ES2968449T3

ES2968449T3 - Composiciones hemostáticas

Info

Publication number: ES2968449T3
Application number: ES16723460T
Authority: ES
Inventors: Renata Zbozien; Ben Nichols
Original assignee: Haemostatix Ltd
Current assignee: Haemostatix Ltd
Priority date: 2015-05-11
Filing date: 2016-05-11
Publication date: 2024-05-09
Anticipated expiration: 2036-05-11
Also published as: GB201508024D0; AU2016261108B2; IL255579A; JP6877360B2; KR102645212B1; JP2018515216A; KR20180006390A; CN107592814B; RU2017139789A; WO2016181137A1; AU2016261108A1; BR112017024162A2; MX2017014418A; EP3294353A1; PH12017501946A1; EP3294353B1; US11246958B2; US20180154038A1; HRP20240065T1; RU2017139789A3

Abstract

Una composición hemostática fluida, estéril, lista para usar, comprende un agente hemostático soluble que comprende una pluralidad de vehículos y una pluralidad de péptidos de unión a fibrinógeno inmovilizados en el vehículo; un líquido biocompatible; y partículas de polisacárido reticulado biocompatible adecuadas para uso en hemostasia y que son insolubles en el líquido biocompatible. Tales composiciones pueden usarse para el control de hemorragias, especialmente en procedimientos quirúrgicos. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Composiciones hemostáticas

Esta invención se refiere a composiciones hemostáticas, en particular a composiciones hemostáticas fluidas en forma estéril, lista para uso, a métodos para producir las composiciones hemostáticas y a composiciones para uso en el control de sangrado, especialmente en procedimientos quirúrgicos.

La formación de polímero de fibrina insoluble a partir de su fibrinógeno precursor soluble en el estadio final de la coagulación sanguínea. La conversión de fibrinógeno en fibrina se produce en tres etapas: proteólisis limitada de fibrinógeno a monómero de fibrina mediante trombina; ensamble de monómeros de fibrina en protofibrillas de cadena doble, semiescalonadas; y reticulación de fibrina ensamblada para fortalecer el coágulo.

La molécula de fibrinógeno consiste en tres pares de cadenas de polipéptidos no idénticas, Aa, Bp y y, ligadas juntas por enlaces disulfuro. Las cadenas de fibrinógeno se pliegan en tres regiones estructurales distintas, dos regiones D distales ligadas a una región E central. Cada región D contiene agujeros de polimerización 'a' y 'b' ubicados en el terminal C de las cadenas y y Bp, respectivamente. La trombina cataliza la eliminación de péptidos cortos, fibrinopéptidos A (FpA) y B (FpB), del terminal amino de las cadenas Aa y Bp de fibrinógeno en la región E central, respectivamente, exponiendo dos sitios de polimerización: “perilla A”, con secuencia de terminal amino Gly-Pro-Arg-; y “perilla B”, con secuencia de terminal amino Gly-His-Arg-. Las perillas de polimerización recién expuestas de un monómero de fibrina interactúan con los agujeros correspondientes de otro monómero de fibrina a través de interacciones perilla-agujero 'A-a' y 'B-b', lo que da como resultado el ensamble de monómeros de fibrina en protofibrillas de cadena doble, semiescalonadas.

Las protofibrillas se agregan lateralmente para formar fibras más gruesas que se fusionan para formar una red tridimensional de coágulo de fibrina. El FpA se escinde del fibrinógeno más rápidamente que el FpB. La eliminación de FpA desencadena la formación de protofibrillas, mientras que la eliminación de FpB coincide con su agregación lateral. La liberación de FpB, que es muy lenta al inicio de la reacción, se acelera durante la formación del polímero. Este retardo en la escisión de FpB es necesario para el ensamble normal de la fibrina, y también está relacionado con la formación de diferentes tipos de coágulos. La fibrina I, en la que sólo se eliminan los FpA, es menos compacta y la plasmina la digiere más fácilmente, mientras que la fibrina II, en la que se eliminan tanto el FpA como el FpB, es más compacta y más resistente a la fibrinólisis.

Los estudios con enzimas del veneno de serpiente que eliminan sólo FpA o principalmente FpB han demostrado que se pueden formar coágulos de fibrina mediante interacciones 'A-a' o 'B-b', lo que indica que ambas interacciones pueden mediar en la formación de protofibrillas. Los experimentos con una variante de fibrinógeno recombinante demostraron que las interacciones 'B-b' pueden desempeñar una función sustancial en la formación de protofibrillas cuando las interacciones 'A-a' están debilitadas. Otros estudios han demostrado que sólo se producen interacciones 'A-a' durante la unión de fragmentos de fibrina a moléculas de fibrinógeno incluso cuando están disponibles tanto las perillas 'B' como los agujeros 'b', y que las interacciones perilla-agujero 'B-b' eran evidentes sólo cuando se excluyeron las interacciones 'A-a'. Sin embargo, los estudios de inhibición de péptidos han indicado que las interacciones 'B-b' pueden ocurrir simultáneamente con 'A-a'.

La fibrina se estabiliza mediante la formación de enlaces cruzados covalentes entre las cadenas laterales de diferentes moléculas en la fibra de fibrina. Los enlaces de péptido se forman entre cadenas laterales específicas de glutamina y lisina en una reacción de transamidación catalizada por el factor XlIIa.

La aplicación de presión directa en el sitio del sangrado puede no ser suficiente para controlar el sangrado cuando el origen del sangrado es difícil de identificar (por ejemplo, en sangrado venosa difusa), o cuando está presente una coagulopatía inherente. La hemostasia también se ve comprometida debido a la presencia de agentes antiplaquetarios y anticoagulantes, especialmente en pacientes sometidos a cirugía cardíaca o vascular, así como de cambios asociados con el bypass cardiopulmonar. En dichos casos los agentes hemostáticos tópicos proporcionan complementos útiles a los métodos convencionales para lograr la hemostasia.

Los hemostáticos a base de gelatina se utilizan en procedimientos quirúrgicos. La gelatina en polvo, cuando se mezcla con fluido, se puede preparar en varias formas dependiendo del uso final, y la relación de fluido a polvo. Por ejemplo, cuando se emplean concentraciones más altas de fluido, se puede preparar una pasta o suspensión que sea útil como hemostático fluido para uso en sangrado difuso, particularmente de superficies irregulares o áreas de difícil acceso. Dichas pastas se preparan en el punto de uso mediante agitación mecánica y mezcla del polvo y el líquido para proporcionar uniformidad a la composición. Luego la pasta se coloca en un medio de suministro o aplicador, por ejemplo, una jeringa, y se aplica a la herida.

Algunos hemostáticos a base de gelatina están disponibles comercialmente en forma de kit como una matriz de gelatina fluida, con trombina liofilizada. Antes de uso, la trombina liofilizada se reconstituye en agua o solución salina, y se mezcla con la matriz de gelatina. La naturaleza granular de la matriz de gelatina permite que el material se adapte a cualquier geometría irregular de la herida. Los componentes de la mezcla actúan sinérgicamente para promover la hemostasia en el sitio del sangrado. Los gránulos de gelatina se hinchan al exponerse a la sangre, lo que reduce el flujo sanguíneo, y proporciona un taponamiento suave. La sangre que pasa a través de los espacios entre los gránulos está expuesta a altas concentraciones de trombina. La trombina convierte enzimáticamente el fibrinógeno de la sangre en monómeros de fibrina, que se polimerizan. El polímero de fibrina atrapa los gránulos de gelatina y otros elementos celulares en el sitio del sangrado. El cuerpo reabsorbe los gránulos de gelatina incorporados en el coágulo resultante en varias semanas, de acuerdo con el transcurso del tiempo de curación normal de la herida.

Un kit hemostático a base de gelatina disponible comercialmente es el kit de Matriz Hemostática FLOSEAL. La matriz de gelatina consiste en gránulos de gelatina reticulados, proporcionados como un gel estéril en una jeringa desechable. La trombina se suministra como una preparación de polvo liofilizado estéril, y se proporciona con cloruro de sodio estéril como diluyente. La matriz de gelatina se elabora mediante extracción de colágeno de corion bovino seguida por gelatinización del colágeno, reticulación con glutaraldehído, y trituración de la gelatina reticulada en partículas de 500 600 |jm de tamaño. Otro kit disponible comercialmente es el kit de Matriz Hemostática SURGIFLO, con trombina. La matriz se suministra en una jeringa precargada para mezclar con trombina. La gelatina utilizada para elaborar la matriz se deriva de pieles de cerdo. La gelatina se procesa para producir un producto de gelatina en polvo, que luego se procesa para producir una pasta. La trombina se proporciona como un polvo liofilizado para reconstitución en agua.

Aunque los agentes hemostáticos que comprenden matriz de gelatina y trombina son eficaces para controlar el sangrado durante la cirugía, los productos de este tipo tienen varias desventajas. En particular, la trombina no es estable en solución, y no se puede esterilizar en solución sin destruir al menos parte de su actividad. En consecuencia, la trombina se proporciona por separado como un polvo liofilizado para reconstitución, antes de mezclarla con la matriz de gelatina unas horas antes de uso. Estas etapas corren el riesgo de comprometer la esterilidad de la mezcla, son inconvenientes para los procedimientos quirúrgicos, y hacen que los productos sean inviables para el tratamiento de heridas traumáticas fuera de un hospital. La trombina proporcionada en los kits actualmente disponibles comercialmente se prepara a partir de plasma humano combinado, obtenido de centros de recolección de plasma autorizados, a través de una serie de etapas de separación y filtración. Si bien estos procedimientos reducen significativamente el riesgo de infección viral o priónica, no eliminan el riesgo.

Por lo tanto, subsiste la necesidad, de proporcionar agentes hemostáticos estables, listos para uso, adecuados para controlar el sangrado en procedimientos quirúrgicos. También subsiste la necesidad de proporcionar agentes hemostáticos, listos para uso que sean más resistentes a la esterilización que los agentes hemostáticos fluidos convencionales que comprenden trombina. Una necesidad adicional es la de agentes hemostáticos que tengan un riesgo aún más reducido de infectividad viral o priónica que los agentes hemostáticos fluidos actualmente disponibles comercialmente que comprenden trombina.

De acuerdo con la invención se proporciona una composición hemostática que comprende: de portadores y una pluralidad de péptidos de unión a fibrinógeno inmovilizados en cada portador; un líquido biocompatible; y partículas de un polisacárido reticulado biocompatible adecuado para uso en hemostasia y que son insolubles en el líquido biocompatible.

De acuerdo con la invención, las composiciones son composiciones hemostáticas, fluidas, listas para uso.

Se ha encontrado que los agentes hemostáticos en las composiciones de la invención son sorprendentemente resistentes a la esterilización, particularmente a la esterilización con vapor, o a la esterilización con calor seco. En consecuencia, las composiciones de la invención se pueden esterilizar utilizando métodos de esterilización convencionales sin una pérdida significativa de actividad hemostática. Esta es una ventaja importante porque permite que las composiciones se proporcionen como composiciones hemostáticas fluidas, hidratadas, estériles, listas para uso. Los hemostáticos convencionales a base de gelatina que comprenden trombina no son estables cuando se esterilizan con calor o vapor en forma hidratada, lista para uso.

El término “hemostático” se utiliza en el presente documento para referirse a la capacidad de detener o minimizar el sangrado.

El término “biocompatible” se utiliza en el presente documento para significar que el material es compatible con el tejido vivo al no ser tóxico o nocivo y no provocar rechazo inmunológico. El material debe cumplir preferiblemente con los criterios de la norma #ISO 10993-1 promulgada por la Organización Internacional de Normalización (NAMSA, Northwood, Ohio).

El término “fluible” se utiliza en el presente documento para significar que las composiciones fluyen cuando se someten a tensiones por encima de un nivel umbral, por ejemplo cuando se extruyen a través de un orificio o cánula o cuando se empaquetan en un sitio de suministro utilizando una espátula. Las tensiones umbral normalmente están en el rango de 3 x 104 Pa a 5 x 105 Pa. Sin embargo, las composiciones, permanecerán generalmente inmóviles cuando se sometan a tensiones por debajo del nivel umbral. Una composición fluida generalmente es capaz de adaptarse a geometrías de herida irregulares en un sitio diana al que se suministra la composición.

El agente hemostático, el líquido y las partículas insolubles se pueden combinar y mezclar bajo condiciones eficaces para proporcionar una composición hemostática sustancialmente homogénea que comprende una fase líquida, biocompatible continua, que comprende las partículas sustancialmente dispersas de manera homogénea en toda la fase líquida.

Como se utiliza en el presente documento, “sustancialmente homogéneo” denota ese estado físico de las composiciones en el que las partículas sólidas están uniformemente dispersas a lo largo de la fase líquida continua de manera que la relación sólido: líquido y la densidad de cualquier porción o sección transversal de la composición son sustancialmente las mismas.

De acuerdo con ciertos aspectos de la invención, las composiciones son reabsorbibles. El término “reabsorbible” se utiliza en el presente documento para significar que las composiciones se degradarán o solubilizarán, cuando se administren directamente en un sitio diana del cuerpo de un paciente (y no estén protegidas dentro de un dispositivo de implante tal como un implante mamario), durante un período de tiempo de un año o menos, usualmente desde 1 día hasta 1 año, más usualmente desde 1 hasta 120 días, o desde 1 hasta 90 días, o desde 2 hasta 30 días, después de su aplicación inicial. Un protocolo para medir la resorción y la degradación se establece en el documento WO 98/08550.

El agente hemostático utilizado en las composiciones de la invención comprende una pluralidad de portadores y una pluralidad de péptidos de unión a fibrinógeno inmovilizados en cada portador. Sorprendentemente se ha encontrado que el agente hemostático es capaz de polimerizar fibrinógeno cuando está presente en una composición hemostática de la invención.

Un agente hemostático para uso en composiciones de la invención es capaz de polimerizar fibrinógeno, en ausencia de trombina, en solución acuosa. Cada molécula de fibrinógeno se puede unir al menos a dos de los péptidos de unión a fibrinógeno. Debido a que una pluralidad de péptidos de unión a fibrinógeno está inmovilizada en cada portador, las moléculas de fibrinógeno se ligan entre sí a través de los portadores. Se forman enlaces no covalentes entre las moléculas de fibrinógeno y los péptidos que se unen al fibrinógeno. En solución acuosa, se forma un hidrogel que comprende fibrinógeno polimerizado cuando el agente hemostático se pone en contacto con fibrinógeno.

El agente hemostático debe ser soluble en el líquido biocompatible, y en el plasma sanguíneo. El agente hemostático puede tener una solubilidad de al menos 10 mg por ml de solvente, por ejemplo 10-1000 mg/ml, 33-1000 mg/ml, o 33 100 mg/ml. El agente hemostático debe ser adecuado para administración en el lugar de una herida con sangrado. Los portadores pueden comprender un polímero, por ejemplo una proteína, un polisacárido, o un polímero biocompatible sintético, tal como polietilenglicol, o una combinación de cualquiera de estos. La albúmina es un ejemplo de portador de proteína. En realizaciones preferidas, los péptidos de unión a fibrinógeno se inmovilizan covalentemente a los portadores.

En algunas realizaciones, el agente hemostático soluble es un agente soluble para la formación de un biogel como se describe en el documento WO 2008/065388. El documento WO 2008/065388 describe la formación de un biogel utilizando un agente que comprende varios péptidos de unión a fibrinógeno (cada uno de los cuales comprende la secuencia del péptido de unión a fibrinógeno GPRP- en el extremo de terminal amino del péptido) conjugados con un portador de albúmina sérica humana (HSA) soluble.

De acuerdo con la invención, cada portador del agente hemostático comprende un núcleo ramificado, y una pluralidad de péptidos de unión a fibrinógeno adheridos covalentemente por separado a cada núcleo ramificado. Por ejemplo, el agente hemostático puede ser un dendrímero de péptido que comprende un núcleo ramificado, y una pluralidad de péptidos de unión a fibrinógeno adheridos covalentemente por separado al núcleo ramificado.

El núcleo ramificado comprende:

desde dos hasta diez residuos de aminoácidos multifuncionales, en el que cada péptido de unión a fibrinógeno se adhiere covalentemente por separado a un residuo de aminoácido multifuncional del núcleo ramificado;

una pluralidad de residuos de aminoácidos multifuncionales, en la que uno o más péptidos de unión a fibrinógeno se adhieren covalentemente por separado a cada uno de al menos dos residuos de aminoácidos multifuncionales adyacentes del núcleo ramificado;

una pluralidad de residuos de aminoácidos multifuncionales, en la que dos o más péptidos de unión a fibrinógeno se adhieren covalentemente por separado a al menos uno de los residuos de aminoácidos multifuncionales del núcleo ramificado; o

una pluralidad de residuos de aminoácidos multifuncionales, en la que dos o más residuos de aminoácidos multifuncionales se ligan covalentemente a través de una cadena lateral de un residuo de aminoácido multifuncional adyacente;

en el que los residuos de aminoácidos multifuncionales comprenden residuos de aminoácidos tri- o tetrafuncionales, o residuos de aminoácidos tri- y tetrafuncionales.

Cada péptido de unión a fibrinógeno tiene un punto diferente de adhesión al núcleo ramificado, por lo que en el presente documento se hace referencia a los péptidos de unión a fibrinógeno como “adheridos covalentemente por separado” al núcleo ramificado.

El núcleo ramificado comprende cualquier secuencia de aminoácidos adecuada. El núcleo ramificado puede comprender hasta diez residuos de aminoácidos multifuncionales, por ejemplo de dos a diez, o de dos a seis residuos de aminoácidos multifuncionales.

El núcleo ramificado puede comprender una pluralidad de residuos de aminoácidos multifuncionales consecutivos. El núcleo ramificado puede comprender hasta diez residuos de aminoácidos multifuncionales consecutivos.

El término “aminoácido trifuncional” se utiliza en el presente documento para referirse a cualquier compuesto orgánico con un primer grupo funcional que es una amina (-NH<2>), un segundo grupo funcional que es un ácido carboxílico (-COOH), y un tercer grupo funcional. El término “aminoácido tetrafuncional” se utiliza en el presente documento para referirse a cualquier compuesto orgánico con un primer grupo funcional que es una amina (-NH<2>), un segundo grupo funcional que es un ácido carboxílico (-COOH), un tercer grupo funcional, y un cuarto grupo funcional. El tercer y cuarto grupo funcional puede ser cualquier grupo funcional que sea capaz de reaccionar con un extremo de terminal carboxi de un péptido de unión a fibrinógeno, o con un grupo funcional de un ligador adherido al extremo de terminal carboxi de un péptido de unión a fibrinógeno.

Los aminoácidos multifuncionales pueden comprender un átomo de carbono central (a- o 2-) que lleva un grupo amino, un grupo carboxilo, y una cadena lateral que lleva un grupo funcional adicional (proporcionando de esta manera un aminoácido trifuncional), o dos aminoácidos funcionales adicionales (proporcionando de esta manera un aminoácido tetrafuncional.

El o cada uno de los residuos de aminoácido multifuncional, o cada uno de ellos, puede ser un residuo de un aminoácido multifuncional proteinógeno o no proteinógeno, o un residuo de un aminoácido multifuncional natural o no natural.

Los aminoácidos trifuncionales proteinógenos poseen un átomo de carbono central (a- o 2-) que lleva un grupo amino, un grupo carboxilo, una cadena lateral y una conformación levo de a-hidrógeno. Ejemplos de aminoácidos proteinógenos trifuncionales adecuados incluyen L-lisina, L-arginina, ácido L-aspártico, ácido L-glutámico, L-asparagina, L-glutamina, y L-cisteína.

Ejemplos de residuos de aminoácidos no proteinógenos trifuncionales adecuados incluyen residuos de D-lisina, betalisina, L-ornitina, D-ornitina y D-arginina.

Por lo tanto, ejemplos de residuos de aminoácidos trifuncionales adecuados para uso en el agente hemostático de las composiciones de la invención incluyen residuos de lisina, ornitina, arginina, ácido aspártico, ácido glutámico, asparagina, glutamina, y cisteína, tales como residuos de L-lisina, D-lisina, beta-lisina, L-ornitina, D-ornitina, L-arginina, D-arginina, ácido L-aspártico, ácido D-aspártico, ácido L-glutámico, ácido D-glutámico, L-asparagina, D-asparagina, L-glutamina, D-glutamina, L-cisteína, y D-cisteína.

Ejemplos de aminoácidos no naturales multifuncionales adecuados para uso en el agente hemostático de las composiciones de la invención incluyen Citrulina, ácido 2,4-diaminoisobutírico, ácido 2,2'-diaminopimélico, ácido 2,3-diaminopropiónico y cis-4-amino-L-prolina. Los aminoácidos no naturales multifuncionales están disponibles de Sigma-Aldrich.

En algunas realizaciones, el núcleo ramificado puede comprender una secuencia de aminoácidos multifuncional homopolimérica, por ejemplo una secuencia de polilisina, poliarginina, o poliornitina, tal como un núcleo ramificado que comprende desde dos hasta diez, o desde dos hasta seis, residuos consecutivos de lisina, arginina, u ornitina. En otras realizaciones, el núcleo ramificado puede comprender diferentes residuos de aminoácidos multifuncionales, por ejemplo uno o más residuos de lisina, uno o más residuos de arginina, y/o uno o más residuos de ornitina.

En otras realizaciones, el núcleo ramificado puede comprender una pluralidad de residuos de aminoácidos multifuncionales, y uno o más residuos de aminoácidos diferentes.

Cuando el núcleo ramificado comprende una pluralidad de residuos de aminoácidos multifuncionales, los residuos de aminoácidos multifuncionales adyacentes se pueden ligar entre sí mediante enlaces de cadenas laterales de aminoácidos, mediante enlaces de péptido, o algunos residuos de aminoácidos multifuncionales adyacentes se pueden ligar entre sí por enlaces de cadenas laterales y otros por enlaces de péptidos.

En realizaciones adicionales, el núcleo ramificado puede comprender dos o más residuos de aminoácidos multifuncionales, y al menos un péptido de unión a fibrinógeno se adhiere por separado a cada uno de dos o más de los residuos de aminoácidos multifuncionales, y dos o más residuos péptidos de unión a fibrinógeno se adhieren por separado a al menos uno de los residuos de aminoácidos multifuncionales del núcleo ramificado.

De acuerdo con otras realizaciones, dos péptidos de unión a fibrinógeno se adhieren por separado a un residuo de aminoácido multifuncional terminal del núcleo ramificado.

Ejemplos de estructuras de dendrímeros de péptido adecuados para uso como agentes hemostáticos en composiciones de la invención incluyen dendrímeros de péptido en los que:

• el núcleo ramificado comprende un primer residuo de aminoácido trifuncional al que se adhieren dos péptidos de unión a fibrinógeno, y un segundo residuo de aminoácido trifuncional al que se adhiere un péptido de unión a fibrinógeno;

• el núcleo ramificado comprende un primer residuo de aminoácido trifuncional al que se adhieren dos péptidos de unión a fibrinógeno, y un segundo residuo de aminoácido trifuncional al que se adhieren dos péptidos de unión a fibrinógeno;

• el núcleo ramificado comprende un primer residuo de aminoácido trifuncional al que se adhieren dos péptidos de unión a fibrinógeno, un segundo residuo de aminoácido trifuncional al que se adhiere un péptido de unión a fibrinógeno y un tercer residuo de aminoácido trifuncional al que se adhiere un péptido de unión a fibrinógeno; o

• el núcleo ramificado comprende un primer residuo de aminoácido trifuncional al que se adhieren dos péptidos de unión a fibrinógeno, un segundo residuo de aminoácido trifuncional al que se adhiere un péptido de unión a fibrinógeno, un tercer residuo de aminoácido trifuncional al que se adhiere un péptido de unión a fibrinógeno y un cuarto residuo de aminoácido trifuncional al que se adhiere un péptido de unión a fibrinógeno.

Un dendrímero de péptido adecuado para uso como agente hemostático en una composición de la invención puede comprender la siguiente fórmula general (I):

FBP-(ligador)-X-(ligador)-Y

Z

(I)

en donde:

FBP es un péptido de unión a fibrinógeno;

-(ligador)- es un ligador opcional, preferiblemente un ligador no peptídico;

X es un residuo de aminoácido trifuncional, preferiblemente lisina, ornitina, o arginina;

Y es -FBP o -NH<2>;

Z es -(ligador)-FBP cuando Y es -FBP, o -[-Xn-(ligador)-FBP]a-(ligador)-FBP cuando Y es -NH<2>;

en donde:

Xn es un residuo de aminoácido trifuncional, preferiblemente lisina, L-ornitina, o arginina; y

a es 1-10, preferiblemente 1-3.

Por ejemplo, cuando Y es NH<2>, Z es -[-Xn-(ligador)-FBP]a-(ligador)-FBP, la estructura del dendrímero es la siguiente: en donde a es 1:

(ligador)-FBP

o, en donde a es 2:

FBP-(l¡gador)-X-(ligador)-NH2

I

X-(ligador)-FBP

I

X-(l¡gador)-FBP

I

(ligador)-FBP

o, en donde a es 3:

FBP-(ligador)-X-(l¡gador)-NH2

X-(l¡gador)-FBP

I

X-(ligador)-FBP

I

(ligador)-FBP

Alternativamente, Z es -[-Xn-(ligador)-FBP]a-(ligador)-FBP cuando Y es -FBP; en donde:

Xn es un residuo de aminoácido trifuncional, preferiblemente lisina, L-ornitina o arginina; y

a es 1-10, preferiblemente 1-3.

Por ejemplo, cuando Y es -FBP, Z es -[-Xn-(ligador)-FBP]a-(ligador)-FBP y a es 1, la estructura del dendrímero es la siguiente:

FBP-(|¡gador)-X-(l¡gador)-FBP

X-(ligador)-FBP

(ligador)-FBP

Un dendrímero de péptido adecuado para uso como agente hemostático en una composición de la invención puede comprender la siguiente fórmula general (II):

FBP-(ligador)-NH-CH-CO-(l¡gador)-Y

Z

(II)

en donde:

FBP es un péptido de unión a fibrinógeno;

-(ligador)- es un ligador opcional, que comprende preferiblemente -NH(CH<2>)sCO-;

Y es -FBP o -NH<2>;

Z es:

-R-(ligador)-FBP, cuando Y es -FBP, o

-R-COCHNH-(ligador)-FBP

R-(l¡gador)-FBP, cuando Y es -N H 2; o

-R-COCHNH-(l¡gador)-FBP

R-COCHNH-(ligador)-FBP

R-(l¡gador)-FBP, cuando Y es -N H 2;

o

-R-COCHNH-(l¡gador)-FBP

R-COCHNH-(|¡gador)-FBP

R-COCHNH-(l¡gador)-FBP

R-(ligador)-FBP, cuando Y es -N H 2;

en donde R es -(CH<2>)<4>NH-, -(CH<2>)aNH-, o -(CH<2>)aNHCNHNH-.

En consecuencia, en una realización, Z puede ser:

NH-(l¡gador)-FBP]a

-(ligador)-FBP, cuando Y es -NH2;

en donde R es -(CH<2>)<4>NH-, -(CH<2>)aNH-, o -(CH<2>)aNHCNHNH-;

donde a es 1-3.

Alternativamente, a puede ser 4-10 o puede ser 1-10.

En otra realización, Z es:

-[-R-COCHNH-(ligador)-FBP]a

R-(l¡gador)-FBP, cuando Y es-F B P ;

en donde R es -(CH<2>)<4>NH-, -(CH<2>)aNH-, o -(CH<2>)aNHCNHNH-;

en donde a es 1-10, preferiblemente 1-3.

Por ejemplo, Z es:

-R-COCHNH-(ligador)-FBP

I

R-(ligador)-FBP, cuando Y es -FBP y a es 1.

Un dendrímero de péptido adecuado para uso como agente hemostático en una composición de la invención puede comprender la siguiente fórmula general (III):

en donde:

FBP es un péptido de unión a fibrinógeno;

-(ligador)- es un ligador opcional, que comprende preferiblemente -NH(CH<2>)<5>CO-;

Y es -FBP o -NH<2>;

Z es:

-(CH<2>)<4>NH-(ligador)-FBP, cuando Y es -FBP; o

NH2; o

-(CH2)4NHCOCHNH-(ligador)-FBP

I

(CH2)4NHCOCHNH-(ligador)-FBP

I

(CH2)4NHCOCHNH-(ligador)-FBP

I

(CH2)4NH-(ligador)-FBP, cuando Y es -NH2.

En consecuencia, en una realización, Z puede ser:

NH-(ligador)-FBP]a

H2)4NH-(l¡gador)-FBP, cuando Y es -NH2;

en donde a es 1-3.

Alternativamente, a es 4-10, o puede ser 1-10.

En otra realización, Z es:

NH-(ligador)-FBP]a

H2)4NH-(|¡gador)-FBP,cuando Y es—FBP;

en donde a es 1-10, preferiblemente 1-3.

Por ejemplo, Z es:

-(C H 2)4NHCOCHNH-(ligador)-FBP

(C H 2)4NH-(l¡gador)-FBP, cuando Y es -FBP y a es 1.

Se puede utilizar cualquier péptido de unión a fibrinógeno (FBP) adecuado en un agente hemostático en una composición de la invención. Por ejemplo, un FBP puede ser capaz de unirse a una región de fibrinógeno que está unida naturalmente a la fibrina o a las glicoproteínas de la membrana plaquetaria GPIIb-IIIa. La unión de fibrina al fibrinógeno se discute en Mosesson et al. 2001, Ann. N.Y Acad. Sci., 936, 11-30. La unión de GPIIb-IIIa al fibrinógeno se discute en Bennett, 2001, Annals of NY Acad. Sci., 936, 340-354.

El término “péptido”, como se utiliza en el presente documento, también incorpora análogos de péptidos. El experto en la materia conoce varios análogos de péptidos. Se puede utilizar cualquier análogo adecuado siempre que el fibrinógeno sea capaz de unirse al péptido de unión a fibrinógeno.

Se proporcionan ejemplos de péptidos de unión a fibrinógeno adecuados y cómo se pueden identificar en os documentos WO 2005/035002, WO 2007/015107 y WO 2008/065388.

Ejemplos de secuencias de FBP adecuadas incluyen: GPR-; GPRP- (SEQ ID NO: 1); GPRV-(SEQ ID NO: 2); GPRPFPA- (SEQ ID NO: 3); GPRVVAA- (SEQ ID NO: 4); GPRPVVER-(SEQ ID NO: 5); GPRPAA- (SEQ ID NO: 6); GPRPPEC- (SEQ ID NO: 7); GPRPPER- (SEQ ID NO: 8); GPSPAA- (SEQ ID NO: 9); GHR-, GHRP- (SEQ ID NO: 10), GHRPY- (SEQ ID NO: 11), GHRPL- (SEQ ID NO: 12), GHRPY amida- (SEQ ID NO: 13); APFPRPG (SEQ ID NO: 14).

Un ejemplo preferido de un FBP comprende la secuencia de aminoácidos G(P,H)RX- (SEQ ID NO: 15) en su extremo de terminal amino, en donde X es cualquier aminoácido y (P,H) significa que en esa posición está presente prolina o histidina.

Los FBP adheridos a un portador pueden comprender la misma secuencia o una diferente. Cada uno de los FBP puede tener una longitud de 3-60, 3-30, o 3-10 residuos de aminoácidos.

En algunas realizaciones, cada péptido de unión a fibrinógeno se une al fibrinógeno con una constante de disociación (Kd) de entre 10'9 a 10'6 M, por ejemplo alrededor de 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 200, 250, 300, 350, 400, o más nM. Se prefiere una Kd de alrededor de 100 nM. La constante de disociación se puede medir en equilibrio. Por ejemplo, se puede incubar fibrinógeno radiomarcado de concentración conocida con microesferas a las que se ha entrecruzado la fracción de unión a fibrinógeno. Normalmente, 5 pM de péptido se reticulan con microesferas de 1 gm, o 15-40 pmoles de péptido se reticulan con 1 gm de microesferas. Las microesferas ligadas a péptidos se diluyen a 0.5 mg/ml y se incuban en tampón isotónico a pH 7.4 (por ejemplo tampón Hepes 0.01 M que contiene NaCl 0.15 M) con fibrinógeno radiomarcado en concentraciones de entre 0.05 y 0.5 mg/ml durante hasta 1 ha 20 °C. El fibrinógeno unido al péptido de unión a fibrinógeno en las microesferas se puede separar del fibrinógeno libre mediante centrifugación y medir la cantidad de fibrinógeno libre y unido. Luego, la constante de disociación se puede calcular mediante el análisis de Scatchard al graficar la concentración de fibrinógeno unido frente a la relación de las concentraciones de fibrinógeno unido: libre, en donde la pendiente de la curva representa Kd.

De acuerdo con algunas realizaciones, los péptidos de unión a fibrinógeno del agente hemostático, en particular dendrímeros de péptido, para uso en composiciones de la invención, se unen preferencialmente al agujero 'a' de fibrinógeno sobre el agujero 'b' de fibrinógeno. Ejemplos de secuencias de péptidos de unión a fibrinógeno adecuadas que se unen preferencialmente al agujero 'a' sobre el agujero 'b' de fibrinógeno incluyen: GPR-; GPRP- (SEQ ID NO: 1); GPRV- (SEQ ID NO: 2); GPRPFPA- (SEQ ID NO: 3); GPRVVAA- (SEQ ID NO: 4); GPRPVVER- (SEQ ID NO: 5); GPRPAA- (SEQ ID NO: 6); GPRPPEC- (SEQ ID NO: 7); GPRPPER- (SEQ ID NO: 8); GPSPAA- (SEQ ID NO: 9).

De acuerdo con otras realizaciones, los péptidos de unión a fibrinógeno del agente hemostático, en particular dendrímeros de péptido, para uso en composiciones de la invención, se unen preferencialmente al agujero 'b' de fibrinógeno sobre el agujero 'a' de fibrinógeno. Ejemplos de secuencias de péptidos de unión a fibrinógeno que se unen preferencialmente al agujero 'b' sobre el agujero 'a' del fibrinógeno incluyen: GHR-, GHRP- (SEQ ID NO: 10), GHRPY- (SEQ ID NO: 11), GHRPL- (SEQ ID NO: 12), GHRPYamida- (SEQ ID NO: 13).

Cada péptido de unión a fibrinógeno se puede, independientemente, adherir en su extremo de terminal carboxi (opcionalmente a través de un ligador) o en su extremo de terminal amino (opcionalmente a través de un ligador) al portador o al núcleo ramificado del dendrímero. Si el péptido de unión a fibrinógeno se adhiere en su extremo de terminal amino, el extremo de terminal carboxi del péptido puede comprender un grupo amida. La presencia de un grupo amida, en lugar de un grupo carboxilo (o un ion carboxilato cargado negativamente), en el extremo de terminal carboxi expuesto del péptido puede ayudar a optimizar la unión del péptido de unión al fibrinógeno al fibrinógeno.

En algunas realizaciones, cada péptido de unión a fibrinógeno se adhiere (opcionalmente a través de un ligador) en su extremo de terminal carboxi al portador o al núcleo ramificado del dendrímero. En otras realizaciones, al menos un péptido de unión a fibrinógeno se adhiere (opcionalmente a través de un ligador) en su extremo de terminal amino al portador, o al núcleo ramificado del dendrímero. Por ejemplo, al menos un péptido de unión a fibrinógeno que se une preferencialmente al agujero 'a' sobre el agujero 'b' de fibrinógeno, tal como un péptido que comprende la secuencia APFPRPG (SEQ ID NO: 14), puede estar unido (opcionalmente a través de un ligador) en su extremo de terminal amino al portador, o al núcleo ramificado del dendrímero.

Ventajosamente, un agente hemostático, o dendrímero de péptido comprende péptidos de unión a fibrinógeno de secuencia diferente (denominados en el presente documento agente hemostático, o dendrímero de péptido 'quimérico'). Por ejemplo, en algunas realizaciones un agente hemostático, o dendrímero de péptido comprende péptidos de unión a fibrinógeno que tienen diferente selectividad de unión al agujero 'a' que al agujero 'b' de fibrinógeno.

Un agente hemostático para uso en composiciones de la invención puede comprender una pluralidad de portadores, en el que cada portador tiene una pluralidad de péptidos de unión a fibrinógeno adheridas al portador, y en el que los péptidos de unión a fibrinógeno adheridos a los portadores comprenden péptidos de unión a fibrinógeno de secuencia diferente.

En algunas realizaciones, la pluralidad de portadores comprende una primera pluralidad de portadores y una segunda pluralidad de portadores, en la que los péptidos de unión a fibrinógeno adheridos a la primera pluralidad de portadores son de secuencia diferente a los péptidos de unión a fibrinógeno adheridos a la segunda pluralidad de portadores.

En otras realizaciones, cada portador tiene adheridos al mismo péptidos de unión a fibrinógeno de diferente secuencia.

En teoría, no existe un límite superior para el número de péptidos de unión a fibrinógeno por molécula portadora. Es probable que el número óptimo dependa de muchos factores, tales como la naturaleza del portador y el número de grupos reactivos en cada portador para adherir los péptidos de unión a fibrinógeno. Sin embargo, se prefiere que en promedio haya hasta 100 péptidos de unión a fibrinógeno por molécula portadora. Preferiblemente, en promedio existen al menos tres, preferiblemente al menos cuatro o cinco péptidos de unión a fibrinógeno por molécula portadora. Un rango preferido es de 10-20 péptidos de unión a fibrinógeno por molécula portadora.

Los portadores pueden comprender grupos reactivos que permitan la adhesión de los péptidos de unión a fibrinógeno. Por ejemplo, los portadores pueden comprender fracciones tiol o fracciones amina sobre su superficie. Si los portadores son proteicos, las fracciones tiol o amina se pueden proporcionar mediante cadenas laterales de aminoácidos, por ejemplo cisteína o lisina. Alternativamente, se pueden agregar grupos reactivos al portador. Esto es particularmente ventajoso si el portador está formado a partir de proteínas, tales como albúmina. Por ejemplo, el portador se puede tiolar utilizando un reactivo tal como 2-iminotiolano (2-IT) que es capaz de reaccionar con grupos amina primaria en el portador. Alternativamente, la cistamina se puede acoplar a grupos carboxilo en el portador en presencia de clorhidrato de 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida (EDC) y N-hidroxisuccinimida (NHS), seguido de la escisión reductora del enlace disulfuro introducido.

En algunas realizaciones, los péptidos de unión a fibrinógeno se inmovilizan covalentemente al portador a través de un espaciador. Un espaciador preferido es un espaciador no peptídico, que comprende por ejemplo un polímero hidrófilo tal como polietilenglicol (PEG). En una realización preferida, una pluralidad de conjugados de péptido, cada uno de los cuales comprende un péptido de unión a fibrinógeno ligado a un grupo tiol reactivo (por ejemplo, un grupo maleimida) mediante un espaciador de PEG, se hace reaccionar con un portador tiolado (por ejemplo preparado utilizando 2-IT o cistamina como se describió anteriormente). Los espaciadores no peptídicos adecuados se describen en el documento WO 2013/114132.

Los péptidos de unión a fibrinógeno de diferente secuencia pueden comprender un primer péptido de unión a fibrinógeno que se une preferencialmente al agujero 'a' sobre el agujero 'b' de fibrinógeno, y un segundo péptido de unión a fibrinógeno que se une con mayor selectividad al agujero 'a' sobre el agujero 'b' de fibrinógeno que el primer péptido de unión a fibrinógeno. Se ha encontrado que los dendrímeros de péptido con dichas secuencias de péptidos de unión a fibrinógeno polimerizan el fibrinógeno rápidamente en un rango relativamente amplio de concentraciones de dendrímero de péptido.

Por ejemplo, el primer péptido de unión a fibrinógeno puede comprender una secuencia de aminoácidos GPRP- (SEQ ID NO: 1) en su extremo de terminal amino, y/o el segundo péptido de unión a fibrinógeno puede comprender una secuencia de aminoácidos -APFPRPG (SEQ ID NO: 14) en su extremo de terminal carboxi, en donde los residuos de aminoácidos de las secuencias se indican en orden amino a carboxi, y “-” indica el extremo de la secuencia que está adherida al núcleo ramificado del dendrímero de péptido, o al portador. Un péptido de unión a fibrinógeno con la secuencia -APFPRPG (SEQ ID NO: 14) en su extremo de terminal carboxi se une con mayor selectividad al agujero 'a' sobre el agujero 'b' de fibrinógeno que un péptido de unión a fibrinógeno con la secuencia GPRP- (SEQ ID NO: 1) en su extremo de terminal amino.

En otras realizaciones, los péptidos de unión a fibrinógeno de diferente secuencia pueden comprender un primer péptido de unión a fibrinógeno que se une preferencialmente al agujero 'a' sobre el agujero 'b' de fibrinógeno, y un segundo péptido de unión a fibrinógeno que se une preferencialmente al agujero 'b' sobre el agujero 'a' de fibrinógeno. Se ha encontrado que los dendrímeros de péptido con dichas secuencias de péptidos de unión a fibrinógeno se polimerizan con fibrinógeno para formar hidrogeles relativamente densos en comparación con los dendrímeros de péptido equivalentes que contienen sólo péptidos de unión a fibrinógeno y que se unen preferencialmente al agujero 'a' sobre el agujero 'b' de fibrinógeno. Se considera que el aumento de densidad de los hidrogeles formados se debe a la unión de los péptidos de unión a fibrinógeno de los dendrímeros a los agujeros 'a' y 'b' de fibrinógeno, reforzando de esta manera la red de fibrinógeno polimerizado.

Por ejemplo, el primer péptido de unión a fibrinógeno puede comprender una secuencia de aminoácidos GPRP- (SEQ ID NO: 1) en su extremo de terminal amino y/o el segundo péptido de unión a fibrinógeno puede comprender una secuencia de aminoácidos GHRP- (SEQ ID NO: 10), o una secuencia de aminoácidos GHRPY- (SEQ ID NO: 11), en su extremo de terminal amino. Los péptidos de unión a fibrinógeno con la secuencia GPRP- (SEQ ID NO: 1) en el extremo de terminal amino se unen con cierta selectividad al agujero 'a' del fibrinógeno. Los péptidos de unión a fibrinógeno con la secuencia GHRP- (SEQ ID NO: 10), o GHRPY- (SEQ ID NO: 11), en el extremo de terminal amino se unen preferencialmente al agujero 'b' de fibrinógeno.

Uno o más, o cada uno, de los péptidos de unión a fibrinógeno, se pueden adherir covalentemente al portador de un agente hemostático, por ejemplo al núcleo ramificado de un dendrímero de péptido, mediante un ligadorno peptídico. El ligador puede ser cualquier ligador adecuado que no interfiera con la unión del fibrinógeno a los péptidos de unión al fibrinógeno. El ligador puede comprender un ligador flexible de cadena lineal, adecuadamente un grupo alquilo de cadena lineal. Dichos ligadores permiten que los péptidos de unión a fibrinógeno se alejen uno del otro. Por ejemplo, el ligador puede comprender un grupo -NH(CH<2>)nCO-, en donde n es cualquier número, adecuadamente 1-10, por ejemplo 5. Un ligador que comprende un grupo -NH(CH<2>)sCO- se puede formar mediante el uso de £-amino de ácido 6-aminohexanoico (£Ahx).

En teoría, no hay límite para el número total de péptidos de unión a fibrinógeno que pueden estar presentes en un dendrímero de péptido. Sin embargo, en la práctica, para cualquier estructura particular, el número de péptidos de unión a fibrinógeno se puede variar y probar para determinar el número óptimo para las propiedades de polimerización de fibrinógeno deseadas, por ejemplo, para la velocidad de polimerización de fibrinógeno o para la densidad del hidrogel producido por polimerización con fibrinógeno. Los dendrímeros de péptido pueden comprender en total hasta veinte péptidos de unión a fibrinógeno por dendrímero, por ejemplo hasta diez péptidos de unión a fibrinógeno por dendrímero, o hasta cinco péptidos de unión a fibrinógeno por dendrímero.

El Solicitante ha encontrado que, sorprendentemente, las mezclas de un dendrímero de péptido con un conjugado de péptido, que comprende dos o más péptidos de unión a fibrinógeno, son capaces de polimerizar el fibrinógeno más rápidamente que el dendrímero de péptido, o el conjugado de péptido solos.

De acuerdo con lo anterior, un agente hemostático para uso en composiciones de la invención puede comprender un dendrímero de péptido, y un conjugado de péptido que comprende dos o más péptidos de unión a fibrinógeno.

El conjugado de péptido puede comprender péptidos de unión a fibrinógeno de la misma secuencia, o de secuencia diferente. Por ejemplo, el conjugado de péptido puede comprender sólo péptidos de unión a fibrinógeno que se unen preferencialmente al agujero 'a' sobre el agujero 'b' de fibrinógeno, o sólo péptidos de unión a fibrinógeno que se unen preferencialmente al agujero 'b' sobre el agujero 'a' de fibrinógeno, o uno o más péptidos de unión a fibrinógeno que se unen preferencialmente al agujero 'a' sobre el agujero 'b' de fibrinógeno y uno o más péptidos de unión a fibrinógeno que se unen preferencialmente al agujero 'b' sobre el agujero 'a' de fibrinógeno.

El conjugado de péptido puede comprender un portador al que están adheridos los péptidos de unión a fibrinógeno. Un portador adecuado puede comprender uno o más residuos de aminoácidos, por ejemplo un único residuo de aminoácido, tal como un residuo de aminoácido de lisina. Una ventaja de los conjugados que comprenden portadores que comprenden uno o más residuos de aminoácidos es que se pueden preparar fácilmente utilizando métodos de síntesis de péptidos en fase sólida. Además, se pueden producir fácilmente sin el uso de agentes inmunogénicos y pueden ser resistentes a la esterilización.

Cada péptido de unión a fibrinógeno del conjugado de péptido se puede, independientemente, adherir en su extremo de terminal carboxi (opcionalmente a través de un ligador), o en su extremo de terminal amino (opcionalmente a través de un ligador), al portador. Si el péptido de unión a fibrinógeno está adherido en su extremo de terminal amino, el extremo de terminal carboxi del péptido puede comprender un grupo amida.

En un ejemplo, el conjugado de péptido puede tener la siguiente fórmula general:

FBP-(ligador)-X-(ligador)-FBP

en donde:

FBP es un péptido de unión a fibrinógeno;

-(ligador)- es un ligador opcional, preferiblemente un ligador no peptídico;

X es un aminoácido, preferiblemente un aminoácido multifuncional, lo más preferiblemente un residuo de aminoácido trifuncional, tal como lisina, ornitina, o arginina.

El conjugado de péptido puede ser un dendrímero. El dendrímero puede comprender un núcleo ramificado y una pluralidad de péptidos de unión a fibrinógeno adheridos covalentemente por separado al núcleo ramificado. El núcleo ramificado puede comprender uno o más aminoácidos multifuncionales. Cada aminoácido multifuncional, o una pluralidad de aminoácidos multifuncionales, puede tener uno o más péptidos de unión a fibrinógeno adheridos covalentemente a este. En algunas realizaciones, el conjugado de péptido puede ser un dendrímero de péptido como se definió anteriormente.

Los péptidos de unión a fibrinógeno de un dendrímero de péptido para uso en una composición de la invención se pueden unir preferencialmente al agujero 'a' de fibrinógeno sobre el agujero 'b' de fibrinógeno, y los péptidos de unión a fibrinógeno del conjugado de péptido se pueden unir preferencialmente al agujero 'b' de fibrinógeno sobre el agujero 'a' de fibrinógeno. Se ha encontrado que dichas composiciones tienen efectos sinérgicos porque son capaces de polimerizar el fibrinógeno más rápidamente que el dendrímero de péptido o el conjugado de péptido solo. El mecanismo de este efecto sinérgico no se comprende completamente, pero sin estar limitado por ninguna teoría, se considera que puede ocurrir porque la composición proporciona más sitios de polimerización de fibrinógeno 'A' y 'B'.

Alternativamente, los péptidos de unión a fibrinógeno de un dendrímero de péptido para uso en una composición de la invención se pueden unir preferencialmente al agujero 'b' de fibrinógeno sobre el agujero 'a' de fibrinógeno, y los péptidos de unión a fibrinógeno del conjugado de péptido se unen preferencialmente al agujero 'a' de fibrinógeno sobre el agujero 'b' de fibrinógeno.

Se apreciará que una ventaja particular de los agentes hemostáticos para uso en las composiciones de la invención es que se pueden sintetizar sin el uso de productos derivados de animales, minimizando de esta manera el riesgo de infección viral o priónica de dichos productos.

El líquido biocompatible utilizado para las composiciones de la invención puede ser un líquido acuoso o no acuoso, pero generalmente es un líquido acuoso. Los líquidos acuosos pueden incluir soluciones acuosas biocompatibles, tales como una solución acuosa de cloruro de calcio o cloruro de sodio. Generalmente, el líquido biocompatible estará cerca del pH fisiológico, por ejemplo en el rango de pH 6.0-7.5, por ejemplo, pH 7.3-7.5 o pH 7.35-7.45.

El líquido biocompatible puede comprender un tampón, por ejemplo un tampón fosfato, HEPES o Tris, tal como tampón fosfato 10-150 mM, tampón HEPES 10-150 mM o, tampón Tris 10-150 mM.

La cantidad y el diámetro promedio de las partículas contenidas en una composición de la invención, y las cantidades relativas del agente hemostático, líquido biocompatible, y partículas insolubles, son eficaces para proporcionar a la composición propiedades físicas y hemostáticas, como se describe a continuación.

De acuerdo con determinadas realizaciones, las partículas de la composición tienen dimensiones y otras propiedades físicas que potencian la fluidez de la composición (por ejemplo, la capacidad de extruirse a través de una jeringa) y la capacidad de la composición para fluir y adaptarse a sitios sobre o en tejido, que incluyen superficies de tejido y cavidades definidas, tales como espacios intravertebrales, hendiduras de tejido, agujeros o bolsas.

Las composiciones de la invención pueden estar parcialmente hidratadas o completamente hidratadas y pueden exhibir un grado de hinchamiento, por ejemplo del 0 % al 100 %, dependiendo del grado de hidratación.

Los rangos de tamaño de ejemplo y preferidos para partículas parcial o totalmente hidratadas son los siguientes:

Tamaño de partícula:

Las composiciones de la invención usualmente estarán en forma parcial o totalmente hidratada. Un polvo seco (que tiene un contenido de humedad inferior al 20 % en peso) que comprende partículas del polisacárido puede ser útil como material de partida para la preparación de una composición de la invención. Las composiciones parcialmente hidratadas de la invención, que normalmente tienen de 50 % a 80 % de hidratación, son útiles para aplicaciones en las que se desea que la composición se hinche aún más tras la aplicación en un sitio diana húmedo, por ejemplo, una hendidura de tejido. Las composiciones completamente hidratadas son útiles para aplicaciones donde no se desea hinchamiento en el sitio, tal como en la columna vertebral y otras áreas donde están presentes nervios y otras estructuras sensibles.

“Sitio diana” es el lugar al que se suministrará una composición de la invención. El sitio diana puede ser un sitio que esté sangrando, o haya estado sangrando anteriormente, como resultado de una lesión o un procedimiento quirúrgico. Usualmente, el sitio diana será la ubicación del tejido de interés, pero en algunos casos la composición se puede administrar en una ubicación cercana a la ubicación de interés, por ejemplo cuando el material se hincha en el lugar para cubrir la ubicación de interés.

Las dimensiones de las partículas se pueden conseguir de diversas formas. Por ejemplo, un material de partida que comprende el polisacárido se puede romper (1) antes o después de la reticulación del material de partida de polisacárido o (2) antes o después de la hidratación de un material de partida de polisacárido reticulado o no reticulado, por ejemplo como un material total o parcialmente hidratado o como un polvo en partículas seco. El término “seco” se utiliza en el presente documento para significar que el contenido de humedad es suficientemente bajo, normalmente por debajo del 20 % en peso de agua, de tal manera que el polvo fluya libremente y las partículas individuales no se agreguen. El término “hidratado” se utiliza en el presente documento para significar que el contenido de humedad es suficientemente alto, normalmente por encima del 50 % del nivel de hidratación de equilibrio, usualmente en el rango de 80 % a 95 % del nivel de hidratación de equilibrio.

Se puede preferir la ruptura mecánica del material de partida en estado seco en los casos en los que se desea controlar el tamaño de partícula y/o la distribución del tamaño de partícula. Puede ser más fácil controlar la pulverización de las partículas secas que la composición hidratada y, por tanto el tamaño de las partículas reducidas resultantes es más fácil de ajustar. Por el contrario, la ruptura mecánica de un material hidratado es generalmente más sencilla e implica menos etapas que la pulverización de un material de partida polimérico seco. Por tanto, se puede preferir la ruptura de un material hidratado cuando el tamaño final de partícula y/o la distribución de tamaño no son críticos.

Una composición de la presente invención se puede romper mecánicamente en el momento en que se suministra a un sitio diana mediante extrusión a través de un orificio u otra restricción de flujo, o se puede romper mecánicamente antes de suministrar a un sitio diana. Alternativamente, una composición de la invención se puede romper mecánicamente antes de uso o suministro final. La reticulación molecular de las cadenas de polisacáridos se puede realizar antes o después de la ruptura mecánica. El propósito principal de la etapa de ruptura mecánica es crear múltiples partículas que tengan un tamaño que permita que la composición se adapte y llene el espacio al que se va a suministrar. Otro propósito de la ruptura mecánica es facilitar el paso de la composición a través de tubos, cánulas y/u otros aplicadores de pequeño diámetro hasta el sitio diana. Cuando la composición se rompe antes de uso, se puede aplicar o administrar mediante técnicas distintas a la extrusión, por ejemplo utilizando una espátula o una cuchara.

En algunas realizaciones, el polisacárido se puede preparar inicialmente (por ejemplo, mediante secado por pulverización) y/o romper mecánicamente antes de reticularse, a menudo usualmente antes de la hidratación. El polisacárido se puede proporcionar como un sólido seco finamente dividido o en polvo que se puede romper mediante una pulverización adicional para proporcionar partículas que tienen un tamaño deseado, usualmente confinadas estrechamente dentro de un pequeño rango. También se pueden realizar etapas adicionales de selección y modificación del tamaño, tales como tamizado, o clasificación ciclónica. Para materiales de ejemplo, el tamaño de partícula seca puede estar en el rango de 10-1500 pm o de 50-1000 pm. Una distribución de tamaño de partícula de ejemplo es tal que más del 95 % en peso de las partículas están en el rango de 50-700 pm.

Los métodos para pulverizar el material de partida polimérico incluyen homogeneización, trituración, coacervación, molienda y molienda por chorro. Los materiales de partida de polisacáridos en polvo también se pueden formar mediante secado por pulverización. La distribución del tamaño de partículas se puede controlar y refinar aún más mediante técnicas convencionales tales como tamizado, agregación o trituración adicional. El sólido en polvo seco luego se puede suspender en un tampón acuoso y reticular. En otros casos, el polisacárido se puede suspender en un tampón acuoso, reticular y después secarse. Luego se puede romper el polisacárido seco reticulado, y resuspender posteriormente el material roto en un tampón acuoso.

En un proceso de producción de ejemplo, un material de partida de polisacárido no reticulado, seco, se rompe mecánicamente mediante una operación unitaria convencional, tal como homogeneización, trituración, coacervación o molienda. El polvo se rompe lo suficiente como para lograr tamaños de partículas secas que producen tamaños de partículas en los rangos deseados cuando el producto está parcial o totalmente hidratado. La relación entre el tamaño de partícula seca y el tamaño de la subunidad completamente hidratada dependerá de la hinchabilidad del material, como se discute a continuación.

Alternativamente, se puede formar un material de partida de polisacárido en partículas mediante secado por pulverización. Los procesos de secado por pulverización se basan en hacer fluir una solución a través de un pequeño orificio, tal como una boquilla, para formar gotitas que se liberan en una corriente de gas en contracorriente o en paralelo, normalmente una corriente de gas calentada. El gas evapora el solvente del material de partida líquido, que puede ser una solución, o una dispersión. El uso de secado por pulverización para formar un material de partida en polvo seco es una alternativa a la ruptura mecánica del material de partida. La operación de secado por pulverización normalmente producirá un producto en polvo seco no reticulado con un tamaño de partícula muy uniforme. Las partículas luego se pueden reticular, como se describe a continuación.

En muchos casos, la ruptura mecánica se puede controlar lo suficiente como para obtener tanto el tamaño de partícula como la distribución del tamaño de partícula dentro de un rango deseado. Sin embargo, en otros casos, donde se requieren distribuciones de tamaño de partícula más precisas, el material fragmentado se puede tratar o seleccionar adicionalmente para proporcionar la distribución de tamaño de partícula deseada, por ejemplo mediante tamizado o agregación. El material de partida polimérico mecánicamente roto luego se puede reticular, como se describe con más detalle a continuación.

Cuando el tamaño de partícula de una composición de la invención es menos importante, un material de partida de polisacárido seco se puede hidratar, disolver o suspender en un tampón adecuado y reticular antes de la ruptura mecánica. La ruptura mecánica normalmente se logrará al hacer pasar el material a través de un orificio, donde el tamaño del orificio y la fuerza de extrusión determinan juntos el tamaño de partícula y la distribución del tamaño de partícula. Si bien este método suele ser operativamente más sencillo que la ruptura mecánica de partículas de polisacárido secas antes de la hidratación y la reticulación, la capacidad de controlar el tamaño de las partículas puede ser menos precisa.

En algunas realizaciones, una composición de la invención se puede empacar en una jeringa u otro aplicador antes de la ruptura mecánica de las partículas en la composición. Luego, los materiales se romperán mecánicamente a medida que se aplican a través de la jeringa al sitio diana del tejido. Alternativamente, un material de partida de polisacárido reticulado, sin romper, se puede almacenar en forma seca antes de uso. Luego, el material seco se puede cargar en una jeringa u otro aplicador adecuado, hidratar dentro del aplicador para formar una composición de la invención, y romper mecánicamente a medida que el material se suministra al sitio diana, de nuevo normalmente a través de un orificio o lumen tubular pequeño.

Se puede utilizar una variedad de polisacáridos naturales, semisintéticos o sintéticos biocompatibles para preparar las partículas utilizadas en las composiciones de la presente invención. Las partículas de polisacárido reticulado deberían ser sustancialmente insolubles en el líquido biocompatible elegido para la composición particular. De manera adecuada, las partículas tienen una solubilidad de menos de 10 mg de partícula por ml de líquido biocompatible, por ejemplo menos de 1 mg/ml o menos de 0.1 mg/ml. De acuerdo con algunas realizaciones, se utilizan partículas insolubles en agua que proporcionan actividad hemostática mecánica, química y/o biológica.

Los polisacáridos de ejemplo incluyen glucosaminoglicanos, derivados de almidón (por ejemplo, almidón oxidado), derivados de celulosa (por ejemplo, celulosa oxidada), derivados de hemicelulosa, xilano, agarosa, alginato, derivados de alginato (por ejemplo alginato oxidado), quitosano, quitina, y combinaciones de los mismos.

La reticulación del polisacárido se puede lograr de cualquier manera convencional. Por ejemplo, los polisacáridos se pueden reticular utilizando agentes de reticulación adecuados.

Las moléculas de polisacárido se pueden reticular utilizando agentes de reticulación bi o polifuncionales que se unen covalentemente a dos o más polisacáridos. Los agentes de reticulación bifuncionales de ejemplo incluyen aldehídos, epoxis, succinimidas, carbodiimidas, maleimidas, azidas, carbonatos, isocianatos, sulfona de divinilo (DVS), éter de 1,4-butanodiol diglicidil (BDDE), alcoholes, aminas, imidatos, anhídridos, diazoacetato, o aziridinas. Alternativamente, la reticulación se puede lograr al utilizar oxidantes u otros agentes, tales como peryodatos, que activan cadenas laterales o fracciones en el polisacárido de tal manera que puedan reaccionar con otras cadenas laterales o fracciones para formar enlaces de reticulación.

Normalmente, cada una de las moléculas de polisacárido del material de partida tendrá un peso molecular en el rango desde 10 kDa a 10,000 kDa, o de 25 kDa a 5,000 kDa. Normalmente, una molécula de polisacárido reticulada tendrá al menos un enlace con otra molécula de polisacárido, que a menudo tiene desde 1 hasta 5 enlaces, en donde el nivel real de reticulación se puede seleccionar para proporcionar una tasa deseada de biodegradabilidad.

El grado de reticulación del polisacárido tiene un efecto sobre varias propiedades funcionales de la composición, que incluye la capacidad de extrusión, capacidad de absorción de los fluidos biológicos circundantes, cohesividad, capacidad de llenar espacios, capacidad de hinchamiento y capacidad de adherirse al sitio del tejido. El grado de reticulación debe ser suficiente para que las partículas insolubles del polisacárido puedan resistir las condiciones de esterilización que se van a utilizar (por ejemplo, condiciones de esterilización con vapor o calor seco) para esterilizar una composición de la invención que comprende las partículas. El grado de reticulación se puede controlar al ajustar la concentración del agente de reticulación, cambiar las cantidades relativas de agente de reticulación y material de partida polisacárido, o variar las condiciones de reacción. Normalmente, el grado de reticulación se controla al ajustar la concentración del agente de reticulación.

En algunas realizaciones (por ejemplo, realizaciones con partículas que comprenden ácido hialurónico), el hinchamiento en equilibrio de las partículas puede variar desde el 0 % hasta 500 %, por ejemplo de 0 % a 100 %.

El hinchamiento en equilibrio se puede controlar al variar el grado de reticulación, lo que a su vez se logra al variar las condiciones de reticulación, tales como el tipo de método de reticulación, duración de la exposición de un agente de reticulación, concentración de un agente de reticulación y temperatura de reticulación. Los materiales que tienen diferentes valores de hinchamiento en equilibrio se comportan de manera diferente en diferentes aplicaciones. La capacidad de controlar la reticulación y el hinchamiento en equilibrio permite optimizar las composiciones de la presente invención para una variedad de usos.

Por “porcentaje de hinchamiento” se entiende el peso seco restado del peso húmedo, dividido por el peso seco y multiplicado por 100, donde el peso húmedo se mide después de que el agente humectante se ha eliminado lo más completamente posible del exterior del material, por ejemplo mediante filtración, y donde el peso seco se mide después de la exposición a una temperatura elevada durante un tiempo suficiente para evaporar el agente humectante, por ejemplo 2 horas a 120 °C. “Hinchamiento en equilibrio” se define como el porcentaje de hinchamiento en equilibrio después de que el material polisacárido se haya sumergido en un agente humectante durante un período de tiempo suficiente para que el contenido de agua se vuelva constante, normalmente de 18 a 24 horas.

Además del hinchamiento en equilibrio, también es importante controlar la hidratación de la composición inmediatamente antes de suministrar al sitio diana. Un material con 0 % de hidratación no estará hinchado. Un material con 100% de hidratación estará en su contenido de agua de equilibrio. La hidratación entre el 0% y el 100% corresponderá a un hinchamiento entre las cantidades mínima y máxima. Como cuestión práctica, muchos materiales secos, no hinchados tendrán cierto contenido de humedad residual, usualmente por debajo del 20 % en peso, más usualmente desde 8 % a 15 % en peso. Cuando se utiliza en el presente documento el término “seco”, especifica materiales que tienen un bajo contenido de humedad en los que las partículas individuales fluyen libremente y generalmente no se hinchan.

La hidratación se puede ajustar de forma muy sencilla, por ejemplo controlando la cantidad de líquido biocompatible (tal como un tampón acuoso) agregado a un material reticulado seco o parcialmente hidratado antes de uso. Usualmente, como mínimo, será deseable introducir suficiente tampón acuoso para permitir la extrusión a través de una jeringa u otro dispositivo de suministro. En otros casos, sin embargo, puede ser deseable utilizar una espátula u otro aplicador para suministrar materiales menos fluidos. El uso previsto también ayudará a determinar el grado de hidratación deseado. En los casos en los que se desea llenar o sellar una cavidad húmeda, generalmente es deseable emplear una composición parcialmente hidratada que se pueda hinchar y llenar la cavidad al absorber humedad del sitio diana. Por el contrario, se prefieren composiciones total o sustancialmente completamente hidratadas para aplicación en el cerebro, cerca de la columna vertebral y a sitios diana cercanos a los nervios y otras estructuras corporales sensibles que se podrían dañar por el hinchamiento posterior a la colocación. También es posible preparar las composiciones de la presente invención con un exceso de tampón, dando como resultado una composición de dos fases que tiene una fase completamente hidratada y una fase de tampón libre.

De acuerdo con algunas realizaciones de la invención, las partículas de polisacárido comprenden un glucosaminoglicano (GAG). Los GAG son grandes polisacáridos lineales construidos a partir de unidades repetidas de disacáridos cuyas configuraciones primarias contienen un aminoazúcar (ya sea GlcNAc o GalNAc) y un ácido urónico (ya sea ácido glucurónico y/o ácido idurónico). Un glucosaminoglicano adecuado para uso de acuerdo con la invención es el ácido hialurónico (H<a>), o una sal del mismo.

El HA está compuesto por residuos alternos de ácido p-D-(1^-3) glucurónico (GlcA) y p-D-(1^4)-N-acetilglucosamina (GlcNAc). El término “ácido hialurónico” se utiliza en la literatura para referirse a polisacáridos ácidos con diferentes pesos moleculares constituidos por residuos de los ácidos D-glucurónico y N-acetil-D-glucosamina, que se encuentran naturalmente en las superficies celulares, en las sustancias extracelulares básicas del tejido conjuntivo de los vertebrados, en el fluido sinovial de las articulaciones, en el fluido endobulbar del ojo, en el tejido del cordón umbilical humano y en la cresta de gallo. El término “ácido hialurónico” se utiliza en el presente documento para incluir mezclas de polisacáridos con diferentes pesos moleculares con residuos alternos de ácidos D-glucurónico y N-acetil-D-glucosamina. El ácido hialurónico también se conoce como hialuronano, hialuronato, o HA. Los términos hialuronano y ácido hialurónico se utilizan indistintamente en el presente documento.

El contenido de ácido hialurónico se puede determinar de acuerdo con el método del carbazol modificado (Bitter and Muir, 1962, Anal Biochem. 4: 330-334). El peso molecular promedio del ácido hialurónico se puede determinar utilizando métodos estándar en la técnica, tales como aquellos descritos por Ueno et al., 1988, Chem. Pharm. Bull.

36, 4971-4975; Wyatt, 1993, Anal. Chim. Acta 272: 1-40; y Wyatt Technologies, 1999, “Light Scattering University DAWN Course Manual” y “DAWN EOS Manual” Wyatt Technology Corporation, Santa Barbara, California.

El ácido hialurónico, o sal del mismo, puede tener un peso molecular de aproximadamente 10,000-10,000,000 Da, 25,000-5,000,000 Da, o 50,000-3,000,000 Da. En realizaciones particulares, el ácido hialurónico, o sal del mismo, tiene un peso molecular en el rango de entre 300,000 y 3,000,000 Da, 400,000 y 2,500,000 Da, 500,000 y 2,000,000 Da, o 600,000 y 1,800,000 Da. En otras realizaciones, el ácido hialurónico, o sal del mismo, tiene un peso molecular promedio bajo en el rango de entre 10,000 y 800,000 Da, 20,000 y 600,000 Da, 30,000 y 500,000 Da, 40,000 y 400,000 Da, o 50,000 y 300,000 Da.

Ejemplos de sales inorgánicas de ácido hialurónico incluyen hialuronato de sodio, hialuronato de potasio, hialuronato de amonio, hialuronato de calcio, hialuronato de magnesio, hialuronato de zinc, e hialuronato de cobalto.

Las crestas de gallo son una importante fuente comercial de ácido hialurónico. Los microorganismos son una fuente alternativa. Los documento 4,801,539 y EP 0,694,616 divulgan métodos de fermentación para preparar ácido hialurónico utilizando cepas deStreptococcus zooepidemicus.El documento WO 03/054163, describe la producción recombinante de ácido hialurónico o sales del mismo, por ejemplo, en un huésped deBacillusGram-positiva.

La patente estadounidense No 4,582,865 (Biomatrix Inc.) describe la preparación de geles reticulados de HA utilizando sulfona de divinilo (DVS) como agente de reticulación. La preparación de un HA reticulado o una sal del mismo utilizando un compuesto epoxi polifuncional se divulga en el documento EP 0 161 887 B1. Otros reactivos bi o polifuncionales que se han empleado para entrecruzar HA mediante ligamientos covalentes incluyen formaldehído (US 4,713,448, Biomatrix Inc.), poliaziridina (documento WO 03/089476 A1, Genzyme Corp.), L-aminoácidos o L-aminoésteres (documento WO 2004/067575, Biosphere S.PA.). También se han informado carbodiimidas para la reticulación de HA (documento U.S. 5,017,229, Genzyme Corp.; U.S. 6,013,679, Anika Research, Inc). Los ésteres totales o parciales reticulados de HA con un alcohol alifático, y las sales de dichos ésteres parciales con bases inorgánicas u orgánicas, se divulgan en el documento US 4,957,744.

Los agentes preferidos para reticular HA químicamente incluyen sulfona de divinilo (DVS), 1,2,7,8-diepoxioctano (DEO) y éter de 1,4-butanodiol diglicidilo (BDDE).

Los métodos para elaborar geles de HA reticulado adecuados para producir partículas para uso en las composiciones de la invención se describen en los documentos WO 2006/056204, US 2010/0035838, US 2010/0028437 y US 2005/0136122. La producción de partículas de hidrogel a base de HA también se describe en Sahiner & Jia, Turk J Chem 32 (2008), 397-409: “One-Step Synthesis of Hyaluronic Acid-Based (Sub)micron Hydrogel Particles: Process Optimization and Preliminary Characterization”.

Por ejemplo, el documento WO 2006/056204 describe un método para producir un hidrogel que comprende ácido hialurónico, o una sal del mismo, reticulado con sulfona de divinilo (DVS). El método comprende las etapas de: (a) proporcionar una solución alcalina de ácido hialurónico, o una sal del mismo; (b) agregar DVS a la solución de la etapa (a), mediante lo cual el ácido hialurónico, o una sal del mismo, se reticula con la DVS para formar un gel; y (c) tratar el gel de la etapa (b) con un tampón, en el que el gel se hincha y forma un hidrogel que comprende ácido hialurónico, o una sal del mismo, reticulado con DVS.

El ácido hialurónico, o una sal del mismo, puede tener un peso molecular medio de entre 100 y 3,000 kDa, por ejemplo entre 500 y 2,000 kDa, o entre 700 y 1,800 kDa. Se puede agregar DVS a la solución de la etapa (a) en una relación en peso de entre 1:1 y 100:1 de<h>A/DVS (peso seco), preferiblemente entre 2:1 y 50:1 de HA/DVS (peso seco), por ejemplo 2.5:1 a 8:1, o 5:1 HA/DVS (peso seco).

Se puede producir un hidrogel de HA reticulado adecuado utilizando la tecnología Hyasis Link de Novozyme para preparar geles de HA reticulado. Novozyme también ofrece Hyasis, un ácido hialurónico derivado deBacillus,obtenido a partir de un proceso de fabricación recombinante basado en la fermentación de una cepa bacteriana no patógenaBacillus subtilis.El proceso no utiliza materias primas de origen animal.

Se puede micronizar un hidrogel de HA reticulado, por ejemplo utilizando cualquiera de los métodos de ruptura mecánica descritos anteriormente, para proporcionar partículas de un tamaño adecuado para uso en las composiciones de la invención. En una realización particular, un hidrogel de HA reticulado se microniza al triturar, y reticular las partículas de hidrogel de HA de un tamaño adecuado que se seleccionan al tamizar el producto triturado.

Las partículas de hidrogel de HA reticulado adecuadas para uso de acuerdo con la invención tienen un diámetro medio (cuando están parcial o totalmente hidratadas) de aproximadamente 100-1500 pm, o 100-1000 pm. Un ejemplo son las partículas de hidrogel de HA reticulado que comprenden HA al 2.7% p/v; reticulación 5:1 de HA:DV<s>, con un tamaño promedio de partícula de hidrogel de aproximadamente 400 pm.

Una desventaja particular de los hemostáticos convencionales a base de gelatina es que la matriz de gelatina es opaca. Esto puede dificultar la visibilidad lo que dificulta la administración precisa en el sitio de la herida y la monitorización del grado de control del sangrado. El solicitante ha descubierto que la eliminación de burbujas de aire de una pasta que comprende partículas de polisacárido reticuladas, en particular una pasta acuosa que comprende partículas de hidrogel de HA reticuladas, por ejemplo mediante centrifugación de la pasta, reduce drásticamente su opacidad, y proporciona una pasta sustancialmente transparente. A través de la pasta transparente se puede observar el sangrado de una herida o de una línea de sutura. Esto permite al cirujano monitorizar la hemostasia de forma más eficaz e intervenir más rápidamente si es necesario.

De acuerdo con un aspecto adicional de la invención, se proporciona un método para reducir la opacidad de una composición que comprende partículas insolubles de un polisacárido biocompatible reticulado dispersas a través de una fase líquida biocompatible, que comprende centrifugar la composición para eliminar las burbujas de aire de la composición.

Se proporciona además una composición sustancialmente transparente que comprende partículas insolubles de un polisacárido biocompatible reticulado dispersas a través de una fase líquida biocompatible. La fase líquida puede ser proporcionada por un líquido biocompatible como se describió anteriormente.

Dichas composiciones transparentes se pueden utilizar en composiciones hemostáticas de la invención, proporcionando de esta manera una composición hemostática de la invención sustancialmente transparente. Por ejemplo, se puede formar una composición hemostática sustancialmente transparente de la invención al mezclar un agente hemostático soluble que comprende una pluralidad de portadores y una pluralidad de péptidos de unión a fibrinógeno inmovilizados en cada portador, con una composición sustancialmente transparente que comprende partículas insolubles de un polisacárido biocompatible reticulado adecuado para uso en hemostasia disperso a lo largo de una fase líquida biocompatible.

Alternativamente, se puede formar una composición hemostática de la invención sustancialmente transparente al eliminar las burbujas de aire de una composición hemostática de la invención. Las burbujas de aire se pueden eliminar de la composición hemostática mediante cualquier método adecuado, por ejemplo mediante centrifugación.

Además de acuerdo con la invención se proporciona una composición hemostática sustancialmente transparente que comprende un agente hemostático soluble que comprende: una pluralidad de portadores y una pluralidad de péptidos de unión a fibrinógeno inmovilizados en cada portador; un líquido biocompatible; y partículas de un polisacárido biocompatible reticulado adecuado para uso en hemostasia y que son insolubles en el líquido biocompatible.

Una composición de la invención se considera transparente si una sutura quirúrgica de 1 mm de diámetro o menos, por ejemplo al menos 0.5 mm, 0.4 mm, 0.3 mm, 0.2 mm o 0.1 mm de diámetro, es visible a través de un grosor de 3 mm de la composición.

Las composiciones de la invención pueden comprender además un excipiente o diluyente farmacéuticamente aceptable. Los excipientes y diluyentes farmacéuticamente aceptables adecuados son bien conocidos por el experto. Los excipientes y diluyentes farmacéuticamente aceptables incluyen aquellos adecuados para la administración tópica con una composición de la invención en el sitio de una herida. Los diluyentes o excipientes farmacéuticamente aceptables adecuados incluyen tampones, tales como tampones Tris-HCl, acetato, o fosfato, aditivos tales como detergentes o agentes solubilizantes (por ejemplo, Tween 80, polisorbato 80), antioxidantes (por ejemplo, ácido ascórbico, metabisulfito de sodio), conservantes (por ejemplo, metacresol, parabenos (metilo, propilo o butilo), clorobutanol, sales fenilmercúricas (por ejemplo, acetato, borato, nitrato), ácido sórbico, alcohol bencílico) y sustancias que aumentan el volumen (por ejemplo, lactosa, manitol), agentes de tonicidad (por ejemplo, azúcares, cloruro de sodio), compuestos poliméricos, tales como ácido poliláctico, ácido poliglicólico.

Las composiciones de la invención pueden incluir además aditivos para facilitar la preparación de la composición, potenciar las propiedades físicas y mecánicas, potenciar las propiedades hemostáticas de la composición o proporcionar propiedades antimicrobianas. Por ejemplo, las composiciones de la invención pueden comprender además cantidades eficaces de uno o más aditivos o compuestos, tales como componente(s) bioactivo(s) que se suministrarán al paciente, modificadores de la viscosidad, tales como carbohidratos y alcoholes, materiales para controlar la tasa de resorción, tensioactivos, antioxidantes, humectantes, agentes humectantes, lubricantes, espesantes, diluyentes, estabilizadores de irradiación (por ejemplo, eliminadores de radicales), plastificantes o estabilizadores. Por ejemplo, se puede agregar glicerol para potenciar la capacidad de extrusión o inyectabilidad de la composición. Cuando se utiliza, el glicerol puede estar presente en las composiciones desde aproximadamente 0 % hasta aproximadamente 20 %, o desde aproximadamente 1 % hasta aproximadamente 10 % o aproximadamente 5 %, en peso de glicerol, basado en el peso de la fase líquida.

Los componentes bioactivos de ejemplo incluyen, pero no se limitan a, proteínas, carbohidratos, ácidos nucleicos y moléculas biológicamente activas inorgánicas y orgánicas tales como enzimas, agentes antineoplásicos, agentes antimicrobianos, tales como agentes bacteriostáticos, agentes bactericidas, antibióticos, agentes antivirales, anestésicos locales, agentes antiinflamatorios, hormonas, agentes antiangiogénicos, anticuerpos, neurotransmisores, fármacos psicoactivos, fármacos que afectan a los órganos reproductivos y oligonucleótidos, tales como oligonucleótidos antisentido. Dichos componentes bioactivos normalmente estarán presentes en concentraciones relativamente bajas, normalmente por debajo del 10 % en peso de las composiciones, usualmente por debajo del 5 % en peso y, a menudo, por debajo del 1 % en peso.

Por “cantidad eficaz”, se entiende la cantidad necesaria para proporcionar a las composiciones aquellas propiedades para las que se agrega el aditivo. La cantidad eficaz también está limitada por la cantidad máxima que se puede agregar sin causar efectos biológicos perjudiciales.

El líquido biocompatible y las partículas de las composiciones de la invención normalmente están presentes en cantidades relativas eficaces para proporcionar una composición, por ejemplo una pasta, o suspensión, adecuada para uso para proporcionar hemostasia. En determinadas realizaciones, la relación en peso de partículas a líquido es desde aproximadamente 1: 1 a aproximadamente 1: 12, o desde aproximadamente 1: 3 a aproximadamente 1: 8 o aproximadamente 1: 5. Las composiciones de la presente invención normalmente tendrán un contenido de sólidos en el rango desde 1 % en peso hasta 70 % en peso, por ejemplo desde 5 % en peso hasta 20 % en peso, o desde 5 % en peso hasta 16 % en peso. Para composiciones que tienen un contenido de sólidos mayor, normalmente por encima del 16 % en peso, se puede incluir un plastificante en la composición, normalmente desde 0.1 % en peso hasta 30 % en peso, o desde 1%en peso hasta 5%en peso. Los plastificantes adecuados incluyen polietilenglicoles, sorbitol y glicerol.

También se proporciona un método para polimerizar fibrinógeno, que comprende poner en contacto fibrinógeno con una composición de la invención.

La concentración relativa de la composición y el fibrinógeno utilizado para la polimerización dependerá de la naturaleza de la composición, por ejemplo, cuántos péptidos de unión a fibrinógeno están presentes, y la secuencia de los péptidos de unión a fibrinógeno. El Solicitante ha observado tiempos de polimerización rápidos utilizando dendrímeros de péptido en concentraciones que varían desde 0.005 mg/ml hasta 2 mg/ml con niveles fisiológicos de fibrinógeno (3 mg/ml).

Para algunos dendrímeros de péptido, a medida que aumenta la concentración del dendrímero, se reduce la velocidad de polimerización del fibrinógeno (es decir, el “tiempo de coagulación”). Sin esta limitado por ninguna teoría, se considera que esto se debe a la saturación de los huecos 'a' y/o 'b' de las moléculas de fibrinógeno por los péptidos de unión a fibrinógeno del dendrímero. En estas concentraciones más altas de dendrímero, hay un exceso de péptidos de unión a fibrinógeno que compiten por los agujeros de unión de fibrinógeno libres (es decir, por los agujeros 'a' y/o 'b' vacíos), y se considera que esta competencia reduce la tas a la que tiene lugar la polimerización.

También se proporciona un kit para tratar sangrado, que comprende una composición de la invención, y, por separado, fibrinógeno.

La composición puede polimerizar el fibrinógeno endógeno (es decir huésped) presente en el sitio diana. En algunas realizaciones, se puede administrar fibrinógeno exógeno así como la composición de la invención al sitio diana.

El término “fibrinógeno” se utiliza en el presente documento para incluir fibrinógeno natural, fibrinógeno recombinante o un derivado de fibrinógeno que se puede convertir mediante trombina para formar fibrina (por ejemplo, monómero de fibrina natural o recombinante, o un derivado de monómero de fibrina que puede o puede no ser capaz de ensamblarse espontáneamente). El fibrinógeno debería poder unirse al menos a dos péptidos de unión a fibrinógeno. El fibrinógeno se puede obtener de cualquier fuente, y de cualquier especie (que incluye el fibrinógeno bovino), pero es preferiblemente fibrinógeno humano. El fibrinógeno humano se puede obtener de sangre autóloga o de donante. Se prefiere el fibrinógeno autólogo, o fibrinógeno recombinante, porque reduce el riesgo de infección cuando se administra a un sujeto.

Una cantidad adecuada de una composición de la invención para administración a un sujeto humano dependerá, por ejemplo, del tipo de agente hemostático, por ejemplo cuántos péptidos de unión a fibrinógeno están presentes por molécula portadora, y del tipo y tamaño de la herida o sitio de sangrado. Sin embargo, una cantidad típica del agente hemostático es de 0.1 ml a 50 ml, por ejemplo de 0.1 ml a 5 ml, de 1 a 50 ml o de 1 a 5 ml, de una composición que contiene el agente hemostático en una concentración de 0.005 a 25 mg/ml, por ejemplo 0.01 a 10 mg/ml.

Una cantidad adecuada de fibrinógeno exógeno para administración a un sujeto humano es desde 0.1 mg hasta 120 mg, por ejemplo desde 3 mg hasta 120 mg.

Las composiciones de la invención tienen varias ventajas importantes. En particular, en determinadas realizaciones, el agente hemostático se puede fabricar fácilmente utilizando procedimientos convencionales de síntesis de péptidos en fase sólida. Esto minimiza el riesgo de infección viral o priónica por dichos productos. En concentraciones óptimas, el agente hemostático de las composiciones de la invención puede polimerizar el fibrinógeno, en ausencia de trombina, en menos de un segundo. El agente hemostático de las composiciones de la invención también puede polimerizar fibrinógeno en plasma humano en menos de un segundo.

La estructura de un agente hemostático para uso en una composición de la invención se puede seleccionar de manera que se optimicen sus propiedades para el uso previsto de la composición. Por ejemplo, un dendrímero de péptido que comprende cinco péptidos de unión a fibrinógeno de la misma secuencia que se unen preferencialmente al agujero 'a' de fibrinógeno es capaz de polimerizar el fibrinógeno casi instantáneamente. Por el contrario, un dendrímero de péptido 'quimérico' con uno o más péptidos de unión a fibrinógeno que se unen preferencialmente al agujero 'a' de fibrinógeno, y uno o más péptidos de unión a fibrinógeno diferentes que se unen preferencialmente al agujero 'b' del fibrinógeno, puede polimerizar el fibrinógeno más lentamente, pero forma hidrogeles de mayor densidad y tamaño.

Se ha encontrado que los agentes hemostáticos en las composiciones de la invención (especialmente composiciones de la invención en las que el líquido biocompatible es un líquido acuoso) son sorprendentemente resistentes a la esterilización, particularmente a la esterilización con vapor y a la esterilización por calor seco. En consecuencia, las composiciones de la invención se pueden esterilizar utilizando métodos de esterilización convencionales sin una pérdida significativa de actividad hemostática, especialmente sin una pérdida significativa de la capacidad del agente hemostático de la composición para polimerizar con fibrinógeno. Esta es una ventaja importante porque permite que las composiciones se proporcionen como composiciones hemostáticas fluidas, hidratadas, estériles, listas para uso.

Las composiciones se pueden preparar mucho antes del momento de uso, manteniendo al mismo tiempo la actividad hemostática, incluso después de ser sometidas a esterilización por calor o vapor.

Como se utiliza en el presente documento, “estéril” significa sustancialmente libre de gérmenes y/o microorganismos viables y como se reconoce y describe adicionalmente en los estándares gubernamentales relacionadas con las composiciones y dispositivos médicos descritos y reivindicados en el presente documento.

Los métodos convencionales adecuados de esterilización incluyen utilizar vapor saturado bajo presión (“esterilización con vapor”), o esterilización por calor seco.

La exposición de microorganismos a vapor saturado bajo presión en un autoclave provoca una desnaturalización irreversible de enzimas y proteínas estructurales. Un autoclave es una cámara de presión utilizada para la esterilización al someter el contenido del autoclave a vapor saturado a alta presión, por ejemplo a 121 °C (249 °F) durante alrededor de 15 a 20 minutos. La temperatura a la que se produce la desnaturalización varía inversamente con la cantidad de agua presente. Se debe evacuar el aire del autoclave antes de la entrada de vapor. Este método es particularmente adecuado para preparaciones acuosas y para apósitos quirúrgicos y dispositivos médicos.

De acuerdo con la invención, se proporciona un método para esterilizar una composición de la invención, que comprende exponer la composición a vapor saturado bajo presión, bajo condiciones de tiempo, temperatura y presión que sean eficaces para esterilizar la composición. Las condiciones adecuadas para la esterilización utilizando vapor saturado a presión en un autoclave son: al menos 15 minutos a 121-124 °C (200 kPa), al menos 10 minutos a 126 129 °C (250 kPa), o al menos 5 minutos a 134-138 °C (300 kPa).

En los procesos de esterilización por calor seco, se considera que el principal proceso letal es la oxidación de los constituyentes celulares. La esterilización por calor seco requiere una temperatura más alta que el calor húmedo y un tiempo de exposición más prolongado. Por lo tanto, el método es más conveniente para materiales no acuosos, termoestables que no se pueden esterilizar con vapor debido a sus efectos nocivos o su falta de penetración.

De acuerdo con la invención, se proporciona un método para esterilizar una composición de la invención, que comprende exponer la composición a calor seco, bajo condiciones de tiempo y temperatura que sean eficaces para esterilizar la composición. Las temperaturas y tiempos adecuados para la esterilización por calor seco son: 160 °C durante 180 minutos, 170 °C durante 60 minutos o 180 °C durante 30 minutos. Pueden ser necesarias otras condiciones para diferentes preparaciones para asegurar la eliminación eficaz de todos los microorganismos indeseables. Normalmente, el horno debe estar equipado con un sistema de aire forzado para garantizar una distribución uniforme del calor entre todos los materiales procesados.

De acuerdo con la invención también se proporciona una composición de la invención, que es estéril. Las composiciones estériles de la invención pueden haberse esterilizado mediante cualquier método adecuado, más adecuadamente mediante esterilización con vapor o esterilización con calor seco.

El solicitante ha encontrado que los agentes hemostáticos para uso en composiciones de la invención conservan la capacidad de polimerizar fibrinógeno después de la esterilización en un autoclave durante 25 minutos a 121 °C, y permanecen estables cuando se almacenan durante al menos trece semanas a 40 °C. El solicitante también ha encontrado que las composiciones de la invención conservan la capacidad de polimerizar fibrinógeno después de la esterilización en un autoclave durante 25 minutos a 121 °C, y permanecen estables cuando se almacenan durante al menos dos semanas a 40 °C. La temperatura de almacenamiento de 40 °C se utiliza para estudios de estabilidad acelerada, y predice el almacenamiento durante períodos más largos a temperaturas que normalmente prevalecen durante el almacenamiento de productos farmacéuticos, por ejemplo temperatura ambiente o de refrigerador.

Las composiciones de la invención se pueden proporcionar ventajosamente como formulaciones fluidas, estériles, listas para uso. Dichas composiciones se pueden proporcionar en un aplicador adecuado para la administración de la composición a un sitio diana.

Las composiciones de la invención se pueden aplicar utilizando un aplicador, tal como una jeringa, una espátula, un cepillo, un pulverizador, manualmente mediante presión o mediante cualquier otra técnica convencional. Usualmente, las composiciones se aplicarán utilizando una jeringa o aplicador similar capaz de extruir la composición a través de un orificio, abertura, aguja, tubo u otro conducto para formar una perla, capa o porción similar de material. Se puede producir una ruptura mecánica de la composición cuando la composición se extruye a través de un agujero en la jeringa u otro aplicador, que normalmente tiene un tamaño en el rango desde 0.01 mm hasta 5.0 mm, preferiblemente de 0.5 mm a 2.5 mm. Sin embargo, normalmente, las partículas en la composición se habrán preparado a partir de un polvo que tiene un tamaño de partícula deseado (que tras la hidratación produce partículas del tamaño requerido), o se romperán mecánicamente parcial o totalmente al tamaño requerido antes de una extrusión final u otra etapa de aplicación.

Los dispositivos médicos en los que se puede utilizar una composición hemostática de la presente invención incluyen cualquier dispositivo adecuado para aplicar una pasta hemostática fluida o inyectable a un sitio diana que requiere hemostasia. Ejemplos de dispositivos o aplicadores incluyen jeringas, tales como jeringas luer Becton Dickinson o Monoject. Otros dispositivos adecuados se describen en detalle en Patente de Estados Unidos No. 6,045,570.

Las composiciones se pueden aplicar con diversos grados de hidratación, estando usualmente pero no necesariamente al menos parcialmente hidratadas. Cuando se aplican a su nivel de hidratación de equilibrio, las composiciones exhibirán una hidratación sustancialmente de equilibrio y poco o ningún hinchamiento cuando se aplica al tejido. En algunas realizaciones, la composición se suministra al paciente a un nivel de hidratación por debajo de su hinchamiento en equilibrio. Las partículas de la composición se pueden hinchar entre un 10 a un 20 % al entrar en contacto con sangre o fluidos corporales. El hinchamiento de las composiciones parcialmente hidratadas resulta de la absorción de humedad del tejido y del entorno al que se aplica la composición.

La presente divulgación proporciona además kits que comprenden una composición de la invención e instrucciones escritas para administrar la composición a un sitio diana. La composición y las instrucciones escritas se incluirán juntas en un recipiente convencional, tal como una caja, frasco, bolsita, o bandeja. Las instrucciones escritas se pueden imprimir en una hoja separada de papel u otro material y empacar sobre o dentro del recipiente o se pueden imprimir en el propio recipiente. Usualmente, la(s) composición(es) se proporcionará(n) en una jeringa estéril separada u otro aplicador, o en una botella, frasco, o vial separado. Si una composición de la invención se proporciona en forma no hidratada, el kit puede incluir opcionalmente un recipiente separado con un tampón acuoso adecuado para la hidratación. Si no se proporciona una composición de la invención en un aplicador, un aplicador adecuado, por ejemplo también se puede proporcionar una jeringa.

De acuerdo con la invención, también se proporciona un método para elaborar una composición hemostática de la invención, que comprende:

mezclar juntos un líquido biocompatible, un agente hemostático soluble y partículas de un polisacárido biocompatible reticulado adecuado para uso en la hemostasia y que son insolubles en el líquido biocompatible, en el que el agente hemostático soluble comprende una pluralidad de portadores y una pluralidad de péptidos de unión a fibrinógeno inmovilizados a cada portador, en el que cada portador del agente hemostático comprende un núcleo ramificado al que los péptidos de unión a fibrinógeno están adheridos covalentemente por separado; y

esterilizar la composición;

en el que el núcleo ramificado comprende:

En realizaciones particulares, el líquido biocompatible, el agente hemostático soluble, y las partículas se mezclan juntos bajo condiciones eficaces para formar una fase líquida continua que comprende las partículas sustancialmente dispersas de forma homogénea a través de la fase líquida, formando de esta manera una composición hemostática sustancialmente homogénea.

El líquido biocompatible, el agente hemostático soluble y las partículas se pueden mezclar entre sí en cualquier orden o sustancialmente al mismo tiempo. Por ejemplo, en una realización, el líquido biocompatible y las partículas se pueden mezclar entre sí para formar una pasta sustancialmente homogénea en la que las partículas se dispersan por todo el líquido, y luego se puede agregar el agente hemostático soluble y mezclar con la pasta para formar la composición hemostática. Por ejemplo, se puede agregar una solución del agente hemostático en el líquido biocompatible, u otro líquido (pero preferiblemente agua o un líquido acuoso, tal como un tampón acuoso) a la pasta sustancialmente homogénea y mezclar con la pasta para formar la composición hemostática. Opcionalmente, la pasta homogénea se puede centrifugar para eliminar las burbujas de aire antes o después de la adición del agente hemostático soluble. En una realización alternativa, el agente hemostático soluble se puede disolver o mezclar con el líquido biocompatible y luego las partículas se pueden agregar a la mezcla y mezclar para formar la composición hemostática. Opcionalmente, luego se puede centrifugar la composición hemostática para eliminar las burbujas de aire. En una realización adicional, el agente hemostático soluble y las partículas se pueden agregar al líquido biocompatible sustancialmente al mismo tiempo, o inmediatamente uno después del otro, y después mezclar para formar la composición hemostática. Opcionalmente, luego la composición se puede centrifugar para eliminar las burbujas de aire. La eliminación de las burbujas de aire reducirá la opacidad de la composición, haciéndola sustancialmente transparente.

La composición hemostática se esteriliza, por ejemplo mediante esterilización con vapor o esterilización con calor seco.

En algunas realizaciones de la invención, una composición hemostática de la invención se puede formular en una pasta o suspensión fluida, hidratada, y empacar en un aplicador (por ejemplo, una jeringa u otro aplicador como se describió anteriormente), que luego se esteriliza para proporcionar una composición hemostática fluida, estéril, lista para uso.

Por tanto, se proporciona un aplicador que comprende una composición hemostática fluida, estéril, lista para uso de la invención.

El aplicador con la composición empacada en su interior se puede esterilizar mediante cualquier método adecuado, más adecuadamente mediante esterilización con vapor o esterilización con calor seco.

Las composiciones de la invención pueden tener propiedades selladoras además del efecto hemostático. Las composiciones se pueden aplicar profilácticamente a una herida que no sangra o que sangra poco y formarán una barrera protectora, cohesiva sobre la herida, ayudando de esta manera a que la herida sane.

De acuerdo con la invención, se proporciona una composición hemostática de la invención para uso como medicamento.

También se proporciona de acuerdo con la invención una composición hemostática de la invención para uso en el tratamiento de sangrado o para utilizar en el tratamiento de una herida.

Además se proporciona (no se reivindica) el uso de una composición hemostática de la invención en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de sangrado o para el tratamiento de una herida.

También se proporciona (no reivindicado) un método para tratar sangrado, que comprende administrar una cantidad eficaz de una composición hemostática de la invención a una herida que sangra.

Además se proporciona (no se reivindica) un método para tratar una herida, que comprende administrar una cantidad eficaz de una composición hemostática de la invención a una herida.

Una cantidad eficaz de una composición de la invención para administración a un sujeto, tal como un sujeto humano, dependerá, por ejemplo, del tipo de agente hemostático, por ejemplo cuántos péptidos de unión a fibrinógeno están presentes por molécula portadora, y del tipo y tamaño de la herida o sitio de sangrado. Sin embargo, una cantidad eficaz típica de la composición es de 0.1 ml a 50 ml, por ejemplo de 0.1 ml a 5 ml, de 1 a 50 ml o de 1 a 5 ml, de una composición que contiene el agente hemostático en una concentración de 0.005 a 25 mg/ml, por ejemplo 0.01 a 10 mg/ml.

A continuación se describen realizaciones de la invención únicamente a modo de ejemplo, con referencia a los dibujos acompañantes en los que:

La Figura 1 muestra la capacidad de un dendrímero de péptido para uso en una realización preferida para polimerizar fibrinógeno en concentraciones variables;

La Figura 2 muestra la capacidad de varios dendrímeros de péptido diferentes para polimerizar fibrinógeno en concentraciones variables. La numeración se refiere a la identidad del dendrímero de péptido;

La Figura 3 muestra la capacidad de varios dendrímeros de péptido diferentes para polimerizar fibrinógeno en concentraciones variables. La numeración se refiere a la identidad del dendrímero de péptido;

La Figura 4 muestra la capacidad de varios dendrímeros de péptido diferentes para polimerizar fibrinógeno en concentraciones variables. La numeración se refiere a la identidad del dendrímero de péptido;

La Figura 5 muestra una fotografía de hidrogeles formados por polimerización de fibrinógeno utilizando diferentes dendrímeros de péptido;

La Figura 6 muestra la capacidad de diferentes combinaciones de dendrímeros de péptido con conjugados de péptido para polimerizar fibrinógeno en concentraciones variables;

La Figura 7 muestra la capacidad de varios dendrímeros de péptido diferentes para polimerizar fibrinógeno en plasma humano;

La Figura 8A muestra un dibujo esquemático de lóbulos de hígado de conejo que indica la posición aproximada de las lesiones de la biopsia hepática. La Figura 8B ilustra cómo se evaluó el grado de sangrado en una escala de 0 a 5; La Figura 9 es una fotografía de un hígado de conejo al que se le ha realizado una biopsia. Se muestra un sitio de biopsia tratado con un control por encima la etiqueta “Control”. Un sitio de biopsia tratado con una composición de acuerdo con una realización de la invención se muestra encima de la etiqueta “pasta HA HXP12”;

La Figura 10 muestra una gráfica del efecto hemostático (% de éxito hemostático) de diferentes realizaciones de una composición de la invención en el tratamiento del sangrado de hígado de conejo al que se le ha realizado una biopsia, en comparación con un control, a lo largo del tiempo; y

La Figura 11A muestra una fotografía de una pasta transparente que contiene partículas de gel de ácido hialurónico reticuladas. La Figura 11B muestra una fotografía de una realización de una composición de la invención formada al mezclar la pasta transparente con un agente hemostático. La Figura 11C muestra una fotografía de una jeringa que contiene una realización de una composición de la invención que ha sido esterilizada en el lugar. La Figura 11D muestra una fotografía de una realización de una composición de la invención que ha sido extruida a través de una jeringa. La Figura 11E muestra una fotografía de una realización de una composición transparente de la invención que se ha depositado sobre material de sutura quirúrgica.

Ejemplo 1

Síntesis de dendrímeros de péptido y conjugados de péptido.

Los péptidos se sintetizaron en resina de baja carga Rink amida MBHA (Novabiochem, 0.36 mmol/g), mediante síntesis de péptidos Fmoc estándar, utilizando aminoácidos protegidos con Fmoc o Boc (Novabiochem).

En general, se utilizaron ciclos de acoplamiento único durante toda la síntesis y se empleó la química de activación de HBTU (se utilizaron HBTU y PyBOP (de AGTC Bioproducts) como agentes de acoplamiento). Sin embargo, en algunas posiciones el acoplamiento fue menos eficiente de lo esperado y se requirieron acoplamientos dobles.

Los péptidos se ensamblaron utilizando un sintetizador de péptidos automatizado y HBTU hasta los puntos de ramificación y mediante síntesis de péptidos manual utilizando PyBOP para las ramas de péptidos.

Para la síntesis automatizada se utilizó un exceso de tres veces de aminoácido y HBTU para cada acoplamiento y un exceso de nueve veces de diisopropiletilamina (DIPEA, Sigma) en dimetilformamida (DMF, Sigma).

Para la síntesis manual se utilizó un exceso de tres veces de aminoácido y PyBOP para cada acoplamiento y un exceso de nueve veces de DIPEA en N-metilpirrolidinona (NMP, Sigma). La desprotección (eliminación del grupo Fmoc) de la cadena de péptidos en crecimiento utilizando piperidina al 20 % (Sigma) en DMF también puede no ser siempre eficaz y requerir una doble desprotección.

Las ramas se elaboraron utilizando Fmoc-Lys(Fmoc)-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, o Fmoc-Lys(Mtt)-OH.

La desprotección final y la escisión del péptido del soporte sólido se realizó mediante tratamiento de la resina con TFA al 95 % (Sigma) que contenía triisopropilsilano (TIS, Sigma), agua y anisol (Sigma) (1:1:1, 5 %) durante 2-3 horas. El péptido escindido se precipitó en éter de dietilo frío (Sigma), se sedimentó mediante centrifugación y se liofilizó. El sedimento se volvió a disolver en agua (10-15 ml), se filtró y se purificó mediante HPLC de fase inversa utilizando una columna C-18 (Phenomenex a un caudal de 20 ml/min) y un gradiente de acetonitrilo/agua que contenía TFA al 0.1 %. El producto purificado se liofilizó y se analizó mediante ESI-LC/MS y HPLC analítica y se demostró que era puro (>95 %). Todos los resultados masivos coincidieron con los valores calculados.

Dendrímeros de péptido y conjugados de péptido

A continuación se muestran las estructuras de los dendrímeros de péptido y los conjugados de péptido sintetizados utilizando los métodos descritos anteriormente.

El grupo “NH<2>-” en el extremo de una secuencia de péptidos denota un grupo amino en el extremo de terminal amino de la secuencia. El grupo “-am” al final de una secuencia peptídica denota un grupo amida en el extremo de terminal carboxi de la secuencia. Los Conjugados de Péptido No. 1 y No. 2 (a continuación) no son agentes hemostáticos de acuerdo con la invención reivindicada.

Conjugado de Péptido No: 1:

Conjugado de Péptido No. 2:

Dendrímero de Péptido No. 3 (no abarcado por el texto explícito de las reivindicaciones):

Dendrímero de Péptido No. 4:

Dendrímero de Péptido No. 5 (no abarcado por el texto explícito de las reivindicaciones):

Dendrímero de Péptido No. 8 (no abarcado por el texto explícito de las reivindicaciones):

Dendrímero de Péptido No. 9 (no abarcado por el texto explícito de las reivindicaciones):

Dendrímero de Péptido No. 10:

Dendrímero de Péptido No. 11:

Dendrímero de Péptido No. 12:

Dendrímero de Péptido No. 13:

Ejemplo 2

Copolimerización de un dendrímero de péptido con fibrinógeno.

El dendrímero No. 12 comprende un núcleo ramificado con cinco residuos de lisina consecutivos. Los residuos de lisina están ligados covalentemente a través de una cadena lateral de un residuo de lisina adyacente.

Se evaluó la capacidad del Dendrímero de Péptido No. 12 para polimerizar fibrinógeno. Se agregaron 30 pl de dendrímero en solución, a una concentración que variaba desde 0.005-2 mg/ml, a 100 pl de fibrinógeno humano purificado a 3 mg/ml (el nivel de fibrinógeno encontrado en la sangre). La polimerización del fibrinógeno se analizó utilizando un analizador de coagulación Sigma Amelung KC4 Delta. La Figura 1 muestra un gráfico de los tiempos de polimerización (coagulación) (en segundos) con una concentración creciente de dendrímero.

Los resultados muestran que el dendrímero fue capaz de copolimerizarse con fibrinógeno casi instantáneamente, incluso a concentraciones muy bajas de dendrímero. Se considera que el aumento del tiempo de coagulación con concentraciones de dendrímero por encima de 0.5 mg/ml se explica por un exceso de péptidos de unión a fibrinógeno en comparación con el número de bolsas de unión libres en el fibrinógeno. En concentraciones más altas, los péptidos de unión a fibrinógeno del dendrímero pueden saturar las bolsas de unión al fibrinógeno, lo que da como resultado un número significativo de moléculas de dendrímero en exceso que no fueron capaces de copolimerizarse con el fibrinógeno.

Ejemplo 3

Efecto de variar el número de péptidos de unión a fibrinógeno por dendrímero sobre la velocidad de copolimerización con fibrinógeno

Este ejemplo investiga el efecto de variar el número de péptidos de unión a fibrinógeno por dendrímero de péptido sobre la velocidad de copolimerización con fibrinógeno.

La capacidad de los Péptidos de Dendrímeros Nos. 4, 5, 10, 11 y 12 para copolimerizar con fibrinógeno se evaluó utilizando el mismo método descrito en el Ejemplo 2. La concentración de cada dendrímero se varió desde 0.0050.5 mg/ml. La Figura 2 muestra un gráfico de los tiempos de coagulación (en segundos) con una concentración creciente de cada dendrímero diferente.

Los resultados muestran que el dendrímero No. 5 (con sólo dos péptidos de unión a fibrinógeno/dendrímero) no fue capaz de copolimerizarse con fibrinógeno. A medida que el número de péptidos de unión a fibrinógeno aumentó desde tres hasta cinco, en concentraciones de dendrímero desde -0.125 hasta ~0.275 mg/ml, aumentó la velocidad de copolimerización. En concentraciones inferiores a ~0.125 mg/ml de dendrímero, el dendrímero No. 10 (con tres péptidos de unión a fibrinógeno/dendrímero) produjo tiempos de coagulación más rápidos que el dendrímero No. 4 (con cuatro péptidos de unión a fibrinógeno/dendrímero). En el rango -0.02-0.5 mg/ml, el dendrímero No. 12 (con cinco péptidos de unión a fibrinógeno/dendrímero) produjeron una coagulación casi instantánea. En el rango -0.05-0.3 mg/ml, el dendrímero No. 11 (con cuatro péptidos de unión a fibrinógeno/dendrímero) también produjo una coagulación casi instantánea.

Se concluye que la velocidad a la que un dendrímero se polimeriza por el fibrinógeno generalmente aumenta a medida que aumenta el número de péptidos de unión a fibrinógeno por dendrímero.

Ejemplo 4

Efecto de la orientación del péptido de unión a fibrinógeno y de diferentes secuencias de péptidos de unión a fibrinógeno sobre la velocidad de copolimerización con fibrinógeno

Para evaluar si la orientación de un péptido de unión a fibrinógeno podría afectar la capacidad de un dendrímero de péptido para copolimerizarse con fibrinógeno, se sintetizaron dendrímeros de péptido que comprenden tres péptidos de unión a fibrinógeno adheridos a un único residuo de aminoácido trifuncional (no abarcado por el texto explícito de las reivindicaciones) (lisina) (denominados dendrímeros de 'tres ramas'), pero con uno de los péptidos de unión a fibrinógeno orientado con su extremo de terminal amino adherido al núcleo ramificado y amidado en su extremo de terminal carboxi. También se probó la capacidad de los dendrímeros de péptido que comprenden diferentes secuencias de péptidos de unión a fibrinógeno para copolimerizar con fibrinógeno.

Los péptidos de unión a fibrinógeno del Dendrímero de Péptido Nos. 3 (no abarcado por el texto explícito de las reivindicaciones) y 10 son cada uno de la secuencia GPRPG (SEQ ID NO: 17). Cada péptido de unión a fibrinógeno del Dendrímero de Péptido No. 10 está orientado con su extremo de terminal carboxi adherido al núcleo ramificado. Uno de los péptidos de unión a fibrinógeno del Dendrímero de Péptido No. 3 está orientado con su extremo de terminal amino adherido al núcleo ramificado. El extremo de terminal carboxi de ese péptido comprende un grupo amida.

Dos de los péptidos de unión a fibrinógeno del Dendrímero de Péptido No. 8 (no abarcados por el texto explícito de las reivindicaciones) son de secuencia GPRPG (SEQ ID NO: 17), y el tercer péptido de unión a fibrinógeno es de secuencia APFPRPG (SEQ ID NO: 14) orientado con su extremo de terminal amino adherido al núcleo ramificado. El extremo de terminal carboxi de ese péptido comprende un grupo amida.

Dos de los péptidos de unión a fibrinógeno del Dendrímero de Péptido No. 9 (no abarcados por el texto explícito de las reivindicaciones) son de secuencia GPRPPFA (SEQ ID NO: 3), y el tercer péptido de unión a fibrinógeno es de secuencia APFPRPG (SEQ ID NO: 14) orientado con su extremo de terminal amino adherido al núcleo ramificado. El extremo de terminal carboxi de ese péptido comprende un grupo amida.

La secuencia GPRPG (SEQ ID NO: 17) se une al agujero 'a' y al agujero 'b' de fibrinógeno, pero con cierta preferencia por el agujero 'a'. La secuencia GPRPPFA (SEQ ID NO: 3) se une con alta preferencia al agujero 'a' en el fibrinógeno. La secuencia Pro-Phe-Pro estabiliza la estructura principal de la cadena de péptidos y potencia la afinidad de la interacción perilla-agujero (Stabenfeld et al., BLOOD, 2010, 116: 1352-1359).

La capacidad de los dendrímeros para copolimerizarse con fibrinógeno se evaluó utilizando el mismo método descrito en el Ejemplo 2, para una concentración de cada dendrímero que variaba desde 0.005-0.5 mg/ml. La Figura 3 muestra una gráfica de los tiempos de coagulación (en segundos) obtenidos con una concentración creciente de cada dendrímero diferente.

Los resultados muestran que cambiar la orientación de uno de los péptidos de unión a fibrinógeno de un dendrímero de tres ramas, de tal manera que el péptido esté orientado con su extremo de terminal amino adherido al núcleo ramificado (es decir, el Dendrímero No. 3), redujo la capacidad del dendrímero para copolimerizar con fibrinógeno (compárese el tiempo de coagulación del Dendrímero No. 3 con el del Dendrímero No. 10). Sin embargo, a concentraciones más altas de fibrinógeno, el Dendrímero No. 3 fue capaz de copolimerizarse con fibrinógeno (datos no mostrados).

Un dendrímero de tres ramas con un péptido de unión a fibrinógeno de diferente secuencia orientado con su extremo de terminal amino adherido al núcleo ramificado fue capaz de copolimerizarse con fibrinógeno (véanse los resultados para el Dendrímero No. 8).

Un dendrímero de tres ramas en el que dos de los péptidos de unión a fibrinógeno comprenden una secuencia que se une preferiblemente al agujero 'b' en el fibrinógeno (secuencia GPRPPFA (SEQ ID NO: 3)), con estos péptidos orientados con su extremo de terminal carboxi adherido al núcleo ramificado, y el otro péptido que comprende la secuencia inversa (es decir, secuencia APFPRPG (SEQ ID NO: 14)) orientado con su extremo de terminal amino adherido al núcleo ramificado (Dendrímero No. 9) también fue muy activo en la copolimerización con fibrinógeno.

Ejemplo 5

Capacidad de los dendrímeros de péptido con diferentes secuencias de péptidos de unión a fibrinógeno para copolimerizar con fibrinógeno

Los motivos GPRPG (SEQ ID NO: 15) y GPRPFPA (SEQ ID NO: 3) se unen principalmente al agujero 'a' en el fibrinógeno. Este ejemplo describe una evaluación de la capacidad de un dendrímero de péptido quimérico (es decir, un dendrímero de péptido con diferentes secuencias de péptidos de unión a fibrinógeno adheridas al mismo núcleo ramificado) para copolimerizar con fibrinógeno.

El dendrímero de péptido No. 13 es un dendrímero de péptido quimérico de cuatro ramas que comprende dos péptidos de unión a fibrinógeno con secuencia GPRPG- (SEQ ID NO: 17) (que tiene preferencia de unión por el agujero 'a'), y dos péptidos de unión a fibrinógeno con secuencia GHRPY-(SEQ ID NO: 11) (que se unen preferencialmente al agujero 'b'). Los dendrímeros de péptido no quiméricos Nos. 11 y 12 son dendrímeros de péptido de cuatro y cinco brazos, respectivamente. Cada péptido de unión a fibrinógeno de estos dendrímeros tiene la secuencia GPRPG- (SEQ ID NO: 17). Cada péptido de unión a fibrinógeno de los dendrímeros Nos. 11, 12 y 13 está adherido por su extremo de terminal carboxi al núcleo ramificado.

La capacidad de los dendrímeros para copolimerizarse con fibrinógeno se evaluó utilizando el mismo método descrito en el Ejemplo 2, para una concentración de cada dendrímero que variaba desde 0.005-0.5 mg/ml. La Figura 4 muestra una gráfica de los tiempos de coagulación (en segundos) obtenidos con una concentración creciente de cada dendrímero diferente.

Los resultados muestran que la velocidad de coagulación utilizando el dendrímero quimérico fue más lenta que la de los dendrímeros no quiméricos en concentraciones inferiores a 0.3 mg/ml. Sin embargo, la Figura 5 muestra una fotografía de los hidrogeles obtenidos utilizando los diferentes dendrímeros. Los geles se etiquetan con el número del dendrímero de péptido utilizado (11, 12 y 13), y “P” etiqueta un hidrogel formado utilizando un producto en el que varios péptidos de unión a fibrinógeno están adheridos a albúmina sérica humana soluble. El hidrogel formado por el dendrímero quimérico era más denso y contenía menos fluido en comparación con los hidrogeles formados utilizando los dendrímeros Nos. 11 y 12 (a 3 mg/ml de fibrinógeno, o a concentraciones más altas de fibrinógeno). Por lo tanto, aunque el tiempo de coagulación fue más lento utilizando el dendrímero quimérico, el hidrogel formado utilizando este dendrímero fue más denso.

Ejemplo 6

Capacidad de mezclas de dendrímeros de péptido y conjugados de péptido para copolimerizar con fibrinógeno

El péptido de unión a fibrinógeno de secuencia GPRP- (SEQ ID NO: 1) se une fuerte y preferencialmente al agujero 'a' del fibrinógeno (Laudano et al., 1978 PNAS 7S). El Conjugado de Péptido No. 1 (no es un agente hemostático de acuerdo con la invención reivindicada) comprende dos péptidos de unión a fibrinógeno con esta secuencia, cada uno adherido a un residuo de lisina. El primer péptido está adherido en su extremo de terminal carboxi mediante un ligador al residuo de lisina, y el segundo péptido está adherido en su extremo de terminal amino mediante un ligador al residuo de lisina. El extremo de terminal carboxi del segundo péptido comprende un grupo amida.

El péptido de unión a fibrinógeno de secuencia GHRPY- (SEQ ID NO: 11) se une fuerte y preferencialmente al agujero 'b' de fibrinógeno (Doolittle and Pandi, Biochemistry 2006, 45, 2657-2667). El Conjugado de Péptido No. 2 (no es un agente hemostático de acuerdo con la invención reivindicada) comprende un primer péptido de unión a fibrinógeno con esta secuencia, adherido en su extremo de terminal carboxi mediante un ligador a un residuo de lisina. Un segundo péptido de unión a fibrinógeno, que tiene la secuencia inversa (YPRHG (SEQ ID NO: 16)), está adherido en su extremo de terminal amino mediante un ligador al residuo de lisina. El extremo de terminal carboxi del segundo péptido comprende un grupo amida.

El ligador permite que los péptidos se extiendan entre sí.

Se mezcló el Conjugado de "Péptido No. 1 o 2 (2 mg/ml) con el Dendrímero de Péptido No. 3 (no abarcado por el texto explícito de las reivindicaciones) o 4, y fibrinógeno, y se evaluó la capacidad de las mezclas para copolimerizar con fibrinógeno utilizando el mismo método descrito en el Ejemplo 2, para una concentración de cada dendrímero que varía desde 0.025-0.5 mg/ml. La Figura 6 muestra una gráfica de los tiempos de coagulación (en segundos) obtenidos con una concentración creciente de cada dendrímero diferente.

Los resultados muestran que, sorprendentemente, sólo las mezclas que contenían el Conjugado de Péptido No. 2 (es decir, con los péptidos de perilla B) y los péptidos de dendrímeros fueron sinérgicos y aumentaban la actividad, mientras que las mezclas que contenían el Conjugado de Péptido No. 1 (los péptidos de perilla A) no fueron activos cuando se agregaron al Conjugado de Péptido No. 2 o a los Dendrímeros de Péptido.

Ejemplo 7

Capacidad de los dendrímeros de péptido para polimerizar fibrinógeno en plasma humano

Se probó la capacidad de varios dendrímeros de péptido diferentes (Nos. 4, 5, 8, 9, 10, 11, 12, 13) para polimerizar fibrinógeno en plasma humano.

Se agregaron 30 pl de cada dendrímero (a una concentración de 0.25 mg/ml) a 100 pl de plasma humano a 37 °C y se determinó la polimerización del fibrinógeno utilizando un analizador de coagulación Sigma Amelung KC4 Delta. Los tiempos de coagulación para cada dendrímero se muestran en la Figura 7, y muestran que los dendrímeros de péptido Nos. 10, 11, 4 (no abarcados por el texto explícito de las reivindicaciones), 12 y 13 fueron capaces de polimerizar fibrinógeno en plasma humano, el dendrímero El No. 12 es particularmente eficaz (con un tiempo de coagulación menor de un segundo). Sin embargo, los dendrímeros de péptido Nos. 5 (no abarcado en el texto explícito de las reivindicaciones), 8 (no abarcado en el texto explícito de las reivindicaciones) y 9 (no abarcado en el texto explícito de las reivindicaciones) no fueron capaces de polimerizar el fibrinógeno en plasma humano.

Ejemplo 8

Efecto de la esterilización por vapor sobre un agente hemostático en solución.

Este ejemplo describe el efecto de la esterilización con vapor sobre la actividad hemostática de un agente hemostático (Dendrímero de Péptido No. 12 (véase Ejemplo 1): “HXP12”) formulado en solución salina.

Se diluyó HXP12 a una concentración de 50 mg/ml con cloruro de sodio 150 mM a una concentración de 0.5 mg/ml. La formulación se preparó como una solución a granel de 6 ml (utilizando 60 pl de solución madre HXP12). Se utilizaron 400 pl de esta solución a granel por cada vial de vidrio de 2 ml, con una tapa hermética de rosca. Cada vial se esterilizó en autoclave (200 kPa) durante 25 minutos a 121 °C. Después de la esterilización, los viales se colocaron a 40 °C y se almacenaron hasta por 27 semanas.

Para probar la capacidad de las muestras almacenadas para polimerizar fibrinógeno, cada muestra se diluyó con tampón fosfato 20 mM, pH 7.6, hasta una concentración de 0.05 mg/ml. Se agregaron 30 pl de cada muestra diluida a 100 pl de fibrinógeno humano, a una concentración de 3 mg/ml, formulado en tampón fosfato 20 mM, pH 7.6. La capacidad de HXP12 en cada muestra diluida para polimerizar fibrinógeno (la actividad de “coagulación”) a 37 °C se determinó utilizando un analizador de coagulación Sigma Amelung KC4 Delta. También se determinó la actividad de polimerización de muestras de control, no esterilizadas. Los resultados se resumen en la Tabla 1 a continuación.

Tabla 1

Los resultados de la Tabla 1 muestran que el agente hemostático formulado en solución salina conserva su capacidad de polimerizar fibrinógeno después de la esterilización con vapor en un autoclave (200 kPa) durante 25 minutos a 121 °C, y que esta actividad se conserva incluso después del almacenamiento a 40 °C durante al menos 27 semanas. Ejemplo 9

Efecto de la esterilización por vapor sobre una composición hemostática, fluida, lista para uso

Este ejemplo describe el efecto de la esterilización con vapor sobre la actividad hemostática de un agente hemostático (HXP12) formulado como una pasta fluida, lista para uso que comprende partículas reticuladas de Ácido Hialurónico (HA).

Se mezclaron 0.6 ml de una solución de HXP12 disuelta en agua con 1.4 g de partículas de hidrogel de HA hidratadas en tampón fosfato 10 mM (concentración de HA 2.7 %; reticulación 5:1 [HA/ sulfona de divinilo “DVS”], tamaño de partícula completamente hidratada 400 pm) para formar una pasta en la que la concentración de HXP12 fue 1 mg/ml. Se repartieron alícuotas de 200 mg de la pasta en viales de vidrio, y cada vial se cerró con una tapa. Los viales se esterilizaron en autoclave (200 kPa) durante 25 min a 121 °C. Después de esterilización, los viales se colocaron a 80 °C durante 16 horas adicionales para simular un proceso de envejecimiento acelerado. Las muestras se evaluaron a las 4 y 16 horas.

Se extrajo HXP12 de las muestras almacenadas y se diluyó con tampón fosfato 20 mM, pH 7.2, hasta una concentración de 0.1 mg/ml. Se agregaron 30 pl de cada muestra extraída a 100 pl de plasma humano (Alpha Labs) y se determinó la capacidad de HXP12 en cada muestra diluida para polimerizar fibrinógeno (la actividad de 'coagulación') a 37 °C utilizando un analizador de coagulación Sigma Amelung KC4 Delta. También se determinó la actividad de polimerización de muestras de control, no esterilizadas. Los resultados se resumen en la Tabla 2 a continuación.

Tabla 2

Los resultados de la Tabla 2 muestran que el péptido HXP12, formulado como una pasta fluida, lista para uso con partículas de hidrogel de HA, conserva la capacidad de polimerizar fibrinógeno del plasma humano después de la esterilización con vapor en un autoclave (200 kPa) durante 25 minutos a 121 °C, y que esta actividad se conserva incluso después de almacenamiento a 80 °C durante al menos 4 horas.

Ejemplo 10

Este ejemplo describe el efecto de la esterilización con vapor sobre la actividad hemostática de un agente hemostático (HXP12) formulado como una pasta fluida, lista para uso elaborada de partículas reticuladas de Ácido Hialurónico (HA).

Se mezclaron 0.6 ml de una solución de HXP12 formulada en tampón fosfato 10 mM, Arg.HCl 160 mM, pH 6.8, con 1.4 g de partículas de hidrogel de HA (concentración de HA 2.7%; reticulación 5:1 [HA/ sulfona de divinilo “DVS”], tamaño de partícula completamente hidratada 400 pm) para formar una pasta en la que la concentración de HXP12 fue 1 mg/ml. Se dividieron alícuotas de 200 mg de la pasta en viales de vidrio, y cada vial se cerró con una tapa. Los viales se esterilizaron en autoclave (200 kPa) durante 25 min a 121 °C. Después de la esterilización, los viales se colocaron a 40 °C. Las muestras se evaluaron a las 0, 2 y 4 semanas.

Se extrajo HXP12 de las muestras almacenadas, y se diluyó con tampón fosfato 20 mM, pH 7.2, hasta una concentración de 0.06 mg/ml. Se agregaron 30 pl de cada muestra extraída a 100 pl de fibrinógeno humano a una concentración de 3 mg/ml (el nivel de fibrinógeno encontrado en la sangre) formulado en tampón fosfato 20 mM, pH 7.2. La capacidad de HXP12 en cada muestra diluida para polimerizar fibrinógeno (la actividad de 'coagulación') a 37 °C se determinó utilizando un analizador de coagulación Sigma Amelung KC4 Delta. También se determinó la actividad de polimerización de muestras de control, no esterilizadas. Los resultados se resumen en la Tabla 3 a continuación.

Tabla 3

Los resultados de la Tabla 3 muestran que el péptido HXP12, formulado como una pasta fluida, lista para uso con partículas de hidrogel de HA, conserva la capacidad de polimerizar fibrinógeno a partir de fibrinógeno humano después de la esterilización en un autoclave durante 25 minutos a 121 °C (200 kPa), y que esta actividad se conserva incluso después de almacenamiento a 40 °C durante al menos 2 semanas.

Ejemplo 11

Evaluación de la actividad hemostática de una composición hemostática de la invención en un modelo de lesión por biopsia hepática de conejo

Este ejemplo describe la prueba de la actividad hemostática de tres composiciones diferentes de la invención, cada una con una concentración diferente de un agente hemostático (dendrímero de péptido HXP12).

Métodos

Se cargaron previamente 7 g de pasta de HA (concentración de HA 2.7%; 5:1; HA/DVS, tamaño de partícula completamente hidratada 400 |jm) en una jeringa y se mezclaron con 3 ml de dendrímero de péptido HXP12 en una de tres concentraciones diferentes, lo que dio como resultado 10 ml del producto final. La concentración final de HXP12 para cada 10 ml de producto fue: muestra B, 1 mg/ml; B2, 0.5 mg/ml; B3, 1.4 mg/ml. Como control (C), se mezclaron 7 g de pasta de HA con 3 ml de solución salina.

Se anestesiaron conejos heparinizados (Raza: Blanco de Nueva Zelanda; Sexo: machos). Los tres lóbulos del hígado se retiraron de la cavidad abdominal y se colocaron sobre hisopos de gasa humedecidos con solución salina. Las muestras se analizaron en lesiones de biopsia que se crearon secuencialmente en los tres lóbulos del hígado como se establece a continuación en la Tabla 3. La Figura 8A muestra la orientación aproximada y el orden de la lesión hepática en los tres lóbulos.

Tabla 4 Orden^ ubicación de la lesión de los lóbulos he áticos.

Las biopsias se crearon en los lóbulos del hígado utilizando una punción de biopsia de 6 mm hasta aproximadamente 5 mm de profundidad. Se utilizó un hisopo seco previamente pesado para recolectar la sangre que salía de la herida durante 15 segundos. Luego se pesó el hisopo como medida de la gravedad del sangrado. Después de retirar el hisopo, se secó la herida con otro hisopo y luego se aplicaron las muestras de prueba.

Para la aplicación de las muestras probadas, se aplicó un hisopo de gasa estéril humedecido con solución salina contra la superficie que sangra y se utilizó la jeringa para dispensar hasta 2 ml de la Muestra B, B2 o B3, o 2 ml del control (C), entre la gasa y la superficie que sangra en la herida de la biopsia. Se aplicó una presión suave a la gasa durante un minuto después de la aplicación. Luego del retiro de la gasa húmeda, se evaluó la herida para hemostasia a 1,3, 6, 9 y 12 minutos después de la aplicación de la muestra de prueba (es decir, incluyendo la aplicación de presión durante un minuto).

Se asignaron puntuaciones de sangrado de 0, 1, 2, 3, 4 y 5 a sin sangrado, supuración, sangrado muy leve, leve, moderado y grave, respectivamente (Figura 8B). Las puntuaciones para el grado de sangrado se adaptaron de Adams et al (J Thromb Thrombolysis DOI 10.1007/s 11239-008-0249-3). Tras una hemostasia satisfactoria, se cubrió el lóbulo con un hisopo empapado en solución salina y se repitió el procedimiento hasta que cada lóbulo recibió el tratamiento descrito anteriormente.

Resultados

La Figura 9 es una fotografía de uno de los hígados al que se le ha realizado una biopsia. Se puede ver sangre fluyendo desde un sitio de biopsia tratado con el control (mostrado encima de la etiqueta “Control”), mientras que el efecto hemostático en un sitio de biopsia tratado con una composición de la invención que comprende pasta HA y HXP12 (mostrado encima de la etiqueta “pasta de HA HXP12”) es claramente visible.

La Figura 10 muestra un gráfico del efecto hemostático (% de éxito hemostático) de las muestras B, B2 y B3, en comparación con el control, durante el tiempo (en minutos) de la evaluación. En contraste con el control, cada una de las diferentes composiciones que comprenden pasta HA y dendrímero de péptido HXP12 demostró una fuerte actividad coagulante. Esta actividad dependía de la dosis, las composiciones que tenían concentraciones más altas de HXP12 (muestras B y B3) demuestran aproximadamente 80 %-100 % de actividad hemostática durante la evaluación de 12 minutos. La composición con la concentración más baja de HXP12 (muestra B2) demostró una actividad hemostática del 100 % durante los primeros tres minutos de la evaluación, pero luego se redujo a -75 % durante los 9 minutos restantes.

Este ejemplo muestra que una realización de una composición de la invención que comprende partículas de HA que esencialmente no son hemostáticas y un dendrímero de péptido que tiene propiedades coagulantes, es sorprendentemente eficaz para controlar el sangrado.

Ejemplo 12

Una composición hemostática fluida, lista para uso, estéril que comprende partículas de gel de HA reticuladas y un agente hemostático

Una pasta fluida elaborada de partículas de gel de ácido hialurónico (HA) reticuladas (concentración de HA 2.7 %; 5:1; HA/DVS, tamaño de partícula completamente hidratada 400 jm ) se hizo transparente al centrifugar la pasta a 600 rpm durante 5 minutos. La pasta transparente se muestra en la Figura 11A.

Se mezclaron 7 g de la pasta de HA transparente con 3 ml de dendrímero de péptido HXP12 (formulado en tampón fosfato 10 mM, Arg.HCl 160 mM, pH 6.8) dando como resultado 10 ml del producto final.

La concentración final de HXP12 fue de 1.05 mg/ml. La Figura 11B muestra una fotografía de parte de la composición resultante. La fotografía muestra que la composición es suficientemente cohesiva para formar una capa continua sobre una herida y, por tanto se puede utilizar para sellar una herida.

La composición se colocó en un vial de vidrio y se esterilizó mediante esterilización con vapor en un autoclave (200 kPa) durante 25 minutos a 121 °C.

La Figura 11C muestra una fotografía de una jeringa que contiene la composición. La Figura 11D muestra una jeringa que contiene la composición, en la que parte de la composición se ha extruido a través de la abertura en la punta del cilindro de la jeringa utilizando su émbolo.

La Figura 11E muestra una fotografía de una realización de una composición transparente de la invención que se ha depositado sobre material de sutura quirúrgica de código de tamaño “0”, diámetro 0.3-0.39 mm. El material de sutura es claramente visible a través de la composición transparente.

Un cirujano puede ver a través de una composición transparente de la invención cuando la administra. Esto hace que sea mucho más fácil administrar correctamente la composición y determinar si ha sido eficaz para controlar o detener el sangrado.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Una composición hemostática fluida, estéril, lista para uso, que comprende:

un agente hemostático soluble que comprende una pluralidad de portadores y una pluralidad de péptidos de unión a fibrinógeno inmovilizados en cada portador, en el que cada portador del agente hemostático comprende un núcleo ramificado al que se adhieren covalentemente por separado los péptidos de unión a fibrinógeno;

un líquido biocompatible; y

partículas de un polisacárido reticulado biocompatible adecuado para uso en hemostasia y que son insolubles en el líquido biocompatible;

en el que el núcleo ramificado comprende:

desde dos hasta diez residuos de aminoácidos multifuncionales, en los que cada péptido de unión a fibrinógeno se adhiere covalentemente por separado a un residuo de aminoácido multifuncional del núcleo ramificado;

2. Una composición de acuerdo con la reivindicación 1, en la que la pluralidad de residuos de aminoácidos multifuncionales comprende un residuo de lisina, ornitina, arginina, ácido aspártico, ácido glutámico, asparagina, glutamina, o cisteína.

3. Una composición de acuerdo con la reivindicación 1, en la que cada péptido de unión a fibrinógeno se adhiere al núcleo ramificado por un ligador no peptídico, opcionalmente en la que el ligador comprende un ligador de cadena lineal, preferiblemente un grupo alquilo de cadena lineal, y opcionalmente en la que el ligador comprende -NH(CH<2>)nCO-, donde n es 1-10.

4. Una composición de acuerdo con cualquier reivindicación precedente, en la que el agente hemostático comprende péptidos de unión a fibrinógeno de secuencia diferente, opcionalmente en la que la pluralidad de portadores comprende una primera pluralidad de portadores, y una segunda pluralidad de portadores, y en la que los péptidos de unión a fibrinógeno adheridos a la primera pluralidad de portadores son de secuencia diferente a los péptidos de unión a fibrinógeno adheridos a la segunda pluralidad de portadores, opcionalmente en la que cada portador tiene péptidos de unión a fibrinógeno de secuencia diferente adheridos al mismo, y opcionalmente en la que los péptidos de unión a fibrinógeno de secuencia diferente tienen diferente selectividad de unión al agujero 'a' sobre el agujero 'b' del fibrinógeno.

5. Una composición de acuerdo con la reivindicación 4, en la que los péptidos de unión a fibrinógeno de secuencia diferente comprenden un primer péptido de unión a fibrinógeno que se une preferencialmente a un agujero 'a' de fibrinógeno sobre un agujero 'b' de fibrinógeno, y un segundo péptido de unión a fibrinógeno que se une con mayor selectividad de unión a un agujero 'a' de fibrinógeno sobre un agujero 'b' de fibrinógeno que el primer péptido de unión a fibrinógeno, opcionalmente en la que el primer péptido de unión a fibrinógeno comprende una secuencia de aminoácidos GPRP- (SEQ ID NO: 1) en su extremo de terminal amino, y opcionalmente en la que el segundo péptido de unión a fibrinógeno comprende una secuencia de aminoácidos -ApFPRPG (SEQ ID NO: 14) en su extremo de terminal carboxi.

6. Una composición de acuerdo con la reivindicación 4, en la que los péptidos de unión a fibrinógeno de secuencia diferente comprenden un primer péptido de unión a fibrinógeno que se une preferencialmente a un agujero 'a' de fibrinógeno sobre un agujero 'b' de fibrinógeno, y un segundo péptido de unión a fibrinógeno que se une preferencialmente a un agujero 'b' de fibrinógeno sobre un agujero 'a' de fibrinógeno, opcionalmente en la que el primer péptido de unión a fibrinógeno comprende una secuencia de aminoácidos GPRP-(SEQ ID NO: 1) en su extremo de terminal amino, y opcionalmente en la que el segundo péptido de unión a fibrinógeno comprende una secuencia de aminoácidos GHRP- (SEQ ID NO: 10), preferiblemente una secuencia de aminoácidos GHRPY- (SEQ ID NO: 11), en su extremo de terminal amino.

7. Una composición de acuerdo con cualquier reivindicación precedente, en la que el líquido biocompatible es una solución acuosa, y opcionalmente en la que la solución acuosa es una solución salina.

8. Una composición de acuerdo con cualquier reivindicación precedente, en la que el polisacárido comprende un glucosaminoglicano, celulosa oxidada, quitosano, quitina, alginato, alginato oxidado, o almidón oxidado, y opcionalmente en la que el glucosaminoglicano comprende ácido hialurónico.

9. Una composición de acuerdo con cualquier reivindicación precedente, en la que las partículas comprenden gránulos de ácido hialurónico reticulados, en la que la mayoría de los gránulos tienen un diámetro en el rango 100-1500 pm en forma parcialmente o totalmente hidratada.

10. Una composición de acuerdo con cualquier reivindicación precedente, en la que la composición es transparente.

11. Una composición de acuerdo con cualquier reivindicación precedente para uso como un medicamento y opcionalmente para uso en el tratamiento de sangrado, o en el tratamiento de una herida.

12. Un método para elaborar una composición hemostática fluida, estéril, lista para uso, que comprende:

mezclar juntos un líquido biocompatible, un agente hemostático soluble, y partículas de un polisacárido reticulado biocompatible adecuado para uso en hemostasia y que son insolubles en el líquido biocompatible, en el que el agente hemostático soluble comprende una pluralidad de portadores y una pluralidad de péptidos de unión a fibrinógeno inmovilizados en cada portador, en el que cada portador del agente hemostático comprende un núcleo ramificado al que se adhieren covalentemente por separado los péptidos de unión a fibrinógeno; y

esterilizar la composición;

en el que el núcleo ramificado comprende:

13. Una composición de acuerdo con la reivindicación 1, en la que la composición hemostática se ha esterilizado mediante esterilización con vapor, o mediante esterilización por calor seco, o un método de acuerdo con la reivindicación 12, en la que la composición se esteriliza mediante esterilización con vapor, o mediante esterilización por calor seco.

14. Una composición de acuerdo con la reivindicación 1 o 13, en la que el líquido biocompatible proporciona una fase líquida continua, y las partículas de polímero sustancialmente se dispersan de forma homogénea a través de la fase líquida, o un método de acuerdo con la reivindicación 12 o 13, en la que el líquido, el agente, y las partículas se mezclan bajo condiciones efectivas para formar una fase líquida continua que comprende las partículas sustancialmente dispersas de forma homogénea a través de la fase líquida, formando de esta manera una composición hemostática sustancialmente homogénea.

15. Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 12 a 14, que comprende además centrifugar la mezcla para eliminar las burbujas de aire de la mezcla.