en la región interfaz del dominio<c>H2-CH3 del fragmento de la bisagra de Fc, de manera que el anticuerpo tiene una unión alterada a la proteína A de estafilococos (SpA) en relación con la unión de SpA del dominio de la bisagra de Fc natural. Este enfoque se describe con más detalle en el documento de patente de Ee . UU. núm. 6.165.745 de Ward et al.

Aún en otros aspectos, la región Fc se altera reemplazando al menos un residuo de aminoácido con un residuo de aminoácido diferente para alterar las funciones efectoras del anticuerpo. Por ejemplo, se puede reemplazar uno o más aminoácidos con un residuo de aminoácido diferente, de manera que el anticuerpo tenga una afinidad alterada hacia un ligando efector pero conserve la capacidad de unión al antígeno del anticuerpo original. El ligando efector hacia el cual se altera la afinidad puede ser, por ejemplo, un receptor de Fc o el componente C1 del complemento. Este enfoque se describe, p. ej., en los documentos de patente de EE. UU. núm. 5.624.821 y 5.648.260, ambos de Winter et al.

En otro aspecto, uno o más aminoácidos seleccionados a partir de residuos de aminoácidos pueden reemplazarse por un residuo de aminoácido diferente, de modo que el anticuerpo tiene la unión a C1q alterada y/o se ha reducido o abolido la citotoxicidad dependiente del complemento (CDC). Este enfoque se describe, p. ej., en el documento de patente de EE. UU. núm. 6.194.551 de Idusogie et al.

En otro aspecto, se alteran uno o más residuos de aminoácidos para alterar de ese modo la capacidad del anticuerpo para fijar el complemento. Este enfoque se describe, p. ej., en el documento de publicación PCT WO 94/29351 de Bodmer et al. En un aspecto específico, uno o más aminoácidos de un anticuerpo o fragmento del mismo que se une a antígeno de la presente divulgación, se reemplazan por uno o más residuos de aminoácidos alotípicos, para la subclase IgG1 y el isotipo kappa. Los residuos de aminoácidos alotípicos también incluyen, pero no se limitan a, la región constante de la cadena pesada de las subclases IgG1, IgG2 e IgG3 así como la región constante de la cadena ligera del isotipo kappa, como se describe en Jefferis et al., MAbs. 1:332-338 (2009).

En otro aspecto más, la región Fc se modifica para aumentar la capacidad del anticuerpo para mediar en la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC) y/o para aumentar la afinidad del anticuerpo hacia un receptor de F<cy>modificando uno o más aminoácidos. Este enfoque se describe, p. ej., en el documento de publicación PCT WO 00/42072 de Presta. Además, se han cartografiado los sitios de unión sobre IgG1 humana para F<cy>R1, F<cy>RII, F<cy>RIII y FcRn y se han descrito variantes con unión mejorada (véase, Shields et al., J. Biol. Chem. 276:6591-6604, 2001).

En otro aspecto más, se modifica la glicosilación de un anticuerpo. Por ejemplo, se puede producir un anticuerpo aglicosilado (es decir, el anticuerpo carece de glicosilación). La glicosilación se puede alterar, por ejemplo, para aumentar la afinidad del anticuerpo hacia el "antígeno". Esas modificaciones de carbohidratos se pueden lograr, por ejemplo, alterando uno o más sitios de glicosilación dentro de la secuencia del anticuerpo. Por ejemplo, se pueden realizar una o más sustituciones de aminoácidos que dan como resultado la eliminación de uno o más sitios de glicosilación estructurales de la región variable para eliminar de ese modo la glicosilación en ese sitio. Esa aglicosilación puede aumentar la afinidad del anticuerpo hacia el antígeno. Este enfoque se describe, p. ej., en los documentos de patente de EE. UU. núm. 5.714.350 y 6.350.861 de Co et al.

Adicional o alternativamente, se puede preparar un anticuerpo que tiene un tipo alterado de glicosilación, tal como un anticuerpo hipofucosilado que tiene cantidades reducidas de residuos de fucosilo o un anticuerpo que tiene estructuras de GlcNac bisectantes aumentadas. Se ha demostrado que esos patrones de glicosilación alterados aumentan la capacidad ADCC de los anticuerpos. Tales modificaciones de carbohidratos se pueden lograr, por ejemplo, expresando el anticuerpo en una célula hospedadora con una maquinaria de glicosilación alterada. En la técnica se han descrito células con maquinaria de glicosilación alterada y pueden usarse como células hospedadoras en las que expresar anticuerpos recombinantes para producir de ese modo un anticuerpo con glicosilación alterada. Por ejemplo, el documento EP 1.176.195 de Hang et al. describe una línea celular con un gen FUT8 funcionalmente alterado, que codifica una fucosiltransferasa, de modo que los anticuerpos expresados en esa línea celular presentan hipofucosilación. El documento de publicación PCT WO 03/035835 de Presta describe una línea celular CHO variante, células Lecl3, con capacidad reducida para fijar fucosa a carbohidratos unidos a Asn(297), lo que también da lugar a una hipofucosilación de los anticuerpos expresados en esa célula hospedadora (véase, también Shields et al., (2002) J. Biol. Chem. 277:26733-26740). El documento de publicación PCT WO 99/54342 de Umana et al. describe líneas celulares diseñadas para expresar glicosiltransferasas modificadoras de glicoproteínas (p. ej., beta(1,4)-N acetilglucosaminiltransferasa III (GnTIII)), de modo que los anticuerpos expresados en las líneas celulares diseñadas exhiben un aumento de las estructuras con GlcNac bisectantes, lo que da como resultado una mayor actividad ADCC de los anticuerpos (véase, también Umana et al., Nat. Biotech. 17:176-180, 1999).

En otro aspecto, el anticuerpo se modifica para aumentar su semivida biológica. Son posibles diversos enfoques. Por ejemplo, se puede introducir una o más de las siguientes mutaciones: T252L, T254S, T256F, como se describe en el documento de patente de EE. UU. núm. 6.277.375 de Ward. Alternativamente, para aumentar la semivida biológica, se puede alterar el anticuerpo dentro de la región CH1 o CL para que contenga un epítopo de unión al receptor de rescate tomado de dos bucles de un dominio CH2 de una región Fc de una IgG, como se describe en los documento de patente de EE. UU. núm. 5.869.046 y 6.121.022 de Presta et al.

Para minimizar la actividad ADCC de un anticuerpo, mutaciones específicas en la región Fc dan como resultado anticuerpos con "Fc silencioso" que tienen una interacción mínima con las células efectoras. En general, la "región Fc de IgG" se usa para definir la región C-terminal de una cadena pesada de inmunoglobulina, incluyendo la región Fc de secuencia natural y las regiones Fc variantes. La región Fc de la cadena pesada de IgG humana se define generalmente como la que comprende los residuos de aminoácidos desde la posición C226 o desde P230 hasta el extremo carboxilo del anticuerpo IgG. La numeración de residuos en la región Fc es la del índice EU de Kabat. La lisina C-terminal (residuo K447) de la región Fc puede eliminarse, por ejemplo, durante la producción o purificación del anticuerpo.

Las funciones efectoras silenciadas se pueden obtener mediante mutación en la región Fc de los anticuerpos y se han descrito en la técnica: LALA y N297A (Strohl, W., 2009, Curr. Opin. Biotechnol. vol. 20(6):685-691); y D265A (Baudino et al., 2008, J. Immunol. 181: 6664-69), véase también Heusser et al., documento WO2012065950. Ejemplos de anticuerpos IgG1 Fc silenciosos son el mutante LALA que comprende las mutaciones L234A y L235A en la secuencia de aminoácidos de Fc de IgG1. Otro ejemplo de un anticuerpo lgG1 silencioso es la mutación DAPA (D265A, P329A) (documento US 6.737.056). Otro anticuerpo lgG1 silencioso comprende la mutación N297A, que da como resultado anticuerpos aglicosilados/no glicosilados.

Los anticuerpos silenciosos Fc dan como resultado una actividad ADCC nula o baja, lo que significa que un anticuerpo con Fc silencioso muestra una actividad ADCC que está por debajo del 50% de lisis celular específica (baja actividad de ADCC), o que está por debajo del 1% de lisis celular específica (sin actividad ADCC).

3. Producción de anticuerpos anti-VP1

Los anticuerpos anti-VP1 y fragmentos de anticuerpos (p. ej., fragmentos que se unen a antígeno) de los mismos pueden producirse mediante cualquier medio conocido en la técnica, incluidos, pero no limitados a, expresión recombinante, síntesis química y digestión enzimática de tetrámeros de anticuerpos, mientras que los anticuerpos monoclonales de longitud completa pueden obtenerse mediante, p. ej., hibridoma o producción recombinante. La expresión recombinante puede ser a partir de cualquier célula hospedadora apropiada conocida en la técnica, por ejemplo, células hospedadoras de mamífero, células hospedadoras bacterianas, células hospedadoras de levadura, células hospedadoras de insecto, etc.

La divulgación proporciona además polinucleótidos que codifican los anticuerpos descritos en el presente documento, p. ej., polinucleótidos que codifican regiones o segmentos variables de la cadena pesada o ligera que comprenden las regiones determinantes de complementariedad como se describe en el presente documento. En algunos aspectos, el polinucleótido que codifica las regiones variables de la cadena pesada tiene al menos 85%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% de identidad de secuencia de ácido nucleico con un polinucleótido seleccionado a partir del grupo que consiste en SEQ ID NO: 13, 33, 53, 73, 93, 113, 133, 153, 173, 193, 213, 233, 253, 273 y 293. En algunos aspectos, el polinucleótido que codifica las regiones variables de la cadena ligera tiene al menos 85%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100 % de identidad de secuencia de ácido nucleico con un polinucleótido seleccionado a partir del grupo que consiste en SEQ ID NO: 23, 43, 63, 83, 103, 123, 143, 163, 183, 203, 223, 243, 263, 283 y 303.

En algunos aspectos, el polinucleótido que codifica la cadena pesada tiene al menos 85%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% de identidad de secuencia de ácido nucleico con un polinucleótido de SEQ ID NO: 15, 35, 55, 75, 95, 115, 135, 155, 175, 195, 215, 235, 255, 275 y 295. En algunos aspectos, el polinucleótido que codifica la cadena ligera tiene al menos 85%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% de identidad de secuencia de ácido nucleico con un polinucleótido de SEQ ID NO: 25, 45, 65, 85, 105, 125, 145, 165, 185, 205, 225, 245, 265, 285 y 305.

Los polinucleótidos de la presente divulgación pueden codificar solo la secuencia de la región variable de un anticuerpo anti-VP1. También pueden codificar tanto una región variable como una región constante del anticuerpo. Algunas de las secuencias de polinucleótidos codifican un polipéptido que comprende regiones variables tanto de la cadena pesada como de la cadena ligera de uno de los anticuerpos anti-VP1 ejemplificados. Algunos otros polinucleótidos codifican dos segmentos polipeptídicos que, respectivamente, son sustancialmente idénticos a las regiones variables de la cadena pesada y la cadena ligera de uno de los anticuerpos de ratón.

Las secuencias de polinucleótidos pueden producirse mediante síntesis de nuevo de ADN en fase sólida o mediante mutagénesis con p Cr de una secuencia existente (p. ej., secuencias tal como se describen en los Ejemplos siguientes) que codifican un anticuerpo anti-VP1 o su fragmento de unión. La síntesis química directa de ácidos nucleicos se puede lograr mediante métodos conocidos en la técnica, tales como el método del fosfotriéster de Narang et al., Meth. Enzimol. 68:90, 1979; el método del fosfodiéster de Brown et al., Meth. Enzimol. 68:109, 1979; el método de la dietilfosforamidita. Beaucage et al., Tetra. Lett., 22:1859, 1981; y el método de soporte sólido del documento de patente de EE. UU. núm. 4.458.066. La introducción de mutaciones en una secuencia de polinucleótidos mediante PCR se puede realizar tal como se describe, p. ej., en PCR Technology: Principles and Applications for DNA Amplification, H.A. Erlich (Ed.), Freeman Press, NY, n Y, 1992; PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Innis et al. (Ed.), Academic Press, San Diego, CA, 1990; Mattila et al., Nucleic Acids Res. 19:967, 1991; y Eckert et al., PCR Methods and Applications 1:17, 1991.

También se proporcionan en la presente divulgación vectores de expresión y células hospedadoras para producir los anticuerpos anti-VP1 descritos anteriormente. Se pueden emplear diversos vectores de expresión para expresar los polinucleótidos que codifican las cadenas o fragmentos de unión del anticuerpo anti-VP1. Se pueden usar vectores de expresión tanto virales como no virales para producir los anticuerpos en una célula hospedadora de mamífero. Los vectores y sistemas no virales incluyen plásmidos, vectores episomales, típicamente con un casete de expresión para expresar una proteína o ARN y cromosomas humanos artificiales (véase, p. ej., Harrington et al., Nat Genet 15:345, 1997). Por ejemplo, vectores no virales útiles para la expresión de polinucleótidos y polipéptidos anti-VP1 en células de mamífero (p. ej., humanas) incluyen pThioHis A, B y C, pcDNA3.1/His, pEBVHis A, B y C (Invitrogen, San Diego, CA), vectores MPSV y muchos otros vectores conocidos en la técnica para expresar otras proteínas. Los vectores virales útiles incluyen vectores basados en retrovirus, adenovirus, virus adenoasociados, virus del herpes, vectores basados en SV40, virus del papiloma, virus HBP de Epstein Barr, vectores de virus vaccinia y virus del bosque de Semliki (SFV). Mira, Brent. et al., supra; Smith, Annu. Rev. Microbiol. 49:807, 1995; y Rosenfeld et al., Cell 68:143, 1992.

La elección del vector de expresión depende de las células hospedadoras previstas en donde se va a expresar el vector. Normalmente, los vectores de expresión contienen un promotor y otras secuencias reguladoras (p. ej., potenciadoras) que están ligados funcionalmente a los polinucleótidos que codifican una cadena o fragmento del anticuerpo anti-VP1. En algunos aspectos, se emplea un promotor inducible para prevenir la expresión de secuencias insertadas, excepto en condiciones inductoras. Los promotores inducibles incluyen, p. ej., arabinosa, lacZ, promotor de metalotioneína o un promotor de choque térmico. Los cultivos de organismos transformados se pueden expandir en condiciones no inductoras sin sesgar la población para que codifique secuencias cuyos productos de expresión sean mejor tolerados por las células hospedadoras. Además de los promotores, también pueden ser necesarios o deseados otros elementos reguladores para una expresión eficaz de una cadena o fragmento de anticuerpo anti-VP1. Esos elementos normalmente incluyen un codón de iniciación ATG y un sitio de unión al ribosoma adyacente u otras secuencias. Además, la eficacia de la expresión puede mejorarse mediante la inclusión de potenciadores apropiados para el sistema celular en uso (véase, p. ej., Scharf et al., Results Probl. Cell Differ. 20:125, 1994; y Bittner et al., Meth. Enzymol., 153:516, 1987). Por ejemplo, se puede usar el potenciador de SV40 o el potenciador de CMV para aumentar la expresión en células hospedadoras de mamífero.

Los vectores de expresión también pueden proporcionar una posición de la secuencia señal de secreción para formar una proteína de fusión con polipéptidos codificados por secuencias del anticuerpo anti-VP1 insertadas. Más a menudo, las secuencias del anticuerpo anti-VP1 insertadas se unen a secuencias señal antes de su inclusión en el vector. Los vectores que se van a usar para recibir secuencias que codifican dominios variables de la cadena ligera y pesada del anticuerpo anti-VP1, a veces también codifican regiones constantes o partes de las mismas. Esos vectores permiten la expresión de las regiones variables como proteínas de fusión con las regiones constantes, lo que conduce a la producción de anticuerpos intactos o fragmentos de los mismos. Normalmente, esas regiones constantes son humanas.

Las células hospedadoras en donde albergar y expresar las cadenas de anticuerpos anti-VP1 pueden ser procariotas o eucariotas.E. colies un hospedador procariota útil para clonar y expresar los polinucleótidos de la presente divulgación. Otros hospedadores microbianos adecuados para el uso incluyen bacilos, tales comoBacillus subtilisy otras enterobacterias, tales comoSalmonella, Serratiay diversas especies dePseudomonas.En esos hospedadores procariotas también se pueden crear vectores de expresión, que normalmente contienen secuencias de control de la expresión compatibles con la célula hospedadora (p. ej., un origen de replicación). Además, estará presente cualquier cantidad entre una variedad de promotores bien conocidos, tales como el sistema promotor de lactosa, un sistema promotor de triptófano (trp), un sistema promotor de beta-lactamasa o un sistema promotor del fago lambda. Los promotores normalmente controlan la expresión, opcionalmente con una secuencia operadora y tienen secuencias de sitios de unión a ribosomas y similares, para iniciar y completar la transcripción y la traducción. También se pueden emplear otros microbios, como la levadura, para expresar polipéptidos anti-VP1. También se pueden utilizar células de insecto en combinación con vectores de baculovirus.

En otros aspectos, se usan células hospedadoras de mamífero para expresar y producir los polipéptidos anti-VP1 de la presente divulgación. Por ejemplo, puede ser una línea celular de hibridoma que expresa genes de inmunoglobulina endógena (p. ej., los clones de hibridoma de mieloma tal como se describen en los Ejemplos) o una línea celular de mamífero que alberga un vector de expresión exógeno. Estas incluyen cualquier célula humana o animal mortal normal o inmortal normal o anormal. Por ejemplo, se han desarrollado varias líneas celulares hospedadoras adecuadas capaces de secretar inmunoglobulinas intactas, incluidas las líneas celulares CHO, diversas líneas celulares COS, células HeLa, líneas celulares de mieloma, linfocitos B transformados e hibridomas. El uso de cultivos de células de tejido de mamíferos para expresar polipéptidos se analiza generalmente, p. ej., en Winnacker, From Genes to Clones, VCH Publishers, Nueva York, Nueva York, 1987. Los vectores de expresión para células hospedadoras de mamífero pueden incluir secuencias de control de la expresión, tales como un origen de replicación, un promotor y un potenciador (véase, p. ej., Queen et al., Immunol. Rev. 89:49-68, 1986) y sitios de información necesarios para el procesamiento, como sitios de unión a ribosomas, sitios de corte y empalme de ARN, sitios de poliadenilación y secuencias terminadoras de la transcripción. Esos vectores de expresión normalmente contienen promotores obtenidos a partir de genes de mamífero o de virus de mamífero. Los promotores adecuados pueden ser constitutivos, específicos de un tipo celular, específicos de una etapa y/o modulables o regulables. Los promotores útiles incluyen, pero no se limitan a, el promotor de metalotioneína, el promotor tardío principal de adenovirus constitutivo, el promotor de MMTV inducible con dexametasona, el promotor de SV40, el promotor de MRP polIII, el promotor constitutivo de MPSV, el promotor de CMV inducible con tetraciclina (tal como el promotor inmediato-temprano humano de CMV), el promotor constitutivo de CMV y combinaciones de promotor-potenciador conocidas en la técnica.

Los métodos para introducir vectores de expresión que contienen las secuencias de polinucleótidos de interés varían dependiendo del tipo de hospedador celular. Por ejemplo, la transfección con cloruro de calcio se utiliza comúnmente para células procariotas, mientras que el tratamiento con fosfato de calcio o la electroporación se pueden usar para otros hospedadores celulares (véase, en general Sambrook et al., supra). Otros métodos incluyen, p. ej., electroporación, tratamiento con fosfato cálcico, transformación mediada por liposomas, inyección y microinyección, métodos balísticos, virosomas, inmunoliposomas, conjugados de policatión:ácido nucleico, ADN desnudo, viriones artificiales, fusión con la proteína estructural VP22 del virus del herpes (Elliot y O'Hare, Cell 88:223, 1997), captación de ADN mejorada por agentes y transducciónex vivo.Para la producción de proteínas recombinantes a largo plazo y de alto rendimiento, a menudo será deseable una expresión estable. Por ejemplo, se pueden preparar líneas celulares que expresan de manera estable cadenas de anticuerpos anti-VP1 o fragmentos de unión usando vectores de expresión que contienen orígenes de replicación virales o elementos de expresión endógenos y un gen marcador seleccionable. Después de la introducción del vector, se puede permitir que las células crezcan durante 1 a 2 días en un medio enriquecido antes de cambiarlas a un medio selectivo. El objetivo del marcador seleccionable es conferir resistencia a la selección y su presencia permite el crecimiento de células que expresan con éxito las secuencias introducidas en medios selectivos. Las células resistentes transfectadas de forma estable pueden proliferar usando técnicas de cultivo de tejidos apropiadas para el tipo de célula.

Usos terapéuticos y diagnósticos

Los anticuerpos, fragmentos de anticuerpos (p. ej., fragmentos que se unen a antígeno) de la presente divulgación son útiles en una variedad de aplicaciones que incluyen, pero no se limitan a, infección y enfermedad viral con poliomas. En ciertos aspectos, los anticuerpos, fragmentos de anticuerpos (p. ej., fragmentos que se unen a antígeno) son útiles para neutralizar la infección por BKV o JCV y la prevención o el tratamiento de la nefropatía por el virus BK (por ejemplo, BKVAN). Los métodos de uso pueden ser métodosin vitro, ex vivooin vivo.

En un aspecto, los anticuerpos, fragmentos de anticuerpos (p. ej., fragmentos que se unen a antígeno), son útiles para detectar la presencia de BKV en una muestra biológica. El término "detección", tal como se utiliza en el presente documento, incluye una detección cuantitativa o cualitativa. En ciertos aspectos, una muestra biológica comprende una célula o tejido. En ciertos aspectos, esos tejidos incluyen tejidos normales y/o cancerosos que expresan BKV en niveles más altos en relación con otros tejidos.

En un aspecto, la presente divulgación proporciona un método para detectar la presencia de BKV en una muestra biológica. En ciertos aspectos, el método comprende poner en contacto la muestra biológica con un anticuerpo anti-VP1 en condiciones que permiten la unión del anticuerpo con el antígeno y detectar si se forma un complejo entre el anticuerpo y el antígeno. La muestra biológica puede incluir, sin limitación, muestras de orina o sangre.

También se incluye un método para diagnosticar un trastorno asociado con la expresión del virus BKV o JCV. En ciertos aspectos, el método comprende poner en contacto una célula de una prueba con un anticuerpo anti-VP1; determinar el nivel de expresión (cuantitativa o cualitativamente) del virus BK en la célula de la prueba detectando la unión del anticuerpo anti-VP1 al virus BK; y comparar el nivel de infección en la célula de la prueba con el nivel de infección del virus BK en una célula de control (p. ej., una célula normal del mismo origen tisular que la célula de la prueba o una célula no infectada con el virus BK), en donde un mayor nivel de presencia de virus B<k>en la célula de la prueba en comparación con la célula de control, indica la presencia de un trastorno asociado con la infección con virus BK. En ciertos aspectos, la célula de prueba se obtiene a partir de un individuo sospechoso de tener una infección por el virus BK.

En ciertos aspectos, un método de diagnóstico o detección, tal como los descritos anteriormente, comprende detectar la unión de un anticuerpo anti-VP1 con una célula infectada por BKV. Un ensayo ejemplar para detectar la unión de un anticuerpo anti-VP1 con una célula infectada con BKV es un ensayo "FACS".

Se pueden utilizar otros métodos para detectar la unión de anticuerpos anti-VP1. Esos métodos incluyen, pero no se limitan a, ensayos de unión a antígeno que son bien conocidos en la técnica, tales como transferencias Western, radioinmunoensayos, ELISA (ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas), inmunoensayos de tipo "sándwich", ensayos de inmunoprecipitación, inmunoensayos fluorescentes, inmunoensayos de proteína A e inmunohistoquímica (IHC).

En ciertos aspectos, los anticuerpos anti-VP1 están marcados. Los marcadores incluyen, pero no se limitan a, marcadores o restos que se detectan directamente (tales como marcadores fluorescentes, cromóforos, de densidad de electrones, quimioluminiscentes y radiactivos), así como restos, tales como enzimas o ligandos, que se detectan indirectamente, p. ej., mediante una reacción enzimática o interacción molecular.

En ciertos aspectos, los anticuerpos anti-VP1 están inmovilizados sobre una matriz insoluble. La inmovilización implica separar el anticuerpo anti-VP1 de cualquier proteína de BKV o JCV que permanezca libre en solución. Esto se logra convencionalmente ya sea insolubilizando el anticuerpo anti-VP1 antes del procedimiento de ensayo, o mediante una adsorción a una matriz o superficie insoluble en agua (Bennich et al., documento de patente de EE. UU. núm.

3.720.760), o mediante acoplamiento covalente (por ejemplo, usando reticulación con glutaraldehído), o mediante insolubilización del anticuerpo anti-VP1 después de la formación de un complejo entre el anticuerpo anti-VP1 y la proteína BKV o JCV, p. ej., por inmunoprecipitación.

Cualquiera de los aspectos anteriores de diagnóstico o detección se puede llevar a cabo usando un anticuerpo anti-VP1 de la presente divulgación en lugar de o además de otro anticuerpo anti-VP1.

En un aspecto, la divulgación proporciona un método para tratar, reducir la probabilidad o mejorar una enfermedad que comprende administrar los anticuerpos, fragmentos de anticuerpos (p. ej., fragmentos que se unen a antígeno), a un paciente, tratando así la enfermedad. En ciertos aspectos, la enfermedad tratada con los anticuerpos, fragmentos de anticuerpos (p. ej., fragmentos que se unen a antígeno), es una infección con virus BK o JC. Ejemplos de enfermedades porK<v>y JCV que pueden tratarse y/o prevenirse incluyen, pero no se limitan a, nefropatía, cistitis hemorrágica, leucoencefalopatía multifocal progresiva (LMP), enfermedad renal intersticial, estenosis ureteral, neuronopatía de células granulares (NCG), vasculitis, colitis, retinitis, meningitis y síndrome inflamatorio de reconstitución inmune (SIRI). En ciertos aspectos, la infección se caracteriza por células que expresan BKV o JCV a las que pueden unirse específicamente los anticuerpos anti-VP1, fragmentos de anticuerpos (p. ej., fragmentos que se unen a antígeno).

La presente divulgación proporciona métodos para tratar una infección viral con BK y BKVAN que comprenden administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de los anticuerpos, fragmentos de anticuerpos (p. ej., fragmentos que se unen a antígeno). En ciertos aspectos, el sujeto es un ser humano.

En ciertos aspectos, el método para reducir la infección viral por BK comprende administrar a un sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz de anticuerpos o fragmentos de anticuerpos (p. ej., fragmentos que se unen a antígeno). En ciertos aspectos, el sujeto es un ser humano. En ciertos aspectos, el sujeto está inmunodeprimido. Para sujetos inmunodeprimidos, la cantidad de inmunosupresión puede aumentar o disminuir debido a los efectos terapéuticos de los anticuerpos anti-VP1.

En ciertos aspectos, el tejido trasplantado está infectado con el virus BK al que se une el anticuerpo anti-VP1. Como la incidencia de infección por BK en la población general es alta, existe una alta probabilidad de que, en caso de un trasplante de riñón, el paciente que acepta el riñón sea positivo para el virus BK o el donante que proporciona el riñón sea positivo para el virus BK, o ambos sean positivos para el virus BK. Para prevenir una BkVa N, se pueden administrar anticuerpos anti-VP1 al receptor del trasplante de riñón, antes y/o después de proceder al trasplante de riñón, dependiendo de la seropositividad del donante de riñón o del receptor del trasplante. En otro aspecto, los anticuerpos anti-VP1 se pueden administrar al paciente cuando se detecta virus en la orina (viruria), o cuando se detecta virus en la sangre (viremia).

Para el tratamiento de una infección con el virus BK o JCV, la dosificación adecuada de anticuerpos o fragmentos de anticuerpos (p. ej., fragmentos que se unen a antígeno), depende de varios factores, como el tipo de infección que se va a tratar, la gravedad y el curso de la infección, la capacidad de respuesta de la infección, la generación de resistencia viral a la terapia, la terapia previa, la historia clínica del paciente y demás factores. El anticuerpo se puede administrar una vez o durante una serie de tratamientos que duran desde varios días hasta varios meses, o hasta que se logra una curación o se logra una disminución de la infección (p. ej., reducción de la viruria o del daño viral en el riñón). Las pautas de dosificación óptimas se pueden calcular a partir de mediciones de la acumulación del fármaco en el cuerpo del paciente y variarán dependiendo de la potencia relativa de un anticuerpo individual o un fragmento de anticuerpo (p. ej., un fragmento que se une a antígeno). En determinados aspectos, la dosificación es de 0,01 mg a 10 mg (p. ej., 0,01 mg, 0,05 mg, 0,1 mg, 0,5 mg, 1 mg, 2 mg, 3 mg, 4 mg, 5 mg, 7 mg, 8 mg, 9 mg o 10 mg) por kg de peso corporal y se puede administrar una o más veces al día, semanal, mensual o anualmente. En ciertos aspectos, el anticuerpo o un fragmento de anticuerpo (p. ej., un fragmento que se une a antígeno), de la presente divulgación, se administra una vez cada dos semanas o una vez cada tres semanas. El médico tratante puede estimar las tasas de repetición de la dosificación basándose en la semivida medida y las concentraciones del anticuerpo en fluidos o tejidos corporales.

Terapia de combinación

En ciertos casos, el anticuerpo o fragmento de anticuerpo (p. ej., fragmento que se une a antígeno), de la presente divulgación se combina con otros agentes terapéuticos, tales como otros agentes antivirales, agentes antialérgicos, agentes contra las náuseas (o antieméticos), analgésicos, agentes citoprotectores, inmunosupresores y combinaciones de los mismos.

La expresión "combinación farmacéutica" tal como se usa en el presente documento, se refiere a una combinación fija en una forma unitaria de dosificación o a una combinación no fija o un kit de partes para la administración combinada en donde dos o más agentes terapéuticos pueden administrarse independientemente al mismo tiempo o por separado dentro de intervalos de tiempo, especialmente cuando esos intervalos de tiempo permiten que los miembros de la combinación muestren un efecto cooperativo, p. ej., un efecto sinérgico.

La expresión "terapia combinada" se refiere a la administración de dos o más agentes terapéuticos para tratar una afección o infección terapéutica descrita en la presente divulgación. Esa administración incluye la coadministración de esos agentes terapéuticos de manera sustancialmente simultánea, tal como en una única cápsula que tiene una proporción fija de ingredientes activos. Alternativamente, esa administración incluye la coadministración en recipientes múltiples o separados (p. ej., cápsulas, polvos y líquidos) para cada ingrediente activo. Los polvos y/o líquidos se pueden reconstituir o diluir hasta una dosis deseada antes de la administración. Además, esa administración también incluye el uso de cada tipo de agente terapéutico de manera secuencial, ya sea aproximadamente al mismo tiempo o en momentos diferentes. En cualquier caso, el régimen de tratamiento proporcionará efectos beneficiosos de la combinación de fármacos en el tratamiento de las afecciones o trastornos descritos en el presente documento.

La terapia combinada puede proporcionar "sinergia" y resultar "sinérgica", es decir, el efecto logrado cuando los ingredientes activos se usan juntos es mayor que la suma de los efectos que resultan del uso de los compuestos por separado. Se puede lograr un efecto sinérgico cuando los ingredientes activos están: (1) coformulados y administrados o administrados simultáneamente en una formulación de dosificación unitaria combinada; (2) administrados mediante alternancia o en paralelo como formulaciones separadas; o (3) mediante algún otro régimen. Cuando se administran en una terapia de alternancia, se puede lograr un efecto sinérgico cuando los compuestos se administran o entregan secuencialmente, p. ej., mediante diferentes inyecciones en jeringas distintas. En general, durante la terapia de alternancia, se administra secuencialmente una dosificación eficaz de cada ingrediente activo, es decir, en serie, mientras que en la terapia combinada, se administran juntas dosificaciones efectivas de dos o más ingredientes activos.

En un aspecto, la presente divulgación proporciona un método para tratar la infección por BKV o JCV administrando a un sujeto que lo necesita un anticuerpo junto con terapias inmunosupresoras. Los anticuerpos anti-VP1 actuarán de forma profiláctica para neutralizar la infección primaria por BKV o JCV o una reactivación viral resultante de la terapia inmunosupresora antes o después del trasplante. Ejemplos de terapia inmunosupresora incluyen, pero no se limitan a; un inhibidor de la monofosfato deshidrogenasa, un inhibidor de la síntesis de purinas, un inhibidor de la calcineurina o un inhibidor de mTOR. Ejemplos específicos de terapias inmunosupresoras incluyen, pero no se limitan a; micofenolato de mofetilo (MMF), micofenolato de sodio, azatioprina, tacrolimús, sirolimús y ciclosporina.

Composiciones farmacéuticas

Para preparar composiciones farmacéuticas o estériles que incluyen anticuerpos anti-VP1, los anticuerpos de la presente divulgación se mezclan con un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable. Las composiciones pueden contener adicionalmente uno o más agentes terapéuticos que sean adecuados para neutralizar la infección por BKV o JCV.

Las formulaciones de agentes terapéuticos y de diagnóstico se pueden preparar mezclándolas con vehículos, excipientes o estabilizadores fisiológicamente aceptables en forma, p. ej., de polvos liofilizados, suspensiones, soluciones acuosas, lociones o suspensiones (véase, p. ej., Hardman et al., Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, McGraw-Hill, New York, N.Y., 2001; Gennaro, Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Lippincott, Williams, and Wilkins, New York, N.Y., 2000; Avis, et al. (eds.), Pharmaceutical Dosage Forms: Parenteral Medications, Marcel Dekker, NY, 1993; Lieberman, et al. (eds.), Pharmaceutical Dosage Forms: Tablets, Marcel Dekker, NY, 1990; Lieberman, et al. (eds.) Pharmaceutical Dosage Forms: Disperse Systems, Marcel Dekker, NY, 1990; Weiner and Kotkoskie, Excipient Toxicity and Safety, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., 2000).

En un aspecto específico, el anticuerpo anti-VP1 es un material liofilizado en un vial que contiene el anticuerpo. El liofilizado se puede reconstituir con agua o un vehículo farmacéutico adecuado para inyección. Para una administración intravenosa posterior, la solución obtenida normalmente se diluirá aún más en una solución portadora.

Los anticuerpos descritos en el presente documento son útiles en la neutralización de BKV o JCV en pacientes con un trasplante de tejido que pueden estar inmunosuprimidos, por lo que se puede utilizar un vehículo farmacéutico de sacarosa y albúmina humana, como el utilizado anteriormente en pacientes con trasplante de médula ósea que reciben CytoGam® (DeRienzo et al. Pharmacotherapy 2000; 20:1175-8). Alternativamente, los anticuerpos anti-VP1 se pueden introducir en pacientes trasplantados a través de un vehículo farmacéutico, como se describe para otro anticuerpo antiviral, Synagis®, tal como se describe en el documento WO2003/105894. En esa publicación, el vehículo farmacéutico estaba compuesto por histidina y/o glicina, un sacárido (por ejemplo, sacarosa) y un poliol (por ejemplo, polisorbato).

La selección de un régimen de administración para un tratamiento depende de varios factores, incluida la gravedad de la infección, el nivel de los síntomas y la accesibilidad a las células diana en la matriz biológica. En ciertos aspectos, un régimen de administración maximiza la cantidad de agente terapéutico administrado al paciente de manera consistente con un nivel aceptable de efectos secundarios. En consecuencia, la cantidad de agente biológico administrado depende en parte de la entidad particular y de la gravedad de la afección que se está tratando. Se dispone de una orientación para seleccionar dosis apropiadas de anticuerpos, citocinas y moléculas pequeñas (véanse, p. ej., Wawrzynczak, Antibody Therapy, Bios Scientific Pub. Ltd, Oxfordshire,K, 1996; Kresina (ed.), Monoclonal Antibodies, Cytokines and Arthritis, Marcel Dekker, New York, N.Y., 1991; Bach (ed.), Monoclonal Antibodies and Peptide Therapy in Autoimmune Diseases, Marcel Dekker, New York, N.Y., 1993; Baert et al., New Engl. J. Med. 348:601-608, 2003; Milgrom et al., New Engl. J. Med. 341:1966-1973, 1999; Slamon et al., New Engl. J. Med. 344:783-792, 2001; Beniaminovitz et al., New Engl. J. Med. 342:613-619, 2000; Ghosh et al., New Engl. J. Med.

348:24-32, 2003; Lipsky et al., New Engl. J. Med. 343:1594-1602, 2000).

La determinación de la dosis adecuada la realiza el médico, p. ej., utilizando parámetros o factores conocidos o sospechados en la técnica que afectan el tratamiento o que se prevé que afectarán el tratamiento. Generalmente, la dosis comienza con una cantidad algo menor de la dosis óptima y se aumenta a continuación en pequeños incrementos hasta que se logra el efecto deseado u óptimo, en relación con cualquier efecto secundario negativo. Las mediciones importantes para el diagnóstico incluyen las de los síntomas, p. ej., de reacciones de infusión.

Los niveles de dosificación reales de los ingredientes activos en las composiciones farmacéuticas con los anticuerpos anti-VP1 se pueden variar para obtener una cantidad de ingrediente activo que sea eficaz para lograr la respuesta terapéutica deseada para un paciente, composición y modo de administración en particular, sin resultar tóxica para el paciente. El nivel de dosificación seleccionado dependerá de una variedad de factores farmacocinéticos que incluyen la actividad neutralizante de los anticuerpos, la vía de administración, el momento de la administración, la semivida del anticuerpo en el paciente, la duración del tratamiento, otros fármacos, compuestos y/o materiales usados en combinación con las composiciones particulares empleadas, edad, sexo, peso, estado, salud general e historial médico previo del paciente que está siendo tratado y factores similares conocidos en las técnicas médicas.

Las composiciones que comprenden anticuerpos o fragmentos de los mismos pueden proporcionarse mediante infusión continua o mediante dosis a intervalos, p. ej., de un día, una semana o de 1 a 7 veces por semana. Las dosis pueden administrarse por vía intravenosa, subcutánea, tópica, oral, nasal, rectal, intramuscular, intracerebral o por inhalación. Un protocolo de dosis específico es aquel que implica la dosis máxima o la frecuencia de dosis que evita efectos secundarios indeseables significativos.

Para los anticuerpos descritos en el presente documento, la dosificación administrada a un paciente puede ser de 0,0001 mg/kg a 100 mg/kg de peso corporal del paciente. La dosis puede estar entre 0,0001 mg/kg y 20 mg/kg, 0,0001 mg/kg y 10 mg/kg, 0,0001 mg/kg y 5 mg/kg, 0,0001 y 2 mg/kg, 0,0001 y 1 mg/kg, 0,0001 mg/kg y 0,75 mg/kg, 0,0001 mg/kg y 0,5 mg/kg, 0,0001 mg/kg a 0,25 mg/kg, 0,0001 a 0,15 mg/kg, 0,0001 a 0,10 mg/kg, 0,001 a 0,5 mg/kg, 0,01 a 0,25 mg/kg o 0,01 a 0,10 mg/kg de peso corporal del paciente. La dosificación de los anticuerpos o fragmentos de los mismos se puede calcular usando el peso del paciente en kilogramos (kg) multiplicado por la dosis que se va a administrar en mg/kg.

Las dosis de los anticuerpos pueden entonces repetirse y las administraciones pueden estar separadas por al menos 1 día, 2 días, 3 días, 5 días, 10 días, 15 días, 30 días, 45 días, 2 meses, 75 días, 3 meses o al menos 6 meses.

Una cantidad eficaz para un paciente en particular puede variar dependiendo de factores como la afección que se está tratando, la salud general del paciente, el método, la vía y la dosis de administración y la gravedad de los efectos secundarios (véase, p. ej., Maynard et al., A Handbook of SOPs for Good Clinical Practice, Interpharm Press, Boca Raton, Fla., 1996; Dent, Good Laboratory and Good Clinical Practice, Urch Publ., London, UK, 2001).

La vía de administración puede ser, p. ej., mediante aplicación tópica o cutánea, inyección o infusión por vía intravenosa, intraperitoneal, intracerebral, intramuscular, intraocular, intraarterial, intracerebroespinal, intralesional o mediante sistemas de liberación sostenida o un implante (véase, p. ej., Sidman et al., Biopolymers 22:547-556, 1983; Langer et al., J. Biomed. Mater. Res. 15:167-277, 1981; Langer, Chem. Tech. 12:98-105, 1982; Epstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:3688-3692, 1985; Hwang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4030-4034, 1980; documentos de patente de EE. UU. núm. 6.350.466 y 6.316.024). Cuando sea necesario, la composición también puede incluir un agente solubilizante o un anestésico local como lidocaína para aliviar el dolor en el lugar de la inyección, o ambos. Además, también se puede emplear una administración pulmonar, p. ej., mediante el uso de un inhalador o nebulizador y formulación con un agente aerosolizante. Véanse, p. ej., los documento de patente de EE. UU. núm. 6.019.968, 5.985.320, 5.985.309, 5.934.272, 5.874.064, 5.855.913, 5.290.540 y 4.880.078; y los documentos de publicación PCT WO 92/19244, WO 97/32572, WO 97/44013, WO 98/31346 y WO 99/66903, cada uno de los cuales se incorpora en este documento como referencia en su totalidad.

Una composición de la presente divulgación también se puede administrar mediante una o más vías de administración usando uno o más entre una variedad de métodos conocidos en la técnica. Como apreciará el experto en la técnica, la vía y/o el modo de administración variará dependiendo de los resultados deseados. Las vías de administración seleccionadas para los anticuerpos incluyen vías de administración intravenosa, intramuscular, intradérmica, intraperitoneal, subcutánea, espinal u otras vías de administración parenteral, por ejemplo, mediante inyección o infusión. La administración parenteral puede representar modos de administración distintos de la administración entérica y tópica, generalmente mediante inyección, e incluye, sin limitación, inyección e infusión intravenosa, intramuscular, intraarterial, intratecal, intracapsular, intraorbitaria, intracardíaca, intradérmica, intraperitoneal, transtraqueal, subcutánea, subcuticular, intraarticular, subcapsular, subaracnoidea, intraespinal, epidural e intraesternal. Alternativamente, una composición de la presente divulgación se puede administrar mediante una vía no parenteral, tal como una vía de administración tópica, epidérmica o mucosa, por ejemplo, intranasal, oral, vaginal, rectal, sublingual o tópica. En un aspecto, los anticuerpos de la presente divulgación se administran mediante infusión. En otro aspecto, los anticuerpos se administran por vía subcutánea.

Si los anticuerpos de la presente divulgación se administran en un sistema de liberación controlada o de liberación sostenida, se puede usar una bomba para lograr una liberación controlada o sostenida (véase, Langer, supra; Sefton, CRC Crit. Ref Biomed. Eng. 14:20, 1987; Buchwald et al., Surgery 88:507, 1980; Saudek et al., N. Engl. J. Med.

321:574, 1989). Se pueden utilizar materiales poliméricos para lograr la liberación controlada o sostenida de las terapias de los anticuerpos (véase, p. ej., Medical Applications of Controlled Release, Langer and Wise (eds.), CRC Pres., Boca Raton, Fla., 1974; Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance, Smolen and Ball (eds.), Wiley, New York, 1984; Ranger and Peppas, J. Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem. 23:61, 1983; véanse también Levy et al., Science 228:190, 1985; During et al., Ann. Neurol. 25:351, 1989; Howard et al., J. Neurosurg. 7 1:105, 1989; los documentos de patente de EE. UU. núm. 5.679.377; 5.916.597; 5.912.015; 5.989.463; 5.128.326; el documento de publicación PCT WO 99/15154; y el documento de publicación PCT WO 99/20253. Ejemplos de polímeros utilizados en formulaciones de liberación sostenida incluyen, pero no se limitan a, poli(metacrilato de 2-hidroxietilo), poli(metacrilato de metilo), poli(ácido acrílico), poli(etilen-co-acetato de vinilo), poli(ácido metacrílico), poliglicolidas (PLG), polianhídridos, poli(N-vinilpirrolidona), poli(alcohol vinílico), poliacrilamida, poli(etilenglicol), polilactidas (PLA), poli(lactida-co-glicolidas) (PLGA) y poliortoésteres. En un aspecto, el polímero usado en una formulación de liberación sostenida es inerte, está exento de impurezas lixiviables, es estable durante el almacenamiento, estéril y biodegradable. Se puede situar un sistema de liberación controlada o sostenida cerca del objetivo profiláctico o terapéutico, requiriendo así solo una fracción de la dosis sistémica (véase, p. ej., Goodson, en Medical Applications of Controlled Release, supra, vol. 2, págs. 115-138, 1984).

Los sistemas de liberación controlada se analizan en la revisión de Langer, Science 249:1527-1533, 1990. Se puede usar cualquier técnica conocida por un experto en la técnica para producir formulaciones de liberación sostenida que comprenden uno o más anticuerpos de la presente divulgación. Véanse, p. ej., el documento de patente de EE. U. núm. 4.526.938, el documento de publicación PCT WO 91/05548, el documento de publicación PCT WO 96/20698, Ning et al., Radiotherapy & Oncology 39:179-189, 1996; Song et al., PDA Journal of Pharmaceutical Science & Technology 50:372-397, 1995; Cleek et al., Pro. Int'l. Symp. Control. Rel. Bioact. Mater. 24:853-854, 1997; y Lam et al., Proc. Int'l. Symp. Control Rel. Bioact. Mater. 24:759-760, 1997, cada uno de los cuales se incorpora en este documento como referencia en su totalidad.

Si los anticuerpos de la divulgación se administran tópicamente, se pueden formular en forma de pomada, crema, parche transdérmico, loción, gel, pulverizador, aerosol, solución, emulsión u otra forma bien conocida por un experto en la materia. Véase, p. ej., Remington's Pharmaceutical Sciences and Introduction to Pharmaceutical Dosage Forms, 19a ed., Mack Pub. Co., Easton, Pa. (1995). Para las formas de dosificación tópicas no pulverizables, normalmente se emplean formas de viscosas a semisólidas o sólidas que comprenden un vehículo o uno o más excipientes compatibles con la aplicación tópica y que tienen una viscosidad dinámica, en algunos casos, mayor que la del agua. Las formulaciones adecuadas incluyen, sin limitación, soluciones, suspensiones, emulsiones, cremas, ungüentos, polvos, linimentos, pomadas y similares, que, si se desea, se esterilizan o se mezclan con agentes auxiliares (p. ej., agentes conservantes, estabilizadores, agentes humectantes, tampones o sales) para influir sobre diversas propiedades, como por ejemplo, la presión osmótica. Otras formas de dosificación tópica adecuadas incluyen preparaciones en aerosol pulverizables, en donde el ingrediente activo, en algunos casos, en combinación con un vehículo inerte sólido o líquido, se envasa en una mezcla con un agente volátil presurizado (p. ej., un propulsor gaseoso, como freón) o en una botella comprimible. También se pueden añadir agentes hidratantes o humectantes a las composiciones farmacéuticas y formas de dosificación, si se desea. Son bien conocidos en la técnica ejemplos de tales ingredientes adicionales.

Si las composiciones que comprenden los anticuerpos se administran por vía intranasal, se pueden formular en forma de aerosol, pulverización, nebulización o en forma de gotas. En particular, los agentes profilácticos o terapéuticos para uso según la presente divulgación se pueden administrar convenientemente en forma de presentación en aerosol a partir de envases presurizados o un nebulizador, con el uso de un propulsor adecuado (p. ej., diclorodifluorometano, triclorofluorometano, diclorotetrafluoroetano, dióxido de carbono u otro gas adecuado). En el caso de un aerosol presurizado, la unidad de dosificación puede determinarse proporcionando una válvula para administrar una cantidad medida. Cápsulas y cartuchos (compuestos, p. ej., de gelatina) para uso en un inhalador o insuflador se pueden formular de forma que contienen una mezcla en polvo del compuesto y una base en polvo adecuada tal como lactosa o almidón.

Métodos de coadministración o tratamiento con un segundo agente terapéutico, p. ej., un inmunosupresor, una citocina, un esteroide, un agente quimioterapéutico, un antibiótico o una radiación, son conocidos en la técnica (véanse, p. ej., Hardman et al., (eds.) (2001) Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, 10a ed., McGraw-Hill, New York, N.Y.; Poole and Peterson (eds.) (2001) Pharmacotherapeutics for Advanced Practice: A Practical Approach, Lippincott, Williams & Wilkins, Phila., Pa.; Chabner and Longo (eds.) (2001) Cancer Chemotherapy and Biotherapy, Lippincott, Williams & Wilkins, Phila., Pa.). Una cantidad eficaz de agente terapéutico puede disminuir los síntomas en al menos un 10%; en al menos un 20%; al menos aproximadamente un 30%; al menos un 40% o al menos un 50%.

Terapias adicionales (p. ej., agentes profilácticos o terapéuticos), que se pueden administrar en combinación con los anticuerpos anti-VP1, se pueden administrar con menos de 5 minutos de diferencia, con menos de 30 minutos de diferencia, con 1 hora de diferencia, con aproximadamente 1 hora de diferencia, con aproximadamente 1 a aproximadamente 2 horas de diferencia, con aproximadamente 2 horas a aproximadamente 3 horas de diferencia, con aproximadamente 3 horas a aproximadamente 4 horas de diferencia, con aproximadamente 4 horas a aproximadamente 5 horas de diferencia, con aproximadamente 5 horas a aproximadamente 6 horas de diferencia, con aproximadamente 6 horas a aproximadamente 7 horas de diferencia, con aproximadamente 7 horas a aproximadamente 8 horas de diferencia, con aproximadamente 8 horas a aproximadamente 9 horas de diferencia, con aproximadamente 9 horas a aproximadamente 10 horas de diferencia, con aproximadamente 10 horas a aproximadamente 11 horas de diferencia, con aproximadamente 11 horas a aproximadamente 12 horas de diferencia, con aproximadamente 12 a 18 horas de diferencia, con 18 a 24 horas de diferencia, con 24 a 36 horas de diferencia, con 36 a 48 horas de diferencia, con 48 horas a 52 horas de diferencia, con 52 horas a 60 horas de diferencia, con 60 horas a 72 horas de diferencia, con 72 horas a 84 horas de diferencia, con 84 horas a 96 horas de diferencia o con 96 horas a 120 horas de diferencia con los anticuerpos anti-VP1 de la presente divulgación. Las dos o más terapias se pueden administrar en una misma visita al paciente.

En ciertos aspectos, los anticuerpos anti-VP1 se pueden formular para asegurar una distribución adecuadain vivo.Por ejemplo, la barrera hematoencefálica (BHE) excluye muchos compuestos altamente hidrófilos. Para garantizar que los anticuerpos anti-VP1 atraviesan la BHE (si se desea), se pueden formular, por ejemplo, en liposomas. Para conocer los métodos de preparación de liposomas, véanse, p. ej., los documentos de patente de EE. UU. núm.

4.522.811; 5.374.548; y 5.399.331. Los liposomas pueden comprender uno o más restos que se transportan selectivamente a células u órganos específicos, mejorando así la administración dirigida de fármacos (véase, p. ej., Ranade, (1989) J. Clin. Pharmacol. 29:685). Los restos dirigidos a modo de ejemplo incluyen folato o biotina (véase, p. ej., el documento de patente de EE. UU. núm. 5.416.016 de Low et al.); manósidos (Umezawa et al., (1988) Biochem. Biophys. Res. Commun. 153:1038); anticuerpos (Bloeman et al., (1995) FEBS Lett. 357:140; Owais et al., (1995) Antimicrob. Agents Chemother. 39:180); receptor de proteína A tensioactivo (Briscoe et al., (1995) Am. J. Physiol.

1233:134); p 120 (Schreier et al., (1994) J. Biol. Chem. 269:9090); véase también, K. Keinanen; M. L. Laukkanen (1994) FEBS Lett. 346:123; J. J. Killion; I. J. Fidler (1994) Immunomethods 4:273.

La presente divulgación proporciona protocolos para la administración de una composición farmacéutica que comprende anticuerpos solos o en combinación con otras terapias, a un sujeto que los necesita. Las terapias combinadas (p. ej., agentes profilácticos o terapéuticos) pueden administrarse de forma concomitante o secuencial a un sujeto. La terapia (p. ej., agentes profilácticos o terapéuticos) de las terapias combinadas también se puede administrar cíclicamente. La terapia cíclica implica la administración de una primera terapia (p. ej., un primer agente profiláctico o terapéutico) durante un período de tiempo, seguido de la administración de una segunda terapia (p. ej., un segundo agente profiláctico o terapéutico) durante un período de tiempo y la repetición de esa administración secuencial, es decir, el ciclo, con el fin de reducir el desarrollo de una resistencia a una de las terapias (p. ej., agentes) para evitar o reducir los efectos secundarios de una de las terapias (p. ej., agentes) y/o mejorar la eficacia de las terapias.

Las terapias (p. ej., agentes profilácticos o terapéuticos) de las terapias combinadas de la divulgación se pueden administrar a un sujeto concurrentemente. El término "concurrentemente" no se limita a la administración de terapias (p. ej., agentes profilácticos o terapéuticos) exactamente al mismo tiempo, sino que significa que una composición farmacéutica que comprende anticuerpos o fragmentos de los mismos se administra a un sujeto en una secuencia y dentro de un intervalo de tiempo tal que los anticuerpos pueden actuar junto con la otra terapia o terapias para proporcionar un beneficio mayor que si se administraran de otra manera. Por ejemplo, cada terapia puede administrarse a un sujeto al mismo tiempo o secuencialmente en cualquier orden en diferentes momentos; sin embargo, si no se administran al mismo tiempo, deben administrarse lo suficientemente cerca en el tiempo para proporcionar el efecto terapéutico o profiláctico deseado. Cada terapia puede administrarse a un sujeto por separado, en cualquier forma apropiada y por cualquier vía adecuada. En diversos aspectos, las terapias (p. ej., agentes profilácticos o terapéuticos) se administran a un sujeto con menos de 15 minutos, con menos de 30 minutos, con menos de 1 hora de diferencia, con aproximadamente 1 hora de diferencia, con aproximadamente de 1 hora a aproximadamente 2 horas de diferencia, con aproximadamente 2 horas a aproximadamente 3 horas de diferencia, con aproximadamente 3 horas a aproximadamente 4 horas de diferencia, con aproximadamente 4 horas a aproximadamente 5 horas de diferencia, con aproximadamente 5 horas a aproximadamente 6 horas de diferencia, con aproximadamente 6 horas a aproximadamente 7 horas de diferencia, con aproximadamente 7 horas a aproximadamente 8 horas de diferencia, con aproximadamente 8 horas a aproximadamente 9 horas de diferencia, con aproximadamente 9 horas a aproximadamente 10 horas de diferencia, con aproximadamente 10 horas a aproximadamente 11 horas de diferencia, con aproximadamente 11 horas a aproximadamente 12 horas de diferencia, con 24 horas de diferencia, con 48 horas de diferencia, con 72 horas de diferencia o con 1 semana de diferencia. En otros aspectos, dos o más terapias (p. ej., agentes profilácticos o terapéuticos) se administran en la misma visita al paciente.

Los agentes profilácticos o terapéuticos de las terapias combinadas se pueden administrar a un sujeto en la misma composición farmacéutica. Alternativamente, los agentes profilácticos o terapéuticos de las terapias combinadas se pueden administrar simultáneamente a un sujeto en composiciones farmacéuticas por separado. Los agentes profilácticos o terapéuticos pueden administrarse a un sujeto a través de la misma vía o diferentes vías de administración.

Ejemplos

Ejemplo 1: Generación de anticuerpos anti-VP1

Se lisaron linfocitos B que expresaban anticuerpos anti-VP1 y se secuenciaron las cadenas VH (pesada) y VL (ligera) mediante RT-PCR y se analizaron para identificar sitios decisivos para una modificación postraduccional (PTM). Después se transfectaron plásmidos de las cadenas VH y VL en una línea celular de mamífero CHO en un vector de la estructura principal de IgG1 para la expresión de los anticuerpos IgG1 completos.

Los métodos para la generación de anticuerpos monoclonales usando tecnología de hibridoma son conocidos en la técnica (Antibody Methods and Protocols, Methods in Molecular Biology vol. 901, 2012, capítulo 7: 117). Brevemente, se inmunizaron ratones hembra Balb/c con VLPs de BKV de serotipo I, serotipo IV y JCV (individualmente o en combinación) usando diversas estrategias de estimulación primaria, dosis de inmunógeno y adyuvantes (incluidos, pero no limitados a, adyuvante de Freund y adyuvante MF59). Se analizó el material sobrenadante de los hibridomas fusionados con éxito (en crecimiento) para detectar la presencia de anticuerpos anti-VP1 mediante ELISA y luego para determinar la actividad funcional en ensayos de neutralización. Las CDRs procedentes de IgGs murinas seleccionadas se humanizaron injertándolas en moldes aceptores de estructura humana, se clonaron en vectores de expresión de la estructura principal de IgG1 de mamífero y se transfectaron a una línea celular de mamífero CHO para la expresión de los anticuerpos IgG1 completos.

Los métodos para la generación de anticuerpos monoclonales utilizando tecnología de presentación en fagos se conocen en la técnica (Antibody Methods and Protocols, Methods in Molecular Biology vol. 901,2012, capítulo 3: 33). Brevemente, se analizó un banco de anticuerpos de linfocitos B humanos en formato scFv con V<k>para detectar anticuerpos anti-VP1 mediante aislamiento y selección de una solución con perlas magnéticas acopladas a estreptavidina que formaban un complejo con VLPs de serotipo IV de BKV, biotiniladas durante 3 rondas de selección con rigor creciente. Los anticuerpos aislados se expresaban primero como scFv y se analizaron mediante ELISA para determinar su unión tanto a las VLPs como a los pentámeros de serotipo IV de BKV. Luego, los anticuerpos aislados seleccionados se clonaron y se expresaron como IgG1, se volvieron a analizar para determinar su unión a VP1 (serotipo I y IV) mediante ELISA y para determinar su actividad funcional en ensayos de neutralización y se transfectaron a una línea celular de mamífero CHO para la expresión de los anticuerpos IgG1 completos.

En la Tabla 3 se proporciona un resumen de los anticuerpos anti-VP1.

Tabla 3: Anticuerpos anti-VP1

Ejemplo 2: Maduración por afinidad de anticuerpos anti-VP1

Los anticuerpos anti-VP1 maduraron por afinidad en levadura mediante PCR propensa a errores o mutagénesis dirigida por CDR. Se usaron proteínas de VP1 de cada uno de los cuatro serotipos de BKV (como se muestra en la Tabla 4) como antígeno en hasta tres rondas de selección mediante análisis FACS. Luego se clonaron las cadenas VH (pesada) y/o VL (ligera) con una afinidad de la unión a VP1 mejorada mediante análisis FACS en vectores de expresión de la estructura principal de IgG1 de mamífero y se transfectaron a una línea celular de mamífero CHO para la expresión de los anticuerpos IgG1 completos.

Tabla 4

Ejemplo 3: Generación de virus BK y partículas similares a virus (VLPs)

Los clones genómicos del serotipo I de BKV se obtuvieron a partir de ATCC (pBR322-BKV MM, n° de cat. 45026; pBR322-BKV Dunlop, n° de cat. 45025). Se generaron clones genómicos infecciosos de virus quiméricos para los serotipos II, III y IV utilizando la estrategia de clonación descrita anteriormente (Broekema et al., Virology 2010407:368-373). Brevemente, se introdujeron sitios de restricción únicos (SacII, Pmll) en los genomas del serotipo I de BKV que flanqueaban la región codificante VP1-VP2-VP3 mediante mutagénesis dirigida al sitio. La región codificante para VP1 del material aislado SB de serotipo II (registro en GenBank CAA79596.1), material aislado AS de serotipo III (registro en GenBank AAA46882.1) y la cepa ITA-4 de serotipo IV (registro en GenBank BAF75132) se sintetizaron en el contexto de la región codificante de VP2/VP3 de los materiales aislados de serotipo I (Genewiz, La Jolla, CA), de modo que los fragmentos sintetizados incluían la región SacII-PmlI que se iba a usar para combinaciones mediante intercambio como se describe en Broekema et al.supra.Los clones genómicos quiméricos resultantes se usaron luego para generar reservas virales infecciosas de título elevado en células epiteliales primarias del túbulo proximal renal (RPTE) (ATCC, número de catálogo PCS-400-010) como se ha descrito anteriormente (Abend et al., J. Virology 200781:272-279).

Las VLPs que representaban cada uno de los cuatro serotipos de BKV se generaron mediante la expresión de VP1 en células de insecto Sf9 y se extrajeron de sedimentos celulares congelados de cultivos de 1 litro, mediante ultrasonidos con micropunta (pulsos de 3 x 45 segundos, descanso de 5 minutos entre los pulsos sobre hielo), aislamiento mediante sedimentación de las VLPs a través de un cojín de sacarosa al 20% (116.000 g durante 2,5 horas) y purificación mediante intercambio aniónico en una columna GE HiTrap Q HP de 5 ml (GE Healthcare, Pittsburgh, PA) seguido de purificación utilizando una columna de exclusión por tamaño basada en resina Capto™ Core700 de 10 ml (GE Healthcare, Pittsburgh, PA) y, finalmente, purificación en una columna de exclusión por tamaño GE Sephacryl S500 26/60 (GE Healthcare, Pittsburgh, PA). Las VLPs preparadas se usaron en ensayos de unión basados en ELISA y SPR en los Ejemplos 6 y 7.

Ejemplo 4: Purificación de pentámeros de VP1 de BKV

Las proteínas VP1 de cada uno de los cuatro serotipos de BKV (secuencias que se muestran en la Tabla 5 a continuación) se clonaron con secuencias N-terminales de GST-6xHis-TEV y se subclonaron en el vector de destino pGEX (GE Healthcare, Pittsburgh, PA). Las proteínas de fusión GST se expresaron enE. coli,se extrajeron desde los sedimentos celulares utilizando un microfluidizador (15.000 PSI, 1034 bar) y se purificaron mediante cromatografía de afinidad con iones metálicos inmovilizados (IMAC) utilizando una columna Fast Flow 6 de níquel-sefarosa de 20 ml (GE Healthcare, Pittsburg, PA). El marcador GST-6xHis-TEV se escindió mediante incubación durante la noche con proteasa TEV y la purificación final se realizó utilizando una columna His-Trap Fast Flow de 5 ml (GE Heathcare, Pittsburg, PA), seguida de una columna de exclusión por tamaño Superdex 20026/60 (GE Healthcare, Pittsburg, Pensilvania).

Tabla 5

Ejemplo 5: Mediciones de la afinidad de los anticuerpos anti-VP1 (ensayo SET)

Se utilizó un ensayo de titulación de equilibrio en solución (SET) para determinar las afinidades de la interacción (K<d>) de los anticuerpos con pentámeros VP1 del BKV de los cuatro serotipos. Los anticuerpos se analizaron a una concentración de 1 pM (constante), los pentámeros de VP1 se diluyeron en serie a partir de una concentración inicial de 10 nM. Anticuerpo: la solución de pentámeros de VP1 se incubó durante la noche y luego se analizó la presencia de anticuerpos no unidos usando una placa de matriz MSD (Meso Scale Discovery n° de cat. L21XA, Rockville MD) recubierta con pentámero VP1. La K<d>se determinó ajustando la gráfica con un modelo de ajuste 1:1 (según Piehler et al. J. Inmunol. Methods. 1997; 201(2):189-206).

En los ensayos SET, los valores de K<d>eran similares para los anticuerpos anti-VP1 que se unían a los pentámeros del serotipo I del BKV, oscilando entre 0,9 y 5,0 pM. P8D11 y los derivados de P8D11 tenían valores de K<d>comparables para la unión a los pentámeros de BKV de serotipo II, III y IV, y en comparación con los otros anticuerpos, tenían al menos una afinidad 3,5 veces mayor hacia los pentámeros de serotipo II y una afinidad 47 veces mayor hacia los pentámeros de serotipo IV. Esto se muestra en la Figura 1A-1D. Además, P8D11 y los derivados de P8D11 mostraron una afinidad de unión que oscilaba entre 2,5 y 6,0 pM hacia los pentámeros de serotipo III, mientras que los otros anticuerpos no tenían una unión detectable a los pentámeros de serotipo III en las condiciones sometidas a ensayo. En la Figura 2 se encuentra un resumen de los datos de la afinidad SET para esos anticuerpos anti-VP1.

Ejemplo 6: Unión de anticuerpos anti-VP1 a pentámeros de VP1 y VLPs (ELISA)

La unión de los anticuerpos anti-VP1 a pentámeros de VP1 y VLPs se analizó mediante ELISA. Brevemente, se recubrieron placas Immulon 2HB (VWR, 62402-972) con 100 ng/pocillo de VLPs de BKV o pentámeros de VP1 durante la noche. Los anticuerpos se diluyeron en serie en PBS con BSA al 0,5% y se permitió la unión a las placas recubiertas con antígeno durante 2 h. Las placas se lavaron con PBS y luego se incubaron con anticuerpo secundario (IgG antihumana de conejo conjugada con HRP, Southern Biotech #6140-05) diluido 1:6000 en BSA al 0,5% en pBS durante 1 h. Las placas se lavaron con PBS y se usó sustrato de peroxidasa en los micropocillos de tetrametilbencidina (TMB) (KPL, 52-00-03 1 L) para desarrollar las reacciones.

Los anticuerpos anti-VP1, EBB-C1975-A3, A7, E7 y B5 mostraban una unión similar a las de las VLPs (CI50s que oscilaban entre 0,044 y 0,1 nM) o los pentámeros de VP1 (CI50s que oscilaban entre 0,026 y 0,078 nM) del serotipo IV de BKV, pero una actividad de unión reducida y más variable a las VLPs de serotipo I (CI50s que oscilaban entre 4,32 y 85,7 nM). Estos datos se muestran gráficamente en las Figuras 4-6 y se resumen en la Figura 7. Por el contrario, los anticuerpos anti-VP1 de las series 2081 y 2075 mostraban una actividad de unión mejorada a las VLPs del serotipo I, con CI50s que oscilaban entre 0,046 y 0,267 nM y estos datos se muestran en las Figuras 8 y 9. Los anticuerpos anti-VP1 específicos del JCV de la serie 2077, mostraban actividad de unión a las VLPs del JCV en un intervalo de 0,034 a 0,651 nM y estos datos se proporcionan en las Figuras 10 y 11.

Ejemplo 7: Unión de los anticuerpos anti-VP1 a los pentámeros de VP1 y VLPs mediante SPR

La unión de anticuerpos anti-VP1 a pentámeros de VP1 y a VLPs se analizó mediante resonancia de plasmón superficial (SPR). Brevemente, la proteína A biotinilada se inmoviliza sobre la superficie de un chip SPR recubierto con estreptavidina y los anticuerpos anti-VP1 se capturan sobre la superficie resultante al unirse a la proteína A. Luego, los pentámeros de VP1 o las VLPs de BKV se hacen fluir sobre la superficie y se permite que se unan a los anticuerpos anti-VP1 durante la fase de asociación, seguido de un lavado con tampón durante la fase de disociación.

Se utilizó SPR para evaluar la unión de los anticuerpos anti-VP1, EBB-C1975-A3, A7, E7 y B5 a los cuatro serotipos de BKV, en relación con un control positivo (P165E2). Los cuatro anticuerpos tenían perfiles de unión muy similares a los pentámeros de VP1: ninguna unión a los pentámeros de serotipo I y III, unión atípica a los pentámeros de serotipo II (gran cambio de masa y sin retorno al valor inicial) y unión a pentámeros de serotipo IV similar a P165E2 pero con menor afinidad (Figuras 3A, 3C y 3E). Para las VLPs, EBB-C1975-A3, A7 y E7 compartían perfiles de unión similares: unión atípica a las VLPs de serotipo I y ninguna unión a las VLPs de serotipo III. Sin embargo, el perfil de unión de EBB-C1975-B5 era distinto, con una unión significativa a las VLPs de serotipo I y III, lo que demuestra la unión a un epítopo diferente en VP1 (Figuras 3B y 3D).

También se usó SPR para caracterizar la unión de los anticuerpos anti-VP1, P165E2, NEG447, P7G11A y P8D11 a pentámeros de VP1 mediante exploración de mutagénesis a alanina (Figuras 13A-F y Figura 14). Todos los anticuerpos anti-VP1 mostraban una unión reducida a los mutantes de VP1, F66A e I145A, debido a un impacto general de la mutación sobre la estructura del pentámero de VP1 (Figuras 13B y 13F). Además, K69A y E82A afectaban a la unión de P165E2, NEG447 y P7G11A (Figuras 13D y 13e ).

Ejemplo 8: Los anticuerpos anti-VP1 se unen a un epítopo conformacional

Para determinar si los anticuerpos anti-VP1 se unen a un epítopo conformacional, se utilizaron transferencias Western de proteína desnaturalizada mediante SDS-PAGE y transferencias puntuales de proteína en conformación natural. Brevemente, el pentámero de VP1 de serotipo I o IV de BKV se procesó en SDS-PAGE y se transfirió a una membrana de nitrocelulosa (transferencia Western) o se colocó directamente sobre una membrana de nitrocelulosa (transferencia puntual). Ambas membranas se incubaron con anticuerpos anti-VP1 seguidos de un anticuerpo secundario anti-IgG humana conjugado con colorantes fluorescentes infrarrojos para la detección utilizando el sistema Licor Odyssey.

El anticuerpo de control positivo disponible comercialmente (Abcam 53977), conocido por reconocer un epítopo lineal, detectaba tanto la VP1 desnaturalizada como la no desnaturalizada. Sin embargo, P165E2, P7G11 y P8D11 no lograron detectar la VP1 desnaturalizada en la transferencia Western y solo reconocían la VP1 natural en la transferencia puntual, lo que indica que esos anticuerpos se unen a un epítopo conformacional (no lineal) de VP1 (Figura 12A y 12B).

Para caracterizar adicionalmente el epítopo de los anticuerpos anti-VP1, se realizó una mutagénesis a alanina con exploración en busca de residuos, principalmente en el bucle BC de VP1, que se sabe que está expuesto en la superficie del virión y dentro de un sitio de interacción importante para los receptores de la superficie celular. Esos pentámeros de VP1 mutantes se analizaron para determinar la unión a P8D11 y P7G11A en estudios de resonancia de plasmón superficial (SPR) como se ha descrito anteriormente en el Ejemplo 7. Las mutaciones en varias posiciones afectaban a la unión de P7G11A (F66A, K69A, E82A, 1145A) (Figuras 13A-F y Figura 14). Sin embargo, las mutaciones en solo dos sitios daban como resultado una reducción de la unión de P8D11 (F66A, 1145A) (Figura 14). Como las mutaciones en F66 e I145 daban como resultado una pérdida de unión de todos los anticuerpos sometidos a ensayo, sin estar ligados a ninguna teoría, es probable que esas mutaciones den lugar a una alteración general de la estructura del pentámero de VP1. Todos los demás pentámeros de VP1 con mutaciones del bucle BC analizados conservaban la unión de P8D11. Por el contrario, los estudios de intercambio de hidrógeno-deuterio han identificado una región protegida dentro del bucle EF de VP1 tras la unión del fragmento Fab P8D11. Los estudios de seguimiento de mutagénesis a alanina confirman que los residuos de contacto clave para la unión de P8D11 dentro de esa región incluyen Y169, R170 y K172, siendo D/E175, K181, N182, T184 y Q186 a M190 residuos importantes según lo determinado por el intercambio de deuterio ((YRXKXX (D/E)XXXXXKNXTXQ) (SEQ ID NO: 500)). Esto se describe con más detalle en los Ejemplos 14 a 17.

Ejemplo 9: Neutralización del virus BK mediante anticuerpos anti-VP1

Se preincubaron BKV de serotipo I infecciosos y virus quiméricos que representan los serotipos II, III y IV con anticuerpos purificados durante 1 hora para permitir la unión y la neutralización. Luego se expusieron células epiteliales primarias de túbulo proximal renal (RPTE) (ATCC, número de catálogo PCS-400-010) a la mezcla de virus y anticuerpos durante 4 horas, se reemplazó el medio con uno de nuevo aporte y se incubaron durante 48 horas para permitir la entrada viral y la expresión génica. Las células se fijaron con paraformaldehído al 4% y se analizaron mediante inmunofluorescencia para detectar la expresión de TAg (Calbiochem DP02, anticuerpo pAb416 de ratón anti-Tag de SV40). La inmunofluorescencia se analizó mediante análisis de imágenes de alto contenido utilizando el lector Cellomics Array Scan® VTI HCS para cuantificar el porcentaje de células infectadas con BKV (positivas para Tag, positivas para DAP1), con datos presentados como porcentaje de inhibición de la infección en relación con los pocillos de control no tratados.

Como se muestra en las Figuras 15-23, los anticuerpos anti-VP1 neutralizaban la infección por BKV, incluido el subconjunto de anticuerpos que neutralizaban la infección con los cuatro serotipos de BKV (I-IV). Esos anticuerpos anti-VP1 incluyen específicamente P8D11, las modificaciones de P8D11 y EBB-C1975-B5.

Ejemplo 10: Neutralización del virus JC mediante anticuerpos anti-VP1 de virus

Los materiales aislados infecciosos de JCV, Mad-1 y Mad-4 tienen secuencias de VP1 idénticas (registro de GenBank NP_043511). Estos materiales aislados de JCV se preincubaron con anticuerpos purificados durante 1 hora para permitir la unión y la neutralización. Luego se expusieron células COS7 (línea celular similar a fibroblastos de riñón de mono verde africano que expresa Tag de SV40, n° de catálogo ATCC CRL-1651) a la mezcla de virus y anticuerpo durante 4 horas, se reemplazó el medio por medio de nuevo aporte y se incubaron durante 72 horas para permitir la entrada viral y la expresión génica. Las células se fijaron con paraformaldehído al 4% y se analizaron mediante inmunofluorescencia para detectar la expresión de VP1 de JCV (Abcam 53977, anticuerpo policlonal de conejo anti-VP1 de SV40). El ensayo se analizó mediante análisis de imágenes de alto contenido utilizando el lector Cellomics ArrayScan®VTI HCS (Thermo Fisher, Waltham MA) para cuantificar el porcentaje de células infectadas con JCV (positivas para VP1, positivas para DAP1), con datos presentados como porcentaje de inhibición de la infección en relación con los pocillos de control no tratados. Como se muestra en las Figuras 24-26, un subconjunto de anticuerpos anti-VP1 neutraliza la infección por JCV, incluidos los anticuerpos P8D11 y la serie 2077.

Ejemplo 11: Resistencia viral

Se llevaron a cabo experimentos de selección por resistencia con anticuerpos P8D11 en cultivos de células epiteliales del túbulo proximal renal (RPTE) infectadas con BKV de serotipo I o serotipo IV. En los estudios con el serotipo I, no se observó una progresión viral en los cultivos con P8D11 en 6 pases (84 días) y, por lo tanto, no se identificaron variantes asociadas a la resistencia (RAVs). No se realizaron más pases a partir de ese punto, ya que no se pudo detectar ningún virus. Por el contrario, se detectó una progresión viral en el pase 3 (día 42) con otro anticuerpo. La secuenciación de VP1 de BKV procedente de esos cultivos identificó una variante asociada a la resistencia (RAV) con cambios de 20 aminoácidos en toda la VP1, sin cambios agrupados alrededor de aminoácidos específicos en la secuencia de VP1. Una caracterización fenotípica posterior de este virus RAV agrupado mostraba una pérdida completa de la actividad de neutralización (cambio >7692 veces en la CE50) en comparación con el virus de tipo silvestre, pero pocos cambios (3,9 veces) en la CE50 de P8D11. Además, el mutante E82K de VP1 se identificó como una RAV durante la selección con otro anticuerpo anti-VP1 (véase, el Ejemplo 8) y la caracterización de un virus mutante E82K clonado mostraba que esa variante confería un cambio de 15.880 veces en la CE50 en comparación con el virus de tipo silvestre, pero no mostraba resistencia cruzada con P8D11.

De manera similar, en cultivos de BKV de serotipo IV, no se detectaba resistencia con P8D11 después de 6 pases (84 días). Nuevamente, no se realizaron más pases a partir de ese punto, ya que no se pudo detectar ningún virus. Sin embargo, ya en el pase 1 (día 14) se seleccionó resistencia con otro anticuerpo anti-BK. Los cambios de aminoácidos L68R y E73K se identificaron como mutaciones de cambio de referencia y conferían cambios de 600 y 227 veces en los valores de CE50 respectivamente, pero no mostraban resistencia cruzada con P8D11. En resumen, P8D11 tiene una alta barrera frente a la resistencia y conserva una actividad neutralizante contra variantes resistentes tanto para los serotipos I como para los IV.

Ejemplo 12: Toxicidad

Debido a que VP1 es una diana exógena no humana que no se expresa en la superficie celular, los anticuerpos anti-VP1 descritos en el presente documento constituyen un riesgo bajo de toxicidad en humanos. Un estudio de TCR demostraba que no había tinción de 42 tejidos humanos ni frotis de sangre con P8D11, lo que respalda la ausencia de reactividad cruzada del anticuerpo anti-VP1 con proteínas humanas. Los anticuerpos anti-VP1 no han mostrado citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos (ADCC)in vitro,lo que es consistente con el hecho de que la proteína VP1 no se expresa en la superficie de la célula hospedadora.

Ejemplo 13: Ensayo de afinidad SET de P8D11 en VLPs de JCV

La leucoencefalopatía multifocal progresiva (LMP) es una infección rara, pero frecuentemente mortal, del cerebro de pacientes inmunodeprimidos por el virus JC. La proteína principal de la cápside (VP1) del virus JC participa en la unión de los receptores de ácido siálico sobre la superficie de las células hospedadoras. Ciertas mutaciones en VP1, tal como en los aminoácidos L55 y S269, suprimen el reconocimiento del ácido siálico y desempeñan un papel en la patogénesis de la leucoencefalopatía multifocal progresiva (LMP). Chen et al., mAbs 2015; 7(4), 681-692). Esas dos mutaciones ocurren con frecuencia en pacientes con leucoencefalopatía multifocal progresiva (Gorelik et al., J. Infect. Dis. 2011204:103-114 y Reid et al., J. Infect. Dis. 2011; 204:237-244). Los anticuerpos de la divulgación se sometieron a ensayo para ver si se unían a las VLPs de JCV mutadas con mutaciones en esas posiciones. La unión de los anticuerpos anti-VP1 a esas VLPs indicaría que el virus JC que porta esas mutaciones comunes de VP1 no es resistente a la terapia.

Se prepararon dos series de veintidós diluciones en serie de VLPs en tampón de muestra. Se agregaron dos concentraciones constantes del anticuerpo P8D11. La concentración de anticuerpo P8D11 utilizada era 9 nM o 1 pM. El rango de concentración del consenso JCV oscilaba entre 105 pg/ml y 72 pg/ml. El intervalo de concentración del mutante de JCV L55F era de 300 pg/ml-143 pg/ml. El intervalo de concentración del mutante de JCV S269F era de 300 pg/ml-143 pg/ml. Se distribuyó por duplicado un volumen de 60 pl de cada mezcla de VLP:anticuerpo en una placa de microtitulación de polipropileno de 384 pocillos (PP MTP). El tampón de la muestra servía como control negativo y una muestra que no contenía antígeno como control positivo (Bmax). La placa se selló y se incubó durante la noche (o/n) a temperatura ambiente (TA). Se recubrió una placa de matriz MSD estándar de 384 pocillos durante la noche con 2 y 0,002 pg/ml de proteína pentamérica con el serotipo I de VP1 de BKV. Después de lavar tres veces con 50 pl/pocillo de tampón de lavado, la placa se bloqueó con 50 pl/pocillo de tampón de bloqueo durante 1 hora a temperatura ambiente. Después del lavado, se transfirió un volumen de 30 pl/pocillo de cada mezcla de VLP:anticuerpo desde el PP MTP a la placa MSD recubierta y se incubó durante 20 minutos a temperatura ambiente. Después de una etapa de lavado adicional, se agregaron a cada pocillo 30 pl de anticuerpo de detección (diluido 1:2000) en tampón de la muestra y se incubaron durante 30 minutos a temperatura ambiente. Se lavó la placa MSD y se añadieron 35 pl/pocillo de tampón de lectura y se incubó durante 5 min. Las señales de ECL se midieron con el MSD SECTOR Imager 6000.

Los reactivos utilizados eran: albúmina sérica bovina (BSA), (VWR n° de cat. 422351S), solución salina tamponada con fosfato (PBS) 10x, (Teknova n° de cat. P0195), tampón de lectura de MSD T 4x, (Meso Scale Discovery n° de cat. R92TC-1), solución salina tamponada con Tris (TBS) 20x, (Teknova n° de cat. T1680), Tween-20, (VWR n° de cat.

437082Q). Los tampones utilizados eran; tampón de bloqueo: 1x PBS BSA al 5% (p/v), tampón de recubrimiento: 1x PBS, tampón de la muestra: 1x PBS BSA al 0,5% (p/v) Tween-20 al 0,02% (v/v), tampón de lavado: 1x TBS 0,05% (v/v) Tween-20 y tampón de lectura: 1x tampón de lectura MSD.

Se utilizó un ensayo de titulación de equilibrio en solución (SET) para determinar las afinidades de la interacción (K<d>) de P8D11 con VLPs de JCV como se describe en el Ejemplo 5. El anticuerpo P8D11 se analizó con concentraciones de 9 nM o 1 pM (constante) y las VLPs de JCV se diluyeron en serie de la siguiente manera: las VLPs de consenso oscilaban entre 105 pg/ml y 72 pg/ml y las VLPs mutantes L55F y S269F oscilaban ambas entre 300 pg/ml y 143 pg/ml. Anticuerpo: la solución de pentámero de VP1 se incubó durante la noche y luego se analizó la presencia de anticuerpos no unidos usando una placa de matriz MSD (Meso Scale Discovery, n° de cat. L21XA, Rockville MD) recubierta con pentámero de VP1. La K<d>se determinó ajustando la gráfica a un modelo de ajuste 1:1 (según Piehler et al. J. Inmunol. Methods. 1997; 201(2):189-206). El análisis se realizó usando los programas informáticos KinExA® Pro y n-Curve de Sapidyne (Boise ID).

La Figura 27 representa los resultados del ensayo SET en forma tabular. Esos datos proporcionan la determinación de la afinidad(Kd)del anticuerpo P8D11 hacia las VLPs de JCV de consenso y las VLPs que contienen mutaciones de VP1 comúnmente asociadas con la leucoencefalopatía multifocal progresiva. P8D11 mostraba afinidades de unión a todas las VLPs de JCV en el rango nanomolar bajo. Sin embargo, la afinidad de la unión al mutante L55F era aproximadamente 2 veces menor que la afinidad hacia las VLPs de tipo silvestre (consenso) y el mutante S269F. Por lo tanto, esto indica que el anticuerpo P8D11 seguiría siendo una terapia eficaz contra el virus JC de tipo silvestre o contra el virus JC con mutaciones comúnmente asociadas con la leucoencefalopatía multifocal progresiva.

Ejemplo 14: Estudio de intercambio de deuterio (Fab de P8D11 formando un complejo con pentámeros de VP1 de BKV) para el cartografiado de epítopos

La espectrometría de masas con intercambio de deuterio (HDx-MS) mide la captación de deuterio en la cadena principal amida de una proteína. Esas mediciones son sensibles a la accesibilidad al disolvente de la amida y a los cambios en la red de enlaces de hidrógeno de las amidas principales. HDx-MS se utiliza a menudo para comparar proteínas en dos estados diferentes, tales como apo y unidas a ligando y acopladas con una digestión rápida con pepsina. En tales experimentos se pueden localizar regiones, típicamente de 10 a 15 aminoácidos, que muestran una captación diferencial de deuterio entre dos estados diferentes. Las regiones que están protegidas están directamente involucradas en la unión del ligando o se ven afectadas alostéricamente por la unión del anticuerpo al ligando.

En esos experimentos, se midió la captación de deuterio de la proteína VP1 de BKV (SEQ ID NO: 502) en ausencia y presencia del fragmento Fab P8D11. Es probable que las regiones de VP1 que muestran una disminución en la captación de deuterio tras la unión del fragmento Fab, estén involucradas en el epítopo; sin embargo, debido a la naturaleza de la medición, también es posible detectar cambios alejados del sitio directo de la unión (efectos alostéricos). En general, las regiones que tienen el mayor grado de protección están involucradas en la unión directa.

Los experimentos de cartografiado de epítopos se realizan en una plataforma Waters Synapt® G2 HDx-MS, que incluye un sistema de robot LEAP®, un sistema nano ACQUITY® UPLC y un espectrómetro de masas Synapt® G2. En ese método, se llevan a cabo experimentos de control por triplicado de la siguiente manera. El pentámero de VP1 de BKV de serotipo I se diluye en 110 pl de tampón PBS deuterado al 95% (pH 7,4) y se incuba a temperatura ambiente en un agitador de mesa durante 25 minutos (% de D = 85,5%). El intercambio de deuterio se inactiva rápidamente mediante dilución 1:1 con tampón de inactivación frío (urea 6 M y TCEP 1 M pH = 2,5) sobre hielo durante 5 minutos. Después de la inactivación, el tubo se transfiere a un sistema LEAP (la caja térmica está configurada a 2°C) y la muestra inactivada se inyecta a través del sistema LEAP en el sistema UPLC para su análisis. El sistema UPLC incorpora una columna de pepsina inmovilizada de 2,1 mm x 30 mm (Life Technologies 2-3131-00) que se mantiene a 12°C. Para la separación se utiliza un gradiente de acetonitrilo del 2 al 35% de 8 minutos y una columna Waters UPLC CSH C18 de 1,0 x 100 mm. A continuación, se llevan a cabo experimentos por triplicado utilizando el anticuerpo. El fragmento Fab P8D11 se inmoviliza sobre perlas de agarosa con proteína G (Thermo Scientific n° de cat. 22851) utilizando técnicas estándar. Brevemente, el anticuerpo se centrifuga para eliminar un tampón de almacenamiento. Luego se añaden 200 pl de tampón PBS (pH 7,4) y una concentración de pentámeros de VP1 al fragmento Fab P8D11 inmovilizado y se incuba durante 30 min a temperatura ambiente. Después de la incubación, el complejo se centrifuga y se lava con 200 |jl de tampón PBS y se centrifuga nuevamente. Para el intercambio de deuterio, se añaden 200 j l de PBS deuterado al complejo antígeno-anticuerpo para la incubación a temperatura ambiente durante 25 minutos (% de D = 85,5%). Luego se retira el tampón de deuterio e inmediatamente se añaden 125 j l de tampón de inactivación enfriado con hielo. Después de inactivar durante 5 minutos, la columna se centrifuga y el flujo se transfiere a un vial de HPLC enfriado previamente. La muestra se analiza utilizando la misma configuración de digestión con pepsina/LC-MS en línea que el experimento de control.

Los resultados de esas mediciones se resumen en la Figura 28. La Figura 28 muestra las diferencias corregidas de referencia entre el control y la muestra unida al anticuerpo P8D11 divididas por el error estándar en la medición. En ese gráfico, el valor más negativo indica una mayor cantidad de protección en una región determinada tras la unión del fragmento Fab P8D11 al pentámero de VP1 de serotipo I de BKV. Observamos las cantidades más significativas de protección en los aminoácidos 168-190 de la proteína VP1 tras la unión del fragmento Fab P8D11. Esa región del bucle EF está altamente conservada en los cuatro serotipos del virus BK y del virus JC, como se puede observar con las secuencias en negrita y subrayadas en la Tabla 1 ((NYRTKYPXGTXXPKNXTXQSQVM) (SEQ ID NO: 501)).

En conclusión, los datos del cartografiado con deuterio indican que el anticuerpo P8D11 se une a un epítopo dentro del bucle EF de VP1 de BKV. Esa región está altamente conservada en los cuatro serotipos de BKV y el virus JC y, por lo tanto, respalda el resultado de que P8D11 tiene actividad neutralizante en los cuatro serotipos de BKV y el virus JC.

Ejemplo 15: Exploración de alanina dirigida y SPR para cartografiado de epítopos de P8D11

Se utilizó resonancia de plasmón de superficie (SPR) Biacore para caracterizar la unión de anticuerpos anti-VP1 a pentámeros de VP1 generados para el cartografiado de epítopos mediante mutagénesis a alanina. Los experimentos se realizaron a 25°C en solución salina tamponada con fosfato (PBS) complementada con detergente Tween 20 al 0,005% (Calbiochem n° 655206) y se ejecutaron en un instrumento Biacore T-200 (GE Healthcare Life Sciences). La proteína A biotinilada (Sigma # P2165) se inmovilizó sobre un chip sensor de estreptavidina Serie S a aproximadamente 1200 unidades de respuesta (UR) y los sitios de estreptavidina libres restantes se bloquearon con biotina-PEG (Pierce EZ-Link # PI21346). Los anticuerpos se capturaron sobre el chip sensor de proteína A preparado con una inyección de 4 segundos con un caudal de 30 jl/minuto. Los anticuerpos se inmovilizaron a 20-40 UR en las celdas de flujo 2, 3 y 4, dejando la celda de flujo 1 como celda de referencia sin ningún anticuerpo. Luego se inyectaron pentámeros de VP1 sobre el chip durante 200 segundos a 100 jl/m in seguido de inyecciones de tampón para controlar la disociación. Entre cada pentámero y concentración de pentámero, la superficie del chip sensor se regeneró con una inyección de NaOH 25 mM durante 60 segundos a 30 jl/minuto para eliminar los anticuerpos antes de volver a capturarlos sobre las superficies de la proteína A para el siguiente ciclo. El análisis de los datos se realizó en el programa informático de GE BiaEvaluation en donde se aplicó la resta doble de referencia. La evaluación del efecto de la mutagénesis a alanina sobre la unión del pentámero VP1 se logró mediante la comparación de los niveles de unión de UR y las formas de las curvas de unión en comparación con las del pentámero de tipo silvestre.

Como se ha descrito anteriormente, los epítopos de los anticuerpos P8D11 y P7G11A son conformacionales y no contiguos (Figuras 12A-B). En ese caso, mutaciones únicas a alanina en Y169, R170 y K172 en el bucle EF de VP1 de BKV impiden la unión de P8D11 (Figuras 29A y 29B). Las mutaciones en Y169 y R170 también impiden la unión del anticuerpo P7G11A; sin embargo, la unión de ese anticuerpo no se ve afectada por los cambios en la posición K172 del bucle EF de VP1 de BKV (Figuras 29A y 29C).

Ejemplo 16: Cartografiado de epítopos mediante cristalografía de rayos X

Se determinó la estructura cristalina de la cadena scFv del anticuerpo P8D11 unido a la proteína VP1 de la cápside principal de BKV en su forma pentamérica. Como se detalla a continuación, se usó una solución 5,5:1 de scFv:pentámero de VP1 de BKV para producir un complejo cristalográficamente adecuado compuesto por cinco cadenas de scFv unidas a cada pentámero. Luego se empleó la cristalografía de proteínas para generar una estructura de resolución atómica y definir el epítopo.

Cristalización y determinación de la estructura

El complejo scFv de P8D11/VP1 de BKV se concentró hasta 5,2 mg/ml y se tamizó para cristalización. Los cristales para la recopilación de datos se cultivaron mediante difusión de vapor en gota colgante a 18°C. Los cristales se cultivaron mezclando 1,0 j l del complejo con 1,0 j l de solución de depósito que contenía PEG3350 al 25% (p/v), cloruro de magnesio 0,2 M y Bis-Tris 0,1 M, pH 7,0 y equilibrando la gota frente a 350 j l de la misma solución de depósito. Los cristales crecieron durante la noche y continuaron creciendo durante unos días. Antes de la recopilación de datos, los cristales se transfirieron a soluciones de depósito al 75% más glicerol al 25% y se enfriaron instantáneamente en nitrógeno líquido.

Los datos de difracción se recopilaron internamente en una fuente de cobre Rigaku FRE+ y un detector de rayos X del eje R. Los datos se procesaron y se ajustaron utilizando Autoproc (Global Phasing, LTD). Los datos de VP1-BKV se procesaron a 2,66 A en el grupo espacial P42212 con dimensiones de celda a=224,4 A, b=224,4 A, c=144,04 A, alfa=90°, beta=90°, gamma=90°. La estructura del complejo se resolvió mediante reemplazo molecular utilizando Phaser (McCoy et al., (2007) J. Appl. Cryst. 40:658-674) con un pentámero de VP1-BKV como modelo de búsqueda.

El modelo final se construyó en COOT (Emsley y Cowtan (2004) Acta Cryst. D60:2126-2132) y se perfeccionó con Buster (Global Phasing, LTD, Cambridge, Reino Unido). Los valores de Rtrabajo y Rlibre son 17,1% y 21,4%, respectivamente; y los valores de desviación cuadrática media (rms) de las longitudes de enlace y los ángulos de enlace son 0,010 A y 1,18°, respectivamente.

Mediante PISA (Krissinel et al., (2007) J Mol Biol. 372:774-97) se identifican todos los residuos de pentámero-VP1-BKV que están en contacto con scFv de P8D11, los tipos de interacciones y las áreas de superficie enterradas y se indican en la Tabla 6 a continuación. Se descubrió que cada monómero del pentámero de VP1 contiene un único epítopo aislado para el anticuerpo P8D11. Por tanto, cinco dominios de scFv se unen a cada pentámero en cinco posiciones química y estéricamente equivalentes. Los detalles de las interacciones en cada epítopo son esencialmente idénticos, por lo que aquí solo se analiza una interfaz scFv/VP1-epítopo.

Epítopos de scFv-P8D11 en VP1-BKV

Estructura general

El plegamiento general de cada estructura de pentámero de VP1 de poliomavirus es altamente homóloga a nivel de estructura terciaria. Las secuencias primarias están bien conservadas con una identidad del 69-85%. Cada pentámero está compuesto por cinco monómeros, cada uno de los cuales está compuesto por una lámina p de tres hebras apilada contra otra lámina p de cinco hebras y luego una lámina p de cuatro hebras. El scFv de P8D11 es una proteína de fusión VH-VL con un enlazador de 20 aminoácidos entre los dominios VH y VL. Como se muestra en la Figura 30, la proteína de fusión VH-VL se une a un epítopo ubicado en la superficie exterior lateral del pentámero de VP1-BKV.

Epítopo de P8D11

La estructura cristalina del complejo VP1-BKV/P8D11 se utiliza para identificar el epítopo de P8D11 sobre BKV-VP1. La superficie de interacción en Vp1 para scFv-P8D11 está formada por varias secuencias continuas y discontinuas (es decir, no contiguas): a saber, los residuos 77-80, 169-186 y 191-192, como se detalla en la Tabla 6. Esos residuos forman el epítopo conformacional tridimensional que es reconocido por el scFv-P8D11 (Figura 31A-B). Ese epítopo definido por cristalografía concuerda con el definido por espectrometría de masas de intercambio de hidrógeno y deuterio (HDx-MS), en donde los residuos 168-190 están sustancialmente protegidos por Fab-P8D11 (Figura 28). También hay buena concordancia con la exploración de alanina que se realizó en los aminoácidos clave del epítopo (Figura 29A-C) que mostraba que TYR169, ARG170 y LYS 172 son residuos de contacto que forman parte del epítopo del anticuerpo P8D11.

Epítopo de scFv-P8D11 sobre BKV-VP1. Todos los residuos de VP1-BKV que están en contacto con scFv-P8D11 en la estructura cristalina se identifican mediante PISA, se enumeran y clasifican según su área de superficie enterrada mediante scFv-P8D11. También se indican los tipos de interacción cuando corresponde.

Tabla 6

*ASA: Área de superficie accesible ;*BSA: Área de superficie enterrada

Ejemplo 18: Formulación

Los anticuerpos anti-VP1 descritos en este documento son anticuerpos monoclonales, de isotipo IgG1 con cadena ligera lambda y pueden liofilizarse. Esos anticuerpos son solubles y estables en un tampón de formulación de histidinasacarosa durante 4 semanas. Además, los anticuerpos anti-VP1 eran solubles a >200 mg/ml como sustancia farmacológica mínimamente formulada (p. ej., en tampón de histidina en ausencia de estabilizadores).

Para la administración intravenosa posterior, la solución obtenida generalmente se diluirá adicionalmente en una solución portadora de la solución de anticuerpos para infusión, lista para usar.

Los métodos analíticos indicadores de estabilidad importantes para seleccionar la formulación más estable incluían, entre otros, cromatografía de exclusión por tamaño para determinar los niveles de agregación, pruebas de partículas subvisibles y pruebas de potencia.

Se entiende que los ejemplos y los aspectos descritos en el presente documento tienen únicamente fines ilustrativos.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un anticuerpo que se une a la proteína VP1 de BKV y JCV, en donde dicho anticuerpo o fragmento del mismo que se une a antígeno comprende:

una región variable de cadena pesada que comprende (a) una HCDR1 (Región Determinante de Complementariedad, CDR) de SEQ ID NO: 6, (b) una HCDR2 de SEQ ID NO: 7, (c) una HCDR3 de SEQ ID NO: 8 y una región variable de cadena ligera que comprende: (d) una LCDR1 de SEQ ID NO: 16, (e) una LCDR2 de SEQ ID NO: 17 y (f) una LCDR3 de SEQ ID NO: 18.

2. El anticuerpo según la reivindicación 1, en donde dicho anticuerpo o fragmento del mismo que se une a antígeno comprende:

(v) una región variable de cadena pesada (vH) que comprende SEQ ID NO: 92 y una región variable de cadena ligera (vL) que comprende SEQ ID NO: 102; o

3. El anticuerpo o un fragmento del mismo según la reivindicación 2, que conserva al menos un 95, 96, 97, 98 o 99% de identidad sobre la región variable ligera o variable pesada.

4. El anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo quimérico, un anticuerpo humanizado, un anticuerpo de cadena sencilla (scFv) o un fragmento de anticuerpo.

5. El anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde el anticuerpo o un fragmento del mismo tiene una glicosilación reducida o no tiene glicosilación o está hipofucosilado.

6. Una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo o un fragmento del mismo según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que comprende además un vehículo farmacéuticamente aceptable.

7. La composición farmacéutica según la reivindicación 6, en donde el vehículo farmacéuticamente aceptable contiene histidina o un azúcar.

8. La composición farmacéutica según la reivindicación 7, en donde el azúcar es sacarosa.

9. Una composición farmacéutica que comprende una pluralidad del anticuerpo o fragmento que se une a antígeno según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde al menos el 0,05%, 0,1%, 0,5%, 1%, 2%, 3%, 5% o más de los anticuerpos en la composición tiene un residuo de ácido siálico con enlace a2,3.

10. Una composición farmacéutica que comprende una pluralidad del anticuerpo o fragmento que se une a antígeno según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde ninguno de los anticuerpos comprende una GlcNAc bisectante.

11. El anticuerpo o fragmento del mismo según cualquiera de las reivindicaciones 1- 5, para uso como medicamento.

12. El anticuerpo o fragmento del mismo según cualquiera de las reivindicaciones 1-5 o la composición farmacéutica según las reivindicaciones 6-10, para uso en un método para neutralizar una infección por virus BK o JCin vivo.

13. El anticuerpo o fragmento del mismo según cualquiera de las reivindicaciones 1-5 o la composición farmacéutica según cualquiera de las reivindicaciones 6-10, para uso en el tratamiento o la reducción de la probabilidad de: nefropatía, nefropatía asociada a BKV (BKVAN), cistitis hemorrágica (CH), leucoencefalopatía multifocal progresiva (LMP), neuronopatía de células granulares (NCG), enfermedad renal intersticial, estenosis ureteral, vasculitis, colitis, retinitis, meningitis y síndrome inflamatorio de reconstitución inmune (SIRI).

14. El anticuerpo o fragmento del mismo o la composición farmacéutica para uso según la reivindicación 13, en donde dicho anticuerpo o fragmento del mismo o dicha composición farmacéutica se administra a un paciente en combinación con uno o más agentes terapéuticos diferentes.

15. El anticuerpo o fragmento del mismo o la composición farmacéutica para uso según la reivindicación 14, en donde el agente terapéutico es un agente inmunosupresor.

16. El anticuerpo o fragmento del mismo o la composición farmacéutica para uso según la reivindicación 15, en donde el agente inmunosupresor es un inhibidor de la monofosfato deshidrogenasa, un inhibidor de la síntesis de purinas, un inhibidor de la calcineurina o un inhibidor de mTOR;

en donde el inhibidor de la monofosfato deshidrogenasa es micofenolato de mofetilo (MMF) o micofenolato de sodio;

el inhibidor de la síntesis de purinas es azatioprina,

el inhibidor de la calcineurina es tacrolimús o ciclosporina; o

el inhibidor de mTOR es sirolimús.

17. El anticuerpo o fragmento del mismo o la composición farmacéutica para uso según la reivindicación 14, en donde el agente terapéutico es un anticuerpo anti-VP1 adicional.

18. Un ácido nucleico que codifica el anticuerpo o fragmento que se une a antígeno según la reivindicación 1.

19. Un vector que comprende el ácido nucleico según la reivindicación 18.

20. Una célula hospedadora que comprende el vector según la reivindicación 19.

21. Un procedimiento para producir un anticuerpo o fragmento que se une a antígeno, que comprende cultivar la célula hospedadora y recuperar el anticuerpo desde el cultivo.

22. Un reactivo de diagnóstico que comprende el anticuerpo o fragmento del mismo que se une a antígeno según la reivindicación 1, que está marcado.

23. El reactivo de diagnóstico según la reivindicación 22, en donde el marcador se selecciona a partir del grupo que consiste en un radiomarcador, un fluoróforo, un cromóforo, un agente de formación de imágenes y un ion metálico.