ES2964340T3

ES2964340T3 - Métodos para generar anticuerpos portadores de péptidos bioactivos y composiciones que comprenden los mismos

Info

Publication number: ES2964340T3
Application number: ES14764165T
Authority: ES
Inventors: W Cummings; Patrick Gray; Larry Tjoelker; Munehisa Yabuki
Original assignee: Omeros Medical Systems Inc
Current assignee: Omeros Corp
Priority date: 2013-03-15
Filing date: 2014-03-14
Publication date: 2024-04-05
Anticipated expiration: 2034-03-14
Also published as: WO2014144542A3; EP2968546A2; AU2017276336A1; AU2019226184A1; EP2968546B1; US20150017162A1; WO2014144542A2; AU2014229020A1; CA2906096A1; US20210079117A1; JP6615854B2; AU2019226184B2; JP2018093875A; AU2014229020B2; NZ629682A; JP2016514456A; EP2968546A4; CA2906096C; NZ729747A

Abstract

En un aspecto, la invención proporciona un anticuerpo aislado, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que comprende una secuencia de aminoácidos del péptido bioactivo, en donde la secuencia de aminoácidos del péptido bioactivo es un inhibidor del sistema del complemento y está fusionada a al menos uno de: (i) la región amino terminal de al menos una de: una región variable de cadena ligera y/o una región variable de cadena pesada; o (ii) la región carboxi terminal de al menos una de: una región constante de cadena ligera y/o una región constante de cadena pesada, en donde el anticuerpo inhibe la activación del complemento. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Métodos para generar anticuerpos portadores de péptidos bioactivos y composiciones que comprenden los mismos Campo de la invención

La presente invención se refiere a métodos para generar anticuerpos portadores de péptidos bioactivos y fragmentos de los mismos, tales como anticuerpos que comprenden péptidos bioactivos (por ejemplo, anticuerpos contra MASP-2 portadores de péptidos inhibidores) y composiciones que comprenden tales anticuerpos portadores de péptidos bioactivos para su uso en la inhibición de la activación del complemento.

Declaración sobre el listado de secuencias

El listado de secuencias asociado con esta solicitud se proporciona en formato de texto en lugar de una copia impresa. El nombre del archivo de texto que contiene el listado de secuencias es MP_1_0207_PCT_Sequence_Listing_20140311_ST25. El archivo de texto pesa 297 KB, fue creado el 12 de marzo de 2014; y se envía a través de EFS-Web junto con la presentación de la especificación.

Antecedentes

El sistema del complemento proporciona un mecanismo de acción temprana para iniciar, amplificar y orquestar la respuesta inmune a la infección microbiana y otras agresiones agudas (documento de M.K. Liszewski y J.P. Atkinson, 1993, en Fundamental Immunology, Tercera edición, editado por W.E. Paul, Raven Press, Ltd., Nueva York.) en humanos y otros vertebrados. Si bien la activación del complemento proporciona una valiosa defensa de primera línea contra patógenos potenciales, las actividades del complemento que promueven una respuesta inmune protectora también pueden representar una amenaza potencial para el hospedero (documento de K.R. Kalli y otros, Springer Semin. Immunopathol. 15: 417-431, 1994; B.P. Morgan, Eur. J. Clinical Investig. 24: 219-228, 1994). Por ejemplo, los productos proteolíticos C3 y C5 reclutan y activan neutrófilos. Si bien son indispensables para la defensa del hospedero, los neutrófilos activados liberan indiscriminadamente enzimas destructivas y pueden causar daño a los órganos. Además, la activación del complemento puede causar el depósito de componentes líticos del complemento en las células hospederas cercanas, así como también en dianas microbianas, lo que resulta en la lisis de la célula hospedera.

El sistema del complemento también ha sido implicado en la patogénesis de numerosos estados de enfermedades agudas y crónicas, que incluye: infarto de miocardio, accidente cerebrovascular, síndrome de dificultad respiratoria aguda, lesión por reperfusión, choque séptico, fuga capilar después de quemaduras térmicas, inflamación post bypass cardiopulmonar, rechazo de trasplantes, artritis reumatoide, esclerosis múltiple, miastenia gravis, degeneración macular relacionada con la edad, hemoglobinuria paroxística nocturna y enfermedad de Alzheimer. En casi todas estas enfermedades, el complemento no es la causa, pero es uno de varios factores implicados en la patogénesis. Sin embargo, la activación del complemento puede ser un mecanismo patológico importante y representa un punto efectivo para el control clínico en muchas de estas enfermedades.

El creciente reconocimiento de la importancia de la lesión tisular mediada por el complemento en una variedad de estados de enfermedades destaca la necesidad de fármacos inhibidores del complemento efectivos. Hasta la fecha, Eculizumab (Soliris®), un anticuerpo contra C5, es el único fármaco dirigido al complemento aprobado para uso humano. Sin embargo, C5 es una de varias moléculas efectoras ubicadas "aguas abajo" en el sistema del complemento, y el bloqueo de C5 no inhibe la activación del sistema del complemento. Por lo tanto, un inhibidor de las etapas de iniciación de la activación del complemento tendría muchas ventajas significativas sobre un inhibidor del complemento "aguas abajo".

Se han definido tres vías distintas de activación del complemento. La vía clásica se activa tras la unión de isotipos de anticuerpos particulares a un patógeno o antígeno del hospedero. La vía de las lectinas se activa tras la unión de lectinas de reconocimiento de patrones, tal como la lectina de unión a manano (MBL), CL-11 o ficolinas L, M o H, a complejos microbianos o macromoléculas del hospedero, tal como los polisacáridos. Finalmente, la vía alternativa sirve para amplificar las señales generadas por las vías clásica y de lectinas. Una familia de serina proteasas es parte integral de las etapas de activación iniciales de las tres vías. Los C1r y C1 forman los componentes enzimáticos del complejo C1 que se ensambla mediante anticuerpos activadores del complemento. Además, hay tres serina proteasas asociadas a las MBL (MASP) que inician y/o propagan las cascadas de proteasas de la lectina y las vías alternativas (documento de Yongqing y otros, Biochim. Biophys. Acta 1824: 253, 2012).

MASP-1, MASP-2 y MASP-3 comparten organizaciones de dominio idénticas con las de C1r y C1s, los componentes enzimáticos del complejo C1 (documento de Sim, R.B. y otros, Biochem. Soc. Trans. 28: 545, 2000). Estos dominios incluyen un dominio N-terminal C1r/C1s/VEGF de erizo de mar/proteína morfogénica ósea (CUB), un dominio similar al factor de crecimiento epidérmico, un segundo dominio CUB, un tándem de dominios de proteína control del complemento y un dominio de serina proteasa. Al igual que en las proteasas C1, la activación de las proteasas MASP se produce mediante la escisión de un enlace Arg-Ile adyacente al dominio de serina proteasa, que divide la enzima en cadenas A y B unidas por puentes disulfuro, esta última que consiste en el dominio de serina proteasa. La generación de inhibidores peptídicos específicos de MASP-1 y MASP-2, denominados SGMI-1 y SGMI-2, respectivamente, se describe en el documento de Heja y otros, J Biol Chem 287: 20290 (2012) y el documento de Heja y otros, PNAS 109: 10498 (2012), cada uno de los cuales se incorpora en la presente descripción como referencia. SGMI-1 y SGMI-2 son cada uno de ellos péptidos de 36 aminoácidos que se seleccionaron de una biblioteca de fagos de variantes del inhibidor de proteasa 2Schistocerca gregariaen el que seis de las ocho posiciones del lazo de unión a proteasa fueron completamente aleatorizadas. Mecánicamente, tanto SGMI-1 como SGMI-2 bloquean la vía de activación del complemento de las lectinas sin afectar la vía clásica (documento de Heja y otros, 2012. Proc. Natl. Acad. Sci. 109: 10498). Sin embargo, péptidos como SGMI-1 y SGMI-2 tienen un potencial limitado para su uso en aplicaciones terapéuticas debido a la corta vida media de los péptidos en el suero.

Resumen

Este resumen se proporciona para introducir una selección de conceptos en forma simplificada que se describen en más detalle más abajo en la Descripción Detallada. Las características de la invención se exponen de acuerdo con las reivindicaciones adjuntas. Otras descripciones en la presente descripción que no entran dentro de las reivindicaciones son para ayudar al experto en la comprensión y práctica de la invención que se describe. Para evitar dudas, se observa que la presente invención no se extiende a métodos de tratamiento del cuerpo humano o animal. Cualquier referencia en la descripción a métodos de tratamiento o diagnóstico in vivo se refiere a los compuestos, composiciones farmacéuticas y medicamentos de la presente invención para uso en un método de tratamiento del cuerpo humano o animal mediante terapia o para diagnóstico in vivo.

En la presente descripción se describe un anticuerpo aislado, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que comprende una secuencia de aminoácidos del péptido bioactivo, en donde la secuencia de aminoácidos del péptido bioactivo es un inhibidor del sistema del complemento y está fusionada a al menos uno de: (i) la región amino terminal de al menos una de: una región variable de cadena ligera y/o una región variable de cadena pesada; o (ii) la región carboxi terminal de al menos una de: una región constante de cadena ligera y/o una región constante de cadena pesada, en donde el anticuerpo inhibe la activación del complemento.

La presente invención proporciona un anticuerpo portador de péptido bioactivo aislado, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que comprende:

(i) una región variable de cadena pesada y una región variable de cadena ligera, cada una de las cuales comprende tres CDR que se unen específicamente a la MASP-2 humana, establecidas como la SEQ ID NO: 4, en donde dicha región variable de cadena pesada comprende la SEQ ID NO: 111 y dicha región variable de cadena ligera comprende la SEQ ID NO: 115; y

(ii) una secuencia peptídica de SGMI establecida como la SEQ ID NO: 6 o la SEQ ID NO:9; en donde el anticuerpo se selecciona del grupo que consiste en:

(a) en donde la secuencia peptídica de SGMI que comprende SGMI-1 establecida como la SEQ ID NO: 6, está fusionada a la región amino terminal de la región variable de cadena pesada del anticuerpo;

(b) en donde la secuencia peptídica de SGMI que comprende SGMI-1 establecida como la SEQ ID NO: 6, está fusionada a la región amino terminal de la región variable de cadena ligera del anticuerpo;

(c) en donde la secuencia peptídica de SGMI que comprende SGMI-1 establecida como la SEQ ID NO: 6, está fusionada a la región carboxi terminal de la región constante de cadena ligera del anticuerpo;

(d) en donde la secuencia peptídica de SGMI que comprende SGMI-2 establecida como la SEQ ID NO: 9, está fusionada a la región carboxi terminal de la región constante de cadena pesada del anticuerpo;

(e) en donde la secuencia peptídica de SGMI que comprende SGMI-2 establecida como la<s>E<q>ID NO: 9, está fusionada a la región amino terminal de la región variable de cadena ligera del anticuerpo; y

(f) en donde la secuencia peptídica de SGMI que comprende SGMI-2 establecida como la SEQ ID NO: 9, está fusionada a la región carboxi terminal de la región constante de cadena ligera del anticuerpo, en donde el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo inhibe la activación del complemento por la vía de las lectinas dependientes de MASP-2.

También se describe en la presente descripción un anticuerpo aislado, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que comprende: (i) una región variable de cadena pesada y/o una región variable de cadena ligera que comprende una o más CDR que se unen específicamente a la MASP-2; y (ii) al menos una secuencia peptídica núcleo de SGMI que comprende una secuencia de aminoácidos de acuerdo con: X1CTX2X3X4CX5Q (SEQ ID NO: 5), en donde: X1 es F o V, X2 es R o K, X3 es K o L, X4 es L o W y X5 es Y o N; y en donde la secuencia peptídica núcleo de SGMI está fusionada con al menos uno de: (a) la región amino terminal de al menos una de: una región variable de cadena ligera y/o una región variable de cadena pesada; o (b) la región carboxi terminal de al menos una de: una región variable de cadena ligera y/o una región variable de cadena pesada; o (c) la región carboxi terminal de al menos una de: una región constante humana de cadena ligera y/o una región constante humana de cadena pesada; en donde el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo inhibe la activación del complemento de la vía de las lectinas dependiente de MASP-2.

También se describe en la presente descripción un método para generar un anticuerpo que comprende una región variable que comprende una o más regiones determinantes complementarias (CDR) que se unen específicamente a la MASP-2 y al menos una secuencia peptídica núcleo de SGMI, donde el método comprende cultivar una célula que comprende una molécula de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos de dicho anticuerpo portador de péptidos en condiciones que permitan la expresión de las moléculas de ácido nucleico que codifican el anticuerpo y aíslan dicho anticuerpo portador de péptidos.

También se describe en la presente descripción un anticuerpo monoclonal aislado o un fragmento de unión a antígeno del mismo que se une a la MASP-2 humana y que además comprende una secuencia de aminoácidos correspondiente a al menos uno de SGMI-1 (establecida como la SEQ ID NO: 6) o SGMI-2 (establecida como la SEQ ID NO: 9), en donde dicho anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo inhibe la activación de C4 en un sustrato recubierto con manano con una IC50 de 10 nM o menos en suero humano al 1 %. En un caso, dicho anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo reconoce específicamente al menos parte de un epítopo reconocido por (i) un anticuerpo de referencia que comprende una región variable de cadena pesada como se establece como la SEQ ID NO: 111 y una región variable de cadena ligera establecida como la s Eq ID NO: 115, o (ii) un anticuerpo de referencia producido por la línea celular de hibridoma depositada en la Colección Europea de Cultivos Celulares (ECACC), Salisbury Wiltshire, Reino Unido, bajo el registro de acceso número 03050904.

También se describe en la presente descripción un método para preparar un anticuerpo portador de péptidos bioactivos, donde el método comprende: (a) injertar la secuencia de aminoácidos de al menos un péptido bioactivo de interés en: (i) al menos una de la CDR-H1, CDR-H2 o CDR-H3 de una región variable de cadena pesada que comprende una o más regiones estructurales de pollo y/o (ii) al menos una de la CDR-L1, CDR-L2 o CDR-L3 de la región variable de cadena ligera que comprende una o más regiones estructurales de pollo, y (b) determinar si el anticuerpo portador del péptido tiene al menos sustancialmente la misma o mayor actividad biológica que el péptido bioactivo aislado.

También se describe en la presente descripción un anticuerpo aislado, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que comprende una o más secuencias de aminoácidos del péptido bioactivo, en donde al menos una secuencia de aminoácidos del péptido bioactivo está injertada en al menos uno de: (i) una región variable de cadena ligera que comprende una o más regiones estructurales de pollo y/o (ii) una región variable de cadena pesada que comprende una o más regiones estructurales de pollo. En algunos casos, se injerta un péptido bioactivo en al menos una de la CDR-H1, CDR-H2 o CDR-H3 de una región variable de cadena pesada que comprende una o más regiones estructurales de pollo. En algunos casos, se injerta un péptido bioactivo en al menos una de la CDR-L1, CDR-L2 o CDR-L3 de una región variable de cadena ligera que comprende una o más regiones estructurales de pollo.

También se describe en la presente descripción un método para preparar un anticuerpo portador de péptidos bioactivos, donde el método comprende: (a) fusionar la secuencia de aminoácidos de al menos un péptido bioactivo de interés con: (i) una región amino terminal de al menos una de: una región variable de cadena ligera que comprende una o más regiones estructurales y/o una región variable de cadena pesada que comprende una o más regiones estructurales, y/o (ii) una región carboxi terminal de al menos uno de: una región constante de cadena ligera y/o una región constante de cadena pesada; y (b) determinar si el anticuerpo portador del péptido tiene al menos sustancialmente la misma o mayor actividad biológica en comparación con el péptido bioactivo aislado. También se describe en la presente descripción un anticuerpo aislado, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que comprende una secuencia de aminoácidos del péptido bioactivo, en donde la secuencia de aminoácidos del péptido bioactivo está fusionada a al menos uno de: (i) la región amino terminal de al menos una de: una región variable de cadena ligera que comprende una o más regiones estructurales y/o una región variable de cadena pesada que comprende una o más regiones estructurales; o (ii) la región carboxi terminal de al menos uno de: una región constante de cadena ligera y/o una región constante de cadena pesada, en donde el anticuerpo portador del péptido tiene al menos sustancialmente la misma o mayor actividad biológica en comparación con el péptido bioactivo aislado.

También se describe en la presente descripción un polipéptido aislado que comprende: (i) una región que comprende una secuencia núcleo de SGMI, donde la secuencia núcleo de SGMI comprende una secuencia de aminoácidos de acuerdo con: X1CTX2X3X4CX5Q (SEQ ID NO:5) en donde: X1 es F o V, X2 es R o K, X3 es K o L, X4 es L o W, y X5 es Y o N; y (ii) una región que comprende Fc de IgG1 humana, en donde el polipéptido inhibe la actividad de al menos una de MASP-1 o MASP-2.

También se describen en la presente descripción composiciones farmacéuticas que comprenden los anticuerpos portadores de péptidos bioactivos y fragmentos de unión a antígeno de los mismos, como se describe en la presente descripción.

También se describe en la presente descripción un método para inhibir la activación del complemento de la vía de las lectinas en un sujeto mamífero que lo necesita, que comprende administrar al sujeto una composición que comprende un anticuerpo portador del péptido SGMI, o un fragmento de unión al antígeno del mismo, en una cantidad suficiente para inhibir la activación de la vía de las lectinas.

También se describe en la presente descripción un método para fabricar un medicamento para su uso en la inhibición de la activación del complemento de lectina dependiente de MASP-2 y/o la activación del complemento de lectina dependiente de MASP-1 para tratar, prevenir o reducir la gravedad de una afección vascular mediada por el complemento de lectina, una lesión por isquemia-reperfusión, aterosclerosis, un trastorno inflamatorio gastrointestinal, una afección pulmonar, un procedimiento de reperfusión extracorpórea, una afección musculoesquelética, una afección renal, una afección de la piel, un trasplante de órganos o tejidos, un trastorno o lesión del sistema nervioso, un trastorno sanguíneo, un trastorno urogenital afección, diabetes, quimioterapia o radioterapia, neoplasia maligna, un trastorno endocrino, un trastorno de la coagulación, una microangiopatía trombótica o una afección oftalmológica, que comprende combinar una cantidad terapéuticamente efectiva de un anticuerpo portador de péptido bioactivo (por ejemplo, un anticuerpo portador de SGMI-2 , tal como un anticuerpo con SGMI-2 contra MASP-2 y/o un anticuerpo portador de SGMI-1, tal como un anticuerpo con SGMI-1 contra MASP-2, o un anticuerpo portador SGMI-1 y SGMI-2) o fragmento de unión a antígeno del mismo, capaz de inhibir la activación de la vía de la lectina dependiente de MASP-2 y/o la activación de la vía de la lectina dependiente de MASP-1 en un portador farmacéutico.

También se describe en la presente descripción un método para fabricar un medicamento para su uso en la inhibición de la activación de la vía de las lectinas y la activación de la vía alternativa dependiente de MASP-1 para tratar, prevenir o reducir la gravedad de una enfermedad o trastorno seleccionado del grupo que consiste en: Hemoglobinuria paroxística nocturna, degeneración macular relacionada con la edad, lesión por isquemiareperfusión, artritis, coagulación intravascular diseminada, microangiopatía trombótica (que incluye el síndrome urémico hemolítico (HUS), HUS atípico (HUSa) y púrpura trombocitopénica trombótica (TTP)), asma, enfermedad de depósito denso, glomerulonefritis necrosante semilunar pauci-inmune, lesión cerebral traumática, neumonía por aspiración, endoftalmitis, neuromielitis óptica y enfermedad de Behcet que comprenden la combinación de una cantidad terapéuticamente efectiva de al menos uno de (i) un anticuerpo portador de péptido bioactivo capaz de inhibir la actividad de MASP-1 (por ejemplo, un anticuerpo que comprende SGMI-1), (ii) un anticuerpo con SGMI-1 contra MASP-2, (iii) un anticuerpo portador del SGMI-1 y SGMI-2, o (iv) un primer anticuerpo portador de SGMI-1 y un segundo anticuerpo portador de SGMI-2 en un portador farmacéutico.

Como se describe en la presente descripción, los diversos casos de anticuerpos portadores de bioactivos y fragmentos de los mismos pueden usarse en las composiciones farmacéuticas de la invención.

Como se describe en la presente descripción, las composiciones farmacéuticas de la invención pueden usarse de acuerdo con los métodos de la descripción.

Descripción de las figuras

La descripción anterior y muchas de las ventajas que la acompañan se apreciarán más fácilmente a medida que se comprendan mejor con referencia a la siguiente descripción detallada, cuando se toman junto con las figuras adjuntas, en donde:

La Figura 1 es un gráfico de barras que muestra el por ciento de formación de C5b-C9 en presencia de suero positivo, suero negativo, control de isotipo, SGMI-1Fc o SGMI-2Fc, lo que demuestra que tanto SGMI-1Fc como SGMI-2Fc inhiben la activación de la vía de las lectinas, como se describe en el Ejemplo 2;

La Figura 2 ilustra gráficamente el nivel de deposición de C3b para suero normal al 1% más control de isotipo, SGMI-1Fc o SGMI-2Fc en un intervalo de concentración de 0,15 nM a 1000 nM, lo que demuestra que tanto SGMI-1Fc como SGMI-2Fc inhibieron la deposición de C3b de suero normal en pocillos de ELISA recubiertos con manano, como se describe en el Ejemplo 2;

La Figura 3 ilustra una secuencia de polipéptido de cadena pesada variable parental (DTLacO) ilustrativa en comparación con una secuencia de polipéptido de cadena pesada variable que comprende una secuencia de aminoácidos de péptido bioactivo injertada dentro de la región determinante de complementariedad 3 (CDR-3); La Figura 4 muestra una alineación de las secuencias de aminoácidos de polipéptidos de cadena pesada variables ilustrativas que comprenden el péptido bioactivo SGMI-1, y variantes del mismo, injertados dentro de la CDR-3, que incluye enlazadores opcionales en el extremo C y/o N-terminal del péptido bioactivo;

La Figura 5 ilustra una secuencia de polipéptido de cadena ligera variable parental (DTLacO) ilustrativa en comparación con una secuencia de polipéptido de cadena ligera variable que comprende un péptido bioactivo injertado dentro de la CDR-1;

La Figura 6 muestra una alineación de las secuencias de aminoácidos de polipéptidos de cadena ligera variables ilustrativas que comprenden el péptido bioactivo SGMI-1 o SGMI-2, y variantes del mismo, injertados dentro de la CDR-1, que incluye enlazadores opcionales en el extremo C y/o N-terminal del péptido bioactivo.

La Figura 7A ilustra gráficamente la actividad inhibidora de varios mAb quiméricos representativos humanos/de pollo que contienen SGMI-1 injertado en la CDR-H3 en la deposición de C5b-C9;

La Figura 7B ilustra gráficamente la actividad inhibidora de varios mAb quiméricos representativos humanos/de pollo adicionales que contienen SGMI-1 injertado en la CDR-3 en la deposición de C5b-C9;

La Figura 8A ilustra gráficamente la actividad inhibidora de varios mAb quiméricos representativos humanos/de pollo que contienen SGMI-1 injertado en la CDR-H3 en la actividad de deposición de C3b del complemento a manera de dosis-respuesta, como se describe en el Ejemplo 3;

La Figura 8B ilustra gráficamente la actividad inhibidora de varios mAb quiméricos representativos humanos/de pollo adicionales que contienen SGMI-1 injertado en la CDR-H3 en la actividad de deposición de C3b del complemento a manera de dosis-respuesta, como se describe en el Ejemplo 3;

La Figura 8C ilustra gráficamente la actividad inhibidora de varios anticuerpos monoclonales (mAb) quiméricos representativos humanos/de pollo que contienen SGMI-1 injertado en la CDR-L1 en la actividad de deposición de C3b del complemento a manera de dosis-respuesta, como se describe en el Ejemplo 3;

La Figura 8D ilustra gráficamente la actividad inhibidora de varios mAb quiméricos representativos humanos/de pollo adicionales que contienen SGMI-1 injertado en la CDR-L1 en la actividad de deposición de C3b del complemento a manera de dosis-respuesta, como se describe en el Ejemplo 3;

La Figura 9A ilustra gráficamente la actividad inhibidora de un mAb quimérico humano/de pollo que comprende SGMI-2 injertado dentro de la CDR-L1 (Ab-SGMI-2L-Igk) y una combinación de SGMI-1 injertado dentro de la CDR-H3 y SGMI-2 injertado dentro de la CDR-L1 (Ab-SGMI-1-L1-IgG1/SGMI-2L-IgA), lo que demuestra que la combinación quimérica de mAb SGMI-1 - SGMI-2 (Ab-SBMI-1-L1-IgG1/SGMI-2L-IgA) inhibe la deposición de C5b-C9, como se describe en el Ejemplo 3;

La Figura 9B ilustra gráficamente la actividad inhibidora de un mAb quimérico humano/de pollo que comprende una combinación de SGMI-1 injertado dentro de la CDR-H3 y SGMI-2 injertado dentro de la CDR-L1 (Ab-SGMI-1-L1-IgG1/SGMI-2L-IgA), lo que demuestra que la combinación quimérica de mAb SGMI-1 - SGMI-2 (Ab-SGMI-1-L1-IgG1/SGMI-2L-IgA) inhibe la deposición de C5b-C9, como se describe en el Ejemplo 3;

La Figura 10 ilustra un anticuerpo quimérico humano/de pollo que comprende péptidos bioactivos fusionados al extremo N-terminal de la región variable de la cadena pesada (A); y/o el extremo N-terminal de la región variable de cadena ligera (B); y/o el extremo C-terminal de la región constante de cadena pesada (C); y/o el extremo C-terminal de la región constante de cadena ligera (D), como se describe en el Ejemplo 4;

La Figura 11 ilustra gráficamente la actividad inhibidora de anticuerpos quiméricos humanos/de pollo que comprenden péptidos bioactivos SGMI-1 o SGMI-2 fusionados al extremo N o C-terminal de la cadena pesada o ligera, lo que demuestra que todas las fusiones de péptido-mAb inhiben la deposición de C5b-C9, como se describe en el Ejemplo 4;

La Figura 12 es un diagrama esquemático adaptado del documento de Schwaeble y otros, Immunobiol 205: 455 466 (2002), modificado por Yongqing y otros, BBA 1824: 253 (2012), que ilustra los dominios proteicos MASP-2 y MAp19 y los exones que los codifican;

La Figura 13 es un diagrama esquemático adaptado del documento de Schwaeble y otros, Immunobiol 205: 455 466 (2002), modificado por Yongqing y otros, BbA 1824: 253 (2012), que ilustra los dominios proteicos MASP-1, MASP-3 y MAp44 y los exones que los codifican;

Las Figuras 14A y 14B muestran una alineación de secuencias de aminoácidos de los clones de scFv más activos, lo que revela dos grupos distintos que pertenecen a la familia de genes VH2 y VH6, respectivamente, como se describe en el Ejemplo 5;

Las Figuras 15A y 15B muestran una alineación de secuencia de aminoácidos de los clones de scFv 17D20, 17N16, 18L16 y 4D9, como se describe en el Ejemplo 5;

La Figura 16 ilustra un andamiaje de anticuerpo contra MASP-2 que comprende uno o más péptidos SGMI fusionados al extremo N-terminal de la región variable de la cadena pesada (A); y/o el extremo N-terminal de la región variable de cadena ligera (B); y/o el extremo C-terminal de la región constante de cadena pesada (C); y/o el extremo C-terminal de la región constante de cadena ligera (D), como se describe en el Ejemplo 7;

La Figura 17A ilustra un andamiaje de anticuerpo scFv contra MASP-2 y un péptido SGMI fusionados al extremo N-terminal de la región variable de cadena pesada y/o al extremo C-terminal de la región variable de cadena ligera, como se describe en el Ejemplo 7;

La Figura 17B ilustra un andamiaje de anticuerpo scFv contra MASP-2 que comprende péptidos SGMI fusionados al extremo N-terminal de la región variable de cadena ligera y/o al extremo C-terminal de la región variable de cadena pesada, como se describe en el Ejemplo 7;

La Figura 18 ilustra fusiones representativas del anticuerpo contra MASP-2 (M2)-SGMI, como se describe en el Ejemplo 7.

La Figura 19 ilustra gráficamente los resultados de un ensayo de deposición de C3b llevado a cabo en suero de ratón al 10 % con un anticuerpo de andamiaje contra MASP-2 (HL-M2) desnudo representativo (mAb#6) en comparación con fusiones de anticuerpo contra MASP-2 (M2)-SGMI que comprende SGMI-1 o SGMI-2, como se describe en el Ejemplo 7;

La Figura 20A ilustra gráficamente los resultados de un ensayo de deposición de C4 llevado a cabo en plasma humano al 10 % con un anticuerpo de andamiaje contra MASP-2 (HL-M2) desnudo representativo (mAb#6) en comparación con fusiones de anticuerpo contra MASP-2 (M2)-SGMI que comprende SGMI-1 o SGMI-2, como se describe en el Ejemplo 7;

La Figura 20B ilustra gráficamente los resultados de un ensayo de deposición de C4 llevado a cabo en plasma humano al 10 % con un anticuerpo de andamiaje contra MASP-2 (HL-M2) desnudo representativo (mAb#6) en comparación con fusiones de anticuerpo contra MASP-2 (M2)-SGMI que comprende SGMI-1 o SGMI-2, como se describe en el Ejemplo 7;

La Figura 21 ilustra gráficamente los resultados de un ensayo de deposición de C3b llevado a cabo en suero humano al 10 % con un anticuerpo quimérico no específico humano/de pollo que comprende el péptido SGMI-1 fusionado al extremo C-terminal de la región constante de cadena ligera (L-SGMI-1-C); o un anticuerpo quimérico/humano no específico que comprende el péptido SGMI-1 fusionado al extremo N-terminal de la región variable de la cadena pesada (H-SGMI-1-N) en comparación con las fusiones homólogas de anticuerpo contra MASP-2 (M2)-SGMI-1, que muestran una inhibición sinérgica de la vía de las lectinas cuando el anticuerpo contra MASP-2 y SGMI-1 se fusionan en el mismo anticuerpo, como se describe en el Ejemplo 7;

La Figura 22A muestra una gráfica de la concentración de un anticuerpo de andamiaje contra MASP-2 (HL-M2) desnudo representativo (mAb#6) o fusiones de anticuerpo contra MASP-2 (M2)-SGMI-1 (conjunto de datos farmacocinéticos (PK)) vs. la actividad de la vía de las lectinas (deposición de C3b; conjunto de datos farmacodinámicos (PD)), en donde se usaron datos farmacodinámicos de los ratones no tratados para proporcionar puntos de datos comunes de "anticuerpo 0 nM" para todas las condiciones. Se combinaron los datos de todos los puntos temporales para cada grupo de tratamiento, como se describe en el Ejemplo 8; y La Figura 22B muestra una gráfica de la concentración de un anticuerpo de andamiaje contra MASP-2 (HL-M2) desnudo representativo (mAb#6) o fusiones de anticuerpo contra MASP-2 (M2)-SGMI-2 (conjunto de datos farmacocinéticos (PK)) vs. la actividad de la vía de las lectinas (deposición de C3b; conjunto de datos farmacodinámicos (PD)), en donde se usaron datos farmacodinámicos de los ratones no tratados para proporcionar puntos de datos comunes de "anticuerpo 0 nM" para todas las condiciones. Se combinaron los datos de todos los puntos temporales para cada grupo de tratamiento, como se describe en el Ejemplo 8.

Breve descripción del listado de secuencias

SEQ ID NO: 1 ADNc de MASP-1 humana;

SEQ ID NO: 2 proteína MASP-1 humana (con secuencia líder);

SEQ ID NO: 3 ADNc de MASP-2 humana;

SEQ ID NO: 4 proteína MASP-2 humana (con secuencia líder);

SEQ ID NO: 5: secuencia núcleo del péptido SGMI;

SEQ ID NO: 6 péptido SGMI-1L (longitud completa);

SEQ ID NO: 7 péptido SGMI-1M (versión truncada mediana);

SEQ ID NO: 8 péptido SGMI-1S (versión truncada corta);

SEQ ID NO: 9 péptido SGMI-2L (longitud completa);

SEQ ID NO: 10 péptido SGMI-2M (versión truncada mediana);

SEQ ID NO: 11 péptido SGMI-2S (versión truncada corta);

SEQ ID NO: 12 polipéptido IgG1-Fc humano;

SEQ ID NO: 13 enlazador peptídico #1 (12aa);

SEQ ID NO: 14: enlazador peptídico #2 (10aa);

SEQ ID NO: 15: ácido nucleico que codifica la fusión de polipéptidos que comprende la secuencia señal de la IL-2 humana, SGMI-1L, enlazador #1 y la IgG1-Fc humana;

SEQ ID NO: 16: fusión de polipéptido maduro que comprende SGMI-1L, enlazador #1 y la IgG1-Fc humana (SGMI-1Fc);

SEQ ID NO: 17: ácido nucleico que codifica la fusión de polipéptidos que comprende la secuencia señal de la IL-2 humana, SGMI-2L, enlazador #1 y la IgG1-Fc humana;

SEQ ID NO: 18: fusión de polipéptido maduro que comprende SGMI-2L, enlazador #1 y la IgG1-Fc humana (SGMI-2Fc);

SEQ ID NO: 19: cebador directo SGMI-1;

SEQ ID NO: 20: cebador inverso SGMI-1;

SEQ ID NO: 21: cebador directo SGMI-2;

SEQ ID NO: 22: cebador inverso SGMI-2;

SEQ ID NO: 23: región variable de cadena pesada de pollo de DTLacO (DTLacO VH) parental (clon #1);

SEQ ID NO: 24: región FR-1 conservada de región variable de cadena pesada de pollo;

SEQ ID NO: 25: región FR-2 conservada de región variable de cadena pesada de pollo;

SEQ ID NO: 26: región FR-3 conservada de región variable de cadena pesada de pollo;

SEQ ID NO: 27: región flanqueante de FR-3 adyacente a la CDR-H3 de la región variable de cadena pesada de pollo;

SEQ ID NO: 28: región FR-4 conservada de región variable de cadena pesada de pollo;

SEQ ID NO: 29: región flanqueante de FR-4 adyacente a la CDR-H3 de la región variable de cadena pesada de pollo;

SEQ ID NO: 30: Región variable de cadena ligera de pollo de DTLacO (DTLacO VL) parental (clon #1);

SEQ ID NO: 31: región FR-1 conservada de región variable de cadena ligera de pollo;

SEQ ID NO: 32: región flanqueante de FR-1 adyacente a la CDR-L1 de la región variable de cadena ligera de pollo;

SEQ ID NO: 33: región FR-2 conservada de región variable de cadena ligera de pollo;

SEQ ID NO: 34: región flanqueante de FR-2 adyacente a la CDR-L1 de la región variable de cadena ligera de pollo;

SEQ ID NO: 35: región FR-3 conservada de región variable de cadena ligera de pollo;

SEQ ID NO: 36: región FR-4 conservada de región variable de cadena ligera de pollo;

SEQ ID NO: 37-46: enlazadores peptídicos

SEQ ID NO: 47: región constante de la IgG1 humana (CH1-bisagra-CH2-CH3);

SEQ ID NO: 48: región constante de cadena ligera lambda humana;

SEQ ID NO: 49: polinucleótido que codifica el polipéptido que comprende la secuencia señal VH humana, la secuencia VH de pollo portador del SGMI-1L y la región constante de la IgG1 humana (pcDNA3-SGMI-1L-IgG1); SEQ ID NO: 50: polipéptido maduro que comprende la región VH de pollo portador del SGMI-1L y la región constante de la IgG1 humana (Ab-SGMI-1L-IgG1);

SEQ ID NO: 51: polinucleótido que codifica el polipéptido que comprende la secuencia señal VH humana, la secuencia VH de pollo portador del SGMI-1M y la región constante de la IgG1 humana (pcDNA3-SGMI-1M-IgG1 );

SEQ ID NO: 52: polipéptido maduro que comprende la región VH de pollo portador del SGMI-1M y la región constante de la IgG1 humana (Ab-SGMI-1M-IgG1);

SEQ ID NO: 53: polinucleótido que codifica el polipéptido que comprende la secuencia señal VH humana, la secuencia VH de pollo portador del SGMI-1S y la región constante de la IgG1 humana (pcDNA3-SGMI-1S-IgG1); SEQ ID NO: 54: polipéptido maduro que comprende la región VH de pollo portador del SGMI-1S y la región constante de la IgG1 humana (Ab-SGMI-1S-IgG1);

SEQ ID NO: 55: polinucleótido que codifica el polipéptido que comprende la secuencia señal VH humana, la secuencia VH de pollo portador del SGMI-1-L1 y la región constante de la IgG1 humana (pcDNA3-SGMI-1-L1-IgG1);

SEQ ID NO: 56: polipéptido maduro que comprende la región VH de pollo portador del SGMI-1-L1 y la región constante de la IgG1 humana (Ab-SGMI-1-L1-IgG1);

SEQ ID NO: 57: polinucleótido que codifica el polipéptido que comprende la secuencia señal VH humana, la secuencia VH de pollo portador del SGMI-1-L2 y la región constante de la IgG1 humana (pcDNA3-SGMI-1-L2-IgG1);

SEQ ID NO: 58: polipéptido maduro que comprende la región VH de pollo portador del SGMI-1-L2 y la región constante de la IgG1 humana (Ab-SGMI-1-L2-IgG1);

SEQ ID NO: 59: polinucleótido que codifica el polipéptido que comprende la secuencia señal VH humana, la secuencia VH de pollo portador del SGMI-1-L3 y la región constante de la IgG1 humana (pcDNA3-SGMI-1-L3-IgG1);

SEQ ID NO: 60: polipéptido maduro que comprende la región VH de pollo portador del SGMI-1-L3 y la región constante de la IgG1 humana (Ab-SGMI-1-L3-IgG1);

SEQ ID NO: 61: polinucleótido que codifica el polipéptido que comprende la secuencia señal VH humana, la secuencia VH de pollo portador del SGMI-1-L4 y la región constante de la IgG1 humana (pcDNA3-SGMI-1-L4-IgG1);

SEQ ID NO: 62: polipéptido maduro que comprende la región VH de pollo portador del SGMI-1-L4 y la región constante de la IgG1 humana (Ab-SGMI-1-L4-IgG1);

SEQ ID NO: 63: polinucleótido que codifica el polipéptido que comprende la secuencia señal VH humana, la secuencia VH de pollo portador del SGMI-1-L5 y la región constante de la IgG1 humana (pcDNA3-SGMI-1-L5-IgG1);

SEQ ID NO: 64: polipéptido maduro que comprende la región VH de pollo portador del SGMI-1-L5 y la región constante de la IgG1 humana (Ab-SGMI-1-L5-IgG1);

SEQ ID NO: 65: polinucleótido que codifica el polipéptido que comprende la secuencia señal VH humana, la secuencia VH de pollo portador del SGMI-1-L6 y la región constante de la IgG1 humana (pcDNA3-SGMI-1-L6-IgG1);

SEQ ID NO: 66: polipéptido maduro que comprende la región VH de pollo portador del SGMI-1-L6 y la región constante de la IgG1 humana (Ab-SGMI-1-L6-IgG1);

SEQ ID NO: 67: polinucleótido que codifica el polipéptido que comprende la secuencia señal VH humana, la secuencia VH de pollo portador del SGMI-1-L7 y la región constante de la IgG1 humana (pcDNA3-SGMI-1-L7-IgG1);

SEQ ID NO: 68: polipéptido maduro que comprende la región VH de pollo portador del SGMI-1-L7 y la región constante de la IgG1 humana (Ab-SGMI-1-L7-IgG1);

SEQ ID NO: 69: polinucleótido que codifica el polipéptido que comprende la secuencia señal VH humana, la secuencia VH de pollo portador del SGMI-1-L8 y la región constante de la IgG1 humana (pcDNA3-SGMI-1-L8-IgG1);

SEQ ID NO: 70: polipéptido maduro que comprende la región VH de pollo portador del SGMI-1-L8 y la región constante de la IgG1 humana (Ab-SGMI-1-L8-IgG1);

SEQ ID NO: 71: polinucleótido que codifica el polipéptido que comprende la secuencia señal VH humana, la secuencia VH de pollo portador del SGMI-1-L9 y la región constante de la IgG1 humana (pcDNA3-SGMI-1-L9-IgG1);

SEQ ID NO: 72: polipéptido maduro que comprende la región VH de pollo portador del SGMI-1-L9 y la región constante de la IgG1 humana (Ab-SGMI-1-L9-IgG1);

SEQ ID NO: 73: polinucleótido que codifica el polipéptido que comprende la secuencia señal VH humana, la secuencia VH de pollo portador del SGMI-1-L10 y la región constante de la IgG1 humana (pcDNA3-SGMI-1-L10-IgG1);

SEQ ID NO: 74: polipéptido maduro que comprende la región VH de pollo portador del SGMI-1-L10 y la región constante de la IgG1 humana (Ab-SGMI-1-L10-IgG1);

SEQ ID NO: 75: polinucleótido que codifica el polipéptido que comprende la secuencia señal VH humana, la secuencia VH de pollo portador del SGMI-1-L11 y la región constante de la IgG1 humana (pcDNA3-SGMI-1-L11-IgG1);

SEQ ID NO: 76: polipéptido maduro que comprende la región VH de pollo portador del SGMI-1-L11 y la región constante de la IgG1 humana (Ab-SGMI-1-L11-IgG1);

SEQ ID NO: 77: polinucleótido que codifica el polipéptido que comprende la secuencia señal VH humana, la secuencia VH de pollo portador del SGMI-1-L12 y la región constante de la IgG1 humana (pcDNA3-SGMI-1-L12-IgG1 );

SEQ ID NO: 78: polipéptido maduro que comprende la región VH de pollo portador del SGMI-1-L12 y la región constante de la IgG1 humana (Ab-SGMI-1-L12-IgG1);

SEQ ID NO: 79: polinucleótido que codifica el polipéptido que comprende la secuencia señal VL humana, la secuencia VL de pollo portador del SGMI-2L y la región constante de la IgA humana (pcDNA3-SGMI-2L-Igk); SEQ ID NO: 80: polipéptido maduro que comprende la región VL de pollo portador del SGMI-2L y la región constante de la IgA humana (Ab-SGMI-2L-IgA);

SEQ ID NO: 81: polinucleótido que codifica el polipéptido que comprende la secuencia señal VL humana, la secuencia VL de pollo portador del SGMI-2M y la región constante de la IgA humana (pcDNA3-SGMI-2M-IgA); SEQ ID NO: 82: polipéptido maduro que comprende la región VL de pollo portador del SGMI-2M y la región constante de la IgA humana (Ab-SGMI-2M-IgA);

SEQ ID NO: 83: polinucleótido que codifica el polipéptido que comprende la secuencia señal VL humana, la secuencia VL de pollo portador del SGMI-2S y la región constante de la IgA humana (pcDNA3-SGMI-2S-IgA); SEQ ID NO: 84: polipéptido maduro que comprende la región VL de pollo portador del SGMI-2S y la región constante de la IgA humana (Ab-SGMI-2S-Igk);

SEQ ID NO: 85: polinucleótido que codifica el polipéptido que comprende la región VL de pollo portador del SGMI-1L y la región constante de la IgA humana (pcDNA3-SGMI-1L-IgA);

SEQ ID NO: 86: polipéptido maduro que comprende la región VL de pollo portador del SGMI-1L y la región constante de la IgA humana (Ab-SGMI-lL-IgA);

SEQ ID NO: 87: polinucleótido que codifica un polipéptido que comprende la región VL de pollo portador del SGMI-1M y la región constante de la IgA humana (pcDNA3-SGMI-1M-IgA);

SEQ ID NO: 88: polipéptido maduro que comprende la región VL de pollo portador del SGMI-1M y la región constante de la IgA humana (Ab-SGMMM-IgA);

SEQ ID NO: 89: polinucleótido que codifica un polipéptido que comprende la región VL de pollo portador del SGMI-1S y la región constante de la IgA humana (pcDNA3-SGMI-1S-IgA);

SEQ ID NO: 90: polipéptido maduro que comprende la región VL de pollo portador del SGMI-1S y la región constante de la IgA humana (Ab-SGMMS-IgA);

SEQ ID NO: 91: región variable de cadena pesada de DTLacO (DTLacO VH) de pollo (clon #2);

SEQ ID NO: 92: región variable de cadena ligera de DTLacO (DTLacO VL) de pollo (clon #2);

SEQ ID NO: 93: polinucleótido que codifica el polipéptido que comprende la secuencia señal VH humana, la secuencia VH de pollo fusionada con SGMI-1, y la región constante de la IgG1 humana (pcDNA3-IgG1-S10); SEQ ID NO: 94: polipéptido maduro que comprende la región VH de pollo fusionada con SGMI-1 y la región constante de la IgG1 humana (Ab-IgG1-S10);

SEQ ID NO: 95: polinucleótido que codifica el polipéptido que comprende la secuencia señal VH humana, la secuencia VH de pollo fusionada con SGMI-2, y la región constante de la IgG1 humana (pcDNA3-IgG1-S20); SEQ ID NO: 96: polipéptido maduro que comprende la región VH de pollo fusionada con SGMI-2 y la región constante de la IgG1 humana (Ab-IgG1-S20);

SEQ ID NO: 97: polinucleótido que codifica el polipéptido que comprende la secuencia señal VH humana, la secuencia VH de pollo, y la región constante de la IgG1 humana fusionada con SGMI-1 (pcDNA3-IgG1-S01); SEQ ID NO: 98: polipéptido maduro que comprende la región VH de pollo y la región constante de la IgG1 humana fusionada conSg MI-1(Ab-IgG1-S01);

SEQ ID NO: 99: polinucleótido que codifica el polipéptido que comprende la secuencia señal VH humana, la secuencia VH de pollo, y la región constante de la IgG1 humana fusionada con SGMI-2 (pcDNA3-IgG1-S02); SEQ ID NO: 100: polipéptido maduro que comprende la región VH de pollo y la región constante de la IgG1 humana fusionada con SGMI-2 (Ab-IgG1-S02);

SEQ ID NO: 101: polinucleótido que codifica el polipéptido que comprende la secuencia señal VL humana, la secuencia VL fusionada con SGMI-1, y la región constante de la IgA humana (pcDNA3-IgA-S10);

SEQ ID NO: 102: polipéptido maduro que comprende la región VL de pollo fusionada con SGMI-1 y la región constante de la IgA humana (Ab-IgA-S10);

SEQ ID NO: 103: polinucleótido que codifica el polipéptido que comprende la secuencia señal VL humana, la secuencia VL fusionada con SGMI-2, y la región constante de la IgA humana (pcDNA3-IgA-S20);

SEQ ID NO: 104: polipéptido maduro que comprende la región VL de pollo fusionada con SGMI-2 y la región constante de la IgA humana (Ab-Igk-S20);

SEQ ID NO: 105: polinucleótido que codifica el polipéptido que comprende la secuencia señal VL humana, la secuencia VL de pollo, y la región constante de la IgA humana fusionada con SGMI-1 (pcDNA3-Igk-S01);

SEQ ID NO: 106: polipéptido maduro que comprende la región VL de pollo, y la región constante de la IgG1 humana fusionada con SGMI-1 (Ab-IgA-S01);

SEQ ID NO: 107: polinucleótido que codifica el polipéptido que comprende la secuencia señal VL humana, la secuencia VL de pollo, y la región constante de la IgA humana fusionada con SGMI-2 (pcDNA3-IgA-S02); y SEQ ID NO 108: polipéptido maduro que comprende la región VL de pollo, y la región constante de la IgG1 humana fusionada con SGMI-2 (Ab-IgA-S02);

ANTICUERPOS MONOCLONALES CONTRA MASP-2: cadenas VH

SEQ ID NO: 109 polipéptido de región variable de cadena pesada (VH) 17D20mc

SEQ ID NO: 110<a>D<n>que codifica la región variable de cadena pesada (VH) 17D20_dc35VH21N11VL (sin péptido señal)

SEQ ID NO: 111 polipéptido de región variable de cadena pesada (VH) 17D20_dc35VH21N11VL

SEQ ID NO: 112 polipéptido de región variable de cadena pesada (VH) 17N16mc

ANTICUERPOS MONOCLONALES CONTRA MASP-2: cadenas VL

SEQ ID NO: 113 polipéptido de región variable de cadena ligera (VL) 17D20mc

SEQ ID NO: 114 a Dn que codifica la región variable de cadena ligera (VL) 17D20_dc21N11VL (sin péptido señal)

SEQ ID NO: 115 polipéptido de región variable de cadena ligera (VL) 17D20_dc21N11VL

SEQ ID NO: 116 polipéptido de región variable de cadena ligera (VL) 17N16mc

SEQ ID NO: 117 Ad N que codifica la región variable de cadena ligera (VL) 17N16_dc17N9 (sin péptido señal) SEQ ID NO: 118 polipéptido de región variable de cadena ligera (VL) 17N16_dc17N9 CDR CADENA PEsAdA DE ANTICUERPOS MONOCLONALES CONTRA MASP-2

SEQ ID NO 119-122 CDR-H1

SEQ ID NO 123-126 CDR-H2

SEQ ID NO 127-131 CDR-H3

CDR DE CADENA LIGERA DE ANTICUERPOS MONOCLONALES CONTRA MASP-2

SEQ ID NO 132-136 CDR-L1

SEQ ID NO 137-141 CDR-L2

SEQ ID NO 142-145 CDR-L3

SEQ ID NO 146 cadena pesada consenso de la CDR-H3 de 17D20m y d3521N11

SEQ ID NO 147 cadena ligera de consenso de la CDR-L1 de 17D20m y d3521 N11

SEQ ID NO 148 cadena ligera consenso de la CDR-L1 de 17N16m y d17N9

SEQ ID NO 149 cadena ligera consenso de la CDR-L2 de 17D20m, d3521N11, 17N16m y d17N9

SEQ ID NO 150 cadena ligera consenso de la CDR-L3 de 17N16m y d17N9

SEQ ID NO 151 clon 17D20 en formato scFv

SEQ ID NO 152 clon 18L16 en formato scFv

SEQ ID NO 153 clon 4D9 en formato scFv

SEQ ID NO 154 clon 17L20 en formato scFv

SEQ ID NO 155 clon 17N16 en formato scFv

SEQ ID NO 156 clon 3F22 en formato scFv

SEQ ID NO 157 clon 9P13 en formato scFv

SEQ ID NO 158 ADNc que codifica la IgG4 de tipo salvaje

SEQ ID NO 159 polipéptido IgG4 de tipo salvaje

SEQ ID NO 160 ADNc que codifica el mutante de bisagra S228P de la IgG4

SEQ ID NO 161 polipéptido S228P mutante de la IgG4

SEQ ID NO 162 ADNc que codifica la IgG2 de tipo salvaje

SEQ ID NO 163 polipéptido IgG2 de tipo salvaje

SEQ ID NO 164 NimoAb101: Región variable de cadena pesada (rata)

SEQ ID NO 165 NimoAb101: Región variable de cadena ligera (rata)

SEQ ID NO 166 NimoAb101: CDR-H1

SEQ ID NO 167 NimoAb101: CDR-H2

SEQ ID NO 168 NimoAb101: CDR-H3

SEQ ID NO 169 NimoAb101: CDR-L1

SEQ ID NO 170 NimoAb101: CDR-L2

SEQ ID NO 171 NimoAb101: CDR-L3

SEQ ID NO 172-173: enlazadores peptídicos

SEQ ID NO: 174: polinucleótido que codifica el polipéptido que comprende VH-M2ab6-SGMI-1-N y la región constante de la IgG4 humana con mutación de bisagra

SEQ ID NO: 175: polipéptido maduro que comprende VH-M2ab6-SGMI-1-N y la región constante de la IgG4 humana con mutación de bisagra

SEQ ID NO: 176: polinucleótido que codifica el polipéptido que comprende VH-M2ab6-SGMI-2-N y la región constante de la IgG4 humana con mutación de bisagra

SEQ ID NO: 177: polipéptido maduro que comprende VH-M2b6-SGMI-2-N y la región constante de la IgG4 humana con mutación de bisagra

SEQ ID NO: 178: polinucleótido que codifica el polipéptido que comprende VH-M2ab6-SGMI-1-C y la región constante de la IgG4 humana con mutación de bisagra

SEQ ID NO: 179: polipéptido maduro que comprende VH-M2ab6-SGMI-1-C y la región constante de la IgG4 humana con mutación de bisagra

SEQ ID NO: 180: polinucleótido que codifica el polipéptido que comprende VH-M2ab6-SGMI-2-C y la región constante de la IgG4 humana con mutación de bisagra

SEQ ID NO: 181: polipéptido maduro que comprende VH-M2ab6-SGMI-2-C y la región constante de la IgG4 humana con mutación de bisagra

SEQ ID NO: 182: polinucleótido que codifica el polipéptido que comprende VL-M2ab6-SGMI-1-N y la región constante de la Ig lambda humana

SEQ ID NO: 183: polipéptido maduro que comprende VL-M2ab6-SGMI-1-N y la región constante de la Ig lambda humana

SEQ ID NO: 184: polinucleótido que codifica el polipéptido que comprende VL-M2ab6-SGMI-2-N y la región constante de la Ig lambda humana

SEQ ID NO: 185: polipéptido maduro que comprende VL-M2ab6-SGMI-2-N y la región constante de la Ig lambda humana

SEQ ID NO: 186: polinucleótido que codifica el polipéptido que comprende VL-M2ab6-SGMI-1-C y la región constante de la Ig lambda humana

SEQ ID NO: 187: polipéptido maduro que comprende VL-M2ab6-SGMI-1-C y la región constante de la Ig lambda humana

SEQ ID NO: 188: polinucleótido que codifica el polipéptido que comprende VL-M2ab6-SGMI-2-C y la región constante de la Ig lambda humana

SEQ ID NO: 189: polipéptido maduro que comprende VL-M2ab6-SGMI-2-C y la región constante de la Ig lambda humana

SEQ ID NO: 190: H-DT40-Ab-SGMI-1-N

SEQ ID NO: 191: L-DT40-Ab-SGMI-1-C

SEQ ID NO: 192-195: enlazadores peptídicos adicionales

Descripción detallada

I. Definiciones

A menos que se definan específicamente en la presente descripción, todos los términos usados en la presente descripción tienen el mismo significado que entenderían los expertos en la técnica de la presente invención. Las siguientes definiciones se proporcionan para proporcionar claridad con respecto a los términos tal como se usan en la especificación y las reivindicaciones para describir la presente invención.

Como se usa en la presente descripción, un "anticuerpo" es una molécula de inmunoglobulina capaz de unirse específicamente a una diana, tal como un carbohidrato, polinucleótido, lípido, polipéptido, etc., a través de al menos un sitio de reconocimiento de epítopo, ubicado en la región variable (también denominada en la presente descripción como el dominio variable) de la molécula de inmunoglobulina. En algunos casos, el anticuerpo descrito en la presente descripción comprende una región variable de pollo y comprende además una secuencia de aminoácidos peptídicos bioactivos injertada en una región determinante de la complementariedad (CDR). En algunos casos, el anticuerpo como se describe en la presente descripción comprende una región variable humana o no humana (por ejemplo, ratón, rata, pollo, camélidos, sintética, etc.) y comprende además un péptido bioactivo fusionado a la región amino y/o carboxi terminal de la cadena ligera y/o pesada. Se proporcionan ejemplos de regiones variables sintéticas en el documento de Holliger y Hudson, Nature Biotechnology, vol 23(9): 1126-1136, 2005. No se pretende que el término "anticuerpo" esté limitado con respecto a la fuente del anticuerpo o la forma en que se produce (por ejemplo, mediante hibridoma, selección de fagos, expresión recombinante, animal transgénico, síntesis de péptidos, etc.). Como se usa en la presente, el término anticuerpo abarca no sólo anticuerpos policlonales o monoclonales intactos, sino también fragmentos de los mismos (tales como un anticuerpo de región variable única (dAb) u otros fragmentos de anticuerpos conocidos tales como Fab, Fab', F(ab')2, Fv y similares, de cadena sencilla (ScFv), variantes sintéticas de los mismos, variantes naturales, proteínas de fusión que comprenden una porción de anticuerpo con un fragmento de unión al antígeno de la especificidad requerida, anticuerpos humanizados, anticuerpos quiméricos y cualquier otra configuración modificada de la molécula de inmunoglobulina que comprende un sitio o fragmento de unión a antígeno (sitio de reconocimiento de epítopo) de la especificidad requerida. "Diacuerpos", fragmentos multivalentes o multiespecíficos construidos mediante fusión de genes (el documento WO94/13804; P. Holliger y otros, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 906444-6448, 1993) también son una forma particular de anticuerpo contemplado en la presente descripción. También se incluyen en la presente descripción minicuerpos que comprenden un scFv unido a un dominio CH3 (documento de S. Hu y otros, Cancer Res., 56, 3055-3061, 1996). Ver por ejemplo, el documento de Ward, E. S. y otros, Nature 341, 544-546 (1989); el documento de Bird y otros, Science, 242, 423-426, 1988; el documento de Huston y otros, PNAS USA, 85, 5879-5883, 1988); el documento PCT/US92/09965; el documento WO94/13804; el documento de P. Holliger y otros, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 6444-6448, 1993; el documento de Y. Reiter y otros, Nature Biotech, 14, 1239-1245, 1996; el documento de S. Hu y otros, Cancer Res., 56, 3055-3061, 1996. También se contemplan nanocuerpos y maxicuerpos (ver, por ejemplo, los documentos U.S. 6,765,087, U.S. 6,838,254, WO06/079372, WO/2010037402).

Como se usa en la presente descripción, el término "región hipervariable" se refiere a los residuos de aminoácidos de un anticuerpo que son responsables de la unión al antígeno. La región hipervariable generalmente comprende residuos de aminoácidos de una "región determinante complementaria" o "CDR" (es decir, de alrededor de los residuos 24-34 (L1), 50-56 (L2) y 89-97 (L3) en el dominio variable de cadena ligera, y alrededor de aproximadamente 31-35 (H1), 50-65 (H2) y 95-102 (H3) en el dominio variable de cadena pesada cuando se numera de acuerdo con el sistema de numeración de Kabat como se describe en el documento de Kabat, y otros, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md (1991)); y/o aquellos residuos de un "lazo hipervariable" (es decir, residuos 24-34 (L1), 50-56 (L2) y 89-97 (L3) en el dominio variable de cadena ligera, y 26-32 (H1), 52-56 (H2) y 95-102 (H3) en el dominio variable de cadena pesada cuando se numeran de acuerdo con el sistema de numeración de Chothia, como se describe en el documento de Chothia y Lesk, J. Mol. Biol. 196: 901-917 (1987)); y/o aquellos residuos de un "lazo hipervariable"/CDR (por ejemplo, residuos 27-38 (L1), 56-65 (L2) y 105-117 (L3) en el VL, y 27-38 (H1), 56-65 (H2) y 105-117 (H3) en el VH cuando están numerados de acuerdo con el sistema de numeración IMGT como se describe en el documento de Lefranc, J.P. y otros, Nucleic Acids Res 27: 209-212; Ruiz, M., y otros, Nucleic Acids Res 28: 219-221 (2000)).

Como se usa en la presente descripción, el término "injertado en una región CDR" se refiere a introducir una secuencia peptídica bioactiva en al menos una región CDR de una región variable de una cadena pesada o ligera que comprende regiones estructurales de pollo (FR1, FR2, FR3 y FR4) parentales genéricas de la cadena pesada o ligera, en donde las regiones estructurales flanqueantes permanecen intactas, y en donde o bien la secuencia CDR nativa completa se reemplaza con el péptido bioactivo, o al menos un aminoácido, al menos dos, al menos tres, al menos cuatro, al menos cinco, o más, hasta todos los residuos de aminoácidos de la secuencia CDR nativa se retienen como secuencias enlazadoras que flanquean el péptido bioactivo en la región variable de cadena pesada o ligera que comprende el péptido bioactivo injertado.

Como se usa en la presente descripción, el término "fusionado sobre una cadena ligera o pesada" se refiere a fusionar una secuencia peptídica bioactiva en la región amino terminal o en la región carboxi terminal de una cadena pesada o cadena ligera de un anticuerpo que comprende un la región variable humana o no humana (por ejemplo, ratón, rata, pollo, camélidos, sintéticos, etc.).

El término "fragmento de unión a antígeno" como se usa en la presente descripción se refiere a un fragmento de polipéptido que contiene al menos una CDR de una cadena pesada y/o ligera de inmunoglobulina que se une a un antígeno de interés, que incluye un fragmento de polipéptido que contiene al menos un péptido bioactivo injertado en una CDR, o un péptido bioactivo fusionado a una cadena ligera o cadena pesada, en donde el fragmento de polipéptido se une a una diana del péptido bioactivo, tal como MASP-1 o MASP-2. Con respecto a esto, un fragmento de unión a antígeno de los anticuerpos descritos en la presente descripción puede comprender 1, 2, 3, 4, 5 o las 6 CDR de una secuencia VH y VL establecida, en donde los anticuerpos se unen a una diana de un péptido bioactivo de interés, tal como MASP-1 o MASP-2. Un fragmento de unión a antígeno de los anticuerpos específicos contra MASP-1 o MASP-2 descritos en la presente descripción es capaz de unirse a MASP-1 o MASP-2. En determinados casos, la unión de un fragmento de unión a antígeno previene o inhibe la unión de una diana de un péptido bioactivo de interés (por ejemplo, un ligando de GPCR a su receptor), lo que interrumpe la respuesta biológica resultante de la unión del ligando al receptor. En determinados casos, el fragmento de unión al antígeno se une específicamente y/o inhibe o modula la actividad biológica de una diana de un péptido bioactivo de interés. En determinados casos, el fragmento de unión al antígeno inhibe la activación del complemento. En determinados casos, el fragmento de unión al antígeno inhibe la activación del complemento por la vía de las lectinas. En determinados casos, el fragmento de unión al antígeno se une específicamente y/o inhibe o modula la actividad biológica de MASP-1 humana y/o MASP-2 humana. En determinados casos, el fragmento de unión a antígeno se refiere a un fragmento de polipéptido que contiene al menos una CDR de una cadena pesada y/o ligera de inmunoglobulina que se une a MASP-2 (por ejemplo, MASP-2 humana). En un caso, un fragmento de unión a antígeno de los anticuerpos descritos en la presente descripción puede comprender 1, 2, 3, 4, 5 o las 6 CDR de una secuencia VH y VL establecida en la presente descripción de los anticuerpos que se unen a MASP-2. Un fragmento de unión a antígeno de los anticuerpos específicos contra MASP-2 descritos en la presente descripción es capaz de unirse a MASP-2. En determinados casos, el fragmento de unión al antígeno se une específicamente y/o inhibe o modula la actividad biológica de MASP-2 humana y/o MASP-1 humana. En determinados casos, un fragmento de unión al antígeno inhibe la activación del complemento dependiente de MASP-2 y/o MASP-1.

El término "antígeno" se refiere a una molécula o una porción de una molécula capaz de unirse mediante un agente aglutinante selectivo, tal como un anticuerpo de interés, que incluye una molécula diana o una porción de una molécula capaz de unirse mediante un péptido bioactivo de interés, y/o adicionalmente capaz de usarse en un animal para producir anticuerpos capaces de unirse a un epítopo de ese antígeno. Un antígeno puede tener uno o más epítopos.

Como se usa en la presente descripción, un "epítopo" se refiere al sitio en una proteína (por ejemplo, una diana de un anticuerpo o péptido bioactivo (por ejemplo, péptido SGMI) tal como una proteína MASP-1 o MASP-2) al que se une un anticuerpo. Los "epítopos superpuestos" incluyen al menos uno (por ejemplo, dos, tres, cuatro, cinco o seis) residuos de aminoácidos comunes, que incluyen epítopos lineales y no lineales. En determinados casos, los epítopos pueden incluir agrupaciones superficiales químicamente activas de moléculas tales como aminoácidos, cadenas laterales de azúcar, grupos fosforilo o grupos sulfonilo y, en determinados casos, pueden tener características estructurales tridimensionales específicas y/o características de carga específicas. En determinados casos, se dice que un anticuerpo se une específicamente a una proteína diana cuando reconoce preferentemente su proteína diana en una mezcla compleja de proteínas y/o macromoléculas. Se dice que un anticuerpo se une específicamente a una proteína diana (también denominada antígeno diana) cuando la constante de disociación en equilibrio es menor o igual a 10'6 M, o menor o igual a 10'7 M, o menor o igual a 10'8 M. En algunos casos, la constante de disociación de equilibrio puede ser menor o igual a 10'9 M o menor o igual a 10'10 M.

La enzima proteolítica papaína escinde preferentemente moléculas de IgG para producir varios fragmentos, dos de los cuales (los fragmentos F(ab)) comprenden cada uno un heterodímero covalente que incluye un sitio de unión al antígeno intacto. La enzima pepsina es capaz de escindir moléculas de IgG para proporcionar varios fragmentos, que incluye el fragmento F(ab')2, que comprende ambos sitios de unión al antígeno. Un fragmento Fv para su uso de acuerdo con determinados casos de la presente invención puede producirse mediante escisión proteolítica preferencial de una IgM y, en raras ocasiones, de una molécula de inmunoglobulina IgG o IgA. Sin embargo, los fragmentos Fv se obtienen más comúnmente mediante el uso de técnicas recombinantes conocidas en la técnica. El fragmento Fv incluye un heterodímero V<h>::V<l>no covalente que incluye un sitio de unión al antígeno que conserva gran parte de las capacidades de unión y reconocimiento del antígeno de la molécula de anticuerpo nativa. Ver, por ejemplo, el documento de Inbar y otros (1972) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 69: 2659-2662; el documento de Hochman y otros (1976) Biochem 15: 2706-2710; y el documento de Ehrlich y otros (1980) Biochem 19: 4091-4096.

En determinados casos, se contemplan anticuerpos Fv o scFV de cadena sencilla. Por ejemplo, los cuerpos Kappa (documento de III y otros, Prot. Eng. 10: 949-57,1997); minicuerpos (documento de Martín y otros, e MbO J. 13: 5305-9,1994); diacuerpos (documento de Holliger y otros, PNAS 90: 6444-8,1993); o Janusinos (documento de Traunecker y otros, EMBO J. 10: 3655-59,1991) y (documento de Traunecker y otros, Int. J. Cancer Suppl. 7: 51 52,1992), pueden prepararse mediante el uso de técnicas de biología molecular estándar siguiendo las enseñanzas de la presente solicitud con respecto a la selección de anticuerpos que tengan la especificidad deseada. En otros casos más, pueden prepararse anticuerpos biespecíficos o quiméricos que abarquen los anticuerpos que comprenden péptidos bioactivos injertados y/o fusiones de anticuerpos de péptidos bioactivos (por ejemplo, SGMI) de la presente descripción. Por ejemplo, un anticuerpo quimérico puede comprender CDR y regiones estructurales de diferentes anticuerpos, mientras que pueden generarse anticuerpos biespecíficos que se unen específicamente a la diana de un primer péptido bioactivo (por ejemplo, un primer péptido SGMI tal como SGMI-1) a través de un dominio de unión y a una diana de un segundo péptido bioactivo (por ejemplo, un segundo péptido SGMI tal como SGMI-2) a través de un segundo dominio de unión. En otro caso, pueden generarse anticuerpos biespecíficos y/o triespecíficos que se unen a la diana del anticuerpo original a través de un dominio de unión y a una diana del primer y/o segundo péptido bioactivo a través de un segundo y/o tercer dominio de unión introducido por la presencia del péptido bioactivo. Estos anticuerpos pueden producirse mediante técnicas de biología molecular recombinante o pueden conjugarse físicamente entre sí.

Un polipéptido Fv (scFv) de cadena sencilla es un heterodímero V<h>::V<l>unido covalentemente que se expresa a partir de una fusión de genes que incluye genes que codifican V<h>y V<l>unidos por un enlazador que codifica un péptido. En el documento de Huston y otros (1988) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 85(16): 5879-5883 se ha descrito un número de métodos para discernir estructuras químicas para convertir las cadenas polipeptídicas ligeras y pesadas, naturalmente agregadas, pero químicamente separadas, de una región variable (V) de anticuerpo en una molécula scFv, que se pliega en una estructura tridimensional sustancialmente similar a la estructura de un sitio de unión a antígeno. Ver, por ejemplo, las patentes de Estados Unidos núm: 5,091,513 y núm: 5,132,405, de Huston y otros; y la patente de Estados Unidos núm: 4,946,778, de Ladner y otros. Un fragmento dAb de un anticuerpo consiste en un dominio VH (documento de Ward, E. S. y otros, Nature 341, 544-546 (1989)).

En determinados casos, un anticuerpo como se describe en la presente descripción (por ejemplo, un anticuerpo específico de MASP-1 o MASP-2) tiene forma de un diacuerpo. Los diacuerpos son multímeros de polipéptidos, que comprende cada polipéptido un primer dominio que comprende una región de unión de una cadena ligera de inmunoglobulina y un segundo dominio que comprende una región de unión de una cadena pesada de inmunoglobulina, estando unidos los dos dominios (por ejemplo, mediante un enlazador peptídico) pero incapaces de asociarse entre sí para formar un sitio de unión a antígeno: los sitios de unión a antígeno se forman mediante la asociación del primer dominio de un polipéptido dentro del multímero con el segundo dominio de otro polipéptido dentro del multímero (documento WO94/13804).

Cuando los anticuerpos biespecíficos van a usarse, estos pueden ser anticuerpos biespecíficos convencionales que pueden fabricarse en una variedad de formas (documento de Holliger, P. y Winter, G. Current Opinion Biotechnol. 4, 446-449 (1993)), por ejemplo, preparados químicamente o a partir de hibridomas híbridos, o puede ser cualquiera de los fragmentos de anticuerpos biespecíficos mencionados anteriormente. Los diacuerpos y los scFv pueden construirse sin región Fc, mediante el uso solo de dominios variables, lo que potencialmente reduce los efectos de la reacción anti-idiotipo.

Los diacuerpos biespecíficos, opuesto a los anticuerpos completos biespecíficos, también pueden ser particularmente útiles, ya que pueden construirse fácilmente y expresar enE. coli.Los diacuerpos (y muchos otros polipéptidos tales como fragmentos de anticuerpos) de especificidades de unión adecuadas, pueden seleccionarse fácilmente mediante el uso de una presentación de fagos (documento WO94/13804) a partir de bibliotecas. Si uno de los brazos del diacuerpo se mantiene constante, por ejemplo, con una especificidad dirigida contra el antígeno X, a continuación, puede hacerse una biblioteca, donde el otro brazo es muy variado y se selecciona un anticuerpo de especificidad adecuada. Pueden producirse anticuerpos completos biespecíficos mediante ingeniería de perillas en orificios (documento de J. B. B. Ridgeway y otros, Protein Eng., 9, 616-621, 1996).

En determinados casos, los anticuerpos descritos en la presente descripción pueden proporcionarse en forma de UniBody®. Un UniBody® es un anticuerpo IgG4 al que se le ha eliminado la región bisagra (ver el documento de GenMab Utrecht, Países Bajos; ver también, por ejemplo, el documento US20090226421). Esta tecnología patentada de anticuerpos crea un formato de anticuerpo más pequeño y estable con una ventana terapéutica anticipada más larga que los formatos de anticuerpos pequeños actuales. Los anticuerpos IgG4 no activan el sistema del complemento. Los anticuerpos IgG4 completamente humanos pueden modificarse mediante la eliminación de la región bisagra del anticuerpo para obtener fragmentos de media molécula que tienen propiedades de estabilidad distintas con relación a la IgG4 intacta correspondiente (GenMab, Utrecht). Reducir a la mitad la molécula de IgG4 deja solo un área en el UniBody® que puede unirse a antígenos afines (por ejemplo, enfermedades diana) y el UniBody®, por lo tanto, se une de manera univalente a un solo sitio en las células diana. Para determinados antígenos de superficie de células cancerígenas, esta unión univalente puede no estimular el crecimiento de las células cancerígenas, como puede observarse mediante el uso de anticuerpos bivalentes que tienen la misma especificidad de antígeno y, por lo tanto, la tecnología UniBody® puede ofrecer opciones de tratamiento para algunos tipos de cáncer que pueden ser refractarios al tratamiento con anticuerpos convencionales. El UniBody® es aproximadamente la mitad del tamaño de un anticuerpo IgG4 normal. Este pequeño tamaño puede suponer un gran beneficio en el tratamiento de algunas formas de cáncer, ya que permite una mejor distribución de la molécula sobre tumores sólidos más grandes y potencialmente aumenta la eficacia.

En determinados casos, los anticuerpos de la presente descripción pueden tomar la forma de un nanocuerpo. Los nanocuerpos se codifican por genes únicos y se producen eficientemente en casi todos los hospederos procariotas y eucariotas, por ejemplo,E. coli(ver, por ejemplo, la patente de los Estados Unidos núm. 6,765,087), mohos (por ejemplo,AspergillusoTrichoderma)y levadura (por ejemplo,Saccharomyces, Kluyveromyces, HansenulaoPichia)(ver, por ejemplo, la patente de los Estados Unidos núm. 6,838,254). El proceso de producción es escalable y se han producido cantidades de varios kilogramos de nanocuerpos. Los nanocuerpos pueden formularse como una solución lista para su uso que tenga una larga vida útil. El método de Nanoclon (ver, por ejemplo, el documento WO 06/079372) es un método patentado para generar nanocuerpos contra una diana deseada, en base a la selección optimizada automática de células B.

En determinados casos, los anticuerpos y sus fragmentos de unión a antígeno como se describen en la presente descripción incluyen un conjunto de las CDR de cadena pesada y de cadena ligera, respectivamente interpuestos entre un conjunto de regiones estructurales (FR) de cadena pesada y de cadena ligera que proporcionan soporte a las CDR y definen la relación espacial de las CDR entre sí. Como se usa en la presente descripción, el término "conjunto de las CDR" se refiere a las tres regiones hipervariables de una región V de cadena pesada o ligera. Partiendo del extremo N-terminal de una cadena pesada o ligera, estas regiones se denominan "CDR1", "CDR2" y "CDR3", respectivamente. Un sitio de unión al antígeno, por lo tanto, incluye seis CDR, que comprenden el conjunto de las CDR de cada una de una región V de cadena pesada y ligera. Un polipéptido que comprende una única CDR (por ejemplo, una CDR1, CDR2 o CDR3) se denomina en la presente descripción como "unidad de reconocimiento molecular". El análisis cristalográfico de varios complejos antígeno-anticuerpo ha demostrado que los residuos de aminoácidos de las CDR forman un contacto extenso con el antígeno unido, en donde el contacto más extenso con el antígeno es con la CDR3 de la cadena pesada. Por tanto, las unidades de reconocimiento molecular son las principales responsables de la especificidad de un sitio de unión a antígeno.

Como se usa en la presente descripción, el término "conjunto de las FR" se refiere a las cuatro secuencias de aminoácidos flanqueantes que encuadran las CDR de un conjunto de las CDR de una región V de cadena pesada o ligera. Algunos residuos de FR pueden entrar en contacto con el antígeno unido; sin embargo, las FR son las principales responsables del plegamiento de la región V en el sitio de unión al antígeno, particularmente los residuos de FR directamente adyacentes a las CDR. Dentro de las FR, determinados residuos amino y determinadas características estructurales están muy conservados. Con respecto a esto, todas las secuencias de la región V contienen un lazo disulfuro interno de alrededor de 70-90 residuos de aminoácidos. Cuando las regiones V se pliegan en un sitio de unión, las CDR se muestran como motivos de lazo proyectados que forman una superficie de unión al antígeno. Generalmente se reconoce que existen regiones estructurales conservadas de las FR que influyen en la forma plegada de los bucles de la CDR en determinadas estructuras "canónicas", independientemente de la secuencia de aminoácidos precisa de la CDR. Además, se sabe que determinados residuos de la FR participan en contactos entre dominios no covalentes que estabilizan la interacción de las cadenas pesada y ligera del anticuerpo.

Como se usa en la presente descripción, el término "región estructural de pollo o una variante de la misma" se refiere a las regiones FR de un anticuerpo de pollo y variantes conservadas de las mismas, por ejemplo como se describe en la presente descripción y se describe adicionalmente en el documento de Wu y otros, J. Immunol 188: 322-333 (2012), incorporado como referencia en la presente descripción.

Las estructuras y ubicaciones de las regiones variables de inmunoglobulina pueden determinarse mediante referencia al documento de Kabat, E. A. y otros, Sequences of Proteins of Immunological Interest. 4ta edición. US Department of Health and Human Services. 1987, y las actualizaciones de la misma, ahora disponibles en Internet (immuno.bme.nwu.edu).

Un "anticuerpo monoclonal" se refiere a una población de anticuerpos homogénea en donde el anticuerpo monoclonal está compuesto de aminoácidos (de origen natural y de origen no natural) que están implicados en la unión selectiva de un epítopo. Los anticuerpos monoclonales son altamente específicos y están dirigidos a un solo epítopo. El término "anticuerpo monoclonal" abarca no sólo anticuerpos monoclonales intactos y anticuerpos monoclonales de longitud completa, sino también fragmentos de los mismos (tales como Fab, Fab', F(ab')2, Fv), de cadena sencilla (ScFv), variantes de las mismas, proteínas de fusión que comprenden una porción de unión al antígeno, anticuerpos monoclonales humanizados, anticuerpos monoclonales quiméricos y cualquier otra configuración modificada de la molécula de inmunoglobulina que comprende un fragmento de unión al antígeno (sitio de reconocimiento de epítopo) de la especificidad requerida y la capacidad de unirse a un epítopo. No se pretende limitarse respecto a la fuente del anticuerpo o la forma en que se produce (por ejemplo, mediante hibridoma, selección de fagos, expresión recombinante, animal transgénico, etc.). El término incluye inmunoglobulinas completas así como también los fragmentos, etc., descritos anteriormente bajo la definición de "anticuerpo".

Los anticuerpos "humanizados" se refieren a una molécula quimérica, generalmente preparada mediante el uso de técnicas recombinantes, que tiene un sitio de unión al antígeno derivado de una inmunoglobulina de una especie no humana (por ejemplo, un pollo) y la estructura de inmunoglobulina restante de la molécula basada en la estructura y/o secuencia de una inmunoglobulina humana. El sitio de unión al antígeno puede comprender regiones variables completas fusionadas en dominios constantes o solo las CDR injertadas (que incluye las CDR que comprenden secuencias peptídicas bioactivas injertadas) en regiones estructurales apropiadas en las regiones variables. Los sitios de unión a epítopos pueden ser de tipo salvaje o estar modificados por una o más sustituciones de aminoácidos. Esto elimina la región constante como inmunógeno en individuos humanos, pero permanece la posibilidad de una respuesta inmune a la región variable extraña (documento de LoBuglio, A. F. y otros, (1989) Proc Natl Acad Sci USA 86: 4220-4224; documento de Queen y otros, PNAS (1988) 86: 10029-10033; documento de Riechmann y otros, Nature (1988) 332: 323-327).

En determinados casos, los anticuerpos de la presente descripción pueden ser anticuerpos quiméricos. Con respecto a esto, en un caso, un anticuerpo quimérico está compuesto por un fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo que comprende una secuencia peptídica bioactiva injertada en una CDR de una región variable operativamente unida o fusionada de cualquier otra manera a una porción Fc heteróloga de un anticuerpo diferente, o fusionado al extremo N o C-terminal de la cadena pesada o ligera. En determinados casos, el dominio Fc heterólogo es de origen humano. En otros casos, el dominio Fc heterólogo puede ser de una clase de Ig diferente del anticuerpo original, que incluye la IgA (que incluye las subclases IgA1 e IgA2), IgD, IgE, IgG (que incluye las subclases IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4) y la IgM. En casos adicionales, el dominio Fc heterólogo puede estar compuesto por dominios CH2 y CH3 de una o más de las diferentes clases de Ig. Como indicó anteriormente con respecto a los anticuerpos humanizados, el fragmento de unión al antígeno de un anticuerpo quimérico puede comprender solo una o más de las CDR de los anticuerpos descritos en la presente descripción (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5 o 6 CDR de los anticuerpos humanizados descritos en el presente documento), o puede comprender una región variable completa (VL, VH o ambas).

En determinados casos, un anticuerpo que comprende una secuencia peptídica bioactiva comprende una o más de las CDR de los anticuerpos descritos en la presente descripción. En determinados casos, un anticuerpo que comprende una secuencia peptídica bioactiva comprende una o más de las CDR de los anticuerpos específicos contra MASP-2 descritos en la presente descripción. Además, con respecto a esto, se ha demostrado en algunos casos que la transferencia de sólo el VH-CDR3 de un anticuerpo puede realizarse al mantener la retención de la unión específica deseada (documento de Barbas y otros, PNAS (1995) 92: 2529-2533). Ver también, documento de McLane y otros, PNAS (1995) 92: 5214-5218, documento de Barbas y otros, J. Am. Chem. Soc. (1994)116: 2161 2162.

Como se usa en la presente descripción, el término "activación del complemento dependiente de MASP-2" comprende la activación dependiente de MASP-2 de la vía de las lectinas, que se produce en condiciones fisiológicas (es decir, en presencia de Ca++) que conduce a la formación de la convertasa C3 C4b2a y tras la acumulación del producto de escisión de C3 C3b subsecuentemente a la convertasa C5 C4b2a(C3b)n.

Como se usa en la presente descripción, el término "activación del complemento dependiente de MASP-1" comprende la activación dependiente de MASP-1 de la vía de las lectinas, que se produce en condiciones fisiológicas (es decir, en presencia de Ca++) que conduce a la formación de la convertasa C3 C4b2a y tras la acumulación del producto de escisión de C3 C3b subsecuentemente a la convertasa C5 C4b2a(C3b)n.

Como se usa en la presente descripción, el término "vía de las lectinas" se refiere a la activación del complemento que se produce mediante la unión específica de proteínas de unión a carbohidratos séricas y no séricas, que incluye la lectina de unión a manano (MBL), CL-11 y las ficolinas (H-ficolina, M-ficolina o L-ficolina).

Como se usa en la presente descripción, el término "anticuerpo inhibidor de MASP-2" se refiere a cualquier anticuerpo contra MASP-2, o fragmento de unión a MASP-2 del mismo, que se une o interactúa directamente con MASP-2 e inhibe efectivamente la activación del complemento dependiente de MASP-2. Los anticuerpos inhibidores de MASP-2 útiles en el método de la invención pueden reducir la activación del complemento dependiente de MASP-2 en más del 20 %, tal como más del 30 %, o más del 40 %, o más del 50 %, o más del 60 %, o más del 70 %, o más del 80 %, o más del 90 %, o más del 95 %.

Como se usa en la presente descripción, el término "anticuerpo inhibidor de MASP-1" se refiere a cualquier anticuerpo contra MASP-1, o fragmento de unión a MASP-1 del mismo, que se une o interactúa directamente con MASP-1 e inhibe efectivamente la activación del complemento dependiente de MASP-1. Los anticuerpos inhibidores de MASP-1 útiles en el método de la invención pueden reducir la activación del complemento dependiente de MASP-1 en más del 20 %, tal como más del 30 %, o más del 40 %, o más del 50 %, o más del 60 %, o más del 70 %, o más del 80 %, o más del 90 %, o más del 95 %.

Como se usa en la presente descripción, el término "anticuerpo bloqueante de MASP-2" se refiere a anticuerpos inhibidores de MASP-2 que reducen la activación del complemento dependiente de MASP-2 en más del 90 %, tal como más del 95 % o más del 98 % (es decir, lo que da como resultado una activación del complemento MASP-2 de sólo el 10 %, tal como sólo el 9 %, o sólo el 8 %, o sólo el 7 %, o sólo el 6 %, como sólo el 5 % o menos, o sólo el 4 %, o sólo el 3 % o sólo el 2 % o sólo el 1 %).

Como se usa en la presente descripción, el término "anticuerpo bloqueante de MASP-1" se refiere a anticuerpos inhibidores de MASP-1 que reducen la activación del complemento dependiente de MASP-1 en más del 90 %, tal como más del 95 % o más del 98 % (es decir, lo que da como resultado una activación del complemento MASP-1 de sólo el 10 %, tal como sólo el 9 %, o sólo el 8 %, o sólo el 7 %, o sólo el 6 %, como sólo el 5 % o menos, o sólo el 4 %, o sólo el 3 % o sólo el 2 % o sólo el 1 %).

Como se usa en la presente descripción, el término secuencia de anticuerpo "variante" se refiere a una molécula que difiere en la secuencia de aminoácidos a partir de una secuencia de aminoácidos "parental" o de referencia en virtud de la adición, eliminación y/o sustitución de uno o más residuos de aminoácidos en la secuencia de anticuerpos parental. En un caso, una secuencia de anticuerpo variante se refiere a una molécula que contiene una o más regiones estructurales que son idénticas a los dominios estructurales parentales, excepto por un total combinado de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 sustituciones de aminoácidos dentro de las regiones estructurales de la región variable de cadena pesada, y/o hasta un total combinado de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 sustituciones de aminoácidos con dichas regiones estructurales de la región variable de cadena ligera. En algunos casos, las sustituciones de aminoácidos son modificaciones de secuencia conservadoras. En algunos casos, la(s) región(ones) estructural(es) variante(s) de la cadena ligera variable y/o la cadena pesada variable comprenden o consisten en una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 85 % de identidad, tal como al menos un 86 %, o al menos un 87 %, o al menos un 88 %, o al menos un 89 %, o al menos un 90 %, o al menos un 91 %, o al menos un 92 %, o al menos un 93 %, o al menos un 94 %, o al menos un 95 %, o al menos un 96 %, o al menos un 97 %, o al menos un 98 % o al menos un 99 % o 100 % de identidad con al menos una o más de las regiones estructurales de pollo VL-FR1, VL-FR2, VL-FR3 y VL-FR4 aminoácidos secuencias establecidas en las SEQ ID NO: 31, 33, 35 y 36, respectivamente; o con al menos una o más de las secuencias de aminoácidos de las regiones estructurales de pollo VH-FR-1, VH-FR2, VH-FR3 y VH-FR4 establecidas en las SEQ ID NO: 24, 25, 26 y 28, respectivamente.

En algunos casos, la(s) región(ones) estructural(es) variante(s) de la cadena ligera variable y/o la cadena pesada variable comprenden o consisten en una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 85 % de identidad, tal como al menos un 86 %, o al menos un 87 %, o al menos un 88 %, o al menos un 89 %, o al menos un 90 %, o al menos un 91 %, o al menos un 92 %, o al menos un 93 %, o al menos un 94 %, o al menos un 95 %, o al menos un 96 %, o al menos un 97 %, o al menos un 98 % o al menos un 99 % o 100 % de identidad con al menos una o más de las secuencias de la región variable del anticuerpo específico contra MASP-2 establecidas en las Tablas 6, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 17, 18 y 19.

Como se usa en la presente descripción, el término "anticuerpo de andamiaje contra MASP-2" se refiere a un anticuerpo que se une a MASP-2 que está codificado por una secuencia de aminoácidos usada para la preparación de un anticuerpo que comprende un péptido bioactivo que inhibe la activación del complemento, tal como un anticuerpo contra MASP-2 que comprende una secuencia peptídica de SGMI.

Como se usa en la presente descripción, el término "anticuerpo de pollo parental" se refiere a un anticuerpo que está codificado por una secuencia de aminoácidos usada para la preparación de la variante que comprende un péptido bioactivo injertado en o sobre al menos una de las regiones variables de la cadena pesada o ligera. El anticuerpo parental tiene una región estructural de pollo y, si está presente, típicamente tiene regiones constantes de anticuerpo humano.

Como se usa en la presente descripción, los residuos de aminoácidos se abrevian como sigue: alanina (Ala; A), asparagina (Asn; N), ácido aspártico (Asp; D), arginina (Arg; R), cisteína (Cys; C), ácido glutámico (Glu; E), glutamina (Gln; Q), glicina (Gly; G), histidina (His; H), isoleucina (Ile; I), leucina (Leu; L), lisina (Lys; K), metionina (Met; M), fenilalanina (Phe; F), prolina (Pro; P), serina (Ser; S), treonina (Thr; T), triptófano (Trp; W), tirosina (Tyr; Y), valina (Val; V).

En el sentido más amplio, los aminoácidos de origen natural pueden dividirse en grupos en base a las características químicas de la cadena lateral de los aminoácidos respectivos. Por aminoácido "hidrófobo" se entiende Ile, Leu, Met, Phe, Trp, Tyr, Val, Ala, Cys o Pro. Por aminoácido "hidrófilo" se entiende Gly, Asn, Gln, Ser, Thr, Asp, Glu, Lys, Arg o His. Este grupo de aminoácidos puede subclasificarse además de la siguiente manera. Por aminoácido "hidrófilo sin carga" se entiende Ser, Thr, Asn o Gln. Por aminoácido "ácido" se entiende Glu o Asp. Por aminoácido "básico" se entiende Lys, Arg o His.

Como se usa en la presente descripción, el término "sustitución conservadora de aminoácidos" se ilustra mediante una sustitución entre aminoácidos dentro de cada uno de los siguientes grupos: (1 ) glicina, alanina, valina, leucina e isoleucina, (2) fenilalanina, tirosina y triptófano, (3) serina y treonina, (4) aspartato y glutamato, (5) glutamina y asparagina, y (6) lisina, arginina e histidina.

Como se usa en la presente descripción, el término "anticuerpo aislado" se refiere a un anticuerpo que ha sido identificado y separado y/o recuperado de un componente de su entorno natural. Los componentes contaminantes de su ambiente natural son materiales que pudieran interferir con los usos terapéuticos o diagnósticos del anticuerpo, y pueden incluir enzimas, hormonas y otros solutos proteicos o no proteicos. En casos preferentes, el anticuerpo se purificará (1) a más del 95 % en peso de anticuerpo según se determina por el método de Lowry, y con la máxima preferencia, más del 99 % en peso, (2) a un grado suficiente para obtener al menos 15 residuos de la secuencia de aminoácidos N-terminal o interna mediante el uso de un secuenciador de copa giratoria; o (3) hasta la homogeneidad mediante SDS-PAGE en condiciones reductoras o no reductoras mediante el uso de tinción con azul de Coomassie o, preferentemente, tinción de plata. Un anticuerpo aislado incluye el anticuerpoin situdentro de células recombinantes ya que al menos un componente del ambiente natural del anticuerpo no estará presente. Habitualmente, sin embargo, un anticuerpo aislado se preparará mediante al menos una etapa de purificación. Como se usa en la presente descripción, una "molécula de ácido nucleico aislada" es una molécula de ácido nucleico (por ejemplo, un polinucleótido) que no está integrada en el ADN genómico de un organismo. Por ejemplo, una molécula de ADN que codifica un factor de crecimiento que ha sido separado del ADN genómico de una célula es una molécula de ADN aislada. Otro ejemplo de una molécula de ácido nucleico aislada es una molécula de ácido nucleico sintetizada químicamente que no está integrada en el genoma de un organismo. Una molécula de ácido nucleico que ha sido aislada de una especie particular es más pequeña que la molécula de ADN completa de un cromosoma de esa especie.

Como se usa en la presente descripción, una "construcción de molécula de ácido nucleico" es una molécula de ácido nucleico, ya sea monocatenaria o bicatenaria, que ha sido modificada mediante intervención humana para contener segmentos de ácido nucleico combinados y yuxtapuestos en una disposición que no existe en la naturaleza.

Como se usa en la presente descripción, un "vector de expresión" es una molécula de ácido nucleico que codifica un gen que se expresa en una célula hospedera. Típicamente, un vector de expresión comprende un promotor de la transcripción, un gen y un terminador de la transcripción. La expresión génica suele estar bajo el control de un promotor, y se dice que dicho gen está "unido operativamente" al promotor. De manera similar, un elemento regulador y un promotor núcleo están operativamente vinculados si el elemento regulador modula la actividad del promotor núcleo.

Como se usa en la presente descripción, los términos "aproximadamente" o "aproximadamente" en referencia a un número generalmente se consideran para incluir números que caen dentro de un intervalo del 5 % en cualquier dirección (mayor o menor que) del número a menos que se indique de cualquier otra manera o que sea evidente de cualquier otra manera por el contexto (excepto cuando dicho número exceda el 100 % de un valor posible). Cuando se indican intervalos, los puntos finales se incluyen dentro del intervalo a menos que se indique de cualquier otra manera o que sea evidente de cualquier otra manera a partir del contexto.

Como se usa en la presente descripción, la forma singular “un”, “una” y “los” incluye aspectos plurales a menos que el contexto claramente lo dicte de cualquier otra manera. Por tanto, por ejemplo, la referencia a "una célula" incluye una sola célula, así como también dos o más células; la referencia a "un agente" incluye un agente, así como dos o más agentes; la referencia a "un anticuerpo" incluye una pluralidad de tales anticuerpos y la referencia a "una región estructural" incluye la referencia a una o más regiones estructurales y equivalentes de las mismas conocidos por los expertos en la técnica, etcétera.

Como se usa en la presente descripción, "un sujeto" incluye todos los mamíferos, que incluye, sin limitaciones, humanos, primates no humanos, perros, gatos, caballos, ovejas, cabras, vacas, conejos, cerdos y roedores.

Como se usa en la presente descripción, el término "péptido bioactivo" se refiere a un péptido que tiene actividad biológica.

El término "péptido", como se usa en la presente descripción, se refiere a una pluralidad de aminoácidos unidos entre sí en una cadena lineal mediante enlaces peptídicos, que incluyen un dipéptido, tripéptido, oligopéptido y polipéptido. El término oligopéptido se usa típicamente para describir péptidos que tienen de al menos 2 a aproximadamente 50 o más (por ejemplo, de 2 aminoácidos a 60 aminoácidos de longitud, tal como de aproximadamente 5 a aproximadamente 50 aminoácidos, tal como de aproximadamente 5 a aproximadamente 40, o de aproximadamente 5 a aproximadamente 30 aminoácidos de longitud). Los péptidos de más de 60 aminoácidos se denominan en la presente descripción polipéptidos o proteínas.

Como se usa en la presente descripción, el término "bioactivo" o "bioactividad" como se usa en la presente descripción incluye, pero no se limita a, cualquier tipo de interacción con otra biomolécula, tal como una proteína, glicoproteína, carbohidrato, por ejemplo un oligosacárido o polisacárido, nucleótido, polinucleótido, ácido graso, hormona, enzima, cofactor o similares, ya sea que las interacciones impliquen unión covalente o no covalente. La bioactividad incluye además interacciones de cualquier tipo con otros componentes o constituyentes celulares, que incluyen sales, iones, metales, nutrientes, agentes extraños o exógenos presentes en una célula tales como virus, fagos y similares, por ejemplo interacciones relacionadas con la unión, el secuestro o el transporte. La bioactividad de un péptido puede detectarse, por ejemplo, mediante la observación de efectos fenotípicos en una célula hospedera en la que se expresa, o mediante la realización de un ensayoin vitropara una bioactividad particular, tal como unión por afinidad a una molécula diana, alteración de una actividad enzimática o similares. Ejemplos de péptidos bioactivos incluyen péptidos antimicrobianos y fármacos peptídicos. Los péptidos antimicrobianos son péptidos que afectan negativamente a un microbio tal como una bacteria, un virus, un protozoo o similares. Los péptidos antimicrobianos incluyen, por ejemplo, péptidos inhibidores que retardan el crecimiento de un microbio, péptidos microbiocidas que son efectivos para matar un microbio (por ejemplo, fármacos peptídicos bactericidas y virocidas, esterilizantes y desinfectantes) y péptidos efectivos para interferir con la reproducción microbiana, la toxicidad del hospedero, o similares. Los fármacos peptídicos para uso terapéutico en seres humanos u otros animales incluyen, por ejemplo, péptidos antimicrobianos que no son prohibitivamente tóxicos para el paciente y péptidos diseñados para provocar, acelerar, ralentizar o prevenir diversos procesos metabólicos en el hospedero, tales como la insulina, oxitocina, calcitonina, gastrina, somatostatina, péptidos anticancerígenos y similares.

Como se usa en la presente descripción, la expresión "en donde el anticuerpo aislado tiene al menos sustancialmente la misma actividad biológica que el péptido bioactivo no modificado" se refiere a en donde el anticuerpo aislado que comprende la secuencia del péptido bioactivo tiene al menos un 70 %, o al menos un 80 %, o al menos al menos el 85 %, o al menos el 90 % o al menos el 95 %, o al menos el 98 % o al menos el 99 % de la actividad biológica en comparación con la forma original no modificada del péptido bioactivo correspondiente.

Cada caso en esta descripción debe aplicarsemutatis mutandisa cualquier otro caso, a menos que se indique de cualquier otra manera.

Las técnicas estándar pueden usarse para el ADN recombinante, la síntesis de oligonucleótidos, y el cultivo y transformación de tejidos (por ejemplo, electroporación, lipofección). Las reacciones enzimáticas y las técnicas de purificación pueden realizarse de acuerdo con las especificaciones del fabricante o como se realiza comúnmente en la técnica o como se describe en la presente descripción. Estos y las técnicas y procedimientos relacionados generalmente pueden realizarse de acuerdo con los métodos convencionales bien conocidos en la técnica y como se describe en diversas referencias generales y más específicas que se mencionan y analizan a lo largo de la presente descripción. Ver, por ejemplo, el documento de Sambrook y otros, 2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3a ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York; Current Protocols in Molecular Biology (Greene Publ. Assoc. Inc. y John Wiley & Sons, Inc., Nueva York, Nueva York); Current Protocols in Immunology (Editado por: John E. Coligan, Ada M. Kruisbeek, David H. Margulies, Ethan M. Shevach, Warren Strober 2001 John Wiley & Sons, Nueva York, Nueva York); u otras publicaciones relevantes de Protocolos Actuales y otras referencias similares. A menos que se proporcionen definiciones específicas, la nomenclatura utilizada en relación con, y los procedimientos y técnicas de laboratorio de, química analítica, química orgánica sintética, y química medicinal y farmacéutica descritas en la presente descripción son aquellas bien conocidas y usados comúnmente en la técnica. Las técnicas estándar pueden usarse para la tecnología recombinante, biología molecular, microbiología molecular, síntesis química, análisis químicos, preparación farmacéutica, formulación, y suministro, y tratamiento de los pacientes.

Se contempla que cualquier caso discutido en esta descripción puede implementarse con respecto a cualquier método, kit, reactivo o composición de la presente descripción, y viceversa. Además, las composiciones de la invención pueden usarse para lograr los métodos de la descripción.

II. Información General

Los péptidos bioactivos son péptidos (es decir, de 2 a 60 residuos de aminoácidos de longitud, tales como de aproximadamente 5 a aproximadamente 50 aminoácidos, tales como de aproximadamente 5 a aproximadamente 40 aminoácidos de longitud, tales como de aproximadamente 5 a aproximadamente 30 aminoácidos ácidos de longitud, o tal como un péptido que tiene una longitud de no más de 60, 59, 58, 57, 56, 55, 54, 53, 52, 51, 50, 49, 48, 47, 46, 45, 44, 43, 42, 41, 40, 39, 38, 37, 36, 35, 34, 33, 32, 31, 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21 o 20 residuos de aminoácidos) que provocan una actividad biológica. De acuerdo con algunos casos de la descripción, los péptidos bioactivos comprenden una secuencia de aminoácidos que inhibe la activación del complemento. En casos adicionales, los péptidos bioactivos comprenden una secuencia núcleo de SGMI (por ejemplo, un péptido bioactivo que comprende una secuencia núcleo de SGMI (establecida como la SEQ ID NO: 5) y que tiene una longitud de 10 a 60 residuos de aminoácidos de longitud, tal como de aproximadamente 10 a aproximadamente 50 aminoácidos, tal como de aproximadamente 10 a aproximadamente 40 aminoácidos de longitud, tal como de aproximadamente 10 a aproximadamente 30 aminoácidos de longitud, o tal como un péptido que tiene una longitud de no más de 60, 59, 58, 57, 56, 55, 54, 53, 52, 51, 50, 49, 48, 47, 46, 45, 44, 43, 42, 41, 40, 39, 38, 37, 36, 35, 34, 33, 32, 31, 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11 o 10 residuos de aminoácidos) que inhiben la actividad de MASP-1 y/o MASP-2. Por ejemplo, los péptidos bioactivos SGMI-1 (establecido como la SEQ ID NO: 6) y SGMI-2 (establecido como la SEQ ID NO: 9) tienen cada uno 36 residuos de aminoácidos de longitud y son inhibidores altamente específicos de MASP-1 y MASP-2, respectivamente. Sin embargo, como péptidos tienen un potencial limitado para su uso en estudios biológicos y aplicaciones terapéuticas. Por ejemplo, a menudo se produce inestabilidad peptídica dentro del sistema biológico de interés, como lo demuestra la degradación no deseada de fármacos peptídicos potenciales por proteasas y/o peptidasas en las células hospederas.

Con el fin de diseñar péptidos bioactivos que inhiban la activación del complemento, tales como péptidos bioactivos que comprenden una secuencia núcleo SGMI (por ejemplo, SGMI-1 y/o SGMI-2), para su uso como agentes terapéuticos, los inventores han generado anticuerpos que contienen péptidos bioactivos y fragmentos de los mismos al injertar secuencias de aminoácidos que codifican péptidos bioactivos, tales como péptidos bioactivos que comprenden una secuencia núcleo de SGMI (por ejemplo, SGMI-1 y/o SGMI-2) en, o fusionados sobre, diversos andamiajes de anticuerpos de la siguiente manera: (1) fusionado en el extremo amino terminal de la región Fc de la IgG1 humana para crear una proteína de fusión Fc, como se describe en el Ejemplo 2; (2) injertado en diversas regiones determinantes de complementariedad (CDR) de un anticuerpo quimérico no específico de pollo (regiones variables) - humano (regiones constantes IgG1 e IgA), como se describe en el Ejemplo 3; (3) fusionado en los extremos amino o carboxi terminal de las cadenas pesada y/o ligera de un anticuerpo quimérico no específico de pollo (regiones variables) - humano (regiones constantes IgG1 e IgA), como se describe en el Ejemplo 4, y (4) fusionado en los extremos amino o carboxi terminal de las cadenas pesada y/o ligera de un anticuerpo humano, tal como un anticuerpo contra MASP-2 humano, como se describe en los Ejemplos 7 y 8.

Mediante el uso de los métodos descritos en la presente descripción, los inventores han producido anticuerpos portadores de péptidos bioactivos y fragmentos de los mismos que sorprendentemente tienen al menos sustancialmente la misma actividad biológica del péptido bioactivo cuando se midein vitro,con las ventajas de una mayor estabilidad para su uso como agente terapéutico en un sujeto vivo. Por ejemplo, como se describe más detalladamente en la presente descripción, de acuerdo con diversos casos de la descripción, los inventores han generado anticuerpos aislados que comprenden péptidos bioactivos que inhiben la activación del complemento, tales como, por ejemplo, anticuerpos contra MASP-2 portadores del péptido SGMI y fragmentos de los mismos mediante fusión las secuencias de aminoácidos del péptido núcleo SGMI (por ejemplo, SGMI-1 y/o SGMI-2) en los extremos amino o carboxi terminal de las cadenas pesada y/o ligera de un anticuerpo contra MASP-2 humano, como se describe en el Ejemplo 7. Mediante el uso de los métodos descritos en la presente descripción, los inventores han producido anticuerpos contra MASP-2 portadores de péptido SGMI y fragmentos de los mismos que sorprendentemente tienen actividad inhibidora mejorada, en comparación con el anticuerpo de andamiaje contra MASP-2 desnudo que no contiene la secuencia peptídica de SGMI, cuando se mide en un ensayo de deposición de C3b o C4b mediante el uso de suero humano, como se describe en el Ejemplo 7, y también tienen una actividad inhibidora mejorada en comparación con el anticuerpo de andamiaje contra MASP-2 desnudo cuando se mide en un modelo de ratónin vivo.

III. Anticuerpos portadores de péptidos bioactivos

De acuerdo con lo anterior, en un aspecto, la invención proporciona un método para preparar un anticuerpo portador de un péptido bioactivo, donde el método comprende (a) injertar la secuencia de aminoácidos de al menos un péptido bioactivo de interés en (i) al menos una de la CDR-H1, CDR-H2 o CDR-H3 de una región variable de cadena pesada que comprende regiones estructurales de pollo y/o (ii) al menos una de la CDR-L1, CDR-L2 o CDR-L3 de la región variable de cadena ligera que comprende regiones estructurales de pollo, y (b) determinar si el anticuerpo portador del péptido tiene al menos sustancialmente la misma o mayor actividad biológica en comparación con el péptido bioactivo aislado.

El método de acuerdo con este aspecto de la invención puede usarse para generar un anticuerpo portador del péptido bioactivo, en donde el anticuerpo comprende la secuencia de aminoácidos de cualquier péptido bioactivo de interés. Los péptidos bioactivos se han aislado de una variedad de sistemas, exhiben un amplio intervalo de acciones y se han utilizado como agentes terapéuticos en el campo de la medicina y como herramientas de diagnóstico tanto en investigación básica como aplicada. Se ha descubierto que el modo de acción de los péptidos bioactivos se debe a la interacción del péptido bioactivo con una proteína diana específica. El péptido bioactivo actúa al unirse y activar o inactivar su proteína diana con especificidades extremadamente altas. Típicamente, se ha determinado que las constantes de unión de los péptidos bioactivos para sus dianas proteicas están en el intervalo nanomolar (nM), con algunos reportes de constantes de unión tan potentes como el intervalo picomolar.

Los métodos de este aspecto de la invención pueden usarse para generar un anticuerpo que comprende una secuencia de aminoácidos con cualquier péptido bioactivo. Los péptidos bioactivos ilustrativos para usar en los métodos de la invención incluyen (i) péptidos bioactivos que inhiben la activación del complemento, (ii) péptidos bioactivos que inhiben proteasas médicamente importantes, (iii) neuropéptidos (iv) péptidos bioactivos que inhiben o activan la actividad de los neuropéptidos, (v) hormonas peptídicas, (vi) péptidos bioactivos que inhiben o activan la actividad de las hormonas peptídicas, (vii) péptidos que son ligandos GPCR de clase A, (viii) péptidos bioactivos que inhiben o activan los GPCR de clase A, (ix) ligandos GPCR de clase B, y (x) péptidos bioactivos que inhiben o activan los GPCR de Clase B.

Por ejemplo, las proteasas de importancia médica que son inhibidas por péptidos bioactivos incluyen, pero no se limitan a: Gamma-secretasa, PAR-1, PAR-2, PAR-3, catepsina, incretina, dipeptidil peptidasa IV, enzima convertidora de angiotensina, calpaína, caspasa-3, carboxipeptidasa, trombina y proteasas en la cascada de coagulación y vías del complemento. Ejemplos de inhibidores de serina proteasa de la vía del complemento (por ejemplo, inhibidores de MASP-1, MASP-2) incluyen los inhibidores peptídicos bioactivos SGMI-1 ySg M i-2.

Los ejemplos de neuropéptidos incluyen, pero no se limitan a: Ácido N-acetilaspartilglutámico, Péptido relacionado con el agutí, Alfa-endorfina, Gran dinorfina, Bombesina, Péptidos similares a la bombesina, Carbetocina, Transcrito regulado por cocaína y anfetamina (CART), Colecistocinina, Corazonina, Péptido intermedio similar a la corticotropina, Cortistatina, Demoxitocina, Dinorfina A, Dinorfina B, Eledoisina, Encefalina, Galanina, Péptido similar a galanina, Galmic, Galnon, Gamma-endorfina, Grelina, Hemopresina, Kisspeptina, Neuroquinina B, Neuromedina B, Neuromedina N, Neuromedina S, Neuromedina U, Neuromedina S, Neuromedina Y, Neuropéptido Y, Neurotensina, Nociceptina, Opiorfina, Orexina, Orexina-A, Oxitocina, Fisalaemina, Preprotaquiquinina, Proctolina, Proencefalina, Proopiomelanocortina, Proteína episteme, Relaxina-3, RVD-Pa, Somatostatina, Sustancia P, TAC1, Péptidos de tacquiquinina, TRH, Vasopresina, Vasotocina, VIP y VGF.

Los ejemplos de hormonas peptídicas incluyen, pero no se limitan a: Activina e inhibina, Adiponectina, Hormonas derivadas del tejido adiposo, Hormona adrenocorticotrópica, Afamelanotida, Gen agutí, Péptido de señalización agutí, Alatostatina, Amilina, Familia de la amilina, Angiotensina, Péptido natriurético auricular, Gastrina grande, Somatotropina bovina, Bradicinina, Factor neurotrófico derivado del cerebro, Calcitonina, Colecistocinina, Factor neurotrófico ciliar, CJC-1293, CJC-1295, Hormona liberadora de corticotropina, Cosintropina, Familia de neurohormonas de crustáceos, Endoteliano, Enteroglucagón, FGF15, GFG15/19, Hormona folículo estimulante, Gastrina, Péptido gastroinhibidor, Grelina, Glucagón, Péptido 1 similar al glucagón, Gonadotropina, Preparados de gonadotropina, Hormona liberadora de gonadotropina, Factor estimulante de colonias de granulocitos, Hormona del crecimiento, Hormona liberadora de la hormona del crecimiento, Hepcidina, Gonadotropina coriónica humana, Lactógeno placentario humano, Incretina, Insulina, Análogo de insulina, Insulina aspart, Insulina degludec, Insulina glargina, Insulina lispro, Factor de crecimiento similar a la insulina, Factor de crecimiento similar a la insulina-1, Factor de crecimiento similar a la insulina-2, Leptina, Liraglutida, Pequeña gastrina I, Hormona luteinizante, Melanocortina, Hormona estimulante de los melanocitos, Hormona estimulante de los melanocitos alfa, Melanotan II, Minigastrina, Prohormona N-terminal del péptido natriurético cerebral, Factor de crecimiento nervioso, Neurotrofina-3, Neurotrofina-4, Insulina NPH, Obestatina, Orexina, Osteocalcina, Hormona pancreática, Hormona paratiroidea, hormona peptídica, péptido YY, actividad de la renina plasmática, pramlintida, preprohormona, prolactina, relaxina, hormona peptídica de la familia relaxina, renina, salcatonina, secretina, hormona peptídica de la familia secretina, sincalida, leptinas teleósteas, temporina, tesamorelina, hormona estimulante de la tiroides, Hormona liberadora de tirotropina, Urocortina, Urocortina II, Urocortina III, Péptido intestinal vasoactivo y Vitelogenina.

Ejemplos de ligandos GPCR de Clase B incluyen, pero no se limitan a: VIP (28aa), PACAP (38aa) y CRF1 (41aa).

Las Tablas 1 y 2 enumeran péptidos bioactivos representativos adecuados para su uso en los métodos de la invención.

De acuerdo con los métodos de la descripción, una secuencia de aminoácidos de un péptido bioactivo de interés se injerta en al menos una región CDR de una región variable de una cadena pesada (por ejemplo, una cadena pesada que comprende una o más regiones estructurales de pollo (VH-FR1, VH-FR2, VH-FR3, VH-FR4)), o se injerta en al menos una región CDR de una región variable de una cadena ligera (por ejemplo, una cadena ligera que comprende una o más regiones estructurales de pollo (VL-FR1, VL-FR2, VL-FR3, VL-FR4)), tal como una región variable de cadena pesada o cadena ligera de un anticuerpo genérico (es decir, no específico) de pollo parental, como se describe en el Ejemplo 3 y se ilustra en las Figuras 3-6. El péptido bioactivo se injerta en una CDR de manera que las regiones estructurales flanqueantes adyacentes a la<c>D<r>en la cadena pesada o ligera variable permanezcan intactas. En algunos casos, la secuencia CDR nativa completa del anticuerpo parental genérico se elimina y se reemplaza con la secuencia peptídica bioactiva.

Como se muestra en las Figuras 3-6, en algunos casos, al menos una secuencia enlazadora peptídica (típicamente de 1 residuo de aminoácido a 20 residuos de aminoácidos de longitud) se incluye entre la secuencia de aminoácidos del péptido bioactivo injertado en la CDR y una o ambas regiones estructurales adyacentes al anticuerpo portador del péptido bioactivo. El enlazador peptídico puede ser cualquier secuencia enlazadora flexible, tal como una secuencia enlazadora flexible mostrada en la Tabla 4. En algunos casos, como se ilustra en las Figuras 4 y 6, los residuos de aminoácidos de las CDR nativas del anticuerpo parental se usan para formar un enlazador en una o ambas regiones flanqueantes del péptido bioactivo adyacentes a las regiones estructurales. En algunos casos, al menos un aminoácido, o al menos dos, al menos tres, al menos cuatro, al menos cinco o más, hasta todos los residuos de aminoácidos de la secuencia CDR nativa se retienen como secuencias enlazadoras que flanquean el péptido bioactivo en la región variable de cadena pesada o ligera que comprende el péptido bioactivo injertado.

En algunos casos, la secuencia peptídica bioactiva se injerta en una región variable de cadena pesada de un anticuerpo, en donde la región variable de cadena pesada comprende una región que tiene la fórmula general (I): N-X-B-Y-C (I) en donde:

N es una región amino terminal de la región variable de cadena pesada,

X es una región enlazadora de aminoácidos flexible y consiste en 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 aminoácidos;

B es una secuencia de aminoácidos peptídica bioactiva y consiste en una secuencia de aminoácidos de no más de 60, o consiste en no más de 50 residuos de aminoácidos hasta un mínimo de al menos 3 residuos de aminoácidos;

Y es una región enlazadora de aminoácidos flexible y consiste en 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 aminoácidos; y

C es una región carboxi terminal de la región variable de cadena pesada, y

en donde se aplica al menos uno de los siguientes:

N comprende la FR-1, establecida como la SEQ ID NO: 24, o una variante de la misma, y C comprende la FR-2, establecida como la SEQ ID NO: 25, o una variante de la misma; o

N comprende la FR-2, establecida como la SEQ ID NO: 25, o una variante de la misma, y C comprende la FR-3, establecida como la SEQ ID NO: 26, o una variante de la misma; o

N comprende la FR-3, establecida como la SEQ ID NO: 26, o una variante de la misma, o la SEQ ID NO: 27 flanqueante, y C comprende la FR-4, establecida como la SEQ ID NO: 28, o una variante de la misma, o la SEQ ID NO: 29 flanqueante.

En un caso, se injerta una secuencia peptídica bioactiva en una región variable de cadena pesada de un anticuerpo, en donde N comprende la FR-3, establecida como la SEQ ID NO: 26, o una variante de la misma, o la SEQ ID NO: 27 flanqueante, y C comprende la FR-4, establecida como la SEQ ID NO: 28, o una variante de la misma, o la SEQ ID NO: 29 flanqueante.

En un caso, la cadena pesada que comprende una o más regiones estructurales (por ejemplo, VH-FR1, VH-FR2, VH-FR3, VH-FR4) y al menos un péptido bioactivo injertado en una CDR comprende además la región constante de la IgG1 humana, establecida como la SEQ ID NO: 47, o una variante de la misma.

En algunos casos, la secuencia peptídica bioactiva se injerta en una región variable de cadena ligera de un anticuerpo, en donde la región variable de cadena ligera comprende una región que tiene la fórmula general (I): N-X-B-Y-C (II) en donde:

N es una región amino terminal de la región variable de cadena ligera,

C es una región carboxi terminal de la región variable de cadena ligera, y

en donde se aplica al menos uno de los siguientes:

N comprende la FR-1, establecida como la SEQ ID NO: 31, o una variante de la misma, o la SEQ ID NO: 32 flanqueante, y C comprende la FR-2, establecida como la SEQ ID NO: 33, o una variante de la misma, o la SEQ ID NO: 34 flanqueante; o

N comprende la FR-2, establecida como la SEQ ID NO: 33, o una variante de la misma, y C comprende la FR-3, establecida como la SEQ ID NO: 35, o una variante de la misma; o

N comprende la FR-3, establecida como la SEQ ID NO: 35, o una variante de la misma, y C comprende la FR-4, establecida como la SEQ ID NO: 36, o una variante de la misma.

En un caso, se injerta un péptido bioactivo en una región variable de cadena pesada de un anticuerpo, en donde N comprende laf R-1,establecida como la SEQ ID NO: 31, o una variante de la misma, o la SEQ ID NO: 32 flanqueante, y C comprende la FR-2, establecida como la SEQ ID NO: 33, o una variante de la misma, o la SEQ ID NO: 34 flanqueante.

En un caso, la cadena ligera que comprende una o más regiones estructurales (VL-FR1, VL-FR2, VL-FR3, VL-FR4) y al menos un péptido bioactivo injertado en una CDR comprende además la cadena ligera lambda humana, establecida como la SEQ ID NO: 48, o una variante de la misma.

En un caso, los métodos de acuerdo con este aspecto de la invención comprenden injertar un péptido bioactivo que comprende una secuencia de aminoácidos del núcleo de SGMI en al menos una de la región variable de cadena pesada y/o región variable de cadena ligera (por ejemplo, una región variable de cadena pesada y/o una región variable de cadena ligera que comprende regiones estructurales de pollo), en donde la secuencia de aminoácidos del núcleo de SGMI comprende:

X1CTX2X3X4CX5Q (SEQ ID NO: 5)

en donde:

X1 es F o V,

X2 es R o K,

X3 es K o L,

X4 es L o W, y

X5 es Y o N; y

en donde el péptido bioactivo inhibe la actividad de al menos una de MASP-1 o MASP-2.

En un caso, el método comprende injertar un péptido bioactivo seleccionado del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 6 a la SEQ ID NO: 11.

En un caso, el método comprende injertar un péptido bioactivo que inhibe la actividad de MASP-1, en donde el péptido bioactivo es al menos uno de la SEQ ID NO: 6 a 8.

En un caso, el método comprende injertar un péptido bioactivo que inhibe la actividad de MASP-2, en donde el péptido bioactivo es al menos uno de la SEQ ID NO: 9 a 11.

También se describe en la presente descripción un anticuerpo aislado, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que comprende una o más secuencias de aminoácidos del péptido bioactivo, en donde al menos una de la secuencia de aminoácidos del péptido bioactivo está injertada en al menos uno de: (i) una región variable de cadena ligera que comprende regiones estructurales de pollo y/o (ii) una región variable de cadena pesada que comprende regiones estructurales de pollo. En algunos casos, se injerta una secuencia de aminoácidos peptídica bioactiva en al menos una de la CDR-H1, CDR-H2 o CDR-H3 de una región variable de cadena pesada que comprende regiones estructurales de pollo. En algunos casos, se injerta la secuencia de aminoácidos peptídica bioactiva en al menos una de la CDR-L1, CDR-L2 o CDR-L3 de una región variable de cadena ligera que comprende regiones estructurales de pollo. Diversos casos de anticuerpos aislados o fragmentos de unión a antígeno de los mismos que comprenden una o más secuencias de aminoácidos peptídicas bioactivas injertadas en una o más regiones CDR de una cadena pesada y/o ligera se generan de acuerdo con los métodos como se describen en la presente descripción.

En un caso, el anticuerpo aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende una secuencia de aminoácidos peptídica bioactiva que comprende una secuencia núcleo de SGMI establecida como la SEQ ID NO: 5. En un caso, el anticuerpo aislado o fragmento del mismo comprende una secuencia peptídica bioactiva injertada en una CDR, en donde la secuencia peptídica bioactiva comprende o consiste en al menos una de las SEQ ID NO: 6 a la SEQ ID NO:11.

En un caso, el anticuerpo aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende al menos una de las SEQ ID NO: 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88 o la SEQ ID NO: 90, o una variante de la misma que tiene al menos un 85 %, o al menos un 88 %, o al menos un 90 %, o al menos un 92 %, o al menos un 95 %, o al menos un 98 % de identidad con la SEQ ID NO: 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88 o la SEQ ID NO: 90. En otro caso, se proporciona una molécula de ácido nucleico que codifica el anticuerpo aislado o un fragmento de antígeno del mismo, donde la molécula de ácido nucleico comprende al menos una de las SEQ ID NO: 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87 o la SEQ ID NO: 89, o una variante de la misma que tiene al menos un 85 %, o al menos un 88 %, o al menos un 90 %, o al menos un 92 %, o al menos un 95 %, o al menos un 98 % de identidad con la SEQ ID NO: 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87 o la SEQ ID NO: 89.

También se describe en la presente descripción un método para preparar un anticuerpo portador de un péptido bioactivo, que comprende (a) fusionar la secuencia de aminoácidos de al menos un péptido bioactivo de interés en: (i) una región amino terminal de al menos una de: una región variable de cadena ligera y/o una región variable de cadena pesada, y/o (ii) una región carboxi terminal de al menos uno de: una región constante de cadena ligera y/o una región constante de cadena pesada; y (b) determinar si el anticuerpo portador del péptido tiene al menos sustancialmente la misma o mayor actividad biológica en comparación con el péptido bioactivo aislado. En algunos casos, la región variable de cadena pesada y/o la región variable de cadena ligera comprenden regiones no humanas. En algunos casos, la región variable de cadena pesada y/o la región variable de cadena ligera comprenden regiones de pollo. En algunos casos, la región variable de cadena pesada y/o la región variable de cadena ligera comprenden o consiste en regiones humanas. En algunos casos, el anticuerpo portador de péptidos bioactivos inhibe la activación del complemento. En algunos casos, el anticuerpo portador de péptidos bioactivos inhibe la vía de las lectinas de la activación del complemento. En algunos casos, el anticuerpo portador del péptido bioactivo inhibe la actividad de al menos una de MASP-1 y/o MASP-2. En algunos casos, la región variable de cadena pesada y/o la región variable de cadena ligera comprenden regiones una o más CDR que se unen específicamente a MASP-2.

Tales métodos pueden llevarse a cabo con cualquier péptido bioactivo de interés, como los péptidos bioactivos ilustrativos descritos en la presente descripción. Las Figuras 10, 16, 17 y 18 son diagramas esquemáticos que ilustran los diversos casos de anticuerpos portadores de péptidos bioactivos que pueden generarse mediante el uso de los métodos de este aspecto de la invención, como se describe con mayor detalle en los Ejemplos 4 y 7.

En algunos casos, el método de la descripción comprende fusionar la secuencia de aminoácidos de un péptido bioactivo de interés con la región amino terminal de al menos una de una región variable de cadena ligera (por ejemplo, una región variable de cadena ligera que comprende regiones no humanas (por ejemplo, de rata, ratón, pollo, camélido, sintética, etc.) o regiones humanas) y/o una región variable de cadena pesada (por ejemplo, una región variable de cadena pesada que comprende regiones no humanas (por ejemplo, de rata, ratón, pollo, camélido, sintética), etc.) o regiones humanas).

En algunos casos, el método de la descripción comprende fusionar la secuencia de aminoácidos de un péptido bioactivo de interés con la región carboxi terminal de al menos una de: una región constante de cadena ligera y/o una región constante de cadena pesada.

Como se muestra en las Figuras 10 y 16, en algunos casos, al menos una secuencia enlazadora peptídica (típicamente de 1 residuo de aminoácido a 20 residuos de aminoácido) se incluye entre la secuencia peptídica bioactiva y el extremo amino terminal de la región de cadena ligera o pesada, o entre la secuencia peptídica bioactiva y el extremo carboxi terminal de la región constante ligera o pesada.

En algunos casos, un péptido bioactivo de interés se fusiona al extremo amino terminal de una región variable de cadena pesada que comprende las secuencias de aminoácidos de las regiones estructurales de pollo VH-FR1, VH-FR-2, VH-FR-3 y VH-FR-4 establecidas como las SEQ ID NO: 24, 25, 26 y 28, respectivamente, o variantes de las mismas. En algunos casos, la cadena pesada comprende además una región constante de IgG1 humana, por ejemplo, establecida como la SEQ ID NO: 47, o una variante de la misma.

En algunos casos, un péptido bioactivo de interés se fusiona al extremo carboxi terminal de una región constante de cadena pesada, en donde la cadena pesada comprende además una región variable que comprende las secuencias de aminoácidos de las regiones estructurales de pollo VH-FR1, VH-FR-2, VH-FR-3 y VH-FR-4 establecidas como las SEQ ID NO: 24, 25, 26 y 28, respectivamente, o variantes de las mismas.

En algunos casos, un péptido bioactivo de interés se fusiona al extremo amino terminal de una región variable de cadena ligera que comprende las secuencias de aminoácidos de las regiones estructurales de pollo VL-FR1, VL-FR-2, VL-FR-3 yVl-FR-4establecidas como las SEQ ID NO: 31, 33, 35 y 36, respectivamente, o variantes de las mismas. En algunos casos, la cadena ligera comprende además una región constante de cadena ligera lambda humana, por ejemplo, establecida en la SEQ ID NO: 48.

En algunos casos, tales métodos comprenden fusionar un péptido bioactivo que comprende una secuencia de aminoácidos del núcleo de SGMI en al menos una de una cadena pesada y/o ligera que comprende proteínas no humanas (por ejemplo, de rata, ratón, pollo, camélido, sintéticas, etc.) o regiones humanas, en donde la secuencia de aminoácidos del núcleo de SGMI comprende:

X1CTX2X3X4CX5Q (SEQ ID NO: 5)

en donde:

X1 es F o V,

X2 es R o K,

X3 es K o L,

X4 es L o W, y

X5 es Y o N; y

En un caso, el método comprende fusionar un péptido bioactivo seleccionado del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 6 a la SEQ ID NO: 11.

En un caso, el método comprende fusionar un péptido bioactivo que inhibe la actividad de MASP-1, en donde el péptido bioactivo es al menos uno de la SEQ ID NO: 6 a 8.

En un caso, el método comprende fusionar un péptido bioactivo que inhibe la actividad de MASP-2, en donde el péptido bioactivo es al menos uno de la SEQ ID NO: 9 a 11.

De acuerdo con lo anterior, en algunos casos, la descripción proporciona un método para preparar un anticuerpo portador de un péptido bioactivo que es un inhibidor de la vía de las lectinas en el que la región variable de cadena pesada y/o la región variable de cadena ligera comprenden una o más CDR que se unen específicamente a MASP-2 y el anticuerpo inhibe la actividad de MASP-2.

También se describe en la presente descripción un método para preparar un anticuerpo contra MASP-2 portador del péptido SGMI (es decir, un andamiaje de anticuerpo que comprende una o más CDR que se unen específicamente a MASP-2), que comprende (a) fusionar la secuencia de aminoácidos de un núcleo de SGMI secuencia peptídica en al menos una de (i) la región amino terminal de al menos una de: una región variable de cadena ligera y/o una región variable de cadena pesada; o (ii) la región carboxi terminal de al menos una de: una región variable de cadena ligera y/o una región variable de cadena pesada; o (iii) la región carboxi terminal de al menos una de: una región constante humana de cadena ligera y/o una región constante humana de cadena pesada; y (b) determinar si la fusión de anticuerpos es capaz de inhibir la actividad de MASP-2.

Tales métodos pueden usarse para generar un anticuerpo contra MASP-2 portador de una secuencia peptídica de SGMI, en donde la fusión del anticuerpo es capaz de inhibir la activación del complemento dependiente de MASP-2. Como se muestra en la Figura 16, en algunos casos, una secuencia enlazadora peptídica opcional (típicamente de 1 residuo de aminoácido a 20 residuos de aminoácidos de longitud, por ejemplo, una secuencia peptídica flexible que consiste en 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 aminoácidos) se incluye entre la secuencia de aminoácidos del péptido SGMI y la secuencia de anticuerpo de andamiaje contra MASP-2 adyacente (por ejemplo, la región amino terminal de al menos una de: una región variable de cadena ligera y/o una región variable de cadena pesada; o la región carboxi terminal de al menos una de: una región variable de cadena ligera y/o una región variable de cadena pesada o la región carboxi terminal de al menos una de: una región constante humana de cadena ligera y/o una región constante humana de cadena pesada). El enlazador peptídico puede ser cualquier secuencia enlazadora flexible, tal como una secuencia enlazadora ilustrativa proporcionada en la presente descripción, establecida como la SEQ ID NO: 13, 172 o 173. La Figura 18 es un diagrama esquemático que ilustran los diversos casos de anticuerpos contra MASP-2 portadores del péptido SGMI que pueden generarse mediante el uso de los métodos de esta descripción, como se describe con mayor detalle en el Ejemplo 7.

Tales métodos pueden comprender fusionar una secuencia de aminoácidos del núcleo de SGMI en al menos una de las siguientes regiones de un anticuerpo que se une específicamente a MASP-2: (i) la región amino terminal de al menos una de: una región variable de cadena ligera y/o una región variable de cadena pesada; o (ii) la región carboxi terminal de al menos una de: una región variable de cadena ligera y/o una región variable de cadena pesada; o (iii) la región carboxi terminal de al menos una de: una región constante humana de cadena ligera y/o una región constante humana de cadena pesada, en donde la secuencia de secuencia de aminoácidos núcleo de SGMI comprende:

X1CTX2X3X4CX5Q (SEQ ID NO: 5)

en donde:

X1 es F o V,

X2 es R o K,

X3 es K o L,

X4 es L o W, y

X5 es Y o N; y

en donde la secuencia peptídica de SGMI inhibe la actividad de al menos una de MASP-1 o MASP-2.

En un caso, el método comprende fusionar una secuencia peptídica de SGMI seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 6 a la SEQ ID NO: 11.

En un caso, el método comprende fusionar una secuencia peptídica de SGMI que inhibe la actividad de MASP-1, en donde la secuencia peptídica de SGMI es al menos una de la SEQ ID NO: 6 a 8.

En un caso, el método comprende fusionar una secuencia peptídica de SGMI que inhibe la actividad de MASP-2, en donde la secuencia peptídica de SGMI es al menos una de la SEQ ID NO: 9 a 11.

En algunos casos, el anticuerpo de andamiaje contra MASP-2 sin el péptido SGMI se une específicamente a MASP-2 pero puede tener una actividad inhibidora de MASP-2 débil o nula, y la fusión MASP-2-SGMI proporciona, o aumenta, la actividad inhibidora de MASP-2 (por ejemplo, inhibe la activación de la vía de las lectinas). En algunos casos, el anticuerpo de andamiaje contra MASP-2 se une específicamente a MASP-2 y tiene un nivel inicial de actividad inhibidora de MASP-2, y la fusión MASP-2-SGMI tiene actividad inhibidora mejorada en comparación con el anticuerpo de andamiaje (por ejemplo, un mejora estadísticamente significativa en la actividad inhibidora, tal como la inhibición de la activación de la vía de las lectinas, en comparación con el anticuerpo de andamiaje sin el péptido SGMI). En las Tablas 18 y 19, respectivamente, se proporcionan ejemplos no limitantes de regiones variables de cadena pesada y regiones variables de cadena ligera de anticuerpo inhibidor de MASP-2 adecuadas.

En un caso, la secuencia peptídica núcleo de SGMI se fusiona con la región amino terminal de al menos una de una región variable de cadena ligera que comprende una o más CDR que se unen a MASP-2 y/o una región variable de cadena pesada que comprende una o más CDR que se unen a MASP-2.

En un caso, la secuencia peptídica núcleo de SGMI se fusiona con la región carboxi terminal de al menos una: de una región variable de cadena ligera que comprende una o más CDR que se unen a MASP-2 y/o una región carboxi terminal de una región variable de cadena pesada que comprende una o más CDR que se unen a MASP-2.

En un caso, la secuencia peptídica núcleo de SGMI se fusiona con la región carboxi terminal de al menos una de una región constante humana de cadena ligera y/o una región constante humana de cadena pesada de un anticuerpo que se une específicamente a MASP-2.

En un caso, la secuencia peptídica núcleo de SGMI se fusiona con al menos una de una región variable de cadena pesada y/o una región variable de cadena ligera que comprende una o más CDR que reconocen específicamente MASP-2 humana (establecida como la SEQ ID NO: 4).

En un caso, la secuencia peptídica núcleo de SGMI se fusiona con un anticuerpo monoclonal contra MASP-2, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que se une específicamente a la MASP-2 humana e inhibe o bloquea la activación del complemento dependiente de MASP-2. Los anticuerpos inhibidores de MASP-2 pueden inhibir o bloquear efectivamente el sistema de activación del complemento dependiente de MASP-2 al inhibir o bloquear la función biológica de MASP-2. Por ejemplo, un anticuerpo inhibidor puede inhibir o bloquear efectivamente las interacciones entre proteínas de MASP-2, interferir con la dimerización o el ensamblaje de MASP-2, bloquear la unión de Ca2+ o interferir con el sitio activo de la serina proteasa de MASP-2.

Como se muestra en las Figuras 12 y 13, el polipéptido MASP-2 exhibe una estructura molecular similar a MASP-1, MASP-3 y C1r y C1s, las proteasas del sistema C1 del complemento. La molécula de ADNc establecida en la SEQ ID NO: 3 codifica un ejemplo representativo de MASP-2 (que consiste de la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 4) y proporciona al polipéptido MASP-2 humano una secuencia líder (los aa 1-15) que se escinde en el proceso de secreción, que da como resultado la forma madura de MASP-2 humana. Como se muestra en la Figura 12, el genMASP2humano comprende doce exones. El ADNc de MASP-2 humana está codificado por los exones B, C, D, F, G, H, I, J, K y L. Los expertos en la técnica reconocerán que las secuencias descritas en la SEQ ID NO: 3 y la SEQ ID NO: 4 representa alelos únicos de MASP-2 humana, y se espera que se produzcan variaciones alélicas y empalmes alternativos. Las variantes alélicas de las secuencias de nucleótidos mostradas en la SEQ ID NO: 3 y la SEQ ID NO: 4, que incluye aquellas que contienen mutaciones silenciosas y aquellas en las que las mutaciones dan como resultado cambios en la secuencia de aminoácidos, están dentro del alcance de la presente invención. Las variantes alélicas de la secuencia de MASP-2 pueden clonarse al sondear ADNc o bibliotecas genómicas de diferentes individuos de acuerdo con los procedimientos estándar.

Los dominios de la proteína MASP-2 humana (SEQ ID NO: 4) se muestran en la Figura 12, e incluyen un dominio N-terminal C1r/C1s/VEGF de erizo de mar/proteína morfogénica ósea (CUBI), un dominio similar al factor de crecimiento epidérmico, un segundo dominio CUB (CUBII), así como también un tándem de dominios de proteína control del complemento CCP1 y CCP2, y un dominio de serina proteasa. El corte y empalme alternativo del gen de MASP-2 da como resultado MAp19. MAp19 es una proteína no enzimática que contiene la región N-terminal CUB1-EGF de MASP-2 con cuatro residuos adicionales (EQSL).

Se ha demostrado que varias proteínas se unen o interactúan con MASP-2 a través de interacciones entre proteínas. Por ejemplo, se sabe que MASP-2 se une y forma complejos dependientes de Ca2+ con las proteínas lectina MBL, H-ficolina y L-ficolina. Se ha demostrado que cada complejo MASP-2/lectina activa el complemento a través de la escisión de las proteínas C4 y C2 dependiente de MASP-2 (Ikeda, K. y otros J. Biol. Chem. 262: 7451 7454, 1987; Matsushita, M., y otros, J. Exp. Med. 176: 1497-2284, 2000; Matsushita, M. y otros, J. Immunol. 168: 3502-3506, 2002). Los estudios han demostrado que los dominios CUB1-EGF de MASP-2 son esenciales para la asociación dem As P-2con MBL (Thielens, N.M. y otros, J. Immunol. 166: 5068, 2001). También se ha demostrado que los dominios CUB1-EGF-CUBII median la dimerización de MASP-2, que es necesaria para la formación de un complejo MBL activo (Wallis, R. y otros, J. Biol. Chim. 275: 30962-30969, 2000). Por lo tanto, pueden identificarse anticuerpos inhibidores de MASP-2 que se unen o interfieren con regiones diana de MASP-2 que se sabe que son importantes para la activación del complemento dependiente de MASP-2.

Los anticuerpos contra MASP-2 para su uso en la generación de fusiones de anticuerpos contra MASP-2-SGMI de la invención pueden unirse a un epítopo en uno de los siguientes dominios polipeptídicos de MASP-2. El dominio CUBI de MASP-2 humana (los aa 16-136 de la SEQ ID NO: 4); o los dominios CUB/<e>GF de MASP-2 humana (los aa 16 181 de la SEQ ID NO: 4); o los dominios CUBI/EGF/CUBII de MASP-2 humana (los aa 16-292 de la SEQ ID NO: 4), o el dominio EGF de MASP-2 humana (los aa 137-181 de la SEQ ID NO: 4), o los dominios CCPI/CCPII/SP de MASP-2 humana (los aa 290-686 de la SEQ ID NO: 4), o los dominios CCPI/<c>CII de MASP-2 humana (los aa 293 444 de la SEQ ID NO: 4), o el dominio CCPI de MA<s>P-2 humana (los aa 293-362 de la SEQ ID NO: 4), o el dominio CCPII de MASP-2 humana (los aa 363-444 de la SEQ ID NO: 4), o los dominios CCPII/SP de MASP-2 humana (los aa 363-686 de la SEQ ID nO: 4), o el dominio SP de MASP-2 humana (los aa 444-6686 de la SEQ ID NO: 4).

En un caso, los anticuerpos de andamiaje inhibidores de MASP-2 para su uso en la invención se unen a una porción de la proteína MASP-2 humana de longitud completa (SEQ ID NO: 4), tal como el dominio CUBI, EGF, CUBII, CCPI, CCPII o SP de MASP-2. En algunos casos, los anticuerpos inhibidores de MASP-2 de la invención se unen a un epítopo en el dominio CCP1 de la MASP-2 humana (los aa 293-362 de la SEQ ID NO: 4). Por ejemplo, se han identificado anticuerpos inhibidores de MASP-2 (por ejemplo, el mAb#6) que solo se unen a fragmentos de MASP-2 que contienen el dominio CCP1 e inhiben la activación del complemento dependiente de MASP-2, como se describe en el Ejemplo 5.

En algunos casos, los anticuerpos de andamiaje contra MASP-2 para su uso en la invención se unen específicamente a la MASP-2 humana (establecida como la SEQ ID NO: 4, codificada por la SEQ ID NO:3), con una afinidad de al menos diez veces mayor que a otros antígenos del sistema del complemento. En algunos casos, los anticuerpos de andamiaje contra MASP-2 se unen específicamente a la MASP-2 humana con una afinidad de unión de al menos 100 veces mayor que a otros antígenos del sistema del complemento.

En algunos casos, los anticuerpos de andamiaje contra MASP-2 para su uso en la invención se unen específicamente a MASP-2 humana con una K<d>(constante de disociación) de menos de aproximadamente 100 nM, o menos de aproximadamente 50 nM, o menos de aproximadamente 25 nM, o menos de aproximadamente 10 nM, o menos de aproximadamente 5 nM, o menos de o igual a aproximadamente 1 nM, o menor o igual a 0,1 nM. La afinidad de unión de los anticuerpos contra MASP-2 puede determinarse mediante el uso de un ensayo de unión adecuado conocido en la técnica, tal como un ensayo ELISA.

En la presente descripción también se describe un anticuerpo aislado, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que comprende una o más secuencias de aminoácidos del péptido bioactivo, en donde al menos una secuencia de aminoácidos del péptido bioactivo se fusiona a al menos una de (i) la región amino terminal de al menos uno de: una región variable de cadena ligera y/o una región variable de cadena pesada; o (ii) la región carboxi terminal de al menos uno de: una región constante de cadena ligera y/o una región constante de cadena pesada, en donde el anticuerpo tiene al menos sustancialmente la misma o mayor actividad biológica en comparación con el péptido bioactivo aislado.

En algunos casos, la región variable de cadena pesada y/o la región variable de cadena ligera comprenden o consiste en regiones humanas. En algunos casos, la región variable de cadena pesada y/o la región variable de cadena ligera comprenden regiones no humanas (por ejemplo, de rata, ratón, pollo, camélido, sintética, etc.). En algunos casos, el anticuerpo portador de péptidos bioactivos inhibe la activación del complemento. En algunos casos, el anticuerpo portador de péptidos bioactivos inhibe la vía de las lectinas de la activación del complemento. En algunos casos, el anticuerpo portador del péptido bioactivo inhibe la actividad de al menos una de<m>A<s>P-1 y/o MASP-2. En algunos casos, la región variable de cadena pesada y/o la región variable de cadena ligera comprenden regiones una o más CDR que se unen específicamente a MASP-2.

Diversos casos de los anticuerpos aislados o fragmentos de los mismos que comprenden uno o más aminoácidos peptídicos bioactivos fusionados a la región amino terminal de una región variable de cadena ligera o pesada, o fusionados a la región carboxi terminal de una región constante de cadena ligera o una región constante de cadena pesada se genera de acuerdo con los métodos como se describen en la presente descripción.

En un caso, el anticuerpo aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo es un anticuerpo portador del péptido SGMI que comprende una secuencia de aminoácidos peptídica bioactiva que comprende una secuencia núcleo de SGMI establecida como la SEQ ID NO: 5. En un caso, el anticuerpo aislado o fragmento del mismo comprende un péptido bioactivo fusionado a la región amino terminal de una región variable de cadena ligera o pesada, o fusionado a la región carboxi terminal de una región constante de cadena ligera o una región constante de cadena pesada, en donde la secuencia peptídica bioactiva comprende o consiste en al menos una de la SEQ ID NO: 6 a la SEQ ID NO: 11.

En un caso, el anticuerpo aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende al menos una de las SEQ ID NO: 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106 o la SEQ ID NO: 108, o una variante de la misma que tiene al menos un 85 %, o al menos un 88 %, o al menos un 90 %, o al menos un 92 %, o al menos un 95 %, o al menos un 98%de identidad con la SEQ ID NO: 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106 o la SEQ ID NO: 108. En otro caso, se proporciona una molécula de ácido nucleico que codifica el anticuerpo aislado o fragmento de antígeno del mismo, donde la molécula de ácido nucleico comprende al menos una de las SEQ ID NO: 93, 95, 97, 99, 101, 103, 105 o la SEQ ID NO: 107, o una variante de la misma que tiene al menos un 85 %, o al menos un 88 %, o al menos un 90 %, o al menos un 92 %, o al menos un 95 % o al menos un 98 % de identidad con la SEQ ID NO: 93, 95, 97, 99, 101, 103, 105 o la SEQ ID NO: 107.

También se describe en la presente descripción un anticuerpo aislado, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que comprende: (i) una región variable de cadena pesada y/o una región variable de cadena ligera que comprende una o más CDR que se unen específicamente a la MASP-2; y (ii) al menos una secuencia peptídica núcleo de SGMI que comprende una secuencia de aminoácidos de acuerdo con: X1CTX2X3X4CX5Q (SEQ ID NO: 5) en donde: X1 es F o V; X2 es R o K; X3 es K o L; X4 es L o W y X5 es Y o N; y en donde la secuencia peptídica núcleo de SGMI está fusionada con al menos uno de: (a) la región amino terminal de al menos una de: una región variable de cadena ligera y/o una región variable de cadena pesada; o (b) la región carboxi terminal de al menos una de: una región variable de cadena ligera y/o una región variable de cadena pesada; o (c) la región carboxi terminal de al menos una de: una región constante humana de cadena ligera y/o una región constante humana de cadena pesada; y en donde la proteína de fusión de anticuerpo inhibe la activación del complemento de la vía de las lectinas dependiente de MASP-2. Los anticuerpos de acuerdo con este aspecto de la descripción también se denominan en la presente descripción como "anticuerpos contra MASP-2 portadores de péptido SGMI". Se generan diversos casos de anticuerpos contra MASP-2 portadores del péptido SGMI, o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, de acuerdo con los métodos como se describen en la presente descripción.

Potencia de los anticuerpos contra MASP-2 portadores del péptido SGMI

En un caso, una fusión de anticuerpo contra MASP-2 portador del péptido SGMI es lo suficientemente potente como para inhibir la activación del complemento dependiente de MASP-2 a una IC50 á 30 nM, preferentemente menos de o aproximadamente 20 nM, o menos de aproximadamente 10 nM o menos de aproximadamente 5 nM, o menos de o igual a aproximadamente 3 nM, o menos de o igual a aproximadamente 1 nM cuando se mide en suero al 1 %. En un caso, una fusión de anticuerpo contra MASP-2 portador del péptido SGMI es lo suficientemente potente como para inhibir la activación del complemento dependiente de MASP-2 a una IC50 á 30 nM, preferentemente menos de o aproximadamente 20 nM, o menos de aproximadamente 10 nM o menos de aproximadamente 5 nM, o menos de o igual a aproximadamente 3 nM, o menos de o igual a aproximadamente 1 nM cuando se mide en suero al 90 %. La inhibición de la activación del complemento dependiente de MASP-2 se caracteriza por al menos uno de los siguientes cambios en un componente del sistema del complemento que se produce como resultado de la administración de una fusión de anticuerpo contra MASP-2 portador del péptido SGMI: la inhibición de la generación o producción de productos del sistema de activación del complemento dependiente de MASP-2 C4a, C3a, C5a y/o c5b-9 (MAC) (medido, por ejemplo, como se describe en el Ejemplo 2 de la patente de Estados Unidos núm.

7,919,094) así como también sus productos de degradación catabólica (por ejemplo, C3desArg), la reducción de la escisión de C4 y la deposición de C4b (medida, por ejemplo, como se describe en el Ejemplo 4) y sus productos de degradación catabólica subsecuentes (por ejemplo, C4bc o C4d), o la reducción de la escisión de C3 y la deposición de C3b (medida, por ejemplo, como se describe en el Ejemplo 4), o sus productos de degradación catabólica subsecuentes (por ejemplo, C3bc, C3d, etc.).

En algunos casos, las proteínas de fusión del anticuerpo contra MASP-2 portador del péptido SGMI de la invención son capaces de inhibir la deposición de C3 en suero completo hasta menos del 80 %, tal como menos del 70 %, tal como menos del 60 %, tal como menos del 50 %, tal como menos del 40 %, tal como menos del 30 %, tal como menos del 20 %, tal como menos del 15 %, tal como menos del 10 % de la deposición control de C3.

En algunos casos, las proteínas de fusión del anticuerpo contra MASP-2 portador del péptido SGMI de la invención son capaces de inhibir la deposición de C4 en suero completo hasta menos del 80 %, tal como menos del 70 %, tal como menos del 60 %, tal como menos del 50 %, tal como menos del 40 %, tal como menos del 30 %, tal como menos del 20 %, tal como menos del 15 %, tal como menos del 10 % de la deposición control de C4.

En algunos casos, las proteínas de fusión del anticuerpo contra MASP-2 portador del péptido SGMI inhiben selectivamente la activación del complemento MASP-2 (es decir, se unen a MASP-2 con al menos 100 veces o más afinidad que a Clr o Cls), mientras dejan el sistema de activación del complemento dependiente de Clq funcionalmente intacto(es decir,se conserva al menos el 80 %, al menos el 90 %, o al menos el 95 %, o al menos el 98 % o el 100 % de la actividad de la vía clásica).

En algunos casos, las proteínas de fusión del anticuerpo contra MASP-2 portador del péptido SGMI en cuestión tienen las siguientes características: (a) alta afinidad por la MASP-2 humana (por ejemplo, una K<d>de 10 nM o menos, preferentemente una K<d>de 1 nM o menos), y (b) inhibir la actividad del complemento dependiente de MASP-2 en suero humano al 90 % con una IC50 de 10 nM o menos, con mayor preferencia una IC50 de 1 nM o menos).

En algunos casos, el andamiaje del anticuerpo contra MASP-2 es completamente humano. En algunos casos, el andamiaje del anticuerpo contra MASP-2 está humanizado y comprende un sitio de unión a MASP-2 derivado de una inmunoglobulina de una especie no humana (por ejemplo, un roedor, tal como un ratón o una rata, o un pollo).

Como se describe en el Ejemplo 5, se han identificado anticuerpos completamente humanos que se unen con alta afinidad a MASP-2 e inhiben la activación del complemento mediada por lectinas mientras dejan intacto el componente de la vía clásica (dependiente de Clq) del sistema inmunitario. Los fragmentos variables de las cadenas ligera y pesada de los anticuerpos se han secuenciado, aislado y analizado tanto en formato scFv como en formato de IgG de longitud completa. Las Figuras 14A y 14B muestran una alineación de secuencia de aminoácidos de siete clones de scFv anti-MASP-2 que se identificaron por tener alta afinidad de unión a MASP-2 y la capacidad de inhibir la actividad dependiente de MASP-2. Las Figuras 15A y 15B muestran una alineación de secuencia de aminoácidos de cuatro de los clones madre de scFv 17D20, 17N16, 18L16 y 4D9, que muestran las regiones estructurales y las regiones CDR. Los clones madre de scFv 17D20 y 17N16 se sometieron a maduración por afinidad, lo que condujo a la generación de clones hijos con mayor afinidad y mayor potencia en comparación con los clones madre, como se describe en el Ejemplo 5. Las secuencias de aminoácidos de las regiones variables de cadena pesada (VH) (los aa 1-120) y las regiones variables de cadena ligera (VL) (los aa 148-250) de los clones de scFv mostradas en las Figuras 14A y B y en las Figuras 15A y B, y los clones hijos resultantes se proporcionan más abajo en las Tablas 6, 8, 9, 10, 11, 12, 18 y 19. Las secuencias de aminoácidos de proteínas de fusión del anticuerpo contra MASP-2 portador del péptido SGMI ilustrativas se proporcionan en la Tabla 14.

Las posiciones sustituibles de un anticuerpo inhibidor de MASP-2, así como la elección de aminoácidos que pueden sustituirse en esas posiciones, se revelan al alinear las secuencias de aminoácidos de las cadenas pesada y ligera de los anticuerpos inhibidores de MASP-2 discutidos anteriormente, y determinar cuáles aminoácidos ocurren en qué posiciones de esos anticuerpos. En un caso ilustrativo, las secuencias de aminoácidos de las cadenas pesada y ligera de las Figuras 14A y B y de las Figuras 15A y B están alineadas, y se determina la identidad de los aminoácidos en cada posición de los anticuerpos ejemplares. Como se ilustra en las Figuras 14A y B y las Figuras 15A y B (que ilustran los aminoácidos presentes en cada posición de las cadenas pesada y ligera de los anticuerpos inhibidores de MASP-2 ilustrativos), varias posiciones sustituibles, así como también los residuos de aminoácidos que pueden ser sustituidos en esas posiciones, se identifican fácilmente. En otro caso ilustrativo, las secuencias de aminoácidos de la cadena ligera de los clones madre e hija se alinean y se determina la identidad de los aminoácidos en cada posición de los anticuerpos ilustrativos para determinar las posiciones sustituibles, así como también los residuos de aminoácidos que pueden ser sustituidos en estas posiciones.

En determinados casos, una proteína de fusión del anticuerpo contra MASP-2 portador del péptido SGMI en cuestión comprende un dominio variable de cadena pesada que es sustancialmente idéntico (por ejemplo, al menos aproximadamente 70 %, al menos 75 %, al menos aproximadamente 80 %, al menos aproximadamente 85 %, al menos aproximadamente 90 %, al menos aproximadamente 95 %, o al menos aproximadamente 96 % idéntico, o al menos aproximadamente 97 % idéntico, o al menos aproximadamente 98 % idéntico, o al menos aproximadamente 99 % idéntico), al de cualquiera de las secuencias del dominio variable de cadena pesada establecidas en la Tabla 18.

En algunos casos, una proteína de fusión del anticuerpo contra MASP-2 portador del péptido SGMI en cuestión comprende un dominio variable de cadena pesada que es sustancialmente idéntico (por ejemplo, al menos aproximadamente 70 %, al menos 75 %, al menos aproximadamente 80 %, al menos aproximadamente 85 %, al menos aproximadamente 90 %, al menos aproximadamente 95 %, o al menos aproximadamente 96 % idéntico, o al menos aproximadamente 97 % idéntico, o al menos aproximadamente 98 % idéntico, o al menos aproximadamente 99 % idéntico) a 17D20 (VH), establecido como la SEQ ID NO: 109. En algunos casos, la proteína de fusión del anticuerpo contra MASP-2 portador del péptido SGMI en cuestión comprende un dominio variable de cadena pesada que comprende la SEQ ID NO: 109.

En algunos casos, una proteína de fusión del anticuerpo contra MASP-2 portador del péptido SGMI en cuestión comprende un dominio variable de cadena pesada que es sustancialmente idéntico (por ejemplo, al menos aproximadamente 70 %, al menos 75 %, al menos aproximadamente 80 %, al menos aproximadamente 85 %, al menos aproximadamente 90 %, al menos aproximadamente 95 %, al menos aproximadamente 96 % idéntico, al menos aproximadamente 97 % idéntico, al menos aproximadamente 98 % idéntico, o al menos aproximadamente 99 % idéntico) a la SEQ ID NO: 111.

En algunos casos, una proteína de fusión del anticuerpo contra MASP-2 portador del péptido SGMI en cuestión comprende un dominio variable de cadena pesada que es sustancialmente idéntico (por ejemplo, al menos aproximadamente 70 %, al menos 75 %, al menos aproximadamente 80 %, al menos aproximadamente 85 %, al menos aproximadamente 90 %, al menos aproximadamente 95 %, o al menos aproximadamente 96 % idéntico, o al menos aproximadamente 97 % idéntico, o al menos aproximadamente 98 % idéntico, o al menos aproximadamente 99 % idéntico) a la SEQ ID NO: 112.

En algunos casos, una proteína de fusión del anticuerpo contra MASP-2 portador del péptido SGMI en cuestión comprende un dominio variable de cadena ligera que es sustancialmente idéntico (por ejemplo, al menos aproximadamente 70 %, al menos 75 %, al menos aproximadamente 80 %, al menos aproximadamente 85 %, al menos aproximadamente 90 %, al menos aproximadamente 95 %, o al menos aproximadamente 96 % idéntico, o al menos aproximadamente 97 % idéntico, o al menos aproximadamente 98 % idéntico, o al menos aproximadamente 99 % idéntico), al de cualquiera de las secuencias del dominio variable de cadena ligera establecidas en la Tabla 19. En algunos casos, una proteína de fusión del anticuerpo contra MASP-2 portador del péptido SGMI en cuestión comprende un dominio variable de cadena ligera que es sustancialmente idéntico (por ejemplo, al menos aproximadamente 70 %, al menos 75 %, al menos aproximadamente 80 %, al menos aproximadamente 85 %, al menos aproximadamente 90 %, al menos aproximadamente 95 %, o al menos aproximadamente 96 % idéntico, o al menos aproximadamente 97 % idéntico, o al menos aproximadamente 98 % idéntico, o al menos aproximadamente 99 % idéntico) a la SEQ ID NO: 113.

En algunos casos, una proteína de fusión del anticuerpo contra MASP-2 portador del péptido SGMI en cuestión comprende un dominio variable de cadena ligera que es sustancialmente idéntico (por ejemplo, al menos aproximadamente 70 %, al menos 75 %, al menos aproximadamente 80 %, al menos aproximadamente 85 %, al menos aproximadamente 90 %, al menos aproximadamente 95 %, o al menos aproximadamente 96 % idéntico, o al menos aproximadamente 97 % idéntico, o al menos aproximadamente 98 % idéntico, o al menos aproximadamente 99 % idéntico) a la SEQ ID NO: 115.

En algunos casos, una proteína de fusión del anticuerpo contra MASP-2 portador del péptido SGMI en cuestión comprende un dominio variable de cadena ligera que es sustancialmente idéntico (por ejemplo, al menos aproximadamente 70 %, al menos 75 %, al menos aproximadamente 80 %, al menos aproximadamente 85 %, al menos aproximadamente 90 %, al menos aproximadamente 95 %, o al menos aproximadamente 96 % idéntico, o al menos aproximadamente 97 % idéntico, o al menos aproximadamente 98 % idéntico, o al menos aproximadamente 99 % idéntico) a la SEQ ID NO: 116.

En algunos casos, una proteína de fusión del anticuerpo contra MASP-2 portador del péptido SGMI en cuestión comprende un dominio variable de cadena ligera que es sustancialmente idéntico (por ejemplo, al menos aproximadamente 70 %, al menos 75 %, al menos aproximadamente 80 %, al menos aproximadamente 85 %, al menos aproximadamente 90 %, al menos aproximadamente 95 %, o al menos aproximadamente 96 % idéntico, o al menos aproximadamente 97 % idéntico, o al menos aproximadamente 98 % idéntico, o al menos aproximadamente 99 % idéntico) a la SEQ ID NO: 118.

En algunos casos, la proteína de fusión del anticuerpo contra MASP-2 portador del péptido SGMI comprende una cadena pesada o ligera que está codificada por una secuencia de nucleótidos que se hibrida en condiciones de alta rigurosidad con una secuencia de nucleótidos que codifica una cadena pesada o ligera, como se establece en la SEQ ID NO: 110 o la SEQ ID NO: 114. Las condiciones de alta rigurosidad incluyen la incubación a 50 °C o más en 0. 1x SSC (solución salina 15 mM/citrato de sodio 0,15 mM).

En algunos casos, las proteínas de fusión del anticuerpo contra MASP-2 portador del péptido SGMI comprenden una región variable de cadena pesada que comprende una o más CDR (CDR1, CDR2 y/o CDR3) que son sustancialmente idénticas (por ejemplo, al menos aproximadamente 70 %, al menos 75 %, al menos aproximadamente 80 %, al menos aproximadamente 85 %, al menos aproximadamente 90 %, al menos aproximadamente 95 %, o al menos aproximadamente 96 % idénticos, o al menos aproximadamente 97 % idénticos, o al menos aproximadamente 98 % idénticos, o al menos 99 % idéntica), o comprende o consiste en la secuencia idéntica en comparación con la secuencia de aminoácidos de las CDR de cualquiera de las secuencias variables de cadena pesada mostradas en las Figuras 14A y B o las Figuras 15A y B, o descritas más abajo en la Tabla 9.

En algunos casos, las proteínas de fusión del anticuerpo contra MASP-2 portador del péptido SGMI comprenden una región variable de cadena ligera que comprende una o más CDR (CDR1, CDR2 y/o CDR3) que son sustancialmente idénticas (por ejemplo, al menos aproximadamente 70 %, al menos 75 %, al menos aproximadamente 80 %, al menos aproximadamente 85 %, al menos aproximadamente 90 %, al menos aproximadamente 95 %, o al menos aproximadamente 96 % idénticos, o al menos aproximadamente 97 % idénticos, o al menos aproximadamente 98 % idénticos, o al menos 99 % idéntica), o comprende o consiste en la secuencia idéntica en comparación con la secuencia de aminoácidos de las CDR de cualquiera de las secuencias variables de cadena ligera mostradas en las Figuras 14A y B o las Figuras 15A y B, o descritas más abajo en la Tabla 11.

En algunos casos, las proteínas de fusión del anticuerpo contra MASP-2 portador del péptido SGMI comprenden una secuencia CDR-H3 de región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos establecida como la SEQ ID NO: 129 o la SEQ ID NO: 146 y modificaciones de secuencia conservadoras de las mismas.

En algunos casos, las proteínas de fusión del anticuerpo contra MASP-2 portador del péptido SGMI comprenden una secuencia CDR-L3 de región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos establecida como la SEQ ID NO: 142 o la SEQ ID NO: 150 y modificaciones de secuencia conservadoras de las mismas.

En algunos casos, las proteínas de fusión del anticuerpo contra MASP-2 portador del péptido SGMI comprenden una secuencia CDR-H2 de región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos establecida como la SEQ ID NO: 123 o la SEQ ID NO: 124, y modificaciones de secuencia conservadoras de las mismas.

En algunos casos, las proteínas de fusión del anticuerpo contra MASP-2 portador del péptido SGMI comprenden una secuencia CDR-H1 de región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos establecida como la SEQ ID NO: 119 o la SEQ ID NO: 120 y modificaciones conservadoras de las mismas.

En algunos casos, las proteínas de fusión del anticuerpo contra MASP-2 portador del péptido SGMI comprenden una secuencia CDR-L2 de región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos establecida como la SEQ ID NO: 149 y modificaciones conservadoras de las mismas.

En algunos casos, las proteínas de fusión del anticuerpo contra MASP-2 portador del péptido SGMI comprenden una secuencia CDR-L1 de región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos establecida como la SEQ ID NO: 147 o la SEQ ID NO: 148 y modificaciones conservadoras de las mismas.

En algunos casos, las proteínas de fusión del anticuerpo contra MASP-2 portador del péptido SGMI comprenden una secuencia de aminoácidos que es sustancialmente idéntica (por ejemplo, al menos aproximadamente 70 %, al menos 75 %, al menos aproximadamente 80 %, al menos aproximadamente 85 %, al menos aproximadamente 90 %, al menos aproximadamente 95 %, o al menos aproximadamente 96 % idénticos, o al menos aproximadamente 97 % idénticos, o al menos aproximadamente 98 % idénticos, o al menos 99 % idéntica), o comprende o consiste en la secuencia idéntica en comparación con la secuencia de aminoácidos descrita más abajo en la Tabla 14.

En algunos casos, las proteínas de fusión del anticuerpo contra MASP-2 portador del péptido SGMI comprenden una secuencia de aminoácidos que es sustancialmente idéntica (por ejemplo, al menos aproximadamente 70 %, al menos 75 %, al menos aproximadamente 80 %, al menos aproximadamente 85 %, al menos aproximadamente 90 %, al menos aproximadamente 95 %, o al menos aproximadamente 96 % idénticos, o al menos aproximadamente 97 % idénticos, o al menos aproximadamente 98 % idénticos, o al menos 99 % idéntica), o comprende en la secuencia idéntica en comparación con la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 175, la SEQ ID NO: 177, la SEQ ID NO: 179, la SEQ ID NO: 181; la SEQ ID NO: 183, la SEQ ID NO: 185; la SEQ ID NO: 187 o la SEQ ID NO: 189.

En otro caso, se proporciona una molécula de ácido nucleico que codifica la proteína de fusión del anticuerpo contra MASP-2 portador del péptido SGMI, donde comprende la molécula de ácido nucleico al menos una de las SEQ ID NO: 174, 176, 178, 180, 182, 184, 186, o laSe QID NO: 188, o una variante de la misma que tiene al menos un 85 %, o al menos un 88 %, o al menos un 90 %, o al menos un 92 %, o al menos un 95 % o al menos un 98 % de identidad con la SEQ ID NO: 174, 176, 178, 180, 182, 184, 186, o la SEQ ID NO: 188.

También se describe en la presente descripción un anticuerpo monoclonal aislado o un fragmento de unión a antígeno del mismo que se une a la MASP-2 humana y que además comprende al menos uno de SGMI-1 (establecida como la SEQ ID NO: 6) y/o SGMI-2 (establecida como la SEQ ID NO: 9), en donde dicho anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo inhibe la activación de C4 en un sustrato recubierto con manano con un IC50 de 10 nM o menos en suero humano al 1 %. En un caso de este aspecto, dicho anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo reconoce específicamente al menos parte de un epítopo reconocido por (i) un anticuerpo de referencia que comprende una región variable de cadena pesada como se establece en la SEQ ID NO: 111 y una región variable de cadena ligera como se establece en la SEQ ID NO: 115, o (ii) un anticuerpo de referencia producido por una línea celular de hibridoma depositada en la Colección Europea de Cultivos Celulares (ECACC), Salisbury Wiltshire, Reino Unido, con el número de acceso 03050904.

De acuerdo con lo anterior, un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que comprende además al menos uno de SGMI-1 y/o SGMI-2 de acuerdo con determinados casos preferentes de la presente solicitud puede ser uno que compita por la unión a MASP-2 humana con cualquier anticuerpo descrito en la presente descripción que (i) se une específicamente al antígeno y (ii) comprende un dominio VH y/o VL descrito en la presente descripción, o comprende una CDR-H3 descrita en la presente descripción, o una variante de cualquiera de estos. La competencia entre los miembros de unión puede ensayarse fácilmentein vitro,por ejemplo, mediante el uso de ELISA y/o mediante el etiquetado de una molécula informadora específica a un miembro de unión que puede detectarse en presencia de otros miembros de unión no etiquetados, para permitir la identificación de los miembros de unión que se unen al mismo epítopo o un epítopo superpuesto. Por lo tanto, actualmente se proporciona un anticuerpo específico o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que comprende un sitio de unión a antígeno de anticuerpo humano que compite con un anticuerpo descrito en la presente descripción que se une a la MASP-2 humana, tal como cualquiera de los anticuerpos contra MASP-2 descritos en el Ejemplo 5, Ejemplo 6 y Ejemplo 7, para la unión a la MASP-2 humana.

En un caso, la descripción proporciona un anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une a la MASP-2 humana y que comprende SGMI-1 (establecido como la SEQ ID NO: 6), en donde el anticuerpo monoclonal comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 175, la SEQ ID NO: 182 y la SEQ ID NO: 187, o una variante de la misma que tiene al menos un 85 %, o al menos un 88 %, o al menos un 90 %, o al menos un 92 %, o al menos un 95%o al menos un 98%de identidad con la SEQ ID NO: 175, la SEQ ID NO: 182 y la SEQ ID NO: 187.

En un caso, la descripción proporciona un anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une a la MASP-2 humana y que comprende SGMI-2 (establecido como la SEQ ID NO: 9), en donde el anticuerpo monoclonal comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 181, la SEQ ID NO: 185 y la SEQ ID NO: 189, o una variante de la misma que tiene al menos un 85 %, o al menos un 88 %, o al menos un 90 %, o al menos un 92 %, o al menos un 95 % o al menos un 98 % de identidad con la SEQ ID NO: 181, la SEQ ID NO: 185 y la SEQ ID NO: 189.

Anticuerpos inhibidores de MASP-2 variantes

Los anticuerpos monoclonales contra MASP-2 descritos anteriormente pueden modificarse para proporcionar anticuerpos variantes que inhiben la activación del complemento dependiente de MASP-2. Los anticuerpos variantes pueden prepararse al sustituir, añadir o eliminar al menos un aminoácido de un anticuerpo monoclonal descrito anteriormente. En general, estos anticuerpos variantes tienen las características generales de los anticuerpos contra MASP-2 descritos anteriormente y contienen al menos las CDR de uno de los anticuerpos descritos anteriormente, o, en determinados casos, las CDR que son muy similares a las CDR de un anticuerpo descrito anteriormente. En el caso preferente, la variante comprende una o más sustituciones de aminoácidos en una o más regiones hipervariables del anticuerpo parental. Por ejemplo, la variante puede comprender al menos uno, por ejemplo, de aproximadamente uno a aproximadamente diez, tal como al menos 1, al menos 2, al menos 3, al menos 4, al menos 5, al menos 6, al menos 7, al menos 8, al menos 9 o al menos 10 sustituciones, y preferentemente de aproximadamente dos a aproximadamente seis sustituciones en una o más regiones CDR del anticuerpo parental. Normalmente, la variante tendrá una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 75 % de identidad de secuencia de aminoácidos con las secuencias del dominio variable de cadena pesada o ligera del anticuerpo parental, con mayor preferencia al menos un 80 %, con mayor preferencia al menos un 85 %, con mayor preferencia al menos un 90 %, y con la máxima preferencia al menos un 95 %, o al menos un 96 %, o al menos un 97 %, o al menos un 98 % o al menos un 99 % de identidad. La identidad u homología con respecto a estas secuencias se define en la presente descripción como el porcentaje de residuos de aminoácidos en la secuencia del candidato que son idénticos a los residuos del anticuerpo parental, después de alinear las secuencias e introducir interrupciones, si es necesario, para lograr el por ciento máximo de identidad de secuencia. La variante conserva la capacidad de unirse a la MASP-2 humana y preferentemente tiene propiedades superiores a las del anticuerpo parental. Por ejemplo, la variante puede tener una afinidad de unión más fuerte y/o una capacidad mejorada para inhibir o bloquear la activación del complemento dependiente de MASP-2.

Para analizar tales propiedades, debe compararse una forma Fab de la variante con una forma Fab del anticuerpo parental o una forma completa de la variante con una forma completa del anticuerpo parental, por ejemplo, ya que se ha descubierto que el formato del anticuerpo anti-MASP-2 afecta su actividad en los ensayos de actividad biológica descritos en la presente descripción. El anticuerpo variante de interés particular en la presente descripción es uno que presenta al menos aproximadamente 10 veces, preferentemente al menos aproximadamente 20 veces, y con la máxima preferencia aproximadamente 50 veces, la potenciación de la actividad biológica en comparación con un anticuerpo parental.

Los anticuerpos pueden modificarse para mejorar las propiedades convenientes, tal como puede ser conveniente controlar la vida media en suero del anticuerpo. En general, las moléculas de anticuerpo completas tienen una persistencia sérica muy prolongada, mientras que los fragmentos (< 60-80 kDa) se filtran muy rápidamente a través del riñón. Por lo tanto, si se desea una acción a largo plazo del anticuerpo contra MASP-2, el anticuerpo contra MASP-2 es preferentemente un anticuerpo IgG completo (tal como la IgG2 o la IgG4), mientras que si se desea una acción más corta del anticuerpo contra MASP-2, puede preferirse un fragmento de anticuerpo. Como se describe en el Ejemplo 7, se ha determinado que una sustitución S228P en la región bisagra de la IgG4 aumenta la estabilidad del suero. En consecuencia, en algunos casos, la proteína de fusión del anticuerpo contra MASP-2 portador del péptido SGMI en cuestión es un anticuerpo IgG4 de longitud completa con una sustitución S228P.

Anticuerpos de cadena sencilla

En un caso, la proteína de fusión del anticuerpo contra MASP-2 portador del péptido SGMI es un anticuerpo de cadena sencilla, definido como una molécula diseñada genéticamente que contiene la región variable de la cadena ligera, la región variable de la cadena pesada, unidas por un enlazador polipeptídico adecuado como una molécula de cadena sencilla genéticamente fusionada, y que comprende además un péptido SGMI, como se ilustra en las Figuras 17A y 17B. Estos anticuerpos de cadena sencilla también se denominan fragmentos de anticuerpo "Fv de cadena sencilla" o "scFv". Generalmente, el polipéptido de Fv comprende además un polipéptido enlazador entre los dominios VH y VL que permite que el scFv forme la estructura deseada para la unión al antígeno. Los anticuerpos scFv que se unen a la MASP-2 pueden orientarse con la región ligera variable ya sea amino terminal a la región pesada variable o carboxilo terminal a la misma. En la Tabla 6 se establecen anticuerpos scFv ilustrativos de la invención.

También se describe en la presente descripción un polipéptido aislado que comprende: (i) una región que comprende una secuencia núcleo de SGMI, donde la secuencia núcleo de SGMI comprende una secuencia de aminoácidos de acuerdo con: X1CTX2X3X4CX5Q (SEQ ID NO:5), en donde: Xi es F o V, X2 es R o K, X3 es K o L, X4 es L o W, y X5 es Y o N; y (ii) una región que comprende Fc de IgG1 humana, en donde el polipéptido inhibe la actividad de al menos una de MASP-1 o MASP-2.

En un caso, la región que comprende la región Fc de la IgG1 humana está ubicada en el extremo amino terminal de la región que comprende la secuencia núcleo de SGMI. En otro caso, la región que comprende la región Fc de la IgG1 humana está ubicada en el extremo carboxi terminal de la región que comprende la secuencia núcleo de SGMI.

En un caso, la región que comprende la Fc de la IgG1 comprende o consiste en la SEQ ID NO: 12, o una variante de la misma.

En un caso, la región que comprende la secuencia núcleo de SGMI comprende o consiste en al menos una de las SEQ ID NO: 6 a la SEQ ID NO: 11. En un caso, la región que comprende la Fc de la IgG1 humana se fusiona directamente con al menos una de las SEQ ID NO: 6 a la SEQ ID NO: 11. En un caso, el polipéptido comprende además una región enlazadora de 1 residuo de aminoácido a 20 residuos de aminoácidos, en donde la región enlazadora está incluida entre la región que comprende la secuencia núcleo de SGMI y la región que comprende la Fc de la IgG1 humana. En un caso, la secuencia enlazadora comprende al menos una de la SEQ ID NO: 13 o la SEQ ID NO: 14. En un caso, el polipéptido comprende al menos una de las SEQ ID NO: 16 o la SEQ ID NO: 18, o una variante de la misma que tiene al menos un 85 %, o al menos un 88 %, o al menos un 90 %, o al menos un 92 %, o al menos un 95 %, o al menos un 98 % de identidad con la SEQ ID NO: 16 o la SEQ ID NO: 18.

En otro caso, se proporciona una molécula de ácido nucleico que codifica los polipéptidos, donde comprende la molécula de ácido nucleico al menos una de las SEQ ID NO: 15 o la SEQ ID NO: 17, o una variante de la misma que tiene al menos un 85 %, o al menos un 88 %, o al menos un 90 %, o al menos un 92 %, o al menos un 95 % o al menos un 98 % de identidad con la SEQ ID NO: 15 o la SEQ ID NO: 17.

Métodos para producir anticuerpos portadores de biopéptidos

Los anticuerpos y polipéptidos de la descripción pueden producirse mediante métodos de ingeniería genética recombinante estándar, que se conocen bien por los expertos en la técnica de la biología molecular y la inmunología.

Para la producción recombinante de un anticuerpo portador de biopéptido o polipéptido de fusión de la invención, pueden ensamblarse secuencias de ADN que codifican los componentes polipeptídicos de un anticuerpo portador de biopéptidos o un polipéptido de fusión (por ejemplo, una secuencia peptídica bioactiva y una secuencia polipeptídica de cadena pesada o cadena ligera de interés) mediante el uso de metodologías convencionales. En un ejemplo, los componentes pueden ensamblarse por separado y ligarse en un vector de expresión adecuado. Por ejemplo, el extremo 3' de la secuencia de ADN que codifica un componente polipeptídico se liga, con o sin un enlazador peptídico, al extremo 5' de una secuencia de ADN que codifica el segundo componente polipeptídico de manera que los marcos de lectura de las secuencias estén en fase.

Para la producción recombinante de una secuencia peptídica bioactiva injertada en una región CDR de una región variable de cadena pesada o una región variable de cadena ligera, los componentes de ácido nucleico pueden ensamblarse y ligarse en un vector de expresión apropiado, con o sin un enlazador peptídico, de manera que la secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia peptídica bioactiva está en fase con la secuencia de ácido nucleico que codifica las regiones estructurales adyacentes de la cadena ligera variable o la cadena pesada variable. Como se describe en la presente descripción, puede emplearse una secuencia enlazadora peptídica para separar una secuencia peptídica bioactiva (por ejemplo, una secuencia peptídica de SGMI) de una secuencia polipeptídica heteróloga a una distancia definida, por ejemplo una distancia suficiente para garantizar que se consigan las ventajas de la invención, por ejemplo, actividad biológica del péptido bioactivo injertado en una región CDR, o fusionado en una región amino o carboxi terminal de un polipéptido de cadena pesada o ligera. Tal secuencia enlazadora peptídica puede incorporarse en los anticuerpos portadores de péptidos bioactivos mediante el uso de técnicas estándar bien conocidas en la técnica. Las secuencias enlazadoras peptídicas adecuadas pueden elegirse, por ejemplo, en base a uno o más de los siguientes factores: (1) su capacidad para adoptar una conformación extendida flexible; y (2) su incapacidad para adoptar una estructura secundaria que podría interferir con la actividad de la secuencia peptídica bioactiva. Las secuencias enlazadoras peptídicas ilustrativas, por ejemplo, pueden contener residuos Gly, Asn y Ser. Otros aminoácidos casi neutros, tales como Thr y Ala también pueden usarse en la secuencia enlazadora. Las secuencias de aminoácidos que pueden emplearse de manera útil como enlazadores incluyen las descritas en la presente descripción así como también las descritas en Maratea y otros, Gene 40: 39-46, 1985; Murphy y otros, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 8258-8262, 1986; Patente de Estados Unidos núm. 4,935,233; y la Patente de Estados Unidos núm. 4,751,180. La secuencia enlazadora puede ser generalmente de 1 a aproximadamente 20 aminoácidos de longitud, por ejemplo.

La invención incluye además moléculas de ácido nucleico que codifican los polipéptidos de la invención como se describe en la presente descripción. También se incluye un vector que contiene dicho ácido nucleico. Cuando el método se realiza en una célula hospedera, la célula hospedera primero se transforma o transfecta con un ácido nucleico exógeno que codifica el polipéptido estabilizado, luego los polipéptidos y anticuerpos se expresan y recuperan. Las células hospederas pueden ser procariotas, tales como bacterias, o eucariotas, como se describe más adelante en la presente descripción.

En muchos casos, los ácidos nucleicos que codifican un anticuerpo monoclonal en cuestión se introducen directamente en una célula hospedera y la célula se incuba en condiciones suficientes para inducir la expresión del anticuerpo codificado.

En algunos casos, la invención proporciona una célula que comprende una molécula de ácido nucleico que codifica un anticuerpo o polipéptido de la invención.

En algunos casos, la invención proporciona un casete de expresión que comprende una molécula de ácido nucleico que codifica un anticuerpo o polipéptido de la invención.

En algunos casos, la invención proporciona un método para producir un anticuerpo o polipéptido de la invención que comprende cultivar una célula que comprende una molécula de ácido nucleico que codifica un anticuerpo de la invención.

De acuerdo con determinados casos relacionados, se proporciona una célula hospedera recombinante que comprende una o más construcciones como se describe en la presente descripción; un ácido nucleico que codifica cualquier anticuerpo, CDR, dominio VH o VL, o fragmento de unión a antígeno del mismo; y un método de producción del producto codificado, método que comprende la expresión a partir del ácido nucleico codificante del mismo. En algunos casos, se proporciona una célula hospedera recombinante que comprende un ácido nucleico que codifica una proteína de fusión del anticuerpo contra MASP-2 portador del péptido SGMI, CDR, dominio VH o VL, o fragmento de unión a antígeno del mismo; y un método de producción del producto codificado, método que comprende la expresión a partir del ácido nucleico codificante del mismo. La expresión puede lograrse convenientemente mediante el cultivo en condiciones adecuadas de células hospederas recombinantes que contienen el ácido nucleico. Después de la producción por expresión, puede aislarse y/o purificarse un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo mediante el uso de cualquier técnica adecuada y luego usarse como se desee.

Por ejemplo, puede usarse como célula hospedera cualquier célula adecuada para la expresión de casetes de expresión, por ejemplo, células de levadura, insecto, planta, etc. En muchos casos, se usa una línea celular hospedera de mamífero que normalmente no produce anticuerpos, ejemplos de los cuales son los siguientes: células de riñón de mono (células COS), células CVI de riñón de mono transformadas por SV40 (COS-7, ATCC CRL 165 1); células de riñón embrionario humano (HEK-293, Graham y otros, J. Gen Virol. 36: 59 (1977)); células de riñón de cría de hámster (BHK, ATCC CCL 10); células de ovario de hámster chino (CHO, Urlaub y Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 77: 4216, (1980); células de sertoli de ratón (TM4, Mather, Biol. Reprod. 23: 243-251 (1980)); células de riñón de mono (CVI ATCC CCL 70); células de riñón de mono verde africano (VERO-76, ATCC CRL-1587); células de carcinoma cervical humano (HELA, ATCC CCL 2); células de riñón canino (MDCK, ATCC CCL 34); células de hígado de rata búfalo (BRL 3A, ATCC CRL 1442); células de pulmón humano (W138, ATCC CCL 75); células de hígado humano (hep G2, HB 8065); tumor mamario de ratón (MMT 060562, ATCC CCL 51); células TRI (Mather y otros, Annals N.Y. Acad. Sci 383: 44-68 (1982)); células NIH/3T3 (ATCC CRL-1658); y células L de ratón (ATCC CCL-1). Las líneas celulares adicionales resultarán evidentes para los expertos en la técnica. Una amplia variedad de líneas celulares está disponible en la Colección Americana de Cultivos Tipo, 10801 University Boulevard, Manassas, Va. 20110-2209.

Los métodos para introducir ácidos nucleicos en células se conocen bien en la técnica. Los métodos adecuados incluyen electroporación, tecnología de pistola de partículas, precipitación con fosfato de calcio, suministro de ácido nucleico lipídico catiónico, microinyección directa y similares. La elección del método generalmente depende del tipo de célula que se transforma y de las circunstancias bajo las cuales se lleva a cabo la transformación (es decir,in vitro, ex vivo,oin vivo).Una discusión general de estos métodos puede encontrarse en el documento de Ausubel, y otros, Short Protocols in Molecular Biology, 3a ed., Wiley & Sons, 1995. En algunos casos, se usan tecnologías de transferencia de genes mediadas por lipofectamina y calcio.

Después de que los ácidos nucleicos en cuestión se hayan introducido en una célula, típicamente la célula se incuba, normalmente a 37 °C, a veces bajo selección, durante un tiempo adecuado para permitir la expresión del anticuerpo. En la mayoría de los casos, el anticuerpo típicamente se secreta en el sobrenadante del medio en el que crece la célula.

En células hospederas de mamíferos, pueden usarse una serie de sistemas de expresión basados en virus para expresar el anticuerpo en cuestión. En los casos donde se usa un adenovirus como un vector de expresión, la secuencia codificante del anticuerpo de interés puede estar ligada a un complejo de control de la transcripción/traducción de adenovirus, por ejemplo, el promotor tardío y la secuencia líder tripartita. Este gen quimérico puede insertarse después en el genoma del adenovirus mediante recombinación in vitro o in vivo. La inserción en una región no esencial del genoma viral (por ejemplo, la región E1 o E3) resultará en un virus recombinante que es viable y capaz de expresar la molécula del anticuerpo en los hospederos infectados. (por ejemplo, ver el documento de Logan y Shenk, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 355-359 (1984)). La eficiencia de la expresión puede mejorarse por la inclusión de elementos potenciadores de la transcripción adecuados, terminadores de la transcripción, etc. (ver el documento de Bittner y otros, Methods in Enzymol. 153: 51-544 (1987)).

Para la producción de alto rendimiento a largo plazo de anticuerpos recombinantes, puede usarse la expresión estable. Por ejemplo, pueden manipularse las líneas celulares que expresan la molécula de anticuerpo de forma estable. En lugar de usar vectores de expresión que contienen orígenes de replicación virales, las células hospederas pueden transformarse con casetes de expresión de inmunoglobulinas y un marcador seleccionable. A continuación de la introducción del ADN exógeno, pueden dejarse crecer las células manipuladas durante 1-2 días en un medio enriquecido y después se cambian a un medio selectivo. El marcador seleccionable del plásmido recombinante confiere resistencia a la selección y permite a las células integrar el plásmido de forma estable dentro de un cromosoma y crecer para formar focos, que a su vez pueden clonarse y expandirse en líneas celulares. Estas líneas celulares manipuladas pueden ser particularmente útiles en el cribado y la evaluación de los compuestos que interactúan directamente o indirectamente con la molécula de anticuerpo.

Una vez que se ha producido una molécula de anticuerpo o un polipéptido de fusión de la invención, puede purificarse mediante cualquier método conocido en la técnica para la purificación de una molécula de inmunoglobulina, por ejemplo, mediante cromatografía (por ejemplo,, cromatografía de intercambio iónico, de afinidad, particularmente mediante la afinidad por el antígeno específico después de proteína A, y de exclusión por tamaño en columna), centrifugación, solubilidad diferencial, o mediante cualquier otra técnica estándar para la purificación de proteínas. En muchos casos, los anticuerpos se secretan desde la célula al medio de cultivo y se recolectan a partir del medio de cultivo. Por ejemplo, puede incluirse una secuencia de ácido nucleico que codifica un péptido señal adyacente a la región codificante del anticuerpo o fragmento. Dicho péptido señal puede incorporarse adyacente al extremo 5' de las secuencias de aminoácidos establecidas en la presente descripción para los anticuerpos en cuestión con el fin de facilitar la producción de los anticuerpos en cuestión.

En un caso, los anticuerpos que comprenden regiones estructurales de pollo de acuerdo con determinados casos de la presente invención pueden generarse y/u optimizarse para la afinidad o especificidad requerida mediante el uso de un sistemain vitrobasado en la línea de linfoma de células B de pollo DT40. La línea de linfoma de células B de pollo DT40 se ha usado para la evolución de anticuerposex-vivo(documento de Cumbers, S.J. y otros. Nat Biotechnol 20: 1129-1134 (2002); documento de Seo, H. y otros, Nat Biotechnol 23:731-735 (2005).). Las células DT40 tienen un enorme potencial de diversidad de secuencias de la región V, ya que pueden acceder a dos vías fisiológicas distintas para la diversificación, la conversión de genes y la hipermutación somática, que crean mutaciones con plantilla y sin plantilla, respectivamente (documento de Maizels, N., Immunoglobulin gene diversification. Ann. Rev. Genet. 39: 23-46 (2005)). Sin embargo, la utilidad de las células DT40 para la evolución de anticuerpos ha sido limitada en la práctica porque, como en otras líneas de células B transformadas, la diversificación se produce a menos del 1 % de la tasa fisiológica. La diversificación puede acelerarse varias veces al desactivar la vía de recombinación homóloga (Cumbers y otros, anterior), pero las células manipuladas de esta forma pierden la capacidad de llevar a cabo una selección genética eficiente. La diversificación también puede acelerarse mediante el tratamiento de las células con el inhibidor de la histona desacetilasa, la tricostatina A (Seo y otros, anterior,), pero las mutaciones resultantes están exclusivamente modeladas, lo que limita la diversidad potencial y es posible que no produzcan anticuerpos con la afinidad o especificidad requeridas.

Las células DT40 usadas en la presente descripción para generar anticuerpos se modifican para acelerar la tasa de diversificación del gen de la inmunoglobulina (Ig) sin sacrificar la capacidad de modificación genética adicional o el potencial de que tanto la conversión genética como la hipermutación somática contribuyan a la mutagénesis. Esto se logró al poner la diversificación del gen Ig bajo control de la potente red reguladora de operadores/represores de lactosa deE. coli.Los multímeros consisten en aproximadamente 100 repeticiones polimerizadas del potente operador de lactosa (PolyLacO) deE. coli,donde se insertó aguas arriba de los genes IgA e IgH reordenados y expresados mediante direccionamiento de genes homólogos. Los factores reguladores fusionados a la proteína represora de lactosa (LacI) pueden unirse después a los elementos reguladores LacO para regular la diversificación, al aprovechar la alta afinidad (K<d>= 10<' 14>M) del represor de lactosa para el ADN operador. Las células DT40 PolyLacO-A<R>, en las que el PolyLacO se integró solo en IgA, exhibieron un aumento de 5 veces en la tasa de diversificación del gen Ig con relación a las células DT40 parentales antes de cualquier manipulación (documento de Cummings, W.J. y otros. PLoS Biol 5, e246 (2007)). La diversificación se elevó aún más en células manipuladas para transportar el PolyLacO dirigido a los genes IgA e IgH ("DTLacO").

Composiciones Farmacéuticas

También se describen en la presente descripción composiciones farmacéuticas que comprenden los anticuerpos portadores de péptidos bioactivos y fragmentos de unión a antígeno de los mismos, como se describe en la presente descripción y un portador farmacéuticamente aceptable. En algunos casos, la descripción proporciona composiciones que comprenden anticuerpos que contienen péptidos bioactivos y fragmentos de unión a antígeno de los mismos capaces de inhibir la activación del complemento. En algunos casos, la descripción proporciona composiciones que comprenden anticuerpos que contienen péptidos bioactivos y fragmentos de los mismos capaces de inhibir la activación de la vía de las lectinas del complemento. En algunos casos, la descripción proporciona composiciones que comprenden anticuerpos contra MASP-2 portadores del péptido SGMI (por ejemplo, SGMI-1 y/o SGMI-2) y fragmentos de los mismos capaces de inhibir la activación de la vía de las lectinas.

En un caso, la composición se formula para inhibir específicamente la actividad de MASP-1 o MASP-2. En un caso, la composición se formula para inhibir específicamente la actividad de MASP-1. En un caso, la composición se formula para inhibir específicamente la actividad de MASP-2. En un caso, la composición se formula para inhibir específicamente la actividad de MASP-1 y MASP-2.

En un caso, la descripción proporciona una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo portador de péptido bioactivo que se une específicamente a MASP-2 e inhibe la activación de la vía de las lectinas dependiente de MASP-2. En un caso, la descripción proporciona una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo portador de péptido bioactivo que se une específicamente a MASP-1 e inhibe la actividad de MASP-1. En un caso, la descripción proporciona una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo biespecífico portador de un péptido bioactivo que se une a M<a>SP-1 y MASP-2 e inhibe la actividad de MA<s>P-1 y MASP-2. En un caso, la descripción proporciona una composición farmacéutica que comprende un primer anticuerpo portador de un péptido bioactivo que se une a MASP-1 e inhibe la actividad de MASP-1 y un segundo anticuerpo portador de un péptido bioactivo que se une a MASP-2 e inhibe la actividad de MASP-2.

El portador no es tóxico, es biocompatible y se selecciona de manera que no afecte perjudicialmente a la actividad biológica del anticuerpo portador del péptido bioactivo (y cualquier otro agente terapéutico combinado con el mismo). Los vehículos farmacéuticamente aceptables ilustrativos para polipéptidos se describen en la Patente de Estados Unidos núm. 5,211,657 de Yamada. Los anticuerpos y polipéptidos portadores de péptidos bioactivos pueden formularse en preparaciones en forma sólida, semisólida, gel, líquida o gaseosa tales como tabletas, cápsulas, polvos, gránulos, ungüentos, soluciones, depósitos, inhaladores e inyecciones que permiten la administración oral, parenteral o quirúrgica. La descripción también contempla la administración local de las composiciones mediante el recubrimiento de dispositivos médicos y similares.

Los portadores adecuados para el suministro parenteral mediante inyectables, infusión o irrigación y suministro tópico incluyen agua destilada, solución salina fisiológica tamponada con fosfato, soluciones de Ringer normal o lactato, solución de dextrosa, solución de Hank o propanodiol. Además, los aceites fijos estériles pueden emplearse como un solvente o medio de suspensión. Para este propósito, puede emplearse cualquier aceite biocompatible que incluye mono o diglicéridos sintéticos. Además, los ácidos grasos tal como el ácido oleico encuentran uso en la preparación de los inyectables. El portador y el agente pueden combinarse como un líquido, suspensión, gel, pasta o ungüento polimerizable o no polimerizable.

El portador también puede comprender un vehículo de suministro para mantener (es decir, extender, retrasar o regular) el suministro del agente o para mejorar el suministro, absorción, estabilidad o farmacocinética del(de los) agente(s) terapéutico(s). Tal vehículo de suministro puede incluir, por medio de ejemplo no limitante, micropartículas, microesferas, nanoesferas o nanopartículas compuestas de proteínas, liposomas, carbohidratos, compuestos orgánicos sintéticos, compuestos inorgánicos, hidrogeles poliméricos o copolímeros y micelas poliméricas. Los sistemas de suministro de hidrogel y micelas adecuados incluyen los copolímeros de PEO:PHB:PEO y los complejos de copolímero/ciclodextrina descritos en el documento WO 2004/009664 A2 y los complejos de PEO y PEO/ciclodextrina descritos en la publicación de solicitud de patente de Estados Unidos núm. 2002/0019369 A1. Tales hidrogeles pueden inyectarse localmente en el sitio de acción previsto, o por vía subcutánea o intramuscular para formar un depósito de liberación sostenida.

Para el suministro intraarticular o intravenosa, los anticuerpos o polipéptidos portadores de péptidos bioactivos pueden transportarse en portadores líquidos o en gel descritos anteriormente que son inyectables, vehículos de suministro de liberación sostenida descritos anteriormente que son inyectables o un ácido hialurónico o derivados de ácido hialurónico.

Para el suministro intratecal (IT) o intracerebroventricular (ICV), pueden usarse sistemas de suministro apropiadamente estériles (por ejemplo, líquidos, geles, suspensiones, etc.) para administrar la presente invención. Las composiciones de la presente invención también pueden incluir excipientes biocompatibles, tales como agentes dispersantes o humectantes, agentes de suspensión, diluyentes, tampones, potenciadores de la penetración, emulsionantes, aglutinantes, espesantes y agentes saborizantes (para administración oral).

Para lograr altas concentraciones de los anticuerpos en cuestión para el suministro local, los anticuerpos pueden formularse como una suspensión de partículas o cristales en solución para una inyección posterior, tal como para inyección intramuscular de depósito.

Métodos terapéuticos:

En la presente descripción también se describen métodos para inhibir la activación de la vía de las lectinas del complemento en un sujeto mamífero, tal como un sujeto humano, que comprenden administrar una composición que comprende un anticuerpo portador de un péptido bioactivo o una fusión de polipéptido portador de un péptido bioactivo como se describe en la presente descripción a dicho sujeto humano, en donde el péptido bioactivo inhibe la activación de la vía de las lectinas del complemento. Como se describe en la presente descripción, los péptidos bioactivos SGMI-1 como SGMI-2 bloquean la vía de activación del complemento de las lectinas sin afectar la vía clásica (documento de Heja y otros, 2012. Proc. Natl. Acad. Sci. 109: 10498). Como se describe en la patente de Estados Unidos núm. 7,919,094, la patente de Estados Unidos núm. 8,652,477, y la solicitud de patente de los Estados Unidos con número de serie 13/083,441 pendiente (publicada como el documento US2011/0311549), solicitud de patente de los Estados Unidos con número de serie 13/830,779 (publicada como el documento US2013/0266559), la solicitud de patente de los Estados Unidos con número de serie 13/441,827 (publicada como el documento US2012/0258095), la solicitud de patente de los Estados Unidos con número de serie 13/830,831 (publicada como el documento US2013/0266560) y la solicitud de patente de los Estados Unidos con número de serie 13/464,334 (publicada como el documento US2012/0282263), (cada uno de los cuales está asignado a Omeros Corporation, el cesionario de la presente solicitud), se ha implicado que la activación de la vía de las lectinas del complemento dependiente de MASP-2 contribuye a la patogénesis de numerosos estados patológicos agudos y crónicos, que incluye las afección vascular mediada por el complemento dependiente de MASP-2, una lesión por isquemia-reperfusión, aterosclerosis, trastorno inflamatorio gastrointestinal, una afección pulmonar, un procedimiento de reperfusión extracorpórea, una afección musculoesquelética, una afección renal, una afección de la piel, un trasplante de órgano o tejido, un trastorno o lesión del sistema nervioso, una trastorno sanguíneo, una afección urogenital, diabetes, quimioterapia o radioterapia, neoplasia maligna, un trastorno endocrino, un trastorno de la coagulación, una microangiopatía trombótica o una afección oftalmológica. Por lo tanto, los anticuerpos inhibidores de la vía de las lectinas de la presente invención pueden usarse para tratar las enfermedades y afecciones mencionadas anteriormente.

Métodos para inhibir la activación de la vía de las lectinas del complemento dependiente de MASP-2 y/o la activación de la vía de las lectinas del complemento dependiente de MASP-1

En un caso, la descripción proporciona un método para inhibir de la activación del complemento de lectina dependiente de MASP-2 y/o la activación del complemento de lectina dependiente de MASP-1 para tratar, prevenir o reducir la gravedad de una afección vascular mediada por el complemento de lectina, una lesión por isquemiareperfusión, aterosclerosis, un trastorno inflamatorio gastrointestinal, una afección pulmonar, un procedimiento de reperfusión extracorpórea, una afección musculoesquelética, una afección renal, una afección de la piel, un trasplante de órganos o tejidos, un trastorno o lesión del sistema nervioso, un trastorno sanguíneo, un trastorno urogenital afección, diabetes, quimioterapia o radioterapia, neoplasia maligna, un trastorno endocrino, un trastorno de la coagulación, una microangiopatía trombótica o una afección oftalmológica, que comprende la administración de una composición que comprende una cantidad terapéuticamente efectiva de un anticuerpo portador de péptido bioactivo (por ejemplo, un anticuerpo portador de SGMI-2, tal como un anticuerpo contra MASP-2-SGMI-2 y/o un anticuerpo portador de SGMI-1, tal como un anticuerpo contra MASP-2-SGMI-1, o un anticuerpo portador SGMI-1 y SGMI-2) o fragmento de unión a antígeno del mismo, capaz de inhibir la activación de la vía de la lectina dependiente de MASP-2 y/o la activación de la vía de la lectina dependiente de MASP-1 a un sujeto que lo necesite.

En algunos casos, los métodos de este aspecto de la descripción se usan para tratar a un sujeto que padece una afección vascular, preferentemente una afección vascular seleccionada del grupo que consiste en una afección cardiovascular, una afección cerebrovascular, una afección vascular periférica (por ejemplo, musculoesquelética), una afección renovascular, afección vascular mesentérica/entérica, revascularización para trasplantes y/o replantes, vasculitis, nefritis por púrpura de Henoch-Schonlein, vasculitis asociada a lupus eritematoso sistémico, vasculitis asociada a artritis reumatoide, vasculitis por complejos inmunitarios, enfermedad de Takayasu, dilatada miocardiopatía, angiopatía diabética, enfermedad de Kawasaki (arteritis), embolia gaseosa venosa (VGE) y reestenosis después de la colocación de una endoprótesis vascular, aterectomía rotacional y angioplastia coronaria transluminal percutánea (PTCA).

En algunos casos, los métodos se usan para tratar a un sujeto que padece una afección asociada con una lesión por isquemia-reperfusión, preferentemente una lesión por isquemia-reperfusión asociada con la reparación de un aneurisma aórtico, derivación cardiopulmonar, reanastomosis vascular en relación con trasplantes de órganos y/o reimplantación de dedos/extremidades, accidente cerebrovascular, infarto de miocardio y reanimación hemodinámica después de choque y/o procedimientos quirúrgicos.

En algunos casos, los métodos se usan para tratar y/o prevenir la aterosclerosis en un sujeto que lo necesita.

En algunos casos, los métodos se usan para tratar a un sujeto que padece una afección asociada con un trastorno gastrointestinal inflamatorio, preferentemente un trastorno gastrointestinal inflamatorio seleccionado del grupo que consiste en pancreatitis, enfermedad de Crohn, colitis ulcerativa, síndrome del intestino irritable y diverticulitis.

En algunos casos, los métodos se usan para tratar a un sujeto que padece una afección pulmonar, preferentemente una afección pulmonar seleccionada del grupo que consiste en síndrome de dificultad respiratoria aguda, lesión pulmonar aguda relacionada con transfusión, lesión pulmonar aguda por isquemia/reperfusión, enfermedad pulmonar obstructiva crónica, asma, granulomatosis de Wegener, enfermedad de la membrana basal antiglomerular (enfermedad de Goodpasture), síndrome de aspiración de meconio, síndrome de bronquiolitis obliterante, fibrosis pulmonar idiopática, lesión pulmonar aguda secundaria a quemadura, edema pulmonar no cardiogénico, depresión respiratoria relacionada con transfusiones y enfisema.

En algunos casos, los métodos se usan para inhibir la activación de la vía de las lectinas del complemento en un sujeto que se ha sometido, se está sometiendo o se someterá a un procedimiento de reperfusión extracorpórea, preferentemente un procedimiento de reperfusión extracorpórea seleccionado del grupo que consiste en hemodiálisis, plasmaféresis, leucoféresis, oxigenador de membrana extracorpórea (ECMo ), oxigenación por membrana extracorpórea inducida por heparina, precipitación de LDL (HELP) y bypass cardiopulmonar (CPB). En algunos casos, los métodos se usan para tratar a un sujeto que padece una afección musculoesquelética seleccionada del grupo que consiste en osteoartritis, artritis reumatoide, artritis reumatoide juvenil, gota, artropatía neuropática, artritis psoriásica, espondiloartropatía, artropatía cristalina y lupus eritematoso sistémico (SLE).

En algunos casos, los métodos se usan para tratar a un sujeto que padece una afección renal seleccionada del grupo que consiste en glomerulonefritis mesangioproliferativa, glomerulonefritis membranosa, glomerulonefritis membranoproliferativa (glomerulonefritis mesangiocapilar), glomerulonefritis posinfecciosa aguda (glomerulonefritis postestreptocócica), glomerulonefritis crioglobulinémica, nefritis lúpica, nefritis por púrpura de Schonlein-Henoch y nefropatía por la IgA.

En algunos casos, los métodos se usan para tratar a un sujeto que padece una afección de la piel seleccionada del grupo que consiste en psoriasis, dermatosis ampollosas autoinmunitarias, espongiosis eosinofílica, penfigoide ampolloso, epidermólisis ampollosa adquirida, herpes gestacional, lesión por quemadura térmica y lesión por quemadura química.

En algunos casos, los métodos se usan para tratar a un sujeto que se ha sometido, se está sometiendo o se someterá a un procedimiento de trasplante de órgano o tejido, preferentemente un procedimiento de trasplante seleccionado del grupo que consiste en alotrasplante de órganos, xenotrasplante de órganos e injerto de tejido. En algunos casos, los métodos se usan para tratar a un sujeto que sufre un trastorno o lesión del sistema nervioso seleccionado del grupo que consiste en esclerosis múltiple, miastenia gravis, enfermedad de Huntington, esclerosis lateral amiotrófica, síndrome de Guillain Barré, reperfusión después de un accidente cerebrovascular, discos degenerativos, trauma cerebral, enfermedad de Parkinson, enfermedad de Alzheimer, síndrome de Miller-Fisher, traumatismo y/o hemorragia cerebral, desmielinización y meningitis.

En algunos casos, los métodos se usan para tratar a un sujeto que padece un trastorno sanguíneo seleccionado del grupo que consiste en sepsis, sepsis grave, choque séptico, síndrome de dificultad respiratoria aguda resultante de sepsis, síndrome de respuesta inflamatoria sistémica, choque hemorrágico, anemia hemolítica, púrpura trombocitopénica trombótica autoinmune y síndrome urémico hemolítico.

En algunos casos, los métodos se usan para tratar a un sujeto que padece una afección urogenital seleccionada del grupo que consiste en enfermedad de la vejiga dolorosa, enfermedad sensorial de la vejiga, cistitis abacteriana crónica, cistitis intersticial, infertilidad, disfunción placentaria y aborto espontáneo y preeclampsia.

En algunos casos, los métodos se usan para tratar a un sujeto que padece una afección asociada con diabetes no obesa (diabetes tipo 1 o diabetes mellitus insulinodependiente) y/o complicaciones asociadas con diabetes tipo 1 o tipo 2 (inicio en la edad adulta), preferentemente una complicación asociada con diabetes tipo 1 o tipo 2 que se selecciona del grupo que consiste en angiopatía, neuropatía y retinopatía.

En algunos casos, los métodos se usan para inhibir la vía de las lectinas del complemento en un sujeto que se ha sometido, se está sometiendo o se someterá a tratamiento quimioterapéutico y/o radioterapia. En algunos casos, los métodos de este aspecto de la invención se usan para tratar a un sujeto que padece una enfermedad maligna. En algunos casos, los métodos se usan para tratar a un sujeto que padece un trastorno endocrino seleccionado del grupo que consiste en tiroiditis de Hashimoto, estrés, ansiedad y trastornos hormonales que implican la liberación regulada de prolactina, crecimiento u otro factor de crecimiento similar a la insulina y adrenocorticotropina de la glándula pituitaria.

En algunos casos, los métodos se usan para tratar a un sujeto que padece una afección oftalmológica mediada por las lectinas del complemento, preferentemente degeneración macular relacionada con la edad.

En algunos casos, los métodos se usan para tratar, prevenir o reducir la gravedad de la coagulación intravascular diseminada en un sujeto que lo necesita, tal como en un sujeto que padece una enfermedad o afección seleccionada del grupo que consiste en sepsis, traumatismo, malignidad, rechazo de trasplante, reacción a transfusión, complicación obstétrica, aneurisma vascular, insuficiencia hepática, insolación, quemaduras, exposición a radiación y reacción tóxica grave.

En algunos casos, los métodos se usan para inhibir la vía de las lectinas del complemento en un sujeto que padece hemoglobinuria paroxística nocturna.

En algunos casos, los métodos se usan para inhibir la vía de las lectinas en un sujeto que padece una microangiopatía trombótica (TMA). En algunos casos, los métodos se usan para inhibir la vía de las lectinas en un sujeto que padece o está en riesgo de desarrollar síndrome urémico hemolítico atípico (aHUS). En algunos casos, los métodos se usan para inhibir la vía de las lectinas en un sujeto que padece o está en riesgo de desarrollar síndrome urémico hemolítico (HUS). En algunos casos, los métodos se usan para inhibir la vía de las lectinas en un sujeto que padece púrpura trombocitopénica trombótica (TTP) o que presenta síntomas compatibles con un diagnóstico de TTP.

En algunos casos, los métodos se usan para inhibir la vía de las lectinas en un sujeto que padece crioglobulinemia. En algunos casos, los métodos se usan para inhibir la vía de las lectinas en un sujeto que padece de la enfermedad de las crioaglutininas.

En algunos casos, los métodos se usan para inhibir la vía de las lectinas en un sujeto que padece glaucoma.

En algunos casos, los métodos se usan para inhibir la vía de las lectinas en un sujeto que está en riesgo de desarrollar o padecer de síndrome de radiación aguda.

En algunos casos, los métodos se usan para inhibir la vía de las lectinas en un sujeto que sufre o está en riesgo de desarrollar una enfermedad o trastorno seleccionado del grupo que consiste en enfermedad de depósito denso, glomerulonefritis necrosante en forma de luna creciente pauci-inmune, lesión cerebral traumática, neumonía por aspiración, endoftalmitis, neuromielitis óptica y enfermedad de Behcet.

Métodos para inhibir la activación e inhibición de la vía de las lectinas del complemento

Activación de la vía alternativa del complemento dependiente de MASP-1

También se describe en la presente descripción un método para inhibir la activación de la vía de las lectinas del complemento y también inhibir la activación de la vía alternativa dependiente del complemento de MASP-1 para tratar, prevenir o reducir la gravedad de la hemoglobinuria paroxística nocturna (PNH), la degeneración macular relacionada con la edad, lesión por isquemia-reperfusión, artritis, coagulación intravascular diseminada, microangiopatía trombótica (que incluye HUS, aHUS y TTP), asma, enfermedad de depósitos densos, glomerulonefritis necrosante pauci-inmune, lesión cerebral traumática, neumonía por aspiración, endoftalmitis, neuromielitis óptica y enfermedad de Behcet que comprende administrar una composición que comprende una cantidad terapéuticamente efectiva de un anticuerpo portador de péptido bioactivo o una fusión de polipéptido portador de péptido bioactivo como se describe en la presente descripción, en donde la composición inhibe la activación de la vía de las lectinas del complemento e inhibe la activación de la vía alternativa dependiente de MASP-1 (por ejemplo, un anticuerpo portador de SGMI-1, o un anticuerpo contra MASP-2-SGMI-1 o un anticuerpo portador de SGMI-1 y SGMI-2) o fragmento de unión a antígeno del mismo, capaz de inhibir la activación de la vía de la lectinas y la activación de la vía alternativa dependiente de MASP-1 para un sujeto que lo necesita.

Descubrimientos recientes han relacionado MASP-1 con la activación de vías alternativas. MASP-1 puede convertir el factor D de la enzima de activación de la vía alternativa de su forma de zimógeno a su forma enzimáticamente activa (ver documento de Takahashi y otros, J Exp Med 207: 29-37 (2010), documento de Iwaki y otros, J. Immunol 187: 3751-58 (2011)). Además, MASP-1 activa la forma zimógena de mAs P-3 (documento de Megyeri y otros, J. Biol. Chem. 288: 8922-8934 (2013); documento de Degn y otros. J. Immunol. 189(8): 3957-69 (2012)), que a su vez puede activar el factor zimógeno D así como también escindir el factor B, otro componente esencial de la vía alternativa, a su forma activa (documento de Iwaki y otros, J. Immunol. 187: 3751-58 (2011)).

Como se describe en la solicitud de patente de los Estados Unidos con número de serie 13/857,391 dependiente (publicada como el documento US2013/0273053) y la solicitud de patente de los Estados Unidos con número de serie 13/921,139 (publicada como el documento US2013/0344073) (cada uno de los cuales está asignado a Omeros Corporation, el cesionario de la presente solicitud), se ha implicado que la activación de la vía de las lectinas dependiente de MASP-2 y la activación del complemento de la vía alternativa dependiente de MASP-1 contribuyen a la patogénesis de numerosas enfermedades en estados agudos y crónicos, que incluyen hemoglobinuria paroxística nocturna, degeneración macular relacionada con la edad, lesión por isquemia-reperfusión, artritis, coagulación intravascular diseminada, microangiopatía trombótica (que incluye HUS, aHUS y TTP), asma, enfermedad de depósitos densos, glomerulonefritis semilunar necrotizante pauci-inmune, cerebro traumático lesión, neumonía por aspiración, endoftalmitis, neuromielitis óptica y enfermedad de Behcet.

En consecuencia, en un caso, en la presente descripción se describe un método para inhibir la activación de la vía de las lectinas y la activación de la vía alternativa dependiente de MASP-1 mediante la administración de una cantidad terapéuticamente efectiva de una composición que comprende al menos uno de (i) un anticuerpo portador de un péptido bioactivo capaz de inhibir la actividad de MASP-1 (por ejemplo, un anticuerpo que comprende SGMI-1), (ii) un anticuerpo contra MASP-2-SGMI-1, (iii) un anticuerpo portador del SGMI-1 y SGMI-2, o (iv) un primer anticuerpo portador de SGMI-1 y un segundo anticuerpo portador SGMI-2, para el tratamiento de un sujeto que padece o está en riesgo de desarrollar una enfermedad o trastorno seleccionado del grupo que consiste en: Hemoglobinuria paroxística nocturna, degeneración macular relacionada con la edad, lesión por isquemiareperfusión, artritis, coagulación intravascular diseminada, microangiopatía trombótica (incluidos HUS, aHUS y TTP), asma, enfermedad de depósitos densos, glomerulonefritis necrosante pauci-inmune, lesión cerebral traumática, neumonía por aspiración, endoftalmitis, neuromielitis óptica y enfermedad de Behcet.

Métodos de suministro

De acuerdo con diversos casos de la presente descripción, la composición se formula para un suministro sistémico, tal como mediante administración intraarterial, intravenosa, intracraneal, intramuscular, inhalatoria, nasal o subcutánea.

Como se usa en la presente descripción, los términos "suministro sistémico" y "administración sistémica" pretenden incluir, pero no se limitan a, las vías oral y parenteral, que incluye las vías intramuscular (IM), subcutánea, intravenosa (IV), intraarterial, inhalatoria, sublingual, bucal, tópica, transdérmica, nasal, rectal, vaginal y otras vías de administración que resultan efectivamente en la dispersión del anticuerpo suministrado a uno o múltiples sitios de acción terapéutica prevista. Las rutas preferentes de suministro sistémico para las presentes composiciones incluyen intravenosa, intramuscular, subcutánea e inhalatoria. Se apreciará que la ruta de administración sistémica exacta para agentes seleccionados usados en composiciones particulares de la presente invención se determinará en parte para tener en cuenta la susceptibilidad del agente a las vías de transformación metabólica asociadas con una ruta de administración determinada.

Los anticuerpos y polipéptidos portadores de péptidos bioactivos pueden suministrarse a un sujeto que los necesite mediante cualquier medio adecuado. Los métodos de suministro incluyen la administración por vía oral, pulmonar, parenteral (por ejemplo, inyección intramuscular, intraperitoneal, intravenosa (IV) o subcutánea), inhalación (tal como mediante una formulación en polvo fino), transdérmica, nasal, vaginal, rectal o vías de administración sublingual, y puede formularse en formas de dosificación apropiadas para cada vía de administración.

Las composiciones de la presente invención pueden administrarse sistémicamente de forma periódica a intervalos determinados para mantener un nivel deseado de efecto terapéutico. Por ejemplo, las composiciones pueden administrarse, por ejemplo mediante inyección subcutánea, cada dos a cuatro semanas o a intervalos menos frecuentes. El régimen de dosificación lo determinará el médico teniendo en cuenta varios factores que pueden influir en la acción de la combinación de agentes. Estos factores incluirán el grado de progreso de la afección que se está tratando, la edad, el sexo y el peso del paciente, y otros factores clínicos. La dosis para cada agente individual variará en función del anticuerpo particular que se incluye en la composición, así como también de la presencia y naturaleza de cualquier vehículo de administración de fármaco (por ejemplo, un vehículo de administración de liberación sostenida). Además, la cantidad de dosificación puede ajustarse para tener en cuenta la variación en la frecuencia de administración y el comportamiento farmacocinético del(de los) agente(s) suministrado(s).

La eficacia terapéutica de las composiciones inhibidoras de MASP-2 y MASP-1 y los métodos de la presente descripción en un sujeto determinado, y las dosis apropiadas, pueden determinarse de acuerdo con ensayos de complemento bien conocidos por los expertos en la técnica. El complemento genera numerosos productos específicos. Durante la última década, se han desarrollado ensayos sensibles y específicos que están disponibles comercialmente para la mayoría de estos productos de activación, que incluye los pequeños fragmentos de activación C3a, C4a y C5a y los grandes fragmentos de activación iC3b, C4d, Bb y sC5b-9. La mayoría de estos ensayos utilizan anticuerpos que reaccionan con nuevos antígenos (neoantígenos) expuestos en el fragmento, pero no con las proteínas nativas a partir de las cuales se forman, lo que hace que estos ensayos sean muy simples y específicos. La mayoría se basa en la tecnología ELISA, aunque a veces todavía se usa el radioinmunoensayo para C3a y C5a. Estos últimos ensayos miden tanto los fragmentos no procesados como sus fragmentos 'desArg', que son las formas principales que se encuentran en la circulación. Los fragmentos no procesados y C5adesArg se eliminan rápidamente al unirse a receptores de la superficie celular y, por lo tanto, están presentes en concentraciones muy bajas, mientras que C3adesArg no se une a las células y se acumula en el plasma. La medición de C3a proporciona un indicador sensible e independiente de la vía de activación del complemento. La activación de la vía alternativa puede evaluarse al medir el fragmento Bb. La detección del producto en fase fluida de la activación de la vía de ataque a la membrana, sC5b-9, proporciona evidencia de que el complemento se está activando por completo. Debido a que tanto la vía de las lectinas como la vía clásica generan los mismos productos de activación, C4a y C4d, la medición de estos dos fragmentos no proporciona ninguna información sobre cuál de estas dos vías ha generado los productos de activación.

L a in h ib ic ió n d e la a c t iv a c ió n d e l c o m p le m e n to d e p e n d ie n te d e le c t in a se c a ra c te r iz a p o r a l m e n o s u n o d e los s ig u ie n te s c a m b io s e n un c o m p o n e n te d e l s is te m a d e l c o m p le m e n to q u e s e p ro d u c e c o m o re s u lta d o d e la a d m in is tra c ió n d e un a n t ic u e rp o a n t i-M A S P -2 d e a c u e rd o c o n la p re s e n te in v e n c ió n : la in h ib ic ió n d e la g e n e ra c ió n o p ro d u c c ió n d e p ro d u c to s d e l s is te m a d e a c t iv a c ió n d e l c o m p le m e n to d e p e n d ie n te d e M A S P -2 C 4 b , C 3 a , C 5 a y /o C 5 b -9 (M A C ), la re d u c c ió n d e la e s c is ió n d e C 4 y la d e p o s ic ió n d e C 4 b , o la re d u c c ió n d e la e s c is ió n d e C 3 y la d e p o s ic ió n d e C 3 b .

A r t íc u lo s d e fa b r ic a c ió n

E n la p re s e n te d e s c r ip c ió n ta m b ié n s e d e s c r ib e un a r t íc u lo fa b r ic a d o q u e c o n t ie n e un a n t ic u e rp o p o r ta d o r d e l p é p tid o b io a c tiv o , o un f ra g m e n to d e u n ió n a a n tíg e n o d e l m is m o , o un p o lip é p tid o c o m o s e d e s c r ib e e n la p re s e n te d e s c r ip c ió n (p o r e je m p lo , un a n t ic u e rp o c o n tra M A S P -2 p o r ta d o r d e l S G M I) e n u n a fo rm a d e d o s if ic a c ió n u n ita r ia a d e c u a d a p a ra la a d m in is tra c ió n te ra p é u t ic a a un s u je to h u m a n o , ta l c o m o , p o r e je m p lo , u n a d o s if ic a c ió n u n ita r ia en e l in te rv a lo d e 1 m g a 5000 m g, ta l c o m o d e 1 m g a 2000 m g, ta l c o m o d e 1 m g a 1000 m g, ta l c o m o 5 m g, 10 m g, 50 m g, 100 m g , 200 m g , 500 m g o 1000 m g . E n a lg u n o s c a s o s , e l a r t íc u lo d e fa b r ic a c ió n c o m p re n d e un re c ip ie n te y u n a e t iq u e ta o p ro s p e c to e n o a s o c ia d a c o n e l re c ip ie n te . L o s re c ip ie n te s a d e c u a d o s in c lu y e n , p o r e je m p lo , b o te lla s , v ia le s , je r in g a s , e tc . L o s re c ip ie n te s p u e d e n fo rm a rs e a p a r t ir d e u n a v a r ie d a d d e m a te r ia le s ta le s c o m o e l v id r io o e l p lá s t ic o . E l re c ip ie n te c o n t ie n e u n a c o m p o s ic ió n q u e e s e fe c t iv a p a ra t r a ta r la a fe c c ió n y p u e d e te n e r un p u e rto d e a c c e s o e s té r il ( p o r e je m p lo , e l re c ip ie n te p u e d e s e r u n a b o ls a d e s o lu c ió n in tra v e n o s a o un v ia l q u e t ie n e un ta p ó n p e r fo ra b le p o r u n a a g u ja d e in y e c c ió n h ip o d é rm ic a ) . A l m e n o s un a g e n te a c t iv o e n la c o m p o s ic ió n e s e l a n t ic u e rp o p o r ta d o r d e l p é p tid o b io a c tiv o o f ra g m e n to d e u n ió n a a n tíg e n o d e l m is m o o e l p o lip é p tid o d e la in v e n c ió n (p o r e je m p lo , un a n t ic u e rp o c o n tra M A S P -2 p o r ta d o r d e l p é p tid o S G M I o f ra g m e n to d e u n ió n a a n tíg e n o d e l m is m o ) . La e t iq u e ta o p ro s p e c to in d ic a q u e la c o m p o s ic ió n s e u s a p a ra t r a ta r la a fe c c ió n p a rt ic u la r . L a e t iq u e ta o p ro s p e c to c o m p re n d e rá a d e m á s in s tru c c io n e s p a ra a d m in is t ra r la c o m p o s ic ió n d e a n t ic u e rp o a l p a c ie n te . T a m b ié n se c o n te m p la n a r tíc u lo s d e fa b r ic a c ió n y k its q u e c o m p re n d e n te ra p ia s c o m b in a to r ia s d e s c r ita s e n la p re s e n te d e s c r ip c ió n .

L o s s ig u ie n te s e je m p lo s s im p le m e n te ilu s tra n e l m e jo r m o d o a h o ra c o n te m p la d o p a ra p o n e r e n p rá c t ic a la p re s e n te d e s c r ip c ió n .

E je m p lo 1

D e s c r ip c ió n g e n e ra l d e la e s tra te g ia p a ra g e n e ra r p o lip é p tid o s M A S P in h ib id o re s m e d ia n te e l in je r to d e p é p tid o s b io a c t iv o s o la fu s ió n d e p é p tid o s b io a c t iv o s e n a n t ic u e rp o s o f ra g m e n to s d e lo s m is m o s .

F u n d a m e n to : La g e n e ra c ió n d e in h ib id o re s e s p e c íf ic o s d e M A S P -1 y M A S P -2 , d e n o m in a d o s S G M I-1 y S G M I-2 , re s p e c t iv a m e n te , s e d e s c r ib e e n e l d o c u m e n to d e H e ja y o tro s , J B io l C h e m 287 : 20290 (2012 ) y e n e l d o c u m e n to d e H e ja y o tro s , P N A S 109 : 10498 (2012 ) , c a d a u n o d e lo s c u a le s s e in c o rp o ra e n la p re s e n te d e s c r ip c ió n c o m o re fe re n c ia . S G M I-1 y S G M I-2 s o n c a d a u n o d e e llo s p é p tid o s d e 36 a m in o á c id o s q u e s e s e le c c io n a ro n d e u n a b ib lio te c a d e fa g o s d e v a r ia n te s d e l in h ib id o r d e p ro te a s a 2S ch is to ce rca g re g a riae n e l q u e s e is d e la s o c h o p o s ic io n e s d e l la z o d e u n ió n a p ro te a s a fu e ro n c o m p le ta m e n te a le a to r iz a d a s . La e v o lu c ió nin v itros u b s e c u e n te p ro d u jo in h ib id o re s m o n o e s p e c íf ic o s c o n v a lo re s d e un s o lo d íg ito K i nM (d o c u m e n to d e H e ja y o tro s , J. B io l. C h e m .

287 : 20290 , 2012 ). L o s e s tu d io s e s tru c tu ra le s re v e la ro n q u e e l la z o d e u n ió n d e p ro te a s a o p t im iz a d o fo rm a e l s it io d e u n ió n p r im a r io q u e d e fin e la e s p e c if ic id a d d e lo s d o s in h ib id o re s . L a s s e c u e n c ia s d e a m in o á c id o s d e la s re g io n e s d e u n ió n in te rn a y s e c u n d a r ia e x te n d id a s o n c o m u n e s a lo s d o s in h ib id o re s y c o n tr ib u y e n a la in te r fa z d e c o n ta c to (d o c u m e n to d e H e ja y o tro s , 2012. J. B io l. C h e m . 287 : 20290 ) . M e c á n ic a m e n te , ta n to S G M I-1 c o m o S G M I-2 b lo q u e a n la v ía d e a c t iv a c ió n d e l c o m p le m e n to d e la s le c t in a s s in a fe c ta r la v ía c lá s ic a (d o c u m e n to d e H e ja y o tro s , 2012. P ro c . N a tl. A c a d . S c i. 109 : 10498 ).

L a s s e c u e n c ia s d e a m in o á c id o s d e lo s in h ib id o re s d e S G M I-1 y S G M I-2 s e e s ta b le c e n m á s a b a jo :

S G M I-1 d e lo n g itu d c o m p le ta : L E V T C E P G T T F K D K C N T C R C G S D G K S A F C T R K L C Y Q (S E Q ID N O : 6 ) S G M I-1 m e d io : T C E P G T T F K D K C N T C R C G S D G K S A F C T R K L C Y Q (S E Q ID N O : 7 ) S G M I-1 co rto : T C R C G S D G K S A F C T R K L C Y Q (S E Q ID N O : 8 ) S G M I-2 d e lo n g itu d c o m p le ta : L E V T C E P G T T F K D K C N T C R C G S D G K S A V C T K L W C N Q (S E Q ID N O : 9 ) S G M I-2 m e d io : T C E P G T T F K D K C N T C R C G S D G K S A V C T K L W C N Q (S E Q ID N O : 10 ) S G M I-2 co rto : T C R C G S D G K S A V C T K L W C N Q (S E Q ID N O : 11 )

X4 es L o W, y

X5 es Y o N

Los péptidos bioactivos (por ejemplo, péptidos SGMI derivados a partir de SGMI-1 (establecidos como las SEQ ID NO: 6-8) y SGMI-2 (establecidos como las SEQ ID NO: 9-11)) son inhibidores altamente específicos de MASP-1 y MASP-2, respectivamente. Sin embargo, como péptidos tienen un potencial limitado para su uso en estudios biológicos y aplicaciones terapéuticas. Para abordar estas limitaciones, como se describe en la presente descripción, los inventores han injertado estas secuencias de aminoácidos de péptidos bioactivos (es decir, secuencias de aminoácidos que codifican los péptidos bioactivos) en varios andamiajes, o las han fusionado: (1) fusionado en el extremo amino terminal de la región Fc de la IgG1 humana para crear una proteína de fusión Fc, como se describe en el Ejemplo 2; (2) injertado en diversas regiones determinantes de complementariedad (CDR) de un anticuerpo quimérico no específico de pollo (regiones variables) - humano (regiones constantes IgG1 e IgA), como se describe en el Ejemplo 3; (3) fusionado en los extremos amino o carboxi terminal de las cadenas pesada y/o ligera de un anticuerpo quimérico no específico de pollo (regiones variables) - humano (regiones constantes IgG1 e IgA), como se describe en el Ejemplo 4, y (4) fusionado en los extremos amino o carboxi terminal de las cadenas pesada y/o ligera de un anticuerpo humano, tal como un anticuerpo contra MASP-2 humano, como se describe en los Ejemplos 7 y 8. Como se describe en la presente descripción, la introducción de una secuencia peptídica bioactiva en o sobre un andamiaje de anticuerpo da como resultado un producto con al menos la misma o mayor bioactividad en comparación con el péptido bioactivo aislado y con propiedades terapéuticas mejoradas, tales como una vida media más larga y una mayor duración de las funciones efectoras del anticuerpo.

Ejemplo 2

Este Ejemplo describe la generación de proteínas de fusión SGMI-Fc recombinantes y demuestra que estas proteínas de fusión son capaces de inhibir la vía de las lectinas.

Métodos: Para expresar las proteínas de fusión SGMI-IgG1 Fc, se sintetizaron polinucleótidos que codifican los péptidos SGMI-1 (SEQ ID<n>O: 6) y SGMI-2 (SEQ ID NO: 9) (ADN 2.0) y se insertaron en el vector de expresión pFUSE-hIgG1-Fc2 (InvivoGen) entre secuencias de nucleótidos que codifican la secuencia señal de la IL-2 y la región Fc de la IgG1 humana (SEQ ID NO: 12). En algunos casos, se incluyó un enlazador polipeptídico flexible opcional (por ejemplo, la SEQD NO: 13 o la S<e>Q ID NO: 14) entre el péptido S<g>MI y la región Fc de IgG1.

Secuencias ilustrativas de enlazadores de polipéptidos flexibles:

GTGGGSGSSSRS (SEQ ID NO: 13)

GTGGGSGSSS (SEQ ID NO: 14)

Cabe señalar que en otro caso, la descripción abarca una versión alternativa de las proteínas de fusión SGMI-IgG1 Fc que contienen la región IgG1 Fc fusionada al extremo amino terminal de los péptidos SGMI. Se observa además que en casos adicionales, la descripción abarca versiones alternativas de las proteínas de fusión SGMI-IgG1 Fc que comprenden una secuencia de aminoácidos del péptido bioactivo que comprende la secuencia núcleo SGMI (SEQ ID NO: 5), y que tiene una longitud de al menos 9 residuos de aminoácidos a 36 residuos de aminoácidos, que incluye varias versiones truncadas de péptidos bioactivos SGMI-1 o SGMI-2 (por ejemplo, péptidos SGMI que comprenden la secuencia núcleo de la SEQ ID NO: 5, tales como cualquiera de la SEQ ID NO: 6 a la SEQ ID NO: 11).

Las construcciones resultantes se describen a continuación:

Un polinucleótido que codifica la fusión de polipéptidos que comprende la secuencia señal de la IL-2 humana, SGMI-1, el enlazador y la IgG1-Fc humana (pFUSE-SGMI-1Fc), se establece como la SEQ ID NO: 15, que codifica la fusión de polipéptidos maduros que comprende SGMI-1 (subrayada), región enlazadora (cursiva) e IgG1-Fc humana (denominadas en conjunto "SGMI-1Fc"), que se establece como la SEQ ID NO: 16.

SEQ ID NO: 16

LEVTCEPGTTFKDKCNTCRCGSDGKSATCTRKLCYOGy'GGGSG.S'SmDK

THTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNW

Y VD GVEVFTN AKTKPREE Q YN S T YRV VS VLT VLFIQ D WLN GKE YKCK V SNK ALP

APIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESN

GQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLY SKLTVDKSRW QQGNVFSC S VMHEALHNEIYT

QKSLSLSPGK

Un polinucleótido que codifica la fusión de polipéptidos que comprende la secuencia señal de la IL-2 humana, SGMI-2, el enlazador y la IgG1-Fc humana (pFUSE-SGMI-2Fc), se establece como la SEQ ID NO: 17, que codifica la fusión de polipéptidos maduros que comprende SGMI-2 (subrayada), región enlazadora (cursiva) e IgG1-Fc humana (denominadas en conjunto "SGMI-2Fc"), que se establece como la SEQ ID NO: 18:

SEQ ID NO: 18

LEVTCEPGTTFKDKCNTCRCGSDGKSAVCTKLWCNQG 7G G G ^G ^m D K

TEFT C PPC P APELLGGP S VF LFPPKPKDTLMISRTPE VTC V V VD V SHEDPE VKFN W

Y VDGVE VFTN AKTKPREEQ YN STYR VV S VET VEHQDWLNGKE YK CK V SNK ALP

APIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESN

GQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMF1EALHNHYT

QKSLSLSPGK

Producción de proteínas recombinantes:

Se transfectaron transitoriamente células Freestyle 293-F o Expi293F (Invitrogen) de acuerdo con el protocolo del proveedor con uno de los dos plásmidos de expresión (pFUSE-SGMI-1Fc (SEQ ID NO: 15) y pFUSE-SGMI-2Fc (SEQ ID NO: 17). Después de cuatro días de incubación a 37 °C, se recogieron los medios de cultivo. Las proteínas de fusión Fc se purificaron mediante cromatografía de afinidad con proteína A.

Ensayos que miden la activación de la vía de las lectinas.

El sistema de cribado del complemento Wieslab® (Euro Diagnostic, Malmo, Suecia), el ensayo MBL mide la deposición de C5b-C9 en condiciones que aislaron la vía de las lectinas. El ensayo se llevó a cabo de acuerdo con las instrucciones del fabricante, ensayándose las proteínas de fusión Fc en concentraciones finales de 400 nM. La Figura 1 es un gráfico de barras que muestra la actividad inhibidora de las proteínas de fusión SGMI-1Fc (SEQ ID NO: 16) o SGMI-2Fc (SEQ ID NO: 18) en comparación con los sueros positivos y negativos proporcionados con el kit de ensayo, así como también un anticuerpo de control de isotipo. Como se muestra en la Figura 1, tanto SGMI-1Fc como SGMI-2Fc inhiben la activación de la vía de las lectinas, mientras que el anticuerpo de control de isotipo no lo hace.

También se probó la capacidad de las proteínas de fusión SGMI-1Fc y SGMI-2Fc para inhibir la deposición de C3b a partir de suero al 1 % en una placa de 96 pocillos recubierta con manano, que es otra medida de la actividad de la vía de las lectinas. Se preincubaron SGMI-1Fc y SGMI-2Fc con suero humano normal al 1 % durante una hora en hielo antes de agregarlos a los pocillos recubiertos con manano (2 pg/pocillo). La deposición de C3b se midió mediante ELISA como se describe en Schwable y otros PNAS 108: 7523, 2011.

La Figura 2 ilustra gráficamente el nivel de deposición de C3b para suero humano normal al 1% más control de isotipo, SGMI-1Fc o SGMI-2Fc en un intervalo de concentración de 0,15 a 1000 nM, lo que demuestra que tanto SGMI-1Fc como SGMI-2Fc inhibieron la deposición de C3b de suero normal en pocillos de ELISA recubiertos con manano, con valores de IC50 de aproximadamente 27 nM y 300 nM, respectivamente.

Estos resultados demuestran que las funciones inhibidoras de MASP-1 y MASP-2 de los péptidos SGMI se conservan en las proteínas de fusión SGMI-1 Fc y SGMI-2Fc.

Ejemplo 3

Este Ejemplo describe la generación de anticuerpos quiméricos de pollo (región V)/región constante humana) que comprenden una secuencia de aminoácidos peptídica bioactiva (por ejemplo, SGMI-1 o SGMI-2) injertada en al menos una región CDR de una región variable de cadena pesada y/o al menos una región CDR de una región variable de cadena ligera (por ejemplo, CDR-H3 y/o CDR-L1).

Antecedentes/Fundamento:

Una línea celular DT40 modificada, DTLacO, que permite la inducción reversible de la diversificación de un polipéptido particular, se describe en el documento WO2009029315 y en el documento US2010093033, cada uno de los cuales se incorpora en la presente descripción como referencia. DT40 es una línea de células B de pollo que se sabe que muta constitutivamente sus genes de inmunoglobulina (Ig) de cadena pesada y ligera en cultivo. Al igual que otras células B, esta mutagénesis constitutiva se dirige a mutaciones en la región V de los genes de Ig y, por tanto, a las CDR de las moléculas de anticuerpo expresadas. La mutagénesis constitutiva en células DT40 tiene lugar mediante la conversión de genes mediante el uso de secuencias donantes una serie de segmentos de genes V no funcionales (genes pseudo-V; ^V) situados aguas arriba de cada región V funcional. Anteriormente se demostró que la eliminación de la región ^V provoca un cambio en el mecanismo de diversificación de la conversión de genes a la hipermutación somática, el mecanismo comúnmente observado en las células B humanas. La línea de linfoma de células B de pollo DT40 se ha mostrado que es un punto de partida prometedor para la evolución de anticuerposex-vivo(documento de Cumbers, S.J. y otros. Nat Biotechnol 20, 1129-1134 (2002); documento de Seo, H. y otros. Nat Biotechnol 23, 731-735 (2005)). Las células DT40 proliferan vigorosamente en cultivo, con un tiempo de duplicación de 8-10 horas (en comparación con las 20-24 horas de las líneas de células B humanas), y soportan una focalización de genes homólogos muy eficiente (documento de Buerstedde, J.M. y otros. Embo J 9, 921-927 (1990)). Las células DT40 tienen un enorme potencial de diversidad de secuencias de la región V, de forma que pueden acceder a dos vías fisiológicas distintas para la diversificación, la conversión de genes y la hipermutación somática, que crean mutaciones con plantilla y sin plantilla, respectivamente (documento de Maizels, N., Annu Rev Genet 39, 23-46 (2005)). Las inmunoglobulinas (Ig) de cadena pesada y ligera diversificadas se expresan en forma de IgM expuesta en la superficie celular. La IgM de superficie tiene una forma bivalente, estructuralmente similar a una molécula de IgG. Las células que presentan IgM con especificidad por un antígeno particular pueden aislarse al unir versiones del antígeno solubles inmovilizadas o presentadas en membrana. Sin embargo, la utilidad de las células DT40 para la evolución de anticuerpos ha sido limitada en la práctica porque, como en otras líneas de células B transformadas, la diversificación se produce a menos del 1 % de la tasa fisiológica.

En el sistema usado en este ejemplo, como se describe en el documento WO2009029315 y el documento US2010093033, las células DT40 fueron manipuladas para acelerar la tasa de diversificación del gen Ig sin sacrificar la capacidad de modificación genética adicional o el potencial de que tanto la conversión genética como la hipermutación somática contribuyan a la mutagénesis. Se realizaron dos modificaciones clave a DT40 para aumentar la tasa de diversificación y, en consecuencia, la complejidad de las especificidades de unión en la biblioteca de células (documento de Yabuki y otros, PLoS One 7: e36032, 2012). Primero, la diversificación del gen Ig se puso bajo el control de la potente red reguladora de operadores/represores de lactosa deE. coli.Los multímeros consisten en aproximadamente 100 repeticiones polimerizadas del potente operador de lactosa (PolyLacO) deE. colidonde se insertó aguas arriba de los genes IgA e IgH reordenados y expresados mediante direccionamiento de genes homólogos. Los factores reguladores fusionados a la proteína represora de lactosa (LacI) pueden unirse después a los elementos reguladores LacO para regular la diversificación, al aprovechar la alta afinidad (kD = 10'14 M) del represor de lactosa para el ADN operador. Las células DT40 PolyLacO-AR, en las que el PolyLacO se integró solo en IgA, exhibieron un aumento de 5 veces en la tasa de diversificación del gen Ig con relación a las células DT40 parentales antes de cualquier manipulación (documento de Cummings, W.J. y otros. PLoS Biol 5, e246 (2007)). La diversificación se elevó aún más en células manipuladas para transportar el PolyLacO dirigido a los genes IgA e IgH ("DTLacO"). Se demostró que las células DTLacO tienen tasas de diversificación de 2,5 a 9,2 veces elevadas con relación al 2,8 % característico de la línea DT40 PolyLacO-AR LacI-HP1 parental. Por lo tanto, dirigir los elementos PolyLacO a los genes de las cadenas pesada y ligera aceleró la diversificación 21,7 veces con relación a la línea celular DT40 parental. La vinculación de factores reguladores a los loci de las Ig no solo altera la frecuencia de la mutagénesis, sino que también puede cambiar la vía de la mutagénesis, lo que crea una colección más grande de cambios de secuencia únicos (Cummings y otros 2007; Cummings y otros 2008). En segundo lugar, se generó una colección diversa de puntos de partida de secuencias para la diversificación del gen de Ig acelerada por el factor anclado. Estos diversos puntos de partida de secuencia se agregaron a DTLacO dirigido a regiones variables de cadena pesada de Ig reordenadas, aisladas de un pollito de dos meses, al locus de la cadena pesada. La adición de estas regiones variables de cadena pesada creó un repertorio de 107 nuevos puntos de partida para la diversificación de anticuerpos. La construcción de estos nuevos puntos de partida en la línea celular DTLacO permite la identificación de clones que se unen a una diana particular y luego permiten una rápida maduración de la afinidad mediante los factores vinculados. Después de la maduración por afinidad, se produce una IgG quimérica recombinante de longitud completa mediante la clonación de las secuencias variables de cadenas pesadas y ligeras reordenadas y maduras (VH y VA que consisten en regiones estructurales de pollo y las CDR) en vectores de expresión que contienen la IgG1 humana y las regiones constantes lambda. Estos mAb recombinantes son adecuados para aplicacionesin vitroein vivo,y sirven como punto de partida para la humanización.

Mediante el uso del sistema DTLacO, los inventores han observado grandes inserciones de más de 25 aminoácidos en la CDR-H3 de las regiones variables de la cadena pesada de pollo (VH) y CDR-L1 de la cadena ligera de pollo (VL). Por el contrario, el tamaño promedio de la CDR-H3 para ratones y humanos es mucho más pequeño (tamaño promedio de 9 aminoácidos y 12 aminoácidos, respectivamente). Dado el potencial de estas CDR de pollo para acomodar grandes bloques de secuencia, los inventores probaron la capacidad de las CDR para presentar los péptidos bioactivos SGMI-1 y SGMI-2 en una conformación activa. El valor de esta estrategia es múltiple: (1) la estabilidaden vivode un anticuerpo se confiere a los inhibidores de SGMI, un beneficio importante para aplicaciones terapéuticas; (2) la integración de los genes VH y VL portadores de un péptido bioactivo (tal como la secuencia SGMI-1 o -2) en la línea celular DTLacO proporciona los medios para la mutagénesisex-vivoy la selección de regiones V con mayor afinidad y potencia; (3) injertar un primer péptido bioactivo (por ejemplo, SGMI-1) en una de las CDR largas e injertar un segundo péptido bioactivo (por ejemplo, SGMI-2) en otra de las CDR largas de un anticuerpo, creará un anticuerpo biespecífico que tiene dos actividades funcionales (por ejemplo, inhibe MASP-1 y MASP-2). Si bien este ejemplo describe la invención en el contexto de injertar secuencias SGMI en la CDR-H3 y/o CDR-L1 de las regiones variables de pollo y retener la actividad inhibidora, un experto en la técnica entenderá que los resultados aquí establecen una paradigma para la presentación y el suministro de otros péptidos bioactivos dentro de las CDR de la cadena ligera y/o pesada variable de anticuerpos que comprenden regiones variables de pollo.

Métodos:

Para generar los anticuerpos quiméricos pollo-humano portadores de péptidos bioactivos (SGMI-1 o SGMI-2) dentro de la CDR-H3 y/o CDR-L1, se insertaron polinucleótidos que codifican los péptidos SGMI-1 y SGMI-2 mediante clonación In-Fusion (los cebadores Clontech que se muestran en la Tabla 3) en los vectores de expresión basados en pcDNA3 (Invitrogen) de anticuerpos quiméricos de cadena pesada y ligera de pollo-humano, descritos en los documentos WO2009029315 y US2010093033, incorporados en la presente descripción como referencia.

Tabla 3: Cebadores de la PCR usados para clonar los polinucleótidos SGMI-1 y SGMI-2 en regiones V de pollo, lo m r l ni r im ri MI-1L-I 1 MI-2L-I Á.

1. SGMI-1 y SGMI-2 se injertaron en la CDR-H3 de una región variable de cadena pesada de pollo parental.

La región variable de cadena pesada de pollo DT40 se eligió como clon parental inicial para su uso como andamiaje en el que se injertaron secuencias peptídicas de SGMI-1 o SGMI-2 en la región CDR-H3, como se muestra en las Figuras 3 y 4.

La Figura 3 ilustra una secuencia de polipéptido de cadena pesada variable parental (DTLacO) ilustrativa en comparación con una versión modificada de la secuencia de polipéptido de cadena pesada variable que comprende una secuencia de aminoácidos de péptido bioactivo injertada dentro de la CDR-H3. Como se muestra en la Figura 3, la región variable de cadena pesada de pollo contiene tres CDR (CDR-H1, CDR-H2 y CDR-H3), flanqueadas por cuatro regiones estructurales (FR-1, FR-2, FR-3 y FR-4). Los inventores han descubierto sorprendentemente que al injertar un péptido bioactivo (por ejemplo, SGMI-1 o SGMI-2) en una CDR de la región variable de cadena pesada del anticuerpo de pollo DT40 parental (que proporciona el andamiaje del anticuerpo), la actividad biológica del péptido bioactivo se confirió al anticuerpo parental que comprende la secuencia peptídica bioactiva injertada.

El anticuerpo de pollo parental proporciona las regiones estructurales (FR1, FR2, FR3 y FR4) de las cadenas pesada y ligera, que se conservan entre varios clones. Puede seleccionarse cualquier clon de anticuerpo de pollo parental para su uso como andamiaje. En algunos casos, el clon de anticuerpo de pollo parental puede seleccionarse en base a las propiedades convenientes, tales como la estabilidad.

Más abajo se proporcionan regiones variables de cadena pesada de pollo parental ilustrativas. Como se muestra en la Figura 4, aunque las regiones CDR nativas varían entre clones parentales, las regiones estructurales entre las CDR se conservan en pollo, en consecuencia, también se proporciona más abajo una secuencia consenso FR-1, FR-2, FR-3 y FR-4 derivada de un alineamiento de varias regiones diferentes de la cadena pesada del pollo parental. Como se muestra además en la Figura 4, en FR-3 hay un residuo de cisteína (C) conservado en la tercera posición N-terminal de la CDR-H3 en los clones parentales (correspondiente a la cisteína en la posición 31 en la SEQ ID NO: 26), que se retiene en FR-3 en las construcciones que contienen un péptido bioactivo injertado en la CDR-H3. Como se muestra además en la Figura 4, en FR-4 hay un residuo de triptófano (W) conservado en la posición inmediatamente adyacente a la CDR-H3 en los clones parentales (correspondiente al triptófano en la posición 1 en la SEQ ID NO: 28), que se retiene en FR-4 en las construcciones que contienen un péptido bioactivo injertado en la CDR-H3.

Región variable de cadena pesada de DTLacO de pollo parental (clon #1): (DTLacO VH) (SEQ ID NO: 23)

A VTLDESGGGLO TPGRALSL VCKASGFTFSSYNMGWl'ROAPGKGLEFVA GIDNTGR YTGYGS AVKGR-4 l ’ISRDNGOSi YHWLNNLRA KDIC 1 YYCA A~A AGGS GYCGSGA YT D A WGHG i /■: / 7 VSS

Las CDR V<h>(31-35 (H1); 50-66 (H2); y 99-114 (H3) están subrayados, y las regiones estructurales (1-30 (FR-1); 36 49 (FR-2); 67-98 (FR-3) y 115-125 (FR-4) están en cursiva.

Región variable de cadena pesada de DTLacO de pollo parental (clon #2) (DTLacO VH) (SEQ ID NO: 91)

A VTLDESGGGLO TPGGALSL l '('ÍC4SGFTFS SNAMG m 'ROAPGKGLE Wl /l G lüü üG S GTRYAPAVKG/iATISRDJVGOSTLRLOLmLRAEDTGIVYCTKCAYSSGCDYEGGYlD AWGHGTEVIVSS

La región FR-1 conservada de DTLacO VH se establece como la SEQ ID NO: 24:

AVTLDESGGGLQTPGXALSLVCKASGFTFS

Donde X = R o G

La región FR-2 conservada de DTLacO VH se establece como la SEQ ID NO: 25:

WVRQAPGKGLEXVA

Donde X = F o W

La región FR-3 conservada de DTLacO VH se establece como la SEQ ID NO: 26:

RATISRDNGQSTX1RLQLNNLRAEDTGIYYCX2K

Donde:

X1 = V o L, y

X2 = A o T

La región flanqueante de FR-3 conservada adyacente a CDR-H3 se establece como la SEQ ID NO: 27:

YYCXK

donde X = A o T

La región FR-4 conservada de DTLacO VH se establece como la SEQ ID NO: 28:

WGHGTEVIVSS

La región flanqueante de FR-4 conservada adyacente a CDR-H3 se establece como la SEQ ID NO: 29:

WGHGT

Como se muestra en la Figura 4, en algunos casos, se incluyó un enlazador peptídico en el extremo amino terminal del péptido bioactivo, o en el extremo carboxi terminal del péptido bioactivo, o en ambas ubicaciones. El enlazador peptídico puede ser cualquier secuencia enlazadora flexible, tal como la secuencia que se muestra en la Tabla 4. En algunos casos, la secuencia enlazadora se derivó de la secuencia CDR-H3 nativa en el clon parental. Como se muestra además en la Figura 4, en algunos casos, la secuencia peptídica bioactiva reemplazó todos menos uno de los dieciséis residuos de aminoácidos originales de la CDR-H3 nativa (ver, por ejemplo, SGMI-1L), en donde la secuencia de aminoácidos restante está incluida como un enlazador. En algunos casos, ocho de los dieciséis residuos de aminoácidos originales de la CDR-H3 nativa se retuvieron en el enlazador C-terminal (ver, por ejemplo, SGMI-1L5), y hasta catorce de los dieciséis residuos de aminoácidos originales de la CDR-H3 nativa se retuvieron en las regiones enlazadoras C-terminal y N-terminal (ver SGMI-L7).

2. SGMI-1 y SGMI-2 se injertaron en la CDR-L1 de una región variable de cadena ligera de pollo parental.

Una región variable de cadena ligera de pollo DT40 se eligió como clon parental inicial para su uso como andamiaje en el que se injertaron secuencias peptídicas de SGMI-1 o SGMI-2 en la región CDR-L1, como se muestra en las Figuras 5 y 6.

La Figura 5 ilustra una secuencia de polipéptido de cadena ligera variable parental (DTLacO) ilustrativa en comparación con una secuencia de polipéptido de cadena ligera variable que comprende una secuencia de aminoácidos del péptido bioactivo injertado dentro de la CDR-L1. Como se muestra en la Figura 5, la región variable de cadena ligera de pollo contiene tres CDR (CDR-L1, CDR-L2 y CDR-L3), flanqueadas por cuatro regiones estructurales (FR-1, FR-2, FR-3 y FR-4). De manera similar a los resultados obtenidos con la CDR-H3 en el polipéptido de cadena pesada variable, los inventores han descubierto que al injertar una secuencia peptídica bioactiva (por ejemplo, SGMI-1) en la CDR-L1 del polipéptido de cadena ligera variable de un anticuerpo de pollo parental (que proporciona el andamiaje del anticuerpo), el anticuerpo parental que comprende la secuencia peptídica bioactiva injertada se convierte en un anticuerpo que comprende la actividad biológica del péptido bioactivo (es decir, se observó inhibición de la vía de la lectina con la construcción SGMI-IL, datos no mostrados).

Más abajo se proporcionan regiones variables de cadena ligera de pollo parental ilustrativas. Como se muestra en la Figura 6, aunque las regiones CDR nativas varían entre clones parentales, las regiones estructurales entre las CDR se conservan en pollo, en consecuencia, también se proporciona más abajo una secuencia consenso FR-1, FR-2, FR-3 y FR-4 derivada de un alineamiento de varias regiones diferentes de la cadena ligera del pollo parental. Como se muestra además en la Figura 6, en FR-1 hay un residuo de cisteína (C) conservado en la posición inmediatamente adyacente a la CDR-L1 en los clones parentales (correspondiente a la cisteína en la posición 23 en la SEQ ID NO: 31), que se retiene en FR-1 en las construcciones que contienen un péptido bioactivo injertado en la CDR-L1. Como se muestra además en la Figura 6, en FR-2 hay un residuo de triptófano (W) conservado en la posición inmediatamente adyacente a la CDR-L1 en los clones parentales (correspondiente al triptófano en la posición 1 en la SEQ ID NO: 33), que se retiene en FR-2 en las construcciones que contienen un péptido bioactivo injertado en la CDR-L1.

Región variable de cadena ligera de DTLacO (DTLacO VL) de pollo (clon #1) (SEQ ID NO: 30)

AL í OPSSVSANPGG'l YK1I ’CSGDS S Y Y G WYOOKA PGSAPVTVIYDNjmPSNIPSRFS GSKSGSTA TL TITG VRA DDNA JTYCA STD S S ST A FGA G TTL 7VL

Las CDR V<l>(21-28 (L1); 45-51 (L2); y 84-92 están subrayados, y las regiones estructurales (1-20 (FR-1); 29-44 (FR-2); 52-83 (FR-3) y 93-102 (FR-4) están en cursiva.

Región variable de cadena ligera de DTLacO (DTLacO VL) de pollo (clon #2) (SEQ ID NO: 92)

AL TQPA SVSA NPGE WKITCSGGGSY AG SYYYG WYOOKA PGSA P VTLIYYNNKRPSD

IPSRFSGSLSGSTNTLTITG VRADDEA TYICGSA DNSC. A A EGA G TTLTVL

La región FR-1 conservada de DTLacO VL se establece como la SEQ ID NO: 31:

ALTQPX1SVSANX2GX3TVKITC

Donde:

Xi = A o S

X2 = L o P

X3 = G o E

La región flanqueante de FR-1 conservada adyacente a CDR-L1 se establece como la SEQ ID NO: 32:

VKITC

La región FR-2 conservada de DTLacO VL se establece como la SEQ ID NO: 33:

WYQQKX1PGSAPVTX2IY

Donde

Xi = A o S,

X2 = V o L

La región flanqueante de FR-2 conservada adyacente a la CDR-L1 se establece como la SEQ ID NO: 34 WXQQK

En donde X = Y, F o H.

La región FR-3 conservada de DTLacO VL se establece como la SEQ ID NO: 35:

X1IPSRFSGSX2SGSTXaTLTITGVRADDX4AVYXsC

Donde:

Xi = N o D

X2 = K o L

X3 = A o N

X4 = N o E

X5 = Y o F

La región FR-4 conservada de DTLacO VL se establece como la SEQ ID NO: 36:

FGAGTTLTVL

Como se muestra en la Figura 6, en algunos casos, se incluyó un enlazador peptídico en el extremo amino terminal del péptido bioactivo, o en el extremo carboxi terminal del péptido bioactivo, o en ambas ubicaciones. El enlazador peptídico puede ser cualquier secuencia enlazadora flexible, tal como las secuencias que se muestran en la Tabla 4. En algunos casos, la secuencia enlazadora se derivó de la secuencia CDR-L1 nativa en el clon parental. Como se muestra además en la Figura 6, en algunos casos, el péptido bioactivo reemplazó cinco de los trece residuos de aminoácidos originales de la CDR-L1 nativa (ver, por ejemplo, SGMI-2L), y se retuvo una porción de la secuencia de la CDR-L1 original como un enlazador peptídico que flanquea la secuencia peptídica bioactiva.

Tabla 4: Enlaz r i il r iv r in r r i i iv s en las CDR:

En algunos casos, la región de cadena pesada variable de pollo se fusiona con una región constante de la IgG1 humana, lo que da como resultado un anticuerpo quimérico de pollo/humano. Más abajo se proporciona una región constante de la IgG1 humana ilustrativa como la SEQ ID NO: 47.

Región constante de la IgG1 humana (CH1-bisagra-CH2-CH3): SEQ ID NO: 47

ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPA

VLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCP

PCP APELLGGP S VFLFPPKPKDTLMISRTPE VT C VVVD VSFTEDPE VKFNW Y VDG V

EVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTI

SK AKGQPREPQ VYTLPP SRDELTKNQ V SLTCL VKGF YP SDIAVEWE SNGQPENN

YKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALfíNHYTQKSLSLS PGK

En algunos casos, la región de cadena ligera variable de pollo se fusiona con una región constante de la cadena ligera lambda humana, lo que da como resultado un anticuerpo quimérico de pollo/humano. Más abajo se proporciona una región constante de la cadena ligera lambda humana ilustrativa como la SEQ ID NO: 48.

Región constante de cadena ligera lambda humana (SEQ ID NO: 48)

Las construcciones de polinucleótidos resultantes se denominaron pcDNA3-SGMI-1L-IgG1, -1M-IgG1, -1S-IgG1 y de -1 -L1-IgG1 a -1-L12-IgG1 (SEQ ID NO: 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75 y 77) y pcDNA3-SGMI-2L-IgA, -2M-IgA y -2S-IgA (SEQ ID NO: 79, 81 y 83), mientras que los polipéptidos se denominaron Ab-SGMI-1L-IgG1, -1M-IgG1, -1S-IgG1 y de -1-L1-IgG1 a -1-L12-IgG1 (SEQ ID NO: 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76 y 78), como se muestra en la Figura 4, y Ab-SGMI-2L-IgA-, -2M-IgA y - 2S-IgA (SEQ ID NO: 80, 82 y 84), como se muestra en la Figura 6. Como se muestra además en la Figura 6, se usaron varias combinaciones de enlazadores y una modificación de uno de los residuos de la zona Vernier (es decir, fuera de la CDR-L1) para generar polipéptidos adicionales: Ab-SGMI-1-F1-IgA, Ab-SGMI-1-F2-IgA, Ab-sGMI-1-F3-IgA, Ab-SGMI-1-F4-IgA, Ab-SGMI-1 -F5-IgA, Ab-SGM I-1 -F3.1 -IgA, Ab-SGMI-1 -F3.2-IgA y Ab-SGMI-1 -F3.3-IgA.

Se transfectaron transitoriamente células Freestyle 293-F o Expi293F con combinaciones de plásmidos de expresión de la siguiente manera: (a) pcDNA3-SGMI-1-IgG1-1L, (y otros), más un plásmido de cadena ligera que codifica DTLacO VL; (b) pcDNA3-SGMI-2-IgA-L1 (y otros), más un plásmido de cadena pesada que codifica DTLacO VH; (c) pcDNA3-SGMI-1-IgG1-1L más pcDNA3-SGMI-2-IgA-L1, y (d) pcDNA3-SGMI-1-F1-IgA a pcDNA3-SGMI-1-F3.3-IgA más un plásmido de cadena pesada que codifica DTLacO VH. Después de cuatro días de incubación a 37 °C, se recogieron los medios de cultivo y los anticuerpos quiméricos portadores del SGMI se purificaron mediante cromatografía de afinidad con proteína A.

Resultados:

Anticuerpos quiméricos humanos/de pollo que comprenden SGMI-1 injertados en la CDR-H3

El sistema de cribado del complemento Wieslab® vía MBL, como se describió en el Ejemplo 2, se usó para medir la funcionalidad de los anticuerpos quiméricos. Los ensayos se realizaron por duplicado con SGMI-1 Fc (generado como se describió en el Ejemplo 2) como controles positivos (inhibitorios). Se incluyó un anticuerpo de isotipo coincidente como control negativo.

Las Figuras 7A y 7B ilustran gráficamente la actividad inhibidora de varios mAb quiméricos representativos humanos/de pollo que contienen SGMI-1 injertado en la CDR-H3 la actividad del complemento MBL. Los datos se distribuyen en dos figuras porque los ensayos se realizaron en momentos diferentes. Como se muestra en las Figuras 7A y 7B, varios de los mAb quiméricos que contienen SGMI-1 injertados dentro de la CDR-H3 inhiben la deposición de C5b-C9 en un grado similar a la proteína de fusión SGMI1-Fc positiva (por ejemplo, Ab-SGMI-1-L2 , -L3, -L4, -L5, -L7, -L9, -L1, -L10, -L11 y -L12). Como se muestra en la Figura 4, estas construcciones difieren sólo en la naturaleza de los enlazadores flexibles que separan el péptido inhibidor de las regiones estructurales del anticuerpo. Curiosamente, otro mAb quimérico con SGMI-1 injertado en la CDR-H3, denominado "Ab-SGMI-IL", no tiene actividad inhibidora. Como se muestra en la Figura 4, Ab-SGMI-1L tiene solo un enlazador de residuo de un aminoácido entre el péptido bioactivo y los segmentos estructurales.

También se evaluó la inhibición de la vía de las lectinas en los anticuerpos Ab-SGMI-1 en un ensayo de deposición de C3b en perlas recubiertas de manano. Este ensayo, que determina el grado de actividad mediante citometría de flujo, ofrece mayor resolución que el ensayo de Wieslab®. El ensayo de perlas de la vía de las lectinas se llevó a cabo de la siguiente manera: el manano se adsorbió en perlas de poliestireno de 7 pM de diámetro (Bangs Laboratories; Fishers, IN, Estados Unidos) durante la noche a 4 °C en tampón carbonato-bicarbonato (pH 9,6). Las perlas se lavaron en PBS y se expusieron a suero al 10 % o suero al 10 % preincubado con anticuerpos o inhibidores. La mezcla de suero y perlas se incubó a temperatura ambiente durante una hora mientras se agitaba. Después de la incubación del suero, se lavaron las perlas y se midió la deposición de C3 en las perlas mediante detección con un anticuerpo policlonal de conejo anti-C3c (Dako North America; Carpinteria, CA, Estados Unidos) y un anticuerpo secundario anti-conejo de cabra conjugado con PE-Cy5. anticuerpo (Southern Biotech; Birmingham, AL, Estados Unidos). Después del procedimiento de tinción, las perlas se analizaron mediante el uso de un citómetro FACS Calibur. Las perlas se seleccionaron como una población uniforme mediante el uso de dispersión frontal y lateral, y la deposición de C3 fue evidente como partículas positivas para FL3 (FL-3, o "canal FL-3" indica el canal 3 0 rojo en el citómetro). La intensidad de fluorescencia media geométrica (MFI) para la población para cada condición experimental se representó con relación a la concentración de anticuerpo/inhibidor para evaluar la inhibición de la vía de las lectinas.

Las Figuras 8A y 8B ilustran gráficamente la actividad inhibidora de varios mAb quiméricos representativos humanos/de pollo que contienen SGMI-1 injertado en la CDR-H3 la actividad de deposición de C3b del complemento a manera de dosis-respuesta. Como se muestra en las Figuras 8A y 8B, todos los anticuerpos que contienen SGMI-1 injertados en la CDR-H3 inhibieron la actividad de la vía de las lectinas en el ensayo de perlas, pero con diversos grados de potencia.

Las Figuras 8C y 8D ilustran gráficamente la actividad inhibidora de varios mAb quiméricos representativos humanos/de pollo que contienen SGMI-1 injertado en la CDR-L1 la actividad de deposición de C3b del complemento a manera de dosis-respuesta. Como se muestra en la Figura 8C, todos los anticuerpos que contienen SGMI-1 injertados en la CDR-L1 inhibieron la actividad de la vía de las lectinas en el ensayo de perlas, con "F1", "F2" y "F3", que tienen varias combinaciones de enlazadores y en algunos casos tienen una modificación en el residuo "Y" de la zona Vernier a "F" o "H" en FR-2 adyacente a la CDR-L1 (como se muestra en la Figura 6) que tiene más actividad inhibidora que "F4" y "F5". Como se muestra en la Figura 6, estas construcciones difieren en la naturaleza de los enlazadores flexibles que separan el péptido inhibidor de las regiones estructurales del anticuerpo y en el aminoácido en la segunda posición de la región FR-2. Como se muestra además en la Figura 6, el anticuerpo más potente, Ab-SGMI-F3-IgA, que contenía un enlazador flexible de tres aminoácidos en el extremo amino del péptido SGMI, se optimizó aún más mediante la creación de las construcciones "F3.1", "F3.2" y "F3.3", que aumentaron el tamaño del enlazador flexible en el extremo amino terminal del péptido SGMI-1 a cinco aminoácidos, siete aminoácidos y nueve aminoácidos, respectivamente. Como se muestra en la Figura 8D, un enlazador flexible de cinco aminoácidos (construcción "F3.1") en el extremo amino terminal del péptido SGMI-1 dio como resultado la inhibición más potente de la vía de las lectinas.

Se observa que las diferencias entre los anticuerpos se distinguen más fácilmente en este ensayo de perlas en comparación con el ensayo de Wieslab®.

En resumen, estos resultados demuestran que pueden generarse polipéptidos terapéuticos inhibidores al injertar un péptido bioactivo en la CDR-H3 o en la CDR-L1 de un andamiaje de anticuerpo de pollo.

Anticuerpos quiméricos humanos/de pollo que comprenden SGMI-2 injertados en la CDR-L1

La Figura 9A ilustra gráficamente que un mAb quimérico de pollo/humano que comprende SGMI-2 injertado dentro de la CDR-L1 (Ab-SGMI-2L-Igk) ejerce poca o ninguna actividad inhibidora en el ensayo de la vía MBL del sistema del complemento de Wieslab. Estos resultados dejan espacio para la optimización de los elementos enlazadores que flanquean el péptido bioactivo, lo que afectó significativamente la eficacia de los mAb que contienen SGMI-1 (como se muestra en las Figuras 7A, 7B y 8A-8D).

Anticuerpos quiméricos humanos/de pollo que comprenden SGMI-1 y SGMI-2

La Figura 9A también muestra la actividad de un anticuerpo quimérico de pollo/humano que comprende SGMI-1 y SGMI-2 injertados en la CDR-H3 y la CDR-L1, respectivamente. Ab-SGMI-1-L1-IgG1/SGMI-2-L-IgA es casi tan potente como el mAb que contiene sólo el péptido SGMI-1 (Ab-SGMI-1-L1-IgG1). Este resultado se confirmó mediante el uso del ensayo de perlas recubiertas de manano por citometría de flujo, como se muestra en la Figura 9B. En conjunto, estos datos demuestran que el péptido SGMI-1 injertado en la CDR-H3 inhibe la vía de las lectinas, independientemente de que el péptido SGMI-2 esté presente injertado en la CDR-L1. En base a los resultados descritos en la presente descripción, se espera que una mayor optimización de los enlazadores flanqueantes de SGMI-2 agregue actividad inhibidora de MASP-2 al anticuerpo que ya porta actividad inhibidora de MASP-1 mediada por SGMI-1.

Ejemplo 4

Este ejemplo describe la generación de anticuerpos quiméricos que comprenden uno o más péptidos bioactivos (por ejemplo, SGMI-1 o SGMI-2) fusionados en los extremos amino o carboxi terminal de las cadenas pesada y ligera de un anticuerpo quimérico de pollo/humano.

Fundamento:

Como se demuestra en los Ejemplos 2 y 3, las funciones inhibidoras de los péptidos SGMI-1 y SGMI-2 (y variantes truncadas de los mismos) se conservaron en las proteínas SGMI-Fc y también, para SGMI-1, cuando se muestran dentro de las regiones CDR de un anticuerpo completo. En este Ejemplo, se llevaron a cabo experimentos para determinar si los péptidos SGMI retenían actividad cuando se fusionaran con los extremos amino o carboxi de las cadenas pesadas o ligeras de un anticuerpo quimérico de pollo/humano.

Tabla 5: Anticuerpos quiméricos humanos/de pollo con los péptidos bioactivos SGMI-1 y SGMI-2 fusionados a los - -

Para las fusiones N-terminales mostradas en la Tabla 5, se añadió un enlazador peptídico (SEQ ID NO: 14) entre el péptido bioactivo y la región variable de pollo.

Para las fusiones C-terminales mostradas en la Tabla 5, se añadió un enlazador peptídico (SEQ ID NO: 37) entre la región constante y el péptido bioactivo, y se añadió un segundo péptido "GSGA" en el extremo C-terminal del polipéptido fusión para proteger los péptidos SGMI C-terminales de la degradación. Estas construcciones de fusión se ilustran esquemáticamente en la Figura 10.

La Figura 11 ilustra la actividad inhibidora de los péptidos N- y C-terminales en el ensayo de Wieslab. En comparación con los controles positivo y negativo, todos los mAb de fusión inhibieron la deposición de C5b-9. Todos excepto un mAb de fusión (SGMI-1 fusionado al extremo C-terminal de la cadena ligera) mostraron niveles de inhibición comparables a los de las proteínas de fusión Fc SGMI-1 y SGMI-2 de control. Varias de estas fusiones de péptido N- y C-terminal del mAb también se probaron en el ensayo de citometría de flujo con perlas recubiertas de manano descrito en el Ejemplo 3, con resultados similares (datos no mostrados). Estos anticuerpos pueden usarse para el desarrollo de anticuerpos biespecíficos portadores de combinaciones de SGMI-1 y SGMI-2.

Ejemplo 5

Este Ejemplo describe la identificación, mediante el uso de presentación en fagos, de anticuerpos scFv completamente humanos que se unen a MASP-2 e inhiben la activación del complemento mediada por lectinas mientras dejan intacto el componente de la vía clásica (dependiente de Clq) del sistema inmunitario.

Información general:

MASP-2 es una proteína compleja con muchos dominios funcionales separados, que incluyen: sitio(s) de unión para MBL y ficolinas, un sitio catalítico de serina proteasa, un sitio de unión para el sustrato proteolítico C2, un sitio de unión para el sustrato proteolítico C4, un sitio de escisión de MASP-2 para la autoactivación del zimógeno MASP-2 y dos sitios de unión Ca++. Como se describe en el documento WO 2012/151481, incorporado en la presente descripción como referencia, se identificaron fragmentos de anticuerpo scFv que se unen con alta afinidad a MASP-2, y los fragmentos scFv identificados se probaron en un ensayo funcional para determinar si eran capaces de bloquear la actividad funcional de MASP-2. Se usó un ensayo funcional que mide la inhibición de la formación de la convertasa C3 de la vía de las lectinas para evaluar la "actividad de bloqueo" de los fragmentos de anticuerpo scFv anti-MASP-2 identificados. Se sabe que la función fisiológica principal de MASP-2 en la vía de las lectinas es generar el siguiente componente funcional de la vía del complemento mediado por lectinas, específicamente, la convertasa C3 de la vía de las lectinas. La convertasa C3 de la vía de las lectinas es un complejo enzimático crítico (C4b2a) que escinde proteolíticamente C3 en C3a y C3b. MASP-2 no es un componente estructural de la vía de las lectinas C3 convertasa (C4b2a); sin embargo, se requiere actividad funcional de MASP-2 para generar los dos componentes proteicos (C4b, C2a) que comprenden la convertasa C3 de la vía de las lectinas. Además, todas las actividades funcionales separadas de MASP-2 enumeradas anteriormente parecen ser necesarias para que MASP-2 genere la convertasa C3 de la vía de las lectinas. Por estas razones, se cree que un ensayo preferente para evaluar la "actividad de bloqueo" de los fragmentos de anticuerpos scFv y Fab2 anti-MASP-2 es un ensayo funcional que mide la inhibición de la formación de convertasa C3 de la vía de las lectinas.

Como se describe en la presente descripción, los anticuerpos contra MASP-2, tales como, por ejemplo, los anticuerpos contra MASP-2 completamente humanos identificados mediante el cribado de una biblioteca de presentación en fagos, pueden usarse como andamiaje para generar fusiones de anticuerpo contra MASP-2-SGMI con actividad inhibidora mejorada.

Generación de anticuerpos de andamiaje inhibidores de MASP-2

Como se describe en el documento WO2012/151481, los fragmentos variables de las cadenas ligera y pesada de los anticuerpos inhibidores de MASP-2 se aislaron tanto en formato scFv como en formato IgG de longitud completa. Los anticuerpos contra MASP-2 humanos son útiles para inhibir la lesión celular asociada con la activación de la vía alternativa del complemento mediada por la vía de las lectinas, mientras dejan intacto el componente de la vía clásica (dependiente de Clq) del sistema inmunitario. En algunos casos, los anticuerpos de andamiaje inhibidores de MASP-2 tienen las siguientes características: (a) alta afinidad por la MASP-2 humana (por ejemplo, una K<d>de 10 nM o menos), y (b) inhibir la actividad del complemento dependiente de MASP-2 en suero humano al 90 % con una IC50 de 30 nM o menos).

Métodos:

Expresión de MASP-2 catalíticamente inactiva de longitud completa:

La secuencia de ADNc de longitud completa de MASP-2 humana (SEQ ID NO: 3), que codifica el polipéptido MASP-2 humano con secuencia líder (SEQ ID NO: 4) se subclonó en el vector de expresión de mamífero pCI-Neo (Promega), que impulsa la expresión eucariota bajo el control de la región potenciadora/promotora de CMV (descrita en el documento de Kaufman R.J. y otros, Nucleic Acids Research 19: 4485-90, 1991; Kaufman, Methods in Enzymology, 185: 537-66 (1991)).

Para generar la proteína MASP-2A humana catalíticamente inactiva, se llevó a cabo mutagénesis dirigida como se describe en el documento US2007/0172483, incorporado en la presente descripción como referencia. Los productos de la PCR se purificaron después de la electroforesis en gel de agarosa y la preparación de bandas y se generaron superposiciones de adenosina individuales mediante el uso de un procedimiento de cola estándar. Luego se clonó<m>A<s>P-2A con cola de adenosina en el vectorpGEM®-T Easy (Promega) y transformado enE. coli.La MASP-2A humana se subclonó además en cualquiera de los vectores de expresión de mamíferos pED (SinoBio) o pCI-Neo (Promega).

La construcción de expresión de MASP-2A descrita anteriormente se transfectó en células DXB1 mediante el uso del procedimiento de transfección con fosfato de calcio estándar (Maniatis y otros, 1989). La MASP-2A se produjo en un medio sin suero para garantizar que las preparaciones no estuvieran contaminadas con otras proteínas séricas. El medio de cultivo se recogió de las células confluentes cada dos días (cuatro veces en total). El nivel de MASP-2A recombinante promedió aproximadamente 1,5 mg/litro de medio de cultivo. La MASP-2A (mutante Ser-Ala descrita anteriormente) se purificó mediante cromatografía de afinidad en columnas de MBP-A-agarosa

ELISA de MASP-2A sobre clones candidatos de ScFv identificados mediante selección/conversión de scFv y filtro de cribado

Una biblioteca de presentación en fagos de secuencias de regiones variables de cadenas ligeras y pesadas de inmunoglobulinas humanas en un formato scFv se sometió a una selección de antígenos seguida de un cribado y selección automatizados de anticuerpos para identificar anticuerpos scFv de alta afinidad contra la proteína MASP-2 humana. Se llevaron a cabo tres rondas de selección de la biblioteca de fagos de scFv contra MASP-2A marcado con HIS o biotina. La tercera ronda de selección se eluyó primero con MBL y luego con TEA (alcalino). Para monitorear el enriquecimiento específico de fagos que presentan fragmentos scFv contra la MASP-2A diana, se llevó a cabo un ELISA de fagos policlonales contra la MASP-2A inmovilizada. Los genes de scFv de la ronda de selección 3 se clonaron en un vector de expresión pHOG y se ejecutaron en un filtro de cribado a pequeña escala para buscar clones específicos contra la MASP-2A.

Se recogieron colonias bacterianas que contenían plásmidos que codificaban fragmentos scFv de la tercera ronda de selección, se colocaron en rejillas sobre membranas de nitrocelulosa y se cultivaron durante la noche en medio no inductor para producir placas maestras. Se recogieron y analizaron un total de 18 000 colonias en la tercera ronda de selección, la mitad de la elución competitiva y la otra mitad de la elución de TEA subsecuente. La selección de la biblioteca de fagémidos de scFv contra MASP-2A seguida de la conversión de scFv y un filtro de cribado produjo 137 clones positivos. 108/137 clones fueron positivos en un ensayo ELISA para la unión de MASP-2, de los cuales 45 clones se analizaron adicionalmente para determinar su capacidad de bloquear la actividad de la MASP-2 en suero humano normal.

Ensayo para medir la inhibición de la formación de la C3 convertasa de la vía de las lectinas

Se usó un ensayo funcional que mide la inhibición de la formación de la convertasa C3 de la vía de las lectinas para evaluar la "actividad de bloqueo" de clones candidatos de scFv de la MASP-2. Se requiere la actividad de la serina proteasa MASP-2 para generar los dos componentes proteicos (C4b, C2a) que comprenden la C3 convertasa de la vía de las lectinas. Por lo tanto, un scFv contra MASP-2 que inhibe la actividad funcional de la MASP-2 (es decir, un scFv bloqueador de la MASP-2), inhibirá la formaciónde novode la C3 convertasa de la vía de las lectinas. C3 contiene un grupo tioéster inusual y altamente reactivo como parte de su estructura. Tras la escisión de C3 por la C3 convertasa en este ensayo, el grupo tioéster de C3b puede formar un enlace covalente con grupos hidroxilo o amino en macromoléculas inmovilizadas en el fondo de los pocillos de plástico mediante enlaces éster o amida, lo que facilita la detección de C3b en el ensayo ELISA.

El manano de levadura es un conocido activador de la vía de las lectinas. En el siguiente método para medir la formación de la C3 convertasa, se incubaron pocillos de plástico recubiertos con manano con suero humano diluido para activar la vía de las lectinas. Luego se lavaron los pocillos y se analizó el C3b inmovilizado en los pocillos mediante el uso de métodos ELISA estándar. La cantidad de C3b generada en este ensayo es un reflejo directo de la formación denovode la C3 convertasa de la vía de las lectinas. En este ensayo se analizaron clones de scFv contra MASP-2 a concentraciones seleccionadas para determinar su capacidad para inhibir la formación de la C3 convertasa y la consiguiente generación de C3b.

Métodos:

Los 45 clones candidatos identificados como se describió anteriormente se expresaron, purificaron y diluyeron hasta la misma concentración madre, que se diluyó nuevamente en Ca++ y Mg++ que contiene tampón GVB (CaMgGVB: barbital 4,0 mM, NaCl 141 mM, MgCb 1,0 mM, CaCb 2,0 mM, gelatina al 0,1 %, pH 7,4) para asegurar que todos los clones tuvieran la misma cantidad de tampón. Cada uno de los clones de scFv se analizó por triplicado a una concentración de 2 pg/ml. El control positivo fue OMS100 Fab2 y se analizó a 0,4 pg/ml. La formación de C3b se monitoreó en presencia y ausencia de los clones de scFv/IgG.

El manano se diluyó a una concentración de 20 |jg/ml (1 jg/pocillo) en tampón carbonato 50 mM (Na2CO315 mM NaHCO3 35 mM NaN3 1,5 mM), pH 9,5 y se recubrió sobre una placa ELISA durante la noche a 4 °C. Al día siguiente, las placas recubiertas con manano se lavaron 3 veces con 200 j l de PBS. Luego se añadieron a los pocillos 100 j l de solución de bloqueo de HSA al 1 % y se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente. Las placas se lavaron 3 veces con 200 j l de PBS y se almacenaron en hielo con 200 j l de PBS hasta la adición de las muestras.

Se diluyó suero humano normal al 0,5 % en tampón CaMgGVB y se añadieron clones de scFv o el control positivo OMS100 Fab2 por triplicado a 0,01 jg/ml; 1 jg/ml (sólo control OMS100) y 10 jg/ml a este tampón y se preincubó durante 45 minutos en hielo antes de agregarlo a la placa ELISA bloqueada. La reacción se inició mediante incubación durante una hora a 37 °C y se detuvo al transferir las placas a un baño de hielo. La deposición de C3b se detectó con un anticuerpo C3c de conejo a-ratón seguido de HRp de cabra a-conejo. El control negativo fue tampón sin anticuerpo (sin OMS100 = deposición máxima de C3b) y el control positivo fue tampón con EDTA (sin deposición de C3b). El fondo se determinó mediante la realización del mismo ensayo excepto que los pocillos estaban libres de manano. La señal de fondo derivada de los pocillos sin manano se restó de las señales en los pocillos que contenían manano. Se estableció un criterio de corte en la mitad de la actividad de un clon de scFv irrelevante (VZV) y tampón solo.

Resultados: En base al criterio de corte, se encontró que 13 clones bloqueaban la actividad de MASP-2. Se seleccionaron y secuenciaron los 13 clones que producían > 50 % de supresión de la vía, lo que produjo 10 clones únicos. Se encontró que los diez clones tenían la misma subclase de cadena ligera, A3, pero tres subclases de cadena pesada diferentes: VH2, VH3 y VH6. En el ensayo funcional, cinco de los diez clones scFv candidatos dieron valores de IC50 nM inferiores al criterio objetivo de 25 nM mediante el uso de suero humano al 0,5 %.

Ta l : n i l n Fv m r n l Fi r 14A B n l Fi r 1 A y B

Las Figuras 14A y 14B muestran una alineación de secuencia de aminoácidos de los clones de scFv de longitud completa 17D20, 18L16, 4D9, 17L20, 17N16, 3F22 y 9P13. Los clones de scFv comprenden una región variable de cadena pesada (los aa 1-120), una región enlazadora (los aa 121-145) y una región variable de cadena ligera (los aa 146-250). Como se muestra en la Figura 14A, el alineamiento de la región de la cadena pesada (residuos 1-120) de los clones más activos reveló dos grupos distintos que pertenecen a la familia de genes VH2 y VH6, respectivamente. Como se muestra además en la Figura 14A, la región VH con respecto a los clones de la clase VH2: (17D20, 18L16 y 4D9) tiene variabilidad en las posiciones de 20 aa en la región total de 120 aminoácidos (es decir, 83 % de identidad).

Como se muestra además en la Figura 14A, la región VH con respecto a los clones de la clase VH6: 17L20, 17N16, 3F22 y 9P13, tiene variabilidad en las posiciones de 18 aminoácido en la región total de 120 aminoácidos (es decir, 85 % de identidad). Las Figuras 15A y B muestran una alineación de secuencia de los clones de scFv 17D20, 17N16, 18L16 y 4D9. Los clones de scFv comprenden una región variable de cadena pesada (los aa 1-120), una región enlazadora (los aa 121-145) y una región variable de cadena ligera (los aa 146-250).

Se analizó la potencia funcional de los clones de scFv en suero humano al 1 % mediante el uso de proteína purificada scFv 1000 nM para determinar la capacidad de inhibir la deposición de C3b. Se eligieron 17N16, 17D20 y 18L16 para la maduración por afinidad en función de la potencia funcional y diferentes familias de genes VH.

Mezcla de cadenas y maduración de afinidad de los clones madre 17N16, 17D20 y 18L16

Para identificar los anticuerpos con potencia mejorada, los tres clones de scFv madre, 17N16, 17D20 y 18L16, identificados como se describió anteriormente, se sometieron a mezcla de cadenas ligeras. Este proceso implicó la generación de una biblioteca combinatoria que consiste en la VH de cada uno de los clones madre emparejada con una biblioteca de cadenas ligeras lambda (VL) humanas ingenuas derivadas de seis donantes sanos, que luego se cribó en busca de clones scFv con afinidad de unión y/o funcionalidad mejorada. Se identificaron clones hijos con mayor actividad funcional y afinidad que los clones madre, como se muestra en la Tabla 7.

Tabla 7:

Región variable de cadena pesada

Tabla 8A: Cadena esada los aa 1-20

Tabla 8B: Cadena esada los aa 21-40

Tabla 8C: Cadena esada los aa 41-60

Tabla 8D Cadena esada los aa 61-80

Tabla 8E: Cadena esada los aa 81 -100

Tabla 8F: Cadena esada los aa 101-118

Más abajo se presentan las secuencias de la región variable de la cadena pesada (VH) para los clones madre y los clones hijos enumerados anteriormente en la Tabla 7 y las Tablas 8A-F.

Las CDR de Kabat (31-35 (H1), 50-65 (H2) y 95-102 (H3)) están en negrita; y las CDR de Chothia (26-32 (H1), 52-56 (H2) y 95-101 (H3)) están subrayadas.

R eg ión va ria b le de cad en a pe sada (V H ) 17D 20 (S E Q ID NO: 109):

O VTLKESGPVLVKPTETLTLTCTVSG FSLSR G K M G VSW IROPPGK ALEW

L A H IF SSD E K S Y R T SLK S RL TI SKDT SKN Q V VL TM TNM DP V D T AT Y Y C A R IR A G

G1DYW GQGTLVTVSS

Región variable de cadena pesada (VH) 17D20_35VH-21N11VL (SEQ ID NO: 111)

OVTLKESGPVLVKPTETLTLTCTVSGFSLSRGKM GVSW IROPPGKALEW

L A H IF S S PEK SYRTSLK SRLTISK DTSK NO VVLTM TN M DPV DTA TY Y C A R IR RG

G1D YWGQGTL VTVS S

Región variable de cadena pesada (VH) 17N16 (SEQ ID NO: 112)

O V OLOO SGPGLVKP S OTL SLT C AI S GD S V S ST S A A WNWIRO SP SRGLE W L

G R T Y Y R SK W YNDYAVSVK SRITINPDTSK NO FSLO LNSVTPEDTA V Y Y C A R DPF

GVPFDIW GQGTMVT VS S

T l : DR n

R e g io ne s va r ia b le s de cadena lige ra

Tabla 10A: Cadena li era los aa 1-20

T l 1B n li r l 21-4

T l 1 n li r l 41-

T l 1D n li r l 1-

T l 1E n li r l 1-1

Tabla 10F: Cadena liera los aa 101-120

Más abajo se presentan las secuencias de la región variable de la cadena ligera (VL) para los clones madre y los clones hijos enumerados anteriormente en la Tabla 7 y las Tablas 10A-F.

Las CDR de Kabat (24-34 (L1); 50-56 (L2); y 89-97 (L3) están en negrita; y las CDR de Chothia (24-34 (L1); 50-56 (L2) y 89-97 (L3) están subrayados. Estas regiones son las mismas ya sea que estén numeradas por el sistema Kabat o Chothia.

R eg ión va ria b le de cad en a lige ra (V L) 17 D 20m (S E Q ID NO: 113)

O PVLTOPPSVSVSPGOTASITCSG D K L G D K F A Y W YOOKPGHSPVLVIYO

D N K R P SG IPGRF SGSN SGNT ATLTISGT Q AM D EA D Y Y COA W D SST A V FGT GTKV

TVLA

Región variable de cadena ligera (VL) 17D20m_d3521 N11 (SEQ ID NO: 115)

QPVLTOPPSLSVSPGQTASITCSG E K L G D K Y A Y W YOOKPGOSPVLVM YO

D K Q R P SG IPERFSGSNSGNTATLTISGTOAM DEADYYCOA W D SST A V F GGGTKL

TVL

Región variable de cadena ligera (VL) 17N16m (SEQ ID NO: 116)

SYVLTOPPSVSVAPGOTARITCGG N N IG SK N V H W YOOKPGOAPVLVVYD

D SD R P SG IPERF S G SN SGNT ATLT V SR VE AGDE AD Y Y CO V W D TT T D H W F GGG

TKLTVLAAAGSEQKLISE

Región variable de cadena ligera (VL) 17N16m_d17N9 (SEQ ID NO: 118)

SYELIO PPSVSVAPG OTATITCAG D N L G K K R V H W YOQRPGOAPVLVIYD

D S D R P S G IPDRFSASNSG NTATLTITRG EAG DEADYYCO V W D IA T D H V VFGGGT

KLT VL A A AG SEQKLI SE

T l 11: DR n li r K h hi

Conversión de clones candidatos a formato IgG4, IgG4/S228P e IgG2

Los clones madre e hija se convirtieron en formato IgG4, mutante de bisagra IgG4/S228P e IgG2 y la funcionalidad de estos anticuerpos se evaluó en un ensayo C3. Se incluyó el mutante de la región bisagra S228P para aumentar la estabilidad del suero (ver Labrijn A.F. y otros, Nature Biotechnology 27: 767 (2009)). Las secuencias de los clones candidatos convertidos a formatos IgG4, IgG4/S228P e IgG2 se proporcionan de la siguiente manera:

SEQ ID NO 158: ADNc que codifica la IgG4 de tipo salvaje

SEQ ID NO 159: polipéptido IgG4 de tipo salvaje

SEQ ID NO 160: A<d>N<c>que codifica el mutante S228P de la IgG4

SEQ ID NO 161: polipéptido S228P mutante de la IgG4

SEQ ID NO 162: ADNc que codifica la IgG2 de tipo salvaje

SEQ ID NO 163: polipéptido IgG2 de tipo salvaje

Tabla 12: Anticuer os contra MASP-2 re resentativos humanos

Mapeo de epítopos

Los anticuerpos contra MASP-2 OMS100 y mAb#6, que se ha demostrado que se unen a MASP-2 humana con alta afinidad y tienen la capacidad de bloquear la actividad funcional del complemento, se analizaron con respecto a la unión del epítopo mediante un análisis de transferencia puntual como se describe en el documento WO2012/151481. Los resultados mostraron que los anticuerpos mAb#6 y OMS100 son altamente específicos para MASP-2 y no se unen a MASP-1 o MASP-3. El anticuerpo no se unió a MAp19 ni a los fragmentos de MASP-2 que no contenían el dominio CCP1 de MASP-2, lo que lleva a la conclusión de que los sitios de unión abarcan CCP 1. Ejemplo 6

Este Ejemplo describe la identificación de anticuerpos monoclonales de rata que se unen a MASP-2 e inhiben la activación del complemento mediada por las lectinas.

Métodos:

Como se describe en el documento WO2004/106384, incorporado en la presente descripción como referencia, se generaron anticuerpos monoclonales contra MASP-2 al inyectar 3 |jg de dominio CCP1-CCP2-SP de MASP-2 humano recombinante en ratas Wistar hembra, fusionar células de bazo con células de mieloma de ratón y cribar los sobrenadantes de hibridoma para detectar anticuerpos anti-MASP-2. Los anticuerpos inhibidores se identificaron mediante el cribado de la inhibición de la deposición de C4 catalizada por MASP-2. Un anticuerpo monoclonal inhibidor de MASP-2 representativo, capaz de inhibir la deposición de C4 en suero humano completo (IC50 = 0,0318 ng/pl contra Eu/Eumax) que fue producida por la línea celular de hibridoma depositada el 9 de mayo de 2003 en la Colección Europea de Cultivos Celulares (ECACC), Salisbury Wiltshire, Reino Unido, con el número de acceso 03050904, que produce el anticuerpo NimoAb101 (también denominado "4A8"). El mapeo de epítopos mediante transferencia Western indicó que NimoAb101 reconoce un epítopo lineal en la cadena B de MASP-2. Las secuencias de las regiones VH y VL del anticuerpo NimoAb101 se proporcionan más abajo.

NimoAb101: Región variable de cadena pesada (rata) (SEQ ID NO: 164)

M SFSNTLVFLLFLLKGILCEVOLVESGGGLVOPGRSLKLSCLVSGFTFSNF

GM NW IROAPGKGLEW VASISSGGTYIYHADTLKGRFTISRENAKNTLYLOM TSL

RSEDTALYYCARGPYHSRYIPYLM DAW GOGASVTVSSAETTAPSVYPLAPGTAL

KSNSM VTLGCLVKGYFPEPVTVTW NSGALSSGVHTFPAVLQSGLYTLTSSVTVPS

STW PSQTVTCNVAHPASSTKVDKKIV

NimoAb101: Región variable de cadena ligera (rata) (SEQ ID NO: 165)

M GVPTOELGLLLLW ITDAICDIOM TOSPGSLCASLGETVTIECR A SD DIYS

NLA W Y QQKPGN SPQLLIFDGNRLADGVP SRF SGSGS GTQ Y SLKMK SLQFED V A S

YFCOO Y N N YPLTF G SGTKLEIKRAD AAPT V SIFPP SMEOLT S GG AT V V CF VNNF Y

PRDISVKW KIDGSEQRDGVLDSVTDQDSKDSTYSM SSTLSLTKVEYERHNLYTCE

VVHKTSSSPVVKSFNRNEKGEFQHT

Tabla 13: Las CDR de NimoAb101

Ejemplo 7

Este Ejemplo describe la generación de anticuerpos contra MASP-2 que comprenden uno o más péptidos inhibidores de SGMI (por ejemplo, SGMI-1 o SGMI-2) fusionados en los extremos amino o carboxi terminal de las cadenas pesada y/o ligera, o en los extremos amino o carboxi terminal de la región variable de cadena pesada y/o la región variable de cadena ligera del anticuerpo contra MASP-2 humano.

Fundamento:

Como se demostró en el Ejemplo 2, se determinó que las funciones inhibidoras de los péptidos SGMI-1 y SGMI-2 se conservan en las proteínas SGMI-Fc. Como se describe en este Ejemplo, se llevaron a cabo experimentos para determinar si los péptidos SGMI retendrían actividad cuando se fusionaran con los extremos amino o carboxi terminal de las cadenas pesadas o ligeras de un andamiaje de anticuerpo contra MASP-2, tal como un anticuerpo inhibidor de MASP-2 completamente humano, y para determinar además si las fusiones de anticuerpo contra MASP-2/péptido SGMI resultantes tendrían una actividad inhibidora mejorada en comparación con el anticuerpo de andamiaje contra MASP-2 desnudo (que no contiene SGMI).

La Figura 16 ilustra un andamiaje de anticuerpo contra MASP-2 ilustrativo que comprende uno o más péptidos SGMI fusionados al extremo N-terminal de la región variable de la cadena pesada (A); y/o el extremo N-terminal de la región variable de cadena ligera (B); y/o el extremo C-terminal de la región constante de cadena pesada (C); y/o el extremo C-terminal de la región constante de cadena ligera (D).

La Figura 17A ilustra un andamiaje de anticuerpo scFv contra MASP-2 que comprende un péptido SGMI fusionado al extremo N-terminal de la región variable de cadena pesada y/o al extremo C-terminal de la región variable de cadena ligera. La Figura 17B ilustra un andamiaje de anticuerpo scFv contra MASP-2 que comprende un péptido SGMI fusionado al extremo N-terminal de la región variable de cadena ligera y/o al extremo C-terminal de la región variable de cadena pesada.

Métodos:

Para examinar la actividad inhibidora de los péptidos SGMI cuando se fusionan con un andamiaje de anticuerpo contra MASP-2, se generaron ocho construcciones de expresión, como se ilustra en la Figura 18, para codificar SGMI-1 o SGMI-2 fusionados al extremo N- o C-terminal de la cadena pesada o ligera de un anticuerpo mAb#6 inhibidor de MASP-2 representativo, que se generó como se describió en el Ejemplo 5.

Tabla 14: Fusiones de anticuer o contra MASP-2/SGMI

Para las fusiones N-terminales mostradas en la Tabla 14, se añadió un enlazador peptídico ('GTGGGSGSSS' SEQ ID NO: 172) entre el péptido SGMI y la región variable.

Para las fusiones C-terminales mostradas en la Tabla 14, se añadió un enlazador peptídico ('AAGGSG' SEQ ID NO: 173) entre la región constante y el péptido SGMI, y se añadió un segundo péptido "GSGA" en el extremo C-terminal del polipéptido fusión para proteger los péptidos SGMI C-terminales de la degradación. Estas construcciones de fusión se ilustran esquemáticamente en las Figuras 16 y 18.

Más abajo se proporcionan secuencias de aminoácidos para las siguientes fusiones representativas de anticuerpo contra MASP-2/SGMI:

H-M2ab6-SGMI-1-N: (SEQ ID NO: 175, codificado por la SEQ ID NO: 174):

LEVTCEPGTTFKDKCNTCRCGSDGKSAFCTRKLCYQGrGGGAGASYOVTLKESGP

VL VKP TETL TLTC TV S GF SL S RGKM G V S WIROPPGK ALEW L AHIF S SDEK S YRT S

LKSRLTISKDTSKNOVVLTM TNM DPVDTATYYCARIRRGGIDYW GOGTLVTVSS

ASTKGPSVFPLAPC SRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSW NSGALTSGVHTFPA

VLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCP

APEFL GGP S VFLFPPKPKDTLMISRTPE VTC V V V D V SQEDPE V QFNW Y VDGVE V

HNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDW LNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISK

AKGQPREPQVYTLPPSQEEM TKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEW ESNGQPENNYK

TTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRW QEGNVFSCSVM HEALHNHYTQKSLSLSLG

K

[proteína de 491 aa, los aa 1-36 = SGMI-1, los aa 37-46 = enlazador; los aa 47-164 = región variable de cadena pesada del ab#6 contra MASP-2; los aa 165-491 = región constante de IgG4 con mutación de bisagra].

H-M2ab6-SGMI-2-N (SEQ ID NO: 177, codificada por la SEQ ID NO: 176):

LEVTCEPGTTFKDKCNTCRCGSDGKSAVCTKLW CNOGyGGGSGYSYOVTLKESG

PVLVKPTETLTLTCTVSGFSLSRGKMGVSW1ROPPGKALEWLAHIFSSDEKSYRT

SLKSRLTISKDTSKNOVVLTM TNM DPVDTATYYCARIRRGGIDYW GOGTLVTVS

SASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSW NSGALTSGVHTFPA

VLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCP

APEFLGGPSVFLFPPKPKDTLM ISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNW YVDGVEV

HNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDW LNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISK

AKGQPREPQVYTLPPSQEEM TKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEW ESNGQPENNYK

TTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRW QEGNVFSCSVM HEALHNHYTQKSLSLSLG

K

[proteína de 491 aa, los aa 1-36 = SGMI-2 (subrayado), los aa 37-46 = enlazador (cursiva); los aa 47-164 = región variable de cadena pesada del ab#6 contra MASP-2 (subrayada); los aa 165-491 = región constante de IgG4 con mutación de bisagra.]

H-M2ab6-SGMI-1-C (SEQ ID NO: 179, codificada por la SEQ ID NO: 178):

OVTLKESGPVLVKPTETLTLTCTVSGFSLSRGKMGVSWJRQPPGKALEWLAHIFS SDEKSYRTSLKSRLTISKDTSKNOVVLTMTNM DPVDTATYYCARIRRGGIDYW G OGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSW NSGAL T SGVHTFP A VLQ S S GL YSLS S VVT VP S S SLGTKT YTCN VDFIKP SNTKVDKRVE SK YGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNW YVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDW LNGKEYKCKVSNKGLPS SIEKTTSKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNG QPENNYKTTPP VLD SDGSFFL YSRLT VDK S RW QEGN VF SC S VM HE ALHNHYTQK SLSLSLGK/MGGSGLEVTCEPGTTFKDKCNTCRCGSDGKSAFCTRKLCYOG.S'GN

[proteína de 491 aa, los aa 1-118 = región variable de cadena pesada del ab#6 contra MASP-2 (subrayado); los aa 119-445 = región constante de IgG4 con mutación de bisagra; los aa 446-451 = 1er enlazador (cursiva); los aa 452-487 = SGMI-1; los aa 488-491 = 2do enlazador (cursiva).]

H-M2ab6-SGMI-2-C (SEQ ID NO: 181, codificada por la SEQ ID NO: 180):

OVTLKESGPVLVKPTETLTLTCTVSGFSLSRGKM GVSW IROPPGKALEW LAHIFS SDEKSYRTSLKSRLTISKDTSKNOVVLTM TNM DPVDTATYYCARIRRGGIDYW G QGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPC SRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSW NSGAL T S G VHTF P A VLQ S S GL YSL S S V VT VP S S SLGTKT YT CN VD HKP SNTKVDKRVE SK Y GPPCPPCPAPEFLGGPS VFLFPPKPKDTLMISRTPEVTC V V V D V SQEDPEVQFNW Y VD G V E VH N AK TKPREEQFN S T YR V V S VLT VLHQD W LN GKE YK CK V SNKGLP S SIEKTI SK AKGQPREP Q VYTLPP S QEEMTKNQ VSLT CL VKGF YP SDIA VE WE SNG QPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRW QEGNVFSCS VMHE ALHNHYTQK SLSLSLGK44GGAGLEVTCEPGTTFKDKCNTCRCGSDGKSAVCTKLW CNOGAG4[proteína de 491 aa, los aa 1-118 = región variable de cadena pesada del ab#6 contra MASP-2 (subrayado); los aa 119-445 = región constante de IgG4 con mutación de bisagra; los aa 446-451 = 1er enlazador (cursiva); los aa 452-487 = SGMI-2; los aa 488-491 = 2do enlazador (cursiva).]

L-M2ab6-SGMI-1-N (SEQ ID NO: 183, codificada por la SEQ ID NO: 182):

LEVTCEPGTTFKDKCNTCRCGSDGKSAFCTRKLCYOGrGGGAGNSffOPVLTOPPS LSVSPGOTASITCSGEKLGDKYAYW YOOKPGOSPVLVM YODKORPSGIPERFSG SNSGNTATLTISG TQ AM DEADYYCOAW DSSTAVFG GG TK LTVLG QPKAAPSVTL FPPSSEELQ ANKATLVCLISDFYPGAVTVAW KADSSPVK AG VETTTPSK QSNNK Y AASSYLSLTPEQW KSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS

[proteína de 258 aa, los aa 1-36 = SGMI-1 (subrayado); los aa 37-46 = enlazador (cursiva); los aa 47-152 = región variable de cadena ligera del ab#6 contra MASP-2 (subrayada); los aa 153-258 = región constante lambda de Ig humana]

L-M2ab6-SGMI-2-N (SEQ ID NO: 185, codificada por la SEQ ID NO: 184):

LEVTCEPGTTFKDKCNTCRCGSDGKSAVCTKLWCNOGTGGG^G&SyOPVLTQPPS

LSVSPGOTASITCSGEKLGDKYAYW YOOKPGOSPVLVM YODKORPSGIPERFSG

SNSGNTATLTISGTOAM DEADYYCOAW DSSTAVFGGGTKLTVLGOPKAAPSVTL

FPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAW KADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKY

AAS S YLSLTPEQWK SFTR S YSCQVTHEGST VEKTV APTEC S

[proteína de 258 aa, los aa 1-36 = SGMI-2 (subrayado); los aa 37-46 = enlazador (cursiva); los aa 47-152 = región variable de cadena ligera del ab#6 contra MASP-2 (subrayada); los aa 153-258 = región constante lambda de Ig humana]

L-M2ab6-SGMI-1-C (SEQ ID NO: 187, codificada por la SEQ ID NO: 186):

OPVLTQPPSLSVSPGOTASITCSGEKLGDKYAYW YOOKPGOSPVLVM YODKQRP

SG1PERFSGSNSGNTATLT1SGTOAM DEADYYCOAW DSSTAVFGGGTKLTVLGO

PKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAW KADSSPVKAGVETTT

PSKQSNNKYAASSYLSLTPEQW KSHRSYSCQVTHEGSTVEKTV APTECS A A G G S G

LEVTCEPGTTFKDKCNTCRCGSDGKSAFCTRKLCY0GAG4

[proteína de 258 aa, los aa 1-106 = región variable de cadena ligera del ab#6 contra MASP-2 (subrayada); los aa 107-212 = región constante lambda de Ig humana; los aa 213-218 = 1er enlazador; los aa 219-254 = S<g>M-1; los aa 255-258 = 2do enlazador]

L-M2ab6-SGMI-2-C (SEQ ID NO: 189, codificada por la SEQ ID NO: 188):

OPVLTOPPSLSVSPGOTASITCSGEKLGDKYAYW YOQKPGOSPVLVM YODKORP

SGIPERFSGSNSGNTATLTISGTQAM DEADYYCOAW DSSTAVFGGGTKLTVLGO

PK A AP S VTLF PP S SEELQ ANK ATL VC LISDF YPG A VT V AW K AD S SP VK AGVETTT

PSKQSNNKYAASSYLSLTPEQW KSHRSYSCQVTFTEGSTVEKTVAPTECSA4GG3G

LE VTCEPGTTFKDKCNT CRCG SDGK S A V C TKLW CNOG.SG4

[proteína de 258 aa, los aa 1-106 = región variable de cadena ligera del ab#6 contra MASP-2 (subrayada); los aa 107-212 = región constante lambda de Ig humana; los aa 213-218 = 1er enlazador; los aa 219-254 = S<g>M-2; los aa 255-258 = 2do enlazador]

Ensayos funcionales:

Las ocho construcciones de anticuerpos de fusión contra MASP-2-SGMI se expresaron transitoriamente en células Expi293F (Invitrogen), se purificaron mediante cromatografía de afinidad con proteína A y se analizaron en suero humano normal al 10 % para determinar la inhibición de la deposición de C3b en un ensayo de perlas recubiertas de manano como se describe más abajo. (Nota: la construcción H-M2-SGMI-1-C no se expresó bien, por lo que no se pudo probar en este ensayo).

Experimento #1: Prueba de las fusiones MASP-2-SGMI en el ensayo de perlas recubiertas de manano para la deposición de C3b

Se evaluaron los anticuerpos de fusión contra MASP-2-SGMI en cuanto a la inhibición de la vía de las lectinas en un ensayo de deposición de C3b en perlas recubiertas de manano. Este ensayo, que determina el grado de actividad mediante citometría de flujo, ofrece mayor resolución que el ensayo de Wieslab®. El ensayo de perlas de la vía de las lectinas se llevó a cabo de la siguiente manera: el manano se adsorbió en perlas de poliestireno de 7 pM de diámetro (Bangs Laboratories; Fishers, IN, Estados Unidos) durante la noche a 4 °C en tampón carbonatobicarbonato (pH 9,6). Las perlas se lavaron en PBS y se expusieron a suero humano al 10 % o suero al 10 % preincubado con anticuerpos o inhibidores. La mezcla de suero y perlas se incubó a temperatura ambiente durante una hora mientras se agitaba. Después de la incubación del suero, se lavaron las perlas y se midió la deposición de C3b en las perlas mediante detección con un anticuerpo policlonal de conejo anti-C3c (Dako North America; Carpinteria, CA, Estados Unidos) y un anticuerpo secundario anti-conejo de cabra conjugado con PE-Cy5. anticuerpo (Southern Biotech; Birmingham, AL, Estados Unidos). Después del procedimiento de tinción, las perlas se analizaron mediante el uso de un citómetro de flujo FACS Calibur. Las perlas se seleccionaron como una población uniforme mediante el uso de dispersión frontal y lateral, y la deposición de C3b fue evidente como partículas positivas para FL3 (FL-3, o "canal FL-3" indica el canal 3 o rojo en el citómetro). La intensidad de fluorescencia media geométrica (MFI) para la población para cada condición experimental se representó con relación a la concentración de anticuerpo/inhibidor para evaluar la inhibición de la vía de las lectinas.

Los valores de la IC50 se calcularon mediante el uso del programa GraphPad PRISM. Específicamente, los valores de la IC50 se obtuvieron mediante la aplicación de una pendiente variable (cuatro parámetros), un ajuste no lineal a log (anticuerpo) contra curvas de intensidad de fluorescencia media obtenidas del ensayo citométrico.

Los resultados se muestran en la Tabla 15.

Tabla 15: Deposici n n rl r i r m n n n r h m n l 1 (Experimento #1)

Resultados:

El control, anticuerpo de andamiaje "desnudo" contra MASP-2 que no contiene SGMI (mAb#6), fue inhibidor en este ensayo, con un valor de IC50 de > 3,63 nM, lo que es consistente con los resultados inhibidores observados en el Ejemplo 5. Sorprendentemente, como se muestra en la Tabla 15, las siete fusiones de anticuerpos contra MASP-2-SGMI que se probaron mejoraron la potencia del anticuerpo de andamiaje contra MASP-2 en este ensayo. Las dos fusiones más potentes, L-M2-SGMI-1C y H-M2-SGMI-1-N, contienen el péptido SGMI-1 específico de MASP-1 (SEQ ID NO: 6), lo que sugiere que la especificidad dual de MASP-1/MASP-2 puede ser ventajosa en la inhibición de la deposición de C3b. También se observa que dos de los anticuerpos de fusión contra MASP-2-SGMI portadores del péptido SGMI-2 específico de MASP-2 (SEQ ID NO: 9), H-M2-SGMI-2-N y H-M2-SGMI-2-C, son casi igual de activos, lo que sugiere que el aumento de la valencia también puede ser beneficioso en la inhibición de la deposición de C3b.

Experimento #2: Ensayo de perlas recubiertas de manano para la deposición de C3b

Se llevó a cabo un ensayo de perlas recubiertas de manano para la deposición de C3b con suero humano al 10 % para evaluar las contribuciones relativas de los dos componentes de las fusiones MASP-2-SGMI, el andamiaje de anticuerpo contra MASP-2 y los péptidos SGMI, a la actividad inhibidora mejorada. En este análisis se usaron las dos fusiones más potentes. Para cada uno, se comparó el andamiaje de anticuerpo contra MASP-2 (mAb#6) con la fusión MASP-2-SGMI contra la correspondiente fusión quimérica de anticuerpo DT40-SGMI, generada a partir de un anticuerpo de pollo DT40 no específico (no se une a MASP-2), y el anticuerpo de pollo no específico con un péptido SGMI-1 fusionado a la región N-terminal de la cadena pesada (H-DT40-Ab-SGMI-1-N, establecido como la SEQ ID NO: 190), y el anticuerpo de pollo no específico con un péptido SGMI-1 fusionado a la región C-terminal de la cadena ligera (L-DT40-Ab-SGMI-1-C, establecido como la s Eq ID NO: 100). El ensayo se llevó a cabo como se describió anteriormente y los resultados se muestran más abajo en la Tabla 16.

Tabla 16: De osición de C3b llevada a cabo con suero humano al 10 % Ex erimento #2

Como se muestra en la Tabla 16, en ambos casos, el péptido SGMI-1 mejoró la actividad del anticuerpo de andamiaje contra MASP-2. De las dos fusiones, la mejora más sorprendente en la actividad se observó con SGMI-1 fusionado al extremo C-terminal de la cadena ligera del anticuerpo contra MASP-2 (L-M2-SGMI-1-C, con una IC50 de 0,33 nM). Por el contrario, cuando el péptido SGMI-1 se fusiona en la misma posición del mAb quimérico de pollo no específico (L-DT40-AB-SGMI-1-C), su actividad inhibidora fue apenas detectable. Cuando SGMI-1 se fusiona con el extremo N-terminal de la cadena pesada de mAb de pollo no específica (H-DT40-Ab-SGMI-1-N), era considerablemente más activo que L-DT40-AB-SGMI-1-C, pero moverlo a la misma posición en el andamiaje de anticuerpo contra MASP-2 (H-M2-SGMI-1-N) aún aumenta su actividad inhibidora en casi dos órdenes de magnitud (IC50 de 32 nM contra 0,38 nM). En conjunto, estos datos indican que, cuando se fusionan en una sola molécula de anticuerpo, el andamiaje de anticuerpo contra MASP-2 y SGMI crean sinergia para bloquear la activación de la vía de las lectinas.

Experimento #3: Ensayo de deposición de C3b con suero de ratón al 10 %

Se llevó a cabo un ensayo de perlas recubiertas de manano para la deposición de C3b como se describió anteriormente con suero de ratón al 10 %. La Figura 19 ilustra gráficamente los resultados de un ensayo de deposición de C3b llevado a cabo en suero de ratón al 10 % con un anticuerpo de andamiaje contra MASP-2 (HL-M2) desnudo representativo (mAb#6) en comparación con fusiones de anticuerpo contra MASP-2 (M2)-SGMI que comprende SGMI-1 o SGMI-2 en un intervalo de concentraciones de anticuerpos. Como se muestra en la Figura 19, la fusión de SGMI-1 o SGMI-2 con el anticuerpo de andamiaje contra MASP-2 aumentó la potencia inhibidora del anticuerpo contra MASP-2 en estas condiciones.

Experimento #4: Ensayo de deposición de C4b con suero humano al 10 %

Se llevó a cabo un ensayo de deposición de C4b con suero humano al 10 % mediante el uso de las mismas condiciones de ensayo como se describió anteriormente para el ensayo de deposición de C3b con las siguientes modificaciones. La detección de C4b y el análisis de citometría de flujo se llevaron a cabo mediante la tinción de la reacción de deposición con un anticuerpo monoclonal de ratón anti-C4b (1:500, Quidel) y la tinción con un F(ab')2 anti-ratón de cabra secundario conjugado con PE Cy5 (1:200, Southern Biotech) antes del análisis de citometría de flujo.

Como se muestra en la Figura 20A, las fusiones de anticuerpos contra MASP-2 portadores de SGMI-2 simples (H-M2-SGMI-2-N, L-M2-SGMI-2-N), y las fusiones de anticuerpos contra MASP-2 portadores de SGMI-2 dobles (H<l>-M2-SGMI-2-2-NN y HL-M2-SGMI-2-2-NC) tenían una mayor potencia en comparación con el anticuerpo de andamiaje contra MASP-2 (HL-M2).

De manera similar, como se muestra en la Figura 20B, las fusiones de anticuerpos contra MASP-2 portadores de SGMI-2 simples (H-M2-SGMI-2-C y L-M2-SGMI-2C), y las fusiones de anticuerpos contra MASP-2 portadores de SGMI-2 dobles (H<l>-M2-SGMI-2-2-C<n>y HL-M2-S<g>M-2-2-CC) tenían una mayor potencia en comparación con el anticuerpo de andamiaje contra MASP-2 (HL-M2).

Experimento #5: Ensayo de deposición de C3b con suero humano al 10 %

Se realizó una deposición de C3b en suero humano al 10 % para evaluar las contribuciones relativas de los dos componentes de los anticuerpos de fusión, el andamiaje de anticuerpo contra MASP-2 (mAb#6) o los péptidos SGMI, a la actividad inhibidora mejorada. Para este análisis se usaron dos fusiones representativas que previamente se determinó que tenían alta potencia, específicamente, H-M2-SGMI-1-N y L-M2-SGMI-1-C. Cada construcción de fusión se comparó con la correspondiente fusión de anticuerpo DT40 quimérico-SGMI (generada como se describió anteriormente en el Ejemplo 4).

La Figura 21 ilustra gráficamente los resultados de un ensayo de deposición de C3b llevado a cabo en suero humano al 10 % con un anticuerpo quimérico no específico humano/de pollo que comprende el péptido SGMI-1 fusionado al extremo C-terminal de la región constante de cadena ligera (L-SGMI-1-C); o un anticuerpo quimérico/humano no específico que comprende el péptido SGMI-1 fusionado al extremo N-terminal de la región variable de la cadena pesada (H-SGMI-1-N) en comparación con las fusiones homólogas de anticuerpo contra MASP-2 (M2)-SGMI-1. Como se muestra en la Figura 21, la mejora más sorprendente en la actividad se logró con SGMI-1 fusionado al extremo C-terminal de la cadena ligera del anticuerpo de andamiaje contra MASP-2 (L-M2-SGMI-1-C, con una IC50 de 0,33 nM), mientras que cuando el péptido SGMI-1 se fusiona con el extremo C-terminal del anticuerpo quimérico no específico DT40 (L-SGMI-1-C), su actividad inhibidora es apenas detectable. Como se muestra además en la Figura 21, cuando SGMI-1 se fusiona con el extremo N-terminal del anticuerpo DT40 quimérico no específico (H-SGMI-1-N), tenía cierta actividad inhibidora (IC50 de 30 nM), sin embargo, se logró una mejora sorprendente de casi dos órdenes de magnitud en la actividad inhibidora cuando se fusionó SGMI-1 en la misma posición N-terminal en el anticuerpo de andamiaje contra MASP-2 (H-M2-SGMI-1-N, IC50 de 0,38 nM). En conclusión, en ambos casos, SGMI-1 mejoró drásticamente la actividad inhibidora del anticuerpo de andamiaje contra MASP-2. En conjunto, estos datos indican que, cuando se fusionan en una sola molécula de anticuerpo, un anticuerpo de andamiaje contra MASP-2 y el péptido bioactivo SGMI-1 crean sinergia para bloquear la activación de la vía de las lectinas.

Casos alternativos:

En vista de la descripción en la presente descripción, un experto en la técnica entenderá que el uso del anticuerpo mAb#6 contra MASP-2 descrito en este ejemplo es un anticuerpo de andamiaje contra MASP-2 representativo, y un péptido SGMI puede fusionarse a cualquier anticuerpo contra MASP-2, tal como los anticuerpos contra MASP-2 descritos en la Tabla 17, mediante el uso de métodos de rutina conocidos en la técnica para generar una fusión de anticuerpo contra MASP-2/SGMI de acuerdo con la invención. En algunos casos, el anticuerpo de andamiaje contra MASP-2 sin el péptido SGMI puede tener actividad inhibidora débil o nula, y la fusión del anticuerpo contra MASP-2 portador de SGMI proporciona, o aumenta, la actividad inhibidora del anticuerpo de andamiaje contra MASP-2. En algunos casos, el anticuerpo de andamiaje contra MASP-2 tiene un nivel inicial de actividad inhibidora, y la fusión del anticuerpo contra MASP-2 portador de SGMI tiene una actividad inhibidora mejorada. En las Tablas 18 y 19, respectivamente, se proporcionan ejemplos no limitantes de regiones variables de cadena pesada y regiones variables de cadena ligera de anticuerpo inhibidor de MASP-2 adecuadas.

Tabla 17: Anticueros Esecíficos Contra Mas-2 De La Literatura

T l 1: R in vri l l n l ni r inhi i r MA P-2

T l 1: R in v ri l l n li r l ni r inhi i r MA P-2

Ejemplo 8

Este Ejemplo describe un estudio de farmacodinámica en ratones que se llevó a cabo para evaluar la actividad de las fusiones de anticuerpos contra MASP-2 portadores de SGMI-1 y SGMI-2in vivo.

Antecedentes/Fundamento:

Como se describió en el Ejemplo 7, se ha determinado que los inhibidores peptídicos bioactivos de MASP-1 y MASP-2, SGMI-1 y SGMI-2, respectivamente, mejoran significativamente la capacidad de un anticuerpo de andamiaje contra MASP-2 para bloquear la activación de la vía de las lectinas en sueros humanos y de ratón. El siguiente experimento se llevó a cabo para evaluar la actividad inhibidora de las fusiones de anticuerpos contra MASP-2 portadores de SGMI-1 y SGMI-2 en un estudio de farmacodinámica de ratón de siete días.

Métodos:

A los ratones (n = 3/grupo) se les inyectaron por vía intraperitoneal 5 mg/kg de un anticuerpo de andamiaje contra MASP-2 (mAb#6), anticuerpos contra MASP-2 portadores del péptido SGMI-1 (L-M2-SGMI-1-C; L-M2-SGMI-1-N o H-M2-SGMI-1-N), anticuerpos contra MASP-2 portadores del péptido SGMI-2 (L-M2-SGMI-2-N, H-M2-SGMI-2-C, H-M2-SGMI-2-N o L-M2-Sg Mi-2-C), o un anticuerpo control de isotipo IgG4 (ET904).

Se obtuvieron muestras de suero de los ratones a las 24, 72 y 168 horas después de la inyección del anticuerpo, y la actividad de la vía de las lectinas se midió en un ensayo de deposición de C3b mediante el uso de suero al 90 %. Se observó que dos de los anticuerpos de fusión, específicamente, H-M2-SGMI-2-C y H-M2-SGMI-1-N, tenían la mayor potencia e inhibían la actividad de la vía de las lectinas a niveles casi indetectables 24 horas después de la inyección y mantenían un alto nivel de inhibición durante una semana.

Para analizar la farmacocinética, también se realizaron ELISA para medir el nivel de anticuerpos en las muestras de suero en los mismos puntos de tiempo usados para el ensayo farmacodinámico. Luego se representaron gráficamente las concentraciones de los anticuerpos, determinadas mediante ELISA (el conjunto de datos farmacocinéticos) frente a la actividad de la vía de las lectinas, determinada mediante el ensayo de deposición de C3b (el conjunto de datos farmacodinámicos). Se usaron datos farmacodinámicos de los ratones no tratados para proporcionar puntos de datos comunes de "anticuerpo 0 nM" para todas las condiciones. Se combinaron los datos de todos los puntos temporales para cada grupo de tratamiento.

Resultados:

La Figura 22A muestra una gráfica de la concentración de un anticuerpo de andamiaje contra MASP-2 (HL-M2) desnudo representativo (mAb#6) o fusiones de anticuerpo contra MASP-2 (M2)-SGMI-1 (conjunto de datos farmacocinéticos (PK)) vs. la actividad de la vía de las lectinas (deposición de C3b; conjunto de datos farmacodinámicos (PD)). La Figura 22B muestra una gráfica de la concentración de un anticuerpo de andamiaje contra MASP-2 (h L-m 2) desnudo representativo (mAb#6) o fusiones de anticuerpo contra MAs P-2 (M2)-SGMI-2 (conjunto de datos farmacocinéticos (PK)) vs. la actividad de la vía de las lectinas (deposición de C3b; conjunto de datos farmacodinámicos (PD)).

Como se muestra en la Figura 22A, el péptido SGMI-1 mejora significativamente la capacidad de un anticuerpo de andamiaje contra MASP-2 para bloquear la activación de la vía de las lectinas en un ratónin vivo.Como se muestra además en la Figura 22B, el péptido SGMI-2 también mejora la capacidad de un anticuerpo de andamiaje contra MASP-2 para bloquear la activación de la vía de las lectinas en un ratónin vivo,pero a una menor medida que el péptido SGMI-1. Estos resultados sugieren que la especificidad dual MASP-1/MASP-2 proporcionada por la fusión anticuerpo-péptido puede ser ventajosa en la inhibición de la vía de las lectinasin vivo.Se observa que los resultados mejorados con los anticuerpos de fusión contra MASP-2-SGMI portadores del péptido SGMI-2 específico de MASP-2 sugieren que el aumento de la valencia también puede ser beneficioso en la inhibición de la vía de las lectinasin vivo.

Si bien se han ilustrado y descrito los casos preferentes de la descripción, se apreciará que pueden realizarse varios cambios en los mismos.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un anticuerpo portador de péptido bioactivo aislado, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que comprende:

(ii) una secuencia peptídica de SGMI establecida como la SEQ ID NO: 6 o la SEQ ID NO 9,

(b) en donde la secuencia peptídica de SGMI que comprende SGMI-1 establecida como la s Eq ID NO: 6, está fusionada a la región amino terminal de la región variable de cadena ligera del anticuerpo;

(d) en donde la secuencia peptídica de SGMI que comprende SGMI-2 establecida como la SEQ ID NO: 9, está fusionada a la región carboxi terminal de la región constante de cadena pesada del anticuerpo; (e) en donde la secuencia peptídica de SGMI que comprende SGMI-2 establecida como la SEQ ID NO: 9, está fusionada a la región amino terminal de la región variable de cadena ligera del anticuerpo; y (f) en donde la secuencia peptídica de SGMI que comprende SGMI-2 establecida como la SEQ ID NO: 9, está fusionada a la región carboxi terminal de la región constante de cadena ligera del anticuerpo.

2. El anticuerpo o fragmento del mismo de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende además una región enlazadora de 1 residuo de aminoácido a 20 residuos de aminoácido entre la secuencia de aminoácidos del péptido SGMI y el extremo amino terminal de la región variable de cadena ligera o pesada del anticuerpo.

3. El anticuerpo o fragmento del mismo de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, que comprende además una región enlazadora de 1 residuo de aminoácido a 20 residuos de aminoácido entre la secuencia de aminoácidos del péptido SGMI y el extremo carboxi terminal de la región variable de cadena ligera o pesada del anticuerpo.

4. El anticuerpo o fragmento del mismo de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el anticuerpo se selecciona del grupo que consiste en un anticuerpo completo, un anticuerpo de cadena sencilla y un anticuerpo univalente que carece de una región bisagra.

5. El fragmento de anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el fragmento se selecciona del grupo que consiste en un fragmento Fab, Fab', F(ab')2 o scFv.

6. Una molécula de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos de un anticuerpo portador de péptido bioactivo aislado establecida en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5.

7. Una célula que comprende al menos una de las moléculas de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 6.

8. Una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo, de cualquiera de la reivindicaciones 1 a 5, y un excipiente farmacéuticamente aceptable.

9. Una composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 8, formulada para suministro sistémico.

10. Una composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 8, formulada para administración intraarterial

11. Una composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 8 , formulada para administración intravenosa.

12. Una composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 8, formulada para administración intracraneal.

13. Una composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 8, formulada para administración intramuscular.

14. Una composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 8, formulada para administración inhalatoria.

15. Una composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 8, formulada para administración nasal o subcutánea.