ES2946060T3

ES2946060T3 - Compuestos y composiciones de urea como inhibidores de SMARCA2/BRM-ATPASA

Info

Publication number: ES2946060T3
Application number: ES19779145T
Authority: ES
Inventors: Christopher Adair; Julien Papillon; Katsumasa Nakajima; Troy Douglas Smith; Rukundo Ntaganda
Original assignee: Novartis AG
Current assignee: Novartis AG
Priority date: 2018-08-17
Filing date: 2019-08-12
Publication date: 2023-07-12
Anticipated expiration: 2039-08-12
Also published as: HRP20230477T1; BR112021002632A2; WO2020035779A1; US11958846B2; CN118666832A; EP3837256B1; SI3837256T1; CY1126039T1; US20240270738A1; PT3837256T; LT3837256T; CA3107097A1; EP4219488A1; DK3837256T3; AU2019322325B2; FI3837256T3; MX2021001804A; KR20210047313A; US20210323956A1; CN112585136A

Abstract

Se proporciona un compuesto de Fórmula (I), o una de sus sales farmacéuticamente aceptables, que ha demostrado ser útil para tratar una enfermedad o trastorno mediado por BRM y/o BRG1: Fórmula (I) en la que R1 a R6 son como definido en este documento. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Compuestos y composiciones de urea como inhibidores de SMARCA2/BRM-ATPASA

Campo de la invención

LISTADO DE SECUENCIAS

La presente solicitud contiene un Listado de secuencias que ha sido presentado electrónicamente en formato ASCII y que se incorpora a la presente por referencia en su totalidad. Dicha copia ASCII, creada el 30 de noviembre de 2016, se denomina PAT057524-US-PSP_SL.txt y tiene un tamaño de 31.078 bites.

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La presente divulgación se refiere a compuestos, composiciones que comprenden a este tipo de compuestos y a su uso para el tratamiento de trastornos o enfermedades mediados por BRM y/o mediados por BRG1, incluyendo cánceres con mutaciones en BRG1/SMARCA4.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

Los complejos multiproteicos SWI/SNF (mSWI/SNF) de mamíferos regulan la estructura de la cromatina a través de la remodelación del nucleosoma dependiente de ATP y, con ello, controlan muchos procesos celulares clave. Varias subunidades de los complejos mSWI/SNF tienen funciones como supresores de tumores, y estudios genómicos recientes revelaron mutaciones recurrentes en varias de estas subunidades, con una frecuencia de mutación colectiva de aproximadamente el 20 % en todos los cánceres. La subunidad catalítica BRG1 de SWI/SNF, también conocida como SMARCA4, está frecuentemente mutada en adenocarcinomas de pulmón y otros tipos de cáncer.

BRM (también conocida como SMARCA2) es el parálogo de BRG1 (o gen 1 relacionado con BRM/SWI2, también conocido como SMARCA4), y estas dos proteínas funcionan como subunidades dependientes de ATP mutuamente excluyentes dentro del complejo de remodelación de la cromatina de SWI/SNF de mamífero. Se requiere BRM o BRG1 para que las células ensamblen un complejo SWI/SNF catalíticamente activo. Se han caracterizado múltiples variantes del complejo SWI/SNF con diferente composición de subunidades, pero solo una subunidad catalítica (BRM o BRG1) está presente en cada complejo.

Se ha demostrado que BRG1 funciona como un supresor de tumores y está significativamente mutado en los cánceres humanos. La evidencia de la función supresora de tumores de BRG1 se ha demostrado mediante la re-expresión de BRG1 de tipo salvaje en líneas celulares mutantes de BRG1, lo que da como resultado la diferenciación y la detención del ciclo celular. Ratones Brg1 /- desarrollan carcinoma mamario con una incidencia del 10% en un año. Se han identificado mutaciones de pérdida de función en BRG1 en -30% de las líneas establecidas de cáncer de pulmón de células no pequeñas, y el silenciamiento de BRG1 se encuentra en muchas otras líneas de células cancerosas y muestras de tumores, incluyendo los cánceres de pulmón, páncreas y ovario, melanomas y sarcomas rabdoides pediátricos. Es importante destacar que los resultados recientes del proyecto Cancer Genome Atlas (TCGA) identificaron mutaciones BRG1 como un gen mutado de forma destacada en muestras de tumores de pacientes con adenocarcinoma de pulmón, que ocurren en ~10 % de todas las muestras de tumores (una tasa similar a otros oncogenes bien caracterizados y supresores de tumores, tales como EGFR y LKB1). El proyecto TCGA ha identificado igualmente mutaciones y deleciones de BRM en diversos tipos de cáncer, incluyendo el de pulmón.

Los conocimientos sobre la orientación terapéutica de los cánceres mutantes SWI/SNF provienen de estudios que demuestran que los complejos SWI/SNF residuales desempeñan un papel en la supervivencia de los cánceres con mutaciones SWI/SNF. En particular, se descubrió una relación letal sintética entre BRM y BRG1, las dos ATPasas del complejo, con lo que la pérdida de una conduce a la dependencia de la otra. Por ejemplo, se demostró que el agotamiento de BRM induce la inhibición del crecimiento en células cancerosas mutantes de BRG1. Adicionalmente, otros estudios han demostrado que las células tumorales deficientes en SNF5 (SNF5 es una subunidad del complejo SWI/SNF) dependen de BRG1. Finalmente, también se ha informado que determinados cánceres que carecen de mutaciones SWI/SNF son sensibles a la inhibición de BRG1 tal como en la leucemia mieloide aguda (AML, por sus siglas en inglés). Por lo tanto, la inhibición de determinadas subunidades de SWI/SNF, incluyendo BRG1 y BRM, presenta oportunidades para el desarrollo de nuevos agentes terapéuticos para el tratamiento de enfermedades humanas, incluyendo los cánceres.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN

La invención se define en las reivindicaciones adjuntas. También, para evitar dudas, cualquier referencia a métodos de tratamiento en los párrafos posteriores de esta descripción debe interpretarse como referencias a los compuestos, composiciones farmacéuticas y medicamentos de la presente invención para uso en un método para el tratamiento del cuerpo humano o animal mediante terapia. Sigue existiendo la necesidad de nuevos tratamientos y terapias para trastornos o enfermedades mediados por BRM y/o mediados por BRG1. La presente divulgación proporciona compuestos, sales farmacéuticamente aceptables de los mismos, composiciones farmacéuticas de los mismos y combinaciones de los mismos, cuyos compuestos son inhibidores de BRM y/o BRG1. La presente divulgación proporciona además un método para tratar trastornos o enfermedades mediados por BRM y/o BRG1, que comprende administrar a un sujeto que lo necesite una cantidad eficaz de un inhibidor de BRM y/o BRG1 (p. ej., compuestos de la presente divulgación).

Un aspecto de la presente divulgación proporciona un compuesto de Fórmula (I) o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en donde R1-R6 son como se definen en esta memoria.

Otro aspecto de la presente divulgación proporciona una composición farmacéutica que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto de Fórmula (I), o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, y uno o más soportes farmacéuticamente aceptables.

En aún otro aspecto de la presente divulgación se proporciona una combinación farmacéutica que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto de Fórmula (I), o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, y uno o más agentes terapéuticamente activos.

En aún otro aspecto de la presente divulgación, se proporciona un método para tratar trastornos o enfermedades mediados por BRM y/o BRG1, que comprende administrar a un sujeto que lo necesite una cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto de Fórmula (I), o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

En aún otro aspecto de la presente divulgación, se proporcionan procedimientos para preparar compuestos de Fórmula (I), o una sal farmacéuticamente aceptable de los mismos.

DESCRIPCIÓN DETALLADA

En el presente documento, se describen diversas realizaciones (enumeradas) de la divulgación. Se reconocerá que las características especificadas en cada una de las realizaciones pueden combinarse con otras características especificadas para proporcionar realizaciones adicionales de la presente divulgación.

Realización 1: Un compuesto de Fórmula (I)

o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en que: R1 se selecciona de hidrógeno, amino y alquilo C^1-2sustituido con hidroxi; R2 es hidrógeno; R3 se selecciona de alquilo C^1-2y alquilo C^1-2sustituido con halo; R4 es hidrógeno; R5 se selecciona de hidrógeno y halo; y R6 se selecciona de hidrógeno y halo.

Realización 2: Un compuesto o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo de acuerdo con la Realización 1, en que: R1 se selecciona de hidrógeno, amino e hidroxi-metilo; R2 es hidrógeno; R3 se selecciona de metilo, difluorometilo y trifluorometilo; R4 es hidrógeno; R5 se selecciona de hidrógeno, cloro y fluoro; y R6 se selecciona de hidrógeno y fluoro. Realización 3: Un compuesto o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo de acuerdo con la Realización 1, seleccionado de:

Realización 4: Una composición farmacéutica, que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto de acuerdo con una cualquiera de las Realizaciones 1 a 3 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, y uno o más soportes farmacéuticamente aceptables.

Realización 5: Una combinación farmacéutica, que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto de acuerdo con una cualquiera de las Realizaciones 1 a 4 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, y uno o más soportes terapéuticamente activos.

Realización 6: Una combinación farmacéutica de acuerdo con la Realización 5, en que dichos uno o más agentes terapéuticamente activos se seleccionan independientemente de agentes anticancerígenos, agentes anti-alérgicos, anti eméticos, analgésicos, inmunomoduladores y agentes citoprotectores.

Realización 7: Un método para tratar un trastorno o enfermedad mediado por BRM y/o BRG1, que comprende administrar a un sujeto que lo necesite una cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto de acuerdo con una cualquiera de las Realizaciones 1 a 27 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

Realización 8: Un método de acuerdo con la Realización 7, en el que dicho trastorno o enfermedad es neoplasia que se caracteriza por deficiencia de BRG1 y/o deficiencia de BRM.

Realización 9: Un método de acuerdo con la Realización 7 u 8, en el que dicho trastorno o enfermedad es neoplasia que se caracteriza por mutación de BRG1 y/o mutación de BRM.

Realización 10: Un método de acuerdo con una cualquiera de las Realizaciones 7-9, en el que dicho trastorno o enfermedad es un tumor sólido, leucemia o linfoma.

Realización 11: Un método de acuerdo con una cualquiera de las Realizaciones 7-10, en el que dicho trastorno o enfermedad se selecciona del grupo que consiste en carcinoma de pulmón de células no pequeñas, adenocarcinoma de pulmón, carcinoma de pulmón, carcinomas de pulmón de células grandes, carcinoma de pulmón de células no pequeñas, carcinoma de células escamosas de pulmón, cáncer de pulmón de células pequeñas, melanoma cutáneo de la piel, melanoma desmoplásico, melanoma uveal, carcinoma de células pequeñas del ovario (tipo hipercalcémico), tumor rabdoide de ovario, carcinoma cutáneo de células escamosas, glioma, carcinosarcoma uterino, carcinoma endometrial del cuerpo uterino, cistoadenocarcinoma seroso de ovario, carcinoma urotelial de vejiga, linfoma primario del sistema nervioso central, carcinoma esofágico, cáncer de vejiga, variante plasmocitoide del cáncer de vejiga, adenocarcinoma de estómago, carcinoma quístico adenoide, neoplasia linfoide, linfoma difuso de células B grandes, cáncer de páncreas, adenocarcinoma colorrectal, colangiocarcinoma, sarcoma, cánceres de cabeza y cuello, cánceres de cuello uterino y endocervicales, meduloblastoma, linfoma cutáneo de células T, carcinoma hepatocelular de hígado, carcinoma de células papilares renales, cáncer de mama, linfoma de células del manto, carcinoma de vesícula biliar, cánceres de células germinales testiculares, carcinoma de células renales de células claras, cáncer de próstata, sarcoma de Ewing pediátrico, timoma, riñón cromófobo, carcinoma renal de células no claras, feocromocitoma y paraganglioma, cánceres de tiroides, tumor maligno de la vaina nerviosa periférica, cáncer de próstata neuroendocrino, carcinoma de células escamosas de cabeza y cuello, carcinoma adrenocortical, carcinoma de cuello uterino y cánceres endocervicales, carcinoma cutáneo de células escamosas, cáncer testicular de células germinales, glioblastoma, glioblastoma multiforme, sarcoma de Ewing, carcinoma de células renales de células claras, neuroblastoma, linfoma difuso de células B grandes, leucemia mieloide aguda, leucemia linfocítica crónica, mieloma múltiple, tumores rabdoides malignos, sarcomas epitelioides, schwannomatosis familiar, carcinomas medulares renales, sarcoma sinovial y meningiomas.

Realización 12: Un método de acuerdo con una cualquiera de las Realizaciones 7-11, en el que dicho trastorno o enfermedad se selecciona del grupo que consiste en carcinoma de pulmón de células no pequeñas, adenocarcinoma de pulmón, carcinoma de pulmón, carcinomas de pulmón de células grandes, carcinoma de pulmón de células no pequeñas, carcinoma de células escamosas de pulmón, cáncer de pulmón de células pequeñas, melanoma cutáneo de la piel, melanoma desmoplásico y melanoma uveal.

Realización 13: Un método de acuerdo con la Realización 7 u 8, en el que dicho trastorno o enfermedad es neoplasia que se caracteriza por deficiencia de BRG1.

Realización 14: Un método de acuerdo con una cualquiera de las Realizaciones 7, 8 o 13, en el que dicho trastorno o enfermedad es neoplasia que se caracteriza por mutación de BRG1.

Realización 15: Un método de acuerdo con una cualquiera de las Realizaciones 7, 8, 13 y 14, en el que dicho trastorno o enfermedad se selecciona del grupo que consiste en carcinoma de pulmón de células no pequeñas, adenocarcinoma de pulmón, carcinoma de pulmón, carcinomas de pulmón de células grandes, carcinoma de pulmón de células no pequeñas, carcinoma de células escamosas de pulmón, cáncer de pulmón de células pequeñas, melanoma cutáneo de la piel, melanoma desmoplásico, melanoma uveal, carcinoma de células pequeñas del ovario, carcinoma cutáneo de células escamosas, glioma, carcinosarcoma uterino, carcinoma endometrial del cuerpo uterino, cistadenocarcinoma seroso de ovario, carcinoma urotelial de vejiga, linfoma primario del sistema nervioso central, carcinoma de esófago, cáncer de vejiga, variante plasmacitoide del cáncer de vejiga, adenocarcinoma de estómago, carcinoma quístico adenoide, neoplasia linfoide, linfoma difuso de células B grandes, cáncer de páncreas, adenocarcinoma colorrectal, colangiocarcinoma, sarcoma, cánceres de cabeza y cuello, cánceres de cuello uterino y endocervical, meduloblastoma, linfoma cutáneo de células T, carcinoma hepatocelular de hígado, carcinoma de células papilares de riñón, cáncer de mama, linfoma de células del manto, carcinoma de vesícula biliar, cánceres de células germinales testiculares, carcinoma de células renales de células claras, cáncer de próstata, sarcoma de ewing pediátrico, timoma, riñón cromófobo, carcinoma renal de células no claras, feocromocitoma y paraganglioma y cánceres de tiroides.

Realización 16: Un método de acuerdo con una cualquiera de las Realizaciones 7, 8 y 13-15, en el que dicho trastorno o enfermedad se selecciona del grupo que consiste en carcinoma de pulmón de células no pequeñas, adenocarcinoma de pulmón, carcinoma de pulmón, carcinomas de pulmón de células grandes, carcinoma de pulmón de células no pequeñas, carcinoma de células escamosas de pulmón, cáncer de pulmón de células pequeñas, melanoma cutáneo de la piel, melanoma desmoplásico y melanoma uveal.

Realización 17: Un método de acuerdo con la Realización 7 u 8, en el que dicho trastorno o enfermedad es neoplasia que se caracteriza por deficiencia de BRM.

Realización 18: Un método de acuerdo con una cualquiera de las Realizaciones 7, 8 y 17, en el que dicho trastorno o enfermedad es neoplasia que se caracteriza por mutación de BRM.

Realización 19: Un método de acuerdo con una cualquiera de las Realizaciones 7, 8 y 17-18, en el que dicho trastorno o enfermedad se selecciona del grupo que consiste en tumor maligno de la vaina de los nervios periféricos, cáncer de próstata neuroendocrino, cáncer de mama, carcinoma urotelial de vejiga, carcinoma adenoide quístico, adenocarcinoma de estómago, carcinomas de mama, cistoadenocarcinoma seroso de ovario, carcinosarcoma uterino, carcinoma de esófago, carcinoma de células escamosas de cabeza y cuello, carcinomas de pulmón de células no pequeñas, adenocarcinoma de pulmón, carcinoma de células escamosas de pulmón, cáncer de pulmón de células pequeñas, cáncer de páncreas, carcinoma adrenocortical, melanoma cutáneo de la piel, sarcoma, adenocarcinoma colorrectal, cánceres de cuello uterino y endocervical, carcinoma hepatocelular hepático, carcinoma cutáneo de células escamosas, cáncer testicular de células germinales, glioblastoma, glioblastoma multiforme, colangiocarcinoma, sarcoma de Ewing, carcinoma de células renales de células claras, neuroblastoma, leucemia mieloide aguda y linfoma difuso de células B. grandes

Realización 20: Un método de acuerdo con una cualquiera de las Realizaciones 7-8 y 17-19, en el que dicho trastorno o enfermedad se selecciona del grupo que consiste en carcinoma de pulmón de células no pequeñas, adenocarcinoma de pulmón, carcinoma de pulmón, carcinomas de pulmón de células grandes, carcinoma de pulmón de células no pequeñas, carcinoma de células escamosas de pulmón, cáncer de pulmón de células pequeñas, melanoma cutáneo de la piel, melanoma desmoplásico y melanoma uveal.

Realización 21: Un método de acuerdo con la Realización 7, en el que dicho trastorno o enfermedad es neoplasia que se caracteriza por mutaciones en subunidades de SWI/SNF distintas de BRM o BRG1.

Realización 22: Un método de acuerdo con la Realización 7 o 21, en el que dicho trastorno o enfermedad es un tumor sólido, leucemia o linfoma.

Realización 23: Un método de acuerdo con una cualquiera de las Realizaciones 7, 21 y 22, en el que dicho trastorno o enfermedad se selecciona del grupo que consiste en tumores rabdoides malignos (caracterizados por deficiencia en SNF5/SMARCB1), sarcomas epitelioides, schwannomatosis familiar, carcinomas medulares renales, sarcomas de Ewing, sarcoma sinovial, carcinoma endometrial del cuerpo uterino, adenocarcinoma de estómago, carcinoma urotelial de vejiga, cáncer de vejiga, carcinoma quístico adenoide, colangiocarcinoma, melanoma desmoplásico, carcinoma cutáneo de células escamosas, cáncer de páncreas, carcinoma hepatocelular hepático, melanoma, linfoma de células B grandes difusas, cáncer de mama, cáncer colorrectal, carcinoma de células claras de ovario, neuroblastoma, carcinoma de esófago, cáncer de pulmón, carcinoma renal de células claras de riñón, mesotelioma, carcinoma adenoide quístico de mama, carcinoma adenoide quístico, cáncer de tiroides, meningiomas, melanomas uveales y leucemias mieloides agudas.

Realización 24: Un método de acuerdo con una cualquiera de las Realizaciones 7, 21, 22 y 23, en el que dicho trastorno o enfermedad se selecciona del grupo que consiste en tumores rabdoides malignos, cánceres de mama, cánceres de páncreas, cánceres de ovario, carcinomas de células claras de ovario, cánceres de vejiga, carcinomas renales de células claras, cáncer colorrectal, cánceres gástricos, cáncer de hígado, melanoma, glioma, leucemia mieloide aguda y cánceres de pulmón.

Realización 25: Un compuesto de acuerdo con una cualquiera de las Realizaciones 1-3, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, para uso como un medicamento.

Otras características de la presente divulgación resultarán evidentes en el curso de las descripciones anteriores de realizaciones ejemplares que se dan para ilustrar la divulgación y no pretenden ser limitantes de la misma.

DEFINICIONES

A los efectos de interpretar esta memoria descriptiva, se aplicarán las siguientes definiciones y, cuando corresponda, las expresiones y los términos utilizados en singular también incluirán el plural. Los términos y las expresiones utilizados en la memoria descriptiva tienen los siguientes significados, a menos que el contexto indique claramente lo contrario.

Todos los métodos descritos en esta memoria se pueden realizar en cualquier orden adecuado, a menos que se indique lo contrario en esta memoria o que el contexto lo contradiga claramente. El uso de cualquiera y todos los ejemplos, o lenguaje ilustrativo (p. ej., "tal como") proporcionado en esta memoria pretende simplemente ilustrar mejor la presente divulgación y no supone una limitación en el alcance de la presente divulgación reivindicada de otro modo.

El término "un", "una", "el" y "la" y términos similares utilizados en el contexto de la presente divulgación (especialmente en el contexto de las reivindicaciones) deben interpretarse para cubrir tanto el singular como el plural a menos que se indique lo contrario en esta memoria o se contradiga claramente por el contexto.

Tal como se utiliza en esta memoria, el término "alquilo" se refiere a un radical hidrocarbonado de fórmula general CnH²n⁺¹. El radical alcano puede ser lineal o ramificado. Por ejemplo, el término "alquilo C¹-C⁶" o "alquilo C¹a C6" se refiere a un grupo alifático monovalente, lineal o ramificado, que contiene 1 a 6 átomos de carbono (p. ej., metilo, etilo, n-propilo, ipropilo, n-butilo, i-butilo, s-butilo, t-butilo, n-pentilo, 1 -metilbutilo, 2-metilbutilo, 3-metilbutilo, neopentilo, 3,3-dimetilpropilo, hexilo, 2-metilpentilo, y similares). Cuando un alquilo está sustituido con uno o más sustituyentes, los sustituyentes pueden estar sustituidos en cualquier átomo de carbono del alquilo.

"Halógeno" o "halo" puede ser flúor, cloro, bromo o yodo (los halógenos preferidos como sustituyentes son flúor y cloro).

Se pretende que "haloalquilo" incluya grupos hidrocarbonados alifáticos saturados, tanto de cadena lineal como ramificada, que tengan el número especificado de átomos de carbono, sustituidos con uno o más halógenos. Por lo tanto, "haloalquilo C¹-C⁶" o "haloalquilo C¹a C6" pretende incluir, pero no se limita a fluorometilo, difluorometilo, trifluorometilo, triclorometilo, pentafluoroetilo, pentacloroetilo, 2,2,2-trifluoroetilo, heptafluoropropilo y heptacloropropilo.

Como se menciona en esta memoria, el término "sustituido" significa que al menos un átomo de hidrógeno se reemplaza por un grupo que no es hidrógeno, con la condición de que se mantengan las valencias normales y que la sustitución dé como resultado un compuesto estable. Cuando un sustituyente es ceto (es decir, = O), entonces se reemplazan 2 hidrógenos en el átomo. Los sustituyentes ceto no están presentes en los restos aromáticos.

La expresión "farmacéuticamente aceptable" indica que la sustancia o composición debe ser compatible desde un punto de vista químico y/o toxicológico con los otros ingredientes que comprende una formulación, y/o el mamífero que está siendo tratado con ella.

A menos que se especifique lo contrario, la expresión "compuestos de la presente divulgación" se refiere a compuestos de Fórmula (I), así como a isómeros, tales como estereoisómeros (incluyendo diastereoisómeros, enantiómeros y racematos), isómeros geométricos, isómeros conformacionales (incluyendo rotámeros y atropisómeros), tautómeros, compuestos marcados isotópicamente (incluyendo sustituciones de deuterio) y restos formados inherentemente (p. ej., polimorfos, solvatos y/o hidratos). Cuando está presente un resto que es capaz de formar una sal, entonces se incluyen también las sales, en particular sales farmacéuticamente aceptables.

Dependiendo de las condiciones del procedimiento, los productos finales de la presente divulgación se obtienen en forma libre (neutra) o de sal. Tanto la forma libre como las sales de estos productos finales están dentro del alcance de la presente divulgación. Si se desea, una forma de un compuesto se puede convertir en otra forma. Una base o un ácido libre se pueden convertir en una sal; una sal se puede convertir en el compuesto libre o en otra sal; una mezcla de compuestos isoméricos de la presente divulgación se puede separar en los isómeros individuales.

Se prefieren las sales farmacéuticamente aceptables. Sin embargo, otras sales pueden ser útiles, p. ej., en etapas de aislamiento o purificación que se pueden emplear durante la preparación y, por lo tanto, se contemplan dentro del alcance de la presente divulgación.

Tal como se utiliza en esta memoria, "sales farmacéuticamente aceptables" se refiere a derivados de los compuestos descritos en los que el compuesto original se modifica haciendo sales ácidas o básicas del mismo. Por ejemplo, sales farmacéuticamente aceptables incluyen, pero no se limitan a forma de sal ascorbato, adipato, aspartato, benzoato, besilato, bromuro/bromhidrato, bicarbonato/carbonato, bisulfato/sulfato, canforsulfonato, caprato, cloruro/clorhidrato, clorteofilonato, citrato, etandisulfonato, fumarato, gluceptato, gluconato, glucuronato, glutamato, glutarato, glicolato, hipurato, hidroyoduro/yoduro, isetionato, lactato, lactobionato, laurilsulfato, malato, maleato, malonato/hidroximalonato, mandelato, mesilato, metilsulfato, nafatoato, nafatoato metílico, nicotinato, nitrato, octadecanoato, oleato, oxalato, palmitato, pamoato, fenilacetato, fosfato/hidrógeno-fosfato/dihidrógeno-fosfato, poligalacturonato, propionato, salicilatos, estearato, succinato, sulfamato, sulfosalicilato, tartrato, tosilato, sal de trifluoroacetato o xinafoato.

Se pueden formar sales por adición de ácidos farmacéuticamente aceptables con ácidos inorgánicos y ácidos orgánicos. Los ácidos inorgánicos a partir de los cuales se pueden obtener sales incluyen, por ejemplo, ácido clorhídrico, ácido bromhídrico, ácido sulfúrico, ácido nítrico, ácido fosfórico y similares. Los ácidos orgánicos a partir de los cuales se pueden obtener sales incluyen, por ejemplo, ácido acético, ácido propiónico, ácido glicólico, ácido oxálico, ácido maleico, ácido malónico, ácido succínico, ácido fumárico, ácido tartárico, ácido cítrico, ácido benzoico, ácido mandélico, ácido metanosulfónico, ácido etanosulfónico, ácido toluenosulfónico, ácido sulfosalicílico y similares.

Sales por adición de bases farmacéuticamente aceptables se pueden formar con bases inorgánicas y orgánicas. Bases inorgánicas de las que se pueden derivar sales incluyen, por ejemplo, sales de amonio y metales de las columnas I a XII de la Tabla Periódica. En determinadas realizaciones, las sales se derivan de sodio, potasio, amonio, calcio, magnesio, hierro, plata, zinc y cobre; sales particularmente adecuadas incluyen sales de amonio, potasio, sodio, calcio y magnesio. Las bases orgánicas a partir de las cuales pueden obtenerse sales incluyen, por ejemplo, aminas primarias, secundarias y terciarias, aminas sustituidas que incluyen aminas sustituidas de origen natural, aminas cíclicas, resinas de intercambio iónico básicas y similares. Algunas aminas orgánicas incluyen isopropilamina, benzatina, colinato, dietanolamina, dietilamina, lisina, meglumina, piperazina y trometamina.

Las sales farmacéuticamente aceptables de la presente divulgación se pueden sintetizar a partir del compuesto original que contiene un resto de carácter básico o ácido mediante métodos químicos convencionales. Generalmente, sales de este tipo se pueden preparar haciendo reaccionar las formas de ácido o base libres de estos compuestos con una cantidad estequiométrica de la base o el ácido apropiado en agua o en un disolvente orgánico, o en una mezcla de los dos; generalmente, se prefieren medios no acuosos tales como éter, acetato de etilo, etanol, isopropanol o acetonitrilo. Listas de sales adecuadas se encuentran en Allen, L.V., Jr., ed., Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 22a Edición, Pharmaceutical Press, Londres, Reino Unido (2012).

Compuestos de la presente divulgación que contienen grupos capaces de actuar como donantes y/o aceptores de enlaces hidrógeno pueden ser capaces de formar co-cristales con formadores de co-cristales adecuados. Estos co-cristales se pueden preparar a partir de compuestos de la presente divulgación mediante procedimientos de formación de co-cristales conocidos. Procedimientos de este tipo incluyen molienda, calentamiento, sublimación conjunta, fusión conjunta o contacto en solución de los compuestos de la presente divulgación con el formador de co-cristales en condiciones de cristalización y el aislamiento de los co-cristales así formados. Formadores de co-cristales adecuados incluyen los descritos en el documento WO 2004/078163. Por lo tanto, la presente divulgación proporciona, además, co-cristales que comprenden un compuesto de la presente divulgación.

Cualquier fórmula dada en esta memoria también pretende representar formas no marcadas, así como formas isotópicamente marcadas de los compuestos. Compuestos marcados isotópicamente tienen estructuras representadas por las fórmulas dadas en esta memoria, excepto que uno o más átomos se reemplazan por un átomo que tiene una masa atómica o un número de masa seleccionados. Ejemplos de isótopos que se pueden incorporar en compuestos de la presente divulgación incluyen isótopos de hidrógeno, carbono, nitrógeno, oxígeno, fósforo, flúor, cloro y yodo, tales como 2H, 3H, 11C, 13C, 14C, 15N, 18F 31P, 32P, 35S, 36Cl, 123I , 124I , 125I, respectivamente. La presente compuestos marcados isotópicamente como se define en esta memoria, por ejemplo, aquellos en los que están presentes isótopos radiactivos, tales como 3H y 14C, o aquellos en los que están presentes isótopos no radiactivos, tales como 2H y

13C. Compuestos marcados isotópicamente de este tipo son útiles en estudios metabólicos (con 14C), estudios cinéticos de reacción (con, por ejemplo, 2H o 3H), técnicas de detección o formación de imágenes tales como la tomografía por emisión de positrones (PET, por sus siglas en inglés) o la tomografía computarizada por emisión de fotón único (SPECt , por sus siglas en inglés), incluyendo los ensayos de distribución tisular de fármacos o sustratos, o en el tratamiento radiactivo de pacientes. En particular, un compuesto marcado o 18F puede ser particularmente deseable para estudios de PET o SPECT.

Además, la sustitución con isótopos más pesados, particularmente deuterio (es decir, 2H o D) puede proporcionar determinadas ventajas terapéuticas que resultan de una mayor estabilidad metabólica, por ejemplo, una semivida in vivo incrementada o requisitos de dosificación reducidos o una mejora en el índice terapéutico. Se entiende que el deuterio en este contexto se considera un sustituyente de un compuesto de la presente divulgación. La concentración de un isótopo más pesado de este tipo, específicamente el deuterio, puede definirse por el factor de enriquecimiento isotópico. Tal como se utiliza en esta memoria, la expresión "factor de enriquecimiento isotópico" se refiere a la relación entre la abundancia isotópica y la abundancia natural de un isótopo especificado. Si un sustituyente en un compuesto de esta divulgación se denomina deuterio, dicho compuesto tiene un factor de enriquecimiento isotópico para cada uno de los átomos de deuterio designados de al menos 3500 (52,5 % de incorporación de deuterio en cada uno de los átomos de deuterio designados), al menos 4000 (60 % de incorporación de deuterio), al menos 4500 (67,5 % de incorporación de deuterio), al menos 5000 (75 % de incorporación de deuterio), al menos 5500 (82,5 % de incorporación de deuterio), al menos 6000 (90 % de incorporación de deuterio), al menos 6333,3 (95 % de incorporación de deuterio), al menos 6466,7

(97 % de incorporación de deuterio), al menos 6600 (99 % de incorporación de deuterio) o al menos 6633,3 (99,5 % de incorporación de deuterio).

Por ejemplo, un compuesto deuterado puede ser:

Compuestos marcados con isótopos de esta presente divulgación se pueden preparar generalmente mediante técnicas convencionales conocidas por los expertos en la técnica o mediante procedimientos descritos en los esquemas o en los ejemplos y preparaciones descritos más adelante (o procedimientos análogos a los descritos en esta memoria), sustituyendo un reactivo apropiado o marcado isotópicamente fácilmente disponible para un reactivo no marcado isotópicamente empleado de otro modo. Compuestos de este tipo tienen una diversidad de usos potenciales, p. ej., como patrones y reactivos para determinar la capacidad de un compuesto farmacéutico potencial para unirse a proteínas o receptores diana, o para formar imágenes de compuestos de esta divulgación unidos a receptores biológicos in vivo o in vitro.

El término "solvato" significa una asociación física de un compuesto de esta divulgación con una o más moléculas de disolvente, ya sean orgánicas o inorgánicas. La asociación física incluye puentes de hidrógeno. En determinados casos, el solvato será capaz de ser aislado, por ejemplo, cuando una o más moléculas de disolvente se incorporen a la red cristalina del sólido cristalino. Las moléculas de disolvente en el solvato pueden estar presentes en una disposición regular y/o una disposición no ordenada. El solvato puede comprender una cantidad estequiométrica o no estequiométrica de las moléculas de disolvente. El término "solvato" engloba tanto solvatos aislables como en fase de solución. Solvatos a modo de ejemplo incluyen, pero no se limitan a hidratos, etanolatos, metanolatos e isopropanolatos. Métodos de solvatación son generalmente conocidos en la técnica.

Tal como se utiliza en la presente, el término "polimorfo(s)" se refiere a forma(s) cristalina(s) que tiene(n) la misma estructura/composición química pero diferentes disposiciones espaciales de las moléculas y/o iones que forman los cristales. Compuestos de la presente divulgación se pueden proporcionar como sólidos amorfos o sólidos cristalinos.

Puede emplearse la liofilización para proporcionar los compuestos de la presente divulgación en forma de un sólido.

"BRM" y "BRG1" se refieren a dos parálogos de la subunidad ATPasa en el complejo SWI/SNF, también conocidos como SMARCA2 y SMARCA4, respectivamente. A menos que se indique específicamente lo contrario, BRM, tal como se utiliza en esta memoria, se refiere a BRM humano (Entrez Gene 6595), cuya secuencia de proteína tiene el número de acceso Swiss-Prot P51531.2; y BRG1, tal como se utiliza en esta memoria, se refiere a BRG1 humano (Entrez Gene 6597), cuya secuencia de proteína tiene el número de acceso Swiss-Prot P51532.2. BRM, BRG1 y el complejo SWI/SNF se describen en detalle en revisiones tales como Wilson, BG, et al. Nat Rev Cancer. 9 de junio de 2011;11(7):481-92. La secuencia genómica de BRG1 (SMARCA4) tiene la secuencia de referencia de NCBI: N^g_011556.1; sus ARNm resultan de una diversidad de formas de corte y empalme (es decir, variantes de transcripción), incluyendo los números de Referencia de NCBI NM_001128844.1, NM_001 128849.1, NM_001 128845.1, NM_001128846.1, NM_001 128847.1, NM_001128848.1 y NM_003072.3. La secuencia genómica de BRM (SMARCA2) tiene la secuencia de referencia de NCBI: NC_000009.11, sus ARNm son resultado de dos formas de corte y empalme (es decir, variantes de transcritos), incluyendo los números de referencia de NCBI NM_003070.3 y NM_139045.2.

La expresión "trastorno o enfermedad mediado por BRM" se refiere a cualquier trastorno o enfermedad que esté directa o indirectamente regulado por BRM. La expresión "trastorno o enfermedad mediado por BRG1" se refiere a cualquier trastorno o enfermedad que esté directa o indirectamente regulado por BRG1. Un trastorno o una enfermedad mediado por BRM o BRG1 puede caracterizarse por deficiencia de BRG1 y/o deficiencia de BRM. Un trastorno o una enfermedad mediado por BRM o mediado por BRG1 puede caracterizarse por mutaciones en subunidades SWI/SNF distintas de BRM/SMARCA2 o BRG1/SMARCA4, p. ej., mutaciones en ARID1A, ARID1B, ARID2, PBRM1, SMARCB1/SNF5, SMARCE1, SMARCC1, SMARCC2, PHF10, DPF1, DPF3, DPF2, ACTL6A, ACTL6B, SMARCD2, SMARCD3, SMARCD1, BCL11A, BCL11B, BCL7A, BCL7B, BCL7C, BRD9, BRD7, SS18 y ACTB. Un trastorno o una enfermedad mediado por BRM o mediado por BRG1 puede caracterizarse por la dependencia de BRM, BRG1 u otras subunidades SWI/SNF como se ha descrito arriba, en que dicha dependencia no está relacionada con mutaciones de BRM, BRG1 u otras subunidades SWI/SNF.

Las expresiones "deficiente en BRG1" y "deficiente en BRG1" se refieren a células (incluyendo, pero no limitadas a células cancerosas, líneas celulares, tejidos, tipos de tejidos, tumores, etc.) que tienen mutación o deleción del gen BRG1, o que tienen una reducción significativa en la producción, expresión, nivel, estabilidad y/o actividad de BRG1 con respecto a la de un control, p. ej., células de referencia o normales o no cancerosas. La reducción puede ser de al menos aproximadamente un 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 % o 90 %. En algunas realizaciones, la reducción es de al menos un 20 %. En algunas realizaciones, la reducción es de al menos un 50 %. Mutaciones en el gen BRG1 que conducen a la pérdida de la función en las que las mutaciones pueden ser del tipo de inserciones/deleciones sin sentido que dan como resultado un cambio de marco o mutaciones con cambio de sentido. Las células deficientes en BRG1 incluyen aquellas en las que el gen BRG1 ha sido mutado o eliminado.

Las expresiones "deficiente en BRM" y "deficiencia en BRM" se refieren a células (incluyendo, pero no limitadas a células cancerosas, líneas celulares, tejidos, tipos de tejidos, tumores, etc.) que tienen una mutación con pérdida de función ("LOF", por sus siglas en inglés) o deleción del gen BRM, o que tienen una reducción significativa en la producción, expresión, nivel, estabilidad y/o actividad de BRM con respecto a la de un control, p. ej., células de referencia o normales o no cancerosas. La reducción puede ser de al menos aproximadamente un 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 % o 90 %. En algunas realizaciones, la reducción es de al menos un 20 %. En algunas realizaciones, la reducción es de al menos un 50 %. Las células deficientes en BRM incluyen aquellas en las que el gen BRM ha sido mutado o eliminado.

La expresión "trastorno o enfermedad relacionada con la deficiencia en BRG1" o "trastorno o enfermedad caracterizados por la deficiencia en BRG1" se refiere a un trastorno o enfermedad en el que las células son deficientes en BRG1. Por ejemplo, en una enfermedad o trastorno relacionado con la deficiencia en BRG1, una o más células de la enfermedad pueden tener una mutación o deleción del gen BRG1, o pueden tener una reducción significativa en la producción, expresión, nivel, estabilidad y/o actividad de BRG1. En un paciente afectado por un trastorno o una enfermedad relacionado con la deficiencia en BRG1, es posible que algunas células de la enfermedad (p. ej., células cancerosas) puedan ser deficientes en BRG1 mientras que otras no lo son.

La expresión "trastorno o enfermedad relacionada con la deficiencia en BRM" o "trastorno o enfermedad caracterizados por la deficiencia en BRM" se refiere a un trastorno o enfermedad en el que las células son deficientes en BRM. Por ejemplo, en un trastorno o enfermedad relacionado con la deficiencia en BRM, una o más células de la enfermedad pueden tener una mutación o deleción del gen BRM, o pueden tener una reducción significativa en la producción, expresión, nivel, estabilidad y/o actividad de BRM. En un paciente afectado por un trastorno o una enfermedad relacionado con la deficiencia en BRM, es posible que algunas células de la enfermedad (p. ej., células cancerosas) puedan ser deficientes en BRM mientras que otras no lo son.

El término "neoplasia", también denominada cáncer, se refiere a enfermedades en las que las células anormales se dividen sin control y pueden invadir tejidos cercanos. Las células malignas también pueden diseminarse a otras partes del cuerpo a través de los sistemas sanguíneo y linfático. Existen varios tipos principales de neoplasia. El carcinoma es una neoplasia que comienza en la piel o en los tejidos que revisten o cubren los órganos internos. El sarcoma es una neoplasia que comienza en el hueso, el cartílago, la grasa, el músculo, los vasos sanguíneos u otro tejido conjuntivo o de soporte.

La leucemia es una neoplasia maligna que comienza en el tejido que forma la sangre, tal como la médula ósea, y hace que se produzcan grandes cantidades de células de la sangre anormales y penetren en la sangre. El linfoma y el mieloma múltiple son tumores malignos que comienzan en las células del sistema inmunitario. Los cánceres del sistema nervioso central son tumores malignos que comienzan en los tejidos del cerebro y la médula espinal.

La expresión "tumor sólido" se refiere a neoplasias/cánceres formados por masas anormales de tejido que habitualmente no contienen quistes o zonas líquidas. Los tumores sólidos se nombran/clasifican de acuerdo con el tejido/células de origen. Ejemplos incluyen, pero no se limitan a sarcomas y carcinomas.

El término "leucemia" se refiere a neoplasias/cánceres hematológicos o de células de la sangre que comienzan en el tejido que forma la sangre, tal como la médula ósea. Ejemplos incluyen, pero no se limitan a leucemia mieloide aguda (AML, por sus siglas en inglés), leucemia mieloide crónica (CML, por sus siglas en inglés), leucemia linfocítica aguda (ALL, por sus siglas en inglés) y leucemia linfocítica crónica (CLL, por sus siglas en inglés).

El término "linfoma" se refiere a neoplasias/cánceres de células linfáticas que comienzan en las células del sistema inmunitario. Ejemplos incluyen, pero no se limitan a linfoma no Hodgkin y mieloma múltiple.

Tal como se utiliza en esta memoria, el término "paciente" engloba todas las especies de mamíferos.

Tal como se utiliza en esta memoria, el término "sujeto" se refiere a un animal. Típicamente el animal es un mamífero. Un sujeto también se refiere, por ejemplo, a primates (p. ej., seres humanos), vacas, ovejas, cabras, caballos, perros, gatos, conejos, ratas, ratones, peces, pájaros y similares. En determinadas realizaciones, el sujeto es un primate. En aún otras realizaciones, el sujeto es un ser humano. Sujetos ejemplares incluyen seres humanos de cualquier edad con factores de riesgo para enfermedad cancerosa.

Tal como se utiliza en esta memoria, un sujeto "necesita" un tratamiento si dicho sujeto se beneficiaría, desde un punto de vista biológico, médico o en su calidad de vida, de un tratamiento de este tipo (preferiblemente, un ser humano).

Tal como se utiliza en esta memoria, el término "inhibir", "inhibición" o la expresión "que inhibe" se refiere a la reducción o supresión de una afección, síntoma o trastorno o enfermedad dados, o a una disminución significativa de la actividad de referencia de una actividad o proceso biológico.

Tal como se utiliza en esta memoria, el término "tratar", "tratando" o "tratamiento" de cualquier enfermedad/trastorno se refiere al tratamiento de la enfermedad/trastorno en un mamífero, particularmente en un ser humano, e incluye: (a) mejorar la enfermedad/trastorno (es decir, retardar o detener o reducir el desarrollo de la enfermedad/trastorno, o al menos uno de los síntomas clínicos del mismo); (b) aliviar o modular la enfermedad/trastorno (es decir, provocar la regresión de la enfermedad/trastorno) , ya sea físicamente (p. ej., la estabilización de un síntoma perceptible), fisiológicamente (p. Ej., la estabilización de un parámetro físico), o ambos); (c) aliviar o mejorar al menos un parámetro físico, incluyendo aquellos que pueden no ser discernibles por el sujeto; y/o (d) prevenir o retrasar la aparición o el desarrollo o la progresión de la enfermedad o el trastorno en un mamífero, en particular, cuando dicho mamífero está predispuesto a la enfermedad o trastorno pero aún no se le ha diagnosticado que lo tenga.

La expresión "una cantidad terapéuticamente eficaz" de un compuesto de la presente divulgación se refiere a una cantidad del compuesto de la presente divulgación que provocará la respuesta biológica o médica de un sujeto, por ejemplo, la reducción o inhibición de una enzima o una actividad de la proteína, o mejorar los síntomas, aliviar afecciones, ralentizar o retrasar la progresión de la enfermedad, o prevenir una enfermedad, etc. En una realización no limitante, la expresión "una cantidad terapéuticamente eficaz" se refiere a la cantidad del compuesto de la presente divulgación que, cuando se administra a un sujeto, es eficaz para (1) aliviar, inhibir, prevenir y/o mejorar al menos parcialmente una afección, o un trastorno o una enfermedad mediado por BRM y/o BRG1; o (2) reduciendo o inhibiendo la actividad de BRM y/o BRG1.

En otra realización no limitativa, la expresión "una cantidad terapéuticamente eficaz" se refiere a la cantidad del compuesto de la presente divulgación que, cuando se administra a una célula, o un tejido, o un material biológico no celular o un medio, es eficaz para reducir o inhibir al menos parcialmente la actividad de BRM y/o BRG1; o reducir o inhibir al menos parcialmente la expresión de BRM y/o BRG1.

La cantidad eficaz puede variar dependiendo de factores tales como el tamaño y el peso del sujeto, el tipo de enfermedad o el compuesto particular de la presente divulgación. Una persona con experiencia ordinaria en la técnica sería capaz de estudiar los factores contenidos en esta memoria y hacer la determinación con respecto a la cantidad eficaz de los compuestos de la presente divulgación sin una experimentación excesiva.

El régimen de administración puede afectar a lo que constituye una cantidad eficaz. El compuesto de la presente divulgación se puede administrar al sujeto antes o después del inicio de una afección mediada por BRM y/o BRG1. Además, se pueden administrar varias dosis divididas, así como también dosis escalonadas, a diario o de manera secuencial, o la dosis se puede infundir de forma continuada, o puede ser una inyección en bolo. Además, las dosis del (de los) compuesto(s) de la presente divulgación se pueden aumentar o disminuir proporcionalmente de acuerdo con lo indiquen las exigencias de la situación terapéutica o profiláctica.

PREPARACIÓN DE COMPUESTOS

Los compuestos de la presente divulgación se pueden preparar de un cierto número de maneras conocidas por los expertos en la técnica de la síntesis orgánica a la vista de los métodos, esquemas de reacción y ejemplos proporcionados en esta memoria. Los compuestos de la presente divulgación se pueden sintetizar utilizando los métodos descritos más adelante, junto con métodos de síntesis conocidos en la técnica de la química orgánica sintética, o mediante variaciones de los mismos, como apreciarán los expertos en la técnica. Los métodos preferidos incluyen, pero no se limitan a los descritos más adelante. Las reacciones se llevan a cabo en un disolvente o mezcla de disolvente apropiados para los reactivos y materiales empleados y adecuados para las transformaciones que se están llevando a cabo. Los expertos en la técnica de la síntesis orgánica entenderán que la funcionalidad presente en la molécula debería ser coherente con las transformaciones propuestas. Esto requerirá a veces un juicio para modificar el orden de las etapas de síntesis o seleccionar un esquema de proceso particular sobre otro con el fin de obtener un compuesto deseado de la divulgación.

Los materiales de partida están disponibles generalmente de fuentes comerciales tales como Sigma Aldrich u otros proveedores comerciales, o se preparan como se describe en esta divulgación, o se preparan fácilmente utilizando métodos bien conocidos por los expertos en la técnica (p. ej., preparados por métodos generalmente descritos en Louis F. Fieser y Mary Fieser, Reagents for Organic Synthesis, v. 1-19, Wiley, Nueva York (1967-1999 ed.), Larock, R.C., Comprehensive Organic Transformations, 2a ed., Wiley-VCH Weinheim, Alemania (1999), o Beilsteins Handbuch der organischen Chemie, 4a ed. Springer-Verlag, Berlin, incluyendo suplementos (también disponibles a través de la base de datos en línea de Beilstein)).

Con fines ilustrativos, los esquemas de reacción que se muestran más adelante proporcionan vías potenciales para sintetizar los compuestos de la presente divulgación, así como compuestos intermedios clave. Para consultar una descripción más detallada de las etapas de reacción individuales, véase la sección de Ejemplos que figura más adelante. Los expertos en la técnica apreciarán que se pueden usar otras vías de síntesis para sintetizar los compuestos de la invención. Aunque los materiales de partida y reactivos específicos se representan en los esquemas y se analizan más adelante, se pueden sustituir por otros materiales de partida y reactivos para proporcionar diversos derivados y/o condiciones de reacción. Además, muchos de los compuestos preparados por los métodos descritos más adelante se pueden modificar adicionalmente tras la lectura de esta divulgación utilizando química convencional muy conocida por los expertos en la técnica.

En la preparación de los compuestos de la presente divulgación, puede ser necesaria la protección de la funcionalidad remota de los compuestos intermedios. La necesidad de una protección de este tipo variará dependiendo de la naturaleza de la funcionalidad remota y las condiciones de los métodos de preparación. Un experto en la técnica puede determinar fácilmente si se necesita una protección de este tipo. Para una descripción general de los grupos protectores y su uso, véase Greene, T.W. et al., Protecting Groups in Organic Synthesis, 4a Ed., Wiley (2007). Grupos protectores incorporados en la preparación de los compuestos de la presente divulgación, tales como el grupo protector tritilo, pueden mostrarse como un regioisómero pero también pueden existir como una mezcla de regioisómeros.

Las siguientes abreviaturas utilizadas en la presente a continuación tienen los significados correspondientes: (app) aparente; (br) ancho; (BSA) albúmina de suero bovino; (d) doblete; (dd) doblete de dobletes; (DCM) diclorometano; (DIPEA) diisopropiletilamina; (DMF) N,N-dimetilformamida; (DMSO) dimetilsulfóxido; (ESI) ionización por electropulverización; (Et) etilo; (EtOAc) acetato de etilo; (h) hora(s); (HPLC) cromatografía líquida de alta presión; (LAH) hidruro de litio y aluminio; (LCMS) cromatografía de líquidos y espectrometría de masas; (LHMDS) hexametildisilazida de litio; (MTBE) Metil tercbutil éter; (MeCN) acetonitrilo; (MeOH) metanol; (MHz) megahercios; (MS) espectrometría de masas; (m) multiplete; (mg) miligramo; (min) minutos; (mL) mililitro; (mmol) milimoles; (m/z) relación masa/carga; (RMN) resonancia magnética nuclear; (Ph) fenilo; (ppm) partes por millón; (q) cuartete; (Rt) tiempo de retención; (TA) temperatura ambiente; (s) singlete; (t) triplete; (TBDM^s) t-butildimetilsililo; (terc.) terciario; (TFA) ácido trifluoroacético; (THF) tetrahidrofurano; (TMAF) fluoruro de tetrametilamonio: (TMS) trimetilsililo.

Métodos LC/MS Empleados en la Caracterización de Ejemplos

Los datos de LC/MS se registraron utilizando sistemas Agilent 1100 HPLC con Waters Micromass ZQ o Waters ACQUITY UPLC con detector Waters SQ o con detector Waters 25 ACQUITY Qda. Los métodos utilizados para adquirir todos los datos de LCMS se describen a continuación.

Método LCMS 1

Método LCMS 2

Método LCMS 3

Método LCMS 4

RMN Empleada en la Caracterización de Ejemplos

Los espectros de 1H RMN se obtuvieron con espectrómetros con transformada de Fourier Bruker que funcionaban a las siguientes frecuencias: 1H RMN: 400 MHz (Bruker). Los datos de los espectros se presentan en el siguiente formato: desplazamiento químico (multiplicidad, número de hidrógenos). Los desplazamientos químicos se especifican en ppm campo abajo de un patrón interno de tetrametilsilano (unidades 5, tetrametilsilano = 0 ppm) y/o se refieren a los picos de disolvente, que en los espectros de 1H RMN aparecen a 2,50 ppm para CDsSOCDs, 3,31 ppm para CD³OD, 1,94 ppm para CD³CN, 4,79 ppm para D²O, 5,32 ppm para CD²O ²y 7,26 ppm para CDCb.

Métodos Empleados en la Purificación de los Ejemplos

La purificación de los productos intermedios y finales se llevó a cabo mediante cromatografía de fase inversa normal o cromatografía de fluidos supercríticos (SFC, por sus siglas en inglés). La cromatografía de fase normal se llevó a cabo utilizando cartuchos de SiO²pre-envasados (p. ej., columnas RediSep® Rf de Teledyne Isco, Inc.) eluyendo con gradientes de sistemas disolventes apropiados (p. ej., heptano y acetato de etilo; DCM y MeOH; o a menos que se indique lo contrario). La HPLC preparativa en fase inversa se llevó a cabo utilizando los métodos que se describen a continuación:

(1) Método básico: Columna XBridge 5 |jm, NH⁴OH 5 mM en acetonitrilo y agua.

(2) Método de ácido fórmico: Columna XBridge 5 jm ; ácido fórmico al 0,1 % en acetonitrilo y agua.

Los métodos de HPLC anteriores ejecutan un gradiente enfocado de 15 % de acetonitrilo a 40 % de acetonitrilo.

ESQUEMAS DE SÍNTESIS GENERALES

Los Esquemas 1 y 2 (que se muestran más adelante) describen vías potenciales para preparar los compuestos de la presente divulgación que incluyen compuestos de Fórmula (I), en donde R1-R6 son como se definen en el Sumario de la Invención. Los materiales de partida para el siguiente esquema de reacción están disponibles comercialmente o se pueden preparar de acuerdo con métodos conocidos por los expertos en la técnica o mediante métodos descritos en esta memoria. Compuestos de Fórmula (I) se pueden preparar en esencia ópticamente puros utilizando material de partida en esencia ópticamente puro o mediante cromatografía de separación, recristalización u otras técnicas de separación bien conocidas en la técnica. Para consultar una descripción más detallada, remítase a la sección de Ejemplos más adelante.

La etapa (a) implica la reacción de cloroformiato de fenilo (no) sustituido (por ejemplo, R puede ser H o un grupo nitro) y 4-aminopiridina (no) sustituida en un disolvente adecuado tal como DCM o dioxano con una base adecuada tal como piridina a una temperatura adecuada tal como TA.

La etapa (b) implica la reacción de 5-aminoisotiazol sustituido (o 3-aminobenzotiazoles sustituidos) y el compuesto intermedio carbamato obtenido en la Etapa (a) en un disolvente adecuado tal como THF o dioxano con una base adecuada tal como diisopropiletilamina, a una temperatura adecuada tal como 60 °C. Alternativamente, el 5-aminoisotiazol sustituido (o los 3-aminobenzotiazoles sustituidos) pueden desprotonarse primero con una base adecuada tal como LHMDS, seguido de reacción con el compuesto intermedio carbamato obtenido en la Etapa (a). Después de la formación de la urea, los grupos R1-R6 pueden sufrir transformaciones adicionales de acuerdo con sea necesario para proporcionar los productos deseados.

Scheme 2

La formación del producto de urea implica la reacción de 4-aminopiridina (no) sustituida con trifosgeno, seguido de 5-aminoisotiazol sustituido, en un disolvente adecuado tal como THF con una base adecuada tal como trietilamina a una temperatura adecuada tal como TA. Después de la formación de la urea, los grupos R1-R6 pueden sufrir transformaciones adicionales de acuerdo con sea necesario para proporcionar los productos deseados.

EJEMPLOS

Los siguientes Ejemplos se han preparado, aislado y caracterizado utilizando los métodos divulgados en la presente. Los siguientes Ejemplos demuestran un alcance parcial de la divulgación y no pretenden limitar el alcance de la divulgación.

A menos que se especifique lo contrario, los materiales de partida están generalmente disponibles de fuentes comerciales no limitativas, tales como TCI Fine Chemicals (Japón), Aurora Fine Chemicals LLC (San Diego, CA), FCH Group (Ucraína), Aldrich Chemicals Co. (Milwaukee, Wis.), Acros Organics (Fairlawn, N.J.), Maybridge Chemical Company, Ltd. (Cornwall, Inglaterra), Matrix Scientific (EE.UU.), Enamine Ltd (Ucraína), Combi-Blocks, Inc. (San Diego, EE.UU.), Oakwood Products, Inc. (EE.UU.), Apollo Scientific Ltd. (Reino Unido).

Ejemplo 1

1-(2-clorop¡r¡d¡n-4-¡l)-3-(3-(d¡fluorometil)¡sot¡azol-5-¡l)urea

A una mezcla de 2-doro-4-aminopiridina (1,57 g, 12,25 mmol) y piridina (1,38 mL, 17,05 mmol) en DCM (100 mL) a 0 °C se añadió cloroformiato de 4-nitrofenilo (2,6 g, 12,89 mmol). La mezcla se mantuvo a 0 °C durante 2 min y luego se calentó a ta. Después de otros 20 min, la mezcla se concentró en vacío para dar un residuo, que se recogió en dioxano (80 mL). Se añadió rápidamente una solución de 3-(difluorometil)isotiazol-5-amina (Compuesto Intermedio 1) (1,60 g, 10,66 mmol) en dioxano (10 mL), seguido de DIPEA (6,51 mL, 37,3 mmol). La mezcla se calentó a 60 °C. Después de 3 h, la mezcla se enfrió a TA y luego se añadieron agua y EtOAc. La capa orgánica se lavó repetidamente con agua, bicarbonato de sodio acuoso saturado y salmuera. La fase orgánica se secó sobre sulfato de sodio, se filtró y se concentró en vacío para obtener un residuo que se purificó por cromatografía de resolución instantánea (EtOH/EtOAc/heptano). El residuo parcialmente purificado se trituró con éter y el sólido obtenido se recogió en agua. La liofilización eliminó el éter residual para dar el compuesto del título. 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6) 5 11,08 (s, 1H), 10,15 (s, 1H), 8,26 (d, J = 4 Hz, 1H), 7,68 (d, J = 2 Hz, 1H), 7,46 (dd, J = 4, 2 Hz, 1H), 7,15 (s, 1H), 6,97 (t, J = 52 Hz, 1H). MS (ESI) m/z 305,1 [M H]+. LCMS: Rt = 1,25 min, m/z 305,1 (M+H) (LCMS Método 1). 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6) 5 11,08 (s, 1H), 10,15 (s, 1H), 8,26 (d, J = 4 Hz, 1H), 7,68 (d, J = 2 Hz, 1H), 7,46 (dd, J = 4, 2 Hz, 1H), 7,15 (s, 1H), 6,97 (t, J = 52 Hz, 1H).

Ejemplo 2

1-(2-cloropiridin-4-il)-3-(3-metilisotiazol-5-il)urea

Se añadió lentamente una solución de 2-cloro-4-aminopiridina (101 mg, 0,786 mmol) en THF (2 mL) a una solución de trifosgeno (101 mg, 0,340 mmol) en THF (2 mL) a TA. Luego se añadió trietilamina (0,11 mL, 0,790 mmol). Después de agitar la mezcla a TA durante 20 min, se añadió una mezcla de hidrocloruro de 3-metil-5-aminoisotiazol (120 mg, 0,797 mmol) y trietilamina (0,12 mL, 0,863 mmol) en THF (2 mL). La mezcla se agitó a TA durante 18 h y se repartió entre EtOAc y KOH acuoso. El extracto orgánico reunido se secó sobre MgSO₄y se concentró. El residuo se purificó por HPLC (método básico) para dar el compuesto del título. LCMS: Rt = 0,85 min, m/z 269,0 (M+H) (LCMS método 2). 1H R^mN (400 MHz, DMSO-d6) 510,78 (s, 1H), 9,87 (s, 1H), 8,24 (d, J = 4 Hz, 1H), 7,66 (s, 1H), 7,43 (d, J = 4 Hz, 1H), 6,73 (s, 1H), 2,30 (s, 3H).

Ejemplo 3

1-(2-cloropiridin-4-ih-3-(3-(trifluorometihisotiazol-5-il)urea

A una mezcla helada de 3-(trifluorometil)isotiazol-5-amina (Compuesto intermedio 2) (70 mg, 0,41 mmol) y (2-cloropiridin-4-il)carbamato de fenilo (Compuesto intermedio 3) (104 mg, 0,41 mmol) en DMF (1,2 mL) se añadió una solución de LHMDS (1 M en THF, 0,41 mL, 0,41 mmol). La mezcla se dejó calentar a TA y se agitó durante 16 h. La mezcla se concentró en vacío y luego se purificó por HPLC (método básico) para obtener el compuesto del título. LCMS: Rt = 1,38 min, m/z 323 (M+H) (LCMS método 1). 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6) 5 11,21 (s a, 1H), 10,18 (s a, 1H), 8,23 (d, J = 5,6 Hz, 1H), 7,69 (d, J = 1,8 Hz, 1H), 7,46 (dd, J = 5,7, 1,9 Hz, 1H), 7,22 (s, 1H).

Ejemplo 4

1-(5-amino-2-cloropiridin-4-il)-3-(3-(difluorometil)isotiazol-5-il)urea

Una mezcla de 1-(5-nitro-2-doropiridin-4-il)-3-(3-(difluorometil)isotiazol-5-il)urea (Compuesto intermedio 5) (7,63 g, 21,82 mmol), hierro (4,87 g , 87 mmol) y cloruro de amonio (9,34 g, 175 mmol) en etanol (84 mL) y agua (25 mL) se calentó durante 1 h a 50 °C. La mezcla se filtró sobre Celite, la torta del filtro se enjuagó con MeOH y el filtrado se concentró en vacío. El residuo se recogió en EtOAc y se lavó con salmuera. La fracción orgánica se secó sobre sulfato de magnesio y se concentró en vacío para dar un residuo que se purificó por cromatografía en gel de sílice (EtOAc/heptano) seguido de purificación utilizando purificación de fase inversa ISCO en una columna C18 eluyendo con agua ácido fórmico al 0,1 % y acetonitrilo ácido fórmico al 0,1%. LCMS: Rt = 0,76 min, m/z = 320,2 (M+H) (LCMS método 2). 1H RMN (400 MHz, Metanol-d4) 57,88 (s, 1H), 7,84 (s, 1H), 6,99 (s, 1H), 6,66 (t, J = 54,9 Hz, 1H).

Ejemplo 5

1-(2-cloro-5-(hidroximetil)piridin-4-il)-3-(3-(difluorometil)isotiazol-5-il)urea

Etapa 1: Síntesis de 1-(5-(((terc.-butildimetilsilil)oxi)metil)-2-cloropiridin-4-il)-3-(3-(difluorometil)isotiazol-5-il)urea

Se añadió gota a gota LHMDS (1 M en THF, 9,2 mL, 9,2 mmol) a una solución de (5-(((terc.-butildimetilsilil)oxi)metil)-2-cloropiridin-4-il)carbamato de fenilo (Compuesto intermedio 6) (3,46 g, 8,81 mmol) y 3-(difluorometil)isotiazol-5-amina (Compuesto intermedio 1) (1,15 g, 7,66 mmol) en DMF (30 mL), y la reacción se agitó a TA durante 30 min. La reacción se extinguió con MeOH (10 mL) y los componentes volátiles se eliminaron en vacío. El residuo se recogió en EtOAc/NH4Cl acuoso saturado 1:1 y las capas se separaron. La capa acuosa se extrajo con EtOAc. Los extractos orgánicos se reunieron, se secaron con Na2SO4, se filtraron y los componentes volátiles se eliminaron en vacío. El residuo bruto se purificó por cromatografía en gel de sílice (EtOAc/heptano). LCMS: Rt = 1,79 min, m/z = 449,2 (M+H) (LCMS método 1).

1H RMN (400 MHz, DMSO-d6) 5 11,39 (s, 1H), 8,93 (s, 1H), 8,29 (s, 1H), 8,14 (s, 1H), 7,19 (s, 1H), 6,96 (t, J = 54,5 Hz, 1H), 4,79 (s, 2H), 0,86 (s, 9H), 0,07 (s, 6H).

Etapa 2: Síntesis de 1-(2-cloro-5-(hidroximetil)piridin-4-il)-3-(3-(difluorometil)isotiazol-5-il)urea

Se añadió TBAF (1 M en THF, 2,45 mL, 2,45 mmol) a una solución de 1 -(5-(((terc.-butildimetilsilil)oxi)metil)-2-cloropi ridin-4-il)-3-(3-(difluorometil) isotiazol-5-il)urea (obtenida en el etapa 1 anterior) (1,1 g, 2,45 mmol) y en THF (8 mL), y la mezcla se agitó a TA durante 2 h. La mezcla de reacción se vertió en agua y el producto se extrajo con EtOAc. El extracto orgánico se reunió, se secó con Na2SO4, se filtró y los componentes volátiles se eliminaron en vacío. El producto bruto se purificó por cromatografía en gel de sílice (MeOH / DCM) para dar el compuesto del título. LCMS: Rt = 0,78 min, m/z = 335,2 (M+H) (LCMS método 2). 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6) 5 11,75 (s, 1H), 9,22 (s, 1H), 8,23 (s, 1H), 8,15 (s, 1H), 7,20 (s, 1H), 6,97 (t, J = 56 Hz, 1H), 5,79 (t, J = 5 Hz, 1H), 4,59 (d, J = 5 Hz, 2H).

Ejemplo 6

1-(5-am¡no-2-fluorop¡r¡d¡n-4-¡l)-3-(3-(d¡fluoromet¡l)¡sotiazol-5-¡l)urea

Una mezcla de 1-(5-nitro-2-cloropiridin-4-il)-3-(3-(difluorometil)isotiazol-5-il)urea (Compuesto intermedio 5) (3,77 g, 8,62 mmol), TMAF (3,61 g , 38,8 mmol) y DMF (83 mL) se calentó a 75 °C durante 1 h. La reacción se extinguió con agua y se extrajo con EtOAc. Las fracciones orgánicas reunidas se lavaron con agua, salmuera, luego se secaron con sulfato de sodio, se filtraron y se concentraron en vacío. A continuación, el residuo se purificó mediante cromatografía de resolución instantánea (EtOAc/heptano) para dar un producto parcialmente purificado (2,73 g) que se recogió en etanol (100 mL) y agua (20 mL). Se añadieron cloruro de amonio (2,13 g, 39,8 mmol) y hierro (1,91 g, 34,2 mmol) y la mezcla se calentó a 45 °C durante 30 min. A continuación, la mezcla de reacción se filtró sobre una almohadilla corta de celite, que se lavó con MeOH. El filtrado se concentró y luego se diluyó con EtOAc y agua. La capa acuosa se extrajo con EtOAc. Las fracciones orgánicas reunidas se lavaron con salmuera, luego se secaron con sulfato de sodio, se filtraron y se concentraron en vacío. El residuo se purificó secuencialmente mediante cromatografía en gel de sílice (EtOAc/heptano), seguido de purificación de fase inversa ISCO en una columna C18 eluyendo con agua ácido fórmico al 0,1 % y acetonitrilo ácido fórmico al 0,1 %. Finalmente, se purificó un pequeño número de fracciones impuras mediante HPLC (método del ácido fórmico) y las fracciones reunidas proporcionaron el compuesto del título. LCMS: Rt = 1,12 min, m/z = 304,2 (M+H) (LCMS método 1). 1H RMN (400 MHz, DMSO-da) 5 11,15 (s, 1H), 8,92 (s, 1H), 7,63 (d, J = 0,9 Hz, 1H), 7,46 (d, J = 0,8 Hz, 1H), 7,14 (s, 1H), 6,95 (t, J = 54,5 Hz, 1H), 4,82 (s, 2H).

Ejemplo 7

1-(3-(difluorometil)isotiazol-5-il)-3-(2-fluoro-5-(hidroximetil)piridin-4-il)urea

Etapa 1: Síntesis de 1-(5-(((terc.-butildimetilsilil)oxi)metil)-2-fluoropiridin-4-il)-3-(3-(difluorometil)isotiazol-5-il)urea.

A una solución de 3-(difluorometil)isotiazol-5-amina (Compuesto intermedio 1) (48 mg, 0,323 mmol) y (5-(((terc.-butildimetilsilil)oxi)metil)-2-fluoropiridin-4-il)carbamato de fenilo (Compuesto intermedio 7) (135 mg, 0,323 mmol) en DMF (2 mL) se añadió LHm Ds (1 M en THF, 0,484 mL, 0,484 mmol) y la mezcla resultante se agitó a TA durante 30 min. La mezcla se concentró in vacuo y el producto se purificó por cromatografía en gel de sílice (EtOAc/heptano) para dar el compuesto del título. LCMS: Rt = 1,76 min, m/z = 433,2 (M+H) (LCMS método 1

Etapa 2: Síntesis de 1-(3-(difluorometil)isotiazol-5-il)-3-(2-fluoro-5-(hidroximetil)piridin-4-il)urea.

A una solución de 1-(5-(((terc.-butildimetilsilil)oxi)metil)-2-fluoropiridin-4-il)-3-(3-(difluorometil)isotiazol-5-il)urea (119 mg, 0,275 mmol) en THF (5 mL) se añadió TBAF (1 M en THF, 0,275 mL, 0,275 mmol) y la mezcla resultante se dejó en agitación a TA durante 2 h. La mezcla se concentró in vacuo y se purificó por cromatografía en gel de sílice (MeOH / DCM con hidróxido de amonio como modificador) para dar el compuesto del título. LCMS: LCMS: Rt = 1,16 min, m/z = 337 (M+H) (LCMS método 1). 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6) 5 11,76 (s, 1H), 9,26 (s, 1H), 8,06 (s, 1H), 7,77 (s, 1H), 7,22 -6,70 (m, 2H), 5,73 (t, J = 5,4 Hz, 1H), 4,59 (d, J = 5,1 Hz, 2H).

Ejemplo 8

1-(3-(difluorometil)isotiazol-5-il)-3-(2-fluoro-3-(hidroximetil)piridin-4-il)urea

Etapa 1: Síntesis de 1-(3-(((terc.-butildimetilsilil)oxi)metil)-2-fluoropiridin-4-il)-3-(3-(difluorometil)isotiazol-5-il)urea

A una solución de 3-(difluorometil)isotiazol-5-amina (Compuesto intermedio 1) (1,04 g, 6,93 mmol) y (3-(((terc.-butildimetilsilil)oxi)metil)-2-fluoropiridin-4-il)carbamato de fenilo (Compuesto intermedio 8) (3,39 g, 9,00 mmol) en DMF (35 mL) se añadió LHMDS (1 M en THF, 13,8 mL, 13,8 mmol) a 0 °C. El baño de enfriamiento se eliminó y la mezcla resultante se agitó a TA durante 45 min. La mezcla se concentró in vacuo y el producto se purificó por cromatografía en gel de sílice (EtOAc / heptano) para dar el compuesto del título. LCMS: Rt = 1,74 min, m/z = 433,3 (M+H) (LCMS método 1).

Etapa 2: Síntesis de 1-(3-(difluorometil)isotiazol-5-il)-3-(2-fluoro-3-(hidroximetil)piridin-4-il)urea

A una solución de 1-(3-(((terc.-butildimetilsilil)oxi)metil)-2-fluoropiridin-4-il)-3-(3-(difluorometil)isotiazol-5-il)urea (2,19 g, 5,06 mmol) en THF (40 mL) se añadió TBAF (1 M en THF, 6,6 mL, 6,6 mmol) y la mezcla resultante se dejó en agitación a TA durante 30 min. La reacción se extinguió con agua y luego se diluyó con EtOAc. La capa acuosa se extrajo con EtOAc. Las fracciones orgánicas reunidas se reunieron, se lavaron con salmuera, luego se secaron con sulfato de sodio, se filtraron y se concentraron en vacío. La mezcla bruta se purificó por cromatografía de resolución instantánea (MeOH/DCM) para dar el compuesto del título. LCMS: Rt = 1,12 min, m/z 319,2 (M+H) (LCMS método 1). 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6) 511,89 (s, 1H), 9,44 (s, 1H), 8,10 - 8,02 (m, 2H), 7,05 (s, 1H), 6,95 (t, J = 54,5 Hz, 1H), 5,83 (s, 1H), 4,62 (s, 2H).

COMPUESTOS INTERMEDIOS

Compuesto intermedio 1

3-(difluorometil)isotiazol-5-amina

Etapa 1: 3-metil-5-nitroisotiazol

Se colocó polvo de Cu (96 g, 1,5 mol) en un reactor de 5 L. Se añadió agua (1 L) seguido de NaNO²(104 g, 1,5 mol). Se añadió HCl acuoso (12 M, 1,5 mL, 18 mmol) y la mezcla de reacción se agitó durante 20 min. Se añadió gota a gota mediante un embudo de adición una solución de hidrocloruro de 3-metil-5-aminoisotiazol (58 g, 507 mmol) en 500 mL de agua y HCl acuoso (12 M, 65 mL, 0,78 mol), manteniendo la temperatura por debajo de 30 °C. Se añadieron 100 mL adicionales de agua. La mezcla de reacción se dejó en agitación durante 3 h después de la adición. La mezcla de reacción se filtró a través de Celite con agua y MTBE. El filtrado se transfirió al reactor y las capas se separaron. La capa acuosa se lavó dos veces con MTBE. Las capas orgánicas reunidas se secaron sobre MgSO₄, se filtraron y concentraron para dar el compuesto del título. 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6) 58,12 (s, 1H), 2,50 (s, 3H).

Etapa 2: Ácido 5-nitroisotiazol-3-carboxílico

A un matraz de fondo redondo de 3 bocas de 1 L en un baño de agua equipado con un agitador mecánico y un monitor de temperatura se añadió 3-metil-5-nitroisotiazol (26,5 g, 184 mmol), luego H²SO⁴(350 mL) a una velocidad para mantener la temperatura por debajo de 30 °C. Se añadió CrO₃(55,1 g, 552 mmol) en 6 porciones cada 20 min, asegurando que la temperatura se mantuviera por debajo de 24 °C. La reacción se dejó en agitación en presencia del baño de agua durante 3 días. La mezcla de reacción se vertió en agua helada (un total de 1,4 L) y se extrajo 3 veces con Et²O (1 L). Las capas orgánicas reunidas se lavaron con salmuera, luego se secaron sobre MgSO₄, se filtraron y concentraron para proporcionar un sólido amarillo. El sólido se recogió en heptano (80 mL) y Et²O (20 mL) y se trituró. Después de 2 min de agitación vigorosa, la mezcla se filtró y luego se enjuagó con una mezcla de heptano/éter 5:1 (cantidad mínima) para proporcionar el compuesto del título. 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6) 59,89 (s, 1H), 8,57 (s, 1H).

Etapa 3: (5-nitroisotiazol-3-il)metanol

Se cargó un matraz con ácido 5-nitroisotiazol-3-carboxílico (3,0 g, 17,2 mmol) en THF (50 mL), se enfrió en un baño de hielo y luego se añadió complejo de borano tetrahidrofurano (1 M en THF) (22,4 mL, 22,4 mmol) gota a gota a lo largo de 30 min y la reacción se dejó calentar durante la noche. La mezcla de reacción se volvió a enfriar a 0 °C y luego se añadió gota a gota metanol (20 mL). La reacción se agitó vigorosamente a 0 °C durante 5 min, luego se dejó calentar a TA y se agitó durante otros 15 min. La mezcla de reacción se concentró en vacío hasta la mitad del volumen y luego se diluyó con EtOAc (100 mL), NH4Cl acuoso saturado (50 mL) y agua (50 mL). Las capas se separaron y la porción acuosa se extrajo con EtOAc (2x100 mL). Las fracciones orgánicas se reunieron y lavaron con salmuera, luego se secaron sobre sulfato de sodio, se filtraron y se concentraron en vacío. La purificación mediante cromatografía en gel de sílice (EtOAc/DCM) dio el compuesto del título. 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6) 58,09 (s, 1H), 5,77 (t, J = 6,1 Hz, 1H), 4,58 (d, J = 6,1 Hz, 2H). MS (ESI) m/z 161,0 [M H]+.

Etapa 4: Síntesis de 5-nitroisotiazol-3-carbaldehído

Se añadió periodinano de Dess-Martin (2,23 g, 5,27 mmol) en pequeñas porciones a lo largo de 5 min a (5-nitroisotiazol-3-il)metanol (767 mg, 4,79 mmol) en DCM (25 mL) a 0 °C. La mezcla se agitó a 0 °C durante 10 min, se calentó a TA y se agitó a TA durante 20 min. La mezcla se diluyó con DCM. Se añadieron NaHCO₃acuoso saturado y tiosulfato de sodio acuoso saturado. La mezcla se agitó vigorosamente durante 10 min y luego se separaron dos capas. La capa acuosa se extrajo con DCM. El extracto orgánico reunido se lavó con salmuera, se secó sobre sulfato de sodio y se concentró en vacío para dar el compuesto del título. El producto se utilizó directamente en la siguiente etapa sin purificación. 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6) 59,85 (s, 1H), 8,58 (s, 1H).

Etapa 5: Síntesis de 3-(difluorometil)-5-nitroisotiazol

Se añadió gota a gota DAST (0,201 mL, 1,518 mmol) a 0 °C a una solución de 5-nitroisotiazol-3-carbaldehído (obtenida en la etapa 1 anterior) (80 mg, 0,506 mmol) en DCM (3,5 mL). La mezcla se agitó a 0 °C durante 25 min, se calentó a TA y se agitó a TA durante 2 h. La mezcla se extinguió a 0 °C con NaHCO₃acuoso saturado y se diluyó con DCM. La mezcla se agitó vigorosamente durante 1 min y se separaron las dos capas. La capa acuosa se extrajo con DCM. El extracto orgánico reunido se lavó con salmuera, se secó sobre sulfato de sodio y se concentró en vacío para dar el compuesto del título. El producto se utilizó directamente en la siguiente etapa sin purificación. 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6) 58,54 (s, 1H), 7,16 (t, J = 52 Hz, 1H).

Etapa 6: Síntesis de 3-(difluorometil)isotiazol-5-amina

Una mezcla de 3-(difluorometil)-5-nitroisotiazol (49 mg, 0,27 mmol), polvo de hierro (46 mg, 0,81 mmol) y ácido acético (1,5 mL) se calentó a 50 °C durante 2 h. La mezcla se diluyó con acetato de etilo y se basificó con hidróxido de amonio al 30 %. La capa orgánica se separó y se concentró en vacío, luego se purificó por cromatografía en gel de sílice (EtOAc/heptano) para obtener el compuesto del título. LCMS: Rt = 0,42 min, m/z 151,2 (M+H) (LCMS método 2);1H RMN (400 MHz, metanol-d4) 56,46 (t, J = 55,0 Hz, 1H), 6,39 (s, 1H). 19F RMN (376 MHz, MeOD) 5 -116,06.

Compuesto intermedio 2

3-(trifluorometil)isotiazol-5-amina

Etapa 1: Síntesis de 4,4,4-trifluoro-3-oxobutanonitrilo

Se cargó un matraz seco de 100 mL con KOt-Bu (1 M en THF, 85 mL, 85 mmol) y se enfrió en hielo. Después de 30 min, se añadió una mezcla de trifluoroacetato de etilo (7,27 ml, 60,9 mmol) y acetonitrilo (3,18 mL, 60,9 mmol) a lo largo de 3 min. La mezcla de reacción se convirtió en una suspensión. La mezcla se dejó calentar lentamente hasta TA y se agitó durante 24 h. La mezcla se extinguió con HCl 1 M y el producto bruto se extrajo con éter y se lavó con agua. La capa orgánica se separó, se secó sobre sulfato de magnesio, se filtró y se concentró en vacío para proporcionar el compuesto del título, que se utilizó en la etapa siguiente sin purificación. LCMS: Rt = 0,22 min, m/z = 136,1 (M-1) (LCMS método 4).

1H RMN (400 MHz, DMSO-d6) 52,99 (s, 2H).

Etapa 2: Síntesis de (Z)-3-amino-4,4,4-trifluorobut-2-enonitrilo

Una mezcla de 4,4,4-trifluoro-3-oxobutanonitrilo (preparada en la etapa 1) (1,1 g, 8,03 mmol), formiato de amonio (1,518 g, 24,08 mmol) y ácido acético (0,046 mL, 0,803 mmol) en tolueno (100 mL) se calentó a 120 °C en condiciones zeotrópicas durante 18 h. La mezcla se concentró en vacío y se utilizó en la siguiente etapa sin purificación adicional. Etapa 3: Síntesis de (Z)-3-amino-4,4,4-trifluorobut-2-enotioamida

Una mezcla de (Z)-3-amino-4,4,4-trifluorobut-2-enonitrilo (preparada en la etapa 2) (1,00 g, 7,35 mmol), MgCh (0,70 g, 7,35 mmol) y NasH (0,824 g, 14,70 mmol) en DMF (20 mL) se dejó en agitación a TA durante 24 h. La mezcla se repartió entre acetato de etilo y agua. El extracto orgánico reunido se secó sobre sulfato de magnesio, se filtró y se concentró en vacío para proporcionar el compuesto del título. LCMS: Rt = 0,81 min, m/z = 171 (M+H) (LCMS método 1).

Etapa 4: Síntesis de 3-(trifluorometil)isotiazol-5-amina

A una mezcla de (Z)-3-amino-4,4,4-trifluorobut-2-enotioamida (preparada en la etapa 3) (1,2 g, 7,05 mmol) en piridina (24 mL) se añadió H²O²(3 mL, 29,4 mmol) a 0 - 5 °C, y la mezcla se dejó calentar hasta TA y se agitó durante 2 h. La mezcla se concentró en vacío y el residuo se cromatografió sobre gel de sílice (acetato de etilo / heptano) para dar el compuesto del título. LCMS: Rt = 0,97 min, m/z 169 (M+H) (LCMS método 1). 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6) 57,21 (s, 2H), 6,44 (s, 1H).

Compuesto intermedio 3

(2-Cloropiridin-4-il)carbamato de fenilo

A una solución de 2-cloropiridin-4-amina (12,9 g, 101 mmol) y piridina (8,13 mL, 101 mmol) en DCM (315 mL) a 0 °C se añadió cloroformiato de fenilo (13,3 mL, 106 mmol). La mezcla se dejó calentar a TA durante 2 h y se concentró en vacío.

Se añadió agua y la mezcla se agitó a TA. El sólido se filtró sobre un embudo de plástico fritado, se enjuagó con agua y se secó en alto vacío a 40 °C durante 24 h para dar el compuesto del título. L^cM^s: Rt = 1,20 min, m/z = 249,2 (M+H) (LCMS método 2).

Compuesto intermedio 4

(2-cloro-5-nitropiridin-4-il)carbamato de fenilo

A una solución de 4-amino-2-cloro-5-nitropiridina (150 mg, 0,864 mmol) y piridina (0,070 mL, 0,86 mmol) en dioxano (4 mL) a 0 °C se añadió cloroformiato de fenilo (0,114 mL, 0,907 mmol). La mezcla se calentó a 80 °C durante 18 h, se enfrió a TA y se vertió en agua. El producto se extrajo con EtOAc. El extracto orgánico reunido se secó sobre Na2SO₄y se concentró en vacío. El residuo bruto se purificó por cromatografía en gel de sílice (EtOAc / heptano) para dar el compuesto del título. LCMS: Rt = 1,51 min, m/z = 294,1 (M+H) (LCMS método 1).

Compuesto intermedio 5

1-(5-nitro-2-cloropiridin-4-il)-3-(3-(difluorometil)isotiazol-5-il)urea

Una solución de (2-cloro-5-nitropiridin-4-il)carbamato de fenilo (Compuesto intermedio 4) (4,50 g, 15,32 mmol), 3-(difluorometil)isotiazol-5-amina (Compuesto intermedio 1) (2,0 g, 13,32 mmol ) y DIPEA (5,8 mL, 33,3 mmol) en dioxano (59 mL) se calentó a 85 °C durante 16 h. La mezcla se concentró en vacío y el residuo se purificó por cromatografía en gel de sílice (EtOAc/heptano) para dar el compuesto del título. LCMS: Rt = 1,43 min, m/z = 350,1 (M+H) (LCMS método 1).

Compuesto intermedio 6

(5-(((Terc.-butildimetilsilil)oxi)metil)-2-cloropiridin-4-il)carbamato de fenilo

Etapa 1: Síntesis de 6-cloro-4-((4-metoxibencil)amino)nicotinato de metilo

Una mezcla de p-metoxibencilamina (19,0 mL, 146 mmol), 4,6-dicloronicotinato de metilo (25 g, 121 mmol), trietilamina (20,3 mL, 146 mmol) en MeCN (60 mL) se agitó a TA durante 24 h. Se añadió más 4-metoxibencilamina (2,5 mL) y la mezcla se agitó a TA durante 72 h. La mezcla se concentró y el residuo se repartió entre EtOAc y NH4Cl acuoso saturado. El extracto orgánico se reunió, se secó con Na2SO4, se filtró y se concentró en vacío. El residuo bruto se purificó por cromatografía en gel de sílice (EtOAc / heptano) para dar el compuesto del título. LCMS: Rt = 1,42 min, m/z = 307,1 (M+H) (LCMS método 1).

Etapa 2: Síntesis de (6-cloro-4-((4-metoxibencil)amino)piridin-3-il)metanol

A una solución de LAH (2 M en THF, 21,52 mL, 43,0 mmol) en THF (150 mL) agitando a 0 °C se añadió gota a gota una solución de 6-cloro-4-((4-metoxibencil)amino)nicotinato de metilo (preparada en la etapa 1) (12 g, 39,1 mmol) en THF (100 mL). La reacción se dejó calentar a TA y se agitó durante 30 min. La reacción se extinguió con la adición lenta de EtOAc en un baño de hielo, seguido de condiciones de Steinhardt para extinguir LAH (2 mL de H²O, seguido de 2 mL de NaOH al 15 % y 6 mL de H²O). La solución resultante se agitó durante 15 min y se dejó calentar a TA. La mezcla se filtró sobre Celite y el filtrado se transfirió a un embudo de decantación. El producto se diluyó adicionalmente con agua y luego se extrajo con EtOAc. Los extractos orgánicos se reunieron, se secaron con Na2SO4, se filtraron y los componentes volátiles se eliminaron en vacío para dar el compuesto del título. LCMS: Rt = 0,84 min, m/z = 279,3 (M+H) (LCMS 1 método 1).

Etapa 3: Síntesis de (4-amino-6-cloropiridin-3-il)metanol

Una solución de (6-cloro-4-((4-metoxibencil)amino)piridin-3-il)metanol (preparada en la etapa 2) (9,82 g, 35,2 mmol) en TFA (2,71 mL, 35,2 mmol) se calentó a 60 °C durante 18 h. La reacción se neutralizó con K²CO³acuoso al 10 % hasta pH ~7. A continuación, la mezcla se transfirió a un embudo de decantación y se extrajo con DCM. Los extractos orgánicos se reunieron, se secaron con Na2SO4, se filtraron y los componentes volátiles se eliminaron en vacío para dar una porción del compuesto del título. La capa acuosa se concentró en vacío y el sólido resultante se diluyó en isopropanol. Las sales insolubles se filtraron y la solución se enfrió en hielo. Las sales adicionales que precipitaron se eliminaron por filtración. Los componentes volátiles se eliminaron en vacío para dar más cantidad del compuesto del título. LCMS: Rt = 0,26 min, m/z = 159,1 (M+H) (LCMS método 2).

Etapa 4: Síntesis de (5-((terc.-butildimetilsilil)oxi)metil)-2-cloropiridin-4-amina

Una mezcla de (4-amino-6-cloropiridin-3-il)metanol (preparada en la etapa 3) (5 g, 32 mmol), TBDMSCI (5,23 g, 34,7 mmol) e imidazol (5,37 g, 79 mmol) en DMF (10 mL) se agitó a TA durante 1 h. La mezcla de reacción se vertió en agua y se extrajo con EtOAc. Los extractos orgánicos se reunieron, se secaron con Na2SO4, se filtraron y los componentes volátiles se eliminaron en vacío. El residuo bruto se purificó por cromatografía en gel de sílice (EtOAc / heptano) para dar el compuesto del título. LCMS: Rt = 1,52 min, m/z = 273,2 (M+H) (LCMS método 2).

Etapa 5: Síntesis de (5-(((terc.-butildimetilsilil)oxi)metil)-2-cloropiridin-4-il)carbamato de fenilo

A una solución de 5-(((terc.-butildimetilsilil)oxi)metil)-2-cloropiridin-4-amina (preparada en la etapa 4) (5,55 g, 20,3 mmol) y piridina (1,8 mL, 22,4 mmol) en DCM (75 mL) agitando a TA se añadió cloroformiato de fenilo (2,68 mL, 21,4 mmol). La reacción se dejó calentar a TA durante 2 h. Los componentes volátiles se eliminaron en vacío y el residuo se diluyó con EtOAc y NaHCO₃acuoso saturado. A continuación, la mezcla se extrajo con EtOAc. Los extractos orgánicos se reunieron, se secaron con Na2SO4, se filtraron y los componentes volátiles se eliminaron en vacío. El residuo bruto se purificó por cromatografía en gel de sílice (EtOAc / heptano) para dar el compuesto del título. LCMS: Rt = 1,94 min, m/z = 393,3 (M+H) (LCMS método 1).

Compuesto intermedio 7

(5-(((terc.-but¡ld¡met¡ls¡l¡l)ox¡)met¡l)-2-fluorop¡r¡d¡n-4-¡l)carbamato de fenilo

Etapa 1: Síntesis de 4-amino-6-fluoronicotinato de metilo.

A un matraz de 500 mL que contenía 4,6-dicloronicotinato de metilo (6,75 g, 32,8 mmol) y TMAF (8,0 g, 86 mmol) se añadió DMF (100 mL) y la mezcla se agitó a TA durante 1,5 h hasta que la formación completa del compuesto intermedio 4,6-difluoronicotinato de metilo se identificó mediante LCMS. A esta mezcla de reacción se añadió luego una solución de amoníaco 2 M en isopropanol (35 mL, 70 mmol) y se agitó a TA durante 20 h. La formación completa del compuesto del título se identificó por LCMS. La mezcla de reacción se extinguió con agua y el producto bruto se extrajo con EtOAc. La capa orgánica se lavó con salmuera, luego se secó sobre sulfato de sodio, se filtró y se concentró in vacuo. El residuo se purificó por cromatografía en gel de sílice (EtOAc / heptano) para obtener el compuesto del título. LCMS: Rt = 0,97 min, m/z 174 (M+H) (LCMS método 1). 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6) 58,43 (s, 1H), 7,52 (s, 2H), 6,30 (s, 1H), 3,82 (s, 3H).

Etapa 2: Síntesis de (4-amino-6-fluoropiridin-3-il)metanol.

A una solución enfriada con hielo (0 °C) de LAH (2 M en THF, 24,8 mL, 49,6 mmol) diluida adicionalmente con THF (200 mL), se añadió, a través de un embudo de adición a lo largo de 45 min, una solución de 4-amino- 6-fluoronicotinato de metilo (4,22 g, 24,8 mmol) en THF (100 mL), dando como resultado una suspensión. La mezcla se dejó calentar a TA durante 2 h, después de lo cual la reacción se consideró completa por LCMS. La mezcla de reacción se diluyó con THF (200 mL) y se enfrió en hielo. Se añadió sulfato de sodio decahidrato en porciones a la mezcla hasta que cesó el burbujeo. La mezcla se agitó durante 18 h, luego se filtró y se concentró in vacuo. El residuo resultante se purificó por cromatografía en gel de sílice (EtOAc / heptano) para obtener el compuesto del título. LCMS : Rt = 0,27 min;/z 143 (M+H) (LCMS método 3). 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6) 57,63 (s, 1H), 6,20 (s, 2H), 6,09 (s, 1H), 5,04 (t, J = 5,5 Hz, 1H), 4,35 (d, J = 5,5 Hz, 2H).

Etapa 3: Síntesis de 5-((terc.-butildimetilsilil)oxi)metil)-2-fluoropiridin-4-amina.

Una mezcla de (4-amino-6-fluoropiridin-3-il)metanol (1,52 g, 10,7 mmol), TBDMSCI (1,77 g, 11,8 mmol) e imidazol (1,82 g, 26,7 mmol) en DMF (50 mL) se agitó a TA durante 1 h después de lo cual la reacción se consideró completa mediante TLC, EtOAc al 100 %. La mezcla de reacción se concentró in vacuo, y luego se purificó por cromatografía en gel de sílice (EtOAc / heptano) para obtener el compuesto del título. LCMS: Rt = 1,46 min, m/z 257 (M+H) (LCMS método 1). 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6) 57,60 (s, 1H), 6,11 (s, 2H), 6,04 (s, 1H), 4,50 (s, 2H), 0,81 (s, 9H), 0,00 (s, 6H).

Etapa 4: Síntesis de (5-(((terc.-butildimetilsilil)oxi)metil)-2-fluoropiridin-4-il)carbamato de fenilo.

A una mezcla de (4-amino-6-fluoropiridin-3-il)metanol (1,45 g, 5,66 mmol) y piridina (0,46 mL, 5,66 mmol) en dioxano (30 mL) se añadió cloroformiato de fenilo (0,710 mL, 5,66 mmol) y la mezcla resultante se agitó durante 1 h. Luego, la mezcla se diluyó con EtOAc, después se lavó con bicarbonato de sodio, seguido de agua. La porción orgánica se secó sobre sulfato de sodio, se filtró y se concentró in vacuo. El residuo se purificó por cromatografía en gel de sílice (EtOAc / heptano) para obtener el compuesto del título. LCMS: Rt = 1,89 min, m/z 377 (M+H) (LCMS método 1). 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6) 59,66 (s, 1H), 8,03 (s, 1H), 7,41 (s, 1H), 7,39 - 7,31 (m, 2H), 7,16 - 7,09 (m, 2H), 6,74 - 6,52 (m, 1H), 4,78 (s, 2H), 0,80 (s,9 H), 0,00 (s, 6H).

Compuesto intermedio 8

(3-(((terc.-butildimetilsilil)oxi)metil)-2-fluoropiridin-4-il)carbamato de fenilo

Etapa 1: Síntesis de 2,4-difluoronicotinato de metilo

Una solución de 2,4-difluoropiridina (5 g, 43,4 mmol) en THF (120 mL) se añadió gota a gota a una solución agitada de diisopropilamida de litio (2 M en THF/heptano/etilbenceno, 26,1 mL, 52,1 mmol) a -78° C. Después de agitar durante 1 h, la reacción se transfirió a través de una cánula a una solución en agitación de cloroformiato de metilo (5,05 mL, 65,2 mmol) en THF (120 mL) a -78 °C. La mezcla de reacción se dejó calentar a TA durante 30 min. La reacción se extinguió lentamente con agua (100 mL) y se extrajo con EtOAc (3 x 100 mL). Los extractos orgánicos se reunieron, se secaron con Na2SO4, se filtraron y los componentes volátiles se eliminaron en vacío. El producto se purificó por cromatografía en gel de sílice (EtOAc / heptano) para dar el compuesto del título. LCMS: Rt = 0,94 min, m/z = 174,1 (M+H) (LCMS método 1).

Etapa 2: Síntesis de 4-amino-2-fluoronicotinato de metilo

A una solución de 2,4-difluoronicotinato de metilo (preparada en la etapa 1) (2 g, 11,55 mmol) en dioxano (40 mL) se añadió amoníaco en dioxano (0,5 M, 46,2 mL, 23,11 mmol). La reacción se agitó a 60 °C durante 18 h. La reacción se vertió en NaHCO3(ac) saturado y se extrajo con EtOAc (3 x 100 mL). Los extractos orgánicos se reunieron, se secaron con Na2SO4, se filtraron y los componentes volátiles se eliminaron en vacío. El producto se purificó por cromatografía en gel de sílice (EtOAc / heptano) para dar el compuesto del título. LCMS: Rt = 0,77 min, m/z = 171,1 (M+H) (LCMS método 1).

Etapa 3: Síntesis de (4-amino-2-fluoropiridin-3-il)metanol

A una solución de 4-amino-2-fluoronicotinato de metilo (2,02 g, 11,87 mmol) en THF (70 mL) en agitación en un baño de hielo se añadió gota a gota LAH (2 M en THF, 7,1 mL, 14,2 mmol). La reacción se agitó a 0 °C durante 30 min y la reacción se extinguió añadiendo lentamente sulfato sódico decahidrato (3,5 g). La mezcla se agitó durante 15 min, antes de añadir Na2SO4 anhidro. La mezcla se filtró sobre Celite y los componentes volátiles se eliminaron en vacío. 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6) 57,56 (d, J = 5,7 Hz, 1H), 6,47 (dd, J = 5,7, 1,2 Hz, 1H), 6,29 (s, 2H), 4,96 (t, J = 5,4 Hz, 1H), 4,40 (d, J = 5,4 Hz, 2H).

Etapa 4: Síntesis de 3-(((terc.-butildimetilsilil)oxi)metil)-2-fluoropiridin-4-amina

Una mezcla de (4-amino-2-fluoropiridin-3-il)metanol (1,57 g, 11,05 mmol), TBDMSCI (2,00 g, 13,26 mmol) e imidazol (1,88 g, 27,6 mmol) se agitó en DMF (30 mL) a TA. Después de 90 min, la reacción se detuvo con NaHCO₃sat.ac. y luego se diluyó con EtOAc. La capa acuosa se extrajo con EtOAc. Las fracciones orgánicas se reunieron, se lavaron con salmuera, luego se secaron con sulfato de sodio, se filtraron y se concentraron en vacío. La mezcla bruta se purificó por cromatografía de resolución instantánea (EtOAc/heptano). LCMS: Rt = 1,47 min, m/z = 257,3 (M+H) (LCMS método 1).

Etapa 5: Síntesis de (3-(((terc.-butildimetilsilil)oxi)metil)-2-fluoropiridin-4-il)carbamato de fenilo

A una solución de 3-(((terc.-butildimetilsilil)oxi)metil)-2-fluoropiridin-4-amina (2,36 g, 9,20 mmol) y piridina (0,89 mL, 11,0 mmol) en dioxano (40 mL) se añadió cloroformiato de fenilo (1,21 mL, 9,7 mmol) a TA. Después de 2,5 h, la reacción se extinguió con NaHCO₃acuoso saturado y luego se diluyó con EtOAc. La capa acuosa se extrajo con EtOAc. Las fracciones orgánicas se reunieron, se lavaron con salmuera, luego se secaron con sulfato de sodio, se filtraron y se concentraron en vacío.

La mezcla bruta se purificó por cromatografía de resolución instantánea (EtOAc/heptano) para dar el compuesto del título. LCMS: Rt = 1,91 min, m/z 377,4 (M+H) (LCMS método 1). 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6) 59,92 (s, 1H), 8,11 (d, J = 5,7 Hz, 1H), 7,78 (d, J = 5,7 Hz, 1H), 7,52 - 7,42 (m, 2H), 7,36 - 7,26 (m, 1H), 7,26 - 7,19 (m, 2H), 4,90 (s, 2H), 0,87 (s, 9H), 0,08 (s, 6H).

COMPOSICIONES Y COMBINACIONES FARMACÉUTICAS

Los compuestos de la presente divulgación se utilizan típicamente como una composición farmacéutica (p. ej., un compuesto de la presente divulgación y al menos un soporte farmacéuticamente aceptable). Un "soporte (diluyente o excipiente) farmacéuticamente aceptable" se refiere a medios generalmente aceptados en la técnica para la administración de agentes biológicamente activos a animales, en particular, mamíferos, incluyendo, generalmente reconocidos como disolventes seguros (GRAS, por sus siglas en inglés), medios de dispersión, revestimientos, tensioactivos, antioxidantes, conservantes (p. ej., agentes antibacterianos, agentes antifúngicos), agentes isotónicos, agentes retardadores de la absorción, sales, conservantes, estabilizadores de fármacos, aglutinantes, agentes tampón, (p. ej., ácido maleico, ácido tartárico, ácido láctico, ácido cítrico, ácido acético, bicarbonato de sodio, fosfato de sodio y similares), agentes de desintegración, lubricantes, agentes edulcorantes, agentes saborizantes, colorantes y similares y combinaciones de los mismos, como sería conocido por los expertos en la técnica (véase, por ejemplo, Allen, L.V., Jr. et al., Remington: The Science and Practice of Pharmacy (2 Volúmenes), 22a Edición, Pharmaceutical Press (2012).

En un aspecto, la presente divulgación proporciona una composición farmacéutica que comprende un compuesto de la presente divulgación, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, y un soporte farmacéuticamente aceptable. En una realización adicional, la composición comprende al menos dos soportes farmacéuticamente aceptables, tales como los descritos en esta memoria. Para los fines de la presente divulgación, a menos que se indique lo contrario, los solvatos e hidratos se consideran generalmente composiciones. Preferentemente, los soportes farmacéuticamente aceptables son estériles. La composición farmacéutica se puede formular para vías particulares de administración tales como administración oral, administración parenteral y administración rectal, etc. Además, las composiciones farmacéuticas de la presente divulgación se pueden preparar en forma sólida (incluyendo, sin limitación, cápsulas, comprimidos, píldoras, gránulos, polvos o supositorios), o en forma líquida (incluyendo, sin limitación, soluciones, suspensiones o emulsiones). Las composiciones farmacéuticas pueden someterse a operaciones farmacéuticas convencionales tales como esterilización y/o pueden contener diluyentes inertes convencionales, agentes lubricantes o agentes tampón, así como adyuvantes, tales como conservantes, estabilizantes, agentes humectantes, emulsionantes y tampones, etc. Típicamente, las composiciones farmacéuticas son comprimidos o cápsulas de gelatina que comprenden el ingrediente activo junto con uno o más de:

a) diluyentes, p. ej., lactosa, dextrosa, sacarosa, manitol, sorbitol, celulosa y/o glicina;

b) lubricantes, p. ej., sílice, talco, ácido esteárico, su sal de magnesio o calcio y/o polietilenglicol; para comprimidos también

c) aglutinantes, p. ej., silicato de magnesio y aluminio, pasta de almidón, gelatina, tragacanto, metilcelulosa, carboximetilcelulosa sódica y/o polivinilpirrolidona; si se desea

d) desintegrantes, p. ej., almidones, agar, ácido algínico o su sal de sodio, o mezclas efervescentes; y

e) absorbentes, colorantes, aromas y edulcorantes.

Los comprimidos pueden estar recubiertos con película o con revestimiento entérico de acuerdo con métodos conocidos en la técnica.

Composiciones adecuadas para administración oral incluyen una cantidad eficaz de un compuesto de la divulgación en forma de comprimidos, grageas, suspensiones acuosas u oleosas, polvos o gránulos dispersables, emulsiones, cápsulas duras o blandas, o jarabes o elixires. Composiciones destinadas a uso oral se preparan de acuerdo con cualquier método conocido en la técnica para la fabricación de composiciones farmacéuticas y composiciones de este tipo pueden contener uno o más agentes seleccionados del grupo que consiste en agentes edulcorantes, agentes aromatizantes, agentes colorantes y agentes conservantes con el fin de proporcionar preparaciones farmacéuticamente elegantes y agradables al paladar. Los comprimidos pueden contener el ingrediente activo mezclado con excipientes no tóxicos farmacéuticamente aceptables que son adecuados para la fabricación de comprimidos. Estos excipientes son, por ejemplo, diluyentes inertes, tales como carbonato cálcico, carbonato sódico, lactosa, fosfato cálcico o fosfato sódico; agentes de granulación y desintegración, por ejemplo, almidón de maíz o ácido algínico; agentes aglutinantes, por ejemplo, almidón, gelatina o goma arábiga; y agentes lubricantes, por ejemplo, estearato de magnesio, ácido esteárico o talco. Los comprimidos están sin recubrir o se recubren mediante técnicas conocidas para retrasar la disgregación y la absorción en el tubo digestivo y de este modo proporcionan una acción sostenida durante un periodo más prolongado. Por ejemplo, se puede utilizar un material retardante tal como monoestearato de glicerilo o diestearato de glicerilo. Formulaciones para uso oral pueden presentarse como cápsulas de gelatina dura en las que el ingrediente activo se mezcla con un diluyente sólido inerte, por ejemplo, carbonato de calcio, fosfato de calcio o caolín, o como cápsulas de gelatina blanda en las que el ingrediente activo se mezcla con agua o un aceite. medio, por ejemplo, aceite de cacahuete, parafina líquida o aceite de oliva.

Determinadas composiciones inyectables son soluciones o suspensiones isotónicas acuosas, y favorablemente se preparan supositorios a partir de emulsiones o suspensiones grasas. Dichas composiciones pueden esterilizarse y/o contener adyuvantes tales como agentes conservantes, estabilizantes, humectantes o emulsionantes, promotores de disolución, sales para regular la presión osmótica y/o tampones. Además, también pueden contener otras sustancias valiosas desde el punto de vista terapéutico. Dichas composiciones se preparan de acuerdo con métodos convencionales de mezcladura, granulación o revestimiento, respectivamente, y contienen aproximadamente 0,1-75 %, o contienen aproximadamente 1-50 % del ingrediente activo.

Las composiciones adecuadas para aplicación transdérmica incluyen una cantidad eficaz de un compuesto de la divulgación con un portador adecuado. Soportes adecuados para la administración transdérmica incluyen disolventes absorbibles farmacológicamente aceptables para facilitar el paso a través de la piel del huésped. Por ejemplo, los dispositivos transdérmicos se encuentran en forma de un vendaje que comprende un miembro de soporte, un depósito que contiene el compuesto opcionalmente con portadores, opcionalmente una barrera de control de la velocidad para suministrar el compuesto a la piel del hospedador a una velocidad controlada y predeterminada durante un periodo de tiempo prolongado y medios para fijar el dispositivo a la piel.

Composiciones adecuadas para aplicación tópica, p. ej., a la piel y los ojos, incluyen soluciones acuosas, suspensiones, ungüentos, cremas, geles o formulaciones pulverizables, p. ej., para la administración por aerosol o similares. Sistemas de administración tópica de este tipo serán en particular apropiados para aplicación dérmica, p. ej., para el tratamiento de cáncer de piel, p. ej., para uso profiláctico en cremas solares, lociones, aerosoles y similares. Por lo tanto, son particularmente adecuados para su uso en formulaciones tópicas, incluidas las cosméticas, bien conocidas en la técnica. Éstas pueden contener solubilizantes, estabilizantes, agentes potenciadores de la tonicidad, tampones y conservantes.

Tal como se utiliza en esta memoria, una aplicación tópica también puede pertenecer a una inhalación o a una aplicación intranasal. Pueden administrarse convenientemente en forma de un polvo seco (ya sea solos, como una mezcla, por ejemplo, una mezcla seca con lactosa, o una partícula de componente mixto, por ejemplo, con fosfolípidos) de un inhalador de polvo seco o una presentación de aerosol de un recipiente presurizado, bomba, espray, atomizador o nebulizador, con o sin el uso de un propulsor adecuado.

La presente divulgación proporciona además composiciones farmacéuticas y formas farmacéuticas anhidras que comprenden los compuestos de la presente divulgación como principios activos, ya que el agua puede facilitar la degradación de ciertos compuestos.

Las composiciones farmacéuticas y las formas farmacéuticas anhidras de la divulgación se pueden preparar utilizando ingredientes anhidros o que contengan poca humedad, y condiciones de baja humectación o baja humedad. Una composición farmacéutica anhidra se puede preparar y almacenar de manera que se mantenga su naturaleza anhidra. Por consiguiente, las composiciones anhidras se envasan utilizando materiales que se sabe que evitan la exposición al agua de modo que se puedan incluir en kits de formulación adecuados. Los ejemplos de envases adecuados incluyen, pero no se limitan a, láminas selladas herméticamente, plásticos, recipientes de dosis unitarias (p. ej., viales), envases de tipo blister y envases de tiras.

La presente divulgación proporciona, además, composiciones farmacéuticas y formas de dosificación que comprenden uno o más agentes que reducen la velocidad a la que se descompondrá el compuesto de la presente invención como ingrediente activo. Agentes de este tipo, a los que se hace referencia en esta memoria como "estabilizadores", incluyen, pero no se limitan a antioxidantes, tales como ácido ascórbico, tampones de pH o tampones de sal, etc.

El compuesto de la presente divulgación se formula típicamente en formas de dosificación farmacéuticas para proporcionar una dosificación del fármaco fácilmente controlable y para proporcionar al paciente un producto elegante y fácilmente manejable. El régimen de dosificación para los compuestos de la presente divulgación, por supuesto, variará dependiendo de factores conocidos, tales como las características farmacodinámicas del agente particular y su modo y vía de administración; la especie, edad, sexo, salud, condición médica y peso del receptor; la naturaleza y extensión de los síntomas; el tipo de tratamiento concurrente; la frecuencia del tratamiento; la vía de administración, la función renal y hepática del paciente y el efecto deseado. Compuestos de esta divulgación pueden administrarse en una sola dosis diaria, o la dosis diaria total puede administrarse en dosis divididas de dos, tres o cuatro veces al día.

En determinados casos, puede ser ventajoso administrar el compuesto de la presente divulgación en combinación con uno o más agentes terapéuticamente activos seleccionados independientemente de agentes anticancerígenos, agentes antialérgicos, antieméticos, analgésicos, inmunomoduladores y agentes citoprotectores.

La expresión "terapia de combinación" se refiere a la administración de dos o más agentes terapéuticos para tratar una enfermedad, trastorno o afección terapéutico descrito en la presente divulgación. Una administración de este tipo abarca la co-administración de estos agentes terapéuticos de manera sustancialmente simultánea, como en una sola cápsula que tiene una proporción fija de ingredientes activos. De manera alternativa, una administración de este tipo engloba la co-administración en recipientes múltiples o independientes (p. ej., cápsulas, polvos y líquidos) para cada principio activo. El compuesto de la presente divulgación y agentes terapéuticos adicionales se pueden administrar por la misma vía de administración o por vías de administración diferentes. Los polvos y/o líquidos se pueden reconstituir o diluir a la dosis deseada antes de la administración. Además, una administración de este tipo también incluye el uso de cada tipo de agente terapéutico de manera secuencial, aproximadamente al mismo tiempo o en momentos diferentes. En cualquier caso, el régimen de tratamiento proporcionará efectos beneficiosos de la combinación de fármacos en el tratamiento de las enfermedades, afecciones o trastornos descritos en esta memoria.

Agentes quimioterapéuticos generales considerados para uso en terapias combinadas incluyen capecitabina (Xeloda®), N4-pentoxicarbonil-5-desoxi-5-fluorocitidina, carboplatino (Paraplatin®), cisplatino (Platino!®), cladribina (Leustatin®), ciclofosfamida (Cytoxan® o Neosar®), citarabina, arabinósido de citosina (Cytosar-U®), inyección de liposomas de citarabina (DepoCyt®), dacarbazina (DTIC-Dome®), hidrocloruro de doxorrubicina (Adriamycin®, Rubex®), fosfato de fludarabina (Fludara®), 5 -fluorouracilo (Adrucil®, Efudex®), gemcitabina (difluorodesoxicitidina), irinotecán (Camptosar®), L-asparaginasa (ELSPAR®), 6-mercaptopurina (Purinethol®), metotrexato (Folex®), pentostatina, 6-tioguanina, tiotepa e hidrcloruro de topotecán para inyección (Hycamptin®).

Agentes anticancerígenos de particular interés para combinaciones con los compuestos de la presente divulgación incluyen:

Inhibidores de la fosfoinositida 3-quinasa (PI3K): 4-[2-(1H-indazol-4-il)-6-[[4-(metilsulfonil)piperazin-1-il]metil]tieno[3,2-d]pirimidin-4-il]morfolina (también conocida como GDC 0941 y descrita en las Publicaciones PCT N°s WO 09/036082 y Wo 09/055730); 4-(trifluorometil)-5-(2,6-dimorfolinopirimidin-4-il)pi ridi n-2-amina (también conocida como BKM120 o NVP-BKM120, y descrita en la Publicación PCT N° WO2007/084786); Alpelisib (BYL719): (5Z)-5-[[4-(4-pi ridi ni l)-6-quinolinil]metileno]-2,4-tiazolidinadiona (GSK1059615, CAS 958852-01-2); 5-[8-metil-9-(1-metiletil)-2-(4-morfolinil)-9H-purin-6-il]-2-pirimidinamina (VS-5584, c As 1246560-33-7) y everolimus (AFINITOR®).

Inhibidores de la proteína quinasa activada por mitógenos (MEK): XL-518 (también conocido como GDC-0973, Cas N° 1029872-29-4, disponible de ACC Corp.); Selumetinib (5-[(4-bromo-2-clorofenil)amino]-4-fluoro-N-(2-hidroxietoxi)-1-metil-1H-bencimidazol-6-carboxamida, también conocido como AZD6244 o ARRY 142886, descrito en la Publicación PCT N° WO2003077914); 2-[(2-cloro-4-yodofenil)amino]-N-(ciclopropilmetoxi)-3,4-difluoro-benzamida(también conocida como CI-1040 o PD184352 y descrito en la Publicación PCT N° WO2000035436); N-[(2R)-2,3-dihidroxipropoxi]-3,4-difluoro-2-[(2-fluoro-4-yodofenil)amino]-benzamida (también conocida como PD0325901 y descrito en la Publicación PCT N° WO2002006213); 2,3-bis[amino[(2-aminofenil)tio]metileno]-butanodinitrilo (también conocido como U0126 y descrito en la Patente de EE.UU. N° 2.779.780); N-[3,4-difluoro-2-[(2-fluoro-4-yodofenil)amino]-6-metoxifenil]-1-[(2R)-2,3-dihidroxipropil]-ciclopropanosulfonamida (también conocida como RDEA119 o BAY869766 y descrita en la Publicación PCT N° WO2007014011); (3S,4R,5Z,8S,9S,11E)-14-(etilamino)-8,9,16-trihidroxi-3,4-dimetil-3,4,9, 19-tetrahidro-1H-2-benzoxaciclotetradecina-1,7(8H)-diona] (también conocida como E6201 y descrita en la Publicación PCT N° WO2003076424); 2'-amino-3'-metoxiflavona (también conocida como PD98059 disponible de Biaffin GmbH & Co., KG, Alemania); (R)-3-(2,3-dihidroxipropil)-6-fluoro-5-(2-fluoro-4-yodofenilamino)-8-metilpirido[2,3-d]pirimidina-4,7(3H,8H)-diona (TAK-733, CAS 1035555-63-5); Pimasertib (AS-703026, CAS 1204531-26-9); Trametinib dimetilsulfóxido (GSK-1120212, CAS 1204531-25-80); 2-(2-fluoro-4-yodofenilamino)-N-(2-hidroxietoxi)-1,5-dimetil-6-oxo-1,6-dihidropiridina-3-carboxamida (AZD 8330); 3,4-difluoro-2-[(2-fluoro-4-yodofenil)amino]-N-(2-hidroxietoxi)-5-[(3-oxo-[1,2]oxazinan-2-il)metil]benzamida (documentos CH 4987655 o Ro 4987655); (); y 5-[(4-bromo-2-fluorofenil)amino]-4-fluoro-N-(2-hidroxietoxi)-1-metil-1H-bencimidazol-6-carboxamida (MEK162).

Inhibidores del receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR): hidrocloruro de Erlotinib (Tarceva®), Gefitnib (Iressa®); Dacomitinib (PF299804); N-[4-[(3-cloro-4-fluorofenil)amino]-7-[[(3"S")-tetrahidro-3-furanil]oxi]-6-quinazolinil]-4(dimetilamino)-2-butenamida, Tovok®); Vandetanib (Caprelsa®); Lapatinib (Tykerb®); (3R,4R)-4-amino-1-((4-((3-metoxifenil)amino)pirrolo[2,1-f][1,2,4]triazin-5-il)metil)piperidin-3-ol (BMS690514); dihidrocloruro de canertinib (CI-1033); 6-[4-[(4-etil-1-piperazinil)metil]fenil]-N-[(1R)-1-feniletil]-7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-4-amina (AEE788, CAS 497839-62-0); Mubritinib (TAK165); Pelitinib (EκΒ569); Afatinib (BIBW2992); Neratinib (HKI-272); éster (3S)-3-morfolinilmetílico del ácido N-[4-[[1-[(3-fluorofenil)metil]-1H-indazol-5-il]amino]-5-metilpirrolo[2,1-/][1,2,4]triazin-6-il]-carbámico, (BMS599626); N-(3,4-dicloro-2-fluorofenil)-6-metoxi-7-[[(3aa,5p,6aa)-octahidro-2-metilciclopenta[c]pirrol-5-il]metoxi]-4-quinazolinamina (XL647, CAS 781613-23-8); y 4-[4-[[(1R)-1-feniletil]amino]-7H-pirrolo [2,3-d]pirimidin-6-il]-fenol (PKI166, CAS 187724-61-4).

Anticuerpos de EGFR: Cetuximab (Erbitux®); Panitumumab (Vectibix®); Matuzumab (EMD-72000); Trastuzumab (Herceptin®); Nimotuzumab (hR3); Zalutumumab; TheraCIM h-R3; MDX0447 (CAS 339151-96-1); y ch806 (mAb-806, CAS 946414-09-1).

Inhibidores de MAPK: Vemurafinib (Zelboraf®), Sorafinib (Nexavar®), Dabrefinib (Tafinlar®), Trametinib (Mekinist®) y Selumetinib (AZD6244, ARRY-142886)

Inhibidores de EED/EZH₂: tazemetostat (EPZ-6438), GSK₂816126 (CAS 1346574-57-9), CPI-1205 (CAS 1621862-70-1) y DS-3201 (también conocido como DS-3201b, Daiichi Sankyo, Inc).

Moduladores del punto de control inmunitario: Pembrolizumab (Keytruda®), Nivolumab (Opdivo®), Atezolizumab (Tecentriq®) e Ipilumumab (Yervoy®).

Algunos pacientes pueden experimentar reacciones alérgicas a los compuestos de la presente divulgación y/u otro u otros agentes anticancerosos durante o después de la administración; por lo tanto, a menudo se administran agentes anti alérgicos para minimizar el riesgo de una reacción alérgica. Agentes antialérgicos adecuados incluyen corticosteroides (Knutson, S., et al., PLoS One, DOI:10.1371/journal.pone.0111840 (2014)), tales como dexametasona (p. ej., Decadron®), beclometasona (p. ej., Beclovent®), hidrocortisona (también conocida como cortisona, succinato sódico de hidrocortisona, fosfato sódico de hidrocortisona y vendida bajo los nombres comerciales Ala-Cort®, fosfato de hidrocortisona, Solu-Cortef®, Hydrocort Acetate® y Lanacort®), prednisolona (vendida bajo los nombres comerciales Delta-Cortel®, Orapred®, Pediapred® y Prelone®), prednisona (vendida bajo los nombres comerciales Deltasone®, Liquid Red®, Meticorten® y Orasone®), metilprednisolona (también conocida como 6-metilprednisolona, acetato de metilprednisolona, succinato sódico de metilprednisolona, vendida bajo los nombres comerciales Duralone®, Medralone®, Medrol®, M-Prednisol® y Solu-Medrol®); antihistaminas, tales como difenhidramina (p. ej., Benadryl®), hidroxizina y ciproheptadina; y broncodilatadores, tales como los agonistas de los receptores beta-adrenérgicos, albuterol (p. ej., Proventil®) y terbutalina (Brethine®).

Algunos pacientes pueden experimentar náuseas durante y después de la administración del compuesto de la presente divulgación y/u otro(s) agente(s) anticancerígeno(s); por lo tanto, los antieméticos se utilizan para prevenir las náuseas (parte superior del estómago) y los vómitos. Antieméticos adecuados incluyen aprepitant (Emend®), ondansetron (Zofran®), granisetron HCl (Kytril®), lorazepam (Ativan®, dexametasona (Decadron®), proclorperazina (Compazine®), casopitant (Rezonic® y Zunrisa®) y combinaciones de los mismos.

A menudo se receta medicación para aliviar el dolor experimentado durante el período de tratamiento para que el paciente se sienta más cómodo. A menudo se utilizan analgésicos comunes de venta libre, tales como Tylenol®. Sin embargo, los analgésicos opioides, tales como hidrocodona/paracetamol o hidrocodona/acetaminofen (p. ej., Vicodin®), morfina (p. ej., Astramorph® o Avinza®), oxicodona (p. ej., OxyContin® o Percocet®), hidrocloruro de oximorfona (Opana®) y fentanilo (p. ej., Duragesic®) también son útiles para el dolor moderado o intenso.

Agentes inmunomoduladores de particular interés para combinaciones con los compuestos de la presente divulgación incluyen: Afutuzumab (disponible de Roche®); Pegfilgrastim (Neulasta®); Lenalidomida (CC-5013, Revlimid®); Talidomida (Thalomid®), Actimid (CC4047); e IRX-2 (mezcla de citoquinas humanas que incluye interleuquina 1, interleuquina 2 e interferón y, CAS 951209-71-5, disponible de IRX Therapeutics).

En un esfuerzo por proteger las células normales de la toxicidad del tratamiento y limitar las toxicidades de los órganos, se pueden utilizar agentes citoprotectores (tales como neuroprotectores, captadores de radicales libres, cardioprotectores, neutralizadores de extravasación de antraciclina, nutrientes y similares) como terapia adjunta. Agentes citoprotectores adecuados incluyen Amifostin (Ethyol®), glutamine, dimesna (Tavocept®), mesna (Mesnex®), dexrazoxana (Zinecard® o Totect®), xaliproden (Xaprila®) y leucovorin (también conocido como leucovorin cálcico, factor de citrovorum y ácido folínico).

La estructura de los compuestos activos identificados por números de código, nombres genéricos o comerciales puede tomarse de la edición actual del compendio estándar "The Merck Index" o de bases de datos, p. ej., Patents International (p. ej., IMS World Publications).

En una realización, la presente divulgación proporciona composiciones farmacéuticas que comprenden al menos un compuesto de la presente divulgación o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo junto con un soporte farmacéuticamente aceptable adecuado para la administración a un sujeto humano o animal, ya sea solo o junto con otros agentes anticancerígenos.

En otra realización, la presente divulgación proporciona métodos para tratar sujetos humanos o animales que padecen una enfermedad de proliferación celular, tal como una neoplasia. La presente divulgación proporciona métodos para tratar a un sujeto humano o animal que necesite un tratamiento de este tipo, que comprende administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto de la presente divulgación o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, ya sea solo o en combinación con otros agentes anticancerígenos.

En particular, las composiciones se formularán juntas como una combinación terapéutica o se administrarán por separado.

En una realización, la presente divulgación proporciona una combinación farmacéutica que comprende un compuesto de la presente divulgación o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, y uno o más agentes terapéuticamente activos seleccionados del grupo que consiste en Abitrexato (Metotrexato), Abraxane (Paclitaxel formulación de nanopartículas estabilizada con albúmina), Dimaleato de Afatinib, Afinitor (Everolimus), Alecensa (Alectinib), Alectinib, Alimta (Pemetrexed Disódico), Avastin (Bevacizumab), Bevacizumab, Carboplatino, Ceritinib, Crizotinib, Cyramza (Ramucirumab), Docetaxel, hidrocloruro de Erlotinib, Everolimus, Folex (Metotrexato), Folex PFS (Metotrexato), Gefitinib, Gilotrif (Dimaleato de Afatinib), Hidrocloruro de Gemcitabina, Gemzar (Hidrocloruro de Gemcitabina), Iressa (Gefitinib), Keytruda (Pembrolizumab), Hidrocloruro de Mecloretamina, Metotrexato, Metotrexato LPF (Metotrexato), Mexate (Metotrexato), Mexate-AQ (Metotrexato), Mustargen (Hidrocloruro de Mecloretamina), Navelbine (Tartrato de Vinorelbina), Necitumumab, Nivolumab, Opdivo (Nivolumab), Osimertinib, Paclitaxel, formulación de nanopartículas estabilizada con albúmina Paclitaxel, Paraplat (Carboplatino), Paraplatin (Carboplatino), Pembrolizumab, Pemetrexed Disódico, Portrazza (Necitumumab), Ramucirumab, Tagrisso (Osimertinib), Tarceva (Hidrocloruro de Erlotinib), Taxol (Paclitaxel), Taxotere (Docetaxel), Tartrato de Vinorelbina, Xalkori (Crizotinib), Zykadia (Ceritinib), CARBOPLATINO-TAXOL y GEMCITABINA-CISPLATINO, para el tratamiento del carcinoma de pulmón (incluyendo, pero no limitado a carcinoma de pulmón de células no pequeñas, adenocarcinoma de pulmón, carcinoma de pulmón, carcinomas de pulmón de células grandes, carcinoma de pulmón de células no pequeñas, carcinoma de células escamosas de pulmón, cáncer de pulmón de células pequeñas).

En otra realización, la presente divulgación proporciona una combinación farmacéutica que comprende un compuesto de la presente divulgación o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, y uno o más agentes terapéuticamente activos seleccionados del grupo que consiste en Aldesleukina, Cobimetinib, Cotellic (Cobimetinib), Dabrafenib, Dacarbazina, DTIC-Dome (Dacarbazina), IL-2 (Aldesleukina), ImLygic (Talimogene Laherparepvec), Interleuquina-2 (Aldesleukina), Intrón A (Interferon Alfa-2b Recombinante), Ipilimumab, Keytruda (Pembrolizumab), Mekinist (Trametinib), Nivolumab, Opdivo (Nivolumab), Peginterferón Alfa-2b, PEG-Intron (Peginterferón Alfa-2b), Pembrolizumab, Proleukina (Aldesleukina), Interferon Alfa-2b Recombinante, Sylatron (Peginterferón Alfa-2b), Tafinlar (Dabrafenib), Talimogene Laherparepvec, Trametinib, Vemurafenib, Yervoy (Ipilimumab) y Zelboraf (Vemurafenib), para el tratamiento del melanoma (incluyendo, pero no limitado a melanoma cutáneo de la piel, melanoma desmoplásico y melanoma uveal).

En la terapia de combinación para el tratamiento de una neoplasia, el compuesto de la presente divulgación y otro(s) agente(s) anticancerígeno(s) pueden administrarse de manera simultánea, concurrente o secuencial sin límites de tiempo específicos, en donde una administración de este tipo proporciona niveles terapéuticamente efectivos de los dos compuestos en el cuerpo del sujeto.

En una realización preferida, el compuesto de la presente divulgación y los otros agentes anticancerígenos se administran generalmente de forma secuencial en cualquier orden mediante infusión u oralmente. El régimen de dosificación puede variar dependiendo de la fase de la enfermedad, el estado físico del paciente, los perfiles de seguridad de los fármacos individuales y la tolerancia de los fármacos individuales, así como otros criterios bien conocidos por el médico tratante y el (los) médico(s) que administran la combinación. El compuesto de la presente divulgación y otro u otros agentes antineoplásicos pueden administrarse en un intervalo de minutos entre sí, con horas, días o incluso semanas de diferencia, dependiendo del ciclo particular que se utilice para el tratamiento. Además, el ciclo podría incluir la administración de un fármaco con más frecuencia que el otro durante el ciclo de tratamiento y en diferentes dosis por administración del fármaco.

En otro aspecto de la presente divulgación, se proporciona un kit que comprende dos o más composiciones farmacéuticas separadas, de las cuales al menos una contiene un compuesto de la presente divulgación. En una realización, el kit comprende medios para retener por separado dichas composiciones, tal como un recipiente, una botella dividida o un envase de aluminio dividido. Un ejemplo de un kit de este tipo es un envase de tipo blister, como se usa típicamente para el envasado de comprimidos, cápsulas y similares.

El kit de la presente divulgación se puede utilizar para administrar diferentes formas de dosificación, por ejemplo, oral y parenteral, para administrar las composiciones separadas en diferentes intervalos de dosificación, o para valorar las composiciones separadas entre sí. Para ayudar al cumplimiento, el kit de la presente divulgación comprende típicamente instrucciones para la administración.

Un compuesto de la presente divulgación también puede utilizarse con ventaja en combinación con procedimientos terapéuticos conocidos, p. ej., la administración de hormonas o, especialmente, radiación. Un compuesto de la presente divulgación puede utilizarse, en particular, como radiosensibilizador, especialmente para el tratamiento de tumores que presentan poca sensibilidad a la radioterapia.

En las terapias de combinación de la presente divulgación, el compuesto de la presente divulgación y el otro agente terapéutico pueden fabricarse y/o formularse por el mismo fabricante o por diferentes fabricantes. Además, el compuesto de la presente divulgación y el otro agente terapéutico (o farmacéutico) pueden combinarse en una terapia de combinación: (i) antes de la liberación del producto de combinación a los médicos (p. ej., en el caso de un kit que comprende el compuesto de la presente divulgación y el otro agente terapéutico); (ii) por el propio médico (o bajo la dirección del médico) poco antes de la administración; (iii) en el propio paciente, p. ej., durante la administración secuencial del compuesto de la presente divulgación y el otro agente terapéutico.

La composición (o formulación) farmacéutica para la aplicación se puede envasar de diversas formas dependiendo del método utilizado para administrar el fármaco. Generalmente, un artículo para distribución incluye un recipiente en el que se ha depositado la formulación farmacéutica en una forma apropiada. Recipientes adecuados son bien conocidos por los expertos en la materia e incluyen materiales tales como botellas (de plástico y vidrio), bolsitas, ampollas, bolsas de plástico, cilindros metálicos y similares. El recipiente también puede incluir un conjunto a prueba de manipulaciones para evitar el acceso indiscreto al contenido del envase. Además, el recipiente tiene depositada sobre él una etiqueta que describe el contenido del recipiente. La etiqueta también puede incluir advertencias apropiadas.

La combinación o composición farmacéutica de la presente divulgación puede estar en una dosificación unitaria de aproximadamente 1-1000 mg del (de los) principio(s) activo(s) para un sujeto de aproximadamente 50-70 kg, o de aproximadamente 1-500 mg o de aproximadamente 1-250 mg o de aproximadamente 1-150 mg o de aproximadamente 0,5-100 mg, o de aproximadamente 1-50 mg de los principios activos. La dosificación terapéuticamente eficaz de un compuesto, la composición farmacéutica o combinaciones del mismo dependen de la especie del sujeto, el peso corporal, la edad y la condición individual, el trastorno o enfermedad o la gravedad del mismo que se esté tratando. Un médico, clínico o veterinario con experiencia ordinaria puede determinar fácilmente la cantidad eficaz de cada uno de los ingredientes activos necesarios para prevenir, tratar o inhibir el progreso del trastorno o enfermedad.

Las propiedades de dosificación citadas anteriormente pueden demostrarse en ensayos in vitro e in vivo utilizando ventajosamente mamíferos, p. ej., ratones, ratas, perros, monos u órganos aislados, tejidos y preparaciones de los mismos. Los compuestos de la presente divulgación se pueden aplicar in vitro en forma de soluciones, p. ej., soluciones acuosas, e in vivo por vía enteral, parenteral, ventajosamente por vía intravenosa, p. ej., como una suspensión o en solución acuosa. La dosificación in vitro puede variar entre concentraciones de aproximadamente 10'3 molar y 10'9 molar. Una cantidad terapéuticamente eficaz in vivo puede variar en función de la vía de administración, entre aproximadamente 0,1-500 mg/kg, o entre aproximadamente 1-100 mg/kg.

FARMACOLOGÍA Y UTILIDAD

Mutaciones en los complejos de remodelación de la cromatina SWI/SNF son muy frecuentes en los cánceres, con una frecuencia de aproximadamente el 20 % (Kadoch, C., Hargreaves, D. C., et al. 2013 Nat Genet. 45: 592-601) (Shain, A.H. y Pollack, J.R. 2013 PLoS ONE 8(1): e55119). Los complejos SWI/SNF consisten en múltiples subunidades y funcionan en la remodelación de la cromatina dependiente de ATP para controlar eventos celulares clave, tales como la regulación de la expresión génica. Las subunidades catalíticas de ATPasa dentro del complejo SWI/SNF consisten en BRM/SMARCA2 o BRG1/SMARCA4 y, por lo tanto, son mutuamente excluyentes (Hodges, C., Kirkland, J.G., et al. 2016 Cold Spring Harb Persp Med 6(8)). La selección genómica funcional a través de ARNhc ha revelado una relación letal sintética convincente entre estas dos ATPasas SWI/SNF, BRM y BRG1 (Hoffman, G.R; Rahal, R et al. 2014 PNAS 111(8): 3128-33; Wilson, B.G., Helming, K.C., et al. 2014 Molecular and Cellular Biology 34(6): 1136-44). En particular, las células cancerosas que carecen de BRG1 funcional tal como por mutaciones o deleciones de pérdida de función, son exquisitamente sensibles al agotamiento de BRM a través de la reducción mediada por ARNhc, lo que resulta en la inhibición del crecimiento (Hoffman, G.R., Rahal, R et al., 2014 PNAS 111(8): 3128-33; Oike, T., Ogiwara, H., et al. 2013 Cancer Research 73(17): 5508-5518); y Vangamudi, B., Paul, T.A., et al. 2015 Cancer Research 75(18): 3865-3878). Por lo tanto, estos estudios revelan que, en ausencia de una de las ATPasas SWI/SNF, las células cancerosas pueden volverse muy dependientes de la ATPasa restante para sobrevivir, lo que revela una vulnerabilidad que puede explotarse para una terapia fijada como objetivo. De hecho, se han identificado lesiones genéticas en BRG1 en diversos cánceres, predominantemente en cánceres de pulmón de células no pequeñas en aproximadamente un 10 %, pero también en otros tipos de cáncer, tales como de hígado, páncreas, melanomas, etc. (Imielinski, M., A. H. Berger, et al. (2012) Cell 150(6): 1107-1120); The Cancer Genome Atlas (TCGA) Data Portal y el cBioPortal for Cancer Genomics). Como tales, estos constituyen poblaciones de pacientes muy significativas con una clara necesidad médica insatisfecha, y se predice que se beneficiarán de la inhibición terapéutica de BRM. Así como determinadas células cancerosas dependen de ^bR^mdebido a la pérdida de la función BRG1, se ha informado que otros tipos de cáncer son potencialmente dependientes de BRG1 a través de diversos mecanismos, incluyendo mutaciones en otras subunidades del complejo SWI/SNF (Shi, J; Whyte, W.A., et al. 2013 Genes and Development 27(24): 2648-2662; Xi, W., Sansam, C.G., et al. 2009 Cancer Research 69(20): 8094-8101; y Zuber, J., Shi, J., et al. 2011 Nature 478(7370), 524-528). Además, también se ha informado que la actividad de SWI/s Nf está alterada en otras enfermedades, lo que la convierte en un objetivo terapéutico atractivo en otras enfermedades además del cáncer (Han, P., Li, W., et al. 2014 Nature 514(7520): 102-06). Por lo tanto, el potencial para inhibir la ATPasa o ambas puede tener múltiples aplicaciones en el tratamiento de diferentes tipos de cánceres y enfermedades.

Mutaciones, deleciones o pérdida de la expresión de BRG1 que pueden conducir a la pérdida de la función pueden ocurrir en diversos tipos de cánceres (The Cancer Genome Atlas (TCGA) Data Portal; the cBioPortal for Cancer Genomics; Becker, T. M., S. Haferkamp, et al. (2009) Mol Cancer 8: 4.; Matsubara, D., Kishaba, Y., et al.2013 Cancer Science 104(2): 266-273; y Yoshimoto, T., Matsubara, D., et al. 2015 Pathology International 65(11): 595-602). Ejemplos de tipos específicos de cánceres con mutación, deleciones o pérdida de expresión de BRG1 incluyen, pero no se limitan a carcinoma de pulmón de células no pequeñas, adenocarcinoma de pulmón, carcinoma de pulmón, carcinomas de pulmón de células grandes, carcinoma de pulmón de células no pequeñas, carcinoma de células escamosas de pulmón, cáncer de pulmón de células pequeñas, melanoma cutáneo de la piel, melanoma desmoplásico, melanoma uveal, carcinoma de células pequeñas del ovario, carcinoma cutáneo de células escamosas, glioma, carcinosarcoma uterino, carcinoma endometrial del cuerpo uterino, cistadenocarcinoma seroso de ovario, carcinoma urotelial de vejiga, linfoma primario del sistema nervioso central, carcinoma de esófago, cáncer de vejiga, variante plasmacitoide del cáncer de vejiga, adenocarcinoma de estómago, carcinoma quístico adenoide, neoplasia linfoide, linfoma difuso de células B grandes, cáncer de páncreas, adenocarcinoma colorrectal, colangiocarcinoma, sarcoma, cánceres de cabeza y cuello, cánceres de cuello uterino y endocervical, meduloblastoma, linfoma cutáneo de células T, carcinoma hepatocelular de hígado, carcinoma de células papilares de riñón, cáncer de mama, linfoma de células del manto, carcinoma de vesícula biliar, cánceres de células germinales testiculares, carcinoma de células renales de células claras, cáncer de próstata, sarcoma de Ewing pediátrico, timoma, riñón cromófobo, carcinoma renal de células no claras, feocromocitoma y paraganglioma y cánceres de tiroides.

Cánceres mutantes de SMARCB1/SNF5, incluyendo los tumores rabdoides malignos en los que se ha demostrado la dependencia de BRG1 (Xi, W., Sansam, C.G., et al. 2009 Cancer Research 69(20): 8094-8101), pero también sarcomas epitelioides mutantes de SMARCB1/SNF, schwannomatosis familiar, carcinomas medulares renales y sarcomas de Ewing (Jahroml, M.S; Putnam, A.R, et al. 2012 Cancer Genetics 205(7-8): 391-404; Prensner, J.R., Iyer, M.K., et al. 2013 Nature Genetics 45(11): 1392-8; y Roberts, C.W.M. y Biegel, J.A., 2009 Cancer Biology and Therapy 8(5): 412-416) y cánceres en los que SNF5 es deficiente en el complejo SWI/SNF que no surgen a través de mutaciones, como en los sarcomas sinoviales (Kadoch, C. y Crabtree, G.R., 2013 Cell 153(1): 71-85), así como en las neoplasias hematopoyéticas dependientes de BRG1, tales como las leucemias mieloides agudas (AML) (Shi, J., Whyte, W.A., et al. 2013 Genes and Development 27(24): 2648-2662; y Zuber, J., Shi, J., et al. 2011 Nature 478(7370), 524-528). Los cánceres mutantes en BRM (incluyendo los eliminados) o mutantes en SNF5/SMARCB1 (incluyendo los eliminados) (The Cancer Genome Atlas (TCGA) Data Portal y el cBioPortal for Cancer Genomics) incluyen, pero no se limitan a tumor maligno de la vaina de los nervios periféricos, cáncer de próstata neuroendocrino, cáncer de mama, carcinoma urotelial de vejiga, carcinoma adenoide quístico, adenocarcinoma de estómago, carcinomas de mama, cistoadenocarcinoma seroso de ovario, carcinosarcoma uterino, carcinoma de esófago, carcinoma de células escamosas de cabeza y cuello, carcinomas de pulmón de células no pequeñas, adenocarcinoma de pulmón, carcinoma de células escamosas de pulmón, cáncer de pulmón de células pequeñas, cáncer de páncreas, carcinoma adrenocortical, melanoma cutáneo de la piel, sarcoma, adenocarcinoma colorrectal, cánceres de cuello uterino y endocervical, carcinoma hepatocelular hepático, carcinoma cutáneo de células escamosas, cáncer testicular de células germinales, glioblastoma, glioblastoma multiforme, colangiocarcinoma, sarcoma de Ewing, carcinoma de células renales de células claras, neuroblastoma, leucemia mieloide aguda y linfoma difuso de células B. grandes, leucemia mieloide aguda, leucemia linfocítica crónica, meduloblastoma, feocromocitoma y paraganglioma y mieloma múltiple.

Inhibidores duales en los que existe el beneficio de la inhibición de BRM, BRG1 o BRM y BRG1 también pueden ser aplicables en cánceres que contienen mutaciones o deficiencias en las subunidades SWI/SNF distintas de BRG1/SMARCA4, BRM/SMARCA2 o SNF5/SMARCB1 como se detalla arriba, tales como ARID1A, ARID1B, ARID2, PBRM1, SMARCE1, SMARCC1, SMARCC2, PHF10, DPF1, DPF3, DPF2, ACTL6A, ACTL6B, SMARCD2, SMARCD3, SMARCD1, BCL11A, BCL11B, BCL7A, BCL7B, BCL7C, BRD9 y ACTB. En otros casos, la dependencia de las ATPasas BRM/BRG1 puede surgir de mecanismos distintos a las mutaciones SWI/SNF.

Compuestos de la presente divulgación tienen beneficios terapéuticos favorables para los trastornos o enfermedades mediados por BRM y/o BRG1. Los compuestos de la presente divulgación en forma libre o en forma de sal farmacéuticamente aceptable exhiben valiosas propiedades farmacológicas, que pueden demostrarse al menos utilizando uno cualquiera de los siguientes procedimientos de ensayo. Se evaluó la capacidad de los compuestos de la presente divulgación para inhibir la actividad de BRM y BRG1 en ensayos bioquímicos.

Ensayo de Inhibición de ATPasa de BRM

I. Aislamiento del Dominio de ATPasa BRM Recombinante

A. Clonación de His ¹⁰ -ZZ-HCV3C-BRM(636-1331) en pFastBac1

Las secuencias que codifican una etiqueta His¹⁰(SEQ ID NO: 1), el dominio ZZ de unión a inmunoglobulina G (IgG) de la proteína A (Staphylococcus aureus) y un sitio de proteasa 3C de rinovirus humano se fusionaron aguas arriba de los residuos 636-1331 de BRM utilizando métodos de síntesis de ADN estándares. La construcción sintetizada se clonó en el MCS de pFastBac1 (Life Technologies) mediante amplificación por PCR utilizando los siguientes cebadores 5' y 3': 5'-GACCGAACTAGTATGGCTTCTCACCACCAT-3' (SEQ ID NO: 2) y 5'-AGCGTTAAGCTTTTAATCCTCGATGGCGCG-3' (SEQ ID NO: 3) para incluir un codón de terminación y ligado en sitios Spel y HindIII utilizando técnicas estándares de biología molecular. El vector recombinante final, pFB1-His10-ZZ-HCV3C-BRM (636-1331), da como resultado la expresión de una etiqueta His¹⁰-ZZ escindible con proteasa de HCV3C (subrayada) aguas arriba de las secuencias BRM nativas que codifican los dominios ATPasa y SnAC.

B. Expresión de BRM (636-1331)

El vector recombinante arriba generado se utilizó para hacer bácmido recombinante transformándolo en células DH10Bac utilizando protocolos estándares como se detalla por el fabricante (Life Technologies). El virus P3 de alto título se generó mediante la transfección del bácmido en células de Spodoptera frugiperda 9 (Sf9) y la amplificación del virus utilizando métodos estándares, tal como lo detalla Life Technologies. His10-ZZ-HCV3C-BRM (636-1331) se expresó a partir de 25 L de células Sf9 en crecimiento en fase logarítmica (1,5 x 106 células/mL) en un biorreactor WAVE (GE Healthcare Life Sciences) a una relación de 1:100 v/v de virus. Se permitió que la infección prosiguiera en la incubadora oscilante a 27 °C y se recolectó tres días después de la infección después de que la viabilidad celular se redujo al 80 % con un aumento en el diámetro total de la célula compatible con la infección. Las células se recolectaron a 4.000xg durante 20 min, se congelaron instantáneamente y se almacenaron a -80 °C hasta su uso.

C. Purificación de BRM (636-1331)

Se lisaron células Sf9 que expresaban His10-ZZ-HCV3C-BRM(636-1331) recombinante en Tris 50 mM (8,0), NaCl 300 mM, glicerol al 10% y TCEP 2 mM complementado con un cóctel inhibidor de proteasa (Roche cOmplete), utilizando 7,5 mL de tampón de lisis por gramo de pasta celular. Las células se lisaron tras descongelarlas, se homogeneizaron y posteriormente se clarificaron en un rotor JA25.50 a 50.000xg durante 30 min para eliminar el material insoluble. El lisado clarificado se aplicó a una columna His-Trap HP de 5 mL (GE Healthcare Life Sciences), se lavó rigurosamente en tampón de lisis sin inhibidores de proteasa complementado con imidazol 25 mM. La proteína unida se eluyó en un gradiente de quince volúmenes de columna frente a tampón de lisis complementado con imidazol 500 mM. Las fracciones que contenían His10-ZZ-HCV3C-BRM (636-1331) se agruparon y dializaron durante la noche frente a Tris 50 mM (8,0), NaCl 300 mM, glicerol al 10 % y TCEP 2 mM complementado con proteasa HCV3C para efectuar la eliminación de la etiqueta His¹⁰-ZZ. La escisión se vigiló mediante SDS/PAGE teñida con Coomassie y LC/MS. La masa intacta coincidía con los residuos de BRM 636-1331 seguidos de dos aminoácidos no nativos, Gly-Pro, un residuo del sitio de escisión de HCV3C. La masa esperada fue 160 Da mayor que la predicha, consistente con dos sitios de fosforilación.

El producto escindido se diluyó en tampón de diálisis no complementado con sal hasta una concentración final de NaCl de 100 mM, se hizo pasar a través de un filtro de jeringa de 0,2 |jm y se cargó inmediatamente en una columna HiTrap Q HP de 1 mL (GE Health Biosciences) previamente equilibrada en Tris 50 mM (8,0), NaCl 100 mM, glicerol al 10% y TCEP 1 mM. Después de la captura, la proteína unida se compitió con el mismo tampón complementado con NaCl 1 M. Las fracciones que contenían BRM (636-1331) se combinaron y cargaron en una columna de exclusión por tamaño S200 16/60 equilibrada en Tris 50 mM (8,0), NaCl 200 mM, glicerol al 10 % y TCEP 2 mM. La construcción purificada se concentró a 2,5 mg/mL, se congeló rápidamente y se almacenó a -80 °C hasta que se utilizó en ensayos posteriores.

II. Actividad de inhibición de ATPasa de BRM

La inhibición del compuesto de la actividad ATPasa de Brm ATPasa-SnAC (636-1331) se midió utilizando el kit de ensayo ADP-Glo de Promega (V6930). Se transfirieron 120 nL de compuesto en DMSO al 100 % a una placa de ensayo de microtitulación blanca de 384 pocillos utilizando un sistema de transferencia acústica ATS de EDC Biosystems. Todas las adiciones de reactivos posteriores se realizaron con un dispensador multimodo MultiFlo FX. El tampón de ensayo era HEPES 20 mM pH 7,5, MgCh 1 mM, KCI 20 mM, DTT 1 mM, BSA al 0,01 %, Tween 20 al 0,005 %. Se añadieron 4 jL de Brm ATPasa-SnAC 7,5 nM en tampón de ensayo a la placa de ensayo y se incubó a TA durante 5 min con compuesto. Se añadieron 2 |^jL de ATP 255 |^jM y plásmido pCMV-dR8.91 6 nM en tampón de ensayo a la placa de ensayo para iniciar la reacción. Las concentraciones finales de los reactivos fueron BRM ATPasa-SnAC 5 nM, ATP 85 j M y plásmido pCMV-dR8.91 2 nM. La reacción de ATPasa se incubó a TA durante 60 min. Se añadieron 3 jiL de reactivo ADP-Glo para detener la reacción y se incubó durante 30 min a TA. Se añadieron 3 ^jiL de reactivo de detección de quinasa a la placa de ensayo que se incubó durante 90 min a TA. Las placas se leyeron con un lector 2103 Multilabel Envision utilizando detección de luminiscencia ultrasensible. Los valores de CI⁵⁰se determinaron a partir de la media de puntos de datos duplicados mediante análisis de regresión no lineal de los valores porcentuales de inhibición representados frente a la concentración del compuesto.

Ensayo de Inhibición de ATPasa de BRG1

I. Aislamiento del Dominio de ATPasa BRG1 Recombinante

A. Clonación de BRG1(658-1361)-His ⁶ en pDEST8

La construcción BRG1(658-1361)-His6 para la expresión en células de insecto se subclonó a partir de un plásmido BRG1 de longitud completa, pDONR221-BRG1-His6 (OPS7173) mediante PCR como sigue. Se generó un fragmento de PCR flanqueado por At TB que codifica BRG1(658-1361)-His6 utilizando los siguientes cebadores: Directo, ATTB1 BRG1(658-x) 5-GGGGACAAGTTT GT ACAAAAAAGCAGGCTTCGAAGGAGAT AGAACCAT GGA AGAAAGTGGCTCAGAAGAAGAGGAAG (SEQ ID NO:

5); Inverso, BRG1(x-1361)HISstpATTB2rev, 5'-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCTCAGTGATGATGATGATGATGCTCCTCGATG GCCTTGAGCCACTGC

(SEQ ID NO: 6). Este fragmento de PCR se recombinó en el vector pDEST8 usando el método Gateway® siguiendo el protocolo del fabricante (Life Technologies). La inserción se confirmó mediante secuenciación y se introdujo en la base de datos OPS (OPS8023) antes de proceder a la generación de bácmido.

B. Expresión de BRG1(658-1361)-His ⁶

El vector recombinante arriba generado se utilizó para hacer bácmido recombinante transformándolo en células DH10Bac utilizando protocolos estándares como se detalla por el fabricante (Life Technologies). El virus P3 de alto título se generó mediante la transfección del bácmido en células de Spodoptera frugiperda 9 (Sf9) y la amplificación del virus utilizando métodos estándares, tal como lo detalla Life Technologies. BRG1 (658-1361)-His6 se expresó a partir de células Sf9 en crecimiento en fase logarítmica (1,5-3,9 * 106 células/mL) a razón de 15 virus/célula. Se permitió que la infección prosiguiera en la incubadora oscilante a 27 °C y se recolectó tres días después de la infección después de que la viabilidad celular se redujo al 80 % con un aumento en el diámetro total de la célula compatible con la infección. Las células se recolectaron a 4.000xg durante 20 min, se congelaron instantáneamente y se almacenaron a -80 °C hasta su uso.

C. Purificación de BRG1(658-1361)-His ⁶

Se lisaron células Sf9 que expresaban BRG1(658-1361)-His6 recombinante en Tris 50 mM (8,0), NaCl 300 mM, glicerol al 5 % y TCEP 1 mM complementado con un cóctel inhibidor de proteasa (Roche cOmplete), utilizando 7,5 mL de tampón de lisis por gramo de pasta celular. Las células se lisaron tras descongelarlas, se homogeneizaron y posteriormente se clarificaron en un rotor JA25.50 a 50.000xg durante 30 min para eliminar el material insoluble. El lisado clarificado se aplicó a una columna His-Trap HP de 5 mL (GE Healthcare Life Sciences), se lavó rigurosamente en tampón de lisis sin inhibidores de proteasa complementado con imidazol 20 mM. La proteína unida se eluyó en un gradiente de diez volúmenes de columna frente a tampón de lisis complementado con imidazol 250 mM. Las fracciones que contenían BRG1(658-1361)-His6 se agruparon y diluyeron hasta que la conductividad alcanzó aproximadamente 6 mS/cm (NaCl ~60 mM) utilizando Tris 50 mM pH 8,0, glicerol al 5 % y TCEP 1 mM, se hicieron pasar a través de un filtro de 0,2 |j e inmediatamente se cargaron en una columna HiTrap Q HP de 5 mL (GE Health Biosciences) previamente equilibrada en Tris 50 mM (pH 8,0), NaCl 100 mM, glicerol al 5 % y TCEP 1 mM. Después de la captura, la proteína unida se compitió con el mismo tampón complementado con NaCl 1 M. Las fracciones que contenían BRG1(658-1361)-His6 se agruparon y cargaron en una columna de exclusión por tamaño S200 16/60 equilibrada en Tris 50 mM (8,0), NaCl 200 mM, glicerol al 5 % y TCEP'1 mM. La construcción purificada se concentró a 1 hasta 2,5 mg/mL, se congeló rápidamente y se almacenó a -80 °C hasta que se utilizó en ensayos posteriores.

Actividad de inhibición de ATPasa de BRG1

La inhibición de la actividad ATPasa de Brg1 ATPasa-SnAC (658-1361) se midió utilizando el kit de ensayo ADP-Glo de Promega (V6930). Se transfirieron 120 nL de compuesto en DMSO al 100 % a una placa de ensayo de microtitulación blanca de 384 pocillos utilizando un sistema de transferencia acústica ATS de EDC Biosystems. Todas las adiciones de reactivos posteriores se realizaron con un dispensador multimodo MultiFlo FX. El tampón de ensayo era HEPES 20 mM pH 7,5, MgCl²1 mM, KCI 20 mM, DTT 1 mM, BSA al 0,01 %, Tween 20 al 0,005 %. Se añadieron 4 jL de Brg1 ATPasa-SnAC 7,5 nM en tampón de ensayo a la placa de ensayo y se incubó a TA durante 5 min con compuesto. Se añadieron 2 jL de ATP 195 jM y plásmido pCMV-dR8.91 6 nM en tampón de ensayo a la placa de ensayo para iniciar la reacción. Las concentraciones finales de los reactivos eran Brg1 ATPasa-SnAC 5 nM, ATP 65 jM y plásmido pCMV-dR8.91 2 nM. La reacción de ATPasa se incubó a TA durante 60 min. Se añadieron 3 jL de reactivo ADP-Glo para detener la reacción y se incubó durante 30 min a TA. Se añadieron 3 jL de reactivo de detección de quinasa a la placa de ensayo que se incubó durante 90 min a TA. Las placas se leyeron con un lector 2103 Multilabel Envision utilizando detección de luminiscencia ultrasensible. Los valores de CI⁵⁰se determinaron a partir de la media de puntos de datos duplicados mediante análisis de regresión no lineal de los valores porcentuales de inhibición representados frente a la concentración del compuesto.

Plásmido pCMV-dR8.91 utilizado para ensayos de inhibición de ATPasa de BRM / BRG1:

El molde de plásmido pCMV-dR8.91 (véase la secuencia que figura a continuación) se propaga utilizando E. coli químicamente competente One Shot Stbl3 (Número de Catálogo C73C7303, Invitrogen/Thermo Fisher Scientific) siguiendo el protocolo de transformación proporcionado con el reactivo. A continuación, las colonias bacterianas transformadas se seleccionan en placas de agar LB que contienen medio de selección de antibiótico de ampicilina/carbeniclina (Número de Catálogo L1010, Teknova). Las colonias bacterianas se cultivan en caldo líquido LB (Número de catálogo 10855001, Invitrogen) que contiene ampicilina a 100 microgramos/mL y el ADN del plásmido se aísla de acuerdo con la escala requerida de acuerdo con el protocolo del fabricante proporcionado con los kits de aislamiento de plásmidos de Qiagen (Maxi prep, Número de Identificación del Producto 10063).

Los datos de actividad inhibitoria de compuestos representativos de la presente divulgación de los dos ensayos arriba descritos (p. ej., el ensayo de inhibición de ATPasa BRM y el ensayo de inhibición de ATPasa BRG1) se proporcionan en la siguiente Tabla 1.

Tabla 1

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un compuesto o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, de fórmula I:

en que:

R1 se selecciona de hidrógeno, amino y alquilo C^1-2sustituido con hidroxi;

R2 es hidrógeno;

R3 se selecciona de alquilo C^1-2y alquilo C^1-2sustituido con halo;

R4 es hidrógeno;

R5 se elige entre hidrógeno y halo; y

R6 se selecciona de hidrógeno y halo.

2. El compuesto o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo de la reivindicación 1, en que:

R1 se selecciona de hidrógeno, amino e hidroxi-metilo;

R2 es hidrógeno;

R3 se selecciona de metilo, difluorometilo y trifluorometilo;

R4 es hidrógeno;

R5 se selecciona de hidrógeno, cloro y fluoro; y

R6 se selecciona de hidrógeno y fluoro.

3. El compuesto de la reivindicación 2, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, seleccionado de:

4. Un compuesto de acuerdo con la reivindicación 3 que tiene la estructura:

0 una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

5. Una composición farmacéutica, que comprende un compuesto de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, y uno o más soportes farmacéuticamente aceptables.

6. Una combinación farmacéutica, que comprende un compuesto de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, y uno o más agentes terapéuticamente activos.

7. Una combinación farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 6, en donde dichos uno o más agentes terapéuticamente activos se seleccionan independientemente de agentes anti-cancerígenos, agentes anti-alérgicos, anti eméticos, analgésicos, inmunomoduladores y agentes citoprotectores.

8. Un compuesto de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 4, o una sal farmacéuticamente aceptable de este, para su uso como medicamento.

9. Un compuesto de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, para uso en el tratamiento de un trastorno o enfermedad mediado por BRM y/o mediado por BRG1, en donde el trastorno o enfermedad mediado por BRM y/o mediado por BRG1 es un tumor sólido, leucemia o linfoma.

10. Un compuesto para uso de acuerdo con la reivindicación 9, en donde dicho trastorno o enfermedad se selecciona de carcinoma de pulmón de células no pequeñas, adenocarcinoma de pulmón, carcinoma de pulmón, carcinomas de pulmón de células grandes, carcinoma de pulmón de células no pequeñas, carcinoma de células escamosas de pulmón, cáncer de pulmón de células pequeñas, melanoma cutáneo de la piel, melanoma desmoplásico, melanoma uveal, carcinoma de células pequeñas del ovario (tipo hipercalcémico), tumor rabdoide de ovario, carcinoma cutáneo de células escamosas, glioma, carcinosarcoma uterino, carcinoma endometrial del cuerpo uterino, cistoadenocarcinoma seroso de ovario, carcinoma urotelial de vejiga, linfoma primario del sistema nervioso central, carcinoma esofágico, cáncer de vejiga, variante plasmocitoide del cáncer de vejiga, adenocarcinoma de estómago, carcinoma quístico adenoide, neoplasia linfoide, linfoma difuso de células B grandes, cáncer de páncreas, adenocarcinoma colorrectal, colangiocarcinoma, sarcoma, cánceres de cabeza y cuello, cánceres de cuello uterino y endocervicales, meduloblastoma, linfoma cutáneo de células T, carcinoma hepatocelular de hígado, carcinoma de células papilares renales, cáncer de mama, linfoma de células del manto, carcinoma de vesícula biliar, cánceres de células germinales testiculares, carcinoma de células renales de células claras, cáncer de próstata, sarcoma de Ewing pediátrico, timoma, riñón cromófobo, carcinoma renal de células no claras, feocromocitoma y paraganglioma, cánceres de tiroides, tumor maligno de la vaina nerviosa periférica, cáncer de próstata neuroendocrino, carcinoma de células escamosas de cabeza y cuello, carcinoma adrenocortical, carcinoma de cuello uterino y cánceres endocervicales, carcinoma cutáneo de células escamosas, cáncer testicular de células germinales, glioblastoma, glioblastoma multiforme, sarcoma de Ewing, carcinoma de células renales de células claras, neuroblastoma, linfoma difuso de células B grandes, leucemia mieloide aguda, leucemia linfocítica crónica, mieloma múltiple, tumores rabdoides malignos, sarcomas epitelioides, schwannomatosis familiar, carcinomas medulares renales, sarcoma sinovial y meningiomas.