ES2969371T3 - Interferencia por ARN para el tratamiento de trastornos de ganancia de función - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere al descubrimiento de un tratamiento eficaz para una variedad de enfermedades de ganancia de función, en particular, la enfermedad de Huntington (EH). La presente invención utiliza tecnología de interferencia de ARN (ARNi) contra regiones polimórficas en los genes que codifican diversas proteínas mutantes de ganancia de función, lo que da como resultado un tratamiento eficaz para la enfermedad de ganancia de función. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

interferencia por ARN para el tratamiento de trastornos de ganancia de función

Antecedentes de la invención

La interferencia por ARN (iARN) es el mecanismo de silenciamiento génico postranscripcional específico de secuencia mediante ARN bicatenarios (ARNbc) homólogos al gen que se suprime. Los ARNbc se procesan por Dicer, una ribonucleasa iii celular, para generar dúplex de alrededor de 21 nt con nucleótidos protuberantes en 3' (ARN interferente pequeño, ARNip) que median en la degradación del ARNm específica de secuencia. En células de mamífero, las moléculas de ARNip son capaces de silenciar específicamente la expresión génica sin inducción de la ruta de respuesta del interferón no específica. Así, los ARNip se han convertido en una alternativa nueva y poderosa a otras herramientas genéticas, tales como oligonucleótidos no codificantes y ribozimas, para analizar la función génica. Además, se están desarrollando ARNip para fines terapéuticos con el objetivo de silenciar los genes de enfermedad en seres humanos.

Las enfermedades de repetición de trinucleótidos comprenden un grupo recientemente reconocido de trastornos heredados. La mutación genética común es un aumento en una serie de una repetición de trinucleótidos particular. Hasta la fecha, la repetición de trinucleótidos más frecuente es CAG, que codifica el aminoácido glutamina. Se conocen al menos 9 enfermedades de repetición de CAG, y existen más de 20 variedades de estas enfermedades, que incluyen enfermedad de Huntington, enfermedad de Kennedy, y muchas enfermedades espinocerebelosas. Estos trastornos comparten un componente neurodegenerativo en el cerebro y/o la médula espinal. Cada enfermedad tiene un patrón específico de neurodegeneración en el cerebro, y la mayoría tiene una herencia dominante autosómica.

La aparición de las enfermedades ocurre, en general, de los 30 a 40 años, pero en la enfermedad de Huntington las repeticiones de CAG en el gen huntingtina de >60 predicen una aparición juvenil.

La investigación reciente por los presentes inventores ha mostrado que la mutación genética (aumento en la longitud de repeticiones de CAG de normal <36 en el gen huntingtina a >36 en enfermedad) está asociada con la síntesis de una proteína huntingtina mutante, que tiene >36 poliglutaminas (Aronin et al., 1995). También se ha mostrado que la proteína forma agregados citoplásmicos e inclusiones nucleares (Difiglia et al., 1997), y se asocia con vesículas (Aronin et al., 1999). No se conocen rutas patógenas precisas.

Se cree que la enfermedad de Huntington (y por implicación otras enfermedades de repetición de trinucleótidos) está causada, al menos en parte, por interacciones aberrantes de proteínas, que provocan la alteración de los procesos neuronales críticos, disfunción neuronal, y finalmente la muerte neuronal (neurodegeneración en áreas del cerebro denominadas el cuerpo estriado y la corteza). En la búsqueda de un tratamiento eficaz para estas enfermedades, los investigadores en este campo enfatizaron el entendimiento de la patogénesis de la enfermedad, e inicialmente buscaron mediar al nivel de las supuestas interacciones aberrantes de proteínas. Sin embargo, no existe tratamiento eficaz para la enfermedad de Huntington u otras enfermedades de repetición de trinucleótidos. Además, se ha apreciado ahora que múltiples procesos anormales podrían ser activos en estos tipos de enfermedad.

Sumario de la invención

La presente invención se define en y por las reivindicaciones adjuntas.

En particular, la invención proporciona agentes para la destrucción selectiva de ARNm mutantes transcritos a partir de genes mutantes de ganancia de función, previniendo así la producción de la proteína mutante codificada por tal gen. Se han propuesto otros métodos basados en iARN para la destrucción de genes mutantes en los que los ARNip se dirigen, por ejemplo, contra una mutación puntual que ocurre en un único alelo en el gen mutante (por ejemplo, la mutación puntual en el gen superóxido dismutasa (SOD) asociada a esclerosis lateral amiotrófica (ELA)). Sin embargo, existe una diferencia clave entre ELA y enfermedades de repetición de trinucleótidos, tales como la enfermedad de Huntington. La ELA tiene una mutación puntual en un alelo como el cambio genético, mientras que las enfermedades de repetición de trinucleótidos tienen una región ampliada de repeticiones de CAG en un alelo como el cambio genético. El uso de iARN contra la región ampliada de repeticiones de CAG tiene posibles complicaciones. Se sabe que existen más de 80 genes normales con regiones de repeticiones de CAG en células. Así, no se pueden usar los ARNip dirigidos contra estas repeticiones de CAG sin arriesgar la destrucción generalizada de ARNm que contienen repeticiones de CAG normales. Asimismo, el silenciamiento de sitios no específicos de alelo daría como resultado la pérdida tanto de huntingtina normal como mutante que provoca la disfunción neuronal.

Los agentes de la invención utilizan tecnología de interferencia por ARN (iARN) contra regiones polimórficas seleccionadas (es decir, regiones que contienen polimorfismos específicos de alelo o alélicos) que son distintos del sitio de mutación en el gen que codifica proteína mutante. Los agentes de la actual invención son tratamientos eficaces para una enfermedad de ganancia de función.

Los agentes de la actual invención proporcionan un tratamiento eficaz para la enfermedad de Huntington (EH).

Por consiguiente, en un aspecto, la presente invención proporciona un agente para<uso>para tratar un sujeto que tiene o está en riesgo de tener una enfermedad caracterizada o provocada por una proteína mutante de ganancia de función, administrando al sujeto una cantidad eficaz del agente de iARN dirigido contra un polimorfismo alélico dentro de un gen que codifica una proteína mutante, es decir, proteína huntingtina, de forma que se produce la interferencia específica de secuencia de un gen, dando como resultado un tratamiento eficaz para la enfermedad.

La proteína mutante contiene una región ampliada de poliglutamina. El gen que codifica la proteína mutante contiene una región ampliada de repeticiones de trinucleótidos.

La invención usa agentes de iARN homólogos a un polimorfismo alélico dentro del gen que codifica, por ejemplo, una proteína huntingtina mutante para el tratamiento de enfermedad de Huntington. En una realización preferida, el agente de iARN se dirige contra un polimorfismo alélico seleccionado del grupo que consiste en P1-P5. En una realización preferida adicional, el agente de iARN se dirige un polimorfismo alélico seleccionado del grupo que consiste en P6-P43.

En una realización adicional, la invención proporciona agentes de iARN que comprenden una primera y una segunda hebra que contienen cada una 16-25 nucleótidos. La primera hebra puede ser homóloga a una región de un gen que codifica una proteína mutante de ganancia de función, en el que la secuencia de nucleótidos de la proteína mutante de ganancia de función comprende un polimorfismo alélico. La segunda hebra incluye 16-25 nucleótidos complementarios a la primera hebra. El agente de iARN también puede tener una porción de bucle que comprende 4 11, por ejemplo 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, nucleótidos que conectan las dos secuencias nucleotídicas. En aún otras realizaciones, la región diana de la secuencia de ARNm se localiza en una región no traducida (UTR) 5' o una UTR 3' del ARNm de una proteína mutante.

En otra realización, la invención proporciona un constructo de expresión que comprende un ácido nucleico aislado que codifica una molécula de ácido nucleico con una primera secuencia de 16-25 nucleótidos homóloga a un polimorfismo alélico dentro de, por ejemplo, el gen que codifica una proteína huntingtina mutante. El constructo de expresión puede ser, por ejemplo, un vector viral, vector retroviral, casete de expresión, o plásmido. El constructo de expresión también puede tener una secuencia promotora de ARN polimerasa II o secuencia promotora de ARN polimerasa II, tal como el promotor de ARNnp U6 o promotor H1.

La presente invención proporciona células hospedantes (por ejemplo células de mamífero) que comprenden moléculas de ácidos nucleicos y constructos de expresión de la presente invención.

La presente invención proporciona composiciones terapéuticas que comprenden las moléculas de ácidos nucleicos de la invención y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

Otras características y ventajas de la invención serán evidentes a partir de la siguiente descripción detallada y las reivindicaciones.

Breve descripción de los dibujos

Figura 1 a-ki Gen de huntingtina humano, secuencia nucleotídica (SEQ ID NO: 1)

Figura 2a-b: Proteína huntingtina humana, secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 2)

Figura 3: Codificante (SEQ ID NO: 3) y no codificante (SEQ ID NO: 4) de la secuencia de ARN diana de huntingtina (htt)

Figura 4: Análisis termodinámico de los extremos 5' de la hebra de ARNip para el dúplex de ARNip

Figura 5a-c: Reaccionesin vitrode iARN programadas con ARNip dirigido contra un polimorfismo dentro del ARNm de huntingtina (htt). (a) ARNip estándar. (b) ARNip mejorado por la reducción de la fortaleza del apareamiento de bases del extremo 5' de la hebra no codificante del dúplex de ARNip. (c) ARNip mejorado por la reducción del desapareamiento del extremo 5' de la cadena no codificante del dúplex de ARNip.

Figura 6a-b. iARN de la proteína Htt endógena en células HeLa, (a) Inmunotransferencia de la proteína Htt humana. (b) Cuantificación de la misma.

Descripción detallada de la invención

La presente invención se refiere a agentes para tratar la enfermedad de Huntington.

La presente invención utiliza tecnología de interferencia por ARN (iARN) contra polimorfismos alélicos localizados dentro de un gen que codifica una proteína mutante de ganancia de función. La iARN destruye el ARNm mutante correspondiente con especificidad y selectividad por nuoleótidos. L<os>agentes de ARN de la presente invención se dirigen contra regiones polimórficas de un gen mutante, dando como resultado la escisión de ARNm mutante. Estos agentes de ARN, mediante una serie de interacciones proteína-nucleótido, funcionan escindiendo los ARNm mutantes. Las células destruyen el ARNm escindido, previniendo así la síntesis de proteína mutante correspondiente, por ejemplo la proteína huntingtina.

Por consiguiente, en un aspecto, la presente invención proporciona un agente para uso para tratar un sujeto que tiene o está en riesgo de tener una enfermedad caracterizada o provocada por una proteína mutante de ganancia de función, administrando al sujeto una cantidad eficaz del agente de iARN dirigido contra un polimorfismo alélico dentro de un gen que codifica proteína huntingtina, de forma que se produce la interferencia específica de secuencia de un gen, dando como resultado un tratamiento eficaz para la enfermedad. En una realización, la proteína mutante contiene una región ampliada de poliglutamina. En otra realización, el gen que codifica la proteína mutante contiene una región ampliada de repeticiones de trinucleótidos.

La invención usa agentes de iARN homólogos a un polimorfismo alélico dentro del gen que codifica una proteína huntingtina mutante para el tratamiento de la enfermedad de Huntington. En una realización preferida, el agente de iARN se dirige contra un polimorfismo alélico seleccionado del grupo que consiste en P1-P5. En una realización preferida adicional, el agente de iARN se dirige un polimorfismo alélico seleccionado del grupo que consiste en P6-P43.

En una realización adicional, la invención proporciona agentes de iARN que comprenden una primera y una segunda hebra que contienen cada una 16-25 nucleótidos. La primera hebra puede ser homóloga a una región de un gen que codifica una proteína mutante de ganancia de función, en el que la secuencia de nucleótidos de la proteína mutante de ganancia de función comprende un polimorfismo alélico. La segunda hebra puede incluir 16-25 nucleótidos complementarios a la primera hebra. El agente de iARN también puede tener una porción de bucle que comprende 4 11, por ejemplo 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, nucleótidos que conectan las dos secuencias nucleotídicas. En aún otras realizaciones, la región diana de la secuencia de ARNm se localiza en una región no traducida (UTR) 5' o una UTR 3' del ARNm de una proteína mutante.

En otra realización, la invención proporciona un constructo de expresión que comprende un ácido nucleico aislado que codifica una molécula de ácido nucleico con una primera secuencia de 16-25 nucleótidos homóloga a un polimorfismo alélico dentro de, por ejemplo, el gen que codifica una proteína huntingtina mutante. El constructo de expresión puede ser, por ejemplo, un vector viral, vector retroviral, casete de expresión, o plásmido. El constructo de expresión también puede tener una secuencia promotora de ARN polimerasa II o secuencia promotora de ARN polimerasa II, tal como el promotor de ARNnp U6 o promotor H1.

En aún otras realizaciones, la presente invención proporciona células hospedantes (por ejemplo, células de mamífero) que comprenden moléculas de ácidos nucleicos y constructos de expresión de la presente invención.

De manera que la invención pueda ser más fácilmente entendida, se definen primero ciertos términos.

El término "nucleósido" se refiere a una molécula que tiene una base de purina o pirimidina enlazada covalentemente a un azúcar de ribosa o desoxirribosa. Los nucleósidos ejemplares incluyen adenosina, guanosina, citidina, uridina y timidina. Los nucleósidos ejemplares adicionales incluyen inosina, 1-metilinosina, pseudouridina, 5,6-dihidrouridina, ribotimidina, 2N-metilguanosina y 22N,N-dimetilguanosina (también denominados nucleósidos "raros"). El término "nucleótido" se refiere a un nucleósido que tiene uno o más grupos fosfato unidos con enlaces de éster al resto de azúcar. Los nucleótidos ejemplares incluyen monofosfatos, difosfatos y trifosfatos de nucleósidos. Los términos "polinucleótido" y "molécula de ácido nucleico" se usan indistintamente aquí, y se refieren a un polímero de nucleótidos unidos juntos por un enlace de fosfodiéster entre los átomos de carbono 5' y 3'.

El término "ARN" o "molécula de ARN" o "molécula de ácido ribonucleico" se refiere a un polímero de ribonucleótidos. El término "ADN" o "molécula de ADN" o "molécula de ácido desoxirribonucleico" se refiere a un polímero de desoxirribonucleótidos. Los ADN y ARN se pueden sintetizar naturalmente (por ejemplo, por replicación de ADN o transcripción de ADN, respectivamente). El ARN se puede modificar postranscripcionalmente. El ADN y el ARN también se pueden sintetizar químicamente. El ADN y el ARN pueden ser monocatenarios (es decir, ARNmc y ADNmc, respectivamente) o de múltiples hebras (por ejemplo, bicatenario, es decir, ARNbc y ADNbc, respectivamente). "ARNm" o "ARN mensajero" es ARN monocatenario que especifica la secuencia de aminoácidos de una o más cadenas polipeptídicas. Esta información se traduce durante la síntesis de proteínas cuando los ribosomas se unen al ARNm.

Como se usa aquí, la expresión "ARN interferente pequeño" ("ARNip") (también denominado en la técnica, "ARN interferentes cortos") se refiere a un ARN (o análogo de ARN) que comprende entre alrededor de 10-50 nucleótidos (o análogos nucleotídicos) que es capaz de dirigir o mediar en la interferencia por ARN. Preferiblemente, un ARNip comprende entre alrededor de 15-30 nucleótidos o análogos nucleotídicos, más preferiblemente entre alrededor de 16-25 nucleótidos (o análogos nucleotídicos), incluso más preferiblemente entre alrededor de 18-23 nucleótidos (o análogos nucleotídicos), e incluso más preferiblemente entre alrededor de 19-22 nucleótidos (o análogos nuoleotídioos) (por ejemplo, 19, 20, 21<o>22 nuoleótidos<o>análogos nucleotídlcos). La expresión ARNIp "corto" se refiere a un ARNIp que comprende ~21 nuoleótidos (o análogos nuoleotídioos), por ejemplo, 19, 20, 21 o 22 nuoleótidos. La expresión ARNip "largo" se refiere a un ARNip que comprende ~24-25 nuoleótidos, por ejemplo, 23, 24, 25 o 26 nuoleótidos. Los ARNip cortos pueden incluir, en algunos casos, menos de 19 nuoleótidos, por ejemplo 16, 17 o 18 nuoleótidos, a condición de que el ARNip más corto retenga la capacidad para mediar en iARN. Asimismo, los ARNip largos pueden incluir, en algunos casos, más de 26 nuoleótidos, a condición de que el ARNip más largo retenga la capacidad para mediar en el procesamiento adicional ausente de iARN, por ejemplo procesamiento enzimático, a un ARNip corto.

La expresión "análogo nuoleotídioos" o "nucleótido alterado" o "nucleótido modificado" se refiere a un nucleótido no estándar, que incluye ribonucleótidos o desoxirribonucleótidos que no existen de forma natural. Los análogos nucleotídicos preferidos se modifican en cualquier posición para alterar ciertas propiedades químicas del nucleótido, aunque retienen la capacidad del análogo nuoleotídioos para realizar su función prevista. Los ejemplos de posiciones del nucleótido que pueden ser derivatizadas incluyen la posición 5, por ejemplo, 5-(2-amino)propiluridina, 5-bromouridina, 5-propinouridina, 5-propeniluridina, etc.; la posición 6, por ejemplo, 6-(2-amino)propiluridina; la posición 8 para adenosina y/o guanosinas, por ejemplo, 8-bromoguanosina, 8-cloroguanosina, 8-fluoroguanosina, etc. Los análogos nuoleotídioos también incluyen deaza nuoleótidos, por ejemplo 7-deaza-adenosina; nuoleótidos modificados en O y N (por ejemplo, alquilados, por ejemplo N6-metiladenosina, o como se conoce de otro modo en la técnica); y otros análogos nuoleotídioos heterocíclicamente modificados, tales como los descritos en Herdewijn, Antisense Nucleic Acid Drug Dev., agosto 2000, 10(4) :297-310.

Los análogos nuoleotídioos también pueden comprender modificaciones en la porción de azúcar de los nuoleótidos. Por ejemplo, el grupo 2' OH se puede sustituir por un grupo seleccionado de H, OR, R, F, Cl, Br, I, SH, SR, NH<2>, NHR, NR<2>, COOR, u OR, en el que R es alquilo de C<1>-C<6>sustituido o sin sustituir, alquenilo, alquinilo, arilo, etc. Otras posibles modificaciones incluyen las descritas en las patentes de EE. UU. núms. 5.858.988, y 6.291.438.

El grupo fosfato del nucleótido también se puede modificar, por ejemplo sustituyendo uno o más de los oxígenos del grupo fosfato por azufre (por ejemplo, fosforotioatos), o haciendo otras sustituciones que permitan al nucleótido realizar su función prevista, como se describe en, por ejemplo, Eckstein, Antisense Nucleic Acid Drug Dev. 2000 Abr.

10(2): 117-21, Rusckowski et al. Antisense Nucleic Acid Drug Dev. 2000 Oot. 10(5):333-45, Stein, Antisense Nucleic Acid Drug Dev. 2001 Oot. 11(5): 317-25, Vorobjev et al. Antisense Nucleic Acid Drug Dev. 2001 Abr. 11 (2):77-85, y la patente de EE. UU. núm. 5.684.143. Algunas de las modificaciones anteriormente referenciadas (por ejemplo, modificaciones de grupo fosfato) disminuyen preferiblemente la tasa de hidrólisis de, por ejemplo, polinucleótidos que comprenden dichos análogos in vivo o in vitro.

El término "oligonucleótido" se refiere a un polímero corto de nuoleótidos y/o análogos nuoleotídioos. La expresión "análogo de ARN" se refiere a un polinucleótido (por ejemplo, un polinucleótido químicamente sintetizado) que tiene al menos un nucleótido alterado o modificado en comparación con un ARN correspondiente sin alterar o sin modificar, pero que retiene la misma o similar naturaleza o función que el ARN sin alterar o sin modificar correspondiente. Como se explica anteriormente, los oligonucleótidos se pueden unir con enlaces que dan como resultado una tasa de hidrólisis más baja del análogo de ARN en comparación con una molécula de ARN con enlaces de fosfodiéster. Por ejemplo, los nuoleótidos del análogo pueden comprender enlaces metilenodiol, etilenodiol, oximetiltio, oxietiltio, oxicarboniloxi, fosforodiamidato, fosforoamidato, y/o fosforotioato. Los análogos de ARN preferidos incluyen ribonucleótidos y/o desoxirribonucleótidos modificados en el azúcar y/o en la cadena principal. Dichas alteraciones o modificaciones pueden incluir además la adición de material no nucleotídico, tal como al o a los extremos del ARN o internamente (en uno o más nucleótidos del ARN). Un análogo de ARN solo necesita ser suficientemente similar al ARN natural que tiene la capacidad para mediar (media) en la interferencia por ARN.

Como se usa aquí, la expresión "interferencia por ARN" ("iARN") se refiere a una degradación intracelular selectiva de ARN. La iARN ocurre en las células naturalmente para retirar ARN extraños (por ejemplo, ARN virales). La iARN natural transcurre a través de fragmentos escindidos del ARNbc libre que dirigen el mecanismo degradativo a otras secuencias de ARN similares. Alternativamente, la iARN se puede iniciar por la mano del hombre, por ejemplo para silenciar la expresión de genes diana.

Un agente de iARN que tiene una hebra que tiene "secuencia suficientemente complementaria a una secuencia de ARNm diana para dirigir la interferencia por ARN (iARN) específica de la diana" significa que la hebra tiene una secuencia suficiente para desencadenar la destrucción del ARNm diana por la maquinaria o proceso de iARN.

Como se usa aquí, el término "ARN aislado" (por ejemplo, "ARNip aislado" o "precursor de ARNip aislado") se refiere a moléculas de ARN que están sustancialmente libres de otro material celular, o medio de cultivo cuando se producen por técnicas recombinantes, o sustancialmente libres de precursores químicos u otros productos químicos cuando se sintetizan químicamente.

La expresión "in vitro" tiene su significado reconocido en la técnica, por ejemplo, que implica reactivos o extractos purificados, por ejemplo extractos celulares. La expresión "in vivo" también tiene su significado reconocido en la técnica, por ejemplo, que implica células vivas, por ejemplo, células inmortalizadas, células primarias, líneas celulares, y/o células en un organismo.

Como se usa aquí, el término "transgén" se refiere a cualquier molécula de ácido nucleico que se inserta por artificio en una célula, y llega a ser parte del genoma del organismo que se desarrolla de la célula, Dicho transgén puede incluir un gen que es parcial o completamente heterólogo (es decir, extraño) al organismo transgénico, o puede representar un gen homólogo a un gen endógeno del organismo, El término "transgén" también significa una molécula de ácido nucleico que incluye una o más secuencias de ácidos nucleicos seleccionadas, por ejemplo ADN, que codifica uno o más precursores de ARN manipulados por ingeniería, a expresar en un organismo transgénico, por ejemplo, animal, que es parcialmente o completamente heteróloga, es decir, extraña, al animal transgénico, u homóloga a un gen endógeno del animal transgénico, pero que se diseña para insertarla en el genoma del animal en una localización que se diferencia de la del gen natural, Un transgén incluye uno o más promotores y cualquier otro ADN, tales como intrones, necesarios para la expresión de la secuencia de ácido nucleico seleccionada, todos operativamente unidos a la secuencia seleccionada, y puede incluir una secuencia potenciadora,

Un gen "implicado" en una enfermedad o trastorno incluye un gen, cuya expresión o función normal o aberrante afecta o provoca la enfermedad o trastorno, o al menos un síntoma de dicha enfermedad o trastorno

La expresión "mutación de ganancia de función", como se usa aquí, se refiere a cualquier mutación en un gen en la que la proteína codificada por dicho gen (es decir, la proteína mutante) adquiere una función no asociada normalmente a la proteína (es decir, la proteína natural) que provoca o contribuye a una enfermedad o trastorno, La mutación de ganancia de función puede ser una deleción, adición o sustitución de un nucleótido o nucleótidos en el gen, que da lugar al cambio en la función de la proteína codificada, En una realización, la mutación de ganancia de función cambia la función de la proteína mutante o provoca interacciones con otras proteínas, En otra realización, la mutación de ganancia de función provoca una disminución o eliminación de la proteína de tipo salvaje normal, por ejemplo por interacción de la proteína mutante alterada con dicha proteína de tipo salvaje normal,

El término "polimorfismo", como se usa aquí, se refiere a una variación (por ejemplo, una deleción, inserción o sustitución) en una secuencia génica que se identifica o detecta cuando se compara la misma secuencia génica de sujetos de fuentes diferentes (pero del mismo organismo), Por ejemplo, se puede identificar un polimorfismo cuando se compara la misma secuencia génica de diferentes sujetos (pero del mismo organismo), La identificación de dichos polimorfismos es rutinaria en la técnica, siendo las metodologías similares a las usadas para detectar, por ejemplo, mutaciones puntuales de cáncer de mama, La identificación se puede hacer, por ejemplo, de ADN extraído de linfocitos del sujeto, seguido de amplificación de regiones polimórficas usando cebadores específicos para dicha región polimórfica, Alternativamente, el polimorfismo se puede identificar cuando se comparan dos alelos del mismo gen, Una variación en secuencia entre dos alelos del mismo gen dentro de un organismo se denomina aquí un "polimorfismo alélico", El polimorfismo puede ser un nucleótido dentro de una región codificante, pero, debido a la degeneración del código genético, no codifica cambio en la secuencia de aminoácidos, Alternativamente, las secuencias polimórficas pueden codificar un aminoácido diferente en una posición particular, pero el cambio en el aminoácido no afecta la función de la proteína, También se pueden encontrar regiones polimórficas en regiones no codificantes del gen,

La expresión "dominio de poliglutamina", como se usa aquí, se refiere a un segmento o dominio de una proteína que consiste en restos consecutivos de glutamina unidos por enlaces peptídicos, En una realización, la región consecutiva incluye al menos 5 restos de glutamina,

La expresión "dominio ampliado de poliglutamina" o "segmento ampliado de poliglutamina", como se usa aquí, se refiere a un segmento o dominio de una proteína que incluye al menos 35 restos consecutivos de glutamina unidos por enlaces peptídicos, Dichos segmentos ampliados se encuentran en sujetos afectados por un trastorno por poliglutamina, como se describe aquí, tanto si se ha mostrado como si no que el sujeto manifiesta síntomas,

La expresión "repetición de trinucleótidos" o "región de repetición de trinucleótidos", como se usa aquí, se refiere a un segmento de una secuencia de ácido nucleico, por ejemplo, que consiste en repeticiones consecutivas de una secuencia trinucleotídica particular, En una realización, la repetición de trinucleótidos incluye al menos 5 secuencias de trinucleótidos consecutivas, Las secuencias de trinucleótidos ejemplares incluyen, pero no se limitan a, CAG, CGG, GCC, GAA, CTG, y/o CGG,

La expresión "enfermedades de repetición de trinucleótidos", como se usa aquí, se refiere a cualquier enfermedad o trastorno caracterizado por una región ampliada de repeticiones de trinucleótidos localizada dentro de un gen, siendo la región ampliada de repeticiones de trinucleótidos la causante de la enfermedad o trastorno, Los ejemplos de enfermedades de repetición de trinucleótidos incluyen, pero no se limitan a, ataxia espinocerebelosa de tipo 12, ataxia espinocerebelosa de tipo 8, síndrome del cromosoma X frágil, retraso mental del cromosoma XE frágil, ataxia de Friedreich, y distrofia miotónica, Las enfermedades de repetición de trinucleótidos preferidas para el tratamiento que no son parte de la invención son las caracterizadas o provocadas por una región ampliada de repeticiones de trinucleótidos en el extremo 5' de la región codificante de un gen, el gen que codifica una proteína mutante que provoca o es causante de la enfermedad o trastorno, Ciertas enfermedades de trinucleótidos, por ejemplo síndrome del cromosoma X frágil, en las que la mutación no está asociada a una región codificante, pueden no ser adecuadas para el tratamiento según las metodologías de la presente Invención, ya que no hay ARNm adecuado para ser silenciado por IARN. Por el contrario, la enfermedad tal como ataxia de Friedreich puede ser adecuada para el tratamiento según las metodologías de la invención debido a que, aunque la mutación causante no está dentro de una región codificante (es decir, se encuentra dentro de un intrón), la mutación puede estar dentro de, por ejemplo, un precursor de ARNm (por ejemplo, un precursor de ARNm previamente ayustado).

La expresión "trastorno por poliglutamina", como se usa aquí, se refiere a cualquier enfermedad o trastorno caracterizado por una expansión de repeticiones de (CAG)n en el extremo 5' de la región codificante (codificando así una región ampliada de poliglutamina en la proteína codificada). En una realización, los trastornos por poliglutamina se caracterizan por una degeneración progresiva de las células nerviosas. Ejemplos de trastornos por poliglutamina incluyen, pero no se limitan a: enfermedad de Huntington, ataxia espinocerebelosa de tipo 1, ataxia espinocerebelosa de tipo 2, ataxia espinocerebelosa de tipo 3 (también conocida como enfermedad de Machado-Joseph), y ataxia espinocerebelosa de tipo 6, ataxia espinocerebelosa de tipo 7, y atrofia dentato-rubro-pálido-luisiana.

La expresión "examinar la función de un gen en una célula u organismo" se refiere a examinar o estudiar la expresión, actividad, función o fenotipo que surge del mismo.

Diversas metodologías incluyen la etapa que implica comparar un valor, nivel, rasgo, característica, propiedad, etc., con un "control adecuado", denominado indistintamente aquí como "control apropiado". Un "control adecuado" o "control apropiado" es cualquier control o patrón conocido por un experto habitual en la técnica, útil para fines de comparación. Un "control adecuado" o "control apropiado" es un valor, nivel, rasgo, característica, propiedad, etc., determinado antes de la realización de una metodología de iARN, como se describe aquí. Por ejemplo, se pueden determinar una tasa de transcripción, nivel de ARNm, tasa de traducción, nivel de proteína, actividad biológica, característica o propiedad celular, genotipo, fenotipo, etc., antes de introducir un agente de iARN de la invención en una célula u organismo.

Un "control adecuado" o "control apropiado" es un valor, nivel, rasgo, característica, propiedad, etc., determinado en una célula u organismo, por ejemplo un control o célula normal u organismo, que presenta, por ejemplo, rasgos normales.

Un "control adecuado" o "control apropiado" es un valor, nivel, rasgo, característica, propiedad, etc. predefinidos.

Diversos aspectos de la invención se describen con más detalle en las siguientes subsecciones.

I. Trastornos por poliglutamina

Los trastornos por poliglutamina son una clase de enfermedad o trastornos caracterizados por una mutación genética común. En particular, la enfermedad o los trastornos se caracterizan por una repetición ampliada del trinucleótido CAG que da lugar, en la proteína codificada, a un tramo ampliado de restos de glutamina. Los trastornos por poliglutamina son similares por cuanto las enfermedades se caracterizan por una degeneración progresiva de células nerviosas. A pesar de sus similitudes, los trastornos por poliglutamina ocurren en diferentes cromosomas, y de este modo ocurren en segmentos de ADN completamente diferentes. Los ejemplos de trastornos por poliglutamina incluyen enfermedad de Huntington, atrofia dentato-rubro-pálido-luisiana, atrofia muscular espinobulbar, ataxia espinocerebelosa de tipo 1, ataxia espinocerebelosa de tipo 2, ataxia espinocerebelosa de tipo 3, ataxia espinocerebelosa de tipo 6, y ataxia espinocerebelosa de tipo 7 (Tabla 3).

L<os>trastornos por poliglutamina se pueden caracterizar, por ejemplo, por dominios que tienen entre alrededor de 30 a 35 restos de glutamina, entre alrededor de 35 a 40 restos de glutamina, entre alrededor de 40 a 45 restos de glutamina, y que tienen alrededor de 45<o>más restos de glutamina. El dominio de poliglutamina contiene normalmente restos de glutamina consecutivos (Q n>36).

II. Enfermedad de Huntington

La enfermedad de Huntington, heredada como una enfermedad dominante autosómica, provoca enfermedad con alteración de la cognición y motora. L<os>pacientes pueden vivir más de una década con intenso debilitamiento, antes de la muerte prematura por inanición<o>infección. La enfermedad empieza en la cuarta<o>quinta década en la mayoría de los casos, pero un subconjunto de pacientes manifiesta la enfermedad en la adolescencia. La mutación genética para la enfermedad de Huntington es una repetición de CAG ampliada en el gen huntingtina. La repetición de CAG varía en número desde 8 hasta 35 en individuos normales (Kremer et al., 1994). La mutación genética, por ejemplo un aumento en la longitud de las repeticiones de CAG desde normal inferior a 36 en el gen huntingtina hasta más de 36 en la enfermedad, está asociada con la síntesis de una proteína huntingtina mutante, que tiene más de 36 poliglutamatos (Aronin et al., 1995). En general, los individuos con 36<o>más repeticiones de CAG tendrán enfermedad de Huntington. Prototípica de nada menos que otras veinte enfermedades con una CAG ampliada como mutación subyacente, la enfermedad de Huntington todavía no tiene terapia eficaz. Se han mostrado prometedoras una variedad de intervenciones - tales como interrupción de las rutas apoptóticas, adición de reactivos para reforzar la eficiencia de las mitocondrias, y bloqueo de receptores de NMDA - en cultivos celulares y modelo de ratón de enfermedad de Huntington. Sin embargo, en el mejor de los casos, estos enfoques revelan una prolongación corta de la supervivencia celular<o>animal.

La enfermedad de Huntington obedece el dogma principal de la genética: un gen mutante sirve de molde para la producción de un ARNm mutante; el ARNm mutante dirige entonces la síntesis de una proteína mutante (Aronin et al., 1995; DiFiglia et al., 1997). La huntingtina mutante (proteína) se acumula probablemente en neuronas selectivas en el cuerpo estriado y la corteza, altera actividades celulares determinadas hasta ahora, y provoca disfunción neuronal y muerte (Aronin et al., 1999; Laforet et al., 2001). Debido a que una única copia de un gen mutante es suficiente para provocar la enfermedad de Huntington, el tratamiento más parco sería volver ineficaz el gen mutante. L<os>enfoques teóricos podrían incluir detener la transcripción génica de la huntingtina mutante, destruir el ARNm mutante, y bloquear la traducción. Cada uno tiene el mismo resultado -- pérdida de huntingtina mutante.

III. Gen huntingtina

El gen de enfermedad ligado a la enfermedad de Huntington se llama Huntington<o>(htt). El locus de huntingtina es grande, abarcando 180 kb, y consistiendo en 67 exones. El gen huntingtina se expresa ampliamente, y es necesario para el desarrollo normal. Se expresa como 2 formas alternativamente poliadeniladas que presentan diferente abundancia relativa en diversos tejidos fetales y adultos. El transcrito más grande tiene aproximadamente 13,7 kb, y se expresa predominantemente en el cerebro adulto y fetal, mientras que el transcrito más pequeño de aproximadamente 10,3 kb se expresa más ampliamente. L<os>dos transcritos se diferencian con respecto a sus regiones no traducidas 3' (Lin et al., 1993). Se predice que ambos mensajeros codifican una proteína de 348 kilodálton que contiene 3144 aminoácidos. Se cree que el defecto genético que conduce a la enfermedad de Huntington confiere una nueva propiedad al ARNm,<o>altera la función de la proteína. En la Figura 2 (SEQ ID NO: 2) se expone una secuencia de aminoácidos del gen huntingtina humano.

En la Figura 1 (SEQ ID NO: 1) se expone una secuencia nucleotídica consenso del gen huntingtina humano (ADNc). La región codificante consiste en los nucleótidos 316 a 9750 de SEQ ID NO: 1. Las dos señales de poliadenilación alternativas se encuentran en los nucleótidos 10326 a 10331 y los nucleótidos 13644 a 13649, respectivamente. L<os>dos sitios de poliadenilación correspondientes se encuentran en los nucleótidos 10348 y 13672, respectivamente. La primera señal/sitio de poliadenilación es la del transcrito de 10,3 kb. La segunda señal/sitio de poliadenilación es la del transcrito de 13,7 kb, el transcrito predominante en el cerebro.

Se identificaron cinco (5) polimorfismos en el gen htt humano como se describe en el Ejemplo I. Se han identificado 38 polimorfismos adicionales en la secuencia del gen huntingtina mediante análisis de SNP (polimorfismo de un solo nuoleótido} (véase la Tabla 3). L<os>polimorfismos expuestos en las Tablas 2 y 3 representan sitios preferidos para silenciar mediante iARN específica de un solo nuoleótido, oomo se desoribe aquí.

Tabla 2.Sitios polimórficos P en el en htt de líneas celulares humanas.

Tabla 3.Sitios polimórficos P en el en htt humano identificado mediante análisis de SNP.

La presente invención se dirige contra huntingtina mutante usando interferencia por ARN (Hutvagner et al,, 2002). Una hebra de ARN bicatenario (ARNip) complementa una región polimórfica dentro del ARNm de huntingtina mutante. Después de la introducción de ARNip en neuronas, el ARNip se desenrolla parcialmente, se une a una región polimórfica dentro del ARNm de huntingtina de una manera específica del sitio, y activa una ARNm nucleasa. Esta nucleasa escinde el ARNm de huntingtina, deteniendo así la traducción de la huntingtina mutante. Las células se libran ellas mismas del ARNm parcialmente digerido, impidiendo así la traducción, o las células digieren proteínas parcialmente traducidas. Las neuronas sobreviven sobre la huntingtina no mutante (del alelo normal); este enfoque previene los estragos de huntingtina mutante eliminando su producción.

IV. Diseño de ARNip

Se diseñan ARNip del siguiente modo. Primero, se selecciona una porción del gen diana (por ejemplo, el gen htt) que incluye el polimorfismo. Los polimorfismos ejemplares se seleccionan de la región no traducida 5' de un gen diana. La escisión de ARNm en estos sitios debe eliminar la traducción de proteína mutante correspondiente. Los polimorfismos de otras regiones del gen mutante también son adecuados para su selección como dianas. Se diseña una hebra codificante basándose en la secuencia de la porción seleccionada. Preferiblemente, la porción (y la hebra codificante correspondiente) incluye alrededor de 19 a 25 nucleótidos, por ejemplo 19, 20, 21, 22, 23, 24 o 25 nucleótidos. Más preferiblemente, la porción (y hebra codificante correspondiente) incluye 21,22 o 23 nucleótidos. El experto apreciará, sin embargo, que los ARNip que tienen una longitud menor que 19 nucleótidos o mayor que 25 nucleótidos también pueden funcionar para mediar en la iARN.

Se ha demostrado que los agentes de iARN más largos provocan una respuesta de interferón o de PKR en ciertas células de mamíferos, que puede ser indeseable. Preferiblemente, los agentes de iARN de la invención no provocan una respuesta de PKR (es decir, son de una longitud suficientemente corta). Sin embargo, agentes de iARN más largos pueden ser útiles, por ejemplo, en tipos celulares incapaces de generar una respuesta de PKR o en situaciones en las que la respuesta de PKR se ha reducido o apagado por medios alternativos.

La secuencia de la hebra codificante se diseña de forma que el polimorfismo esté esencialmente en el centro de la hebra. Por ejemplo, si se escoge un ARNip de 21 nucleótidos, el polimorfismo está, por ejemplo, en el nucleótido 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 o 16 (es decir, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 o 16 nucleótidos desde el extremo 5' de la hebra codificante. Para un ARNip de 22 nucleótidos, el polimorfismo está, por ejemplo, en el nucleótido 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 o 16. Para un ARNip de 23 nucleótidos, el polimorfismo está, por ejemplo, en 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 o 16. Para un ARNip de 24 nucleótidos, el polimorfismo está, por ejemplo, en 9, 10, 11, 12, 13, 14 o 16. Para un ARNip de 25 nucleótidos, el polimorfismo está, por ejemplo, en 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 o 17. El mover el polimorfismo hacia una posición descentrada puede reducir, en algunos casos, la eficiencia de escisión por el ARNip. Tales composiciones, es decir, composiciones menos eficientes, pueden ser deseables para su uso si se detecta el silenciamiento del ARNm de tipo salvaje.

La hebra no codificante es rutinariamente de la misma longitud que la hebra codificante, e incluye nucleótidos complementarios. En una realización, las hebras son completamente complementarias, es decir, las hebras son de extremos romos cuando se alinean o hibridan. En otra realización, las hebras comprenden alinear o hibridar de manera que se generen nucleótidos protuberantes de 1, 2 o 3 nucleótidos, es decir, el extremo 3' de la hebra codificante se extiende 1, 2 o 3 nucleótidos más que el extremo 5' de la hebra no codificante, y/o el extremo 3' de la hebra no codificante se extiende 1, 2 o 3 nucleótidos más que el extremo 5' de la hebra codificante. Las protuberancias pueden comprender (o consistir en) nucleótidos correspondientes a la secuencia del gen diana (o complemento de la misma). Alternativamente, las protuberancias pueden comprender (o consistir en) desoxirribonucleótidos, por ejemplo dTs, o análogos nucleotídicos, u otro material no nucleotídico adecuado.

Para facilitar la entrada de la hebra no codificante en RISC (y así aumentar o mejorar la eficiencia de la escisión y el silenciamiento dianas), se puede alterar la fortaleza del par de bases entre el extremo 5' de la hebra codificante y el extremo 3' de la hebra no codificante, por ejemplo se puede disminuir o reducir, como se describe en detalle en las solicitudes de patente provisionales de EE. UU. núms. 60/475.386, titulada "Methods and Compositions for Controlling Efficacy of RNA Silencing" (presentada el 2 de junio de 2003), y 60/475.331, titulada "Methods and Compositions for Enhancing the Efficacy and Specificity of RNAi" (presentada el 2 de junio de 2003).

En una realización de estos aspectos de la invención, la fortaleza del par de bases es menor debido a un menor número de pares de bases G:C entre el extremo 5' de la primera hebra o no codificante y el extremo 3' de la segunda hebra<o>codificante que entre el extremo 3' de la primera hebra<o>no codificante y el extremo 5' de la segunda hebra<o>codificante. En otra realización, la fortaleza del par de bases es menor debido a al menos un par de bases mal apareado entre el extremo 5' de la primera hebra<o>no codificante y el extremo 3' de la segunda hebra<o>codificante. Preferiblemente, el par de bases mal apareado se selecciona del grupo que consiste en G:A, C:A, C:U, G:G, A:A, C:C y U:U. En otra realización, la fortaleza del par de bases es menor debido a al menos un par de bases de titubeo, por ejemplo, G:U, entre el extremo 5' de la primera hebra<o>no codificante y el extremo 3' de la segunda hebra<o>codificante. En otra realización, la fortaleza del par de bases es menor debido a al menos un par de bases que comprende un nucleótido raro, por ejemplo inosina (I). Preferiblemente, el par de bases se selecciona del grupo que consiste en l:A, I:U y I:C. En otra realización más, la fortaleza del par de bases es menor debido a al menos un par de bases que comprende un nucleótido modificado. En realizaciones preferidas, el nucleótido modificado se selecciona del grupo que consiste en 2-amino-G, 2-amino-A, 2,6-diamino-G, y 2,6-diamino-A.

A continuación se describe con detalle el diseño de los ARNip adecuados para dirigirlos contra los polimorfismos de htt expuestos en la Tabla 2

ADN de P1TGTGCTGACTCTGAGGAACAG(SEQ ID NO:5)

codificante UGUGCUGACUCUGAGGAACAG (SEQ ID NO:6)

no ACACGACUGAGACUCCUUGUC (extremos romos, 21- (SEQ ID NO:7) codificante mero)

(2 nucleótidos protuberantes) véase la Figura 5

ADN de P2 CATACCTCAAACTGCATGATG (SEQ ID NO:8)

codificante CAUACCUCAAACUGCAUGAUG (SEQ ID NO:9)

no GUAUGGAGUUUGACGUACUAC (extremos romos, 21- (SEQ ID NO:10) codificante mero)

ADN de P3 GCCTGCAGAGCCGGCGGCCTA (SEQ ID NO:11)

codificante GCCUGCAGAGCCGGCGGCCUA (SEQ ID NO:12)

no CGGACGUCUCGGCCGCCGGAU (extremos romos, 21- (SEQ ID NO:13) codificante mero)

ADN de P4 ACAGAGTTTGTGACCCACGCC (SEQ ID NO:14)

codificante ACAGAGUUUGUGACCCACGCC (SEQ ID NO:15)

no UGUCUCAAACACUGGGUGCGG (extremos romos, 21- (SEQ ID NO:16) codificante mero)

ADN de P5 TCCCTCATCTACTGTGTGCAC (SEQ ID NO:17)

codificante UCCCUCAUCUACUGUGUGCAC (SEQ ID NO:18)

no AGGGAGUAGAUGACACACGUG (extremos romos, 21- (SEQ ID NO:19) codificante mero)

Se pueden diseñar ARNip según las enseñanzas ejemplares anteriores para cualesquiera otros polimorfismos encontrados en el gen htt. Además, la tecnología es aplicable para silenciar cualquier otro gen de enfermedad que tenga asociados polimorfismos, es decir, polimorfismos que no causan enfermedad.

Para validar la eficacia por la que los ARNip destruyen ARNm mutantes (por ejemplo, ARNm de huntingtina mutante), el ARNip se incuba con ADNc mutante (por ejemplo, ADNc de huntingtina mutante) en un sistema de expresión de ARNmin vitrobasado enDrosophila.Radiomarcados con 32P, los ARNm mutantes recién sintetizados (por ejemplo, ARNm de huntingtina mutante) se detectan autorradiográficamente sobre un gel de agarosa. La presencia de ARNm mutante escindido indica actividad de ARNm nucleasa. Los controles adecuados incluyen la omisión de ARNip y el uso de ADNc de huntingtina no mutante. Alternativamente, se seleccionan ARNip de control que tienen la misma composición de nucleótidos que el ARNip seleccionado, pero sin complementariedad de secuencias significativa con el gen diana apropiado. Tales controles negativos se pueden diseñar reordenando aleatoriamente la secuencia nucleotídica del ARNip seleccionado; se puede realizar una búsqueda de homología para garantizar que el control negativo carezca de homología con cualquier otro gen en el genoma apropiado. Además, se pueden diseñar ARNip de control negativo introduciendo uno<o>más mal apareamientos de bases en la secuencia.

Se seleccionan sitios de complementación ARNip-ARNm que dan como resultado la especificidad óptima de ARNm y la máxima escisión de ARNm.

Mientras que la presente invención caracteriza el silenciamiento de regiones polimórficas en el gen htt mutante diana distintas de la mutación de la región ampliada de CAG, el experto apreciará que silenciar la región mutante puede tener aplicabilidad como estrategia terapéutica en ciertas situaciones. El silenciamiento de la región mutante se puede llevar a cabo usando ARNip, que complementa CAG en serie. El ARNipcag se uniría a ARNm con complementación de CAG, pero cabría esperar que tuviese mayor oportunidad de unirse a una serie ampliada de CAG. Múltiples ARNipcag se unirían al ARNm de huntingtina mutante (a diferencia de menos para el ARNm de huntingtina no mutante); así, es más probable que se escinda el ARNm de huntingtina mutante. La inactivación con éxito de ARNm usando este enfoque también eliminaría ARNm de huntingtina normal o de tipo salvaje. También inactivados, al menos de algún modo, podrían estar otros genes normales (aproximadamente 70) que también tienen repeticiones de CAG, en los que sus ARNm podrían interaccionar con el ARNip. Este enfoque se basaría así en una de estrategia de desgaste -- se destruiría más del ARNm de huntingtina mutante que del ARNm de huntingtina de tipo salvaje o los otros aproximadamente 69 ARNm que codifican poliglutaminas.

V. Agentes de iARN

La presente invención incluye moléculas de ARNip diseñadas, por ejemplo, como se describe anteriormente. Las moléculas de ARNip se pueden sintetizar químicamente, o se pueden transcribirin vitroa partir de un molde de ADN, oin vivode, por ejemplo, ARNhp, o, usando la enzima DICER humana recombinante, para escindirin vitromoldes de ARNbc transcritos en conjuntos de ARN dúplex de 20, 21 o 23 pb que median en la iARN. Las moléculas de ARNip se pueden diseñar usando cualquier método conocido en la técnica.

En un aspecto, en lugar de que el agente de iARN sea un ácido ribonucleico interferente, por ejemplo un ARNip o ARNhp como se describe anteriormente, el agente de iARN puede codificar un ácido ribonucleico interferente, por ejemplo un ARNhp, como se describe anteriormente. En otras palabras, el agente de iARN puede ser un molde transcripcional del ácido ribonucleico interferente. Así, los agentes de iARN de la presente invención también pueden incluir ARN de horquilla pequeña (ARNhp), y constructos de expresión manipulados para expresar los ARNhp. La transcripción de los ARNhp se inicia en un promotor de la polimerasa III (pol III), y se cree que termina en la posición 2 de un sitio de terminación de la transcripción de 4-5-timina. Tras la expresión, se cree que los ARNhp se pliegan en una estructura de tallo-bucle con protuberancias UU de 3'; posteriormente, los extremos de estos ARNhp se procesan, convirtiendo los ARNhp en moléculas de tipo ARNip de alrededor de 21-23 nucleótidos (Brummelkamp et al., 2002; Lee et al., 2002.más arriba;Miyagishi et al., 2002; Paddison et al., 2002,más arriba;Paul et al., 2002,más arriba;Sui et al., 2002más arriba;Yu et al., 2002,más arriba.Se puede encontrar en internet más información sobre el diseño y uso de ARNhp en las siguientes direcciones: katahdin.cshl.org:9331/RNAi/docs/BseRI-BamHI_Strategy.pdf and katahdin.cshl.org:9331/RNAi/docs/Web_version_of_PCR_strategy1 .pdf.

Las constructos de expresión de la presente invención incluyen cualquier constructo adecuado para uso en el sistema de expresión apropiado, e incluyen, pero no se limitan a, vectores retrovirales, casetes de expresión lineales, plásmidos, y vectores virales o derivados de virus, como se conoce en la técnica. Tales constructos de expresión pueden incluir uno o más promotores inducibles, sistemas de promotores de ARN Pol III tales como los promotores de ARNnp U6 o promotores de la ARN polimerasa III H1, u otros promotores conocidos en la técnica. Los constructos pueden incluir una o ambas hebras del ARNip. Los constructos de expresión que expresan ambas hebras también pueden incluir estructuras de bucle que unen ambas hebras, o cada hebra se puede transcribir por separado de promotores separados dentro del mismo constructo. Cada hebra también se puede transcribir a partir de un constructo de expresión distinto. (Tuschl, T., 2002,más arriba).

Se pueden administrar ARNip sintéticos en células por métodos conocidos en la técnica, que incluyen transfección con liposomas catiónicos y electroporación. Sin embargo, estos ARNip exógenos muestran, en general, persistencia a corto plazo del efecto de silenciamiento (4~5 días en células cultivadas), lo que puede ser beneficioso en sólo ciertas realizaciones. Para obtener la supresión a largo plazo de los genes diana (es decir, genes mutantes) y para facilitar la administración en ciertas circunstancias, se pueden expresar uno o más ARNip dentro de células a partir de constructos de ADN recombinante. Se conocen en la técnica tales métodos para expresar dúplex de ARNip dentro de células a partir de constructos de ADN recombinante para permitir la supresión de genes diana a largo plazo en células, que incluyen sistemas de promotores Pol III de mamífero (por ejemplo, sistemas de promotores H1 o U6/ARNnp (Tuschl, T., 2002,más arriba)capaces de expresar ARNip bicatenarios funcionales; (Bagella et al., 1998; Lee et al., 2002,más arriba;Miyagishi et al., 2002,más arriba;Paul et al., 2002,más arriba;Yu et al., 2002),más arriba;Sui et al., 2002,más arriba).La terminación transcripcional por ARN Pol III ocurre en series de cuatro restos T consecutivos en el molde de ADN, que proporciona un mecanismo para terminar el transcrito de ARNip en una secuencia específica. El ARNip es complementario a la secuencia del gen diana en las orientaciones 5'-3' y 3'-5', y las dos hebras del ARNip se pueden expresar en el mismo constructo o en constructos distintos. Los ARNip de horquilla, conducidos por el promotor HI o ARNnp U6 y expresados en células, pueden inhibir la expresión de genes diana (Bagella et al., 1998; Lee et al., 2002,más arriba;Miyagishi et al., 2002,más arriba;Paul et al., 2002,más arriba;Yu et al., 2002),más arriba;Sui et al., 2002,más arriba).Los constructos que contienen secuencia de ARNip bajo el control del promotor T7 también hacen funcional los ARNip cuando se cotransfectan en las células con un vector que expresa ARN polimerasa T7 (Jacque et al., 2002,más arriba).Un único constructo puede contener múltiples secuencias que codifican los ARNip, tales como múltiples regiones del gen que codifica htt mutante, que silencia el mismo gen o múltiples genes, y se puede accionar, por ejemplo, por sitios de promotor Pol III distintos.

Las células de animales expresan una variedad de ARN no codificantes de aproximadamente 22 nucleótidos denominados microARN (miARN), que pueden regular la expresión génica al nivel postranscripcional o traduccional durante el desarrollo animal. Una característica común de los miARN es que todos se escinden de un tallo-bucle de ARN precursor de aproximadamente 70 nueleótidos, probablemente por Dicer, una enzima de tipo RNasa III,<o>un homólogo de la misma. Sustituyendo las secuencias de tallo del precursor de miARN por una secuencia complementaria al ARNm diana, se puede usar un constructo vector que expresa el precursor manipulado por ingeniería para producir los ARNip para iniciar la iARN contra dianas de ARNm específicas en células de mamífero (Zeng et al., 2002,más arriba).Cuando se expresa por vectores de ADN que contienen promotores de polimerasa III, las horquillas diseñadas como micro-ARN pueden silenciar la expresión génica (McManus et al., 2002,más arriba).Los micro-ARN dirigidos contra polimorfismos también pueden ser útiles para bloquear la traducción de proteínas mutantes, en ausencia de silenciamiento génico mediado por ARNip. Tales aplicaciones pueden ser útiles en situaciones, por ejemplo, en las que un ARNip diseñado causó el silenciamiento fuera de la diana de la proteína de tipo salvaje.

También se pueden usar mecanismos de administración mediados por virus para inducir el silenciamiento específico de genes diana mediante la expresión de ARNip, por ejemplo generando adenovirus recombinantes que alojan ARNip bajo el control de la transcripción del promotor de ARN Pol II (Xia et al., 2002,más arriba).La infección de células HeLa por estos adenovirus recombinantes permite la expresión disminuida de genes diana endógenos. La inyección de los vectores de adenovirus recombinante en ratones transgénicos que expresan los genes diana del ARNip da como resultado la reducciónin vivode la expresión del gen diana.Ídem.En un modelo animal, la electroporación de embrión completo puede suministrar eficientemente ARNip sintético en embriones de ratón después de la implantación (Calegari et al., 2002). En ratones adultos, la administración eficiente de ARNip se puede llevar a cabo por la técnica de administración de "alta presión", una inyección rápida (en 5 segundos) de un gran volumen de ARNip que contiene disolución en el animal a través de la vena de la cola (Liu et al., 1999,más arriba; McCaffrey et al., 2002,más arriba; Lewis et al., 2002). También se pueden usar nanopartículas y liposomas para administrar ARNip en animales.

Las composiciones de ácido nucleico de la invención incluyen tanto ARNip sin modificar como ARNip modificados, como se conoce en la técnica, tales como derivados de ARNip reticulados o derivados que tienen restos no nucleotídicos unidos, por ejemplo, a sus extremos 3' o 5'. La modificación de derivados de ARNip de esta forma puede mejorar la captación celular o potenciar las actividades de silenciamiento celular del derivado de ARNip resultante en comparación con el ARNip correspondiente, son útiles para rastrear el derivado de ARNip en la célula, o mejorar la estabilidad del derivado de ARNip en comparación con el ARNip correspondiente.

Los precursores de ARN manipulados por ingeniería, introducidos en células u organismos completos como se describe aquí, conducirán a la producción de una molécula de ARNip deseada. Dicha molécula de ARNip se asociará entonces con componentes proteicos endógenos de la ruta de iARN para unirse a y silenciar una secuencia de ARNm específica para la escisión y destrucción. De esta manera, el ARNm a ser silenciado por el ARNip generado a partir del precursor de ARN manipulado por ingeniería se agotará de la célula u organismo, conduciendo a una disminución en la concentración de la proteína codificada por ese ARNm en la célula u organismo. Los precursores de ARN normalmente son moléculas de ácido nucleico que codifican individualmente una hebra de un ARNbc o codifican toda la secuencia nucleotídica de una estructura de bucle de horquilla de ARN.

Los precursores de ARN manipulados por ingeniería de la invención pueden estar sin conjugar, o se pueden conjugar con otro resto, tal como una nanopartícula, para potenciar una propiedad de las composiciones, por ejemplo un parámetro farmacocinético tal como absorción, eficacia, biodisponibilidad, y/o vida media. La conjugación se puede lograr por métodos conocidos en la técnica, por ejemplo usando los métodos de Lambert et al., Drug Deliv. Rev.:47(1), 99-112 (2001) (describen ácidos nucleicos cargados a nanopartículas de policianoacrilato de alquilo (PACA)); Fattal et al., J. Control Release 53(1-3):137-43 (1998) (describen ácidos nucleicos unidos a nanopartículas); Schwab et al., Ann. Oncol. 5 Supl. 4:55-8 (1994) (describen ácidos nucleicos unidos a agentes intercalantes, grupos hidrófobos, policationes o nanopartículas de PACA); y Godard et al., Eur. J. Biochem. 232(2):404-10 (1995) (describen ácidos nucleicos unidos a nanopartículas).

Los precursores de ARN manipulados por ingeniería de la presente invención también se pueden marcar usando cualquier método conocido en la técnica; por ejemplo, las composiciones de ácido nucleico se pueden marcar con un fluoróforo, por ejemplo Cy3, fluoresceína, o rodamina. El marcaje se puede llevar a cabo usando un kit, por ejemplo el kit de marcaje de ARNip SILENCER™ (Ambion). Además, el ARNip se puede radiomarcar, por ejemplo usando 3H, 32P, u otro isótopo apropiado.

Además, debido a que se cree que la iARN progresa a través de al menos un producto intermedio de ARN monocatenario, el experto apreciará que también se pueden diseñar ARNip-mc (por ejemplo, la hebra no codificante de un ARNip-bc) (por ejemplo, para síntesis química) generados (por ejemplo, generados enzimáticamente) o expresados (por ejemplo, a partir de un vector o plásmido) como se describe aquí y utilizados según las metodologías reivindicadas. Además, en invertebrados, la iARN puede ser eficazmente desencadena por ARNbc largos (por ejemplo, ARNbc de alrededor de 100 - 1000 nucleótidos de longitud, preferiblemente alrededor de 200 - 500, por ejemplo alrededor de 250, 300, 350, 400 o 450 nucleótidos en longitud) que actúan como efectores de iARN. (Brondani et al., Proc Natl Acad Sci USA. 2001 Dic 4;98(25):14428-33. Epub 2001 Nov 27).

VI. Métodos para introducir ARN, vectores, y células hospedantes

L<os>métodos físicos para introducir ácidos nucleicos incluyen la inyección de una disolución que contiene el ARN, bombardeo por partículas cubiertas por el ARN, impregnación de la célula u organismo en una disolución del ARN,<o>electroporación de membranas celulares en presencia del ARN. Un constructo viral empaquetado en una partícula viral lograría tanto la introducción eficiente de un constructo de expresión en la célula como la transcripción de ARN codificado por el constructo de expresión. Se pueden usar otros métodos conocidos en la técnica para introducir ácidos nucleicos en células, tales como el transporte de vehículos mediado por lípidos, transporte mediado por sustancias químicas, tal como fosfato de calcio, y similares. Así, el ARN se puede introducir junto con componentes que realizan una<o>más de las siguientes actividades: potenciar la captación de ARN por la célula, inhibir la hibridación de hebras individuales, estabilizar las hebras individuales,<o>aumentar de otro modo la inhibición del gen diana.

El ARN se puede introducir directamente en la célula (es decir, intracelularmente);<o>se puede introducir extracelularmente en una cavidad, espacio intersticial, en la circulación de un organismo, introducido por vía oral,<o>se puede introducir sumergiendo una célula u organismo en una disolución que contiene el ARN. La circulación vascular<o>extravascular, el sistema circulatorio<o>linfático, y el líquido cefalorraquídeo son sitios en los que se puede introducir el ARN.

La célula que tiene el gen diana puede ser de la línea germinal,<o>somática, totipotente<o>pluripotente, divisora<o>no divisora, parénquima<o>epitelio, inmortalizada<o>transformada,<o>similar. La célula puede ser una célula madre<o>una célula diferenciada. L<os>tipos celulares que están diferenciados incluyen adipocitos, fibroblastos, miocitos, cardiomiocitos, endotelio, neuronas, glía, glóbulos sanguíneos, megacariocitos, linfocitos, macrófagos, neutrófilos, eosinófilos, basófilos, mastocitos, leucocitos, granulocitos, queratinocitos, condrocitos, osteoblastos, osteoclastos, hepatocitos, y células de las glándulas endocrinas<o>exocrinas.

Dependiendo del gen diana particular y la dosis de material de ARN bicatenario suministrada, este proceso puede proporcionar pérdida de función parcial<o>completa para el gen diana. Una reducción<o>pérdida de la expresión génica en al menos 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 %<o>99 %<o>más de células silenciadas es ejemplar. La inhibición de la expresión génica se refiere a la ausencia (<o>disminución observable) al nivel de proteína y/o producto de ARNm de un gen diana. La especificidad se refiere a la capacidad para inhibir el gen diana sin manifestar efectos sobre otros genes de la célula. Las consecuencias de la inhibición se pueden confirmar por examen de las propiedades exteriores de la célula u organismo (como se presenta más adelante en los ejemplos)<o>por técnicas bioquímicas tales como hibridación en disolución de ARN, protección con nucleasas, hibridación Northern, transcripción inversa, monitorización de la expresión génica con una micromatriz, unión de anticuerpos, enzimoinmunoanálisis de adsorción (ELISA), transferencia Western, radioinmunoensayo (RIA), otros inmunoensayos, y análisis por citometría de flujo (FACS).

Para la inhibición mediada por ARN en una línea celular u organismo completo, la expresión génica se evalúa convenientemente usando un gen informador<o>de resistencia a fármaco, cuyo producto proteico se evalúa fácilmente. Dichos genes informadores incluyen acetohidroxiácido sintasa (ARAS), fosfatasa alcalina (AP), beta-galactosidasa (LacZ), beta-glucoronidasa (GUS), cloranfenicol acetiltransferasa (CAT), proteína verde fluorescente (GFP), peroxidasa de rábano picante (HRP), luciferasa (Luc), nopalina sintasa (NOS), octopina sintasa (OCS), y derivados de los mismos. Están disponibles múltiples marcadores seleccionables que confieren resistencia a ampicilina, bleomicina, cloranfenicol, gentamicina, higromicina, kanamicina, lincomicina, metotrexato, fosfinotricina, puromicina, y tetraciclina. Dependiendo del ensayo, la cuantificación de la cantidad de expresión génica permite determinar un grado de inhibición que es mayor que l0 %, 33 %, 50 %, 90 %, 95 %<o>99 % en comparación con una célula no tratada según la presente invención. Dosis más bajas de material inyectado y tiempos más largos después de la administración del agente de iARN pueden dar como resultado la inhibición en una fracción más pequeña de células (por ejemplo, al menos 10 %, 20 %, 50 %, 75 %, 90 %<o>95 % de células silenciadas). La cuantificación de la expresión génica en una célula puede mostrar cantidades similares de inhibición al nivel de acumulación de ARNm diana<o>de traducción de proteína diana. Como un ejemplo, la eficiencia de inhibición se puede determinar evaluando la cantidad de producto génico en la célula; se puede detectar ARNm con una sonda de hibridación que tiene una secuencia nucleotídica fuera de la región usada para el ARN bicatenario inhibidor,<o>se puede detectar polipéptido traducido con un anticuerpo producido contra la secuencia polipeptídica de esa región.

El ARN se puede introducir en una cantidad que permite la administración de al menos una copia por célula. Dosis más altas (por ejemplo, al menos 5, 10, 100, 500<o>1000 copias por célula) de material pueden dar una inhibición más eficaz; también pueden ser útiles dosis más bajas para aplicaciones específicas.

En un aspecto preferido, la eficacia de un agente de iARN de la invención (por ejemplo, un ARNip que silencia un polimorfismo en un gen mutante) se prueba para determinar su capacidad para degradar específicamente ARNm mutante (por ejemplo, ARNm de htt mutante y/o la producción de la proteína huntingtina mutante) en células, en particular, en neuronas (por ejemplo, líneas clónales neuronales estriatales<o>corticales y/o neuronas primarias). También son adecuados para los ensayos de validación basados en células otras células fácilmente transfectables, por ejemplo células HeLa<o>células COS. Las células se transfectan con ADNc humanos de tipo salvaje<o>mutantes (por ejemplo, ADNc de huntingtina de tipo salvaje<o>mutante humanó). Se cotransfectan ARNip estándar, ARNip modificado,<o>vectores capaces de producir ARNip a partir de ARNm en bucle en U. Se mide la reducción selectiva del ARNm mutante (por ejemplo, ARNm de huntingtina mutante) y/o de la proteína mutante (por ejemplo, huntingtina mutante}. La reducción de ARNm<o>proteína mutante se puede comparar con niveles de ARNm<o>proteína normal. Para fines de comparación, se puede evaluar ARNm<o>proteína normal introducida exógenamente (<o>ARNm<o>proteína normal endógena}, Cuando se utilizan células neuronales, que se sabe que son algo resistentes a las técnicas de transfección convencionales, puede ser deseable introducir agentes de iARN (por ejemplo, ARNip} por captación pasiva,

VII. Métodos de tratamiento:

La presente invención proporciona métodos tanto profilácticos como terapéuticos para tratar un sujeto en riesgo de (<o>susceptible a} una enfermedad<o>trastorno causado, en todo<o>en parte, por una proteína mutante de ganancia de función, La enfermedad<o>trastorno es la enfermedad de Huntington,

"Tratamiento"<o>"tratar", como se usa aquí, se define como la aplicación<o>administración de un agente terapéutico (por ejemplo, un agente de ARN<o>vector<o>transgén que lo codifica} a un paciente,<o>la aplicación<o>administración de un agente terapéutico a un tejido<o>línea celular aislado de un paciente, que tiene la enfermedad<o>trastorno, un síntoma de enfermedad<o>trastorno<o>una predisposición hacia una enfermedad<o>trastorno, con el fin de curar, sanar, aliviar, mitigar, alterar, remediar, recuperarse de, mejorar<o>afectar la enfermedad<o>trastorno, los síntomas de la enfermedad<o>el trastorno,<o>la predisposición hacia la enfermedad,

La invención proporciona un método para prevenir en un sujeto una enfermedad<o>trastorno como se describe anteriormente, administrando al sujeto un agente terapéutico (por ejemplo, un agente de iARN<o>vector<o>transgén que lo codifica}, Los sujetos en riesgo de la enfermedad se pueden identificar, por ejemplo, por cualquiera<o>una combinación de ensayos de diagnóstico<o>de pronóstico como se describen aquí, La administración de un agente profiláctico puede ocurrir antes de la manifestación de los síntomas característicos de la enfermedad<o>trastorno, de forma que la enfermedad<o>trastorno se prevenga<o>, alternativamente, se retrase en su progresión,

La invención también permite métodos para tratar sujetos terapéuticamente, es decir, alterar la aparición de síntomas de la enfermedad<o>trastorno,

El método modulador implica poner en contacto una célula que expresa un mutante de ganancia de función con un agente terapéutico (por ejemplo, un agente de iARN<o>vector<o>transgén que lo codifica} que es específico para un polimorfismo dentro del gen, de forma que se logre la interferencia específica de secuencia con el gen, Estos métodos se pueden realizarin vitro(por ejemplo, cultivando la célula con el agente}<o>, alternativamente,in vivo(por ejemplo, administrando el agente a un sujeto},

Con respecto a métodos tanto profilácticos como terapéuticos de tratamiento, tales tratamientos se pueden adaptar<o>modificar específicamente, basándose en el conocimiento obtenido del campo de la farmacogenómica, "Farmacogenómica", como se usa aquí, se refiere a la aplicación de tecnologías de genómica, tales como secuenciación génica, genética estadística, y análisis de expresión génica a fármacos en desarrollo clínico y a la venta, Más específicamente, el término se refiere al estudio de cómo los genes de un paciente determinan su respuesta a un fármaco (por ejemplo, "fenotipo de respuesta al fármaco"<o>"genotipo de respuesta al fármaco" de un paciente}, Así, la invención proporciona métodos para adaptar un tratamiento profiláctico<o>terapéutico de un individuo con cualquiera de las moléculas de gen diana de la presente invención<o>moduladores de gen diana según el genotipo de respuesta al fármaco del individuo, La farmacogenómica permite que un profesional clínico<o>médico dirija los tratamientos profilácticos<o>terapéuticos a los pacientes que se beneficiarán más del tratamiento y para evitar el tratamiento de pacientes que experimentarán efectos secundarios tóxicos relacionados con el fármaco,

Se pueden probar agentes terapéuticos en un modelo animal apropiado, Por ejemplo, un agente de iARN (<o>vector de expresión<o>transgén que lo codifica} como se describe aquí se puede usar en un modelo animal para determinar la eficacia, toxicidad<o>los efectos secundarios del tratamiento con dicho agente, Alternativamente, un agente terapéutico se puede usar en un modelo animal para determinar el mecanismo de acción de tal agente, Por ejemplo, un agente se puede usar en un modelo animal para determinar la eficacia, toxicidad<o>los efectos secundarios del tratamiento con dicho agente, Alternativamente, un agente se puede usar en un modelo animal para determinar el mecanismo de acción de dicho agente,

VIII. Composiciones farmacéuticas

La invención se refiere al uso de los agentes descritos anteriormente para tratamientos profilácticos y/o terapéuticos como se describe más adelante, Por consiguiente, los moduladores (por ejemplo, agentes de iARN} de la presente invención se pueden incorporar en composiciones farmacéuticas adecuadas para administración, Dichas composiciones normalmente comprenden la molécula de ácido nucleico, proteína, anticuerpo,<o>compuesto modulador, y un vehículo farmacéuticamente aceptable, Como se usa aquí, la expresión "vehículo farmacéuticamente aceptable" pretende incluir todos y cada uno de los disolventes, medios de dispersión, revestimientos, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes isotónicos y de retraso de la absorción, y similares, compatibles con la administración farmacéutica, Se conoce bien en la técnica el uso de dichos medios y agentes para sustancias farmacéuticamente activas, Excepto en tanto que cualquier medio<o>agente convencional sea incompatible con el compuesto activo, se contempla el<uso>del mismo en las composiciones. También se pueden incorporar en las composiciones compuestos activos suplementarios.

Una composición farmacéutica se formula para que sea compatible con su ruta de administración prevista. Los ejemplos de las vías de administración incluyen parenteral, por ejemplo administración intravenosa, intradérmica, subcutánea, intraperitoneal, intramuscular, oral (por ejemplo, inhalación), transdérmica (tópica), y transmucosal. Las disoluciones o suspensiones usadas para administración parenteral, intradérmica, o subcutánea pueden incluir los siguientes componentes: un diluyente estéril tal como agua para inyección, disolución salina, aceites fijos, polietilenglicoles, glicerina, propilenglicol u otros disolventes sintéticos; agentes antibacterianos tales como alcohol bencílico o metilparabenos; antioxidantes tales como ácido ascórbico o bisulfito de sodio; agentes quelantes tales como ácido etilendiaminatetraacético; amortiguadores tales como acetatos, citratos o fosfatos, y agentes para el ajuste de la tonicidad tales como cloruro sódico o dextrosa. El pH se puede ajustar con ácidos o bases, tales como ácido clorhídrico o hidróxido sódico. La preparación parenteral se puede encerrar en ampollas, jeringas desechables, o viales de dosis múltiple hechos de vidrio o plástico.

Las composiciones farmacéuticas adecuadas para uso inyectable incluyen disoluciones (cuando son solubles en agua) o dispersiones acuosas estériles y polvos estériles para la preparación extemporánea de disoluciones o dispersión inyectables estériles. Para administración intravenosa, los vehículos adecuados incluyen disolución salina fisiológica, agua bacteriostática, Cremophor EL™ (BASF, Parsippany, NJ), o disolución salina amortiguada con fosfato (PBS). En todos los casos, la composición debe ser estéril, y debe ser líquida hasta el punto de que exista una fácil inyectabilidad. Debe ser estable en las condiciones de fabricación y almacenamiento, y se debe preservar contra la acción contaminante de microorganismos tales como bacterias y hongos. El vehículo puede ser un disolvente o medio de dispersión que contiene, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol, y polietilenglicol líquido, y similares), y mezclas adecuadas de los mismos. La fluidez apropiada se puede mantener, por ejemplo, usando un revestimiento tal como lecitina, por el mantenimiento del tamaño de partículas requerido en el caso de dispersión, y usando tensioactivos. La prevención de la acción de microorganismos se puede lograr por diversos agentes antibacterianos y antifúngicos, por ejemplo parabenos, clorobutanol, fenol, ácido ascórbico, timerosal, y similares. En muchos casos, será preferible incluir en la composición agentes isotónicos, por ejemplo azúcares, polialcoholes tales como manitol, sorbitol, cloruro sódico. La absorción prolongada de las composiciones inyectables se puede provocar incluyendo en la composición un agente que retrasa la absorción, por ejemplo monoestearato de aluminio y gelatina.

Las disoluciones inyectables estériles se pueden preparar incorporando el compuesto activo en la cantidad requerida en un disolvente apropiado con uno o una combinación de los ingredientes enumerados anteriormente, según se requiera, seguido de esterilización por filtración. En general, las dispersiones se preparan incorporando el compuesto activo en un vehículo estéril que contiene un medio de dispersión básico y los otros ingredientes requeridos de los enumerados anteriormente. En el caso de polvos estériles para la preparación de disoluciones inyectables estériles, los métodos preferidos de preparación son secado a vacío y liofilización, que da un polvo del ingrediente activo más cualquier ingrediente deseado adicional de una disolución previamente filtrada de forma estéril del mismo.

Las composiciones orales incluyen, en general, un diluyente inerte o un vehículo comestible. Se pueden encerrar en cápsulas de gelatina o comprimir en comprimidos. Con el fin de la administración terapéutica oral, el compuesto activo se puede incorporar con excipientes y usar en forma de comprimidos, trociscos, o cápsulas. Las composiciones orales también se pueden preparar usando un vehículo líquido para uso como un enjuague bucal, en las que el compuesto en el vehículo líquido se aplica por vía oral y se enjuaga y expectora o se traga. Se pueden incluir aglutinantes y/o materiales adyuvantes farmacéuticamente compatibles como parte de la composición. Los comprimidos, píldoras, cápsulas, trociscos y similares pueden contener cualquiera de los siguientes ingredientes, o compuestos de una naturaleza simular: un aglutinante tal como celulosa microcristalina, goma tragacanto o gelatina; un excipiente tal como almidón o lactosa, un agente disgregante tal como ácido algínico, Primogel o almidón de maíz; un lubricante tal como estearato de magnesio o Sterotes; un deslizante tal como dióxido de silicio coloidal; un edulcorante tal como sacarosa o sacarina; o un aromatizante tal como menta piperita, salicilato de metilo, o aromatizante de naranja.

Para administración por inhalación, los compuestos se administran en forma de un espray en aerosol desde un recipiente o dispensador a presión que contiene un propulsor apropiado, por ejemplo un gas tal como dióxido de carbono, o un nebulizador.

La administración sistémica también puede ser por medios transmucosales o transdérmicos. Para la administración transmucosal o transdérmica, se usan en la formulación penetrantes apropiados para que atraviesen la barrera. Dichos penetrantes se conocen en general en la técnica, e incluyen, por ejemplo, para administración transmucosal, detergentes, sales biliares, y derivados de ácido fusídico. La administración transmucosal se puede lograr mediante el uso de esprays nasales o supositorios. Para administración transdérmica, los compuestos activos se formulan en pomadas, bálsamos, geles, o cremas, como se conoce en general en la técnica.

Los compuestos también se pueden preparar en forma de supositorios (por ejemplo, con bases de supositorio convencionales tales como manteca de cacao y otros glicéridos) o enemas de retención para administración rectal.

En una realización, I<os>agentes activos se preparan con vehículos que protegerán el agente frente a la eliminación rápida del cuerpo, tal como una formulación de liberación controlada, incluyendo implantes y sistemas de administración microencapsulados. Se pueden usar polímeros biodegradables biocompatibles, tales como etilenoacetato de vinilo, polianhídridos, ácido poliglicólico, colágeno, poliortoésteres, y ácido poliláctico. L<os>métodos para la preparación de tales formulaciones serán evidentes para I<os>expertos en la técnica. L<os>materiales también se pueden obtener comercialmente de Alza Corporation y Nova Pharmaceuticals, Inc. También se pueden usar suspensiones liposomales (que incluyen liposomas dirigidos contra células infectadas con anticuerpos monoclonales contra antígenos virales) como vehículos farmacéuticamente aceptables. Estos se pueden preparar según métodos conocidos para I<os>expertos en la técnica, por ejemplo como se describe en la patente de EE. UU. núm. 4.522.811.

E<s>especialmente ventajoso formular composiciones orales<o>parentales en forma de dosificación unitaria para facilitar la administración y la uniformidad de la dosificación. Forma de dosificación unitaria, como se usa aquí, se refiere a unidades físicamente discretas aptas como dosificaciones unitarias para el sujeto que se va a tratar; conteniendo cada unidad una cantidad predeterminada de compuesto activo calculada para producir el efecto terapéutico deseado en asociación con el vehículo farmacéutico requerido. L<os>requisitos para las formas unitarias de dosificación vienen dictados por y dependen directamente de las características únicas del agente activo y del efecto terapéutico particular a lograr, y las limitaciones inherentes en la técnica de combinar tal agente activo para el tratamiento de individuos.

La toxicidad y eficacia terapéutica se puede determinar por procedimientos farmacéuticos convencionales en cultivos celulares<o>animales experimentales, por ejemplo para determinar la LD50 (la dosis letal para el 50 % de la población) y la ED50 (la dosis terapéuticamente eficaz en el 50 % de la población). La relación de dosis entre efectos tóxicos y terapéuticos es el índice terapéutico, y se puede expresar como la relación LD50/ED50. Se prefieren agentes que presentan grandes índices terapéuticos. Aunque se pueden usar agentes que presentan efectos secundarios tóxicos, se debe tener cuidado en el diseño de un sistema de administración que dirija tales agentes al sitio de tejido afectado, para minimizar el posible daño a células no infectadas y, de ese modo, reducir I<os>efectos secundarios.

Se pueden usar I<os>datos obtenidos de I<os>ensayos de cultivo celular, y se pueden usar estudios en animales a la hora de formular un intervalo de dosificación para uso en seres humanos. La dosis de tales agentes se encuentra preferiblemente dentro de un intervalo de concentraciones circulantes que incluyen la ED50 con poca<o>ninguna toxicidad. La dosificación puede variar dentro de este intervalo, dependiendo de la forma farmacéutica empleada y la vía de administración utilizada.

Para cualquier agente, la dosis terapéuticamente eficaz se puede estimar inicialmente a partir de ensayos de cultivo celular. Una dosis se puede formular en modelos animales para lograr un intervalo de concentración plasmática circulante que incluye la EC50 (es decir, la concentración del agente de prueba que logra una respuesta semimáxima) como se determina en cultivo celular. Tal información se puede usar para determinar con más exactitud dosis útiles en I<os>seres humanos. Se pueden medir niveles en plasma, por ejemplo por cromatografía de líquidos de alta resolución.

Las composiciones farmacéuticas se pueden incluir en un recipiente, envase,<o>dispensador, junto con instrucciones para administración.

Esta invención se ilustra además por I<os>siguientes ejemplos, que no se debe interpretar como limitativos.

E JE M P L O S

A diferencia de otros tipos de enfermedades autosómicas dominantes, la enfermedad de Huntington no contiene una mutación puntual, por ejemplo cambio de un solo nucleótido. Por tanto, no se puede implementar la estrategia para diseñar ARNip dirigido contra una mutación puntual en el alelo de la enfermedad. En su lugar, la presente invención se refiere a ARNip diseñados dirigidos contra polimorfismos en el gen huntingtina, de I<os>que hay alrededor de 30 disponibles en GenBank. La presente invención también identifica el polimorfismo en el alelo de la enfermedad de Huntington que difiere del alelo de tipo salvaje, de manera que el ARNip destruye sólo el ARNm de la enfermedad y deja intacto el ARNm del alelo de tipo salvaje (normal). Así, sólo se destruye la proteína huntingtina mutante, y la proteína normal está intacta.

E je m p lo I: P ru eb a d e ag e n te s d e iA R N (p o r e je m p lo , A R N ip ) c o n tra htt m u ta n te en lis ad o s d e Drosophila

Se diseñó un ARNip que silencia la posición 2886 en el ARNm de htt como se describemás arriba.La secuencia del ARNip se representa en la Figura 5a (SEQ ID NO: 24 codificante; 25 no codificante). Se desprotegió ARN sintético (Dharmacon) según el protocolo del fabricante. Se hibridaron hebras de ARNip (Elbashir et al., 2001a).

L<os>ARN diana se prepararon según lo siguiente. Se transcribieron ARN diana con T7 ARN polimerasa recombinante, etiquetada con histidina, de productos de PCR como se ha descrito (Nykanen et al., 2001; Hutvágner et al., 2002). Se generaron moldes de PCR para codificante y no codificante de htt amplificando 0,1 ng/ml (concentración final) de molde plasmídico que codifica ADNc de htt usando I<os>siguientes pares de cebadores: diana codificante de htt, 5'-GCG TAA TAC GAC TCA CTA TAG GAA CAG TAT GTCTCA GAC ATC-3' (SEQ ID NO:30) y 5'-UUCG AAG UAU UCC GCG UAC GU-3' (SEQ<id>NO:31); diana no codificante de htt, 5'-GCG TAA TAC GAC TCA CTA TAG GAC AAG CCT AAT TAG TGA TGC-3' (SEQ ID NO:32) y 5'-GAA CAG TAT GTC TCA GAC ATC-3' (SEQ ID NO:33).

Se probó el ARNip usando un ensayo de iARNin vitro, que caracteriza los lisados de embrión deDrosophila.Se llevaron a cabo las reacciones y los análisis de iARNin vitrocomo se ha descrito previamente (Tuschl et al., 1999; Zamore et al., 2000; Haley et al., 2003). Se usaron dianas de ARN a concentración de ~ 5 nM, de manera que las reacciones estuvieran principalmente en condiciones de un solo reemplazo. La escisión de la diana en estas condiciones es proporcional a la concentración de ARNip.

La Figura 5a muestra la eficacia del ARNip dirigido contra la posición 2886 en el htt mutante. Los datos demuestran claramente que el ARNip dirige la escisión de la diana codificante a un mayor grado que la observada para la diana no codificante. Sin embargo, se reconoce que este ARNip diseñado en primer lugar no produjo una molécula muy activa, al menos en este ensayoin vitro.El análisis termodinámico de la fortaleza del par de bases en los dos extremos del dúplex de ARNip indicó fortalezas de pares de bases aproximadamente equivalentes. La Figura 4 representa el análisis termodinámico de extremos 5' de hebras codificantes (SEQ ID NO:20; 22 respectivamente) y no codificantes (SEQ ID NO: 21; 23 respectivamente) de ARNip para el dúplex de ARNip en 5a. Se calculó AG (kcal/mol) en NaCI 1 M a 37sC.

Para mejorar la eficacia del dúplex de ARNip diseñado, el extremo 5' de la hebra codificante o la posición 19 de la hebra no codificante del ARNip de htt probado en la Figura 5a se alteró para producir dúplex de ARNip en los que el extremo 5' de la hebra codificante estaba completamente desapareado (Figura 5c; SEQ ID NO: 28 codificante; SEQ ID NO: 29 no codificante) o en un par de bases A:U (Figura 5b; S<e>Q ID NO:26 codificante; SEQ ID NO:27 no codificante). La falta de apareamiento del extremo 5' de una hebra de ARNip -la hebra codificante, en este caso- hace que la hebra funcione con la exclusión de la otra hebra. Cuando el extremo 5' de la hebra codificante de htt estaba presente en un par de bases A:U y el extremo 5' de la hebra no codificante de htt estaba en un par G:C, la hebra codificante dominó la reacción (Figura 5b-c), pero la hebra no codificante de htt retuvo la actividad similar a la observada para el ARNip originalmente diseñado.

Ejemplo II: Inactivación por iARN de la proteína Htt en células cultivadas

En un primer experimento, los ARNip dirigidos contra un polimorfismo en el ARNm de htt (es decir, el polimorfismo en la posición 2886 en el ARNm de htt) se probaron para determinar su capacidad para disminuir la proteína Htt endógena en células HeLa. Las células HeLa se cultivaron y transfectaron según lo siguiente. Loas células HeLa se mantuvieron a 37sC en medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM, Invitrogen) suplementado con 10 % de suero bovino fetal (FBS), 100 unidades/ml de penicilina y 100 pg/ml de estreptomicina (Invitrogen). Las células se sometieron a pasadas regulares a sub-confluencia, y se sembraron a 70 % de confluencia 16 horas antes de la transfección. La transfección transitoria mediada por Lipofectamine™ (Invitrogen) de los ARNip se realizó en placas de 6 pocilios por duplicado (Falcon), como se describe para las líneas de células adherentes por el fabricante. A cada pocilio se añadió una mezcla de transfección estándar que contenía ARNip 100-150 nM y 9-10 pl de Lipofectamine™ en 1 mi de OPTI-MEM® reducido en suero (Invitrogen). Las células se incubaron en mezcla de transfección a 37C durante 6 horas, y se cultivaron adicionalmente en DMEM libre de antibiótico. Para el análisis de transferencia Western en diversos intervalos de tiempo, las células transfectadas se recogieron, se lavaron dos veces con disolución salina amortiguada con fosfato (PBS, Invitrogen), se ultracongelaron en nitrógeno líquido, y se conservaron a -802C para el análisis.

Se probaron tres ARNip contra una secuencia diana común en el exón 1, y se probaron cuatro ARNip para el polimorfismo de la posición 2886. El análisis de transferencia Western se llevó a cabo según lo siguiente. Las células tratadas con ARNip se recogieron como se describe anteriormente, y se lisaron en amortiguador de lisis informador enfriado en hielo (Promega) que contenía inhibidor de proteasas (completo, libre de EDTA, 1 comprimido/10 mi de amortiguador, Roche Molecular Biochemicals). Después de aclarar los lisados resultantes por centrifugación, la proteína en los lisados claros se cuantificó mediante el kit del ensayo de proteínas Dc (Bio-Rad). Las proteínas en 60 pg de lisado celular total se resolvieron mediante 10 % de SDS-PAGE, se transfirieron sobre una membrana de poli(difluoruro de vinilideno) (PVDF, Bio-Rad), y se inmunotransfirieron con anticuerpos contra CD80 (Santa Cruz). El contenido de proteína se visualizó con un kit de inmunotransferencia quimioluminiscente BM (Roche Molecular Biochemicals). Las transferencias se expusieron a película de rayos X (Kodak MR-1) durante diversos tiempos (30 s a 5 min). La Figura 6a representa los resultados del análisis Western. La tubulina sirvió de control de carga. Los datos se cuantifican y se normalizaron en la Figura 6b. De los ARNip probados, 2886-4, mostró reproduciblemente eficacia potenciada en células HeLa cultivadas (Figura 6). Este ARNip también mostró reproduciblemente eficaciain vitropotenciada (no mostrada). ARNip de GFP es un ARNip de control que no comparte homología de secuencia con ARNm de htt.

Asimismo, se pueden probar ARNip contra regiones polimórficas en el ARNm de htt en células transfectadas con ADNc de htt humano o en células transfectadas con constructos informadores de htt. Las cotransfecciones transitorias mediadas por Lipofectamine™ (Invitrogen) de los ADNc o plásmidos informadores y los ARNip se realizan como se describemás arriba.Para probar la capacidad de ARNip para dirigirse contra los constructos de htt informados, se usó iARN para inhibir la expresión de GFP-htt en líneas celulares HeLa humanas cultivadas. Brevemente, se transfectaron células HeLa con dúplex de ARNip de GFP-htt, que silencia la secuencia de ARNm de GFP-htt. Para analizar I<os>efectos de IARN contra GFP-htt, se prepararon Usados a partir de células tratadas con dúplex de ARNIp en diversos momentos después de la transfección. Se llevaron a cabo experimentos de transferencia Western como se describe más arriba. Brevemente, se recogieron células HeLa en diversos momentos después de la transfección, su contenido de proteína se resolvió sobre 10 % de SDS-PAGE, se transfirió sobre membranas de PVDF, y se inmunotransfirió con anticuerpos apropiados. L<os>resultados de este estudio indicaron que el ARNip contra GFP puede eliminar la expresión de la expresión de GFP-htt en células HeLa transfectadas con el gen GFP-htt. Para estudios dirigidos contra htt exógenamente introducida, I<os>procedimientos son como se describen, excepto que se usan anticuerpos anti-Htt para la inmunotransferencia.

También se puede usar iARN para inhibir la expresión de htt en células neuronales cultivadas. Las células ejemplares incluyen las líneas celulares PC12 (Scheitzer et al., Thompson et al.) y NT3293 (Tagle et al.) como se describe previamente. Células adicionales ejemplares incluyen células establemente transfectadas, por ejemplo células neuronales<o>células neuronalmente derivadas. Se pueden usar líneas celulares PC12 que expresan el exón 1 del gen huntingtina humana (Htt), aunque la expresión del exón 1 reduce la supervivencia celular. Las células GFP-Htt PC12 que tienen un gen GFP-htt inducible también se pueden usar para probar<o>validar la eficacia de ARNip.

E je m p lo III: A d m in is tra c ió n d e A R N ip d e H tt en un e n to rn o in vivo

L<os>modelos de ratones R6/2 (que expresan el producto de ADNc de htt de R6/2 humano) son un modelo animal aceptado para estudiar la eficacia de la administración de ARNip en un entornoin vivo.Se usaron ratones R6/2 genéticamente manipulados para probar la eficacia de ARNip en el extremo 5' de ARNm de huntingtina. Se inyectó ARNip de Htt en el cuerpo estriado de ratones R6/2 mediante una bomba Alzet. L<os>ratones se trataron durante 14 días con el sistema de administración de bomba ARNip/Alzet.

L<os>resultados de este estudio indicaron que I<os>dos ratones que recibieron el ARNip con Trans-IT TKO (Mirus) como una disolución 20<o>200 nM a 0,25 gl/hora no mostraron deterioro de la alteración motora desde el día 67 hasta el día 74. En general, se espera que estos R6/2 tengan una reducción continuada en la varilla giratoria más allá del día 60.R e fe re n c ia s

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McCaffrey et al., Gene Ther. 2002 Dic;9(23):1563 (2002)

McManus et al., RNA 8, 842-850 (2002)

Miyagishi et al,,Nature Bioteohnol. 20:497-500 (2002)

Nykanen et al., Cell 107, 309-321 (2001)

Paddison et al., Genes Dev 16, 948-958. (2002)

Paul et al., Nat Bioteohnol 20, 505-508 (2002)

Soheitzer et al.

Sui et al., Proo Natl Aoad Soi USA 99, 5515-5520 (2002)

Tagle et al.

Thompson et al.

Tusohl, T., Nat Bioteohnol. 2002 May;20(5):446-8 (2002)

Tusohl et al., Genes Dev 13, 3191-3197 (1999)

Xia et al., (2002)

Yohrling G.J. et al., Mol Cell Neurosoi. May;23(1):28-38 (2003)

Yu et al., Proo Natl Aoad Soi U S A 99, 6047-6052 (2002)

Zamore et al., Cell 101,25-33 (2000)

Zamore et al., Nature Medicine, volumen 9 número 3 págs. 266 - 267 (2003)

Zeng et al., (2002)

Equivalentes

Los expertos en la técnica reconocerán, o serán oapaoes de determinar usando no más de experimentación rutinaria, muchos equivalentes a las realizaciones específicas de la invención descritas aquí. Tales equivalentes pretenden estar englobados por las siguientes reivindicaciones.

Claims (9)

REIVINDICACIONES

1. Una cantidad eficaz de un agente de ¡ARN para<uso>en el tratamiento de un sujeto que tiene<o>está en riesgo de padecer una enfermedad caracterizada<o>causada por una proteína mutante de ganancia de función, en la que el agente de ¡ARN es capaz de dirigirse contra un polimorfismo alélico dentro de un gen que codifica dicha proteína mutante de manera que se produzca una interferencia específica de secuencia de dicho gen,

en la que la proteína mutante de ganancia de función es huntingtina, y la enfermedad es la enfermedad de Huntington, y en la que el agente de ¡ARN es un precursor de ARN diseñado por ingeniería,<o>un constructo de expresión diseñado por ingeniería para expresar un precursor de ARN diseñado por ingeniería, y en la que la región polimórfica contra la que se dirige el agente de ¡ARN es distinta de la mutación de la región CAG ampliada del gen.

2. El agente de ¡ARN para uso según la reivindicación 1, en el que

el agente de ¡ARN se dirige contra un polimorfismo seleccionado del grupo que consiste en P1-P5 y P6-P43.

3. El agente de ¡ARN para uso según cualquier reivindicación anterior, en el que el agente de ¡ARN es un constructo de expresión seleccionado de vectores retrovirales, casetes de expresión lineal, plásmidos, vectores virales, y vectores derivados de virus.

4. El agente de ¡ARN para uso según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el constructo de expresión comprende un promotor de la ARN polimerasa II<o>un promotor de la ARN polimerasa III, opcionalmente en el que la secuencia del promotor de la ARN III es el promotor del ARNnp U6<o>el promotor H1.

5. El agente de ¡ARN para uso según cualquier reivindicación anterior, en el que el agente de ¡ARN está contenido en una célula hospedante.

6. El agente de ¡ARN para uso según la reivindicación 5, en el que la célula hospedante es una célula de mamífero, opcionalmente una célula de mamífero no humana<o>una célula humana.

7. El agente de ¡ARN para uso según las reivindicaciones 1-6, en el que el constructo de expresión expresa una cantidad eficaz de un precursor de ARN diseñado por ingeniería dirigido contra ARNm de Htt, de manera que se produce el silenciamiento de ARN de dicho ARNm, en el que el precursor de ARN diseñado por ingeniería comprende (i) una hebra no codificante que tiene suficiente complementariedad con el ARNm de Htt para dirigir la escisión específica de la diana<o>la represión traduccional del ARNm de Htt; y (ii) una hebra codificante que es sustancialmente complementaria a la hebra no codificante, de modo que las hebras codificante y no codificante sean capaces de hibridarse entre sí.

8. El agente de ¡ARN para uso según cualquier reivindicación anterior, en el que el agente de ¡ARN comprende una primera hebra que comprende alrededor de 16-25 nucleótidos homólogos a una región del gen que comprende el polimorfismo, y una segunda hebra que comprende alrededor de 16-25 nucleótidos complementarios a la primera hebra.

9. El agente de ¡ARN para uso según una cualquiera de las reivindicaciones 7-8, en el que la primera hebra comprende una secuencia nucleotídica idéntica a la secuencia del polimorfismo.