ES2971677T3

ES2971677T3 - Método para la producción de tejido retiniano

Info

Publication number: ES2971677T3
Application number: ES16844465T
Authority: ES
Inventors: Satoshi Ando; Takao Kuroda; Yoshiki Sasai
Original assignee: Sumitomo Pharmaceuticals Co Ltd; Sumitomo Chemical Co Ltd; Sumitomo Pharma Co Ltd; RIKEN
Current assignee: Sumitomo Chemical Co Ltd; Sumitomo Pharma Co Ltd; RIKEN
Priority date: 2015-09-08
Filing date: 2016-09-08
Publication date: 2024-06-06
Anticipated expiration: 2036-09-08
Also published as: US20180245039A1; WO2017043604A1; JPWO2017043604A1; CA2998091A1; CA2998091C; EP3348631B1; EP3348631A1; JP6884354B2; JP7154546B2; EP3348631A4; JP2021118733A

Abstract

La presente invención proporciona un método para producir células retinianas o tejido retiniano, incluyendo el método los siguientes pasos 1-3: (1) un primer paso para cultivar células madre pluripotentes de mamíferos en un medio que contiene 1) factor de mantenimiento de pluripotencia y 2) MEK. inhibidor en ausencia de células alimentadoras durante un tiempo que no exceda los 30 días; (2) una segunda etapa para cultivar en suspensión las células obtenidas en la primera etapa y formar agregados de células; y (3) un tercer paso para cultivar en suspensión los agregados obtenidos en el segundo paso en presencia de un agonista de la vía de señalización de BMP, y obtener agregados que incluyen células retinianas o tejido retiniano. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Método para la producción de tejido retiniano

Campo técnico

La presente invención se refiere a un método para producir células retinianas o un tejido retiniano a partir de células madre pluripotentes.

Antecedentes de la técnica

Como un método para producir un tejido neural tal como tejido retiniano a partir de células madre pluripotentes, se ha reportado un método para producir tejido neural que comprende formar agregados uniformes de células madre pluripotentes en un medio sin suero, cultivarlas en suspensión, cultivarlas en suspensión en un medio para la inducción de la diferenciación en presencia de un factor inductor de la diferenciación y similares como apropiado para inducir la diferenciación de células madre pluripotentes en las células neurales deseadas (documento de patente 1 y documento de no patente 1). Por ejemplo son conocidos, un método para obtener un tejido retiniano multicapa a partir de células madre pluripotentes (documento de patente 2 y documento de no patente 2), y un método para obtener tejido retiniano multicapa que comprende formar agregados uniformes de células madre pluripotentes en un medio sin suero que contiene un inhibidor de la vía de señalización de Wnt, seguido de su cultivo en suspensión en presencia de una preparación de membrana basal, y después su cultivo en suspensión en un medio que contiene suero (documento de patente 3 y documento de no patente 3). Además, también se han reportado un método para inducir la diferenciación de células madre pluripotentes en un tejido hipotalámico (documento de patente 4 y documento de no patente 4), y un método para inducir la diferenciación de células madre pluripotentes en células progenitoras neurales (documentos de no patente 5 y 6). Se ha reportado un método para producir una célula relacionada con la retina o un tejido retiniano, que comprende cultivar agregados de células madre pluripotentes en suspensión en un medio que no contiene una sustancia activadora de la vía de transducción de señales de Sonic hedgehog pero que contiene una sustancia activadora de la vía de transducción de señales de BMP (documento de patente 5 y documento de no patente 10). Las células madre pluripotentes como material de partida de estos métodos de producción, particularmente en el caso de células madre pluripotentes de primates, se cultivaron en presencia de células alimentadoras en condiciones para mantener un estado indiferenciado mediante la adición de uno o más factores para el mantenimiento de un estado indiferenciado (método de cultivo de mantenimiento indiferenciado). En los últimos años, se han realizado mejoras en el método de cultivo para mantener un estado indiferenciado y se ha reportado un método para cultivar células madre pluripotentes de primates en ausencia de una célula alimentadora (en condiciones sin alimentación) con la adición de un factor para el mantenimiento de un estado indiferenciado (documento de no patente 7, documento de no patente 8 y documento de no patente 9).

Lista de documentos

Documentos de patente

Documento de patente 1: WO 2009/148170

Documento de patente 2: WO 2011/055855

Documento de patente 3: WO 2013/077425

Documento de patente 4: WO 2013/065763

Documento de patente 5: WO 2015/025967

Documentos de no patente

Documento de no patente 1: Cell Stem Cell, 3, 519-32 (2008)

Documento de no patente 2: Nature, 472, 51 -56 (2011)

Documento de no patente 3: Cell Stem Cell, 10(6), 771-775 (2012)

Documento de no patente 4: Nature, 480, 57-62 (2011)

Documento de no patente 5 : Nature Biotechnology, 27 (3), 275-80 (2009)

Documento de no patente 6: Proc Natl Acad Sci USA, 110(50), 20284-9 (2013)

Documento de no patente 7: Nature Methods, 8, 424-429 (2011)

Documento de no patente 8: Scientific Reports, 4, 3594 (2014)

Documento de no patente 9 :In Vitro Cell Dev Biol Anim., 46, 247-58 (2010)

Documento de no patente 10: Nature Communications, 6 (2015), Article number:6286

Compendio de la invención

Problemas a resolver por la invención

El problema que debe resolver la presente invención es proporcionar un método para producir eficientemente células retinianas o tejidos retinianos a partir de células madre pluripotentes preparadas o cultivadas en mantenimiento en ausencia de una célula alimentadora (en condiciones sin alimentación).

Medios de resolver los problemas

Los presentes inventores han realizado estudios en un intento de resolver los problemas antes mencionados y han descubierto que se puede formar un agregado celular que contiene células retinianas con alta eficiencia mediante el cultivo de células madre pluripotentes en ausencia de una célula alimentadora (en condiciones sin alimentación) en un medio que contiene (1) un factor para mantener un estado indiferenciado y (2) un inhibidor de la MAP quinasa (inhibidor de MEK), y después cultivar las células en suspensión.

Además, han descubierto que se puede formar un agregado celular que contiene células retinianas con alta eficacia cultivando células madre pluripotentes en ausencia de una célula alimentadora (en condiciones sin alimentación) en un medio que contiene (1) un factor para mantener una estado indiferenciado, (2) un inhibidor de MAP quinasa (inhibidor de MEK) y (3) un inhibidor de PKC o un inhibidor de B-Raf, y después cultivar las células en suspensión. Además, han descubierto que mediante el uso de este agregado celular, se pueden inducir células retinianas y tejidos retinianos con alta eficacia, lo que da como resultado la finalización de la presente invención.

Es decir, la presente invención se refiere a lo siguiente.

[1] Un método para producir una célula retiniana o un tejido retiniano, que comprende las siguientes etapas:

(1) una primera etapa de cultivar una célula madre pluripotente de mamífero en ausencia de una célula alimentadora durante un período que no exceda de 30 días en un medio que comprende

a) un factor para mantener un estado indiferenciado, en el que el factor para mantener un estado indiferenciado es una o más sustancias seleccionadas del grupo que consiste en bFGF, FGF4, FGF8, TGFp, TGFp2, Nodal, Activina A y Activina B y

b) un inhibidor de MEK,

(2) una segunda etapa de cultivar la célula obtenida en la primera etapa en suspensión para formar un agregado celular, y

(3) una tercera etapa de cultivar el agregado obtenido en la segunda etapa en suspensión en presencia de una sustancia activadora de la vía de transducción de señales de BMP para obtener un agregado que contiene una célula retiniana o un tejido retiniano, en donde la sustancia activadora de la vía de transducción de señales de BMP es una o más proteínas seleccionadas del grupo que consiste en BMP2, BMP4, BMP7 y GDF7.

[2] El método de producción según [1], en el que:

(a) el medio en la primera etapa comprende además un inhibidor de PKC o un inhibidor de B-Raf; y/o

(b) la primera etapa se realiza en condiciones sin suero; y/o

(c) la primera etapa se realiza con un método de cultivo de adhesión.

[3] El método de producción según [1] o [2], en el que el período de cultivo es de 0,5 días a 8 días, de 1 día a 6 días o de 4 días a 6 días en la primera etapa.

[4] El método de producción según uno cualquiera de [1] a [3], en el que el factor para el mantenimiento de un estado indiferenciado es bFGF.

[5] El método de producción según uno cualquiera de [1] a [4], en el que:

(a) el inhibidor de MEK es PD0325901;

(b) el inhibidor de PKC es Go6983; y/o

(c) el inhibidor de B-Raf es SB590885.

[6] El método de producción según uno cualquiera de [1] a [5], en el que las células se cultivan en presencia de un inhibidor de ROCK en la primera etapa.

[7] El método de producción según [6], en el que el inhibidor de ROCK es Y-27632.

[8] El método de producción según uno cualquiera de [1] a [7], en el que las células se cultivan en suspensión en un medio sin suero que contiene una sustancia activadora de la vía de transducción de señales de Sonic hedgehog en la segunda etapa, en el que la sustancia activadora de la vía de transducción de señales de Sonic hedgehog es una o más sustancias seleccionadas del grupo que consiste en Shh, Ihh, receptores de Shh, agonistas de Shh, Purmorfamina y SAG.

[9] El método de producción según [8], en el que la sustancia activadora de la vía de transducción de señales de Sonic hedgehog es SAG.

[10] El método de producción según uno cualquiera de [1] a [9], en el que la sustancia activadora de la vía de transducción de señales de BMP es BMP4.

[11] El método de producción según [8], en el que, en la segunda etapa, la concentración de la sustancia activadora de la vía de transducción de señales de Sonic hedgehog en el medio es una concentración correspondiente a la actividad de transducción de señales de Sonic hedgehog de SAG de 10 nM a 700 nM.

[12] El método de producción según uno cualquiera de [1] a [11], en el que, en la tercera etapa, la sustancia activadora de la vía de transducción de señales de BMP se añade al medio en un momento entre el día 1 y el día 9 o entre el día 3 y el día 6 desde el inicio de la segunda etapa.

[13] El método de producción según uno cualquiera de [1] a [12], en el que

(a) se forman agregados uniformes en la segunda etapa; y/o

(b) el cultivo en suspensión se realiza en ausencia de una preparación de membrana basal.

[14] El método de producción según uno cualquiera de [1] a [13], en el que la célula madre pluripotente es una célula madre pluripotente inducida.

[15] El método de producción según [14], en el que la célula madre pluripotente inducida es una célula madre pluripotente inducida humana.

Efecto de la invención

Según la presente invención, se puede producir con alta eficacia un agregado celular capaz de diferenciarse en una célula retiniana, y una célula retiniana y un tejido retiniano a partir de células madre pluripotentes cultivadas en ausencia de una célula alimentadora.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 muestra imágenes microscópicas de agregados celulares que contienen células progenitoras retinianas derivadas de células iPS humanas producidas mediante un método de producción de un tejido retiniano que comprende una etapa de cultivo de células iPS humanas en un medio que contiene un inhibidor de MEK y un inhibidor de PKC o un Inhibidor de B-Raf. 201B7: se utilizaron células iPS humanas (cepa 201B7). El día 20 después del cultivo en suspensión. 1231A3: se utilizaron células iPS humanas (cepa 1231A3). El día 21 después del cultivo en suspensión. Chx10: marcador de células progenitoras retinianas. DAPI: tinción nuclear celular. MEKi: inhibidor de MEK (PD0325901 1 pM), PKCi: inhibidor de PKC (Go69832 pM), B-Raf i: inhibidor de B-Raf (SB5908850,5 pM).

La Figura 2 muestra imágenes microscópicas de agregados celulares que contienen células progenitoras retinianas derivadas de células iPS humanas producidas mediante un método de producción de un tejido retiniano que comprende una etapa de cultivo de células iPS humanas en un medio que contiene un inhibidor de MEK, o un inhibidor de MEK y un inhibidor de PKC, y una etapa de cultivo de las células obtenidas en un medio que contiene una sustancia activadora de la vía de transducción de señales de Sonic hedgehog. 1231A3: se utilizaron células iPS humanas (cepa 1231A3). El día 10 después del cultivo en suspensión. MEKi: inhibidor de MEK (PD0325901 1 pM), PKCi: inhibidor de PKC (Go69832 pM), SAG: sustancia activadora de la vía de transducción de señales de Sonic hedgehog (SAG 30 nM).

La Figura 3 muestra imágenes microscópicas de agregados celulares que contienen células progenitoras retinianas derivadas de células iPS humanas producidas mediante un método de producción de un tejido retiniano que comprende una etapa de cultivo de células iPS humanas en un medio que contiene un inhibidor de MEK ± un inhibidor de PKC, y un etapa de cultivar las células obtenidas en un medio que contiene una sustancia activadora de la vía de transducción de señales de Sonic hedgehog. 1231A3: se utilizaron células iPS humanas (cepa 1231A3). El día 22 después del cultivo en suspensión. Pax6: marcador de células progenitoras retinianas. Chx10: marcador de células progenitoras retinianas. DAPl: tinción nuclear celular. MEKi: inhibidor de MEK (PD0325901 1 pM), PKCi: inhibidor de PKC (Go69832 pM), SAG: sustancia activadora de la vía de transducción de señales de Sonic hedgehog (SAG 30 nM).

Descripción de realizaciones

1. Definición

"Célula madre" significa una célula indiferenciada que tiene potencia de diferenciación y capacidad proliferativa (particularmente competencia de autorrenovación) manteniendo la potencia de diferenciación. La célula madre incluye subpoblaciones tales como células madre pluripotentes, células madre multipotentes, células madre unipotentes y similares según la potencia de diferenciación. Célula madre pluripotente se refiere a una célula madre capaz de cultivarse in vitro y que tiene una potencia para diferenciarse en cualquier linaje celular perteneciente a tres capas germinales (ectodermo, mesodermo, endodermo) (pluripotencia). La célula madre multipotente significa una célula madre que tiene una potencia para diferenciarse en varios tipos de tejidos o células, aunque no en todos los tipos. La célula madre unipotente significa una célula madre que tiene una potencia para diferenciarse en un tejido o célula particular.

Se pueden inducir células madre pluripotentes a partir de óvulos fertilizados no humanos, embriones clonados no humanos, células madre germinales, células madre en un tejido y similares. Los ejemplos de células madre pluripotentes incluyen células madre embrionarias no humanas (células ES), células EG no humanas (células germinales embrionarias), células madre pluripotentes inducidas (células iPS) y similares.

La célula madre embrionaria se estableció por primera vez en 1981 y también se ha aplicado a la generación de ratones knockout desde 1989. La célula EB5, que es una célula madre embrionaria de ratón, está disponible en Incorporated Administrative Agency RIKEN, y la línea celular D3, que es una célula madre embrionaria de ratón, está disponible en ATCC.

La célula ES de transferencia nuclear (célula ntES), que es una de las células ES, se puede establecer a partir de un embrión clonado no humano producido mediante el trasplante del núcleo de una célula somática no humana a un óvulo no humano del que se deriva una línea celular.

La "célula madre pluripotente inducida" (también llamada célula iPS) en la presente invención es una célula inducida para que tenga pluripotencia mediante la reprogramación de una célula somática mediante un método conocido y similares. Específicamente, se puede mencionar una célula inducida para que tenga pluripotencia mediante la reprogramación de células somáticas diferenciadas tales como fibroblastos, células mononucleares de sangre periférica y similares mediante la expresión de una combinación de una pluralidad de genes seleccionados del grupo que consiste en genes de reprogramación que incluyen Oct3/4, Sox2, Klf4, Myc (c-Myc, N-Myc, L-Myc), Glis1, Nanog, Sall4, lin28, Esrrb y similares. Ejemplos de combinación de factores de reprogramación preferibles incluyen (1) Oct3/4, Sox2, Klf4 y Myc (c-Myc o L-Myc), y (2) Oct3/4, Sox2, Klf4, Lin28 y L-Myc (Stem Cells, 2013; 31:458-466) y similares.

La célula madre pluripotente inducida fue establecida por Yamanaka et al. en células de ratón en 2006 (Cell, 2006, 126(4), pp.663-676). En 2007, también se estableció la célula madre pluripotente inducida a partir de fibroblastos humanos, y tiene pluripotencia y competencia de autorrenovación similares a las de las células madre embrionarias (Cell, 2007, 131(5), pp. 861-872; Science, 2007, 318(5858), pp.1917-1920; Nat. Biotechnol., 2008, 26(1), pp.101-106). Posteriormente se han realizado varias mejoras en el método de inducción de células madre pluripotentes inducidas (por ejemplo, células iPS de ratón: Cell. 2006 Aug 25; 126(4):663-76, células iPS humanas: Cell. 2007 Nov 30; 131 (5): 861-72) .

Además del método de producción de células madre pluripotentes inducidas basado en la reprogramación directa mediante expresión génica, también se pueden obtener células madre pluripotentes inducidas a partir de células somáticas mediante la adición de un compuesto y similares (Science, 2013, 341, pp. 651-654).

También es posible obtener células madre pluripotentes inducidas establecidas y, por ejemplo, líneas celulares pluripotentes inducidas humanas establecidas por Kyoto University tales como células 201B7, células 201B7-Ff, células 253G1, células 253G4, células 1201C1, células 1205D1, células 1210B2 células 1231A3, células Ff-I01, células QHJI01 y similares están disponibles en National University Corporation Kyoto University e iPS Academia Japan, Inc.

Si bien la célula somática utilizada para obtener células madre pluripotentes inducidas no está particularmente limitada, se pueden mencionar fibroblastos derivados de tejido, células de linaje sanguíneo (por ejemplo, células mononucleares de sangre periférica, células T), hepatocitos, células pancreáticas, células epiteliales intestinales, células de músculo liso y similares. Como fibroblastos, se pueden mencionar los derivados de la dermis y similares.

Cuando se producen células madre pluripotentes inducidas mediante reprogramación mediante la expresión de varios tipos de genes, los medios para la expresión génica no están particularmente limitados. Los ejemplos de los medios mencionados anteriormente incluyen un método de infección que usa un vector de virus (por ejemplo, vector de retrovirus, vector de lentivirus, vector de virus Sendai, vector de adenovirus, vector de virus adenoasociado), un método de transferencia de genes que usa un vector de plásmido (por ejemplo, vector de plásmido, vector episomal) (por ejemplo, método de fosfato cálcico, método de lipofección, método de RetroNectin, método de electroporación), un método de transferencia de genes usando un vector de RNA (por ejemplo, método de fosfato cálcico, método de lipofección, método de electroporación), un método con inyección directa de proteína y similares.

La célula madre pluripotente es preferiblemente una célula ES o una célula madre pluripotente inducida, más preferiblemente una célula madre pluripotente inducida.

Las células madre pluripotentes modificadas genéticamente se pueden producir utilizando, por ejemplo, una técnica de recombinación homóloga. Ejemplos del gen en el cromosoma que se va a modificar incluyen un gen marcador celular, un gen del antígeno de histocompatibilidad, un gen relacionado con una enfermedad debida a un trastorno de las células retinianas, etc. Un gen objetivo en el cromosoma se puede modificar utilizando los métodos descritos en Manipulating the Mouse Embryo, A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1994); Gene Targeting, A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press (1993); Biomanual Series 8, Gene Targeting, Making of Mutant Mouse using ES cell, YODOSHA CO., LTD. (1995); etcétera.

Para ser específico, por ejemplo, se aísla el DNA genómico que comprende el gen objetivo que se va a modificar (por ejemplo, gen marcador celular, gen del antígeno de histocompatibilidad, gen relacionado con la enfermedad, etc.), y un vector de direccionamiento usado para la recombinación homóloga del gen objetivo se produce usando el DNA genómico aislado. El vector de direccionamiento producido se introduce en células madre y se seleccionan las células que mostraron recombinación homóloga entre el gen objetivo y el vector de direccionamiento, con lo que se pueden producir células madre que tienen el gen modificado en el cromosoma.

Ejemplos del método para aislar DNA genómico que comprende el gen objetivo incluyen métodos conocidos descritos en Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons (1987-1997) etcétera. El gen genómico que comprende el gen objetivo también se puede aislar usando un sistema de detección de biblioteca de DNA genómico (fabricado por Genome Systems), Universal GenomeWalker Kits (fabricados por CLONTECH), etc. También se puede utilizar un polinucleótido que codifique la proteína objetivo en lugar del DNA del genoma. El polinucleótido se puede obtener mediante amplificación del polinucleótido correspondiente mediante el método de PCR.

La producción del vector de direccionamiento usado para la recombinación homóloga del gen objetivo y la selección eficaz de un recombinante homólogo se puede realizar según los métodos descritos en Gene Targeting, A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press (1993); Biomanual Series 8, Gene Targeting, Making of Mutant Mouse using ES cell, YODOSHA CO., LTD. (1995); etcétera. Como vector de direccionamiento, se puede utilizar cualquier tipo de sustitución o tipo de inserción. Como método de selección, se pueden usar métodos tales como selección positiva, selección del promotor, selección negativa, selección de poliA, etc.

Ejemplos de un método para seleccionar el recombinante homólogo deseado a partir de las líneas celulares seleccionadas incluyen el método de hibridación Southern, el método de PCR, etc. para el DNA genómico.

"Mamífero" abarca roedores, ungulados, carnívoros, primates y similares. Los roedores abarcan ratones, ratas, hámsteres, cobayas y similares. Los ungulados abarcan cerdos, bovinos, cabras, caballos, ovejas y similares. Los carnívoros abarcan perros, gatos y similares. "Primates" se refiere a mamíferos que pertenecen al primate, y los primates incluyen estrepsirrinos tales como lémures, loris, tupai y similares, y antropoideos tales como monos, simios, humanos y similares.

Las células madre pluripotentes que se van a usar en la presente invención son células madre pluripotentes de mamíferos y pueden ser células madre pluripotentes de roedores (por ejemplo, ratón, rata) o primates (por ejemplo, humanos, monos), preferiblemente células madre pluripotentes humanas.

La célula madre pluripotente que se va a utilizar en la presente invención es lo más preferiblemente una célula madre pluripotente inducida humana (célula iPS humana).

El "cultivo en suspensión" o "método de cultivo en suspensión" en la presente invención se refiere a cultivar mientras se mantiene un estado en el que las células o agregados celulares se suspenden en un medio de cultivo y un método para realizar el cultivo. Es decir, el cultivo en suspensión se realiza en condiciones en las que las células o agregados celulares no se adhieren a un recipiente de cultivo y similares, y el cultivo realizado en condiciones que permiten la adhesión a un recipiente de cultivo y similares (cultivo de adhesión o método de cultivo por adhesión) no está incluido en la categoría de cultivo en suspensión. En este caso, la adhesión de células significa que se forma una fuerte unión célula-sustrato entre una célula o agregado celular y un recipiente de cultivo. Más particularmente, el cultivo en suspensión se refiere al cultivo en condiciones en las que no se forma una fuerte unión célula-sustrato entre una célula o agregado celular y un recipiente de cultivo, y "cultivo por adhesión" se refiere al cultivo en condiciones en las que se forma una fuerte unión célula-sustrato entre una célula o agregado celular y un recipiente de cultivo y similares.

En un agregado celular en cultivo en suspensión, se forma una adhesión plana célula-célula. En agregados celulares en cultivo en suspensión, apenas se forma una unión célula-sustrato con un recipiente de cultivo y similares e, incluso si se forma, su contribución es pequeña. Puede estar presente una unión endógena entre células y sustrato dentro del agregado, pero difícilmente se forma una unión entre células y sustrato con un recipiente de cultivo y similares e, incluso si se forma, su contribución es pequeña.

La adhesión plana célula-célula (unión plana) significa que una célula se une a otra mediante planos. Más particularmente, la adhesión célula-célula plana significa que, por ejemplo, no menos del 1%, preferiblemente no menos del 3%, más preferiblemente no menos del 5%, del área superficial de una célula se adhiere a la superficie de otra célula. Se puede observar la superficie de una célula tiñendo con un reactivo (por ejemplo, DiI) que tiñe las membranas, inmunotinción de moléculas de adhesión celular (por ejemplo, E-cadherina y N-cadherina).

El recipiente de cultivo celular que se utilizará al realizar el cultivo en suspensión no está particularmente limitado siempre que permita el "cultivo en suspensión" y los expertos en la técnica puedan determinarlo adecuadamente. Ejemplos de dichos recipientes de cultivo celular incluyen matraces, matraces de cultivo de tejidos, placas, placas de Petri, placas de cultivo de tejidos, placas múltiples, microplacas, placas de micropocillos, microporos, placas múltiples, placas de múltiples pocillos, portaobjetos de cámara, escalas, tubos, bandejas, bolsas de cultivo y matraces giratorios, botella con rodillo, etc. Para permitir el cultivo en suspensión, estos recipientes de cultivo son preferiblemente no adherentes a las células. Los recipientes de cultivo no adherentes a las células útiles incluyen recipientes de cultivo cuyas superficies no se han sometido a un tratamiento artificial para mejorar la adhesividad celular (por ejemplo, tratamiento de superficie tal como tratamiento de recubrimiento con matriz extracelular tal como preparación de membrana basal, laminina, entactina, colágeno, gelatina, etc., y similares, o polímero tal como polilisina, poliornitina y similares o tratamiento con carga eléctrica positiva y similares), y similares. Como recipiente de cultivo no adherente a las células, se pueden usar recipientes de cultivo cuyas superficies hayan sido tratadas artificialmente para disminuir la adhesividad a las células (por ejemplo, tratamiento superhidrófilo con polímero MPC y similares, tratamiento de baja adsorción de proteínas, etc.) y similares. Se puede realizar un cultivo con rodillo usando un matraz giratorio, una botella con rodillo y similares. La superficie de cultivo del recipiente de cultivo puede ser un fondo plano o puede tener cóncavas y convexas.

Como recipiente de cultivo utilizado para el cultivo de adhesión, se pueden mencionar recipientes de cultivo cuyas superficies hayan sido tratadas artificialmente para mejorar la adhesividad celular (por ejemplo, tratamiento de superficie tal como tratamiento de recubrimiento con matriz extracelular tal como preparación de membrana basal, laminina, entactina, colágeno, gelatina, Matrigel, Synthemax, vitronectina y similares, o polímeros tales como polilisina, poliornitina y similares, o procesamiento de superficie mediante un tratamiento de carga eléctrica positiva) y similares.

El medio a utilizar para cultivar células en la presente invención se puede preparar a partir de un medio utilizado generalmente para cultivar células animales como un medio basal. Los ejemplos del medio basal incluyen medios que se pueden usar para cultivar células animales tales como medio BME, medio BGJb, medio CMRL1066, medio Glasgow MEM, medio m Em Zinc Option mejorado, medio IMDM, medio Medium199, medio Eagle MEM, medio aMEM, medio DMEM, medio F-12, medio DMEM/F-12, medio IMDM/F12, medio Ham, medio RPMI1640, medio de Fischer y medio mixto de los mismos, etc.

El "medio sin suero" en la presente invención significa un medio sin suero no ajustado o no purificado. Un medio que contiene componentes derivados de sangre purificados y componentes derivados de tejidos animales (por ejemplo, factor de crecimiento) también se incluye en un medio sin suero a menos que contenga suero no purificado o no ajustado.

Las "condiciones sin suero" significan condiciones sin suero no ajustado o no purificado, específicamente, condiciones que utilizan un medio sin suero.

El medio sin suero puede contener un sustituto de suero. Ejemplos de sustituto de suero incluyen uno que contiene apropiadamente albúmina, transferrina, ácido graso, precursor de colágeno, oligoelemento, 2-mercaptoetanol o 3'-tiolglicerol, o equivalentes de estos, etc. Dicho sustituto de suero puede prepararse mediante, por ejemplo, el método descrito en el documento de Patente WO98/30679. El sustituto del suero también puede ser un producto disponible comercialmente. Ejemplos de dicho sustituto de suero disponible comercialmente incluyen Knockout™ Serum Replacement (Life Technologies: en adelante a veces se indicará como KSR), concentrado de lípidos definidos químicamente (fabricado por Life Technologies) y Glutamax™(fabricado por Life Technologies), B27 (fabricado por Life Technologies), N2 (fabricado por Life Technologies).

El medio sin suero que se utilizará para el cultivo en suspensión puede contener apropiadamente un ácido graso o lípido, aminoácido (por ejemplo, aminoácidos no esenciales), vitamina, factor de crecimiento, citoquina, antioxidante, 2-mercaptoetanol, ácido pirúvico, agente tampón, sales inorgánicas, etc.

Para evitar una preparación complicada, se puede utilizar como tal un medio sin suero suplementado con una cantidad apropiada (por ejemplo, aproximadamente de 0,5% a aproximadamente 30%, preferiblemente de aproximadamente 1% a aproximadamente 20%) de KSR disponible comercialmente (fabricado por Life Technologies) (por ejemplo, medio de una mezcla 1:1 de medio F-12 y medio IMDM suplementado con KSR al 10 % y 1-monotioglicerol 450 pM). Como un producto equivalente a KSR, se puede mencionar el medio descrito en el documento de Patente JP-A-2001-508302.

"Medio que contiene suero" significa un medio que contiene suero no ajustado o no purificado. El medio puede contener un ácido graso, lípido, aminoácido (por ejemplo, aminoácidos no esenciales), vitamina, factor de crecimiento, citoquina, antioxidante, 2-mercaptoetanol, 1-monotioglicerol, ácido pirúvico, agente tampón, sales inorgánicas, etc. Por ejemplo, se puede usar un medio de suero en la etapa de mantenimiento de la célula retiniana o el tejido retiniano producido por la presente invención (Cell Stem Cell, 10(6), 771-775 (2012)).

El cultivo se realiza preferiblemente en condiciones sin xeno. "Sin xeno" significa condiciones que eliminan componentes derivados de especies diferentes a la de la célula que se va a cultivar.

"Medio que contiene sustancia X" o "en presencia de sustancia X" se refiere a un medio suplementado con una sustancia exógena X o un medio que contiene una sustancia exógena X, o en presencia de una sustancia exógena X. Es decir, cuando las células o los tejidos presentes en el medio expresan, secretan o producen de manera endógena la sustancia X, la sustancia endógena X se distingue de la sustancia exógena X, y se entiende que un medio sin sustancia exógena X queda fuera de la categoría de "medio que contiene la sustancia X" , incluso cuando contiene una sustancia endógena X.

Por ejemplo, un "medio que contiene un factor para mantener un estado indiferenciado" es un medio suplementado con un factor exógeno para mantener un estado indiferenciado o un medio que contiene un factor exógeno para mantener un estado indiferenciado.

En la presente invención, una célula alimentadora se refiere a una célula distinta de una célula madre que coexiste cuando se cultiva la célula madre. Ejemplos de células alimentadoras utilizadas para cultivar células madre pluripotentes mientras se mantiene un estado indiferenciado incluyen fibroblastos de ratón (MEF), fibroblastos humanos, células SNL y similares. Como células alimentadoras, son preferibles las células alimentadoras que se sometieron a un tratamiento de supresión del crecimiento. Los ejemplos del tratamiento de supresión del crecimiento incluyen tratamiento con un inhibidor del crecimiento (por ejemplo, mitomicina C), radiación gamma, irradiación UV y similares. Las células alimentadoras utilizadas para cultivar células madre pluripotentes mientras se mantiene un estado indiferenciado contribuyen al mantenimiento de la indiferenciación de células madre pluripotentes mediante la secreción de un factor humoral (preferiblemente un factor para mantener un estado indiferenciado) o la producción de un andamio para la adhesión celular (sustrato extracelular).

En la presente invención, la ausencia de células alimentadoras (en condiciones sin alimentación) significa cultivar en ausencia de una célula alimentadora. La ausencia de células alimentadoras significa, por ejemplo, condiciones sin adición de células alimentadoras, o condiciones sustancialmente sin células alimentadoras (por ejemplo, la relación entre el número de células alimentadoras con respecto al número total de células no es superior al 3%).

En la presente invención, un "agregado" de células se refiere a un grupo formado por el ensamblaje de células dispersas en un medio, en donde las células se adhieren entre sí. Los agregados celulares también incluyen grupos de células, cuerpos embrioides, esferas y esferoides. Preferiblemente, se forma una adhesión célula-célula plana en el agregado de células. Las células a veces forman una unión célula-célula y/o una adhesión celular, por ejemplo, unión de adherencia, en algunos o todos los agregados. El "agregado" en la presente invención incluye específicamente un agregado producido en la segunda etapa de la presente invención mencionada anteriormente [1], que está formado por células dispersas en el momento del inicio del cultivo en suspensión, y un agregado producido en la tercera etapa de la presente invención [1] mencionada anteriormente, que contiene células retinianas inducidas diferenciadas a partir de células madre pluripotentes, y el "agregado" también incluye un agregado ya formado en el momento del inicio de la segunda etapa en la presente invención mencionada anteriormente [1] (es decir, en el momento del inicio del cultivo en suspensión). El agregado celular formado en la segunda etapa abarca el "cuerpo embrioide (EB)".

En la presente invención, "agregados uniformes" significa que el tamaño de cada agregado es constante cuando se cultiva una pluralidad de agregados, y que la variación en la longitud del diámetro máximo es pequeña cuando el tamaño de los agregados se evalúa mediante la longitud del diámetro máximo. Más específicamente, significa que no menos del 75% de los agregados en la población de agregados total están dentro de la media ± 100%, preferiblemente de la media ± 50%, más preferiblemente de la media ± 20%, del diámetro máximo en la población de agregados.

"Formar agregados celulares uniformes" significa "añadir rápidamente un número dado de células dispersas" para formar agregados celulares de tamaño uniforme, al reunir las células para formar agregados celulares y cultivar los agregados en suspensión.

La dispersión se refiere a dividir células o un tejido en pequeños grupos de células (no menos de 2 células y no más de 100 células, preferiblemente no más de 50 células) o células individuales mediante un tratamiento de dispersión tal como tratamiento enzimático, tratamiento físico y similares. Un número determinado de células dispersas es una colección de un determinado número de grupos de células o células individuales.

Ejemplos del método de dispersión de células madre pluripotentes incluyen tratamiento de dispersión mecánica, tratamiento de solución de dispersión celular y tratamiento de adición de agente protector celular. Estos tratamientos se pueden realizar en combinación. Preferiblemente, se realiza un tratamiento de dispersión celular y después se realiza un tratamiento de dispersión mecánica.

Como un método de tratamiento de dispersión mecánica se puede mencionar el tratamiento con pipeta o la operación de raspado mediante un raspador.

Como solución de dispersión celular para su uso en el tratamiento de solución de dispersión celular, se puede utilizar una solución que contenga una cualquiera de las enzimas tales como tripsina, colagenasa, hialuronidasa, elastasa, pronasa, DNasa, papaína, etc., y se puede mencionar un agente quelante tal como ácido etilendiaminotetraacético, etc. También se puede utilizar una solución de dispersión celular disponible comercialmente tal como TripLE Select (fabricado por Life Technologies) y TripLE Express (fabricado por Life Technologies).

Cuando las células madre pluripotentes se dispersan o hasta que las células dispersas formen un agregado, la muerte celular de las células madre pluripotentes que no han formado un agregado puede suprimirse mediante un tratamiento con un agente protector celular. Como agente protector celular para su uso en el tratamiento con agente protector celular, se puede mencionar una sustancia activadora de la vía de transducción de señales de FGF, heparina, inhibidor de quinasa en espiral asociada a Rho (ROCK), suero o sustituto de suero. Como agente protector celular preferible, se puede mencionar un inhibidor de ROCK. Como inhibidor de ROCK se pueden mencionar Y-27632, Fasudil o H-1152. Si bien los expertos en la técnica pueden establecer apropiadamente la concentración de un inhibidor de ROCK, por ejemplo, se puede establecer dentro de un intervalo de concentración correspondiente a una actividad inhibidora de r Oc K con aproximadamente 50 nM - 200 pM de Y-27632.

Por ejemplo, un método para dispersar células madre pluripotentes incluye, por ejemplo, un método que implica tratar una colonia de células madre pluripotentes con una solución de dispersión celular (TrypLE Select) en presencia de un inhibidor de ROCK así como un agente protector celular, y dispersarlos adicionalmente mediante pipeteo.

En el método de producción, es preferible formar un agregado de células madre pluripotentes reuniendo rápidamente las células madre pluripotentes. Cuando se forma un agregado de células madre pluripotentes de dicha manera, se puede formar una estructura similar a un epitelio con buena reproducibilidad en las células inducidas y diferenciadas del agregado formado. Ejemplos de operación experimental para formar un agregado incluyen un método que implica mantener las células en un espacio pequeño usando una placa con pocillos pequeños (por ejemplo, una placa con pocillos que tiene un área de base de aproximadamente 0,1 - 2,0 cm2 cuando se calcula en términos de fondo plano), microporos, etc., un método que implica añadir células mediante centrifugación durante un período breve utilizando un pequeño tubo de centrifugación. Como una placa con pocillos pequeños, por ejemplo, una placa de 24 pocillos (área de aproximadamente 1,88 cm2 cuando se calcula en términos de fondo plano), placa de 48 pocillos (área de aproximadamente 1,0 cm2 cuando se calcula en términos de fondo plano), placa de 96 pocillos (área de aproximadamente 0,35 cm2 cuando se calcula en términos de fondo plano, diámetro interior de aproximadamente 6 -8 mm) y se puede mencionar una placa de 384 pocillos. Se prefiere la placa de 96 pocillos. Como una forma de la placa con pocillos pequeños, la forma de la superficie inferior cuando se ve el pocillo desde arriba es, por ejemplo, polígono, rectángulo, elipse, círculo verdadero, preferiblemente círculo verdadero. Como una forma de la placa con pequeños pocillos cuando el pocillo se ve desde el lateral, la forma de la superficie inferior es preferiblemente una estructura que tiene una circunferencia exterior alta y una cóncava interior baja. Por ejemplo, se pueden mencionar fondo en U, fondo en V, fondo p, preferiblemente fondo en U o fondo en V, más preferiblemente fondo en V. Como una placa con pocillos pequeños, también se puede utilizar una placa de cultivo celular (por ejemplo, placa de 60 mm -150 mm, matraz de cultivo) con una superficie cóncava-convexa o abollada (por ejemplo, EZSPHERE (Asahi Techno Glass)) en la superficie inferior. La superficie inferior de una placa con pocillos pequeños es preferiblemente una superficie inferior sin adhesivo celular, preferiblemente la superficie inferior recubierta sin adhesivo celular antes mencionada.

La formación de agregados de células madre pluripotentes y la formación de una estructura de tipo epitelial en el agregado se puede confirmar basándose en la morfología macroscópica del agregado, la morfología microscópica mediante análisis de tinción del tejido, la distribución de células que expresan marcadores de diferenciación e indiferenciación y similares.

"Tejido" se refiere a una estructura de una población celular que tiene una estructura en la que varios tipos de células que tienen diferentes morfologías y propiedades están dispuestas estéricamente en un patrón determinado.

En la presente invención, el "tejido retiniano" significa un tejido en el que al menos dos o más tipos de células tales como células fotorreceptoras, células horizontales, células bipolares, células amacrinas, células ganglionares de la retina, sus progenitores/células progenitoras y células progenitoras retinianas, etc., que constituyen las respectivas capas retinianas en la retina in vivo, están dispuestas estéricamente en capas. La capa retiniana que está constituida por cada célula puede confirmarse mediante un método conocido, por ejemplo, la presencia o ausencia de la expresión de un marcador celular o el nivel del mismo, etc.

"Capa retiniana" significa cada capa que constituye la retina. Ejemplos específicos de las mismas incluyen capa epitelial pigmentaria de la retina, capa de fotorreceptores, membrana limitante externa, capa nuclear externa, capa plexiforme externa, capa nuclear interna, capa plexiforme interna, capa de células ganglionares, capa de fibras nerviosas y membrana limitante interna.

"Célula progenitora retiniana" se refiere a una célula progenitora capaz de diferenciarse en cualquier célula retiniana madura, incluyendo células fotorreceptoras, células horizontales, células bipolares, células amacrinas, células ganglionares de la retina, células epiteliales pigmentarias de la retina y similares.

La célula progenitora fotorreceptora, la célula progenitora de células horizontales, la célula progenitora de células bipolares, la célula progenitora de células amacrinas, la célula progenitora de células ganglionares de la retina y la célula progenitora del epitelio pigmentario de la retina se refieren a células progenitoras comprometidas para diferenciarse en células fotorreceptoras, células horizontales, células bipolares, células amacrinas, células ganglionares de la retina y células epiteliales pigmentarias de la retina, respectivamente.

"Neurona específica de la capa de la retina" es una célula que constituye una capa de la retina y es una célula neuronal específica de la capa de la retina. Ejemplos de neurona específica de la capa de la retina incluyen células bipolares, células ganglionares de la retina, células amacrinas, células horizontales y células fotorreceptoras, y ejemplos de células fotorreceptoras incluyen células de bastones y células de conos.

La "célula retiniana" en la presente invención abarca la célula progenitora retiniana, la neurona específica de la capa de la retina y la célula progenitora de la neurona específica de la capa de la retina antes mencionadas.

Los ejemplos del marcador de células retinianas incluyen Rx (también denominado como Rax), PAX6 y Chx10 expresados en células progenitoras retinianas, Nkx2.1 expresado en células progenitoras de neuronas del hipotálamo pero no expresado en células progenitoras retinianas, Sox1 expresado en neuroepitelio del hipotálamo pero no expresado en la retina, Crx y Blimp1 expresados en células progenitoras de células fotorreceptoras, y similares. Ejemplos del marcador de la neurona específica de la capa de la retina incluyen Chx10, PKCa y L7 expresados en células bipolares, TUJI y Brn3 expresados en células ganglionares de la retina, Calretinina expresada en células amacrinas, Calbindina expresada en células horizontales, Rodopsina y Recoverina expresadas en células fotorreceptoras maduras, Nrl expresado en células de bastón, Rxr-gamma expresado en células de cono, RPE65 y Mitf expresado en células del epitelio pigmentario de la retina y similares.

2. Método para producir células retinianas o un tejido retiniano.

El método de producción es un método para producir una célula retiniana o un tejido retiniano, que comprende las siguientes etapas:

(1) una primera etapa de cultivar una célula madre pluripotente de mamífero en ausencia de una célula alimentadora durante un período que no exceda de 30 días en un medio que comprende 1) un factor para mantener un estado indiferenciado y 2) un inhibidor de MEK,

(2) una segunda etapa de cultivar las células obtenidas en la primera etapa en suspensión para formar un agregado celular, y

(3) una tercera etapa de cultivar el agregado obtenido en la segunda etapa en suspensión en presencia de una sustancia activadora de la vía de transducción de señales de BMP para obtener un agregado que contiene una célula retiniana o un tejido retiniano.

(1) La primera etapa

Como una célula madre pluripotente preferible en la primera etapa, se pueden mencionar células madre pluripotentes inducidas, más preferiblemente células madre pluripotentes inducidas humanas. El método de producción de células madre pluripotentes inducidas no está particularmente limitado y puede producirse mediante un método bien conocido por los expertos en la técnica como se mencionó anteriormente. También es deseable realizar una etapa para preparar células madre pluripotentes inducidas (es decir, una etapa de reprogramación de células somáticas para establecer células madre pluripotentes) en condiciones sin alimentación.

El cultivo de mantenimiento o el cultivo de expansión para obtener células madre pluripotentes para utilizarlas en la primera etapa se puede realizar mediante un método bien conocido por los expertos en la técnica como se mencionó anteriormente. Si bien el cultivo de mantenimiento y el cultivo de expansión de células madre pluripotentes se pueden realizar mediante un cultivo por adhesión o un cultivo en suspensión, se realiza preferiblemente mediante un cultivo por adhesión. Si bien la etapa de cultivo de mantenimiento y cultivo de expansión de células madre pluripotentes se puede realizar en presencia de un alimentador o en condiciones sin alimentador, se realiza preferiblemente en condiciones sin alimentador.

El método de producción puede comprender, antes de la etapa (1), una etapa de mantenimiento de una célula madre pluripotente en condiciones sin alimentación y proporcionar la célula madre pluripotente mantenida en condiciones sin alimentador. Si bien el período de mantenimiento en condiciones sin alimentación no está particularmente limitado mientras se produzcan células retinianas o tejidos retinianos, generalmente no es inferior a un día, preferiblemente no menos de 3 días, más preferiblemente no menos de 7 días. No existe un límite superior teórico en el período de mantenimiento en condiciones sin alimentación, y las células madre pluripotentes se pueden cultivar y expandir de manera semipermanente mientras se mantiene la pluripotencia en condiciones de cultivo apropiadas y en condiciones sin alimentación. Sin embargo, cuando las células madre pluripotentes se mantienen durante un largo plazo, puede aumentar el riesgo de su diferenciación y pérdida de pluripotencia. Por lo tanto, el período para el mantenimiento en condiciones sin alimentación es, por ejemplo, de 6 meses, preferiblemente de aproximadamente 3 meses, y el número de pases es, por ejemplo, de 30 pases, preferiblemente de 20 pases. El cultivo de mantenimiento en condiciones sin alimentación se puede realizar en las condiciones de cultivo de la primera etapa descrito en detalle a continuación, excepto que el medio no contenga un inhibidor de MEK, un inhibidor de PKC o un inhibidor de B-Raf.

Cuando se recuperan las células madre pluripotentes que se sometieron a cultivo de mantenimiento o cultivo de expansión en condiciones sin alimentación, se preparan células madre pluripotentes dispersas mediante una operación de dispersión. Una operación de dispersión de las células madre pluripotentes incluye tratamiento de dispersión mecánica, tratamiento de solución de dispersión celular o tratamiento con adición de agente protector celular, mencionado anteriormente. Estos tratamientos se pueden realizar en combinación. Preferiblemente, el tratamiento de dispersión celular se realiza simultáneamente con el tratamiento de adición de agente protector celular y después se realiza el tratamiento de dispersión mecánica.

Como agente protector celular usado para el tratamiento de adición de agente protector celular, se pueden mencionar heparina, suero y sustituto de suero. Para suprimir la muerte celular inducida por la dispersión (en particular, la muerte celular de células madre pluripotentes humanas), se puede añadir un inhibidor de la quinasa en espiral asociada a Rho (ROCK) en el momento de la dispersión. Como un inhibidor de ROCK, se pueden mencionar Y-27632, Fasudil (HA1077), H-1152 y similares.

Como una solución de dispersión celular para su uso en el tratamiento de dispersión celular, se puede utilizar una solución que contenga una cualquiera de las enzimas tales como tripsina, colagenasa, hialuronidasa, elastasa, pronasa, DNasa, papaína, etc., y se puede mencionar un agente quelante tal como ácido etilendiaminotetraacético, etc. También se puede utilizar una solución de dispersión celular disponible comercialmente tal como TrypLE Select (fabricado por Life Technologies) y TrypLE Express (fabricado por Life Technologies).

Como un método del tratamiento de dispersión mecánico se puede mencionar un tratamiento de pipeteo o un raspado mediante un rascador.

Las células madre pluripotentes dispersas se siembran en un nuevo recipiente de cultivo y se someten a la primera etapa.

Para suprimir la muerte celular inducida por la dispersión (en particular, la muerte celular de células madre pluripotentes humanas), las células madre pluripotentes se pueden sembrar en un nuevo recipiente de cultivo, el cultivo de mantenimiento se puede realizar de forma continua en condiciones sin alimentación en presencia de un inhibidor de ROCK, y la primera etapa puede iniciarse a partir de entonces. Si bien el período de tratamiento con un inhibidor de ROCK no está particularmente limitado siempre que pueda suprimirse la muerte celular inducida por la dispersión, generalmente es de aproximadamente 12 - 24 horas.

El factor para mantener un estado indiferenciado no está particularmente limitado siempre que sea una sustancia que tenga una acción para suprimir la diferenciación de células madre pluripotentes. Generalmente es un factor para mantener un estado indiferenciado derivado de un mamífero. Dado que el factor para mantener un estado indiferenciado puede tener reactividad cruzada entre especies de mamíferos, también se puede usar un factor para mantener un estado indiferenciado de cualquier mamífero siempre que se pueda mantener el estado indiferenciado de las células madre pluripotentes que se van a cultivar. Preferiblemente, se usa un factor para mantener un estado indiferenciado de un mamífero de la misma especie que las células que se van a cultivar.

Ejemplos del factor para mantener un estado indiferenciado ampliamente utilizado por los expertos en la técnica incluyen una sustancia activadora de la vía de transducción de señales de FGF, una sustancia activadora de la vía de transducción de señales de la familia TGFp y similares en el caso de células madre pluripotentes cebadas (por ejemplo, células ES humanas, células iPS humanas). Como sustancia activadora de la vía de transducción de señales de FGF, se pueden mencionar específicamente factores de crecimiento de fibroblastos (por ejemplo, bFGF, FGF4, FGF8). Como sustancia activadora de la vía de transducción de señales de la familia TGFp, se pueden mencionar una sustancia activadora de la vía de transducción de señales de TGFp, una sustancia activadora de la vía de transducción de señales Nodal/Activina. Como sustancia activadora de la vía de transducción de señales de TGFp, se pueden mencionar TGFp1 y TGFp2. Como sustancia activadora de la vía de transducción de señales de Nodal/Activina, se pueden mencionar Nodal, Activina A, Activina B. Cuando se cultivan células madre pluripotentes humanas (células ES humanas, células iPS humanas), el factor para mantener un estado indiferenciado es preferiblemente bFGF.

Preferiblemente se aísla el factor para mantener un estado indiferenciado a utilizar. Estar "aislado" significa que se ha realizado una operación para eliminar factores distintos del componente o célula previstos, y el componente o célula ya no se encuentra en un estado natural. Por lo tanto, "proteína X aislada" no incluye una proteína X endógena producida a partir de las células o tejido que se van a cultivar y contenida en una célula o tejido o en el medio. La pureza de la "proteína X aislada" (porcentaje del peso de la proteína X con respecto al peso total de la proteína) es generalmente no menos del 70 %, preferiblemente no menos del 80 %, más preferiblemente no menos del 90 %, más preferiblemente no menos del 99%, lo más preferiblemente 100%.

Se puede añadir un factor aislado para mantener un estado indiferenciado a un medio utilizado en la primera etapa. Alternativamente, se puede añadir de antemano un factor para mantener un estado indiferenciado a un medio que se utilizará en la primera etapa. Para ser específico, en la primera etapa se puede usar el medio basal antes mencionado suplementado con un factor de mantenimiento indiferenciado o un medio disponible comercialmente que contiene un factor de mantenimiento indiferenciado para cultivar células indiferenciadas tales como células madre o células iPS y similares.

La concentración del factor para mantener un estado indiferenciado en el medio a usar en la primera etapa es una concentración capaz de mantener el estado indiferenciado de las células madre pluripotentes a cultivar, y puede ser determinada de manera apropiada por aquellos expertos en la técnica. Por ejemplo, específicamente, cuando se usa bFGF como un factor para mantener un estado indiferenciado en ausencia de una célula alimentadora, la concentración del mismo es generalmente de aproximadamente 4 ng - 500 ng/mL, preferiblemente de 10 ng - 200 ng/mL, más preferiblemente aproximadamente de 30 ng - 150 ng/mL.

El inhibidor de MEK no está particularmente limitado siempre que sea una sustancia que inhiba la expresión o actividad de la familia MEK, y puede ser uno cualquiera de proteínas, ácidos nucleicos y compuestos de bajo peso molecular. Como familia MEK representativa, se pueden mencionar MEK1, MEK2, MEK3 y similares, y el inhibidor de MEK es una sustancia que inhibe la expresión o actividad de una, una pluralidad o todas estas familias MEK. Los ejemplos de la sustancia incluyen, pero no se limitan a, sustancias (por ejemplo, oligonucleótidos antisentido, siRNA, etc.) que suprimen la expresión de genes que codifican diversas MEKs y sustancias que inhiben la actividad enzimática de diversas MEKs. Los ejemplos específicos del inhibidor de MEK incluyen, pero no se limitan a, compuestos de bajo peso molecular tales como PD0325901 (N-[(2R)-2,3-dihidroxipropoxi-3,4-difluoro-2-[(2-fluoro-4-yodofenil)amino]-benzamida), PD184352 (2-(2-cloro-4-indofenilamino)-N-ciclopropilmetoxi-3,4-difluorobenzamido), PD98059 (2'-amino-3'-metoxiflavona), U0126 (1,4-diamino-2,3-diciano-1,4-bis[2-amino-feniltio]butadieno), MEK162 (5-[(4-bromo-2-fluorofenil)amino]-4-fluoro-N-(2-hidroxietoxi)-1 -metil-1 H-bencimidazol-6-carboxamida), SL327 (a-[amino[(4-aminofenil)tio]metilen]-2-(trifluorometil)bencenoacetonitrilo) y similares. PD0325901, PD184352, PD98059, U0126, MEK162 y SL327 son inhibidores de MEK conocidos y se pueden obtener productos comercialmente disponibles y similares según sea apropiado. Como inhibidor de MEK, se prefiere PD0325901, PD184352 o U0126, y más preferido es PD0325901.

En el método de la presente invención, la concentración del inhibidor de MEK contenido en el medio no está particularmente limitada siempre que se pueda producir una célula retiniana o tejido retiniano de un mamífero mediante el método de la presente invención, y se pueda determinar apropiadamente según el tipo de inhibidor de MEK. Por ejemplo, la concentración del inhibidor de MEK está en un intervalo de concentración que muestra una actividad inhibidora de MEK correspondiente a 0,001 - 10 pM, preferiblemente 0,005 - 5 pM, particularmente preferiblemente 0,01 - 2,5 pM, de PD0325901.

En el método de la presente invención, el medio usado en la primera etapa puede contener un inhibidor de PKC o un inhibidor de B-Raf así como un factor para mantener un estado indiferenciado y un inhibidor de MEK. Se espera que la adición de un inhibidor de PKC o un inhibidor de B-Raf mejore la eficiencia de producción de un agregado celular capaz de diferenciarse en células retinianas, o células retinianas y tejidos retinianos.

El inhibidor de PKC no está particularmente limitado siempre que sea una sustancia capaz de inhibir la expresión o actividad de la proteína quinasa C (PKC), y puede ser uno cualquiera de proteínas, ácidos nucleicos y compuestos de bajo peso molecular. En la presente memoria, PKC es una familia de proteínas constituida por al menos 10 tipos de isoenzimas, y el inhibidor de PKC es una sustancia que inhibe la expresión o actividad de una, una pluralidad o todas estas familias de PKC. Los ejemplos de la sustancia incluyen, pero no se limitan a, una sustancia que suprime la expresión de un gen que codifica PKC (por ejemplo, oligonucleótido antisentido, siRNA, etc.), una sustancia que inhibe la actividad enzimática de PKC [por ejemplo, compuestos de bajo peso molecular tales como Go6983 (en donde "o" es diéresis) (3-[1-[3-(Dimetilamino)propil]-5-metoxi-1H-indol-3-il]-4-(1H-indol-3-il )-1H-pirrol-2,5-diona) y similares, y similares] y similares. Go6983 es un inhibidor de PKC conocido y se puede obtener fácilmente ya que está disponible comercialmente. Como inhibidor de PKC, se prefiere Go6983.

En el método de la presente invención, cuando el medio en la primera etapa contiene un inhibidor de PKC, la concentración del inhibidor de PKC contenido en el medio no está particularmente limitada siempre que el método de la presente invención pueda producir una célula retiniana o un tejido retiniano de un mamífero, y puede determinarse apropiadamente según el tipo de inhibidor de PKC. La concentración del inhibidor de PKC está, por ejemplo, dentro de un intervalo de concentración que muestra una actividad inhibidora de PKC correspondiente a 0,05 - 10 pM, preferiblemente 0,25 - 5 pM, más preferiblemente 0,5 - 2,5 pM, de Go6983.

El inhibidor de B-Raf no está particularmente limitado siempre que sea una sustancia que suprima la expresión o la actividad serina/treonina quinasa de B-Raf y puede ser uno cualquiera de proteínas, ácidos nucleicos y compuestos de bajo peso molecular. Los ejemplos de la sustancia incluyen, pero no se limitan a, una sustancia que suprime la expresión de un gen que codifica B-Raf (por ejemplo, oligonucleótido antisentido, siRNA, etc.), una sustancia que suprime la actividad enzimática de B-Raf [por ejemplo, compuestos de bajo peso molecular tal como el anticuerpo anti-B-Raf, SB590885 (oxima de 5-[2-[4-[2-(dimetilamino)etoxi]fenil]-5-(4-piridinil)-1H-imidazol-4-il]-2,3-dihidro-1H-inden-1-ona) y similares, y similares] y similares. El inhibidor de B-Raf es preferiblemente SB590885.

En el método de la presente invención, cuando el medio en la primera etapa contiene un inhibidor de B-Raf, la concentración del inhibidor de B-Raf contenido en el medio no está particularmente limitada siempre que el método de la presente invención pueda producir un célula retiniana o un tejido retiniano de un mamífero, y puede determinarse apropiadamente según el tipo de inhibidor de B-Raf. Por ejemplo, la concentración del inhibidor de B-Raf está dentro de un intervalo de concentración que muestra una actividad inhibidora de B-Raf correspondiente a 0,05 - 10 pM, preferiblemente 0,25 - 5 pM, más preferiblemente 0,5 - 2,5 pM, de SB590885.

En la primera etapa, se puede cultivar una célula madre pluripotente en cualquier condición de cultivo en suspensión y cultivo por adhesión, preferiblemente cultivo por adhesión.

Un medio a utilizar en la primera etapa puede ser un medio que contenga suero o un medio sin suero. Para evitar la contaminación con componentes químicamente no definidos, es preferiblemente un medio sin suero, más preferiblemente, un medio sin suero que contiene el sustituto de suero mencionado anteriormente.

Para evitar la contaminación de componentes químicamente no definidos, el medio utilizado en la primera etapa es preferiblemente un medio que contiene componentes químicamente determinados.

El medio usado en la primera etapa no está particularmente limitado siempre y cuando contenga 1) un factor para mantener un estado indiferenciado, y 2) un inhibidor de MEK (y opcionalmente 3) un inhibidor de PKC o un inhibidor de B-Raf) y permita el cultivo de mantenimiento indiferenciado de células madre pluripotentes en condiciones sin alimentador (medio sin alimentación).

En la primera etapa, en ausencia de una célula alimentadora (condiciones sin alimentación) significa condiciones sustancialmente libres de una célula alimentadora (por ejemplo, la proporción del número de células alimentadoras con respecto al número total de células no es más del 3%).

Como medio sin alimentador, se han desarrollado muchos medios sintéticos y están disponibles comercialmente y, por ejemplo, se puede mencionar el medio Essential 8. El medio Essential 8 es medio DMEM/F12 que contiene ácido L-ascórbico-2-fosfato de magnesio (64 mg/l), selenio de sodio (14 pg/1), insulina (19,4 mg/l), NaHCO3(543 mg/l), transferrina (10,7 mg/l), bFGF (100 ng/mL) y una sustancia activadora de la vía de transducción de señales de la familia TGFp (TGFp 1 (2 ng/mL) o Nodal (100 ng/mL)) como aditivos (Nature Methods, 8, 424-429 (2011)). Ejemplos de medio sin alimentación disponible comercialmente incluyen Essential 8 (fabricado por Life Technologies), medio S (fabricado por DS Pharma Biomedical), StemPro (fabricado por Life Technologies), hESF9 (Proc Natl Acad Sci. USA.

2008 Sep 9; 105(36):13409-14), mTeSR1 (fabricado por STEMCELL Technologies), mTeSR2 (fabricado por STEMCELL Technologies) y TeSR-E8 (fabricado por STEMCELL Technologies). Además de estos, se puede mencionar StemFit (fabricado por Ajinomoto Co., Inc.) como medio sin alimentación. La presente invención se puede realizar usando uno cualquiera de estos medios añadidos con (i) un inhibidor de MAP quinasa quinasa (inhibidor de MEK) o un medio añadido con (ii) un inhibidor de MEK y un inhibidor de PKC o un inhibidor de B-Raf en la primera etapa mencionada anteriormente. En una realización, en la primera etapa mencionada anteriormente, se puede mencionar uno cualquiera de estos medios añadidos con un inhibidor de MEK, un medio añadido con un inhibidor de MEK y un inhibidor de PKC o un medio añadido con un inhibidor de MEK y un inhibidor de B-Raf.

El medio utilizado en la primera etapa contiene un inhibidor de MEK además de un factor para mantener un estado indiferenciado. Alternativamente, el medio utilizado en la primera etapa contiene un inhibidor de MEK y un inhibidor de PKC o un inhibidor de B-Raf además de un factor para mantener un estado indiferenciado. Por ejemplo, se utilizan:

(i) un medio que contiene un factor para mantener un estado indiferenciado y un inhibidor de MEK, y que no contiene un inhibidor de PKC ni un inhibidor de B-Raf,

(ii) un medio que contiene un factor para mantener un estado indiferenciado y un inhibidor de MEK y que no contiene un inhibidor de PKC, un inhibidor de B-Raf, un inhibidor de la vía de transducción de señales de la familia TGFp y una sustancia activadora de la vía de transducción de señales de Sonic hedgehog,

(iii) un medio que contiene un factor para mantener un estado indiferenciado, un inhibidor de MEK y un inhibidor de PKC o un inhibidor de B-Raf,

(iv) un medio que contiene un factor para mantener un estado indiferenciado, un inhibidor de MEK y un inhibidor de PKC o un inhibidor de B-Raf, y que no contiene un inhibidor de la vía de transducción de señales de la familia TGFp ni una sustancia activadora de la vía de transducción de señales de Sonic hedgehog,

y similares.

Al someter las células madre pluripotentes a un cultivo en suspensión en la segunda etapa después de la primera etapa, el estado de las células cambia y se pueden producir agregados celulares con alta eficiencia. Por ejemplo, al someter las células madre pluripotentes a un cultivo en suspensión en la segunda etapa después de la primera etapa, el estado de las células cambia y se mejora la calidad de los agregados. Por lo tanto, se espera que se produzcan con alta eficiencia agregados de células redondas con una superficie lisa y un interior denso. El medio a utilizar en la primera etapa puede contener un componente adicional (por ejemplo, cualquier sustancia activadora o inhibidor de la vía de transducción de señales) siempre que la eficiencia de producción de células o tejidos retinianos mediante el método de producción de la presente invención no sea marcadamente disminuida (por ejemplo, el mismo nivel o no más que el nivel de eficiencia sin la primera etapa).

Para cultivar células madre pluripotentes en condiciones sin alimentación en la primera etapa, se puede usar una matriz apropiada como soporte para proporcionar un soporte en lugar de las células alimentadoras a las células madre pluripotentes. Las células madre pluripotentes se someten a un cultivo de adhesión en un recipiente celular cuya superficie está recubierta con una matriz a modo de soporte.

Como una matriz disponible como soporte, se pueden mencionar laminina (Nat Biotechnol 28, 611-615 (2010)), fragmento de laminina (Nat Commun 3, 1236 (2012)), preparación de la membrana basal (Nat Biotechnol 19, 971-974 (2001)), gelatina, colágeno, proteoglicano de sulfato de heparán, entactina, vitronectina y similares.

La "Laminina" es una molécula de heterotrímero que consiste en cadenas a, p,<y>y una proteína de matriz extracelular que contiene isoformas que tienen diferentes composiciones de cadenas de subunidades. Específicamente, la laminina tiene aproximadamente 15 tipos de isoformas basadas en combinaciones de heterotrímeros con 5 tipos de cadenas a, 4 tipos de cadenas p y 3 tipos de cadenas y. El nombre de laminina se determina combinando los números respectivos de cadena a (a1 - a5), cadena p (p1 - p4) y cadena<y>(<y>1 - Y3). Por ejemplo, una laminina que tiene una combinación de cadena a5, cadena p1 y cadena y1 se denomina laminina 511 (Nat Biotechnol 28, 611 -615 (2010)).

La laminina a utilizar es generalmente una laminina de mamífero. Como mamífero, se pueden citar los mencionados anteriormente. Para lograr condiciones libres de xeno, se usa preferiblemente laminina de un mamífero de la misma especie que la célula a cultivar. Por ejemplo, la laminina humana (preferiblemente laminina humana 511) se usa para cultivar células madre pluripotentes humanas.

Un fragmento de laminina a utilizar no está particularmente limitado siempre que tenga adhesividad a las células madre pluripotentes y permita el cultivo de mantenimiento de células madre pluripotentes en condiciones sin alimentación, y es preferiblemente un fragmento E8. El fragmento E8 de laminina (laminina511-E8) se identificó como un fragmento con fuerte actividad de adhesión celular entre los fragmentos obtenidos por digestión de laminina 511 con elastasa (EMBO J., 3:1463-1468, 1984, J. Cell Biol., 105:589-598, 1987). Preferiblemente se usa un fragmento E8 de laminina 511 (Nat Commun 3, 1236 (2012), Scientific Reports 4, 3549 (2014)). No es necesario que el fragmento E8 de laminina sea un producto de digestión con elastasa de laminina y puede ser recombinante. Para evitar la contaminación de componentes no identificados, se utiliza preferiblemente un fragmento de laminina recombinante. Un fragmento E8 de laminina 511 está disponible comercialmente y, por ejemplo, se puede adquirir iMatrix-511 (Nippi, Inc.) y similares.

Preferiblemente se aísla la laminina o el fragmento de laminina a utilizar.

"Preparación de membrana basal (muestra de membrana basal)" se refiere a una que contiene componentes que constituyen la membrana basal que tienen una función para controlar la morfología celular, la diferenciación, el crecimiento, la motilidad, la expresión de funciones, etc., que son similares a los de las células epiteliales, cuando las células previstas capaces de formar una membrana basal se siembran en placas y se cultivan. Por ejemplo, las células retinianas y los tejidos retinianos producidos mediante la presente invención pueden dispersarse y cultivarse en presencia de una preparación de membrana basal cuando se realizan cultivos de adhesión adicionales. En la presente memoria, los "componentes que constituyen la membrana basal" se refieren a moléculas de la matriz extracelular en forma de una membrana delgada presente entre la capa de células epiteliales y la capa de células intersticiales, y así sucesivamente en los tejidos animales. Una preparación de membrana basal se puede producir, por ejemplo, eliminando las células capaces de formar una membrana basal, que se adhieren a un soporte a través de una membrana basal, de un soporte con una solución capaz de disolver los lípidos de las células, una solución alcalina, etc,. Ejemplos de preparación de membrana basal incluyen productos disponibles comercialmente como preparación de membrana basal (por ejemplo, Matrigel™(fabricado por Becton Dickinson: en adelante denominado a veces Matrigel)), Geltrex™(fabricado por Life Technologies) y moléculas de la matriz extracelular conocidas como componentes de la membrana basal (por ejemplo, laminina, colágeno tipo IV, proteoglicano de sulfato de heparán, entactina, etc.).

Matrigel™ es una preparación de membrana basal extraída del sarcoma de ratón Engelbreth Holm Swarn (EHS). El componente principal de Matrigel™ es colágeno tipo IV, laminina, proteoglicano sulfato de heparán y entactina. Además de estos, contiene TGF-p, FGF, activador del plasminógeno tisular y un factor de crecimiento producido naturalmente por el tumor EHS. El "producto reducido en factor de crecimiento" de Matrigel™ tiene una concentración de factor de crecimiento más baja que el Matrigel común™, y la concentración estándar del mismo es <0,5 ng/ml para EGF, <0,2 ng/ml para NGF, <5 pg/ml para PDGF, 5 ng/ml para IGF1 y 1,7 ng/ml para TGFp.

Para evitar la contaminación de componentes no identificados, se utiliza preferiblemente una laminina aislada o un fragmento de laminina.

Preferiblemente, en el cultivo de células madre pluripotentes en condiciones sin alimentación en la primera etapa, las células madre pluripotentes humanas se cultivan en un estado adherido en un recipiente celular con una superficie recubierta con laminina 511 aislada o un fragmento E8 de laminina 511 (lo más preferiblemente, un fragmento E8 de laminina 511).

Si bien el período para el cultivo de células madre pluripotentes en la primera etapa no está particularmente limitado siempre que se pueda lograr el efecto de mejorar la calidad del agregado formado en una segunda etapa, generalmente es un período que no excede los 30 días, preferiblemente de 0,5 a 8 días, más preferiblemente de 1 a 6 días, más preferiblemente de 4 a 6 días. Es decir, la primera etapa se inicia 30 días, preferiblemente de 0,5 a 8 días, más preferiblemente de 1 a 6 días, más preferiblemente de 4 a 6 días antes del inicio de la segunda etapa, y la segunda etapa se realiza de forma continua al finalizar la primera etapa.

Cuando el medio en la primera etapa contiene un factor para mantener un estado indiferenciado y un inhibidor de MEK y no contiene tanto un inhibidor de PKC como un inhibidor de B-RAF (por ejemplo, no contiene otros factores que posiblemente influyan en la inducción de diferenciación), el período de cultivo de las células madre pluripotentes en la primera etapa se pueden establecer de 4 a 6 días (por ejemplo, 5 días).

Cuando el medio en la primera etapa contiene un factor para mantener un estado indiferenciado, un inhibidor de MEK y un inhibidor de PKC o un inhibidor de B-RAF, el período de cultivo de las células madre pluripotentes en la primera etapa puede establecerse entre 1 y 6 días (por ejemplo, de 1 a 5 días).

Las condiciones de cultivo, tal como la temperatura del cultivo y la concentración de CO2 en la primera etapa se puede determinar apropiadamente. Mientras que la temperatura del cultivo es, por ejemplo, de aproximadamente 30°C a aproximadamente 40°C, preferiblemente aproximadamente 37°C. La concentración de CO2 es, por ejemplo, aproximadamente del 1% a aproximadamente el 10%, preferiblemente aproximadamente el 5%.

La población celular obtenida en la primera etapa puede ser una población celular que contiene células que mantienen propiedades similares a las pluripotente (estado de tipo pluripotente). En este sentido, se puede decir que es una población celular que mantiene propiedades de tipo pluripotente. Las propiedades de tipo pluripotente significan que se mantiene al menos una parte de las características únicas y comunes a las células madre pluripotentes, incluyendo la pluripotencia. Las propiedades de tipo pluripotente no requieren una pluripotencia estricta. Específicamente, un estado que expresa todos o algunos de los marcadores como índice de propiedades pluripotentes (estado pluripotente) se incluye en las "propiedades de tipo pluripotente". Como un marcador (marcador indiferenciado) de las propiedades de tipo pluripotente, se pueden mencionar Oct3/4 positivo, fosfatasa alcalina positiva y similares. Una célula que mantiene las propiedades de tipo pluripotente puede ser Oct3/4 positivo. Incluso si el nivel de expresión de Nanog es inferior al de las células ES o iPS, corresponde a una "célula que muestra propiedades similares a las pluripotentes". Es decir, si bien la primera etapa no es la condición de cultivo capaz de mantener el estado indiferenciado de las células madre pluripotentes, se lleva a cabo en condiciones de cultivo capaces de mantener propiedades de tipo pluripotentes que permiten la diferenciación en al menos varios tipos de células ectodérmicas. Las propiedades de tipo pluripotente se mantienen durante toda la primera etapa.

Las células obtenidas en la primera etapa tienen la capacidad de diferenciarse en células retinianas y tejidos retinianos. En una realización, las células obtenidas en la primera etapa son células madre que tienen la capacidad de diferenciarse en células retinianas (incluyendo células progenitoras retinianas, células nerviosas específicas de la capa de la retina y células progenitoras de las mismas) y tejidos retinianos.

Las células madre pluripotentes humanas (por ejemplo, células iPS) pueden cultivarse por adhesión en ausencia de una célula alimentadora en (i) un medio sin suero que contenga un inhibidor de MEK y bFGF, o (ii) un medio sin suero que contenga un inhibidor de MEK, un inhibidor de PKC o un inhibidor de B-Raf y bFGF. Una combinación específica incluye una combinación de un inhibidor de MEK (por ejemplo, PD0325901) y bFGF; una combinación de un inhibidor de MEK (por ejemplo, PD0325901), un inhibidor de PKC (por ejemplo, Go6983) y bFGF; una combinación de un inhibidor de MEK (por ejemplo, PD0325901), un inhibidor de B-Raf (por ejemplo, SB590885) y bFGF, y similares.

El cultivo de adhesión mencionado anteriormente se realiza preferiblemente en un recipiente celular con una superficie recubierta con laminina 511 o un fragmento E8 de laminina 511.

Por ejemplo, las células madre pluripotentes humanas (por ejemplo, células iPS humanas) se cultivan en mantenimiento en ausencia de una célula alimentadora y en un medio sin suero que contiene bFGF. El cultivo en mantenimiento se realiza preferiblemente en cultivo de adhesión. El cultivo de adhesión se realiza preferiblemente en un recipiente celular con una superficie recubierta con vitronectina, laminina 511 o un fragmento E8 de laminina 511. Al cultivo de la misma se añade (i) un inhibidor de MEK o (ii) una combinación de un inhibidor de MEK y un inhibidor de PKC o un inhibidor de B-Raf (específicamente, se puede mencionar PD0325901; combinación de PD0325901 y Go6983; combinación de PD0325901 y SB590885 y similares) y se continúa con el cultivo.

Las células así obtenidas en la primera etapa tienen una capacidad de diferenciarse en al menos tejidos retinianos, células retinianas, células progenitoras retinianas o células nerviosas específicas de la capa de la retina. Preferiblemente, las células así obtenidas en la primera etapa incluyen células madre que tienen la capacidad de diferenciarse en al menos tejidos retinianos, células retinianas, células progenitoras retinianas o células nerviosas específicas de la capa de la retina.

[2] La segunda etapa

Se explica la segunda etapa de cultivar las células obtenidas en la primera etapa en suspensión en un medio para formar un agregado celular.

El medio a utilizar en la segunda etapa no está particularmente limitado siempre que sea como se describe en la sección de definición mencionada anteriormente. El medio a utilizar en la segunda etapa puede ser un medio que contenga suero o un medio sin suero. Para evitar la contaminación de componentes químicamente indefinidos, en la presente invención se puede utilizar un medio sin suero al que no se le ha añadido ningún factor para mantener un estado indiferenciado, un inhibidor de MEK, un inhibidor de PKC y un inhibidor de B-Raf. Para evitar una preparación complicada, por ejemplo, se puede utilizar preferiblemente un medio sin suero suplementado con una cantidad adecuada de un sustituto de suero disponible comercialmente tal como KSR, etc. (por ejemplo, un medio de una mezcla 1:1 de IMDM y F-12, que se suplementa con KSR al 10%, 1-monotioglicerol 450 gM y 1x concentrado de lípidos definidos químicamente, o medio GMEM suplementado con KSR al 5% - 20%, NEAA, ácido pirúvico, 2-mercaptoetanol). La cantidad de KSR que se va a añadir a un medio sin suero en el caso de células madre pluripotentes humanas es, por ejemplo, de aproximadamente el 1 % a aproximadamente el 30 %, preferiblemente de aproximadamente el 2 % a aproximadamente el 20 %.

Para la formación de un agregado, las células dispersas se preparan mediante una operación de dispersión de las células obtenidas en la primera etapa. Las "células dispersas" obtenidas mediante la operación de dispersión se refieren a una población de células en la que, por ejemplo, no menos del 70 % de las células son células individuales y no más del 30 % de las células son grupos de 2 a 50 células. Preferiblemente, es una población celular de células dispersas en la que no menos del 80% de las células son células individuales y no más del 20% de las células son grupos de 2 a 50 células. Las células dispersas pueden ser una población de células en un estado casi libre de adhesión mutua de células (por ejemplo, unión plana). Las células dispersas pueden ser una población de células en un estado casi libre de unión entre células (por ejemplo, unión adhesiva).

Una operación de dispersión de las células obtenidas en la primera etapa puede contener el tratamiento de dispersión mecánica mencionado anteriormente, el tratamiento con solución de dispersión celular y el tratamiento de adición de un agente protector celular. Estos tratamientos se pueden realizar en combinación. Preferiblemente, el tratamiento con solución de dispersión celular se realiza simultáneamente con el tratamiento de adición de un agente protector celular y después se realiza el tratamiento de dispersión mecánica.

Como un agente protector celular que se va a utilizar para el tratamiento de adición de un agente protector celular, se pueden mencionar heparina, suero y sustituto de suero. Además, para suprimir la muerte celular de las células madre pluripotentes (en particular, las células madre pluripotentes humanas) inducida por la dispersión, se puede añadir un inhibidor de la quinasa en espiral asociada a Rho (ROCK) o un inhibidor de la miosina desde el inicio del cultivo de la segunda etapa. Como inhibidor ROCK, se pueden mencionar Y-27632, Fasudil (HA1077), H-1152 y similares.

Como una solución de dispersión celular que se va a utilizar para el tratamiento de dispersión celular, se puede mencionar una solución que contenga una cualquiera de las enzimas tales como tripsina, colagenasa, hialuronidasa, elastasa, pronasa, DNasa, papaína, etc., y un agente quelante tal como ácido etilendiaminotetraacético, etc. También se puede utilizar una solución de dispersión celular disponible comercialmente tal como T rypLE Select (fabricado por Life Technologies) y TrypLE Express (fabricado por Life Technologies).

Como un método de tratamiento de dispersión mecánico se puede mencionar el tratamiento por pipeteo o el raspado con un rascador.

Las células dispersas se suspenden en el medio mencionado anteriormente.

Después, se siembra una suspensión de las células dispersas en el recipiente de cultivo mencionado anteriormente, y las células dispersas se cultivan en condiciones no adhesivas al recipiente de cultivo, por lo que se reúnen varias células para formar un agregado.

En este caso, se pueden formar simultáneamente varios agregados celulares en un recipiente de cultivo sembrando las células dispersas en un recipiente de cultivo comparativamente grande, tal como una placa de 10 cm. Sin embargo, el tamaño de los agregados varía en este caso. Así, por ejemplo, se coloca una cantidad dada de células en cada pocillo de una placa multipocillo (fondo en U, fondo en V), tal como una microplaca de 96 pocillos, y se realiza un cultivo estático, mediante el cual las células se coagulan rápidamente para formar un agregado en cada pocillo. Los agregados se recuperan de varios pocillos, por lo que se puede obtener una población de agregados uniformes.

La concentración de las células en la segunda etapa se puede establecer apropiadamente para que se puedan formar agregados celulares de manera más uniforme y eficiente. Por ejemplo, cuando se cultivan células humanas (por ejemplo, células obtenidas de células iPS humanas en la primera etapa) en suspensión usando una placa de micropocillos de 96 pocillos, se prepara un líquido para lograr de aproximadamente 1 x 103 a aproximadamente 1 x 105 células, preferiblemente de aproximadamente 3 x 103 a aproximadamente 5 x 104 células, más preferiblemente de aproximadamente 4 x 103 a aproximadamente 2 x 104 células, más preferiblemente de aproximadamente 4 x 103 a aproximadamente 1,6 x 104 células, más preferiblemente de aproximadamente 8 x 103 a aproximadamente 1,2 x 104 células, por pocillo se añaden a los pocillos y se deja reposar la placa para formar agregados.

Las condiciones de cultivo, tal como la temperatura del cultivo, la concentración de CO2, etc., en la segunda etapa, se puede determinar apropiadamente. La temperatura del cultivo es, por ejemplo, de aproximadamente 30°C a aproximadamente 40°C, preferiblemente aproximadamente 37°C. La concentración de CO2 es, por ejemplo, aproximadamente del 1% a aproximadamente el 10%, preferiblemente aproximadamente el 5%.

En la segunda etapa, cuando se realiza una operación de cambio de medio, por ejemplo, se puede mencionar una operación para añadir un medio nuevo sin descartar el medio existente (operación de adición de medio), una operación para descartar aproximadamente la mitad de la cantidad del medio existente (aproximadamente 30 - 90%, por ejemplo, 40 - 60% del volumen del medio existente) y añadir aproximadamente la mitad de una cantidad de un medio nuevo (30 - 90%, por ejemplo, aproximadamente 40 - 60% del volumen del medio existente) (operación de cambio de medio medio), y una operación para descartar aproximadamente la cantidad total del medio existente (no menos del 90% de la cantidad del medio existente) y añadir aproximadamente la cantidad total de medio nuevo (no menos del 90% de la cantidad del medio existente) (operación de cambio de medio completo).

Cuando se añade un componente particular en un momento determinado, por ejemplo, se puede realizar una operación para calcular la concentración final, descartar aproximadamente la mitad de la cantidad del medio existente y añadir aproximadamente la mitad de la cantidad de un medio nuevo que contiene un componente particular a una concentración mayor que la concentración final (operación de medio cambio de medio).

Cuando la concentración de un componente contenido en el medio existente se va a disminuir mediante dilución en un momento determinado, por ejemplo, la operación de cambio de medio se puede realizar varias veces al día, preferiblemente varias veces (por ejemplo, 2 - 3 veces) dentro de 1 hora. Además, cuando la concentración de un componente contenido en el medio existente debe reducirse mediante dilución en un momento determinado, las células o agregados pueden transferirse a otro recipiente de cultivo.

Si bien la herramienta utilizada para la operación de cambio de medio no está particularmente limitada, se pueden mencionar, por ejemplo, una pipeta, una micropipeta, una micropipeta multicanal, un dispensador continuo y similares. Por ejemplo, cuando se utiliza una placa de 96 pocillos como recipiente de cultivo, se puede utilizar una micropipeta multicanal.

El período de cultivo en suspensión necesario para formar un agregado celular se puede determinar según sea apropiado para la célula que se vaya a utilizar, de modo que las células se puedan agregar uniformemente. Para formar agregados celulares uniformes, es deseable que sea lo más corto posible. Las etapas para que las células dispersas formen agregados celulares se pueden dividir en una etapa para reunir células y una etapa para formar agregados celulares a partir de las células reunidas. En el momento de sembrar las células dispersas (es decir, en el momento del inicio del cultivo en suspensión) para reunir las células en el caso de células madre pluripotentes humanas (por ejemplo, células madre obtenidas de células iPS humanas en la primera etapa), por ejemplo, las células reunidas se forman preferiblemente en aproximadamente 24 h, más preferiblemente en aproximadamente 12 h. El período desde el momento de la siembra de las células dispersas (es decir, en el momento del inicio del cultivo en suspensión) hasta la formación de un agregado en el caso de células madre pluripotentes humanas (por ejemplo, células iPS humanas) está, por ejemplo, preferiblemente dentro de aproximadamente 72 h, más preferiblemente dentro de aproximadamente 48 h. El período para la formación de agregados celulares se puede ajustar adecuadamente controlando las herramientas para añadir las células, las condiciones de centrifugación, etc.

La formación de agregados celulares se puede determinar basándose en el tamaño y el número de células de los agregados, la morfología macroscópica, la morfología microscópica mediante análisis de tinción de tejidos y la uniformidad de los mismos, la expresión de marcadores de diferenciación e indiferenciación y su uniformidad, el control de la expresión del marcador de diferenciación y sincronismo de los mismos, reproducibilidad de la eficiencia de la diferenciación entre los agregados, etc.

Después de la formación del agregado, el agregado puede cultivarse de manera continua tal como está. El período para el cultivo en suspensión en la segunda etapa es generalmente de 12 h a 6 días, preferiblemente de aproximadamente 12 h a 48 h.

El medio utilizado en la segunda etapa puede contener una sustancia activadora de la vía de transducción de señales de Sonic hedgehog. Es decir, en la segunda etapa, las células obtenidas en la primera etapa se cultivan en suspensión en un medio (preferiblemente medio sin suero) que contiene una sustancia activadora de la vía de transducción de señales Sonic hedgehog, por lo cual se puede formar un agregado celular que tiene una calidad del agregado mejorada adicionalmente con una alta eficiencia. Por ejemplo, se espera que se produzcan con alta eficiencia agregados de células redondas con una superficie lisa y un interior denso y que tengan una calidad de agregado mejorada y mantengan la forma.

La sustancia activadora de la vía de transducción de señales de Sonic hedgehog (en adelante indicada a veces como Shh) es una sustancia capaz de mejorar la transducción de señales mediada por Shh. Ejemplos de la sustancia activadora de la vía de transducción de señales Shh incluyen proteínas que pertenecen a la familia Hedgehog (por ejemplo, Shh e Ihh), receptor de Shh, agonista del receptor de Shh, purmorfamina o SAG (agonista del suavizado; N-metil-N'-(3-piridinilbencil)-N'-(3-clorobenzo[b]tiofen-2-carbonil)-1,4-diaminociclohexano) y similares. La sustancia activadora de la vía de transducción de señales Shh es preferiblemente SAG.

La actividad promotora de la transducción de señales de Sonic hedgehog de SAG se puede determinar mediante un método bien conocido por los expertos en la técnica, por ejemplo, ensayo del gen indicador tomando nota de la expresión del gen Gli1 (Oncogene (2007) 26, 5163-5168).

Se puede determinar apropiadamente que la concentración de la sustancia activadora de la vía de transducción de señales de Sonic Hedgehog en el medio se encuentre dentro de un intervalo capaz de lograr los efectos antes mencionados. SAG se usa generalmente en una concentración de 1 - 2000 nM, preferiblemente 1 - 1000 nM, preferiblemente 10 nM - 700 nM, 20 nM - 500 nM, más preferiblemente 100 nM - 500 nM. Cuando se usa una sustancia activadora de la vía de transducción de señales de Sonic hedgehog distinta de SAG, se usa deseablemente a una concentración que confiere una actividad promotora de la transducción de señales de Sonic hedgehog equivalente a la de SAG a la concentración mencionada anteriormente.

El momento de la adición de una sustancia activadora de la vía de transducción de señales de Sonic hedgehog al medio no está particularmente limitado siempre que se puedan lograr los efectos mencionados anteriormente, pero se puede obtener un efecto mayor cuando se añade antes. Se añade al medio una sustancia activadora de la vía de transducción de señales de Sonic hedgehog generalmente dentro de los 6 días, preferiblemente dentro de los 3 días, más preferiblemente dentro de 1 día, desde el inicio de la segunda etapa, y lo más preferiblemente en el momento del inicio de la segunda etapa.

La concentración de la sustancia activadora de la vía de transducción de señales de Sonic hedgehog en el medio puede variarse durante el período de la segunda etapa. Por ejemplo, se proporciona que la sustancia activadora de la vía de transducción de señales de Sonic hedgehog esté dentro del intervalo mencionado anteriormente en el momento del inicio de la segunda etapa, y la concentración se puede disminuir gradual o progresivamente en una proporción de 40 - 60 % durante 2 - 4 días.

En la segunda etapa, las células humanas obtenidas en la primera etapa (por ejemplo, células obtenidas de células iPS humanas en la primera etapa) pueden recuperarse, dispersarse en células individuales o en un estado cercano al mismo y someterse a cultivo en suspensión en un medio sin suero que contiene una sustancia activadora de la vía de transducción de señales de Sonic hedgehog (por ejemplo, SAG) para formar agregados. Preferiblemente, el medio contiene una sustancia activadora de la vía de transducción de señales de Sonic hedgehog desde el momento del inicio del cultivo en suspensión. También se puede añadir al medio un inhibidor de ROCK (por ejemplo, Y-27632). El periodo para el cultivo es de 12 h - 6 días, preferiblemente de 12 h - 48 h. Los agregados formados son preferiblemente agregados uniformes.

Por ejemplo, las células humanas obtenidas en la primera etapa (por ejemplo, células obtenidas a partir de células iPS humanas en la primera etapa) se recuperan, se dispersan en células individuales o en un estado cercano al mismo en un medio sin suero que contiene una sustancia activadora de la vía de transducción de señales de Sonic hedgehog (por ejemplo, SAG), y se someten a cultivo en suspensión. El medio sin suero puede contener un inhibidor de ROCK (por ejemplo, Y-27632). Se siembra una suspensión de las células obtenidas a partir de células madre pluripotentes humanas (por ejemplo, células iPS) en el recipiente de cultivo no adhesivo mencionado anteriormente, mediante lo cual se ensamblan varias células para formar un agregado. El periodo de cultivo es de 12 h - 6 días, preferiblemente de 12 h - 48 h. Los agregados formados son preferiblemente agregados uniformes.

También está dentro del alcance de la presente invención cultivar agregados en suspensión en ausencia de una preparación de membrana basal.

Cuando el medio en la primera etapa contiene un factor para mantener un estado indiferenciado y un inhibidor de MEK y no contiene ni un inhibidor de PKC ni un inhibidor de B-RAF (por ejemplo, no contiene otros factores que posiblemente influyan en la inducción de la diferenciación), se puede utilizar en la segunda etapa un medio que contenga una sustancia activadora de la vía de transducción de señales de Sonic hedgehog (por ejemplo, SAG). Es decir, se proporciona un método de producción de una célula retiniana o tejido retiniano que incluye las siguientes etapas:

(1) una primera etapa de cultivo de células madre pluripotentes de mamíferos en ausencia de una célula alimentadora en un medio que contiene 1) un factor para mantener un estado indiferenciado y 2) un inhibidor de MEK, y que no contiene 3) ni un inhibidor de PKC ni un B-RAF inhibidor (por ejemplo, no contiene otros factores que puedan influir posiblemente en la inducción de la diferenciación) durante un período que no exceda de 30 días, preferiblemente de 0,5 a 8 días, más preferiblemente de 1 a 6 días,

(2) una segunda etapa de cultivo en suspensión de las células obtenidas en la primera etapa en un medio sin suero que contiene una sustancia activadora de la vía de transducción de señales de Sonic hedgehog para formar un agregado de las células, y

(3) una tercera etapa de cultivo en suspensión del agregado obtenido en la segunda etapa en presencia de una sustancia activadora de la vía de transducción de señales de BMP para dar un agregado que contiene células retinianas o un tejido retiniano.

Cuando el medio en la primera etapa contiene un factor para mantener un estado indiferenciado y un inhibidor de MEK y no contiene ni un inhibidor de PKC ni un inhibidor de B-RAF (por ejemplo, no contiene otros factores que posiblemente influyan en la inducción de diferenciación), el período de cultivo de la primera etapa puede ser de 4 a 6 días (por ejemplo, 5 días) y en la segunda etapa se usa un medio que no contiene una sustancia activadora de la vía de transducción de señales de Sonic hedgehog (por ejemplo, SAG). Es decir, se proporciona un método de producción de una célula retiniana o tejido retiniano que incluye las siguientes etapas:

(1) una primera etapa de cultivo de células madre pluripotentes de mamíferos en ausencia de una célula alimentadora en un medio que contiene 1) un factor para mantener un estado indiferenciado y 2) un inhibidor de MEK, y que no contiene 3) ni un inhibidor de PKC ni un inhibidor de B-RAF (por ejemplo, no contiene otros factores que posiblemente puedan influir en la inducción de la diferenciación) durante 4 a 6 días (por ejemplo, 5 días)

(2) una segunda etapa de cultivo en suspensión de las células obtenidas en la primera etapa en un medio sin suero que no contiene una sustancia activadora de la vía de transducción de señales de Sonic hedgehog para formar un agregado de células, y

Cuando el medio en la primera etapa contiene un factor para mantener un estado indiferenciado, un inhibidor de MEK y un inhibidor de PKC o un inhibidor de B-RAF (por ejemplo, un medio que contiene un factor para mantener un estado indiferenciado, un inhibidor de MEK y un inhibidor de PKC o inhibidor de B-RAF, y que no contiene otros factores que posiblemente influyan en la inducción de la diferenciación), en la segunda etapa se puede usar un medio que contenga o no una sustancia activadora de la vía de transducción de señales de Sonic hedgehog (por ejemplo, SAG). Es decir, se proporciona un método de producción de una célula retiniana o tejido retiniano que incluye las siguientes etapas:

(1) una primera etapa de cultivo de células madre pluripotentes de mamíferos en ausencia de una célula alimentadora en un medio que contiene 1) un factor para mantener un estado indiferenciado, 2) un inhibidor de MEK y 3) un inhibidor de PKC o un inhibidor de B-RAF ( por ejemplo, un medio que contiene 1) un factor para mantener un estado indiferenciado, 2) un inhibidor de MEK y 3) un inhibidor de PKC o un inhibidor de B-RAF, y que no contiene 4) otros factores que posiblemente influyan en la inducción de la diferenciación) durante un período que no exceda los 30 días,

(2) una segunda etapa de cultivo de las células obtenidas en la primera etapa en suspensión en un medio sin suero que contiene o no una sustancia activadora de la vía de transducción de señales de Sonic hedgehog (por ejemplo, SAG) para formar un agregado celular, y

(3) una tercera etapa de cultivo del agregado obtenido en la segunda etapa en suspensión en presencia de una sustancia activadora de la vía de transducción de señales de BMP para dar un agregado que contiene células retinianas o un tejido retiniano.

Al realizar la segunda etapa de esta manera, se forma un agregado de las células obtenidas en la primera etapa, o las células derivadas de las mismas. La presente invención también proporciona un método para producir dicho agregado. El agregado obtenido en la segunda etapa tiene mayor calidad que el formado sin tratamiento en un medio que contiene (i) un inhibidor de MEK o (ii) un inhibidor de MEK, y un inhibidor de PKC o inhibidor de B-Raf en la primera etapa. Por lo tanto, la presente invención proporciona un método para producir un agregado celular con una calidad mejorada y con alta eficiencia. Para ser específicos, por ejemplo, se puede esperar que se obtenga una población de agregados que tienen una alta proporción de agregados de células redondas que tienen una superficie lisa, un interior denso y una forma no colapsada. Cuando se seleccionan aleatoriamente agregados (por ejemplo, no menos de 100 agregados) el día 6, preferiblemente el día 10, desde el inicio de la segunda etapa, la suma de las proporciones de agregados no colapsados y/o agregados no quísticos es, por ejemplo, no menos del 70%, preferiblemente no menos del 80%.

El agregado obtenido en la segunda etapa tiene la capacidad de diferenciarse en una célula retiniana (incluyendo células progenitoras retinianas, células nerviosas específicas de la capa de la retina y células progenitoras de las mismas) o un tejido retiniano que las contiene.

Usando, en la segunda etapa, las células obtenidas en la primera etapa y que tienen la capacidad de diferenciarse en una célula retiniana (incluyendo células progenitoras retinianas, células nerviosas específicas de la capa de la retina y células progenitoras de las mismas) o un tejido retiniano que las contiene, se puede obtener un agregado que contiene células que tienen la capacidad de diferenciarse en una célula retiniana (incluyendo células progenitoras retinianas, células nerviosas específicas de la capa de la retina y células progenitoras de las mismas) o un tejido retiniano que las contiene. Dado que el agregado obtenido en la segunda etapa tiene alta calidad, se pueden inducir diversas células retinianas y tejidos retinianos con alta eficiencia cultivando el agregado en condiciones de diferenciación apropiadas.

Usando, en la segunda etapa, las células madre (preferiblemente, células que tienen la capacidad de diferenciarse en al menos tejido retiniano, células retinianas, células progenitoras retinianas o células nerviosas específicas de la capa de la retina) obtenidas en la primera etapa y que tienen la capacidad de diferenciarse en al menos células retinianas (incluyendo células progenitoras retinianas, células nerviosas específicas de la capa de la retina y células progenitoras de las mismas) o un tejido retiniano que las contiene, se puede obtener un agregado que contiene células que tienen la capacidad de diferenciarse en al menos células retinianas (incluyendo células progenitoras retinianas, células nerviosas específicas de la capa de la retina y células progenitoras de las mismas) o un tejido retiniano que las contenga.

El agregado obtenido en la segunda etapa puede contener células que mantienen propiedades de tipo pluripotente (específicamente, que expresan Oct3/4) obtenidas al completar la primera etapa, y/o células correspondientes a las células en una etapa intermedia entre las células y las células neurales tales como como células retinianas y similares. Estas células expresan uno cualquiera de los marcadores de estado pluripotente Oct3/4, marcador de ectodermo (Sox1, Sox2, N-cadherina, TP63), marcador de neuroectodermo (Sox1, Sox2, Nestina, N-cadherina, TP63, Otx2) y el marcador de células neurales antes mencionado. Es decir, el agregado obtenido en la segunda etapa puede contener una mezcla de células que expresan uno cualquiera de los marcadores del estado pluripotente Oct3/4, marcador de ectodermo (Sox1, Sox2, N-cadherina, TP63), marcador de neuroectodermo (Sox1, Sox2, Nestina, N -cadherina, TP63, Otx2), y el marcador de células neurales antes mencionado. Es decir, el agregado obtenido en la segunda etapa contiene células madre que tienen una potencia para diferenciarse en al menos una célula retiniana o tejido retiniano, y/o células progenitoras de una célula retiniana o tejido retiniano. Las células progenitoras se caracterizan porque muestran una capacidad (competencia) para expresar los marcadores de células retinianas antes mencionados cuando se cultivan en condiciones de cultivo apropiadas conocidas. Por lo tanto, el agregado obtenido en la segunda etapa puede contener células madre Oct3/4 positivas que tienen una potencia para diferenciarse en al menos una célula retiniana o tejido retiniano, y/o células progenitoras de una célula retiniana o tejido retiniano. Una parte de las células contenidas en el agregado obtenido en la segunda etapa pueden expresar los marcadores de tejido retiniano antes mencionados.

El agregado obtenido en la segunda etapa tiene una potencia para diferenciarse en células retinianas y tejidos retinianos. Se puede producir un agregado que contiene células retinianas y tejidos retinianos con alta eficiencia cultivando el agregado obtenido en la segunda etapa bajo las siguientes condiciones de la tercera etapa, ya que el agregado tiene alta calidad.

[3] La tercera etapa

Se explica una tercera etapa donde se induce un agregado que contiene células retinianas o un tejido retiniano a partir del agregado obtenido en la segunda etapa.

El medio a utilizar en la tercera etapa es, por ejemplo, un medio sin suero o un medio que contiene suero (preferiblemente medio sin suero) suplementado con una sustancia activadora de la vía de transducción de señales de BMP. Dicho medio puede contener o no una preparación de membrana basal. Como preparación de membrana basal se pueden utilizar las mencionadas anteriormente. Cuando se añade una preparación de membrana basal, la concentración de la misma es, por ejemplo, del 0,1 al 10 %, más preferiblemente del 0,5 % al 2 %, en concentración en volumen cuando se utiliza Matrigel. Para evitar la contaminación con una sustancia químicamente no identificada, no se añade una preparación de membrana basal. Es decir, la presente invención abarca un método de cultivo en el que el cultivo en suspensión en la tercera etapa se realiza en ausencia de una preparación de membrana basal.

Un medio sin suero o un medio que contiene suero para utilizarlo para dicho medio no está particularmente limitado siempre que sea como se mencionó anteriormente. Para evitar una preparación complicada, por ejemplo, se puede utilizar preferiblemente un medio sin suero suplementado con una cantidad adecuada de un sustituto de suero disponible comercialmente tal como KSR, etc. (por ejemplo, medio de una mezcla 1:1 de IMDM y F-12 suplementado con KSR al 10 %, 1 -monotioglicerol 450 pM y 1x concentrado de lípidos químicamente definidos). La cantidad de KSR que se va a añadir a un medio sin suero en el caso de células derivadas de células madre pluripotentes humanas (por ejemplo, células iPS) es generalmente de aproximadamente 1 % a aproximadamente 20 %, preferiblemente de aproximadamente 2 % a aproximadamente 20 %.

Como el medio (preferiblemente medio sin suero) que se va a usar en la tercera etapa, el medio (preferiblemente medio sin suero) usado en la segunda etapa puede usarse directamente, o puede sustituirse con un medio nuevo (preferiblemente medio sin suero). Cuando el medio sin suero usado en la segunda etapa, libre de una sustancia activadora de la vía de transducción de señales de BMP se usa directamente para la tercera etapa, se puede añadir al medio una sustancia activadora de la vía de transducción de señales de BMP.

Ejemplos de sustancia activadora de la vía de transducción de señales de BMP usada en la tercera etapa incluyen proteínas BMP tales como BMP2, BMP4, BMP7, etc., proteínas GDF tales como GDF7, etc., anticuerpos del receptor de anti-BMP, péptidos parciales de BMP, etc. La proteína BMP2, la proteína BMP4 y la proteína BMP7 están disponibles, por ejemplo, en R&D Systems, y la proteína GDF7 está disponible, por ejemplo, en Wako Pure Chemical Industries, Ltd. La sustancia activadora de la vía de transducción de señales de BMP es preferiblemente BMP4.

La concentración de la sustancia activadora de la vía de transducción de señales de BMP puede ser una concentración a la que se puede inducir la diferenciación de las células que forman los agregados mencionados anteriormente en células retinianas. Por ejemplo, en el caso de BMP4 humana, se añade al medio a una concentración de aproximadamente 0,01 nM a aproximadamente 1 pM, preferiblemente de aproximadamente 0,1 nM a aproximadamente 100 nM, más preferiblemente aproximadamente 1,5 nM (55 ng/ml). Cuando se usa una sustancia activadora de la vía de transducción de señales de BMP distinta de BMP4, se usa deseablemente a una concentración en la que se ejerce una actividad promotora de la transducción de señales de BMP equivalente a la de BMP4 a la concentración mencionada anteriormente.

La concentración de la sustancia activadora de la vía de transducción de señales de BMP en el medio puede variarse durante el período de la tercera etapa. Por ejemplo, se proporciona que la sustancia activadora de la vía de transducción de señales de BMP esté dentro del intervalo de concentración mencionado anteriormente en el momento del inicio de la tercera etapa, y la concentración puede disminuirse gradual o progresivamente en una proporción de 40 - 60 % durante 2 - 4 días.

Se puede añadir una sustancia activadora de la vía de transducción de señales de BMP después de aproximadamente 24 horas o más tarde desde el inicio del cultivo en suspensión en la segunda etapa, y también se puede añadir al medio dentro de varios días (por ejemplo, dentro de los 15 días) desde el inicio del cultivo en suspensión. Preferiblemente, se añade al medio una sustancia activadora de la vía de transducción de señales de BMP en cualquier momento entre el día 1 y el día 15, más preferiblemente entre el día 1 y el día 9, más preferiblemente entre el día 3 y el día 8, aún más preferiblemente, entre el día 3 y el día 6, desde el inicio del cultivo en suspensión.

Después de la adición de una sustancia activadora de la vía de transducción de señales BMP al medio y del inicio de la inducción de la diferenciación de las células que forman un agregado en células retinianas, la adición de la sustancia activadora de la vía de transducción de señales BMP al medio no es necesaria, y el medio puede intercambiarse con un medio sin suero o un medio que contiene suero, cada uno de ellos libre de una sustancia activadora de la vía de transducción de señales de BMP. Después del inicio de la inducción de la diferenciación en células retinianas, la concentración de la sustancia activadora de la vía de transducción de señales de BMP en el medio puede disminuirse gradual o progresivamente en una proporción del 40 - 60% cada 2 - 4 días intercambiando el medio con un medio sin suero o un medio que contiene suero, cada uno libre de una sustancia activadora de la vía de transducción de señales de BMP. Las células cuya inducción de diferenciación en células retinianas se ha iniciado pueden confirmarse, por ejemplo, detectando la expresión del gen marcador de células progenitoras retinianas (por ejemplo, gen Rx (alias Rax), gen Pax6, gen Chx10) en las células. El agregado formado en la segunda etapa mediante el uso de células madre pluripotentes en las que un gen de la proteína indicadora de fluorescencia, tal como GFP, etc., se activa en el locus del gen Rx, se cultiva en suspensión en presencia de una sustancia activadora de la vía de transducción de señales de BMP a una concentración necesaria para la inducción de la diferenciación en las células retinianas, y se detecta la fluorescencia emitida por la proteína indicadora de fluorescencia expresada, por lo que se puede confirmar el momento en el que se inició la inducción de la diferenciación en las células retinianas. La tercera etapa puede incluir una etapa de cultivo del agregado formado en la segunda etapa en suspensión en un medio sin suero o en un medio que contiene suero que contiene una sustancia activadora de la vía de transducción de señales de BMP a una concentración necesaria para la inducción de la diferenciación en células retinianas, hasta que comienza a aparecer una célula que expresa el gen marcador de células progenitoras retinianas (por ejemplo, gen Rx, gen Pax6, gen Chx10), obteniendo de este modo un agregado celular que comprende células progenitoras retinianas.

En la tercera etapa, se puede mencionar cuando se realiza una operación de cambio de medio, por ejemplo, una operación para añadir un medio nuevo sin descartar el medio existente (operación de adición de medio), una operación para descartar aproximadamente la mitad de la cantidad del medio existente (aproximadamente 40 - 80% del volumen del medio existente) y añadir aproximadamente la mitad de la cantidad de medio nuevo (40 - 80% del volumen del medio existente) (operación de cambio de medio medio), y una operación para descartar aproximadamente la cantidad total del medio existente (no menos del 90% de la cantidad del medio existente) y añadir aproximadamente la cantidad total de un medio nuevo (no menos del 90% de la cantidad del medio existente) (operación de cambio de medio completo).

Cuando se añade un componente particular (por ejemplo, BMP4) en un momento determinado, por ejemplo, basándose en el cálculo de la concentración final, se puede realizar una operación para descartar aproximadamente la mitad de la cantidad del medio existente y añadir aproximadamente la mitad de la cantidad de un medio nuevo que contenga un componente particular a una concentración superior a la concentración final (operación de cambio de la mitad del medio).

Cuando la concentración de un componente contenido en el medio existente se va a disminuir mediante dilución en un momento determinado, por ejemplo, la operación de cambio de medio se puede realizar varias veces al día, preferiblemente varias veces (por ejemplo, 2 - 3 veces) dentro de 1 hora. Además, cuando se va a disminuir la concentración de un componente contenido en el medio existente mediante dilución en un momento determinado, la célula o el agregado se puede transferir a otro recipiente de cultivo.

Cuando la concentración de la sustancia activadora de la vía de transducción de señales de Shh añadida al medio en la segunda etapa es comparativamente baja (por ejemplo, no más de 700 nM para SAG, y una concentración que confiere una actividad promotora de la transducción de señales de Shh equivalente o inferior a la de SAG a la concentración mencionada anteriormente, para otras sustancias activadoras de la vía de transducción de señales de Shh), puede no ser necesario el cambio de medio, y en la tercera etapa, se puede añadir una sustancia activadora de la vía de transducción de señales de BMP al medio usado en la segunda etapa.

Por otra parte, cuando la concentración de la sustancia activadora de la vía de transducción de señales de Shh es comparativamente alta (por ejemplo, superior a 700 nM, preferiblemente no inferior a 1000 nM para SAG, y una concentración que confiere una actividad promotora de la transducción de señales de Shh equivalente a la de SAG a la concentración mencionada anteriormente, para otras sustancias activadoras de la vía de transducción de señales Shh), es deseable cambiar el medio a un medio nuevo que contenga una sustancia activadora de la vía de transducción de señales de BMP (por ejemplo, BMP4) para suprimir un efecto de la sustancia activadora de la transducción de señales de Shh que queda cuando se añade una sustancia activadora de la vía de transducción de señales de BMP.

La concentración de una sustancia activadora de la vía de transducción de señales de Shh en el medio que se utilizará en la tercera etapa, cuando se calcula en términos de actividad promotora de la transducción de señales de Shh de SAG, no puede ser superior a 700 nM, no superior a 300 nM, no más de 10 nM, o no más de 0,1 nM. El medio que se utilizará en la tercera etapa puede estar sin una sustancia activadora de la vía de transducción de señales de Shh. El medio "sin una sustancia activadora de la vía de transducción de señales de Shh" también incluye un medio sustancialmente sin una sustancia activadora de la vía de transducción de señales de Shh, por ejemplo, un medio no suplementado con una sustancia activadora de la vía de transducción de señales de Shh a una concentración que imparte una influencia adversa en la diferenciación selectiva en una célula progenitora retiniana o un tejido retiniano. El medio "no suplementado con una sustancia activadora de la vía de transducción de señales de Shh" también incluye un medio sustancialmente no suplementado con una sustancia activadora de la vía de transducción de señales de Shh, por ejemplo, un medio no suplementado con una sustancia activadora de la vía de transducción de señales de Shh a una concentración que imparte una efecto adverso sobre la diferenciación selectiva en una célula progenitora retiniana o un tejido retiniano.

Las condiciones de cultivo, tales como la temperatura del cultivo, la concentración de CO2 , etc en la tercera etapa se pueden determinar apropiadamente. La temperatura del cultivo es, por ejemplo, de aproximadamente 30°C a aproximadamente 40°C, preferiblemente aproximadamente 37°C. La concentración de CO2 es, por ejemplo, aproximadamente del 1% a aproximadamente el 10%, preferiblemente aproximadamente el 5%.

Mediante dicho cultivo, se induce la diferenciación de las células que forman el agregado obtenido en la segunda etapa en células progenitoras retinianas, por lo que se puede obtener un agregado que contiene las células progenitoras retinianas. La presente invención también proporciona un método para producir dicho agregado que contiene células progenitoras retinianas. La obtención de un agregado que comprende células progenitoras retinianas se puede confirmar, por ejemplo, detectando la presencia de células que expresan Rax, PAX6 o Chx10, que es un marcador de células progenitoras retinianas, en el agregado. La tercera etapa puede implicar una etapa de cultivo del agregado formado en la segunda etapa en suspensión en un medio sin suero o en un medio que contiene suero que contiene una sustancia activadora de la vía de transducción de señales de BMP a una concentración necesaria para la inducción de la diferenciación en una célula retiniana, hasta que comienza a aparecer una célula que expresa el gen Rx, obteniéndose así un agregado que comprende células progenitoras retinianas. El cultivo de la tercera etapa se puede realizar hasta que no menos del 20% (preferiblemente, no menos del 30%, no menos del 40%, no menos del 50%, no menos del 60%) de las células contenidas en el agregado expresen Rx.

En el agregado obtenido en la tercera etapa, la proporción de los agregados que expresan Rx del día 18 al día 25, por ejemplo, el día 22, desde el inicio de la segunda etapa es, por ejemplo, no menos del 60%, preferiblemente no menos del 80%.

En el agregado obtenido en la segunda etapa, la proporción de los agregados que expresan Pax6 y/o Chx10 del día 18 al día 25, por ejemplo, el día 22, desde el inicio de la segunda etapa es, por ejemplo, no menos del 60%, preferiblemente no menos del 80%.

En la producción de células progenitoras retinianas y/o tejidos retinianos, las células madre pluripotentes humanas (por ejemplo, células iPS humanas) pueden someterse a un cultivo de adhesión en ausencia de una célula alimentadora en un medio sin suero que contenga bFGF, un inhibidor de MEK ( por ejemplo, PD0325901) y un inhibidor de PKC (por ejemplo, Go6983) durante un período que no exceda de 30 días, preferiblemente 0,5 días - 8 días, más preferiblemente 1 día - 6 días en la primera etapa; las células obtenidas en la primera etapa se someten a cultivo en suspensión en un medio sin suero que contiene una sustancia activadora de la vía de transducción de señales de Sonic hedgehog (por ejemplo, SAG) para formar agregados celulares en la segunda etapa; y los agregados obtenidos en la segunda etapa se someten a cultivo en suspensión en un medio sin suero que contiene una sustancia activadora de la vía de transducción de señales de BMP (por ejemplo, BMP4) en la tercera etapa.

En la producción de células retinianas y/o tejidos retinianos, las células madre pluripotentes humanas (por ejemplo, células iPS humanas) pueden someterse a cultivo de adhesión en ausencia de una célula alimentadora en un medio sin suero que contenga bFGF, un inhibidor de MEK (por ejemplo, PD0325901) y un inhibidor de B-Raf (por ejemplo, SB590885) durante un período que no exceda de 30 días, preferiblemente 0,5 días - 8 días, más preferiblemente 1 día - 6 días en la primera etapa; las células obtenidas en la primera etapa se someten a cultivo en suspensión en un medio sin suero que contiene una sustancia activadora de la vía de transducción de señales de Sonic hedgehog (por ejemplo, SAG) para formar agregados celulares en la segunda etapa; y los agregados obtenidos en la segunda etapa se someten a cultivo en suspensión en un medio sin suero que contiene una sustancia activadora de la vía de transducción de señales de BMP (por ejemplo, BMP4) en la tercera etapa.

En la producción de células progenitoras retinianas y/o tejidos retinianos, las células madre pluripotentes humanas (por ejemplo, células iPS humanas) pueden someterse a un cultivo de adhesión en ausencia de una célula alimentadora en un medio sin suero que contiene bFGF y un inhibidor de MEK (por ejemplo, PD0325901) y que no contiene un inhibidor de PKC (por ejemplo, Go6983) o un inhibidor de B-Raf (por ejemplo, SB590885) durante un período que no exceda de 30 días, preferiblemente de 0,5 días a 8 días, más preferiblemente de 1 día a 6 días, además preferiblemente 4 días - 6 días en la primera etapa; las células obtenidas en la primera etapa se someten a cultivo en suspensión en un medio sin suero que no contiene una sustancia activadora de la vía de transducción de señales de Sonic hedgehog (por ejemplo, SAG) para formar agregados celulares en la segunda etapa; y los agregados obtenidos en la segunda etapa se someten a cultivo en suspensión en un medio sin suero que contiene una sustancia activadora de la vía de transducción de señales de BMP (por ejemplo, BMP4) en la tercera etapa.

En la producción de células progenitoras retinianas y/o tejidos retinianos, las células madre pluripotentes humanas (por ejemplo, células iPS humanas) pueden someterse a un cultivo de adhesión en ausencia de una célula alimentadora en un medio sin suero que contiene bFGF y un inhibidor de MEK ( por ejemplo, PD0325901) y que no contiene un inhibidor de PKC (por ejemplo, Go6983) o un inhibidor de B-Raf (por ejemplo, SB590885) durante un período que no exceda de 30 días, preferiblemente 0,5 días - 8 días, más preferiblemente 1 día - 6 días, en la primera etapa; las células obtenidas en la primera etapa se someten a cultivo en suspensión en un medio sin suero que contiene una sustancia activadora de la vía de transducción de señales de Sonic hedgehog (por ejemplo, SAG) para formar agregados celulares en la segunda etapa; y los agregados obtenidos en la segunda etapa se someten a cultivo en suspensión en un medio sin suero que contiene una sustancia activadora de la vía de transducción de señales de BMP (por ejemplo, BMP4) en la tercera etapa.

El agregado obtenido que contiene células progenitoras retinianas se puede utilizar tal cual como un reactivo para evaluar la toxicidad o la eficacia. Un agregado que contiene células progenitoras retinianas se somete a un tratamiento de dispersión (por ejemplo, tratamiento con tripsina/EDTA o tratamiento con papaína), y las células obtenidas se someten a una selección usando FACS o MACS, mediante lo cual también se pueden obtener células progenitoras retinianas de alta pureza.

Además, el agregado que contiene células progenitoras retinianas se puede cultivar de manera continua en un medio sin suero o en un medio que contiene suero para producir un tejido retiniano similar a una estructura neuroepitelial que contiene células nerviosas específicas de la capa de la retina.

Un medio sin suero o un medio que contiene suero para utilizarlo para dicho medio no está particularmente limitado siempre que sea como se mencionó anteriormente. Por ejemplo, se pueden mencionar un medio que contiene suero que es un medio DMEM-F12 suplementado con suero bovino fetal al 10%, suplemento de N2, taurina 100 pM y ácido retinoico 500 nM, o un medio sin suero suplementado con una cantidad apropiada de un sustituto de suero disponible comercialmente tal como KSR , etc. (por ejemplo, medio de una mezcla 1:1 de IMDM y F-12 suplementado con KSR al 10%, 1 -tioglicerol (o tioglicerol) 450 pM y 1x concentrado de lípidos definido químicamente) y similares.

Si bien el período de cultivo para inducir un tejido retiniano que contiene células nerviosas específicas de la capa de retina a partir de células progenitoras retinianas varía dependiendo de las neuronas específicas de la capa de la retina previstas, es, por ejemplo, de aproximadamente 7 días a aproximadamente 200 días.

El tejido retiniano existe cubriendo la superficie del agregado. Después de completar el cultivo en suspensión, el agregado se puede fijar con un fijador tal como una solución de paraformaldehído, etc., y se prepara una criosección, después se puede confirmar la formación de un tejido retiniano que tiene una estructura en capas mediante inmunotinción y similares. Dado que las capas respectivas de un tejido retiniano se componen de diferentes precursores de células nerviosas específicas de la capa de la retina (célula fotorreceptora, célula horizontal, célula bipolar, célula amacrina, célula ganglionar de la retina), la formación de una estructura de capa puede confirmarse utilizando anticuerpos contra los marcadores antes mencionados expresados en estas células mediante la inmunotinción. El tejido retiniano puede ser una estructura neuroepitelial positiva para Rx o Chx10.

El tejido retiniano existente en la superficie del agregado se puede cortar físicamente a partir del agregado usando alicates y similares. En este caso, dado que se puede formar un tejido neural distinto del tejido retiniano en la superficie de cada agregado, una parte del tejido neural cortado a partir del agregado puede someterse a confirmación mediante la inmunotinción mencionada a continuación y similares, por lo cual se puede confirmar que el tejido es un tejido retiniano.

El agregado obtenido en la tercera etapa puede contener un tejido retiniano y está sustancialmente libre de ectodermo de cabeza no neural. En un agregado que contiene un tejido retiniano y sustancialmente libre de ectodermo de cabeza no neural, por ejemplo, se observa un tejido Rx positivo y no se observa un tejido Rx negativo en el exterior del mismo en las imágenes de inmunotinción de la sección congelada del agregado antes mencionado.

La tercera etapa puede incluir una etapa de cultivo del agregado formado en la segunda etapa en suspensión en un medio sin suero o en un medio que contiene suero que contiene una sustancia activadora de la vía de transducción de señales de BMP a una concentración necesaria para la inducción de la diferenciación en células retinianas, hasta que empieza a aparecer una célula que expresa el gen Rx o Pax6 para dar un agregado que comprende células progenitoras retinianas, y posteriormente cultivar el agregado que contiene las células progenitoras retinianas en suspensión en un medio sin suero o en un medio que contiene suero hasta que se forma un tejido retiniano, con lo que se obtiene un agregado que comprende un tejido retiniano. Cuando el agregado que contiene las células progenitoras retinianas se cultiva posteriormente en suspensión en un medio sin suero o en un medio que contiene suero hasta que se forma un tejido retiniano, la concentración de la sustancia activadora de la vía de transducción de señales de BMP en el medio para inducir las células progenitoras retinianas puede disminuir gradual o progresivamente en una proporción del 40 - 60% cada 2 - 4 días intercambiando el medio con un medio sin suero o un medio que contiene suero, cada uno de los cuales no está suplementado con una sustancia activadora de la vía de transducción de señales de BMP. El cultivo en suspensión de un agregado que contiene células progenitoras retinianas se puede realizar hasta que no menos del 20% (preferiblemente, no menos del 30%, no menos del 40%, no menos del 50%, no menos del 60%) de las células contenidas en el agregado expresen Chx10.

En la tercera etapa, el agregado obtenido en la segunda etapa, o un agregado obtenido cultivando el agregado obtenido en la segunda etapa en suspensión mediante el método mencionado anteriormente, se puede someter a cultivo por adhesión para formar un agregado adherido. El agregado adherido se cultiva en un estado adherido en un medio sin suero o en un medio que contiene suero que contiene una sustancia activadora de la vía de transducción de señales de BMP a una concentración necesaria para la inducción de la diferenciación en una célula retiniana, hasta que comienza a aparecer una célula que expresa el gen Rx o Pax6 para dar un agregado que contiene células progenitoras retinianas. El agregado que contiene las células progenitoras retinianas se cultiva en un estado adherido en un medio sin suero o en un medio que contiene suero hasta que se forma un tejido retiniano, con lo que se obtiene un agregado que contiene un tejido retiniano. El cultivo de adhesión del agregado que contiene células progenitoras retinianas se puede realizar hasta que no menos del 10% (preferiblemente, no menos del 20%, no menos del 30%, no menos del 40%, no menos del 50%) de las células expresen Chx10.

Mediante el método de producción de la presente invención, se puede obtener tejido retiniano con alta eficacia a partir de células madre pluripotentes. Dado que el tejido retiniano obtenido mediante el método de producción de la presente invención contiene neuronas específicas para cada una de las capas de la retina, también es posible obtener células que constituyen un tejido retiniano, tales como células fotorreceptoras, células horizontales, células bipolares, células amacrinas, células ganglionares de la retina o una célula progenitora de la misma y similares. Qué célula se obtuvo del tejido retiniano obtenido puede confirmarse mediante un método conocido per se, por ejemplo, la expresión de un marcador celular.

El agregado obtenido que contiene tejido retiniano también se puede utilizar directamente como un reactivo para evaluar la toxicidad o la eficacia. Un agregado que contiene tejido retiniano se somete a un tratamiento de dispersión (por ejemplo, tratamiento con tripsina/EDTA), y las células obtenidas se someten a una selección usando FACS o MACS, mediante lo cual también se pueden obtener células que constituyen tejido retiniano de alta pureza, por ejemplo, células fotorreceptoras de alta pureza.

Se puede producir una estructura similar a una zona marginal ciliar mediante un método bien conocido por los expertos en la técnica a partir del agregado celular que contiene un tejido retiniano, que se obtiene mediante el método de producción de la presente invención (por ejemplo, los documentos de Patente WO 2013/183774, WO 2015/087614, WO 2015/107738). Específicamente, se puede mencionar el método descrito en la siguiente etapa (A) y etapa (B).

La estructura similar a una zona marginal ciliar se refiere a una estructura similar a una zona marginal ciliar. Ejemplos de la "zona marginal ciliar (CMZ)" incluyen un tejido presente en la región límite del tejido retiniano (específicamente, retina neural) y el epitelio pigmentario retiniano en la retina in vivo, que es una región que contiene células madre tisulares de la retina (células madre retinianas). La zona marginal ciliar también se denomina margen ciliar o margen retiniano, y la zona marginal ciliar, el margen ciliar y el margen retiniano son tejidos equivalentes. Se sabe que la zona marginal ciliar desempeña un papel importante en el suministro de células progenitoras retinianas o células diferenciadas a los tejidos retinianos, el mantenimiento de la estructura del tejido retiniano, etc. Ejemplos del gen marcador de la zona marginal ciliar incluyen el gen Rdh10 (positivo), el gen Otx1 (positivo), Zic1 (positivo), etc.

La etapa (A) comprende el cultivo de un agregado celular que comprende un tejido retiniano obtenido mediante el método de producción 2 en el que las células Chx10 positivas están presentes en una proporción del 20 % o más y del 100 % o menos del tejido retiniano, en un medio sin suero o en un medio que contiene suero, cada uno de los cuales contiene una sustancia activadora de la vía de señalización de Wnt y/o un inhibidor de la vía de señalización de FGF solo durante un período antes de la aparición de una célula que expresa el gen RPE65.

Como un cultivo preferible de la etapa (A) en la presente memoria, se puede mencionar el cultivo en suspensión.

Como un medio sin suero para utilizarse en la etapa (A), se puede mencionar un medio sin suero que es un medio basal suplementado con N2 o KSR. Más específicamente, se puede mencionar un medio sin suero que es un medio DMEM/F-12 suplementado con suplemento de N2 (fabricado por Life Technologies Corporation). Como medio que contiene suero, se puede mencionar un medio que contiene suero que es un medio basal suplementado con suero bovino fetal.

Las condiciones de cultivo de la etapa (A), tales como la temperatura de cultivo, la concentración de CO2 se pueden ajustar adecuadamente. La temperatura del cultivo está, por ejemplo, en el intervalo de aproximadamente 30°C a aproximadamente 40°C, preferiblemente, por ejemplo, alrededor de aproximadamente 37°C. La concentración de CO2 está, por ejemplo, en el intervalo de aproximadamente 1% a aproximadamente 10%, preferiblemente, por ejemplo, alrededor de aproximadamente 5%.

En la etapa (A), la sustancia activadora de la vía de transducción de señales de Wnt que está contenida en un medio sin suero o en un medio que contiene suero cuando el "agregado celular que comprende un tejido retiniano'' mencionado anteriormente se cultiva en el medio no está particularmente limitada siempre que pueda mejorar la transducción de señales mediada por Wnt. Ejemplos específicos de la sustancia activadora de la vía de transducción de señales de Wnt incluyen una proteína que pertenece a la familia Wnt (por ejemplo, Wnt1, Wnt3a, Wnt7a), receptor de Wnt, agonista del receptor de Wnt, inhibidor de GSK3p (por ejemplo, 6-bromoindirubin-3'-oxima (BIO), CHIR99021, Kenpaulona),etc.

La concentración de la sustancia activadora de la vía de transducción de señales de Wnt que debe estar contenida en un medio sin suero o en un medio que contiene suero en la etapa (A) en el caso de una sustancia activadora de la vía de transducción de señales de Wnt común tal como CHIR99021 está, por ejemplo, en el intervalo de aproximadamente 0,1 pM a aproximadamente 100 pM, preferiblemente, por ejemplo, en el intervalo de aproximadamente 1 pM a aproximadamente 30 pM, más preferiblemente, por ejemplo, alrededor de 3 pM.

El inhibidor de la vía de transducción de señales de FGF que está contenido en un medio sin suero o en un medio que contiene suero en la etapa (A) cuando el "agregado celular que comprende un tejido retiniano" mencionado anteriormente se cultiva en el medio, no está particularmente limitado siempre que puede inhibir la transducción de señales mediada por FGF. Los ejemplos del inhibidor de la vía de transducción de señales de FGF incluyen el receptor de FGF, el inhibidor del receptor de FGF (por ejemplo, SU-5402, AZD4547, BGJ398), el inhibidor de la cascada de MAP-quinasa (por ejemplo, el inhibidor de MEK, el inhibidor de MAPK, el inhibidor de ERK), el inhibidor de la quinasa PI3, el inhibidor de Akt. etc.

La concentración del inhibidor de la vía de transducción de señales de FGF contenido en un medio sin suero o en un medio que contiene suero en la etapa (A) sólo necesita estar a una concentración a la que se pueda inducir la diferenciación de un agregado en una estructura similar a una zona marginal ciliar. Por ejemplo, en el caso de SU-5402, se añade al medio a una concentración de aproximadamente 0,1 pM a aproximadamente 100 pM, preferiblemente de aproximadamente 1 pM a aproximadamente 30 pM, más preferiblemente aproximadamente 5 pM.

"Cultivar sólo durante un período antes de la aparición de una célula que expresa el gen RPE65" en la etapa (A) significa cultivar en todo o parte del período antes de la aparición de una célula que expresa el gen RPE65. Es decir, cultivar en todo o parte del período (cualquier período) durante el cual el "agregado celular que comprende un tejido retiniano" antes mencionado en el sistema de cultivo está constituido por células que no expresan sustancialmente el gen RPE65. Empleando dicho cultivo, se puede obtener un agregado celular en el que no aparece una célula que expresa el gen RPE65.

Para determinar dicho período particular, se utiliza como una muestra el "agregado celular que comprende un tejido retiniano" antes mencionado, y la presencia o ausencia de expresión del gen RPE65 contenido en la muestra o el nivel del mismo se puede medir mediante un método de ingeniería genética general o un método bioquímico. Específicamente, por ejemplo, la presencia o ausencia de expresión del gen RPE65 o el nivel del mismo puede examinarse sometiendo una criosección del "agregado celular que comprende un tejido retiniano" antes mencionado a un método de inmunotinción usando un anticuerpo contra la proteína RPE65.

Como un "período antes de la aparición de una célula que expresa el gen RPE65" en la etapa (A), por ejemplo, se puede mencionar un período durante el cual la proporción de células Chx10 positivas presentes en el tejido retiniano mencionado anteriormente disminuye con respecto a la del momento del inicio del cultivo del agregado celular antes mencionado en un medio sin suero o en un medio que contiene suero, cada uno de los cuales contiene una sustancia activadora de la vía de transducción de señales de Wnt y/o un inhibidor de la vía de transducción de señales de FGF, y está dentro del intervalo de 30% a 0%. Como el "agregado celular en el que no aparece una célula que expresa el gen RPE65", se puede mencionar un agregado celular en el que las células Chx10 positivas están presentes en el tejido retiniano antes mencionado en una proporción entre el 30% y el 0% del tejido.

Dado que el número de días del "período antes de la aparición de una célula que expresa el gen RPE65" en la etapa (A) varía dependiendo del tipo de sustancia activadora de la vía de transducción de señales de Wnt y/o del inhibidor de la vía de transducción de señales de FGF, el tipo del medio sin suero o del medio que contiene suero, otras condiciones de cultivo, etc., está, por ejemplo, dentro de 14 días. Más específicamente, cuando se usa un medio sin suero (por ejemplo, medio sin suero que es un medio basal suplementado con N2), el período mencionado anteriormente está preferiblemente, por ejemplo, dentro de 10 días, más preferiblemente, por ejemplo, de 3 días a 6 días. Cuando se usa un medio que contiene suero (por ejemplo, un medio que contiene suero que es un medio basal suplementado con suero bovino fetal), el período mencionado anteriormente está preferiblemente, por ejemplo, dentro de 12 días, más preferiblemente, por ejemplo, de 6 días a 9 días.

Después, como etapa (B), el "agregado celular en el que no aparece una célula que expresa el gen RPE65" obtenido mediante cultivo como se mencionó anteriormente se cultiva en un medio sin suero o en un medio que contiene suero, cada uno de los cuales no está suplementado con una sustancia activadora de la vía de transducción de señales de Wnt.

Como un cultivo preferible en la etapa (B), se puede mencionar el cultivo en suspensión.

Como medio sin suero en la etapa (B), se puede mencionar un medio que es un medio basal suplementado con N2 o KSR. Como medio que contiene suero, se puede mencionar un medio que es un medio basal suplementado con suero fetal bovino. Más específicamente, se puede mencionar un medio que contiene suero que es un medio DMEM/F-12 suplementado con suero fetal bovino.

El medio anterior sin suero o el medio que contiene suero en la etapa (B) puede contener un factor de crecimiento conocido, un aditivo y una sustancia química que promueva el crecimiento, etc. Ejemplos de factores de crecimiento conocidos incluyen EGF, FGF, IGF, insulina, etc. Ejemplos de aditivos que promueven el crecimiento incluyen el suplemento de N2 (Life Technologies), el suplemento de B27 (Life Technologies), el KSR (Life Technologies), etc. Ejemplos de sustancias químicas que promueven el crecimiento incluyen retinoides (por ejemplo, ácido retinoico) y taurina.

Un período preferible para el cultivo en la etapa (B), por ejemplo, se puede mencionar un período para el cultivo durante el cual la proporción de células Chx10 positivas presentes en el tejido retiniano mencionado anteriormente aumenta con respecto al momento del inicio del cultivo del agregado celular mencionado anteriormente en un medio sin suero o en un medio que contiene suero cada un libre de una sustancia activadora de la vía de transducción de señales de Wnt, y alcanza el 30% o más.

Las condiciones de cultivo, tales como la temperatura del cultivo, la concentración de CO2 y similares en la etapa (B) se pueden establecer apropiadamente. La temperatura del cultivo está, por ejemplo, en el intervalo de aproximadamente 30°C a aproximadamente 40°C, preferiblemente, por ejemplo, alrededor de aproximadamente 37°C. La concentración de CO2 está, por ejemplo, en el intervalo de aproximadamente 1% a aproximadamente 10%, preferiblemente, por ejemplo, alrededor de aproximadamente 5%.

Si bien el número de días de cultivo antes mencionados hasta que se obtiene "un agregado celular que comprende una estructura similar a una zona marginal ciliar" en la etapa (B) varía dependiendo del tipo de medio sin suero o medio que contiene suero, otras condiciones de cultivo, etc., está, por ejemplo, dentro de 100 días. El número anterior de días de cultivo es preferiblemente, por ejemplo, de 20 días a 70 días, más preferiblemente, por ejemplo, de 30 días a 60 días.

En un "agregado celular que comprende una estructura similar a una zona marginal ciliar" preparado mediante las etapas (A) y (B) antes mencionadas, un epitelio pigmentario retiniano y un tejido retiniano (específicamente, retina neural) están presentes respectivamente junto a la estructura similar a una zona marginal ciliar en el mismo agregado celular. La estructura puede confirmarse mediante observación microscópica, etc. Específicamente, por ejemplo, la presencia de una estructura similar a una zona marginal ciliar como una estructura epitelial que es gruesa en el lado de la retina y delgada en el lado del epitelio pigmentario de la retina, y que se forma entre un tejido retiniano que tiene una alta transparencia y un epitelio pigmentario de la retina que muestra pigmentación, puede confirmarse mediante observación microscópica. Además, la presencia de una estructura similar a una zona marginal ciliar se puede confirmar identificando células Rdh10 positivas, Otx1 positivas o Zic1 positivas con inmunotinción de una sección congelada del agregado. Un tejido retiniano cortado a partir de la estructura similar a la zona marginal ciliar obtenida también puede usarse como tejido retiniano para trasplante.

Se puede producir una célula epitelial pigmentaria de la retina mediante la siguiente etapa (C) a partir de un agregado celular que contiene un tejido retiniano obtenido mediante el método de producción de la presente invención y similares. Se puede producir una lámina epitelial pigmentaria de la retina mediante la siguiente etapa (D) a partir de una célula epitelial pigmentaria de la retina obtenida mediante la siguiente etapa (C).

"Célula epitelial pigmentaria de la retina" significa una célula epitelial presente en el exterior del tejido neural de la retina en la retina in vivo. Los expertos en la técnica pueden confirmar si se trata de una célula epitelial pigmentaria de la retina basándose, por ejemplo, en la expresión de un marcador celular (RPE65 (célula epitelial pigmentaria de la retina madura), Mitf (célula epitelial pigmentaria de la retina juvenil o madura) y similares), la presencia de gránulos de melanina, morfología celular característica del polígono y similares.

En primer lugar, en la etapa (C), se cultiva en suspensión un agregado celular que contiene un tejido retiniano obtenido mediante el método de producción en un medio sin suero o en un medio que contiene suero no suplementado con una sustancia activadora de la vía de señalización de BMP pero que contiene una sustancia activadora de la vía de señalización de Wnt para dar un agregado que contiene células epiteliales pigmentarias de la retina.

Como un medio sin suero para utilizarlo en la etapa (C), se puede mencionar un medio sin suero que es un medio basal suplementado con N2 o KSR. Más específicamente, se puede mencionar un medio sin suero que es un medio DMEM/F-12 suplementado con suplemento de N2 (Life Technologies). Como medio que contiene suero, se puede mencionar un medio que contiene suero que es un medio basal suplementado con suero bovino fetal.

El medio sin suero que se va a utilizar en la etapa (C) puede contener, además de la sustancia activadora de la vía de transducción de señales de Wnt antes mencionada, la sustancia activadora de la vía de transducción de señales Nodal/Activina antes mencionada y/o el inhibidor de la vía de transducción de señales de FGF antes mencionado.

Un cultivo preferible en la etapa (C) es, por ejemplo, un cultivo en suspensión.

Se explica la etapa (D) en la que se dispersa el agregado obtenido en la etapa (C) y las células obtenidas se cultivan en un estado adherido.

La etapa (D) se realiza dentro de los 60 días, preferiblemente dentro de los 30 días, más preferiblemente 3 días, después del inicio de la etapa (C).

Como medio sin suero o medio que contiene suero que se va a utilizar para el cultivo de adhesión en la etapa (D), se puede mencionar el medio mencionado anteriormente. Para evitar una preparación complicada, se utiliza preferiblemente un medio sin suero suplementado con una cantidad adecuada de un sustituto de suero disponible comercialmente tal como KSR y similares (por ejemplo, un medio de una mezcla 1:1 de DMEM/F-12 y Neurobasal suplementado con 1/2 x suplemento de N2, 1/2 x suplemento de B27 y 2-mercaptoetanol 100 pM). La cantidad de KSR que se va a añadir al medio sin suero es, por ejemplo, generalmente de aproximadamente el 1 % a aproximadamente el 20 %, preferiblemente de aproximadamente el 2 % a aproximadamente el 20 %, en el caso de una célula derivada de una célula iPS humana.

En la etapa (D), es preferible cultivar células en el medio sin suero mencionado anteriormente o en un medio que contiene suero y que contiene un inhibidor de ROCK.

En la etapa (D), es más preferible cultivar células en un medio sin suero o en un medio que contiene suero que contiene además una o más sustancias seleccionadas del grupo que consiste en una sustancia activadora de la vía de señalización de Wnt, un inhibidor de la vía de señalización de FGF, una sustancia activadora de la vía de señalización de activina y sustancia activadora de la vía de transducción de señales de BMP.

La sustancia activadora de la vía de señalización de Activina es una sustancia capaz de potenciar una señal mediada por Activina. Ejemplos de sustancias activadoras de la vía de señalización de Activina incluyen proteínas que pertenecen a la familia de Activina (por ejemplo, Activina A, Activina B, Activina C, Activina AB y similares), receptor de Activina y agonista del receptor de Activina.

La concentración de la sustancia activadora de la vía de señalización de Activina que se utilizará en la etapa (D) puede ser cualquiera siempre que se pueda formar eficientemente una lámina uniforme de células epiteliales pigmentarias de la retina. Por ejemplo, se añade Activina A recombinante humana/ratón/rata (R&D Systems, #338-AC) a una concentración de aproximadamente 1 ng/ml a aproximadamente 10 ug/ml, preferiblemente de aproximadamente 10 ng/ml a aproximadamente 1 ug/ml, más preferiblemente aproximadamente 100 ng/ml.

Se añade una sustancia activadora de la vía de señalización de Activina, por ejemplo, dentro de los 18 días, preferiblemente el día 6, desde el inicio de la etapa (D).

En la etapa (D), el cultivo de adhesión se realiza preferiblemente en un recipiente de cultivo cuya superficie se trata con un sustrato de cultivo. Como un sustrato de cultivo a utilizar para tratar el recipiente de cultivo en la etapa (D), se puede mencionar un sustrato de cultivo celular que permita el cultivo por adhesión de células derivadas de agregados y la formación de una lámina epitelial pigmentaria de la retina.

3. Método para evaluar la toxicidad o eficacia descrito en la presente memoria y que no forma parte de la invención.

Dado que las células retinianas o un tejido retiniano que las contiene producido mediante el método de producción de la presente invención son útiles como material para una investigación sobre enfermedades o descubrimiento de fármacos en una selección de un medicamento para tratar una enfermedad debida a un trastorno de un tejido retiniano, o en la evaluación de la toxicidad, se puede utilizar como un reactivo para evaluar la toxicidad o eficacia de una sustancia de prueba. Por ejemplo, las células iPS se producen a partir de un paciente humano con una enfermedad debida a un trastorno de un tejido retiniano, particularmente una enfermedad hereditaria, y usando las células iPS, se producen las células retinianas o un tejido retiniano que las contiene mediante el método de la presente invención. Las células retinianas o el tejido retiniano que las contiene pueden imitar el trastorno del tejido retiniano que provoca la enfermedad del paciente in vitro. Por lo tanto, la toxicidad o eficacia de una sustancia de prueba se puede evaluar poniendo en contacto la sustancia de prueba con células retinianas o un tejido retiniano que las contiene producido mediante el método de producción de la presente invención, y detectando un efecto de la sustancia sobre las células o el tejido.

Por ejemplo, las células retinianas o un tejido retiniano que las contiene que tienen un trastorno particular (por ejemplo, un trastorno hereditario), que se producen mediante el método de producción de la presente invención, se cultivan en presencia o ausencia (control negativo) de una sustancia de prueba. Después, se compara la gravedad del trastorno en las células retinianas o en el tejido retiniano tratados con la sustancia de prueba con la del control negativo. Como resultado, la sustancia de prueba que redujo la gravedad del trastorno puede seleccionarse como sustancia candidata para un medicamento para tratar la enfermedad resultante del trastorno. Por ejemplo, una sustancia de prueba que mejora la actividad fisiológica (por ejemplo, mayor supervivencia o maduración) de las células retinianas o un tejido retiniano que las contiene producido mediante el método de producción de la presente invención se puede seleccionar para una sustancia candidata de un producto farmacéutico. Alternativamente, las células retinianas o un tejido retiniano que las contiene se preparan induciendo la diferenciación de las células madre pluripotentes inducidas usando el método de producción de la presente invención, en donde las células madre pluripotentes inducidas se preparan a partir de una célula somática que tiene una mutación genética que provoca un trastorno particular en una enfermedad acompañada por un trastorno en el tejido retiniano y similares. Se puede seleccionar una sustancia de prueba candidata eficaz como un fármaco terapéutico o fármaco profiláctico para el trastorno, basándose en un índice (si las células retinianas o el tejido retiniano que las contiene añadido con una sustancia de prueba muestran el trastorno antes mencionado).

Para la evaluación de la toxicidad, se cultivan células retinianas o un tejido retiniano que las contiene producido mediante el método de producción de la presente invención en presencia o ausencia (control negativo) de una sustancia de prueba. Después, se compara la gravedad de la toxicidad en las células retinianas o en el tejido retiniano que las contiene con la del control negativo. Como resultado, una sustancia de prueba que ejerció toxicidad en comparación con el control negativo puede determinarse como una sustancia que tiene toxicidad para las células retinianas o un tejido retiniano que las contiene. Es decir, la toxicidad puede evaluarse mediante un método que comprende las siguientes etapas:

(etapa 1) una etapa de cultivo de células retinianas o un tejido retiniano que las contiene producido mediante el método de producción de la presente invención en condiciones de cultivo viables durante un tiempo determinado en presencia de una sustancia de prueba, y medición de la gravedad de la lesión celular,

(etapa 2) una etapa de cultivo de células retinianas o un tejido retiniano que las contiene producido mediante el método de producción de la presente invención en condiciones de cultivo viables durante un tiempo determinado en ausencia de la sustancia de prueba o en la presencia de un control positivo, y medición de la gravedad de la lesión celular,

(etapa 3) una etapa de evaluación de la toxicidad de la sustancia de prueba en la etapa 1, basándose en la diferencia en los resultados medidos en (etapa 1) y (etapa 2).

Como se usa en la presente memoria, "en ausencia de una sustancia de prueba" abarca añadir solo un medio de cultivo o un disolvente usado para disolver la sustancia de prueba en lugar de añadir una sustancia de prueba. Además, "control positivo" significa un compuesto conocido que tiene toxicidad.

Ejemplos del método para medir la gravedad de la lesión celular incluyen un método para medir el número de células viables, por ejemplo, un método para medir la cantidad de ATP intracelular, un método para medir el número de células viables mediante tinción celular (por ejemplo, tinción del núcleo) y observación de morfología y similares.

En la etapa 3, como un método para evaluar la toxicidad de una sustancia de prueba, se comparan el valor de medición en la etapa 1 y el valor de medición del control negativo en la etapa 2, y cuando la gravedad de la lesión celular en la etapa 1 es alta, se puede determinar que la sustancia de prueba muestra toxicidad. Además, se comparan el valor de medición en la etapa 1 y el valor de medición del control positivo en la etapa 2, y cuando la gravedad de la lesión celular en la etapa 1 es igual o superior, se puede determinar que la sustancia de prueba muestra toxicidad.

4. Composición farmacéutica descrita en la presente memoria y que no forma parte de la invención.

Se puede proporcionar una composición farmacéutica que contiene una cantidad eficaz de células retinianas o un tejido retiniano que las contiene producido mediante el método de producción de la presente invención.

La composición farmacéutica que contiene una cantidad eficaz de células retinianas o un tejido retiniano que las contiene producido mediante el método de producción de la presente invención, y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

Como vehículo farmacéuticamente aceptable, se puede utilizar un disolvente acuoso fisiológico (solución salina, tampón, medio sin suero, etc.). Cuando sea necesario, en una terapia de trasplante, un medicamento que contiene un tejido o células que se va a trasplantar puede contener conservantes, estabilizadores, agentes reductores, agentes isotonizantes y similares usados convencionalmente.

La composición farmacéutica se puede producir como una suspensión mediante la suspensión de células retinianas o un tejido retiniano que las contiene producido mediante el método de producción en un disolvente acuoso fisiológico apropiado. Cuando sea necesario, la composición puede crioconservarse con un crioconservante, descongelarse cuando esté en uso, lavarse con tampón y usarse para una terapia de trasplante.

Un tejido retiniano obtenido mediante el método de producción de la presente invención también se puede cortar en un tamaño apropiado con alicates y similares para obtener una preparación en lámina.

Las células obtenidas mediante el método de producción de la presente invención también pueden someterse a cultivo de adhesión en la tercera etapa para la inducción de la diferenciación para formar células en forma de lámina para dar una preparación en lámina.

La composición farmacéutica es útil como un fármaco terapéutico para una enfermedad debida a un trastorno de las células retinianas o de un tejido retiniano que las contiene.

5. Fármaco terapéutico y método de tratamiento descritos en la presente memoria y que no forman parte de la invención.

Las células retinianas o el tejido retiniano que las contiene producido mediante el método de producción de la presente invención son útiles para una terapia de trasplante para una enfermedad debida a (provocada por) un trastorno de la misma. Por lo tanto, se puede proporcionar un fármaco terapéutico que contenga células retinianas o un tejido retiniano que las contenga producido mediante el método de producción de la presente invención para tratar una enfermedad debida a un trastorno del tejido retiniano. Las células retinianas o un tejido retiniano que las contiene producido mediante el método de producción de la presente invención se pueden usar como un medicamento para tratar una enfermedad debida a un trastorno de un tejido retiniano o para complementar el sitio dañado correspondiente en un estado dañado del tejido retiniano. Una enfermedad debida a un trastorno de un tejido retiniano y un estado dañado de un tejido retiniano se pueden tratar trasplantando células retinianas o un tejido retiniano que las contiene producido mediante el método de producción de la presente invención a un paciente con la enfermedad debida al trastorno de un tejido retiniano, o el estado dañado de un tejido retiniano, que requiere un trasplante, para complementar el propio tejido retiniano alterado. Ejemplos de enfermedades debidas a un trastorno del tejido retiniano incluyen desnaturalización de la retina, degeneración pigmentaria de la retina, degeneración macular relacionada con la edad, intoxicación por mercurio orgánico, retinopatía por cloroquina, glaucoma, retinopatía diabética, retinopatía de recién nacidos o similares.

En la terapia de trasplante, el rechazo debido a la diferencia en los antígenos de histocompatibilidad plantea a menudo un problema. Sin embargo, el problema puede resolverse mediante el uso de células madre pluripotentes (por ejemplo, células madre pluripotentes inducidas) establecidas a partir de las células somáticas del receptor del trasplante. Es decir, células madre pluripotentes (por ejemplo, células madre pluripotentes inducidas) establecidas a partir de las células somáticas del receptor pueden usarse como células madre pluripotentes en el método de la presente invención, y un tejido neural o células neurales, que es inmunológicamente propio para el receptor, producido y trasplantado al receptor.

Además, se puede producir un tejido retiniano alogénico o una célula retiniana a partir de una célula madre pluripotente (por ejemplo, célula madre pluripotente inducida) establecida a partir de una célula somática de otros que sean inmunológicamente compatibles con el receptor (por ejemplo, compatibles en tipo HLA y tipo MHC parcial o totalmente) y trasplantados al receptor.

[Ejemplos]

La presente invención se explica en detalle a continuación haciendo referencia a Ejemplos, que no deben considerarse limitantes.

Ejemplo 1: Producción de tejido retiniano utilizando células iPS humanas, que incluye una etapa de cultivo en medio que contiene inhibidor de MEK e inhibidor de PKC o inhibidor de B-Raf.

Se utilizaron células iPS derivadas de fibroblastos dérmicos humanos establecidos a partir de fibroblastos dérmicos humanos (HDF) de Cell Applications, Inc. (cepa 201B7, Kyoto University) y células iPS derivadas de células mononucleares derivadas de sangre periférica humana establecidas a partir de ePMBC (marca comercial registrada) de Cellular Technology Limited (cepa 1231A3, Kyoto University). El cultivo de mantenimiento indiferenciado de estas células iPS en condiciones sin células alimentadoras se realizó según el método descrito en "Nakagawa, M. et al., Sci. Rep. 2014 Jan 8; 4: 3594". Como medio, se utilizó el medio AK03 "StemFit (marca comercial registrada)" (Ajinomoto Co., Inc.) y iMatrix-511 (Nippi) como sustrato de cultivo.

La producción de tejido retiniano que incluye una etapa de cultivo en un medio que contiene un inhibidor de MEK y un inhibidor de PKC o un inhibidor de B-Raf se realizó de la siguiente manera. Las células iPS humanas en cultivo para mantener un estado indiferenciado se trataron con 0,5 x T rypLE select (mezcla de cantidades iguales de T rypLE select (Life Technologies) y EDTA/PBS(-) 0,5 mM), se rasparon usando un raspador de células y se dispersaron en células individuales mediante pipeteo, se sembraron en una placa de cultivo de 6 pocillos recubierta con iMatrix-511 (0,5 pg/cm2) a 1,2 x 104 células por 1 pocillo y se cultivaron en un medio StemFit que contiene Y-27632 (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) (concentración final 10 pM) como inhibidor de ROCK en condiciones de 37°C, CO2 al 5 %. Al día siguiente de la siembra, se añadieron PD0325901 (SIGMA) (concentración final 1 pM) como un inhibidor de MEK y Go6983 (SIGMA) (concentración final 2 pM) como un inhibidor de PKC y la mezcla se cultivó durante 6 días, o a los 2 días después de la siembra, se añadieron PD0325901 (concentración final 1 pM) y Go6983 (concentración final 2 pM) y la mezcla se cultivó durante 5 días, o a los 6 días después de la siembra, se añadieron PD0325901 (concentración final 1 pM) y SB-590885 (SIGMA) (concentración final 0,5 pM) como un inhibidor de B-Raf y la mezcla se cultivó durante 1 día (finalización de la etapa 1). Las células cultivadas en el medio que contenía los inhibidores mencionados anteriormente se trataron con 0,5 x TrypLE select, se rasparon con un raspador de células, se dispersaron en células individuales mediante pipeteo y se sembraron en una placa de cultivo de 96 pocillos (placa PrimeSurface 96 V-BOTTOM, SUMITOMO BAKELITA CO., LTD.) a 1,2 x 104 células por 1 pocillo y se cultivaron en 100 ul de un medio gfCDM+KSR [45 % de IMDM (Life Technologies), 45 % de F12 (Life Technologies), 10 % de KSR (Life Technologies), 1 % de concentrado de lípidos definido químicamente (Life Technologies), 1 -tioglicerol (SIGMA) 450 pM] suplementado con Y-27632 (concentración final 20 pM) y se cultivaron en suspensión en condiciones de 37°C, 5 % de CO2. Los agregados celulares se formaron el día 2 desde el inicio del cultivo en suspensión (es decir, 2 días después del inicio del cultivo en suspensión) (finalización de la etapa 2). El día 3 desde el inicio del cultivo en suspensión (es decir, 3 días después del inicio del cultivo en suspensión), se añadió medio gfCDM+KSR que no contenía un inhibidor de ROCK pero que contenía BMP4 humana recombinante (R&D Systems) (4,5 nM) en 50 pl por 1 pocillo de modo que la concentración final de BMP4 recombinante humana exógena fuera de 1,5 nM (55 ng/ml) (inicio de la etapa 3). El día 6 (es decir, 6 días después del inicio del cultivo en suspensión), el día 9 (9 días después), el día 12 (12 días después), el día 15 (15 días después) desde el inicio del cultivo en suspensión, se cambió la mitad de la cantidad del medio a un medio gfCDM+KSR que no contenía inhibidor de ROCK ni BMP4 recombinante humana, el día 18 desde el inicio del cultivo en suspensión (18 días después del inicio del cultivo en suspensión), los agregados celulares se transfirieron a una placa de cultivo de 90 mm (placa de Petri para cultivo en suspensión, SUMITOMO BAKELITE CO., LTD.) que contenía 15 ml de medio DMEM/F12+N2 (DMEM/F-12, GlutaMAX (Life Technologies), 1 x suplemento de N2 (Life Technologies), 100 U/ml de penicilina-100 ug/ml de estreptomicina) y se cultivaron de manera continua en suspensión en condiciones de 37°C, 5% de CO2. El día 20 o 21 desde el inicio del cultivo en suspensión (20 o 21 días después del inicio del cultivo en suspensión), los agregados celulares se fijaron con paraformaldehído al 4% y se produjeron criosecciones. Estas criosecciones se inmunotiñeron para un marcador de células progenitoras retinianas, Chx10, utilizando un anticuerpo anti-Chx10 (Exalpha). Como resultado, se confirmaron las células Chx10 positivas (Figura 1).

Ejemplo 2: Producción de tejido retiniano usando células iPS humanas que incluye una etapa de cultivo en un medio que contiene inhibidor de MEK ± inhibidor de PKC, y una etapa de cultivo en un medio que contiene sustancia activadora de la vía de transducción de señales de Sonic hedgehog.

Se utilizaron células iPS derivadas de células mononucleares derivadas de sangre periférica humana establecidas a partir de ePMBC (marca comercial registrada) de Cellular Technology Limited (cepa 1231A3, Kyoto University). El cultivo de mantenimiento indiferenciado de estas células iPS en condiciones sin células alimentadoras se realizó según el método descrito en "Nakagawa, M. et al., Sci. Rep. 2014 Jan 8; 4: 3594". Como medio, se utilizó el medio AK03 "StemFit (marca comercial registrada)" (Ajinomoto Co., Inc.) y se utilizó iMatrix-511 (Nippi) como sustrato de cultivo.

La producción de tejido retiniano que incluye una etapa de cultivo en un medio que contiene un inhibidor de MEK, un inhibidor de PKC o una sustancia activadora de la vía de transducción de señales de Sonic hedgehog se realizó de la siguiente manera. Las células iPS humanas en cultivo para mantenimiento en un estado indiferenciado se trataron con 0,5 x TrypLE select (mezcla de cantidades iguales de TrypLE select (Life Technologies) y EDTA/PBS(-) 0,5 mM), se rasparon usando un raspador de células y se dispersaron en células individuales mediante pipeteo, se sembraron en una placa de cultivo de 6 pocillos recubierta con iMatrix-511 (0,5 pg/cm2) a 1,2 x 104 células por 1 pocillo y se cultivaron en un medio StemFit que contiene Y-27632 (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) (concentración final 10 pM) como un inhibidor de ROCK en condiciones de 37°C, 5 % de CO2.2 días después de la siembra, se añadieron PD0325901 (SIGMA) (concentración final 1 pM) como inhibidor de MEK y Go6983 (SIGMA) (concentración final 2 pM) como inhibidor de PKC y la mezcla se cultivó durante 5 días, o a 6 días después de la siembra, se añadió PD0325901 (concentración final 1 pM) y la mezcla se cultivó durante 1 día (finalización de la etapa 1). Las células cultivadas en el medio que contenía los inhibidores mencionados anteriormente se trataron con 0,5 x TrypLE select, se rasparon con un raspador de células, se dispersaron en células individuales mediante pipeteo y se sembraron en una placa de cultivo de 96 pocillos (placa PrimeSurface 96 V-BOTTOM, SUMITOMO BA<k>E<l>ITA CO., LTD.) a 1,0 x 104 células por 1 pocillo y se cultivaron en 100 ul de un medio gfCDM+KSR [45 % de IMDM (Life Technologies), 45 % de F12 (Life Technologies), 10 % de KSR (Life Technologies), 1 % de concentrado de lípidos definido químicamente (Life Technologies ), 1 -tioglicerol (SIGMA) 450 pM] suplementado con Y-27632 (concentración final 20 pM) (segunda etapa SAG(-)) o se sembraron en un medio gfCDM+KSR suplementado con SAG (Enzo) (concentración final 30 nM) (segunda etapa SAG(+)) y se cultivaron en suspensión en condiciones de 37°C, 5% de CO2. Los agregados celulares se formaron 2 días después del inicio del cultivo en suspensión (finalización de la etapa 2). 3 días después del inicio del cultivo en suspensión, se añadió medio gfCDM+KSR que no contenía un inhibidor de ROCK ni SAG pero que contenía BMP4 humana recombinante (R&D Systems) (4,5 nM) en 50 pl por 1 pocillo de modo que la concentración final de la BMP4 humana recombinante exógena fue 1,5 nM (55 ng/ml) (inicio de la etapa 3). A los 6 días, 9 días, 12 días, 15 días y 18 días después del inicio del cultivo en suspensión, se cambió la mitad del medio a un medio gfCDM+KSR que no contenía inhibidor de ROCK, SAG ni BMP4 humana recombinante. A los 10 días después del inicio del cultivo en suspensión, se observaron al microscopio los agregados celulares (Figura 2). Como resultado, se observó el colapso de los agregados en la segunda etapa SAG(-) sin tratamiento y con tratamiento de 1 día con inhibidor de MEK; sin embargo, apenas se observó un colapso de los agregados en la segunda etapa SAG(+). No se observó colapso de los agregados en el tratamiento de 5 días con inhibidor de MEK y en el tratamiento de 5 días con inhibidor de MEK inhibidor de PKC, independientemente de la presencia o ausencia de SAG en la segunda etapa.

22 días después del inicio del cultivo en suspensión, los agregados celulares se fijaron con paraformaldehído al 4% y se produjeron criosecciones. Estas criosecciones se inmunotiñeron para marcadores de células progenitoras retinianas, Pax6 y Chx10, utilizando un anticuerpo anti-Pax6 (Covance) y un anticuerpo anti-Chx10 (Exalpha). Como resultado, se confirmaron las células Pax6, Chx10 copositivas (Figura 3).

[Aplicabilidad industrial]

Según el método de producción de la presente invención, la diferenciación de células madre pluripotentes en células retinianas se induce eficazmente en ausencia de una célula alimentadora, y se puede producir un tejido retiniano. El método de producción de la presente invención que incluye el uso de un tejido retiniano es útil porque puede producir un tejido retiniano para que sea un material utilizado en las pruebas y tratamientos, para la aplicación a una evaluación de la toxicidad y eficacia de un compuesto candidato a producto farmacéutico u otra sustancia química, o un material de trasplante para el tratamiento de trasplante de tejido retiniano.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un método para producir una célula retiniana o un tejido retiniano, que comprende las siguientes etapas:

(1) una primera etapa de cultivo de una célula madre pluripotente de mamífero en ausencia de una célula alimentadora durante un período que no exceda de 30 días en un medio que comprende a) un factor para el mantenimiento de un estado indiferenciado, en donde el factor para el mantenimiento de un estado indiferenciado es una o más sustancias seleccionadas del grupo que consiste en bFGF, FGF4, FGF8, TGFp, TGFp2, Nodal, Activina A y Activina B y b) un inhibidor de M<e>K,

(2) una segunda etapa de cultivo de la célula obtenida en la primera etapa en suspensión para formar un agregado celular, y

(3) una tercera etapa de cultivo del agregado obtenido en la segunda etapa en suspensión en presencia de una sustancia activadora de la vía de transducción de señales de BMP para obtener un agregado que contiene una célula retiniana o un tejido retiniano, en donde la sustancia activadora de la vía de transducción de señales de BMP es una o más proteínas seleccionadas del grupo que consiste en BMP2, BMP4, BMP7 y GDF7.

2. El método de producción según la reivindicación 1, en el que:

(a) el medio en la primera etapa comprende además un inhibidor de PKC o un inhibidor de B-Raf; y/o (b) la primera etapa se realiza en condiciones sin suero; y/o

(c) la primera etapa se realiza con un método de cultivo de adhesión.

3. El método de producción según la reivindicación 1 o 2, en el que el período de cultivo es de 0,5 días a 8 días, de 1 día a 6 días o de 4 días a 6 días en la primera etapa.

4. El método de producción según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el factor para el mantenimiento de un estado indiferenciado es bFGF.

5. El método de producción según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que:

(a) el inhibidor de MEK es PD0325901;

(b) el inhibidor de PKC es Go6983; y/o

(c) el inhibidor de B-Raf es SB590885.

6. El método de producción según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que las células se cultivan en presencia de un inhibidor de ROCK en la primera etapa.

7. El método de producción según la reivindicación 6, en el que el inhibidor de ROCK es Y-27632.

8. El método de producción según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que las células se cultivan en suspensión en un medio sin suero que contiene una sustancia activadora de la vía de transducción de señales de Sonic hedgehog en la segunda etapa, en donde la sustancia activadora de la vía de transducción de señales de Sonic hedgehog es una o más sustancias seleccionadas del grupo que consiste en Shh, Ihh, receptores de Shh, agonistas de Shh, Purmorfamina y SAG.

9. El método de producción según la reivindicación 8, en el que la sustancia activadora de la vía de transducción de señales de Sonic hedgehog es SAG.

10. El método de producción según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que la sustancia activadora de la vía de transducción de señales de BMP es BMP4.

11. El método de producción según la reivindicación 8, en el que, en la segunda etapa, la concentración de la sustancia activadora de la vía de transducción de señales de Sonic hedgehog en el medio está en una concentración correspondiente a la actividad de transducción de señales de Sonic hedgehog de SAG de 10 nM a 700 nM.

12. El método de producción según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en el que, en la tercera etapa, la sustancia activadora de la vía de transducción de señales de BMP se añade al medio en un momento entre el día 1 y el día 9 o entre el día 3 y el día 6 a partir del inicio de la segunda etapa.

13. El método de producción según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en el que:

(a) se forman agregados uniformes en la segunda etapa; y/o

14. El método de producción según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, en el que la célula madre pluripotente es una célula madre pluripotente inducida.

15. El método de producción según la reivindicación 14, en el que la célula madre pluripotente inducida es una célula madre pluripotente inducida humana.